Быстрый способ диагностики рака

1 Предпосылки создания изобретения Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к быстрому способу диагностики рака, пригодному для обнаружения наличия у субъекта канцерогенного процесса на бессимптомной стадии или на ранней стадии. В изобретении также предложены соединение, которое является активатором карбонатдегидратазы II, т.е. маркером опухоли, и которое присутствует в сыворотке людей, имеющих злокачественную опухоль, способ лечения рака, включающий выявление рака у пациента на бессимптомной стадии или на ранней стадии с помощью указанного способа диагностики рака, и набор, предназначенный для осуществления указанного способа диагностики рака. Способ диагностики рака по изобретению основан на воздействии сыворотки пациентов, имеющих злокачественные опухоли, на активность очищенной карбонатдегидратазы II. Установлено, что активность очищенной карбонатдегидратазы II существенно увеличивается при добавлении определенного количества сыворотки пациентов, имеющих злокачественные опухоли. С другой стороны, подобный эффект не наблюдается ни с использованием сыворотки здоровых добровольцев, ни с использованием сыворотки пациентов, страдающих другими болезнями, отличными от рака. Описание прототипов Карбонатдегидратаза представляет собой цинксодержащий фермент, описанный у Meldrum и др. в 1932 г. (Meldrum N.U., Roughtonanhydrase isozymes, Ann. N.Y. Acid. Sci. 1984,429, 338-358). У позвоночных обнаружено восемь различных изоферментов карбонатдегидратазы (обозначенных как I-VIII), которые обладают различными физиологическими функциями и принимают участие в секреции кислоты желудочного сока, в образовании внутриглазной жидкости и спинномозговой жидкости,в секреции бикарбонатов поджелудочной железой, в промежуточном метаболизме, в кальцинозе и т.д. Проведенные ранее авторами изобретения исследования показали, что специфические ингибиторы карбонатдегидратазы (ацетазоламид,этоксизоламид, бензтиазол-2-сульфонамид) при введении оральным путем в стандартных терапевтических дозах снижают секрецию кислоты желудочного сока и приводят к исчезновению связанной с язвой боли и, как показано с помощью гастродуоденскопии, к быстрому заживле 003185 2 нию язв желудка и двенадцатиперстной кишкиJaneiro, Brasil, 1-ое изд. 1990, 2-ое изд. 1996,173-179). В последующих исследованиях авторами изобретения было установлено, что гистамин,гастрин и ацетилхолин, которые представляют собой основные стимуляторы секреции кислоты желудочного сока, непосредственно активируют карбонатдегидратазу II и IV в слизистой оболочке желудка (I. Puscas, New concepts concerning the mechanism of stimulation of gastric acidsecretion by histamine, VI-й Всемирный конгресс по гастроэнтерологии, Мадрид, 1978, 213; I.Rev. Roum. Biochim., 1979, 4: 317-329). Исследования, проведенные авторами изобретения,также показали, что изофермент I карбонатдегидратазы, который локализован в эритроцитах и в стенках сосудов, участвует в процессах сосудистой модуляции (I. Puscas и др., Inhibition ofJournal of Hypertension, 1997, 10(1), 124-128). Изоферомент II карбонатдегидратазы, который локализован в эритроцитах и в секреторных клетках, модулирует секреторные процессы в организме (I. Puscas и др., Всемирный конгресс по гастроэнтерологии, Лос Анджелес, октябрь 1994 г.: 1329-1332; 1366-1381; I. Puscas и др.,Nonsteroidal anti-inflammatory drugs activate carbonic anhydrase by a direct mechanism of action, J.Pharmacol. Exp. Therap., USA, 1996, 277, 3: 11461148). Полученные авторами изобретения результаты позволили выдвинуть новую теорию пере 3 дачи сигналов внутри клетки: рН-теорию. Согласно этой теории стимулы или первичные переносчики, которые вызывают сосудистые и секреторные модификации, действуют посредством двойного механизма, как на уровне специфичных рецепторов клеточной мембраны, так и путем непосредственного воздействия на связанную с мембраной карбонатдегидратазу. Этот фермент при его активации или ингибировании обеспечивает такое значение рН, которое требуется для образования комплекса стимулрецептор, необходимого для передачи информации на клеточный эффектор. При таком механизме благодаря изменениям значений рН,вызыванным карбонатдегидратазой, этот фермент участвует в модуляции физиологических и патологических процессов в организме, а также в канцерогенезе (I. Puscas и др., Carbonic anhydrase and modulation of physiologic and pathological processes in organism, I. под ред. I. Puscas,Helicon Publishing House Timisoara, Romania,1994, версия на румынском языке стр. 155-205 и 577-585 и версия на английском языке стр. 147197 и 551-559; I. Puscas, Carbonic anhydrase - ain the organism: The pH Theory. 