Способ интеграции экзогенной днк в геном растительной клетки и способ получения фертильного трансгенного растения с интегрированной в геном экзогенной днк.
Формула / Реферат
1. Способ интеграции экзогенной ДНК в геном растительной клетки, отличающийся тем, что включает трансформацию этой клетки указанной ДНК, связанной с пограничными последовательностями Т-ДНК, и, по крайней мере, одной вспомогательной последовательностью ДНК или РНК, обеспечивающей экспрессию в растительной клетке одного или более белков, опосредующих интеграцию экзогенной ДНК, причем эти белки кодируются участком vir Ti или Ri-плазмид агробактерий таким образом, чтобы данные белки присутствовали в растительной клетке в достаточном количестве после проникновения экзогенной ДНК в растительную клетку и до того, как произойдет интеграция экзогенной ДНК в геном растительной клетки.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экзогенную ДНК и вспомогательные последовательности ДНК или РНК вводят в растительную клетку одновременно.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что один или несколько белков, опосредующих интеграцию экзогенной ДНК, кодируются участком VirD1, VirD2, VirC1, VirC2 или VirE2.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что один или несколько белков, опосредующих интеграцию экзогенной ДНК, кодируются участком VirD2, или комбинацией VirD1 и VirD2, или комбинацией VirD1, VirD2 и VirE2.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что один или несколько белков, опосредующих интеграцию экзогенной ДНК, кодируются участком VirD2.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что экзогенная ДНК, связанная с пограничными областями Т-ДНК агробактерий, представляет собой фрагмент растительного вирусного вектора.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что вспомогательная последовательность ДНК представляет собой фрагмент растительного вирусного вектора.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что экзогенная ДНК, связанная с пограничными последовательностями Т-ДНК агробактерий, и вспомогательная последовательность ДНК представляют собой фрагмент растительного вирусного вектора.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что растительная клетка представляет собой клетку двудольного растения.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что двудольное растение выбирают из группы, включающей табак, хлопчатник, масличный рапс и сою.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что растительная клетка представляет собой клетку однодольного растения.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что однодольное растение выбирают из группы, включающей кукурузу, пшеницу и рис.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что экзогенная ДНК представляет собой химерный ген.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что химерный ген обеспечивает экспрессию белка в растительной клетке.
15. Способ по п.2, отличающийся тем, что экзогенная ДНК, связанная с пограничными последовательностями Т-ДНК агробактерий, и вспомогательная последовательность ДНК являются фрагментами одной молекулы ДНК.
16. Способ получения фертильного трансгенного растения с интегрированной в геном экзогенной ДНК, связанной с пограничными последовательностями Т-ДНК агробактерий, включающий интеграцию экзогенной ДНК в геном растительной клетки в соответствии со способом по п.1 и регенерацию фертильного трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что получают фертильное трансгенное растение, выбранное из группы, включающей табак, хлопчатник, масличный рапс, сою, кукурузу, пшеницу и рис.
18. Способ по п.16, отличающийся тем, что получают фертильное трансгенное растение, выбранное из группы, включающей кукурузу, пшеницу, овес, рожь, сорго, рис, ячмень, просо, дернообразующие и кормовые травы, а также хлопчатник, сахарный тростник, сахарную свеклу, масличный рапс, бананы, тополь, орех, табак и сою.
Текст
1 Настоящее изобретение относится к трансформации эукариотических клеток, в частности растительных клеток, экзогенной ДНК, а также к получению трансгенных организмов,тканей и культур из таких клеток. Было разработано несколько методов интродукции молекул экзогенной ДНК в растительные клетки, что позволяет использовать общеизвестные преимущества применения метода рекомбинантной ДНК для получения трансгенных растений. Эти методы включают использование модифицированных биологических систем, таких как опосредуемыйAgrobacterium перенос Т-ДНК в растительные клетки, и физических небиологических систем,таких как электропорация, микроинъекция, опосредуемое фосфатом кальция или полиэтиленгликолем (ПЭГ) поглощение ДНК или слияние клеток и бомбардировка микроснарядами (общий обзор методов и некоторые конкретные данные см., например, в разделах 2 и 3 PlantRep. 3: 117-128 (1985. Разработанные методы позволяют стабильно трансформировать экзогенной ДНК широкий спектр видов растений. В частности, развитие физических методик позволило преодолеть известные ограничения, связанные с диапазоном хозяев и характерные для биологических систем. Однако общим недостатком этих физических методов является то, что они не дают возможность осуществлять направленную интеграцию введенной ДНК в геном растительной клетки. Поэтому эти методы должны зависеть от неконтролируемой интеграции введенной ДНК посредством недостаточно понятных механизмов, вследствие чего экзогенную ДНК необходимо интегрировать в виде многочисленных копий случайных фрагментов в один сайт в геноме растительной клетки. Увеличение предсказуемости случаев стабильной трансформации при использовании физических методов интродукции экзогенной ДНК в растительную клетку должно значительно улучшить пригодность и общую эффективность этих способов для получения генетически стабильных трансформированных растений,обладающих способностью стабильно экспрессировать трансгены. Одним из подходов, предпринятых для достижения этой цели, было сочетание протеинов, обеспечивающих трансформацию и/или интеграцию в биологических системах, с небиологическими методами введения. Для достижения требуемого эффекта представлялось необходимым связать эти протеины с молекулами экзогенной ДНК перед введением в трансформируемую клетку-мишень, имитируя при этом по возможности наиболее точно био 001039 2 логическую систему, из которой получены протеины (WO 95/05471 и WO 95/34647). Известен целый ряд протеинов, которые обеспечивают стабильную интегративную трансформацию эукариотических клеток экзогенной ДНК, которые производятся вне эукариотической клетки и вводятся в комбинации с экзогенной ДНК. В основе настоящего изобретения лежит открытие того факта, что для таких протеинов не требуется их получение и связывание с экзогенной ДНК вне эукариотической клетки, как это осуществляют обычно для усиления стабильной интегративной трансформации. В отличие от этого введение в эукариотическую трансформируемую клетку-мишень транслируемой РНК или химерного гена, кодирующего такой протеин, также может обеспечить эффективную стабильную интегративную трансформацию совместно введенной экзогенной ДНК. Согласно настоящему изобретению предлагается прежде всего улучшенный способ стабильной трансформации растительных клеток с помощью экзогенной ДНК, который объединяет положительные характеристики опосредуемогоAgrobacterium tumefaciens переноса Т-ДНК и интеграции с небиологическими методами введения. Этот способ включает введение в растительную клетку фрагмента экзогенной ДНК,предназначенного для интеграции в геном растительной клетки, связанного с пограничными последовательностями Т-ДНК, вместе с, по крайней мере, одной вспомогательной последовательностью ДНК или РНК, обеспечивающей экспрессию в растительной клетке одного или нескольких белков, опосредующих интеграцию экзогенной ДНК, кодируемых участком vir Ti или Ri - плазмид агробактерий, таким образом,чтобы указанные белки присутствовали в клетке в достаточном количестве после проникновения экзогенной ДНК в клетку и до того, как произойдет интеграция экзогенной ДНК в геном растительной клетки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения экзогенную ДНК и вспомогательные последовательности ДНК и РНК вводят в растительную клетку одновременно. В альтернативном варианте подлежащая трансформации растительная клетка может быть получена из растения или культуры клеток, которые предварительно были стабильно трансформированы с помощью химерного(ых) гена(ов),предназначенного(ых) для экспрессии белков,опосредующих интеграцию. Один или несколько белков, опосредующих интеграцию, в соответствии с настоящим изобретением, могут кодироваться участкомVirD1, VirD2, VirC1, VirC2 или VirE2. Предпочтительно используют один участок VirD2, или комбинацию VirD1 и VirD2, или комбинацию 3 В еще одном предпочтительном варианте экзогенная ДНК, связанная с пограничными областями Т-ДНК агробактерий, представляет собой фрагмент растительного вирусного вектора. Фрагментом растительного вирусного вектора может быть только вспомогательная последовательность ДНК или РНК. Возможен также вариант, когда и экзогенная последовательность, связанная с пограничными последовательностями Т-ДНК агробактерий, и вспомогательная последовательность ДНК или РНК представляют собой фрагмент растительного вирусного вектора. Предпочтительно используют растительную клетку, которая представляет собой клетку двудольного растения, предпочтительно выбранного из группы, включающей табак, хлопчатник, масличный рапс и сою. Однако возможен вариант, когда растительная клетка представляет собой клетку однодольного растения, которое предпочтительно выбирают из группы, включающей кукурузу,пшеницу и рис. Экзогенная ДНК может представлять собой любой фрагмент ДНК, который требуется интегрировать в геном растительной клетки в интактной форме, например, химерный ген,сконструированный для экспрессии в растительной клетке или трансгенном растении, или в культуре растительных клеток определенной биологически активной РНК (например, антисмысловой РНК или рибозима) или представляющего интерес белка. Предпочтительно, чтобы экзогенная ДНК,связанная с пограничными последовательностями Т-ДНК агробактерий, и вспомогательная последовательность ДНК были фрагментами одной молекулы ДНК. Другим объектом изобретения является способ получения фертильного трансгенного растения с интегрированной в геном экзогенной ДНК, связанной с пограничными последовательностями Т-ДНК агробактерий, включающий интеграцию экзогенной ДНК в геном растительной клетки в соответствии с описанным выше способом и регенерацию фертильного трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. С помощью данного способа возможно получение фертильных трансгенных растений,предпочтительно выбранных из группы, включающей табак, хлопчатник, масличный рапс,сою, кукурузу, пшеницу и рис. Наиболее предпочтительно из группы,включающей кукурузу, пшеницу, овес, рожь,сорго, рис, ячмень, просо, дернообразующие и кормовые травы, а также хлопчатник, сахарный тростник, сахарную свеклу, масличный рапс,бананы, тополь, орех, табак и сою. 4 Ниже приведены пояснения некоторых определений для лучшего понимания настоящего изобретения. Интеграция. В контексте настоящего описания понятие интеграция в целом применяют по отношению к процессу, посредством которого молекула экзогенной ДНК, введенная в эукариотическую клетку, стабильно включается в геномную ДНК эукариотической клетки. Бомбардировка микроснарядами. В контексте настоящего описания понятие бомбардировка микроснарядами применяют для обозначения общего метода введения нуклеиновых кислот, включая ДНК и РНК, в живую клетку путем нанесения нуклеиновых кислот на микроснаряд и внедрения микроснаряда с нанесенным покрытием в живую клетку (см., например, примеры 1-4 патента США 5036006; WO 91/02071 (в которых описано применение этого метода для трансформации растений и их клеток); см. также патент США 5302523; Koziel и др., Biotechnology 11: 194-200 (1993) (в которых описана трансформация элитных инбредных линий кукурузы с помощью бомбардировки частицами); Vasil и др., Biotechnology 11:15531558 (1993); Weeks и др., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993); Tanaka T. и др., SuccessfulMorikawa H. и др., Appl. Microbiol. Biotechnol. 31:320-322 (1989. Инъекция с помощью струи аэрозоля. В контексте настоящего описания понятие инъекция с помощью струи аэрозоля применяют для обозначения физического метода введения в живые клетки нуклеиновых кислот в форме струи аэрозоля (см., например, патент США 5240842). Электропорация. В контексте настоящего описания понятие электропорация применяют для обозначения метода введения биологических молекул, в частности, нуклеиновых кислот,таких как ДНК и РНК, в живые клетки, заключающегося в том, что на клетки воздействуют электрическим импульсом или разрядом в присутствии биологических молекул (см., например, патент США 5231019; главу 3.3 PlantCiba-Geigy) и WO 93/07278 (на имя CibaGeigy. Микроинъекция. В контексте настоящего описания понятие микроинъекция применяют для обозначения метода механической инъекции биологического вещества, в частности, ДНК или РНК, непосредственно в живую клетку (см.,например,главу 3.4in Enzymology 101:482-492 (1993. Индуцируемое поглощение. В контексте настоящего описания понятие индуцируемое поглощение в целом применяют для обозначения методов, которые индуцируют поглощение биологических веществ, в частности, нуклеиновых кислот, живыми клетками (см., например,раздел Предпосылки создания изобретения в патенте США 5036066). Такие методы включают, в частности, поглощение, опосредуемое полиэтиленгликолем (ПЭГ) (см., например, раздел 3.2 Plant Genetic Transformation and Gene(1987 и обработку тепловым шоком (см. патент США 5231019).VirD. В контексте настоящего описания понятие VirD относится к генам или протеинам, происходящим из вирулентного (Vir) Dоперона Ti- или Ri-плазмиды, которые обеспечивают функции, необходимые для переноса ТДНК (см. обзор Zambryski P.C., Chronicles fromthe Agrobacterium-plant cell DNA transfer story,Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465490 (1992. Конкретные гены и соответствующие протеины из этого участка обозначают номерами в зависимости от их расположения в опероне VirD. Например, первый ген в вирулентном D-опероне обозначают VirD1, второй ген обозначают VirD2 и т.