Натриевая соль поли-/2,5-дигидрокси-фенилен/-4-тиосульфокислоты линейного строения , как регулятор метаболизма клетки и способ ее получения

1 Изобретение относится к области медицины и биологии и касается препаратов, регулирующих метаболизм клетки, которые могут быть использованы для профилактики и лечения различных заболеваний, а также в исследовательских целях. Предшествующий уровень техники Большинство используемых в настоящее время лекарственных препаратов являются специфичными в том смысле, что их действие направлено на устранение конкретных специфических причин и/или следствий тех или иных патологических состояний. Однако существует группа лечебных препаратов более общего действия, биологическая активность которых проявляется в нормализации правильного функционирования живой клетки, нарушенной в результате воздействия неблагоприятных факторов. Среди разрешенных к медицинскому применению лекарственных препаратов имеется,например, группа терапевтических средств, которые оказывают благоприятное влияние на метаболитические процессы в клетке и проявляют в результате многообразный желаемый физиологический эффект [М.Д. Машковский"Лекарственные средства" изд. 11, М., "Медицина", 1988 г.]. Например, цитохром С ускоряет ход окислительных процессов и применяется для улучшения тканевого дыхания. Аденозинтрифосфат активно влияет на общие процессы обмена веществ и поэтому широко применяется для улучшения мозгового и коронарного кровообращения. Ретаболил и другие анаболические стероиды оказывают положительное влияние на азотистый обмен и способствуют, кроме того, фиксации кальция в костях. Церебролизин, который представляет собою гидролизат мозгового вещества, нормализует обмен веществ в мозговой ткани и его применяют при нарушениях функций центральной нервной системы. Убихинон нормализулизует физиологическое состояние клетки в условиях гипоксии[Г.И. Андреева "Влияние убихинонов и их аналогов на активность ферментов дыхательной цепи". "Микробиология", 1979, т. 48,6, с. 969-974]. Одним из наиболее эффективных известных препаратов, способных положительным образом влияют на физиологическое состояние клетки, является стэкинг-спирилизованный орто-олигомер, содержащий гексациклолинейные ядра, количество которых на виток спирали вторичной структуры названного олигомера равно 2,6-3,0, при этом в спирали вторичной структуры такого олигомера содержится более 1, но менее 10 витков. Примером подобного стэкингспирилизованного олигомера может служить 2 олиго-1,6-(2,5-диоксифенилен)-тиосульфат натрия. Описанные олигомеры - это семейство индивидуальных мономеров, имеющих число бензольных ядер в структуре от 3 до 30. Методы разделения индивидуальных мономеров и условия получения тех или иных мономеров определенной длины не описаны. Эти обстоятельства до известной степени могут затруднить стандартизацию готового лекарственного препарата. Известные соединения растворимы в воде,спирте, ацетоне, но нерастворимы в диметиловом эфире. Олигомеры подобной структуры обладают способностью оказывать регулирующее воздействие на функционирование биоэнергетических систем клеток эукариот и прокариот [Опубликованная международная заявка WO 96/08527,С 08G 61/10, 21.03.96]. Способ получения упомянутого соединения заключается в том, что в водно-ацетоновой среде при температуре не выше 37C подвергают взаимодействию парабензохинон и тиосульфат натрия, отделяют осадок целевого продукта и удаляют из него примеси экстрагированием последних диметиловым эфиром. Все вышеперечисленные препараты имеют присущий каждому из них спектр свойств, определяющий характер их практического применения. С этой точки зрения понятен интерес к веществам, влияющим на такие фундаментальные свойства клетки, как ее метаболизм. Краткое описание изобретения Целью настоящего изобретения является расширение ассортимента средств, влияющих на метаболизм клетки. В результате исследовательских усилий заявителем было неожиданно установлено, что описанная ранее биологическая активность известных стэкинг-спирилизованных олигомеров,обладающих спиральной структурой, сохраняется и у их линейных