4-ая Международная конференция по карбонатдегидратазе,июль 1995 г., Оксфордский Университет, Англия; I. Puscas и др.: Carbonic anhydrase modulating of physiological and pathological processes in(Noutatea Medicala), Bucharest, Romania, 1997, 3: 5-15). В последние несколько лет обнаружен значительный прогресс в понимании биологических и биохимических основ рака. Рак представляет собой болезнь, отличающуюся неконтролируемым ростом аномальных клеток, которые распространяются от их анатомического места происхождения в другие ткани. Этот процесс метастазирования включает различные клеточные реакции, происходящие до того, как любая опухолевая клетка превратится в метастазирующую колонию. Это распространение,если оно не контролируется, является основной причиной фатального исхода заболеваний раком. Однако многие случаи рака могут быть излечены, если они выявлены на ранней стадии и начинают быстро лечиться; другие могут контролироваться в течение многих лет с помощью различных методик лечения. Проведенные авторами исследования invitro и in vivo показали, что канцерогенные вещества уменьшают активность карбонатдегидратазы II и супероксиддисмутазы, а соединения,обладающие антиканцерогенным действием,увеличивают активность этих ферментов (I.some carcinogenic substances. Неделя, посвященная проблемам, связанным с заболеваниями пищеварительной системы (Digestive Diseaseto controls, неделя, посвященная проблемам,связанным с заболеваниями пищеварительной системы, Сан Франциско, Калифорния, май 1995 г., 0798; I. Puscas и др., Anticancer chemotherapy increases red cell and gastric mucosa carbonic anhydrase activity. In vivo studies, неделя,посвященная проблемам, связанным с заболеваниями пищеварительной системы, Сан Франциско, Калифорния, май 1995 г., 0797). Другие современные исследования авторов, которые были проведены на пациентах,имеющих различные формы рака (подтвержденные гистологически и с помощью компьютерной томографии), показали, что активность карбонатдегидратазы II и супероксиддисмутазы эритроцитов является низкой у всех этих пациентов по сравнению с контрольной группой,состоящей из здоровых добровольцев (I. Puscas и др., The effect of benzpyrene and cyclophosphamide on superoxid dismutase and carbonic anhydrase activity in gastric carcinoma patients as compared to controls, Первый форум по гастроэнтерологии, "Banat-Crisana", Тимишоара, Румыния,октябрь 1996 г.). К настоящему времени во многих случаях раннее обнаружение опухолей и внимательное наблюдение за протеканием и состоянием заболевания возможно с помощью маркеров опухоли, которые являются биохимическими индикаторами присутствия неопластической пролиферации и могут быть выявлены в сыворотке,плазме или в других жидкостях организма. Наибольшую применимость маркеры опухоли, такие как карциноэмбриональный антиген (СЕА),фактор некроза опухоли (THF- и ), сиаловая кислота, специфический для простаты антиген(РСА), нашли в области определения реакции на лечение, для обнаружения остаточного заболевания или рецидива. Однако к настоящему времени не выявлен маркер опухоли, который являлся бы специфичным; при нормальном физиологическом статусе или при заболевании, не связанном с неоплазией, большинство маркеров,как правило, присутствует в низких концентрациях. Таким образом, эти маркеры не пригодны для теста, предназначенного для общего скрининга рака. С целью устранения основных недостатков маркеров для опухоли в настоящем изобретении разработан и предложен быстрый способ выявления рака на его бессимптомной стадии или его подтверждения на симптоматичной стадии. Это раннее обнаружение рака позволяет применить эффективное хирургическое лечение или лекарственную терапию наряду с другим стандартным методом, применяемым для локализации опухоли. При создании настоящего изобретения было установлено, что активность очищенной кар 5 бонатдегидратазы II в значительной степени активируется