д. Вирулентный участок ДНК в норме не переносится в растительную клетку и не интегрируется в геном растения во время опосредуемого Agrobacterium переноса Т-ДНК. В отличие от этого продукты гена vir в естественных условиях обеспечивают непосредственный перенос элемента Т-ДНК от бактериальной Ti- или Riплазмиды в геном растения. Т-участок и virучасток могут находиться на различных плазмидах без потери функций (De Framond A.J. и др., Bio/Technology 1:262-269 (1983); Hoekema иAcids Res. 12:8711-8721 (1984. Два полипептида VirD1 и VirD2, кодируемых 5'-половиной локуса VirD, играют основную роль в инициации процессинга ДНК при переносе Т-ДНК из Agrobacterium в растительные клетки. Протеины VirD1 и VirD2 кодируются соответственно первым геном и вторым геном оперона VirD (Stachel S.E. и Nester E.W.Stachel и др., EMBO J. 6:857-863 (1987. В частности, было показано, что первый и второй гены оперона VirD кодируют полипептиды, необходимые для расщепления пограничной последовательности Т-ДНК (De Vos и Zambryski,Mol. Plant Microbe Inter. 2: 43-52 (1989);(1993); Jayaswal и др., J. Bacteriol. 169: 50355045 (1987); Porter и др., Nucleic Acids Res. 15: 7503-7515 (1987); Stachel и др., EMBO J. 6: 857863 (1987. Эта активность приводит к образованию одноцепочечных разрывов (ников) внутри пограничных последовательностей Т-ДНКBacteriol. 169: 1046-1055 (1987. VirD1/VirD2 расщепляют пограничную последовательность Т-ДНК между третьим и четвертым основаниями. Как только образуются эти разорванные молекулы, наблюдается образование свободных линейных копий одноцепочечной ДНК (ssДНК) нижней цепи Т-ДНК (Т-цепь) (Stachel S.E. и др.,Nature (London) 322: 706-712 (1986); Stachel и др., EMBO J. 6: 857-863 (1987. VirD2 остается ковалентно присоединенным к 5'-концу Т-ДНКT-DNA from Agrobacterium to the plant cell,Plant Physiol. 107: 1041-1047 (1995. Изучение мутанта virD2, у которого отсутствует С-концевая половина (50%) VirD2, показало, что для разрыва пограничных последовательностей Т-ДНК необходима только Nконцевая половина (50%) VirD2. Однако этот мутант не обладает способностью вызывать опухоли в инфицированных растениях. Таким образом, можно предположить, что С-конец играет определенную роль в переносе Т-ДНК в растительные клетки (данные обобщены в обзоре Zambryski P.C., Chronicles from theAgrobacterium-plant cell DNA transfer story,Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465490 (1992. Этот домен содержит состоящий из двух частей сигнал ядерной локализации (NLS)(Howard и др., Cell 68: 109-118 (1992. Биологическая роль последовательностей NLS была подтверждена данными о том, что уAgrobacterium в значительной степени снижается онкогенность, когда удаляют 2 основные структуры состоящего из двух частей NLS(Shurvinton, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 11837-11841 (1992. Один VirD2 вызывает in vitro сайтспецифическую реакцию расщепления-соединения одноцепочечной ДНК, что свидетельствует о том, что этот протеин обладает каталитической активностью, обеспечивающей разрезание ДНКChemistry 270: 1269-1276 (1995) говорится, что объединение в pTiC58 VirD1 и VirD2 оказалось достаточным для катализа in vitro расщепления,специфического по отношению к Тпограничной последовательности (см. также у(1994. У экстрактов, содержащих VirD1, обнаружена топоизомеразная активность типа I (Ghai иDas, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 319-3113 (1989. Эта активность связана с VirD1 и, вероятно, необходима для релаксации ДНК с целью ее подготовки к расщеплению с помощью VirD2. Однако более высоко очищенный протеин VirD1 не проявил топоизомеразной активности(1995. Анализ последовательности VirD2 у штаммов Agrobacterium, несущих октопиновый,нопалиновый или ризогеновый тип плазмид показал, что N-конец этой последовательности консервативен на 85% (Hirayama и др., Mol.Bacteriol. 172: 4432-4440 (1990); Yanofsky и др.,Cell 47: 471-477 (1986. С-конец консервативен только на 25%, причем наибольшее сходство с сигнальными последовательностями NLS обнаружено для последних 30 аминокислот (см. обзор Zambryski, 1992).VirE. В контексте настоящего описания понятие VirE относится к генам или соответствующим протеинам, происходящим из вирулентного (Vir) Е-оперона Ti- или Ri-плазмиды,которые обеспечивают функции, необходимые для переноса Т-ДНК. Понятие VirЕ 2 в контексте настоящего описания относится к связывающему одноцепочечную ДНК (ssДНК) протеину, который был идентифицирован как продукт гена VirE2 на опероне VirE (Gielt C. и др.,Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 9006-9010 (1987);Citovsky и др., Science 240: 501-504 (1988. Вероятно, VirE2 может покрывать Т-цепь вдоль ее длины. Взаимодействие этого протеина с одноцепочечной ДНК является неспецифическим. Нопалиновый протеин VirE2 (Hirooka и др., J. 8 15: 825-837 (1987 содержат сигналы ядерной локализации. Вероятно, протеин VirE2 является основной частью Т-комплекса, и он может принимать участие в транспорте в ядро (см. обзор(1995. Трансгенные растения, экспрессирующие продукт гена virE2, способны дополнять мутантов VirE у Agrobacterium, подтверждая тем самым, что протеин VirE2 играет важную роль в растительной клетке (см. обзор Zupan иVirC. В контексте настоящего описания понятие VirС относится к локусу VirС Ti- иRi-плазмиды, который кодирует два полипептида VirС 1 и VirС 2 (Yanofsky M.F. и Nester E.W.tumefaciens, J. Bacteriol. 168: 237-243 (1986. Было показано, что этот локус усиливает разрыв пограничной последовательности Т-ДНК вAgrobacterium, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),85(22): 8558-8562 (1988. Также было показано,что VirC1 усиливает производство Т-цепи в гетерологичной системе E.coli, если ограничено количество продуктов генов VirD1 и VirD2 (Deproduction in E.coli, Molec. Plant Microbe Inter. 2: 42-52 (1989. Хотя с помощью аффинной хроматографии ДНК было показано, что VirC1 взаимодействует с октопиновыми, усиливающими перенос (overdrive) последовательностями, точная функция VirC1 остается неизвестной. Он может связываться с VirD1 и VirD2 или с повтором пограничной последовательности и/или с усиливающей перенос последовательностью, способствуя разрыву и производству Тцепи (Toro N. и др., The Agrobacteriumtumefaciens virC1 gene product binds to overdrive,a T-DNA transfer enhancer, J. Bacteriol. 171: 6845-6849 (1989. Пограничные последовательности Т-ДНК. В контексте настоящего описания понятие пограничные последовательности Т-ДНК относится к неполным прямым повторам последовательностей ДНК длиной приблизительно 25 пар оснований, которые благодаря своему присутствию на обоих концах фрагмента ДНК приводят к тому, что фрагмент распознается как ТДНК, и действуют аналогично протеинамAgrobacterium. Пограничные последовательности Т-ДНК, расположенные на каждом из концов Т-ДНК, условно обозначают как левая и правая. Консенсусная последовательность для правой пограничной последовательности представляет собой 5'-GNNTGNCAGGATATATNNNNNNGTNAN-3' (SEQ ID NO:1), а консенсусная последовательность для левой пограничной последовательности представляет собой 5' 9(SEQ ID NO:2) (Jouanin и др., Plant Mol. Biol. 12: 75-85 (1989. Любой фрагмент ДНК между этими пограничными последовательностями переносится из Agrobacterium в растительную клетку (см. обзор Zambryski P.C., Chroniclesstory, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465-490 (1992. Изучение Т-ДНК различных трансформированных линий растений позволило установить, что интеграция Т-ДНК в геном растения часто происходит на этих повторах пограничных последовательностей (для правой пограничной последовательности) или около них (для левой пограничной последовательности)Ohta и др.,Plant J. 7: 157-164 (1995); Koncz и др.,Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 8467-8471 (1989. Несмотря на структурные сходства между левой и правой пограничными последовательностями исследования функций пограничных последовательностей показало, что пограничные последовательности Т-ДНК функционируют по-разному. Делеция или инверсия правой пограничной последовательности приводит к практически полному прекращению переноса ТДНК, тогда как делеция повтора левой пограничной последовательности практически не оказывает на него влияния (Shaw C.H. и др.,The right hand copy of the nopaline Ti plasmid 25Natl. Acad. Sci. (USA), 83: 3895-3899 (1986. Генетический анализ показал, что перенос ТДНК является полярным, причем полярность определяется ориентацией повторов пограничной последовательности (Wang и др., Cell 38: 455-462 (1984); Peralta и Ream, Proc. Natl. Acad.Sci. 82: 5112-5116 (1985. Вероятно, это обусловлено тем фактом, что Т-цепь формируется в направлении справа налево (Albright и др.,Processing of the T-DNA of Agrobacteriumtumefaciens generates border nicks and linear,single-stranded T-DNA, J. Bacteriol. 16: 10461055 (1987. Последовательности-контексты,окружающие пограничные последовательности ТДНК, оказывают сильное влияние на их активность. Последовательности, окружающие правую пограничную последовательность, усиливают, а последовательности, окружающие левую пограничную последовательность, ослабляют полярный перенос ДНК (Wang K. и др.,Sequence context of the T-DNA border repeat 10 338-346 (1987. Цис-активная последовательность длиной 24 пары оснований, называемая усилителем переноса, расположена рядом с правой пограничной последовательностью октопиновой плазмиды (Peralta и др., EMBO J., 5: 11371142 (1986); Shurviton и Ream, J. Bacteriol. 173: 5558-5563 (1991. Усилитель переноса стимулирует перенос Т-ДНК даже в том случае, когда он расположен на расстоянии нескольких тысяч пар оснований от пограничной последовательности (Van Haaren M.J.J. и др., Overdrive is a Tregion transfer enhancer which stimulates T-strandproduction in A. tumefaciens, Nucleic Acids Res. 15: 8983-8997 (1987. Однако он сам по себе не может опосредовать перенос Т-ДНК (PeraltaBiol. 8: 95-104 (1987. Усиливающая перенос последовательность первоначально локализована на участке справа от повтора левой пограничной последовательности TL-ДНК октопиновой Ti-плазмиды. Аналогичные последовательности присутствуют рядом с повтором правой пограничной последовательности TR-области октопиновой Ti-плазмиды (pTi) и TL- и TRобластей агропиновой Ri-плазмиды (pRi)A4, Plant Mol. Biol. 12: 75-85 (1989. Сравнение последовательностей вблизи правой пограничной последовательности позволило выявить участок длиной 8 пар оснований, названный коровой (сердцевинной) последовательностью(5'-TGTTTGTT-3') и располагающийся на различных расстояниях справа от каждого повтора правой пограничной последовательности. Правая пограничная последовательность Т-ДНК плазмиды pRi8196 маннопинового типа не содержит никакой последовательности, сходной с усиливающей перенос последовательностью, но содержит другую последовательность длиной 8 пар оснований (5'-ATTAGTTC-3'), повторяющуюся 6 раз (Hansen G. и др., AgrobacteriumAcad. Sci. (USA), 88: 7763-7767 (1991. Вероятно, эта последовательность функционально эквивалентна усилителю переноса (Hansen G. и др., A T-DNA transfer enhancer sequence in the(1992. Из литературы неизвестно о существо 11 вании последовательности, очень похожей на усиливающую перенос последовательность вблизи нопалиновых пограничных последовательностей Т-ДНК (Wang K. и др., Sequencetransfer to plant cells, Mol. Gen. Genet. 210: 338346 (1987, но это не исключает того, что некоторая последовательность, присутствующая на этом участке, играет аналогичную роль. Используемая в примерах правая пограничная последовательность длиной 25 пар оснований получена из pTiAch5 (Van Haaren M.J.J.,Plant Mol. Biol. 13: 523-531 (1989. Левая пограничная последовательность, присутствующая в плазмиде pNeoRBluc, получена из pTiT37(Bevan, Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721 (1984. Хотя было показано, что последовательности, соседние с правой пограничной последовательностью, могут усиливать перенос ДНК в растительную клетку, в экспериментах, описанных в примерах, выбирали минимальную длину правой пограничной последовательности с той целью, чтобы минимизировать возможное нарушение экспрессии гена люциферазы. Однако могут быть использованы и более длинные правые пограничные последовательности, содержащие последовательность, которая подобна энхансерной последовательности, такую как усилитель переноса. Химерные гены, обладающие способностью продуцировать в эукариотической клетке протеин, который обеспечивает интеграцию представляющей интерес ДНК, могут быть сконструированы с использованием стандартных методов генетической инженерии, как это описано в примерах. Такой химерный ген должен состоять из последовательности ДНК, кодирующей протеин и функционально связанной с соответствующими регуляторными сигнальными последовательностями (например, с промотором, лидерной последовательностью, терминатором транскрипции, сайтом полиаденилирования), которые управляют экспрессией функционально связанной кодирующей последовательности в эукариотической клетке. Такие кодирующие последовательности и регуляторные сигнальные последовательности хорошо известны в данной области. Для улучшения экспрессии обеспечивающего интеграцию протеина можно использовать синтетический вариант кодирующей последовательности, оптимизированной для экспрессии в эукариотической клетке-мишени. мРНК, обладающие способностью продуцировать в эукариотической клетке обеспечивающий интеграцию протеин, могут быть сконструированы с использованием стандартных систем, предназначенных для получения транслируемых кэппированных транскриптов поли(A)-мРНК, кодирующих требуемый протеин,как это проиллюстрировано в примерах. 