аналогов. Иными словами, не имеющие спиральной конфигурации линейные олигомеры аналогичной химической природы оказываются способными оказывать регулирующее влияние на метаболизм клетки. В частности, такой способностью обладает линейный олигомер олиго-1,6-(2,5-диоксифенилен)-тиосульфат натрия, который заявитель считает более корректным именовать в дальнейшем как натриевую соль [поли-(2,5 дигидроксифенилен)J-4-тиосульфокислоты. Этот линейный полимер представляет собою смесь мономеров, включающих соединения, имеющие от 2 до 6 бензольных ядер. Получить индивидуальные мономерысоставляющие смеси полимеров удовлетворительной степени чистоты не представилось возможным, но, варьируя условия химического синтеза этих соединений, удавалось получать 3 полимерную смесь, содержащую преимущественно мономеры требуемой длины. Молекулярная масса данного полимерного соединения может лежать в пределах от 352 до 784. Оно представляет собой порошок черного цвета без запаха, обладающий солоноватым вкусом. Легко растворимо в воде, практически нерастворимо в 95%-ном этаноле, ацетоне, диэтиловом эфире. Не имеет четкой температуры плавления. Экстинция 0,003%-ного раствора в воде при длине волны 305 nm равняется 18,9 л/гсм. УФ-спектр показывает ярко выраженный максимум при длине волны 305+1 nm. Положение максимума не изменяется при изменении значений рН в диапазоне от 5,0 до 9,0, т.е. гипсо- и батохромные эффекты отсутствуют, что достоверно свидетельствует о том,что полимер не содержит спиральных структур. Для ИК-спектра характерны полосы поглощения в областях 610-630 см-1, 790-810 см-1,1195-1215 см-1, 1440-1460 см-1. Данный полимерный продукт показал выраженную биологическую активность, проявившуюся в отношении микроорганизмов, дезагрегированных клеток животной ткани, животных и человека. Основная направленность биологического действия - нормализация и оптимизация обмена веществ в живой клетке, особенно в условиях гипоксии. Другой важной особенностью предлагаемого полимера является его свойство повышать работоспособность организма. Способ получения натриевой соли [поли-(2,5 дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты заключается в том, что при температуре выше 60C в среде органического растворителя подвергают взаимодействию парабензохинон и тиосульфат натрия, отделяют осадок целевого продукта и очищают его путем экстракции примесей этиловым спиртом. Предпочтительно взаимодействие осуществляют в водно-ацетоновой среде. Таким образом, патентуемое соединение отличается от наиболее близкого известного структурного и функционального аналога с аналогичной биологической активностью тем, что- представляет собою смесь мономеров, но не является отдельным индивидуальным мономером;- нерастворимо в отличие от аналога в спиртах и ацетоне;- получается способом, отличным по параметрам от способа получения аналога. Способ получения патентуемого соединения имеет ту особенность, что синтез полимера 4 проводят при более высокой температуре - при температуре выше 65 С. Подробное описание изобретения Экспериментальным путем заявитель доказал, что наличие у олигомеров ряда олиго-1,6(2,5-диоксифенилен)-тиосульфата натрия стэкинг-спирилизованной конфигурации не является необходимым условием для проявления биологической активности, направленной на нормализацию и оптимизацию функций живой клетки. Было установлено, в частности, что способностью положительным образом влиять на процессы обмена веществ в клетке обладает натриевая соль [поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты,представляющая собою линейный полимер. Подобный результат отнюдь не являлся очевидным, поскольку известно, что пространственная ориентация молекул определяет их свойства и, в частности, уникальные свойства нуклеиновых кислот связываются именно с их определенным трехмерным пространственным положением. В этой связи вполне законно рассматривать химические соединения, различающиеся пространственной структурой, как самостоятельные индивидуальные вещества. Предлагаемое полимерное соединение имеет следующую структурную формулу: Молекулярная масса данного полимерного соединения может лежать