сывороткой пациентов, больных раком, и что такая активация не обнаруживается при использовании сыворотки здоровых людей или при использовании сыворотки пациентов,страдающих другими заболеваниями, отличных от рака. Исходя из этих данных, было обнаружено, что путем тестирования воздействия сыворотки крови на активность очищенной карбонатдегидратазы II можно диагностировать любой тип рака, в том числе на его ранних стадиях. Краткое изложение сущности изобретения Таким образом, в настоящем изобретении предложены:(а) приготовление первой реакционной смеси путем смешения разбавленного образца сыворотки крови субъекта, подлежащего тестированию, и раствора очищенной карбонатдегидратазы II,(б) определение активности карбонатдегидратазы II в первой реакционной смеси,(в) определение активности карбонатдегидратазы II во второй реакционной смеси, содержащей все компоненты первой реакционной смеси, за исключением сыворотки крови, и(г) определение уровня активации карбонатдегидратазы II путем сопоставления активностей, измереных на стадии (б) и на стадии (в);(2) маркер опухоли, присутствующий в сыворотке пациентов, больных раком, причем этот маркер опухоли активирует карбонатдегидратазу в концентрациях 1 мкМ или ниже,(3) способ лечения рака, включающий выявление процесса образования злокачественной опухоли у пациентов на бессимптомной стадии или на ранней стадии с помощью способа диагностики, описанного выше в п.(1), и(4) набор для осуществления способа диагностики рака по п.(1), описанного выше, который включает композицию, содержащую карбонатдегидратазу Подробное описание изобретения Способ диагностики рака по настоящему изобретению представляет собой способ in vitro,а предпочтительными подлежащими тестированию субъектами являются люди. В предпочтительном варианте осуществления способа диагностики рака разбавленная сыворотка крови содержит от 0,1 до 50 об.%,предпочтительно от 1 до 10 об.% сыворотки крови. Разбавитель для разбавленной сыворотки крови выбирают из группы, включающей воду и водные органические растворители, например,водные смеси, содержащие от 0,1 до 50 об.%,предпочтительно от 1 до 15 об.% одного или нескольких органических растворителей, и эти разбавители необязательно могут содержать буфер и/или органические или неорганические соли. Пригодными органическими растворителями являются низшие спирты, такие как метанол, этанол, пропанол, изопропанол и бутанол, 003185 6 кетоны, такие как ацетон и бутанон, соединения из группы диолов и триодов, такие как этиленгликоль-1,3-пропандиол и глицерин, и простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диэтиленгликоль и 2-метоксиэтанол. Пригодные буферы включают HEPES, DIPSO, TAPSO, TES иMOPS, а пригодные органические или неорганические соли включают Na2SO4 и K2SO4. Концентрация карбонатдегидратазы II в растворе очищенной карбонатдегидратазы II находится в диапазоне от 0,01 нМ до 0,1 мМ,предпочтительно от 1,0 нМ до 1,0 мкМ. Пригодными растворителями этого раствора являются вода и водные органические растворители, причем эти растворители дополнительно могут содержать буфер, неорганические или органические соли и/или один или несколько индикаторов. Органические растворители, буферы и органические или неорганические соли соответствуют таковым, которые используются для разбавленного образца сыворотки крови, как описано выше. Приемлемые индикаторы включают пара-нитрофенол, феноловый красный и тетразолиевый нитро-голубой. Согласно настоящему изобретению предпочтительно объединять разбавленный образец сыворотки крови и очищенную карбонатдегидратазу в соотношении от 100:1 до 1:100, предпочтительно в соотношении от 10:1 до 1:10 и наиболее предпочтительно в соотношении от 1:1. В предпочтительном варианте осуществления первая реакционная смесь содержит от 0,05 до 25 об.%, предпочтительно от 0,5 до 5 об.% сыворотки крови. Очевидно, что повышение активности (активация) на 100% или более в первой реакционной смеси (при условии, что первая реакционная смесь содержит 25 об.% или менее, предпочтительно 5 об.% или менее сыворотки) относительно активности карбонатдегидратазы II во второй смеси (т.