12 Для специалиста в данной области очевидно, что экзогенная ДНК и химерный(ые) ген(ы) или РНК, кодирующие протеин(ы), которые обеспечивают стабильную интеграцию экзогенной ДНК, могут быть введены в растительную клетку различными путями с использованием стандартных методов, применяемых в данной области. Конкретный способ, с помощью которого эти компоненты вводятся в эукариотическую клетку, не имеет решающего значения,поскольку протеин(ы), которые обеспечивают стабильную интеграцию экзогенной ДНК, продуцируются в той же самой клетке фрагментом экзогенной ДНК в течение соответствующего периода времени, как описано ниже. Для достижения положительного эффекта,а именно, для обеспечения стабильной интеграции фрагмента экзогенной ДНК в интактной форме, не является необходимым, чтобы протеины, обеспечивающие этот эффект, продуцировались в эукариотической клетке либо до того, как фрагмент экзогенной ДНК введен в эукариотическую клетку, либо после того, как экзогенная ДНК была интегрирована в эукариотическую клетку. Единственным необходимым требованием, которым должны удовлетворять эти протеины, является их продуцирование в растительной клетке таким образом, чтобы они присутствовали в достаточных количествах во время переходного периода после того, как фрагмент экзогенной ДНК введен в эукариотическую клетку, и до того, как экзогенная ДНК была интегрирована. Может быть применен любой метод переноса химерного гена или транслируемой РНК в эукариотическую клетку, который обеспечивает продуцирование кодируемого протеина в течение соответствующего периода времени. Как видно из представленных в настоящем описании примеров, один из способов, позволяющих достичь производства достаточных количеств этих протеинов в течение соответствующего периода времени, состоит в интродукции кодирующего протеин химерного гена или транслируемой РНК в эукариотическую клетку вместе с экзогенным фрагментом ДНК (т.е. одновременный перенос компонентов). Этот способ является предпочтительным потому, что он включает однократный перенос молекул нуклеиновых кислот (ДНК или ДНК и РНК) в эукариотическую клетку, предназначенную для трансформации. Другое потенциальное преимущество этого способа состоит в том, что он может использоваться для кратковременного производства обеспечивающего интеграцию протеина в течение соответствующего периода времени, а не для стабильного производства,что может оказывать вредное воздействие на нормальный рост и развитие эукариотической клетки. Одним из объектов настоящего изобретения является способ достижения стабильной 13 трансформации растительной клетки с помощью интактного фрагмента экзогенной ДНК,связанного с пограничными последовательностями Т-ДНК, в результате чего имитируется опосредуемая Т-ДНК Agrobacterium трансформация. В соответствии с этим объектом изобретения в растительную клетку, подлежащую трансформации, вводятся следующие компоненты: а) фрагмент представляющей интерес экзогенной ДНК, подлежащий интегрированию в геном растительной клетки, причем этот фрагмент связан с одной или более пограничными последовательностями Т-ДНК (для эффективного переноса Т-ДНК, в частности, кольцевой ТДНК, у которой одна пограничная последовательность может выполнять функции как правой, так и левой пограничной последовательности, может оказаться достаточно одной пограничной последовательности Т-ДНК), и б) по крайней мере, один химерный ген или РНК, причем каждый такой химерный ген или РНК способен(а) продуцировать в растительной клетке протеин, который происходит изAgrobacterium и который либо индивидуально,либо в комбинации с другими такими протеинами обеспечивает стабильную интеграцию фрагмента экзогенной ДНК в интактной форме. Происходящий из Agrobacterium протеин,который продуцируется в растительной клетке в соответствии с этим объектом изобретения,включает протеины, происходящие из вирулентного участка Ti- или Ri-плазмидыAgrobacterium, но не ограничен ими. В частности, он включает VirC1, VirC2, VirD1, VirD2 иAgrobacterium, в растительной клетке приводит к предсказуемой целевой интеграции экзогенной ДНК в виде ее интактного фрагмента. Образовавшаяся трансформированная растительная клетка содержит фрагмент экзогенной ДНК,сходный с Т-ДНК Agrobacterium и интегрированный в ее геном. Химерные гены, способные продуцировать происходящий из Agrobacterium протеин, могут быть сконструированы с использованием стандартных методов генетической инженерии, как это проиллюстрировано в примерах. Такой химерный ген должен состоять из последовательности ДНК, кодирующей происходящий изAgrobacterium протеин и функционально связанной с соответствующими регуляторными сигнальными последовательностями (например,с промотором, лидерной последовательностью,терминатором транскрипции, сайтом полиаденилирования), которые управляют экспрессией функционально связанной кодирующей последовательности в растительной клетке. Такие 14 кодирующие последовательности и регуляторные сигнальные последовательности хорошо известны в данной области. Кодирующие последовательности VirD1 и VirD2, которые были использованы в примерах, помещены в GenBank и имеют регистрационный номер M14762. РНК, обладающие способностью продуцировать в растительной клетке происходящий изAgrobacterium протеин по изобретению, могут быть сконструированы с использованием стандартных систем, предназначенных для получения транскриптов транслируемой кэппированной поли-(A)-мРНК, кодирующих требуемый протеин, как это проиллюстрировано в примерах. Фрагмент экзогенной ДНК, предназначенный для интеграции в соответствии с этим объектом изобретения, может представлять собой любой фрагмент ДНК, который требуется интегрировать в интактной форме в геном растительной клетки, такой как химерный ген, сконструированный для экспрессии определенной биологически активной РНК (например, антисмысловой РНК или рибозима) или представляющего интерес протеина в растительной клетке или в образовавшемся растении либо в культуре клеток растения. Единственным требованием является то, чтобы фрагмент был связан с одной или более пограничными последовательностями Т-ДНК таким образом, чтобы его можно было распознать и чтобы на него могли действовать протеины VirD1 и VirD2. Присоединение таких пограничных последовательностей Т-ДНК к фрагменту экзогенной ДНК описано в примере 1. Любой эукариотический организм, восприимчивый к переносу нуклеиновых кислот с помощью одного или более различных механизмов, известных в данной области, может быть использован в качестве мишени для трансформации в соответствии с настоящим изобретением. Он включает грибы, дрожжи,клетки животных и, прежде всего, растительные клетки. Для дрожжей был описан перенос ТДНК (см. Piers и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 1613-1618 (1996. Для клеток животных была описана локализация VirD1 и VirD2 (после модификации их сигналов локализации) в клеточных ядрах (см. Guralnick и др., Plant Cell 8: 363373 (1996. Методы переноса нуклеиновых кислот в различные клетки животных хорошо известны в данной области (см., например,Current Protocols in Molecular Biology, т. 1-3,ред. Ausubel F.M. и др., изд. John WileySons,Inc. (1995); см., в частности, главу 9Introduction of DNA into Mammalian Cells). Описанный способ трансформации приводит к получению полного набора или коллекции трансформированных клеток, обычно выявляемых по экспрессии маркерного гена. Последующая регенерация клеток в растения приводит к получению полного набора или коллекции 15 трансформированных растений. Полный набор как трансформированных растительных клеток,так и регенерированных из них трансформированных растений может быть охарактеризован на основе данных о природе случаев их интеграции. Набор клеток или растений в соответствии с настоящим изобретением характеризуется тем, что более 5% отдельных растительных клеток или растений включают представляющую интерес ДНК, соединенную с геномной ДНК с помощью правых пограничных последовательностей Т-ДНК Agrobacterium, как если бы их трансформировали с использованием опосредуемого Agrobacterium заражения (агроинфекции). Предпочтительно указанное количество составляет более 10%. Обычно это количество составляет 5-70%, более предпочтительно 1050%. Набор трансформированных растительных клеток или растений обычно базируется на 10 или более независимых случаях трансформации. Один из предпочтительных экспериментов по физической трансформации приводит к получению более чем 20, 30, 40 или 50 независимых случаев трансформации. Наборы трансформированных клеток и растений, а также потомство индивидуальных растительных клеток или растений составляют еще один объект настоящего изобретения. Растения, представляющие собой потенциальные мишени, включают как однодольные,так и двудольные растения или их растительные клетки соответственно, в частности важные в сельскохозяйственном отношении культурные растения, такие, как кукуруза и другие зерновые культуры, например, пшеница, овес, рожь, сорго, рис, ячмень, просо, дернообразующие и кормовые травы и т.п., а также хлопчатник, сахарный тростник, сахарная свекла, масличный рапс,бананы, тополь, орех, табак и соя. Любой тип или источник растительных клеток, которые могут служить в качестве мишени для трансформации с помощью одного или нескольких различных биологических и небиологических механизмов переноса, известных в данной области, может служить в качестве мишени для трансформации в соответствии с настоящим изобретением. Они включают, но не ограничены ими, незрелые и зрелые зародыши,пыльцу, протопласты, суспензионную культуру клеток, клетки каллюса, семядоли или другой семянной материал, части проростков и листья или кусочки листьев. Трансформированные растительные клетки, полученные с использованием способа по изобретению, должны содержать интегрированную интактную экзогенную представляющую интерес ДНК. Эта интегрированная экзогенная ДНК может включать части пограничных последовательностей Т-ДНК, обычно сохраняющиеся на интегрированной ДНК после осуществления встраивания Т-ДНК. Трансформированные растительные клетки, полученные с исполь 001039 16 зованием способа по изобретению, могут использоваться для получения культур трансгенных растительных клеток и фертильных трансгенных растений в соответствии со стандартными методами, хорошо известными в данной области. Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ получения фертильного трансгенного растения, несущего фрагмент экзогенной ДНК, связанный с пограничными последовательностями Т-ДНК и стабильно интегрированный в интактной форме в геном растения, включающий: а) трансформацию или интеграцию экзогенной ДНК в геном растительной клетки в соответствии со способом по изобретению и б) регенерацию растительной клетки, полученной на стадии а), с получением фертильного трансгенного растения. Предпочтительно фертильное трансгенное растение выбирают из группы, включающей табак, хлопчатник, масличный рапс, сою, кукурузу, пшеницу и рис. Генетические особенности, созданные в трансгенных растениях и полученных от них семенах с помощью методов генетической инженерии, передаются при половом размножении или вегетативном росте и, таким образом, могут сохраняться и передаваться по наследству потомству этих растений. Обычно это сохранение и передачу по наследству осуществляют с использованием известных сельскохозяйственных методов, таких как обработка почвы, посев или сбор урожая, разработанных специально с учетом этих целей. Также могут применяться специальные способы, такие как гидропоника или методы культивирования в закрытом грунте. Поскольку выращиваемая сельскохозяйственная культура подвержена нападению и повреждениям, вызванным насекомыми или инфекциями, а также конкуренции со стороны сорных растений, с целью повысить урожайность должны быть предприняты соответствующие меры для борьбы с сорными растениями, болезнями растений, насекомыми, нематодами и другими вредными воздействиями. Они включают механические способы, такие как обработка почвы или удаление сорняков и зараженных растений,а также внесение средств защиты растений, таких как гербициды, фунгициды, гаметоциды,нематоциды, регуляторы роста, агенты, способствующие созреванию, и инсектициды. Полезные генетические свойства трансгенных растений и семян по изобретению далее могут быть использованы при селекции растений с целью создания растений с улучшенными свойствами, такими как устойчивость к вредителям, гербицидам или стрессу, улучшенная питательная ценность, повышенная урожайность или улучшенное строение, вызывающее снижение потерь от полегания или осыпания. Различные стадии селекции, такие как отбор 17 подлежащих скрещиванию линий, направленное опыление родительских линий или отбор соответствующих растений-потомков, характеризуются продуманным вмешательством человека. В зависимости от требуемых свойств выбирают различные методы селекции. Пригодные методики хорошо известны в данной области и включают гибридизацию, инбридинг, обратное возвратное скрещивание, скрещивание многих линий, смешивание сортов, межвидовую гибридизацию, методы анеуплоидии и т.