в пределах от 352 до 784. Суммарная формула соединенияNaS2C12+6nO7+2nH9+4n. Этот полимер представляет собой смесь отдельных мономеров и содержит мономеры,имеющие от 2 до 6 бензольных ядер в структуре. Соотношение мономеров в полимерном продукте может колебаться, но, как показали проведенные исследования, это соотношение не оказывает решающего влияния на степень выраженности биологической активности такого препарата. Тем не менее, соблюдая одинаковые условия, удается воспроизводимо получать полимерный продукт со стандартным составом мономеров. Более того, подбирая соответствующие условия при проведении синтеза, можно синтезировать продукт с разным соотношением мономеров. Не имеет четкой температуры плавления. Экстинция 0,003%-ного раствора в воде при длине волны 305 nm равняется 18,9 л/гсм. 5 УФ-спектр показывает ярко выраженный максимум при длине волны 305+1 nm (фиг. 2). Положение максимума не изменяется при изменении значений рН в диапазоне от 5,0 до 9,0, т.е. гипсо- и батохромные эффекты отсутствуют, что достоверно свидетельствует о том,что полимер не содержит спиральных структур. Для ИК-спектра характерны полосы поглощения в области 610-630 см-1, обусловленные валентными колебаниями группировок C-S и S-O; внеплоскостные деформационные колебания незамещенных атомов водорода в бензольном кольце в области 790-810 см-1 и деформационные колебания С-ОН в ароматическом кольце в области 1195-1215 см-1; валентные колебания группы C-S в области 1440-1460 см-1(фиг. 3). Остальные полосы поглощения, представленные на спектре, не являются характерными, перекрываются спектрами исходных реакционных продуктов и не идентифицировались. Основное принципиальное отличие патентуемого соединения от его ближайшего аналога состоит в том, что известное соединение имеет спиральную структуру, а предложенное соединение спиральной структурой не обладает, являясь линейным полимером. Патентуемое соединение представляет собою смесь мономеров, и составляющие ее мономеры могут содержать в структуре от 2 до 6 бензольных ядер, а известное соединение - это семейство индивидуальных мономеров, включающее мономеры, содержащие от 3 до 30 бензольных ядер. 6 Кроме того, между известным и предложенным соединениями существуют различия в растворимости: в отличие от известного соединения предложенное нерастворимо в спиртах и в ацетоне. Биологическая активность предлагаемой натриевой соли[поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты изучалась на клеточных культурах, микроорганизмах, животных, человеке, и некоторые результаты приведены ниже. Совокупность полученных заявителем результатов дает основания для вывода о том, что патентуемое соединение нормализует и оптимизирует обмен веществ в живой клетке у всех изученных организмов, находящихся на разных стадиях эволюции. Видимые проявления благоприятного воздействия патентуемого соединения на обмен веществ, в частности, заключаются в более активном росте дезагрегированных клеток животной ткани, в большей продуцирующей активности микроорганизмов, в повышении работоспособности экспериментальных животных, в противогипоксическом эффекте у человека. Результаты некоторых испытаний патентуемого соединения на жизнеспособных биологических объектах приводятся ниже. Если особо не оговорено иное, исследованиям подвергалась натриевая соль [поли-(2,5 дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты линейного строения, содержащая примерно 60% димерного соединения. Таблица 1 Влияние натриевой соли [поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты на рост клеток ВНК-21 Концентрация клеток, млн/мл Кон-ция Средняя Пассаж препарата,кон-ция клеток,мг/мл млн/мл 1 2 3 4 5 6 7 0 1,8 1,3 1,5 1,3 1,7 1,5 1,5 1,5 2,5 1,9 2,0 1,7 1,7 2,1 1,8 1,9 1,9 5,0 2,1 1,7 1,8 2,0 1,9 1,9 1,8 1,9 10,0 1,7 1,8 1,6 1,9 2,0 1,7 1,9 1,8 Исследования проводились классическим методом, многократно описанным в литературе[Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток, М., "Мир", 1978 г.]