е. активность карбонатдегидратазы в первой реакционной смеси, по меньшей мере, в 2 раза выше, чем активность во второй реакционной смеси) свидетельствует о наличии канцерогенного процесса у субъекта. В еще одном предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению разбавленный образец сыворотки крови представляет собой водный раствор, содержащий 10 об.% сыворотки, раствор очищенной карбонатдегидратазы II представляет собой водный буферный раствор, содержащий от 1,0 до 10 мкМ карбонатдегидратазы II, а первая реакционная смесь содержит разбавленный образец сыворотки крови и раствор очищенной карбонатдегидратазы II в соотношении 1:1. Активность карбонатдегидратазы II может быть определена с помощью одного из известных методов, например, с помощью метода,описанного в специальной литературе, указанной в данном описании. В предпочтительном 7 варианте осуществления способа по изобретению активность карбонатдегидратазы определяют с помощью метода прекращения реакцииChem. 1971, 246: 2561-2573). Этот метод включает измерение ферментативной активности в отношении гидратации СО 2. Степень гидратации СО 2 оценивают колориметрическим методом на основе изменения значения рН. Определяют промежуток времени, в течение которого значение рН смеси реагентов уменьшается с начального значения 7,5 до конечного значения 6,5. Реакцию оценивают спектрофотометрически при длине волны 400 нм, используя быстрый кинетический спектрофотометр типа HIТЕСН SF-51MX (Великобритания), снабженный смешивающим устройством и системой, состоящей из двух шприцев, с помощью которой вводятся реагенты. Введение реагентов в реакционную кювету осуществляют двумя различными путями: с помощью первого шприца вводят реакционную смесь, состоящую из фермента-буфера (т.е. первую или вторую реакционную смесь), а с помощью второго шприца вводят раствор субстрата, представляющего собой водный раствор СО 2 с содержанием СО 2 от 5 до 50 мМ, предпочтительно 15 мМ. Поступая в реакционную кювету, реагенты смешиваются, что приводит к началу реакции, после чего начинается наблюдение за ее ходом. Получают передаваемый с помощью фотоумножителя сигнал из камеры для смешения и визуализируют с помощью компьютера, снабженного математическим сопроцессором и программным обеспечениемRKBIN IS-1 для обработки параметров кинетики реакции. Измерение активности карбонатдегидратазы также может быть проведено с помощью других методов, описанных ниже. Методы, основанные на изменениях значений рН (Philpot F.J. и др., А modified colorimetric estimation of carbonic anhydrase, Biochem.and colorimetric determination of carbonic anhydrase, J. Biol.Chem. 1948, 176: 147-153). Этот метод основан на измерении производства и поглощения Н+ и может быть осуществлен с помощью а) индикаторов рН, и в этом случае производство Н+ оценивают визуально по изменению цвета индикатора, или с помощью б) рНэлектродов, и в этом случае образование и поглощение Н+ измеряют с помощью рНэлектродов. Методы, основанные на изменениях концентрации СО 2 или рСО 2. Эти методы основаны 8 на измерении образования или поглощения СО 2 при обратимой реакции СО 2 НСО 3 с помощью а) газо-манометрического метода (MeldrumAppl. Physiol. 1976, 40: 707-714). Методы, основанные на изменениях температуры реакции. Эти методы основаны на измерении быстрого начального роста температуры в результате взаимодействия, а измерения проводят с помощью устройства, снабженного термопарами (Kernohan J.C. и др., J. Physiol,London, 1968, 197: 345-361). Методы с мечеными изотопами (метчиками), такими как 18 О (Silverman D.N., MethodsEnzymol. 1982, 87: 732-752). Методы на основе ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с использованием 13 С (Simonsson I. и др., Eur. J. Biochem. 1979, 93: 409-417). Методы релаксации, основанные на том,что в растворе, находящемся в состоянии равновесия HCO3CO2 внезапно изменяются его физические свойства, например, электрическое поле, давление или температура с последующим изменением состояния химического равновесия(Eigen M. и др., Z. Physik. Chem. NF, 1961, 30: 130-136). Иммуногистохимические методы, которые основаны на улавливании с помощью кобальта СО 2, продуцируемого карбонатдегидратазой, и которые служат для локализации карбонатдегидратазы в различных местах организма (Hansson H.P.J., Histochemical demonstration of carbonic anhydrase activity, Histochemie, 1967, 11: 112-128; Lonnerholm G., Histochemical demonstration of carbonic anhydrase activity in humanactivity using a sensitive fluorometric assay, Analytical Biochemistry, 1997, 252, 1: 190-198). Методы с использованием других субстратов для определения карбонатдегидратазы, таких как пара-нитрофенилацетат (Schneider F. и др., ber die Reaktion von Carbonathydrolase mitp-Nitrophenylacetat, Z. Physiol. Chem., 1963: 334: 279-282). Как указано выше, уровень активации, составляющий 100% или более, в первой реакционной смеси (которая содержит 25 об.