д., но не ограничены ими. Методы гибридизации также включают стерилизацию растений с получением стерильных мужских или женских растений с использованием механических, химических или биохимических способов. Перекрестное опыление стерильного мужского растения пыльцой другой линии обеспечивает то, что геном стерильного мужского, но фертильного женского растения неизменно приобретет свойства обеих родительских линий. Так, трансгенные семена и растения в соответствии с изобретением вследствие измененения их генетических свойств могут применяться для селекции улучшенных линий растений, которые позволяют, например,увеличить эффективность обычных методов,таких как обработка гербицидом или пестицидом, или исключить применение этих методов. В альтернативном варианте могут быть получены новые культурные растения с улучшенной устойчивостью к стрессу, которые вследствие их оптимизированного генетического оснащения дают урожай продуктов лучшего качества по сравнению с растениями, которые не обладают сопоставимой способностью сопротивляться вредным условиям при их развитии. При производстве семян качество прорастания и однородность семян являются важными характеристиками продукта, в то время как для семян, собираемых и продаваемых фермером,качество прорастания и однородность не являются важными. Поскольку трудно выращивать культурное растение вне контакта с семенами другого культурного и сорного растения, для борьбы болезнями, которые передаются с семенами, и для получения семян с хорошим прорастанием производителями, занимающимися выращиванием, кондиционированием и продажей чистых семян, разработаны многочисленные и продуманные способы производства семян. Так, обычно фермер практикует покупку сертифицированного семенного материала,удовлетворяющего определенным стандартам качества, а не использует семенной материал,полученный от его собственной культуры. Материал для размножения, который используют в качестве семенного материала, обычно обрабатывают защитным покрытием, включающим гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскициды или их смеси. Обычно применяемые защитные покрытия 18 включают такие соединения, как каптан, карбоксин, тирам (TMTD), металаксил (Apron) и пиримифосметил (Actellic). При необходимости эти соединения изготавливают в виде препаративной формы вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или способствующими нанесению адъювантами, обычно применяемыми в технике приготовления препаративных форм, предназначенных для защиты от повреждения, вызванного бактериями, грибами или вредителями. Защитные покрытия могут быть нанесены путем пропитывания материала для размножения жидкой композицией или путем покрытия комбинированной влажной или сухой композицией. Также возможны другие способы нанесения,такие как обработка почек или плодов. Еще одним объектом настоящего изобретения являются новые сельскохозяйственные методы, такие как методы, примеры которых приведены выше, характеризующиеся использованием трансгенных растений, материала трансгенного растения или трансгенных семян в соответствии с настоящим изобретением. Для специалиста в данной области техники очевидно, что компоненты, применяемые при реализации этого способа (т.е. экзогенная ДНК и химерные гены или РНК, кодирующие протеины, которые обеспечивают интеграцию экзогенной ДНК) могут быть введены в растительную клетку различными путями с использованием стандартных методов, применяемых в данной области. Конкретный метод, с помощью которого эти компоненты вводятся в растительную клетку, не имеет решающего значения, поскольку протеин(ы), который(е) обеспечивает(ют) стабильную интеграцию экзогенной ДНК, продуцируется(ются) в течение соответствующего периода времени, как описано выше. Точное количество каждого компонента,вводимого в растительную клетку, также не имеет решающего значения и может варьироваться в зависимости от способа и формы, в которой введен компонент. При необходимости специалист в данной области может на основе общеизвестных способов изменять количество каждого вводимого компонента, определяя оптимальный уровень для каждой применяемой определенной системы переноса. В примере 1 описана эффективная комбинация, которая может служить в качестве исходной точки для дальнейшей оптимизации. Введение компонентов в соответствии с этим способом в растительную клетку может быть осуществлено с помощью различных методик, применяемых в данной области для введения нуклеиновых кислот в растительную клетку, включающих биологические механизмы, такие как опосредуемая Agrobacterium трансформация Т-ДНК (см., например, WO 95/35388,озаглавленную 19 небиологические механизмы, такие как бомбардировка микроснарядами, электропорация, микроинъекция, индуцированное поглощение и инъекция с помощью струи аэрозоля, но необязательно ограниченных ими. В предпочтительном варианте для введения в растительную клетку-реципиент всех компонентов в соответствии с этим способом(т.е. экзогенной ДНК и химерных генов или РНК, кодирующих протеины, которые обеспечивают интеграцию экзогенной ДНК) используется метод одновременного переноса. Предполагается, что мРНК, кодирующая обеспечивающий интеграцию протеин, вводимый в соответствии с изобретением, будет продуцировать кодируемый протеин в растительной клетке в течение конечного периода времени до его расщепления. Предполагается, что протеин, продуцируемый этой мРНК, сохраняется в этой растительной клетке в течение конечного периода времени до того, как он также будет расщеплен в результате обычных клеточных процессов. Таким образом, в соответствии с предлагаемым способом эти протеины могут вводиться в растительную клетку на ограниченный период времени в форме РНК. Кратковременное введение этих протеинов может осуществляться в тех случаях, когда постоянное присутствие таких протеинов может оказывать нежелательные воздействия. Такого же эффекта можно достичь путем введения химерного гена,кодирующего протеин, обеспечивающий интеграцию, в форме, которую нельзя легко интегрировать в геном растительной клетке в функциональном активном состоянии. В тех случаях, когда обеспечивающие интеграцию протеины вводятся в клетку посредством химерного гена, соответствующие химерные гены предпочтительно вводятся совместно с фрагментом экзогенной ДНК в виде отдельных молекул ДНК, хотя различные компоненты могут быть объединены и введены в виде одной молекулы ДНК. Перенос в виде отдельных молекул ДНК позволяет изменять и оптимизировать соотношение химерного гена и фрагмента экзогенной ДНК. По-видимому, также может оказаться более целесообразным создание этих конструкций на отдельных молекулах. Можно предположить, что стабильное включение таких химерных генов в геном посредством случайной интеграции будет происходить с частотой, соизмеримой с таковой для направленной интеграцией экзогенной ДНК,связанной с пограничными последовательностями Т-ДНК. С целью облегчить отделение таких вариантов случайной интеграции от направленной интеграции экзогенной ДНК химерные гены, кодирующие обеспечивающие интеграцию протеины, предпочтительно могут быть введены в виде индивидуальной молекулы ДНК отдельно от экзогенной ДНК. При использовании этого подхода копии химерных генов, веро 001039 20 ятно, будут интегрироваться в локусы, отличные от таковых при направленной интеграции экзогенной ДНК, связанной с пограничными последовательностями Т-ДНК. В результате с помощью последующей селекции растений, полученных из трансформированных растительных клеток, более легко осуществить отделение случаев направленной интеграции с использованием экзогенной ДНК от случайным образом интегрированных генов VirD1 и VirD2. В предпочтительном варианте осуществления в качестве переносчика для введения химерного гена или РНК, кодирующей обеспечивающий интеграцию протеин, в растительную клетку ДНК используют вектор, представляющий собой растительный вирус. Такие векторы могут быть сконструированы из репликонов ДНК растительного вируса,таких как репликоны геминивирусов (Ugaki M.,Nucleic Acids Research, 19: 371-377 (1984, и векторов на основе РНК-содержащих вирусов(Sablowski R.W., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 69016907 (1995 для включения и экспрессии требуемой ДНК или РНК в растительной клетке. В результате того, что эти векторы обычно реплицируются в растительной клетке-мишени, происходит амплификация химерного гена или РНК, встроенных в такие векторы, и увеличение количества продуцируемого ими протеина. Также можно предположить, что вирусные векторы этого типа не будут интегрироваться в геном растительной клетки, поскольку вирусные репликоны, от которых они происходят, обычно не способны к этому. Таким образом, преимуществом этого метода является ограниченное по времени продуцирование больших количеств обеспечивающих интеграцию протеинов, что снижает риск интеграции химерных генов, кодирующих такие протеины. Также преимуществом может являться системное применение таких вирусных векторов для предварительного заражения подлежащих трансформации растительных клеток. Этот подход позволяет вводить экзогенную ДНК, предназначенную для интеграции, в больших количествах, избегая тем самым необходимости совместного переноса ДНК или РНК, кодирующей обеспечивающий интеграцию протеин или протеины. Вектор, представляющий собой растительный вирус, также может использоваться в качестве переносчика для введения подлежащего интеграции фрагмента экзогенной ДНК в растительную клетку. Поскольку эти векторы обычно реплицируются в растительной клетке-мишени,при таком их применении происходит амплификация матриц фрагмента экзогенной ДНК в количестве, пригодном для интеграции. Когда вектор, представляющий собой растительный вирус, применяют для введения в растительную клетку как фрагмента экзогенной ДНК, подлежащего интеграции, так и химерного гена, кодирующего обеспечивающий инте 21 грацию протеин, то для введения обоих компонентов может использоваться один и тот же вирусный вектор или могут применяться два отдельных вирусных вектора. Когда для введения вирусного(ых) вектора(ов) в растительную клетку применяют метод опосредуемойAgrobacterium трансформации, этот подход называют агроинфекцией (см. Grimsley и др.,Nature, 325: 177-179 (1987. В качестве варианта, альтернативного совместному введению химерных генов, кодирующих обеспечивающие интеграцию протеины, и экзогенной ДНК, последняя может быть введена в трансгенную растительную клетку,уже содержащую эти химерные гены, стабильно включенные в ее геном. В качестве источника таких трансгенных растительных клеток могут использоваться трансгенные растения или культуры клеток трансгенных растений, полученные путем трансформации с использованием стандартных методов с помощью молекул ДНК,включающих химерные гены, кодирующие обеспечивающие интеграцию протеины. При использовании этого подхода случаи направленной интеграции введенной экзогенной ДНК могут быть отделены от стабильно интегрированных химерных генов путем последующей селекции растений, полученных из трансформированных растительных клеток (см., например,Peerbolte R. и др., Transformation of plantsegregation of transforming DNA sequences,Plant. Mol.Biol. 5(4): 235-246 (1985. Несмотря на то, что настоящее изобретение изложено в данном описании с использованием понятий трансформации одной растительной клетки, для специалиста в данной области очевидно, что способы введения, на которых основано изобретение (за исключением метода микроинъекции), обычно применяют для популяции растительных клеток в виде культуры клеток, каллюса или ткани, полученной из целого растения. Вследствие этого были разработаны различные методики, пригодные для использования вместе с этими методами введения, для идентификации и/или отбора стабильно трансформированных растительных клеток из смешанной популяции трансформированных и нетрансформированных растительных клеток (см.markers for rice transformation, Plant Physiol.,90(1): 217-223 (1989. Таким образом, эти методики также могут использоваться в данном изобретении. Предполагается, что по отношению к такому компоненту, как экзогенная ДНК,трансформация растительных клеток в соответствии со способом по настоящему изобретению с использованием небиологических методов переноса должна приводить к двум основным типам случаев интеграции: (1) простая инсерция интактного фрагмента экзогенной ДНК, связан 001039 22 ного с пограничными последовательностями ТДНК, направляемая присутствием протеина(ов),обеспечивающих такие случаи интеграции, и (2) случайная инсерция различных частей и перестановка экзогенной ДНК, характерных для применяемого небиологического метода переноса. Эти два типа случаев интеграции могут быть легко различены при применении к геномной ДНК трансформированных растительных клеток стандартных аналитических методов молекулярной биологии, таких как гибридизация методом Саузерн-блоттинга расщепленной геномной ДНК с использованием фрагмента экзогенной ДНК или его субфрагмента в качестве зонда, и методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), предназначенные для обнаружения присутствия фрагмента экзогенной ДНК в интактной форме. При использовании растительных клеток, которые содержат оба типа случаев инсерции, эти типы могут быть разделены в полученных из них трансгенных растениях с помощью традиционных методов селекции. С использованием этих методов трансгенные растительные клетки или растения,имеющие простую инсерцию интактного фрагмента экзогенной ДНК, связанного с пограничными последовательностями Т-ДНК, полученные в соответствии с описанием настоящего изобретения, могут быть идентифицированы и применяться для получения культур клеток трансгенных растений и/или трансгенных растений и их потомства. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено улучшенными системами интеграции, основанными на системе переноса Т-ДНК Agrobacterium. Для увеличения частоты случаев простой интеграции в эукариотической клетке, подлежащей трансформации, в соответствии с настоящим изобретением могут быть модифицированы дополнительные системы, в которых используются обеспечивающие интеграцию протеины и узнаваемые последовательности, аналогичные протеинам Vir и пограничным последовательностям Т-ДНК. Например,накопленные данные позволяют предположить,что существует тесная зависимость между переносом Т-ДНК из Agrobacterium в растения и опосредуемый плазмидой бактериальной конъюгацией. Было обнаружено сходство последовательностей между: (I) участками одноцепочечных разрывов (ников) Т-пограничных последовательностей и началом переноса incP, (II) кластерами генов оперона VirD и оперона релаксазы (TraI/TraJ). TraI и VirD2, а также их мишени участок одноцепочечного разрыва RP4 oriT и повторы Т-пограничной последовательности соответственно - обладают значительным сходством (cм. WO 88/03564, озаглавленную PlantTransformation). В опытах in vitro было установлено, что каждого из TraI и VirD2 достаточно для образования одноцепочечных разрывов в одноцепочечных олигонуклеотидах, несущих 23 соответствующие родственные сайты одноцепочечных разрывов (см. Pansegrau и др., Proc.Natl. Acad. Sci. (USA), 90: 11538-11542 (1993. В присутствии избытка продуктов расщепленияTraI и VirD2 также могут катализировать обратную реакцию, соединяя два участка одноцепочечной ДНК. VirD2 также способен катализировать расщепление oriT. Функциональное сходство также обнаружено между протеинами геминивируса Rep или протеинами, участвующими в репликации бактериальных фагов и плазмид по типу разматывающегося рулона, а также между протеинами, участвующими в переносе ДНК при бактериальной конъюгации или в переносе и интеграции Т-ДНК из Agrobacterium в геном растения (Heyraud-Nitschke F. и др., Nucl.Acids Res. 910-916 (1995. Описание чертежей На фиг. 1 (А-Б) приведены структуры плазмид, применяемых в экспериментах, описанных в примере 1. Компоненты этих плазмид описаны в разделе Материалы и методы примера 1. RB обозначает правую пограничную последовательность длиной 25 пар оснований. Сайты рестрикции обозначены следующим образом: E = EcoRI; P = PstI. На фиг. 2 представлена схематическая диаграмма плазмиды pNeoRBLuc. LB обозначает левую пограничную последовательность, а RB обозначает правую пограничную последовательность. Прямоугольниками над диаграммой обозначены зонды, применяемые для анализа трансформантов методом Саузерн-блоттинга. Сайты рестрикции обозначены следующим образом: E = EcoRI; P = PstI; X = XbaI; H = HindIII.NPTII обозначает открытую рамку считывания неомицинфосфотрансферазы II. NOS T обозначает терминатор нопалинсинтазы. CaMV 35S обозначает промотор вируса 35S мозаики цветной капусты (CaMV). LUC обозначает открытую рамку считывания люциферазы. 35ST обозначает терминатор транскрипта CaMV 35S. На фиг. 3 представлен анализ последовательности сайтов растительной ДНК-мишени после трансформации с помощью плазмидpNeoRBLuc, p35SD1 и p35SD2. Номера соответствуют номерам, обозначающим клонымишени. Правая пограничная последовательность, входящая в pNeoRBLuc, написана прописными буквами (ряд соединительного участка(X62426; 908 нуклеотидов), 100%-ной гомологией с NtpII табака (X70088; 573 нуклеотида),100%-ной гомологией с рибулозо-1,5 бифосфаткарбоксилазой табака (X02353; 2174 нуклеотида) и 80%-ной гомологией с хлорофиллсвязывающим протеином петуньи (M21317; 1013 нуклеотидов). 24 На фиг. 4 (А-Е) представлены карты плазмид, применяемых в примерах 3 и 4. Используемые сокращения описаны в разделе Материалы и методы примера 3. На фиг. 5 (А-Б) представлены схематические изображения плазмид pwAdhD1, pwAdhD2,pwBarRBLuc и pBARRBLuc, применяемых в примере 5. На фиг. 6 - схематическое изображение плазмиды pCIB1711 (см. пример 1). На фиг. 7 - схематическое изображение плазмиды pCIB1711deltaB (см. пример 7). На фиг. 8 - схематическое изображение плазмиды pCIB1711deltaB-H,N (см. пример 7). На фиг. 9 - схематическое изображение плазмиды pCIB1711-H,N-B (см. пример 7). На фиг. 10 - схематическое изображение плазмиды pCIB1711-H,N (см. пример 7). На фиг. 11 - схематическое изображение плазмиды pBS-NC (см. пример 7). На фиг. 12 - схематическое изображение плазмиды pBS-NC-RB (см. пример 7). На фиг. 13 - схематическое изображение плазмиды UbiPATdl (см. пример 7). На фиг. 14 - схематическое изображение плазмиды LB.UbiPATdl (см. пример 7). На фиг. 15 - схематическое изображение плазмиды pAVM1 (см. пример 7). На фиг. 16 - схематическое изображение плазмиды p35SD2 (см. пример 8). На фиг. 17 (А-Б) - схематическое изображение получения фрагментов A-C из EcoRIфрагмента p35SD2, содержащего открытую рамку считывания virD2 (см. пример 8). На фиг. 18 - схематическое изображение плазмиды pTC182 (см. пример 8). На фиг. 19 - схематическое изображение плазмиды pTC182-A (см. пример 8). На фиг. 20 - схематическое изображение плазмиды pTC182-A-B (см. пример 8). На фиг. 21 - схематическое изображение плазмиды pUC21 (см. пример 8). На фиг. 22 - схематическое изображение плазмиды pC21-X (см. пример 8). На фиг. 23 - схематическое изображение плазмиды pUC21-C (см. пример 8). На фиг. 24 - схематическое изображение плазмиды pUC21-virD2 (см. пример 8). На фиг. 25 - схематическое изображение плазмиды T7polyA (см. пример 8). На фиг. 26 - схематическое изображение плазмиды T7virD2polyA (см. пример 8). Примеры В настоящем описании использованы стандартные методики рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, хорошо известные в данной области и описанные у J.(1984). Пример 1. Агролистическая трансформация растительных клеток: интеграция Тцепей, образованных в растении после биобаллистического введения генов VirD1 и VirD2 и пограничного с Т-ДНК селектируемого маркерного гена. А. Краткое содержание. Вирулентные гены VirD1 и VirD2 необходимы для вырезания Т-цепей из Ti-плазмидыAgrobacterium tumefaciens перед введением в растительные клетки-хозяева, где Т-ДНК встраивается в ядерную ДНК растения. Для выявления связывания и/или сайтспецифического одноцепочечного расщепления пограничной последовательности Т-ДНК в растениях с помощью VirD1 и VirD2 применяли биобаллистическое введение плазмидных ДНК. Золотые микроснаряды покрывали смесью трех плазмид,содержащих соответственно кодирующие области VirD1 и VirD2, находящиеся под контролем промотора CaMV35S, и тестируемый ген,содержащий правую пограничную последовательность, встроенную между промоторомCaMV35S и кодирующей областью люциферазы. Для оценки целостности и способности к транскрипции тестируемого гена измеряли кратковременную экспрессию гена люциферазы. В клетках табака и кукурузы кратковременная экспрессия гена люциферазы в значительной степени ингибировалась при совместном введении плазмид, содержащих VirD1 и VirD2. Ингибирование возрастало при увеличении соотношения плазмид, содержащих гены VirD, и плазмиды, содержащей тестируемый ген. Выраженное ингибирование происходило только при одной ориентации пограничной последовательности, т.е. при ориентации, которая могла привести к одноцепочечному разрыву с помощью VirD2 цепи ДНК, которая является матрицей для мРНК люциферазы. Действие одногоVirD1 или одного VirD2 оказалось менее выраженным. Биобаллистическое введение трансформирующего вектора с селектируемым маркером и тестируемым геном люциферазы вместе со смесью плазмид, содержащих VirD, привела к получению среднего количества агролистических вставок (инсерций), у которых правые участки на стыке с ДНК растения имели точно такую же последовательность, которая ожидалась для случаев Т-ДНК-вставки. В некоторых трансформированных линиях были обнаружены как биобаллистические вставки,так и агролистические вставки. Б. Введение. Введение гена с помощью бомбардировки частицами стала общепринятым методом, который нашел широкое применение при трансформации растений (см. обзор Ahl Goy и Duesing,1995). Например, с помощью этого метода была получена кукуруза, устойчивая к мотыльку ку 001039 26 курузному (Koziel и др., 1993). При создании продукта должно учитываться строение и количество копий трансгенов, а также их стабильность. Наиболее предпочтительный продукт должен иметь одну простую вставку и не иметь чужеродных ДНК плазмидных векторов. Однако при трансформации растения путем бомбардировки частицами наблюдается тенденция к интеграции множественных копий интродуцированных генов, включая плазмидные векторы(Klein и др., 1988; Klein и др., 1989; GordonKamm W.J. и др., 1990; Vasil и др., 1992; Wan Y. и Lemaux P. 1994). Этот способ, вероятно, обеспечивает конкатемеризацию плазмиды, либо до,либо во время интеграции. Множественные копии, встроенные при биобаллистической трансформации, обычно являются генетически связанными и не могут быть расщеплены при последующей селекции. Множественные копии трансгенов могут привести к нестабильности их экспрессии в результате действия нескольких механизмов (см. обзор Matzke M. и Matzke A., 1995): множественные копии трансгенов могут взаимодействовать, инактивируя друг друга и родственные гены-хозяева с помощью эпигенетических механизмов, называемых, либо косупрессией,либо генетическим молчанием. Кроме того,гомологичная рекомбинация может привести к генетической нестабильности множественных копий. По этим причинам снижение количества копий встроенных трансгенов должно быть пригодным для поддержания точности воспроизведения интродуцированных генов. Схема интеграции чужеродных генов, интродуцированных посредством опосредуемойAgrobacterium трансформации, обычно значительно отличается от таковой, получаемой при бомбардировке растительных клеток частицами(обзор Chilton, 1993). Количество копий интактных и преобразованных трансгенов, получаемых при биобаллистическом введении, превышает, часто очень значительно, количество копий трансгенов, интродуцированных в растения с помощью системыAgrobacterium обладает развитым механизмом, с помощью которого переносимые гены локализуются на плазмидах, называемых опухолеродными (Ti) или индуцирующими избыточное разрастание корней (Ri) плазмидами (cм. обзорKado, 1993). Определенный сегмент ДНК Tiили Ri-плазмиды, называемый Т-ДНК (переносимая ДНК), который фланкирован на Ti/Riплазмиде пограничными последовательностями,состоящими из прямых повторов длиной 25 пар оснований, переносится от бактерии в ядро растительной клетки и интегрируется в хромосомную ДНК растения. Сложный механизм переноса ДНК кодируется сериями вирулентных (vir-) генов (см. обзор Zambryski, 1992). Активацияvir-генов приводит к образованию сайтспецифических одноцепочечных разрывов внутри 27 повторов пограничной последовательности ТДНК и продуцирует линейную одноцепочечную молекулу ДНК (Т-цепь), соответствующую нижней цепи Т-ДНК. Для образования одноцепочечных разрывов требуются два полипептида,кодируемые опероном VirD: VirD1 и VirD2(Ghai и Das, 1990; Filichkin и Gelvin, 1993), тогда как VirD2 обладает эндонуклеазной активностью, с помощью которой расщепляется нижняя цепь пограничной последовательности (Stachel и др., 1986; Yanofsky и др., 1986; Wang и др.,1987; Albright и др., 1987). В опытах in vitro также показано, что очищенный VirD2 специфично расщепляет одноцепочечную ДНК(Pansegrau и др., 1993; Jasper и др., 1994). Ни суперспиральная, ни релаксированная двухцепочечная ДНК не являются субстратом для расщепления одним VirD2 в опытах in vitroVirD2 оказывается ковалентно присоединенным к 5'-концу ДНК, имеющей одноцепочечный разрыв (Ward и Barnes, 1988; Young иNester, 1988; Howard и др., 1989), через тирозиновый остаток в положении 29 (Durrenberger и др., 1989; Vogel и Das, 1992; Pansegrau и др.,1993). Второе расщепление левой пограничной последовательности приводит к высвобождению Т-цепи. Кроме того, Т-цепь покрыта по всей ее длине одноцепочечным связывающим протеином VirE2. VirD2 и VirE2 содержат сигналы ядерной локализации (NLS), которые, повидимому, управляют Т-цепью в ядре растительной клетки (Herrera-Estrella, 1990; Howard и др., 1992; Shurvinton и др., 1992; Tinland и др.,1992; Rossi и др., 1993). NLS генов VirD2 иVirE2 выявлены в табаке и в кукурузе (Citovsky и др., 1992), но их эффективность зависит от стадии развития ткани. Современные данные подтверждают мнение, что VirD2 может участвовать в лигировании 5'-конца Т-цепи с ДНК растения (Tinland и др., 1995). В настоящем исследовании предложен новый способ трансформации растения, который объединяет определенные преимущества системы Agrobacterium и биобаллистической и других систем введения, для которых доказана высокая эффективность для широкого спектра культурных растений. Он предназначен для интеграции представляющего интерес гена без векторной последовательности, такой как ТДНК-вставка, и для контроля за количеством копий. Этот подход состоит в применении растительных кассет экспрессии для совместного введения генов VirD1 и VirD2 и трансформирующей плазмиды, содержащей пограничные последовательности Т-ДНК, фланкирующие селектируемый маркер. Было установлено, что 28 после биобаллистического введения экспрессируемые в течение определенного периода времени продукты генов VirD1 и VirD2 действительно могут расщеплять пограничные последовательности Т-ДНК в растении и вызывать инсерции Т-ДНК-типа (агролистические инсерции). В. Материалы и методы. 