. Из полученных результатов следует, что натриевая соль [поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты стимулирует рост изолированных клеток ВНК-21, увеличивая накопление клеток приблизительно на 25%, при этом концентрация изучаемого вещества до 10 мг/мл не проявляла токсического действия. Этот показатель особенно важен, поскольку именно изолированные клетки животной ткани являются наиболее чувствительной тест-системой из всех используемых для выявления токсичности. Выявление стимулирующего действия патентуемого соединения на уровне микроорга низмов было проведено, в частности, при обработке производственного штамма Aspergillusniger - продуцента лимонной кислоты. Препарат добавляли только в посевную питательную среду. В результате промышленного эксперимента в стандартных условиях было получено увеличение съема лимонной кислоты на 21%, экономия мелассы на 9%, сокращение времени производственного цикла на 10%. Некоторые полученные результаты представлены в нижеприводимой табл. 2. Таблица 2 Влияние натриевой соли [поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты на биосинтез лимонной кислоты культурой Aspergillus niger Кон-ция натриевой соли [поли-(2,5-дигидроксиПроизводственный фенилен)]-4-тиосульфокислоты в посевной среде,показатель мг/мл 0 10 Максимальная концентрация лимонной кислоты, г/л 9,2 11,2 Содержание лимонной кислоты от суммы кислот, % 69 72 Средняя продолжительность ферментации, сутки 7 6,4 Для оценки влияния исследуемого соединения на работоспособность использовали стандартную методику определения так называемой"продолжительности плавания", описанную,например, в Методических рекомендациях по экспериментальному изучению препаратов,предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств, одобренных Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения СССР 11 апреля 1990 г. Протокол 7. Экспериментальным животным, в данном случае мышам, вводили предлагаемый препарат, помещали в сосуд с водой и оценивали их способность держаться на воде, выражающуюся в длительности свободного плавания. Контролем служили мыши, не получавшие препарат. Некоторые полученные результаты содержатся в приведенной ниже табл. 3. Таблица 3 Влияние натриевой соли [поли-(2,5-дигидроксифенилен)3-4-тиосульфокислоты в стандартном тесте Контроль Образец 1 Образец 2 Образец 3 1 8 00 18 20 9 10 18 20 2 8 20 24 30 21 00 17 55 3 8 30 26 30 21 25 20 00 4 9 00 28 00 22 10 22 00 5 9 20 29 05 22 20 23 00 6 9 55 30 02 27 00 23 20 7 10 10 30 05 29 30 24 00 8 10 25 39 15 30 10 25 10 9 10 30 40 10 31 00 25 20 10 11 20 41 30 33 00 29 20 В качестве исследуемых образцов были использованы препараты патентуемого соединения, различающиеся соотношением индивидуальных мономеров: образец 1 содержал более 60% димера, образец 2 содержал 50% димера,образец 3 содержал менее 40% димера. В качестве экспериментальных животных использовали самок мышей линии BALB. Видно, что предлагаемое средство существенно повышает устойчивость мышей в экспе риментальных условиях к физическим нагрузкам. Следующие результаты были достигнуты при исследовании влияния натриевой соли [поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты на выживаемость крыс в условиях экспериментальной гипоксии, осуществленном по методикам, описанным в упомянутых выше методических рекомендациях. Таблица 4 Сравнительная эффективность натриевой соли [поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты как антигипоксанта Циркуляторная Геморрагический Препарат Доза мг/кг Гипоксическая гипоксия шок массы гипоксия Убихинон 200 0 2,3+0,3 20/Цитохром 10 30 2,5+0,4 30/Известный 30 80 3,5+0,3 70/75 Предложенный 30 75/Контроль 0 0/17 В данном случае были приняты следующие обозначения:(1) - выживаемость крыс или повышение срока их жизни более 45 мин после пребывания в барокамере на высоте 12000 м;(2) - выживаемость крыс через 6 ч после кровопотери;(3) - выживаемость крыс после перевязывния сонных артерий. В качестве известного препарата был использован индивидуальный стэкинг-спирилизованный мономер - натриевая соль [тетра-(2,5 дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты, а в качестве предложенного препарата - полимерная натриевая соль [поли(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты,содержащая 