% или менее, предпочтительно 5 об.% или менее сыворотки) от активности карбонатдегидратазы II во второй реакционной смеси свидетельствует о наличии канцерогенного процесса. Кроме того,было установлено, что более слабую активацию карбонатдегидратазы II получали при использовании сыворотки пациентов с начальными стадиями рака (вне зависимости от локализации 9 рака). Таким образом, способ по изобретению также пригоден для определения у пациентов стадии развития рака (путем сравнения уровня активации карбонатдегидратазы II) при сравнении с активацией сывороткой пациентов на прогрессирующих стадиях заболевания. При этом во всех случаях с использованием сыворотки пациентов на ранних стадиях рака активация карбонатдегидратазы II (концентрация сыворотки в первой реакционной смеси составляла 5 об.%) превышала 100%, а активация, полученная при использовании сыворотки пациентов,находящихся на прогрессирующей стадии заболевания, достигала 400% или более. Способ по настоящему изобретению обладает следующими преимуществами: 1. он позволяет выявлять карциномы на бессимптомной стадии и соответственно на ранних стадиях, когда карциномы не выявляются общепринятыми способами; 2. он позволяет использовать небольшое количество сыворотки крови; 3. он является высокочувствительным и дает воспроизводимые результаты; 4. он является высокоэкономичным вследствие низкой стоимости требуемых реагентов. Исходя из приведенных выше результатов,касающихся активирующего действия сыворотки больных раком пациентов в отношении карбонатдегидратазы II, предпринята попытка выявления в сыворотке указанных больных раком пациентов некоторых факторов, ответственных за активацию карбонатдегидратазы II (т.е. маркеров опухоли). Так, например, установлено,что факторы некроза опухолии , карциноэмбриональный антиген, сиаловая кислота и 1 антихимотрипсин являются сильными активаторами карбонатдегидратазыII. Проведенные исследования также показали, что уровень гастрина в крови на 80% выше у больных раком пациентов по сравнению с сывороткой здоровых добровольцев. Таким образом, он может представлять собой один из эндогенных сывороточных активаторов карбонатдегидратазы II. Маркеры опухоли по настоящему изобретению активируют карбонатдегидратазу II даже в концентрациях ниже 1 мкМ, в частности даже при концентрации 1 нМ или ниже и даже при концентрации 1 пМ или ниже. Предпочтительные маркеры опухоли включают факторы некроза опухолии , карциноэмбриональный антиген (СЕА), сиаловую кислоту, 1 антихимотрипсин и онкопротеин sp 185Her2. Маркеры опухоли по настоящему изобретению могут применяться в виде стандартных растворов для количественной оценки (в процентах) выявленной активации, в частности для определения стадии заболевания раком. Способ лечения рака по настоящему изобретению, который включает выявление заболе 003185 10 вания раком у пациента на бессимптомной стадии или на ранней стадии, как указано выше,может применяться для лечения пациентов,страдающих любым типом рака. Таким образом,способ диагностики рака по настоящему изобретению может быть объединен с любым типом терапевтического лечения (в том числе хирургического или химиотерапевтического). Обнаружение начальных стадий заболевания раком повышает шансы излечения рака. Набор для осуществления предлагаемого способа диагностики рака включает композицию, содержащую карбонатдегидратазу II. Указанная композиция может находиться в сухом состоянии или в виде раствора. Дополнительные ингредиенты композиции и количество карбонатдегидратазы II в композиции указано выше при описании соединений, входящих в первую реакционную смесь. Набор дополнительно может включать композиции, содержащие буфер, например, буферные растворы, композиции, содержащие соединение-индикатор, и композиции, содержащие один или несколько маркеров опухоли,причем пригодные буфер, индикатор и маркер