1. Плазмиды. Строение всех плазмидных вставок, использованных в данном исследовании, представлены на фиг. 1. Плазмида pCIB1711 происходит из плазмиды pUB и содержит ген люциферазы светляка, контролируемый промотором вируса мозаики 35S цветной капусты (CaMV35S). Конструирование pCIB1711 Плазмида pCIB1711 содержит ген люциферазы, связанный с сигналами экспрессии 35S. Родительский вектор pCIB710 (Rothstein и др.,1987) модифицировали до инсерции гена люциферазы, удаляя уникальные сайты рестрикцииPstI и NarI. Сайт PstI, локализованный против хода транскрипции относительно промотораCaMV, удаляли путем расщепления в соседних сайтах рестрикции SalI и SphI и лигирования с синтезированным линкером [5'-TCGACATG-3'] для восстановления сайта SalI и удаления сайтовSphI и PstI. Сайт NarI, локализованный на 3'конце полиаденилированных последовательностей CaMV, удаляли путем расщепления с помощью NarI и NdeI, вырезая фрагмент длиной 52 пары оснований, с последующим разложением фрагментом Кленова и лигированием тупых концов. Плазмиды pJD204 (Ow и др., Science,234: 856-859 (1986 и pDO0432 (De Wet и др.,Mol. Cell Biol., 7(2): 725-737 (1987 были получены от Dr. Donald Helinski и Dr. Steve Howell соответственно. Фрагмент HindIII-BamHI длиной 1826 пар оснований из pJD204, содержащий ген люциферазы, фрагмент длиной 22 пары оснований 5'-UTL ДНК гена люциферазы, фрагмент длиной 130 пар оснований 3'-конца этого гена, лигировали с синтетическим линкером,созданным из олигонуклеотидов 5'GATCCCTGCAGA-3' (SEQ ID NO: 3) и 5'AGCTTCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 4) в сайтеBamHI плазмиды pCIB710 таким образом, чтобы он находился между промотором 35S и сигналами полиаденилирования. В результате инсерции фрагмента гена люциферазы в модифицированный векторpCIB1701 с помощью PstI и NarI и лигирования образовавшейся плазмиду с линкером R5B1,содержащим лидерную последовательность и 5'конец гена. Линкер R5B1 состоит из фрагмента, полученного из следующих комплементарных олигомеров:(SEQ ID NO: 6). Для интродукции пограничных последовательностей Т-ДНК два синтетических олигонуклеотида, соответствующих правой пограничной последовательности LBA5269 (VanTAATTCTGCA-3' (SEQ ID NO: 7). Этот дуплекс, фланкированный сайтами BamHI-PstI,встраивали в соответствующие сайты pCIB1711 между промотором и последовательностью, кодирующей люциферазу, получая pRB(+)Luc. В плазмиду pRB(-)Luc интродуцировали правую пограничную последовательность в обратной ориентации относительно промотора. ПлазмидаpNeoRBLuc была сконструирована для стабильной трансформации суспензионных клеток табака, и она содержит левую пограничную последовательность, ген неомицинфосфотрансферазы (nptII) и ген люциферазы вместе с правой пограничной последовательностью, встроенной между промотором и кодирующей областью люциферазы из pRB(+)Luc (фиг. 2). Ген nptII,находящийся под контролем промотора nos (нопалинсинтаза), вырезали из плазмиды pBin19 в виде фрагмента SacII-HindIII длиной 2,2 т.п.н.(Bevan, 1984). Левую пограничную последовательность вырезали из плазмиды pBin19 в виде фрагмента BglII-EcorI. Оба эти фрагмента встраивали в сайты XbaI-HindIII плазмидыpRB(+)Luc. Плазмида pNeoLuc эквивалентна плазмиде pNeoRBLuc, но у нее отсутствует правая пограничная последовательность, встроенная между промотором CaMV35S и кодирующей областью люциферазы. Гены VirD1 и VirD2 из плазмиды pTiA6 субклонировали в векторе экспрессии pMF6(0,5 т.п.н.) и области полиаденилирования нопалинсинтазы (nos) (0,25 т.п.н.) (фиг. 1). ФрагментDas, 1989), соответствующий кодирующей последовательности VirD1, клонировали в вектореDas, 1989) и клонировали в pMF6. Полученные плазмиды p35SAdhD2 и p35SAdhD2(rev) несли кодирующую область VirD2 либо в смысловой,либо в антисмысловой ориентации. Для опытов с тканями табака последовательность первого интрона Adh1 изымали путем делеции из 30 Плазмида pGUS происходит из pUC и содержит кодирующую последовательность гена-глюкуронидазы (GUS) под контролем промотора CaMV35S и интрона гена каталазы клещевины обыкновенной (Ohta и др., 1990). 2. Растительный материал. Суспензионные клетки кукурузы Суспензионные культуры кукурузы (Zeamays L.) первоначально получали из хранившегося в криогенных условиях эмбриогенного каллюса типа II, взятого из незрелых зародышей элитной линии, родственной В 73. Приблизительно 1 г хранившегося в криогенных условиях каллюса (DiMaio и Shillito, 1992) добавляли к 50 мл жидкой среды N6 (Chu и др., 1975), дополненной 30 г/л сахарозы и 2 мг/л 2,4 дихлорфеноксиуксусной кислоты(2N63S). Культуры инкубировали при 25 С в темноте на орбитальном шейкере при 150 об/мин. Суспензионные культуры пересевали каждые 7 дней путем переноса 1 мл клеточной массы в 50 мл свежей жидкой среды 2N63S. Суспензии клеток кукурузы для опытов с использованием бомбардировок отбирали из 3 дневных культур, выращенных ускоренным методом. Перед бомбардировкой приблизительно 0,5 мл клеточной массы фильтровали под вакуумом через 7-сантиметровые фильтры(Whatman 4). Затем фильтры переносили на отвержденную герлитом среду N6, содержащую 120 г/л сахарозы. Посеянные клетки выдерживали перед бомбардировкой в течение 4 ч при 25 С. После бомбардировки пластины инкубировали при 25 С в течение 24 ч. Суспензионные клетки табака Линию клеток Nicotiana tabacum NT-1 (An,1985) выращивали в среде Мурасига и Скуга(Murashige и Skoog) (MS-среда), дополненной 2 мл/л 2,4-Д и сахарозой (30 г/л) (MS3S). Клетки пересевали один раз в неделю, добавляя 5 мл инокулята к 100 мл свежей среды в колбы объемом 500 мл. Колбы инкубировали при 27 С на роторном шейкере при 125 об/мин. Аликвоты по 0,5 мл четырехдневных культур наносили на стерильные фильтры (Whatman 4), которые затем переносили на MS-среду, дополненную 12% сахарозы, и выдерживали перед бомбардировкой при комнатной температуре в течение 4 ч. 3. Бомбардировка растительных клеток. Ткани подвергали бомбардировке золотыми микроснарядами, на которые была осаждена смесь плазмид. ДНК плазмиды pGUS применяли в качестве внутреннего контроля во всех экспериментах с использованием клеток кукурузы и табака. Для экспериментов по совместной трансформации использовали золотые частицы,которые несли либо равную массу ДНК всех плазмид (по 0,5 мкг ДНК каждой плазмиды на пластину-мишень), либо смесь плазмид, несущих гены VirD1 и VirD2, и плазмиды-субстрата 31 в молярном соотношении 2:1. Для экспериментов по стабильной трансформации использовали смеси для совместной трансформации, содержащие смесь плазмид, несущих гены VirD1 иVirD2, и плазмиды с отбираемым геном nptlI в молярном соотношении 5:1. Каждая аликвота смеси плазмид, которой бомбардировали пластину-мишень, состояла из 0,1 мкг селектирующего маркера и по 0,5 мкг каждой из ДНК плазмид p35SD1 и p35SD2. Соответствующие количества каждой ДНК смешивали в полном объеме 10 мкл и осаждали с помощью 50 мкл 2,5 МCaCl2 и 20 мкл 0,1 М свободного от спермидина основания для осаждения на 50 мкл золотых микроносителей размером 1,0 мкм (60 мг/мл). Бомбардировку микроснарядами проводили с помощью биобаллистического приспособления типа PDS-1000 He (фирма DuPont) с использованием дисков, разрушаемых при давлении 1500 фунтов/кв. дюйм, помещая образец на 8 см ниже задерживающей экранирующей полки. 4. Стабильная трансформация суспензионных клеток табака. Через 24 ч после бомбардировки клетки табака переносили на пластины со средой MS3S с 300 мкг/мл канамицина. Отдельные микрокаллюсы, появившиеся приблизительно через 3 недели после бомбардировки, переносили на пластины со свежей средой, дополненной 300 мкг/мл канамицина. После двух пересевов на эту же среду инициировали рост суспензионных культур, инокулируя приблизительно 100 мкг клеток табака в 25 мл жидкой среды, дополненной 300 мкг/мл канамицина. 5. Оценки кратковременной экспрессии. Люциферазу анализировали в экстрактах ткани в соответствии с рекомендацией поставщика (Luciferase assay system, фирма Promega).-Глюкуронидазную активность определяли хемолюминисцентным методом с помощью набора GUS-Light (фирма Tropix). Люциферазную и -глюкуронидазную активности выражали в виде единиц света, обнаруживаемого приборомLuminometer, проинтегрированного в течение 10 с при 25C. 6. Экстракция ДНК и гибридизация методом Саузерн-блоттинга. Культуры клеток собирали фильтрацией через 10 дней после инокуляции и замораживали в жидком азоте. ДНК выделяли, как описано у Hall и др., 1991. Для разложения с помощью EcoRI использовали приблизительно 5 мкг геномной ДНК. После разделения на 0,7%-ном агарозном геле ДНК переносили на генное сито плюс мембрану и гибридизацию проводили в соответствии с условиями, описанными у производителя (NENResearch Products, DuPont). ДНК-зонды метили с помощью [a32P]дЦТФ, используя набор для мечения олигонуклеотидов фирмы Pharmacia. ЗондXbaI-EcoRI-фрагменту длиной 0,7 т.п.н. гена люциферазы (фиг. 2). Для удаления зондов мембраны промывали 0,1%-ным раствором ДСН(додецилсульфат натрия) при 100 С в течение 5 мин. 7. Клонирование соединительных участков Т-ДНК/растительная ДНК. ДНК (30 мкг) из каллюса трансгенной линии табака разлагали с помощью EcoRI и подвергали препаративному электрофорезу на 1%ном агарозном геле Sea-plaque (агароза с малой степенью эндоосмоса и пониженными температурами плавления и затвердевания) (FMC). Из геля вырезали кусочки агарозы, соответствующие по размеру фрагментам, предназначенным для клонирования, и ДНК экстрагировали из агарозы с использованием набора QIAquick GelExtraction Kit (фирма Qiagen). Затем фрагменты клонировали в дефосфорилированном сайтеEcoRI плазмиды pUC19. Для трансформации клеток E.coli HB101 с помощью электропорации применяли лигированные смеси. Колонии, содержащие плазмиды с правильной инсерцией,выявляли с помощью гибридизации колонии на фильтре, используя в качестве зонда фрагмент длиной 0,5 т.п.н. промотора CaMV35S. Последовательность участка на стыке ДНК донорной плазмиды и растительной ДНК анализировали,используя праймер 5'-CCACTATCCTTCGCAAGACC-3' (SEQ ID NO: 8), локализованный в промоторе CaMV35S на расстоянии 106 пар оснований от правой пограничной последовательности. Г. Результаты. 1. Экспериментальное конструирование. Для изучения вопроса о том, могут ли продукты генов VirD1 и VirD2 вызывать одноцепочечный разрыв в пограничной последовательности Т-ДНК при экспрессии в растительной клетке, конструировали плазмиду pRB(+)Luc, содержащую между промотором и кодирующей последовательностью гена люциферазы пограничную последовательность Т-ДНК, являющуюся субстратом. Инсерция правой пограничной последовательности между промоторомCaMV35S и кодирующей последовательностью гена люциферазы не влияет на экспрессию гена люциферазы в растительных тканях (данные не приведены). Пограничную последовательность располагали таким образом, чтобы сайтспецифический одноцепочечный разрыв, вызванный продуктами генов VirD1 и VirD2, мог привести к разрыву цепи ДНК, являющейся матрицей для мРНК люциферазы, и тем самым снизить производство транскрипта люциферазы и фермента. После совместной бомбардировки растительных клеток плазмидой pRB(+)Luc и плазмидами,несущими гены virD, любые одноцепочечные разрывы в пограничной последовательности могли быть количественно оценены путем из 33 мерения люциферазной активности. Однако любое уменьшение люциферазной активности также может быть объяснено присоединением продуктов генов VirD1 и VirD2 к пограничной последовательности, локализованной между промотором и кодирующей последовательностью, что может ингибировать транскрипцию гена люциферазы. С целью определить, какое из двух предположений имеет место, изучали плазмиду pRB(-)Luc, которая содержит пограничную последовательность в обратной ориентации по отношению к промотору. Если уменьшение люциферазной активности является результатом связывания продукта(ов) гена(ов)VirD с пограничной последовательностью, то это снижение, вероятно, должно наблюдаться даже тогда, когда пограничная последовательность находится в обратной ориентации. Поскольку протеины VirD1 и VirD2 должны продуцироваться в течение небольшого промежутка времени в подвергнутых бомбардировке растительных клетках до того, как они могут вызвать одноцепочечный разрыв пограничной последовательности, любой такой одноцепочечный разрыв, по-видимому, должен иметь место после того, как транскрипция гена люциферазы уже началась. Следовательно, измерения люциферазной активности, вероятно, могут занижать оценку активности VirD1 и VirD2 в растительных клетках. Для экспрессии генов VirD1 и VirD2 в растительных клетках соответствующие им открытые рамки считывания (ОРС) помещали под контроль промотора CaMV35S. В качестве контроля ОРС гена VirD2 также встраивали в антисмысловой ориентации по отношению к промотору. Поскольку известно, что присутствие интрона 1 спиртовой дегидрогеназы 1 кукурузы увеличивает экспрессию генов кукурузы (Callis и др., 1987), для использования в экспериментах по кратковременной экспрессии в клетках кукурузы также были сконструированы плазмидыp35SAdhD1 и p35SAdhD2 (содержащие интрон,встроенный между промотором и кодирующей областью ОРС генов VirD1 и VirD2 соответственно). Плазмиду, экспрессирующую ген глюкуронидазы (GUS), рGUS, включали в каждую бомбардировку в качестве внутреннего стандарта для контроля эффективности переноса ДНК. Во всех случаях активность репортерного гена выражали в виде отношения активностей люциферазы и GUS с целью скорректировать с учетом вариабельности оценку эффективности введения ДНК. 2. Анализ кратковременной экспрессии для изучения расщепления пограничной последовательности продуктами генов VirD1 и VirD2 в растении. Клетки кукурузы и табака сначала подвергали кратковременной трансформации с помощью тестируемой плазмиды, вводимой совместно с одним из генов VirD1 и VirD2, для изуче 001039 34 ния их способности по отдельности влиять на транскрипцию через пограничную последовательность Т-ДНК. После совместного введения либо ДНК p35SD1, либо ДНК p35SAdhD1 и ДНК pRB(+)Luc в тканях табака и кукурузы наблюдали 80%-ную активность по сравнению с контрольным уровнем активности люциферазы относительно GUS (табл. 1 и 2; см. ниже). Совместное введение ДНК p35SD2 (табак) или ДНК p35SAdhD2 (кукуруза) и ДНК pRB(+)Luc привела к 50%-ной и 80%-ной активности по сравнению с контрольным уровнем активности люциферазы относительно GUS (табл. 1 и 2; см. ниже). Таблица 1 Активность VirD1 и VirD2 в суспензионных клетках табака Плазмиды+pGUS Таблица 1. Активность VirD1 и VirD2 в клетках табака. Конструкции плазмид представлены на фиг. 1, их вводили в клетки табака с помощью устройства для биобаллистического введения. Числа в скобках показывают молярное соотношение плазмид. После инкубации в течение 24 ч ткани гомогенизировали и