50% димера. Очевиден высокий эффект, проявляемый предложенным соединением линейной структу ры, который не уступает эффекту, достигаемому при использовании мономера стэкингспирализованной структуры. Клинические исследования патентуемого соединения показали, что патентуемый препарат, в частности, нормализует иммунный статус пациентов при целом ряде патологий. Таблица 5 Влияние натриевой соли [поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты на функциональную активность моноцитов до (1) приема и после (2) приема препарата Процент функционально Процент фагоцитирующих Группы больных активных моноцитов моноцитов 1 2 1 2 Железодефицитная анемия(n=3) 48,3+3,6 54,7+3,2 21,7+2,1 33,3+3,1 Инфекционно-аллергический полиартрит (n=5) 39,6+3,2 56,4+4,2 18,4+1,0 24,8+2,8 Лейкопения (n=14) 41,3+2,1 56,5+3,1 13,4+3,4 32,6+6,1 Тромбопения (n=3) 54,2+4,5 64,2+3,6 15,3+2,4 34,3+3,5 Здоровые (n=50) 60,0+2,5 30,2+2,5 Представленные результаты, являющиеся статистически достоверными (р 0,05), показывают, что предложенный препарат обладает способностью активизировать метаболизм клетки, повышает устойчивость животных к стрессовым нагрузкам, нормализует функционирование клеточных систем у человека. Препарат не обладает концерогенностью и мутагенностью. Токсичность препарата низкая. Она составляет более 1500 мг/кг веса при внутривенном введении белым мышам при средней эффективной терапевтической ее дозировке на уровне 30 мг/кг веса. Он может быть приготовлен в виде таких традиционных лекарственных форм, как раствор, порошки, таблетки, мази. Способ получения натриевой соли [поли(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты заключается в том, что при температуре выше 60C в среде органического растворителя подвергают взаимодействию парабензохинон и тиосульфат натрия, отделяют осадок целевого 11 продукта и очищают его путем экстракции примесей этиловым спиртом. В оптимальном варианте осуществления предлагаемого способа раствор парабензохинона в ацетоне подвергают взаимодействию с водным раствором тиосульфата натрия при температуре выше 60C, после чего отделяют образовавшийся осадок целевого продукта и очищают его экстракцией кипящим этиловым спиртом. Молярное соотношение парабензохинона и тиосульфата натрия должно лежать в пределах от 10:1 до 2:1. Способ получения заявляемого продукта отличается от способа получения наиболее близкого структурного аналога тем, что реакцию взаимодействия проводят при более высокой температуре (при температуре выше 60C, в то время как для получения известного соединения температура взаимодействия не должна превышать 37C), а отделение примесей осуществляют экстракцией их спиртами, а не диметиловым эфиром. Готовый продукт промывают органическим растворителем, например спиртом для 12 удаления непрореагировавших веществ и примесей. Исходная концентрация парабензохинона в ацетоне обычно составляет 5-16%. Исходная концентрация тиосульфата в водном растворе обычно составляет 20-30%. Готовый продукт можно промыть, в частности, 2-3 раза 5 объемами растворителя. Препарат можно получить, исходя из гидрохинона,подвергая его окислению известным образом, а затем сочетая образовавшийся парабензохинон без промежуточного выделения с тиосульфатом натрия. При взаимодействии парабензохинона и тиосульфата натрия образуется смесь продуктов, содержащих разное число циклолинейных структур в составе от 2 до 6 бензольных колец. Состав этой смеси может быть различным и зависит от принятых условий взаимодействия соотношения реагентов, температуры, длительности реакции и т.