опухоли описаны выше. Ниже изобретение более подробно описано на примерах, которые не ограничивают его объем. Примеры Реагенты: пара-нитрофенол: применяли в качестве индикатора цвета в концентрации 0,2 мМ,рН=7,5, температура 20-25 С, что соответствует комнатной температуре (ниже обозначена как"КТ"); буфер HEPES: применяли в концентрации 20 мМ, рН=7,5, КТ; маточный раствор очищенной карбонатдегидратазы II (полученной от фирмы SIGMA,Deisenhofen, Германия): применяли в концентрации 3,44 х 10-6M, рН=7,5, КТ; раствор CO2 в концентрации 15 мМ (в качестве субстрата): получали барботированием дважды дистиллированной воды СО 2 до насыщения;Na2SO4 в концентрации 0,1 М: применяли для поддержания постоянной ионной силы. Определение активности очищенной карбонатдегидратазы II проводили путем измерения времени, в течение которого происходила гидратация СО 2 в присутствии фермента. Измерение начинали в момент времени, когда начиналась реакция (когда оптическая плотность реакционной смеси составляла 3 ед.), и проводили до окончания реакции (когда оптическая плотность реакционной смеси возвращалась к нулю). Значения оптической плотности представляли в виде зависимости от времени реакции. Реакционная кювета была снабжена двумя шприцами, которые содержали: 11 шприц I: 1 мл смеси, включающей 0,8 мл буфера + индикатор + 0,1 мл раствора КД II(3,44 х 10-6M) + 0,1 мл H2 О; шприц II: 1 мл раствора СО 2 (15 мМ). Введение реагентов и измерения активности карбонатдегидратазы проводили по описанной выше методике. Время реакции, определенное таким путем, обозначили как Т. Активность карбонатдегидратазы определяли по формулеT3 =0,874 с - для разведения 1/10. Активность карбонатдегидратазы II в присутствии сыворотки определяли по следующим формулам:T0 обозначает время реакции без катализатора и Т обозначает время реакции при применении катализатора (в присутствии КД II). Измерение активности карбонатдегидратазы в присутствии сыворотки согласно способу по настоящему изобретению проводили следующим образом. Пример 1. У пациента с диагнозом рак желудка брали 5 мл венозной крови. Образец крови выдерживали в течение 30 мин в термостате и затем центрифугировали в течение 5 мин при 4000 об/мин. После центрифугирования отбирали 2 мл сыворотки и с помощью дважды дистиллированной воды следующим образом получали 3 разведения 1/10, 1/50 и 1/100; добавляя к 0,5 мл сыворотки 4,5 мл Н 2 О, получали разведение 1/10; добавляя к 1 мл сыворотки из разведения 1/10 4 мл Н 2 О, получали разведение 1/50; добавляя к 1 мл сыворотки из разведения 1/50 4 мл Н 2 О, получали разведение 1/100. На первой стадии измеряли время реакции без катализатора, т.е. определяли время реакции в растворе, включающем 0,8 мл буфера + индикатор + раствор СО 2. Время, оцененное таким путем, обозначили как T0, и оно составляло 6,5 с. На второй стадии измеряли время реакции в растворе СО 2 с добавлением 0,1 мл очищенной карбонатдегидратазы II (3,44 х 10-6 М) + 0,8 мл буфера + индикатор+0,1 мл Н 2 О. Время, оцененное таким путем, обозначили как Т, и оно составляло 3,25 с. Активность очищенной карбонатдегидратазы II в присутствии Н 2 О определяли по следующей формуле На третьей стадии каждое из разведений сыворотки 1/100, 1/50 и 1/10 в объемном соотношении 1:1 добавляли к 0,1 мл раствора очищенной карбонатдегидратазы II (3,44 х 10-6M) в 0,8 мл буфера HEPES (20 мМ) + индикатор (пара-нитрофенол, 0,2 мМ). В каждой реакционной смеси измеряли время реакции в присутствии СО 2, обозначенное как Т 1, Т 2 и T3. Эти значения(Т 1, Т 2, Т 3) представляют собой промежуток времени, в течение которого оптическая плотность каждой реакционной смеси снижалась до нуля. Активацию (в процентах) разведений сыворотки рассчитывали следующим образом: Пример 2. У пациента с диагнозом рак легкого брали 5 мл венозной крови и обрабатывали по способу, описанному в примере 1. Первая стадия: Т 0 = 6,40 с. Вторая стадия: Т =3,20 с; А =1,00 [ед./мл]. Третья стадия:[ед./мл]; активация 368%. Пример 3. У пациента с диагнозом рак молочной железы брали 5 мл венозной крови и обрабатывали по способу, описанному в примере 1. Первая стадия: Т 0=6,35 с. Вторая стадия: Т=3,175 с; А=1,00 [ед./мл]. Третья стадия: Т 1 = 2,201 с (разведение 1/100); А 1 = 1,885[ед./мл]; активация 342%. Пример 4. У пациента с диагнозом рак