определяли ферментативные активности. Активности выражали в виде отношения активностей люциферазы (Luc) и -глюкуронидазы (Glu). Проводили анализ независимых бомбардировок и данные выражали в виде средних значений по 6 повторностямстандартное отклонение (СО). Значения в % к контролю определяли из отношения активностей люциферазы и глюкуронидазы к этим же активностям, полученным для контрольной плазмиды. Таблица 2 Активность VirD1 и VirD2 в суспензионных клетках кукурузы Плазмиды+pGUS Таблица 2. Активность VirD1 и VirD2 в клетках кукурузы. Активности выражены в соответствии со сноской к табл. 1. Два гена vir вместе, по-видимому, обладают синергетическим действием. Совместное введение с помощью биобаллистического устройства равных количеств ДНК pRB(+)Luc и обеих плазмид, несущих гены VirD1 и VirD2(соотношение 1:1:1), привело к уменьшению люциферазной активности по сравнению с контролем приблизительно на 20% в клетках табака(табл. 1) и на 10% в клетках кукурузы (табл. 2). При более высоком соотношении плазмид, несущих VirD1 и VirD2, и тестируемой плазмиды(2:2:1) люциферазная активность в клетках табака снижалась еще больше, приблизительно до 10% (табл. 1), и до 1% в клетках кукурузы (табл. 2). Аналогичные эксперименты, проведенные с использованием контрольной плазмидыp35SD2(rev) (табак) или p35SAdhD2(rev) (кукуруза) или плазмиды, несущей кодирующую последовательность VirD2 в антисмысловой ориентации, как и ожидалось, дали результаты,аналогичные таковым, полученным при использовании одного VirD1 (табл. 1 и 2). Это свидетельствует о том, что применяемый в качестве внутреннего стандарта ген GUS обеспечивал эффективный контроль за любыми результатами изменения концентрации введенной общей ДНК. Изменение ориентации пограничной последовательности Т-ДНК в тестируемой плазмиде полностью устраняет или в значительной степени снижает любое воздействие геновVirD1 и/или VirD2 на кратковременную экспрессию гена люциферазы. Когда ДНК плазмиды pRB(-)Luc вводили в ткани табака путем совместной бомбардировки с ДНК плазмидp35SD1 и p35SD2, то не наблюдали заметного снижения люциферазной активности. Совместное введение pRB(-)Luc c каждой из p35SD1 илиp35SD2 по отдельности также не привела к заметному снижению люциферазной активности(табл. 1). Эти данные явно свидетельствуют о том, что снижение люциферазной активности,наблюдаемое при использовании тестируемой плазмиды pRB(+)Luc и генов VirD1 и VirD2,являлось результатом специфического для цепи одноцепочечного разрыва на правой пограничной последовательности продуктами гена vir аналогично тому, что наблюдалось при использовании Agrobacterium (см. обзор Zambryski,1992). 3. Анализ стабильных трансформантов. Далее осуществляли стабильную трансформацию суспензионных клеток табака для определения влияния активности продуктов генов VirD1 и VirD2 на схему интеграции ДНК после совместного введения этих генов с их 36 ДНК-субстратом с помощью устройства для биобаллистического введения. Для этих экспериментов применяли плазмиду pNeoRBLuc, которая содержит левую пограничную последовательность Т-ДНК, nptII в качестве селектируемого маркера и ген 35SRB(+)Luc, у которого правая пограничная последовательность Т-ДНК встроена между промотором и кодирующей областью люциферазы. В разделе Результаты и в приведенном ниже их обсуждении понятием агролистические случаи обозначены такие инсерции ДНК в геном табака, которые могут произойти в результате воздействия VirD1 иVirD2 на пограничные последовательности с получением Т-цепи. В противоположность этому понятием биобаллистические случаи обозначены такие инсерции ДНК, которые представляют собой процесс, обычно происходящий после введения гена в растительные клетки с помощью устройства для биобаллистического введения. Первым критерием, позволяющим отличить биобаллистические случаи от предполагаемых агролистических случаев, было отсутствие люциферазной активности в трансформированном клоне вследствие исключения кодирующей области Luc при вырезании Т-ДНК изpNeoRBLuc. На молекулярном уровне трансгены, представляющие собой результат агролистического случая, должны гибридизоваться с зондом neo, но не гибридизоваться с зондом luc. Кроме того, в агролистическом случае последовательность соединительного участка между интродуцированной ДНК и растительной ДНК должна точно соответствовать правому пограничному концу Т-цепи. Оба типа случаев могут иметь место в одной и той же растительной клетке, но такие клоны должны рассматриваться генетически как биобаллистические случаи, поскольку в них присутствует люциферазная активность. Частоту инсерции каждого типа как биобаллистических, так и предполагаемых агролистических случаев исследовали с помощью Саузерн-гибридизации. Суспензионные клетки табака подвергали бомбардировке микроснарядами, покрытыми ДНК плазмиды pNeoRBLuc вместе с ДНК p35SD1 и p35SD2 в соотношении 1:5:5. В качестве контроля для бомбардировки также использовали одну плазмиду pNeoRBLuc,а не содержащую пограничных последовательностей контрольную плазмиду pNeoLuc использовали для совместной бомбардировки с p35SD1 и p35SD2. Стабильных трансформантов отбирали на основе их способности расти на среде,содержащей канамицин. В среднем выявлено 40 устойчивых к канамицину клонов на один подвергнутый бомбардировке фильтр, но только один или два каллюса на пластину подвергали дальнейшему анализу. Близкое количество устойчивых к канамицину каллюсов получали после бомбардировки с использованием ДНК только контрольных плазмид pNeoRBLuc или 37 Грубая оценка частоты агролистических случаев может быть сделана по величине отношения общего количества устойчивых к канамицину каллюсов, которые не экспрессируют люциферазу, к общему количеству проанализированных каллюсов. В соответствии с этим критерием частота агролистических случаев составила приблизительно 10%; из 32 проанализированных линий каллюса 3 не проявляли люциферазной активности. Как обсуждалось ранее, повидимому, это количество занижает количество агролистических случаев, поскольку агролистические случаи и биобаллистические случаи могут иметь место в одной и той же клетке. 4. Анализ методом Саузерн-блоттинга контрольных биобаллистических случаев. Проводили гибридизацию методом Саузерн-блоттинга с использованием ДНК из контрольных устойчивых к канамицину линий каллюса, полученных после бомбардировки (I) одной плазмидой pNeoRBLuc и (II) после совместной бомбардировки ДНК плазмиды pNeoLuc вместе с ДНК плазмид p35SD1 и p35SD2. Геномную ДНК разлагали с помощью EcoRI, в результате чего из плазмиды pNeoRBLuc получали фрагмент длиной 3,9 т.п.н., который гомологичен обоим зондам neo и luc (фиг. 2). Когда продукты разложения геномной ДНК гибридизовали с зондом neo, во всех зонах была обнаружена полоса гибридизации предсказанного размера (3,9 т.п.н.), а количество копий интактного фрагмента, полученное на основе сравнения интенсивности гибридизации с таковой для копий в контрольных зонах, варьировало от 1 до более 10 на ядро. Анализ методом Саузернблоттинга трансформированных линий, полученных после совместной бомбардировки с использованием ДНК p35SD1 и ДНК p35SD2 и лишенной пограничных последовательностей контрольной плазмиды pNeoLuc, примененных в качестве зондов, показал наличие в этих линиях как интактных, так и преобразованных копий гена nptII. Такие преобразования часто наблюдаются в трансформантах, полученных с помощью устройства для биобаллистического введения. 5. Анализ методом Саузерн-блоттинга возможных агролистических случаев. Методом Саузерн-блоттинга также проводили анализ мДНК из 16 устойчивых к канамицину линий каллюса, полученных после совместной бомбардировки плазмидой pNeoRBLuc с использованием ДНК плазмид p35SD1 и p35SD2 в качестве зондов гибридизации. Для анализа методом Саузерн-блоттинга случайным образом отбирали 13 линий каллюса из 32, давших положительные результаты в отношении люциферазной активности, а также три клона, для которых было обнаружено, что они не экспрессируют люциферазу. ДНК из положительных в отношении люциферазной активности линий каллюса содержала полосу предсказанного размера(3,9 т.п.н.), гибридизующуюся с зондом neo. Количество копий интактного гена nptII, полученное на основе сравнения интенсивности гибридизации с таковой для копий в контрольных зонах, варьировало от 1 до 10 на ядро. Количество обнаруженных копий было существенно меньшим в каллюсах, трансформированных ДНК pNeoLuc совместно с ДНК плазмидp35SD1 и p35SD2. В ДНК из всех трансгенных каллюсов, которые подвергали бомбардировке ДНК p35SD1 и p35SD2 вместе с pNeoRBLuc, обнаружили полосу, соответствующую 3,4 т.п.н. Было обнаружено, что в этих линиях фрагмент такого размера гибридизуется с зондом VirD2. Фрагмент,использованный для зонда neo, содержал участок терминирующей последовательности, который также присутствовал в конструкцияхp35SD1 и p35SD2, и, хотя он представляет собой только 1,2% меченого зонда, в нем может быть большое количество копий вставок генаVirD, и это может дать сигнал заметной величины. Когда блотты гибридизовали с зондом luc,можно было различить три группы трансгенных линий каллюса: (I) линии каллюса, имеющие вставки, гибридизующиеся с зондом neo и зондом luc, (II) линии каллюса, в которых некоторые вставки, гибридизующиеся только с зондомneo, и некоторые вставки, гибридизующиеся с обоими зондами neo и luc, и (III) линии каллюса,имеющие вставки гибридизующиеся только с зондом neo. Первая группа каллюсов, повидимому, не содержит агролистических случаев. Вторая группа каллюсов, по-видимому, содержит два типа случаев: наличие агролистических случаев доказывается по присутствию фрагментов длиной 4,8 т.п.н., 4,6 т.п.н. и 5 т.п.н., гибридизующихся с зондом neo, а наличие биобаллистических случаев доказывается по присутствию фрагмента длиной 3,9 т.п.н., гибридизующегося с зондом luc. Третья группа каллюсов содержит только предполагаемые агролистические случаи, что подтверждается их способностью гибридизоваться только с зондомneo. К этой группе относятся три линии каллюса; одна, содержащая полосу гибридизации, соответствующую 3,2 т.п.н., вторая, содержащая две полосы гибридизации, соответствующие 3,8 т.п.н. и 5 т.п.н., и третья, содержащая одну полосу, соответствующую 5,5 т.п.н. Эти три схемы гибридизации были уникальными, ясно характеризующими независимые случаи трансформации отдельной клетки. Из 16 трансгенных линий табака, проанализированных с использованием Саузернгибридизации, в 10 обнаружены биобаллистические случаи, в 3 обнаружены предполагаемые агролистические случаи и в 3 обнаружены оба этих варианта. 6. Молекулярный анализ предполагаемых агролистических случаев. 39 Природу предполагаемых случаев агролистической инсерции окончательно подтверждали путем определения последовательности соединительного участка между интегрированной ДНК и растительной ДНК в линиях каллюсов, у которых обнаружены схемы гибридизации, согласующиеся с такими предполагаемыми случаями. Клонировали и секвенировали фрагменты ДНК из этих линий каллюсов, содержащие эти соединительные участки, расположенные снаружи от внутренних пограничных последовательностей Т-ДНК (см. описание методов). Анализ нуклеотидных последовательностей подтвердил, что каждый из этих фрагментов содержал последовательность, характерную для соединительного участка: правая пограничная последовательность/растительная ДНК. Правый конец Т-ДНК был идентичен сайту одноцепочечного разрыва правой пограничной последовательности Т-ДНК. Растительная нуклеотидная последовательность в четырех случаях из пяти точно совпадала с последовательностями соединительных участков табака, которые ранее были описаны в кДНК другими авторами. Интересно отметить,что во всех четырех случаях правую пограничную последовательность Т-ДНК встраивают с промотором CaMV35S, ориентированным в антисмысловом направлении относительно растительных генов в областях с высоким содержанием АТ, расположенных около сайта полиаденилирования в 5'-нетранслируемой области гена. В сайтах правых соединительных участков не обнаружено ни дополнительных нуклеотидов, ни повторяющихся последовательностей. Не представляется возможным определить, имели ли место какие-либо делеции сайтов-мишеней, поскольку не проводили секвенирования левой пограничной последовательности вставки. В качестве контроля также клонировали фрагменты ДНК, включающие правую пограничную последовательность и участки, прилегающие к ней с каждой стороны, из линий каллюсов, у которых обнаружены схемы гибридизации, согласующиеся с биобаллистическими случаями для фрагментов ДНК. В нуклеотидной последовательности в этих случаях не выявлено никакого соединительного участка на стыке правой пограничной последовательности и растительной ДНК, а правая пограничная последовательность имела практически полную длину и предполагаемую расположенную за ней кодирующую последовательность люциферазы. Д. Заключение. Вирулентные протеины VirD1 и VirD2, кодируемые Ti-плазмидой, необходимы для образования Т-цепей в Agrobacterium. Получено доказательство того, что после интродукции с помощью устройства для биобаллистического введения двух вирулентных генов VirD1 иVirD2 под контролем промотора CaMV35S вместе с плазмидой, несущей пограничные после 001039 40 довательности, происходит образование Т-ДНК в растениях и интеграция в растительные клетки. Приблизительно у 10% трансформированных каллюсов табака обнаружены агролистические инсерции, т.