д. Некоторые данные на этот счет приведены ниже. Таблица 6 Состав продукта взаимодействия парабензохинона и тиосульфата натрия в зависимости от молярного соотношения реагентов Соотношение реагентов Молекулярная масса Выход продукта (% от р-бензохинона) тиосульфат/р-бензохинон 1:3 370 55 1:6 540 58 1:9 760 56 При осуществлении реакции взаимодействия при температуре 65-70 в течение 2 ч, увеличение в реакционной среде доли парабензо линона приводит к большему образованию относительно длинноцепочечных мономеров. Таблица 7 Состав продукта взаимодействия парабензохинона и тиосульфата натрия в зависимости от температуры реакции Температура реакции,Выход продукта Молекулярная масса градусы Цельсия(% от р-бензохинона) 50 580 40 65 545 55 80 520 58 При проведении реакции взаимодействия при постоянном соотношении парабензохинона и тиосульфата натрия 6:1 в течение 2 ч, повы шение температуры приводит к укорочению длины образующихся мономеров. Таблица 8 Состав продукта взаимодействия парабензохинона и тиосульфата натрия в зависимости от длительности реакции Длительность реакции, ч Молекулярная масса Выход продукта (% от р-бензохинона) 1 530 38 2 540 56 3 570 57 При выполнении реакции взаимодействия при соотношении парабензохинона и тиосуль фата натрия, равном 6:1 при температуре 65, 13 увеличение времени реакции приводит к параллельному увеличению длины цепи мономеров. Следующие примеры, не ограничивающие существа изобретения, более подробно иллюстрируют сущность предложения. Пример 1. В реактор с мешалкой емкостью 50 л загружают 1 кг парабензохинона и заливают 19,6 л ацетона. Полученный 5%-ный раствор перемешивают 10-15 мин, затем вливают 0,765 кг тиосульфата натрия, растворенного в 1,7 л дистиллированной воды. Соотношение тиосульфат:бензохинон составляет 1:3. Смесь перемешивают в течение двух часов, поддерживая температуру в пределах 65-70C. После завершения реакции эту смесь остужают, выпавший осадок отделяют, сушат, а затем экстрагируют кипящим этиловым спиртом в течение 24 ч. Полученный продукт сушат. Выход целевого продукта - 0,55 кг. Молекулярная масса, определенная криоскопическим методом, равняется 370. Содержание серы, определенное элементным анализом,составляет 19,2%. Пример 2. В реактор с мешалкой емкостью 50 л загружают 1 кг парабензохинона и заливают 19,6 л ацетона. Полученный 5%-ный раствор перемешивают 10-15 мин, затем вливают 0,38 кг тиосульфата натрия, растворенного в 0,9 л дистиллированной воды. Соотношение тиосульфат натрия:бензохинон составляет 1:6. Смесь перемешивают в течение одного часа, поддерживая температуру в пределах 70C. После завершения реакции смесь остужают, выпавший осадок отделяют, сушат, затем экстрагируют кипящим этиловым спиртом в течение 24 ч. Полученный продукт сушат. Выход целевого продукта составляет 0,50 кг. Молекулярная масса, определенная криоскопическим методом, равняется 540. Содержание серы, определенное элементным анализом,составляет 14,5%. Пример 3. В реактор с мешалкой емкостью 50 л загружают 1 кг парабензохинона и заливают 19,6 л ацетона. Полученный 5%-ный раствор перемешивают 10-15 мин, затем вливают 0,26 кг тиосульфата натрия, растворенного в 0,6 л дис 001563 14 тиллированной воды. Соотношение тиосульфат натрия:бензохинон составляет 1:9. Смесь перемешивают в течение трех часов, поддерживая температуру в пределах 80 градусов. После завершения реакции смесь остужают, выпавший осадок отделяют, сушат, а затем экстрагируют кипящим этиловым спиртом в течение 24 ч. Полученный продукт сушат. Выход целевого продукта составляет 0,55 кг. Молекулярная масса, определенная криоскопическим методом, равняется 740. Содержание серы, определенное элементным анализом,составляет 11,3%. Таким образом, отличия предложенного способа от известного способа обеспечивают получение продукта, отличающегося от известного продукта. Предложенный препарат, по сведениям заявителя, ранее не был описан, сведения о его влиянии на метаболизм клетки отсутствуют,способ его получения ранее не был известен. В России патентуемое соединение в установленном порядке разрешено к практическому использованию в медицинской практике. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Натриевая соль [поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты линейного строения общей формулы как регулятор метаболизма клетки. 2. Способ получения натриевой соли [поли-(2,5-дигидроксифенилен)]-4-тиосульфокислоты линейного строения, отличающийся тем, что в водно-органической среде подвергают взаимодействию парабензохинон и тиосульфат натрия при молярном соотношении от 10:1 до 2:1 и при температуре выше 65 градусов,выделяют целевой продукт из реакционной смеси и отделяют примеси.