яичника брали 5 мл венозной крови и обрабатывали по способу, описанному в примере 1. Первая стадия: Т 0=6,52 с,Вторая стадия: Т =3,26 с; А = 1,00 [ед./мл]. Третья стадия: Т 1 = 2,330 с (разведение 1/100); А 1 = 1,798[ед./мл]; активация 287%. Пример 5. У пациента с диагнозом тестикулярный рак брали 5 мл венозной крови и обрабатывали по способу, описанному в примере 1. Первая стадия: T0 =6,24 с. Вторая стадия: Т =3,12 с; А =1.00 [ед./мл]. Третья стадия:[ед./мл]; активация 316%. Пример 6. У пациента с диагнозом рак предстательной железы брали 5 мл венозной крови и обрабатывали по способу, описанному в примере 1. Первая стадия: Т 0=6,42 с. Вторая стадия: Т =3,21 с; А =1,00 [ед./мл]. Третья стадия: Т 1 = 2,407 с (разведение 1/100); А 1 = 1,708[ед./мл]; активация 242%. Пример 7. У пациента с диагнозом лейкемия брали 5 мл венозной крови и обрабатывали по способу,описанному в примере 1. Первая стадия: Т 0=6,36 с. Вторая стадия: Т =3,18 с; А=1,00 [ед./мл]. Третья стадия:[ед./мл]; активация 408%. Пример 8. У пациента, представляющего собой здорового добровольца, брали 5 мл венозной крови и обрабатывали по способу, описанному в примере 1. Первая стадия: Т 0=6,28 с. Вторая стадия: Т=3,14 с; А=1,00 [ед./мл]. Третья стадия: Т 1=3,14 с (разведение 1/100); А 1=1,00[ед./мл]; активация 5%. Пример 9. Быстрый способ диагностики карциномы по изобретению тестировали на следующих двух группах пациентов: группа 1 (N=2320): пациенты, страдающие различными формами карциномы, причем карциномы подтверждены гистологически; 14 группа 2 (N=2638): здоровые добровольцы и пациенты, страдающие другими болезнями,отличными от рака. В обеих группах брали образцы венозной крови и определяли воздействие разведений сыворотки 1/100, 1/50 и 1/10 на очищенную карбонатдегидратазу II по способу, описанному в примере 1. Полученные результаты приведены ниже в таблице, при этом указанные значения представляют собой средние значения активирующего действия сыворотки на очищенную карбонатдегидратазу II. Группа Результаты свидетельствуют о том, что очищенная карбонатдегидратаза II (КД II) выраженно активируется сывороткой пациентов,страдающих карциномой, и что активность КДII не изменяется ни при использовании сыворотки здоровых добровольцев, ни при использовании сыворотки пациентов, не больных раком. Из приведенных выше данных очевидно,что активирующее действие увеличивается пропорционально концентрации сыворотки, т.е. в примерах максимальное активирующее действие наблюдали при разведении 1/10 (5 об.% сыворотки в первой реакционной смеси), а, с другой стороны, уменьшение концентрации сыворотки от 5 до 0,5 об.% (при разведении от 1/10 до 1/100) уменьшает активирующее действие сыворотки. Однако активирующее действие обнаружено даже при разведении 1/100 (0,5 об.% сыворотки в первой реакционной смеси). Практическое значение Способ по настоящему изобретению представляет собой быстрый тест для диагностики различных типов рака. При создании изобретения исследовали свыше 3000 пациентов на различных стадиях заболевания и с различной локализацией опухоли, включая фарингеальный рак, рак желудка,рак пищевода, колоректальный рак, гепатоцеллюлярный рак, рак поджелудочной железы, легкого, молочной железы, яичника, матки, тестикулярный рак, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак щитовидной железы, рак губы, лейкемия, злокачественные меланомы,лимфому Ходжкина и т.д. В описании представлено много категорий активаторов и ингибиторов карбонатдегидратазы, которые могут вводиться в качестве терапевтических агентов при различных заболеваниях и которые могут оказывать влияние на способ тестирования, приведенный в настоящем описании. По этой причине строго рекомендуется за 5 дней до применения способа диагно 15 стики рака прекратить любое лечение с использованием антагонистов Н 2-рецептора, а также прекратить любое лечение с использованием ингибиторов карбонатдегидратазы (ацетазоламид, E1-, Е 2-, I2-простагландины) и за 10 дней до проведения теста прекратить лечение с использованием любого противовоспалительного лекарства нестероидного типа. Проведенные исследования доказали, что предлагаемый способ может эффективно применяться в качестве теста для выявления всех типов рака. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ диагностики рака, включающий(а) приготовление первой реакционной смеси путем смешения разбавленного образца сыворотки крови субъекта, содержащего от 0,1 до 50 об. сыворотки крови и подлежащего тестированию, и раствора очищенной карбонатдегидратазы II, где концентрация карбонатдегидратазы II составляет от 0,01 нМ до 1,0 мМ;(б) определение активности карбонатдегидратазы II в первой реакционной смеси,(в) определение активности карбонатдегидратазы II во второй реакционной смеси, содержащей все компоненты первой реакционной смеси, за исключением сыворотки крови, и(г) определение уровня активации карбонатдегидратазы II путем сопоставления активностей, полученных на стадии (б) и на стадии(в), при этом активация, составляющая 100% или более, свидетельствует о наличии канцерогенного процесса у субъекта. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что разбавленный образец сыворотки крови содержит от 1 до 10 об.% сыворотки крови. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем,что разбавитель образца разбавленной сыворотки крови выбирают из воды и водных органических растворителей, причем этот разбавитель необязательно может содержать буфер. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация карбонатдегидратазы II в растворе очищенной карбонатдегидратазы составляетII от 1,0 нМ до 1,0 мкМ, причем растворитель этого раствора выбирают из воды и водных органических растворителей и этот растворитель может дополнительно содержать буфер и/или индикатор. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что разбавленный образец сыворотки крови и раствор очищенной карбонатдегидратазы объединяют в соотношении от 100:1 до 1:100, предпочтительно в соотношении от 10:1 до 1:10, более предпочтительно в соотношении 1:1. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что первая реакционная смесь содержит от 0,05 до 25 об.%, предпочтительно от 0,1 до 10 об.%, 16 более предпочтительно от 0,5 до 5 об.% сыворотки крови. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что первая реакционная смесь содержит 25 об.% или менее, предпочтительно 5 об.% или менее сыворотки. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что разбавленный образец сыворотки крови представляет собой водный раствор, содержащий 10 об.% сыворотки, раствор очищенной карбонатдегидратазы II представляет собой водный буферный раствор,содержащий от 1,0 до 10 нМ карбонатдегидратазыII, а первую реакционную смесь получают объединением разбавленного образца сыворотки и раствора очищенной карбонатдегидратазы в соотношении 1:1. 9. Способ по п.1 или 8, отличающийся тем,что определение карбонатдегидратазы осуществляют на основе кинетического метода определения прекращения реакции гидратации СО 2 с помощью фермента. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что первоначальное значение рН первой и второй реакционной смеси составляет 7,5, а определение активности фермента включает объединение первой или второй реакционной смеси с раствором субстрата, который представляет собой водный раствор, содержащий от 5 до 50 мМ СO2, предпочтительно от 10 до 25 мМ СО 2 и наиболее предпочтительно 15 мМ СО 2, и измеряют время, необходимое для достижения конечного значения рН 6,5. 11. Способ по п.1, пригодный для обнаружения заболевания раком у субъекта независимо от стадии заболевания раком, в частности на бессимптомной стадии или на ранней стадии. 12. Способ по п.1, пригодный в качестве скринингового теста для диагностики рака на различных стадиях заболевания и с различной локализацией опухоли, включая фарингеальный рак, рак желудка, рак пищевода, колоректальный рак, гепатоцеллюлярный рак, рак поджелудочной железы, легкого, молочной железы, яичника, матки, тестикулярный рак, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак щитовидной железы, рак губы, лейкемия, злокачественные меланомы, лимфому Ходжкина и любые другие формы рака. 13. Набор для осуществления способа диагностики рака по п.1 или 12, который содержит композицию, включающую карбонатдегидратазу II и, по меньшей мере, один маркер опухоли,который активирует карбонатдегидратазу II в концентрации 1 мкМ или ниже. 14. Набор по п.13, отличающийся тем, что маркер выбирают из группы, включающей фактор некроза опухолии , карциноэмбриональный антиген, сиаловую кислоту, 1-антихимотрипсин и онкопротеин sp 185Her2.