е. ДНК интегрировалась только после воздействия продуктов генов VirD1 иVirD2. Приблизительно у такой же части трансформированных каллюсов обнаружены как случаи агролистических инсерций, так и биобаллистических инсерций. В соединительных участках на стыке трансгена и растительной ДНК в агролистических случаях обнаружено сайтспецифическое расщепление внутри правой пограничной последовательности, что согласуется с известными данными, свидетельствующими о том, что правая пограничная последовательность Т-ДНК заканчивается сразу за первыми тремя нуклеотидами повтора длиной 25 пар оснований (Gheysen и др., 1991; Mayerhofer и др.,1991; Ohba, 1995). Точность интеграции была интерпретирована как результат непосредственного участия VirD2 в процессе рекомбинации в ядре растительной клетки (Tinland и др., 1995). В настоящем исследовании установлено,что сайты интеграции в агролистических случаях находятся в транскрибируемых областях, и это подтверждает данные о том, что Т-ДНК предпочтительно интегрируется в потенциально транскрибируемые локусы генома у различных видов растений (Koncz и др., 1989; Herman и др.,1990; Kertbundit и др., 1991), причем Т-ДНКвставки распределены случайным образом в хромосомах растений (Chyi и др., 1986; Wallroth и др., 1986). Хотя интеграция Т-ДНК обычно не коррелирует с большими преобразованиями растительной ДНК, в процессе Т-ДНК трансформации ДНК могут иметь место делеции, инверсии и дубликации последовательностей ДНК растения-мишени. Для изученных в настоящем описании агролистических случаев не было отмечено существенного преобразования сайтов растения-мишени. Представляет интерес постоянная схема агролистических интеграций, которые происходят рядом с сигнальной последовательностью полиаденилирования известных индуцируемых светом и/или фотосинтезирующих генов табака с промотором CaMV35S на правой пограничной последовательности, расположенным в обратной ориентации по отношению к открытой рамке считывания. При такой ориентации инсерция структуры Т-ДНК может привести к образованию антисмыслового транскрипта, который может инактивировать экспрессию соответствующего гена табака. Однако указанные фотосинтезирующие гены не требуются для нефотосинтезирующей культуры клеток, такой как NT1. Данные экспериментов по кратковременной экспрессии, при которой расщепление на правой пограничной последовательности, вероятно, происходит с высокой частотой, показывают, что, по-видимому, был расщеплен боль 41 шой процент молекул-субстратов. Неожиданно было обнаружено, что это процентное соотношение не сохраняется при стабильной трансформации. Это может быть объяснено реакцией лигирования правой пограничной последовательности после расщепления VirD2, причем в опытах in vitro было установлено, что VirD2 катализирует сайтспецифическую реакцию расщепления-соединения в одноцепочечных олигонуклеотидах, содержащих пограничные последовательности Т-ДНК (Pansegrau и др.,1993). Другим объяснением может быть отсутствие одноцепочечного связывания VirЕ 2, необходимого для эффективной опосредуемойAgrobacterium трансформации. Хотя можно предположить, что имеется эквивалент неспецифическому протеину VirЕ 2, связывающему одну цепь в растительных клетках, который может связывать и защищать Т-цепь, введение гена virЕ 2 вместе с VirD1 и VirD2 может улучшить эффективность выявления агролистических случаев. Следует отметить также недостаток, состоящий в том, что при совместном введении обоих генов VirD1 и VirD2 и трансформирующей плазмиды с использованием биобаллистического способа введения, они, вероятно, с высокой частотой интегрируются в одних и тех же трансформированных линиях: совместная трансформация происходит очень эффективно при использовании устройства для биобаллистического введения. Эти нежелательные гены представляют собой другой тип чужеродной ДНК. Однако можно предположить, что вследствие своего уникального механизма инсерции они не связываются с агролистической вставкой и могут быть удалены при последующей селекции трансгенного растения. Это предположение не может быть изучено при использовании указанных трансгенных клеток NT1, которые не обладают способностью к регенерации. Система агролистической трансформации обладает несколькими выраженными преимуществами: (I) Она может быть непосредственно применена к любой растительной тканимишени, чувствительной к способам биобаллистической трансформации. (II) Встроенная ДНК не несет чужеродную векторную ДНК. (III) В этом случае встраивают меньшее количество копий представляющего интерес гена, чем в случае, когда ДНК вводят без генов VirD1 иVirD2. Это должно свести к минимуму наличие гомологичных областей, которые могут вызвать нестабильность. Таким образом, агролистический подход объединяет лучшие особенности биобаллистического введения с изяществом и точностью механизма встраивания Т-ДНК Agrobacterium,что позволяет получить новую широко применимую технологию получения трансгенных культурных растений, имеющих сельскохозяйственное значение. 42 Пример 2. Конструирование растительных кассет экспрессии. Для создания химерного гена сначала последовательности генов, предназначенные для экспрессии в трансгенных растениях или растительных клетках, объединяют в кассетах экспрессии за соответствующим промотором и в обратном направлении от соответствующего терминатора транскрипции. Затем эти кассеты экспрессии могут быть легко перенесены в растительные трансформирующие векторы, аналогично тому, как описано ниже в примере 3. Выбор промотора Выбор промотора, применяемого в кассетах экспрессии или в химерных генах, должен определить пространственную и временную схему экспрессии трансгена в трансгенном растении. Выбранные промоторы должны обеспечивать экспрессию трансгенов в определенных типах клеток (таких как эпидермальные клетки листа, мезофильные клетки, клетки коры корня) или в определенных тканях или органах (например, в корнях, листьях или цветках), и этот выбор должен отражать требуемую локализацию экспрессии трансгена. В другом варианте выбранный промотор может обеспечивать экспрессию гена под контролем индуцируемого светом или другого промотора, который регулируется в зависимости от времени. Еще в одном варианте выбранный промотор может регулироваться химическими факторами. Это должно обеспечить возможность индуцировать экспрессию трансгена только тогда, когда это требуется, и вызывать ее путем обработки химическим индуктором. Терминаторы транскрипции Для применения в кассетах экспрессии пригодны различные терминаторы транскрипции. Они ответственны за окончание транскрипции за трансгеном и за его правильное полиаденилирование. Пригодными терминаторами транскрипции являются таковые, для которых известно, что они функционируют в растениях,и они включают терминатор 35S CaMV, терминатор tml, терминатор нопалинсинтазы, терминатор E9 rbcS гороха. Они могут применяться как в однодольных, так и в двудольных растениях. Последовательности для усиления или регуляции экспрессии Известны многочисленные последовательности, обладающие способностью усиливать экспрессию единицы транскрипции гена, и эти последовательности могут применяться в сочетании с генами по изобретению для усиления их экспрессии в трансгенных растениях. Было показано, что различные интронные последовательности усиливают экспрессию, в частности в клетках однодольных растений. Например, было обнаружено, что интроны генаAdh1 кукурузы при интродукции в клетки кукурузы значительно усиливают экспрессию гена 43 дикого типа под контролем родственного ему промотора. Было обнаружено, что интрон 1 является особенно эффективным и усиливает экспрессию в гибридных конструкциях при слиянии с геном хлорамфеникол-ацетилтрансферазы(1987. В этой же экспериментальной системе интрон гена bronze1 кукурузы проявляет аналогичное действие по усилению экспрессии (Callis и др., см. выше). Последовательности интрона включали общепринятыми способами в растительные трансформирующие векторы, обычно в составе нетранслируемой лидерной последовательности. Также известно большое количество нетранслируемых лидерных последовательностей,происходящих из вирусов, которые усиливают экспрессию. В частности было показано, что лидерные последовательности из вируса табачной мозаики (TMV, омега-последовательность), вируса хлорозной пятнистости кукурузы (MCMV) и вируса мозаики люцерны (AIMV) эффективно усиливают экспрессию (см. Gallie и др., Nucl. Acids Res., 15: 8693-8711 (1987);and Run) для эффективной сайтспецифической рекомбинации введенной биобаллистическим методом ДНК: совместное введение мРНК рекомбиназы. А. Краткое содержание. Описан метод совместного введения ДНК и мРНК в растительные клетки с использованием устройства для биобаллистического введения. Методом гель-электрофореза была показана стабильность и способность восстанавливаться ДНК и РНК, осажденных на микроснаряды, в различных условиях. Для введения активной мРНК оказалось эффективным осаждение с помощью одного CaCl2 или CaCl2 плюс спермидин плюс трис-буфер, тогда как незабуференный спермидин приводил к фрагментации РНК. С использованием эффективных методов осаждения и биобаллистического введения в клетки кукурузы и табака была доказана экспрессия синтезированной in vitro кэппированной полиаденилированной мРНК, кодирующей люциферазу светляка. Кинетические исследования показали, что экспрессия мРНК люциферазы достигает максимума раньше, чем происходит кратковременная экспрессия одновременно введенной 35S/ДНК люциферазы. С целью продемонстрировать активность введенной биобаллистическим методом мРНК,кодирующей сайтспецифическую рекомбиназуZygosaccharomyces rouxii (R), ее вводили в клетки кукурузы совместно со субстратной плазмидой, содержащей обратный промотор 35S,фланкированный инвертированными копиями мишень-специфического сайта рекомбиназы 44 ными далее областями лидера 35S, гена люциферазы и терминатора 35S. Тогда как при введении только одной субстратной плазмиды не происходило значительной экспрессии люциферазы, при ее совместном введении с мРНК R ее промотор 35S удалялся рекомбиназой, что приводило к продуцированию фермента люциферазы. В этом примере описана также возможность применения систем на основе сайтспецифической рекомбиназы в виде мРНК для контроля инсерции трансгена и экспрессии с учетом их преимуществ, связанных с кратковременной интродукцией рекомбиназной активности. Б. Введение. Когда для введения генов в растительные клетки применяют бомбардировку частицами,трансгенная ДНК встраивается в геном случайным образом, обычно в отдельный сайт, содержащий множественные копии (Klein и др., 1988;Vasil и др., 1992; Wan Y. и Lemaux P., 1994). Особенности конструкции, положение вставки и часто возникающее большое количество копий трансгенов могут привести к нестабильности экспрессии в результате нескольких механизмов: например, в результате того, что взаимодействие множественных копий трансгенов инактивирует друг друга посредством антисмысловых механизмов или вследствие метилирования или в результате действия других приводящих к молчанию механизмов, которые пока недостаточно изучены (см. обзорMatzke M. и Matzke A., 1995). Поскольку множественные копии трансгенов связаны с одним сайтом инсерции, не представляется возможным снизить количество копий посредством их расщепления в следующих поколениях растений. Как для фундаментальных исследований экспрессии трансгенов, так и для коммерческого производства трансгенных культурных растений для сельскохозяйственного применения улучшение конструкции и экспрессии интродуцированных генов имеет очень большое значение. Сайтспецифические системы рекомбинации могут служить пригодными средствами упрощения схемы инсерции трансгена и даже позволяют направлять их в предварительно выбранный сайт в геноме растения (Albert и др.,1995). Было показано, что несколько сайтспецифических рекомбиназ обладают активностью в растительных клетках (см. обзор Odell и Russell,1994): система Cre/lox бактериофага Р 1, рекомбинантная система FLP/FRT из 2 плазмиды(Matsuzaki и др., 1988). Эти системы обладают потенциальной возможностью для применения вследствие их простоты; являясь полностью работоспособными, они нуждаются только в 45 одном протеине рекомбиназе (Cre, FLP, R) и в соответствующей им мишени, в определенном коротком сайте рекомбинации (lox, FLP, RS соответственно). Кроме того, частота их рекомбинаций является исключительно высокой. Рекомбиназа посредством реакции рекомбинации может опосредовать три типа преобразований ДНК в зависимости от локализации и ориентации сайтов узнавания. Если фрагмент ДНК связан с двумя сайтами узнавания, которые являются инвертированными по отношению друг к другу, то происходит инверсия внедряющейся ДНК. Если два сайта узнавания находятся в одинаковой ориентации, то происходит вырезание и циркуляризация внедряющейся ДНК. Если сайты узнавания находятся на различных молекулах ДНК, то происходит генетический обмен, а если один из них является круговым, то молекула линейным образом интегрируется в другую. Сайтспецифическая рекомбиназная активность может применяться для упрощения и направленного встраивания трансгенов, интродуцированных в растения. Однако если эта активность является постоянной, то она может привести к нестабильности рекомбинантной структуры. Поэтому целесообразно, чтобы экспрессия рекомбинантной активности была лишь кратковременной. Это было достигнуто в современных исследованиях, в которых показана направленная интеграция lox-содержащего трансгена в сайт lox в трансгенном растении,экспрессирующем Cre (Albert и др., 1995). Поскольку сайт lox был расположен между промотором и кодирующей последовательностью гена сre, сайтспецифическая рекомбинация инактивировала экспрессию Сre, приводя к стабилизации продукта. По результатам, полученным с помощью Саузерн-гибридизации, все исследованные случаи интеграции были однокопийными. В настоящем исследовании сайтспецифическая рекомбиназная система R/RS была адаптирована для применения вместе с устройством для биобаллистического введения гена. Было показано, что система R/RS эффективно функционирует в клетках табака: когда ген R кратковременно трансформировали в протопласты,продукт этого гена с помощью сайтспецифической инверсии или вырезания ДНК активировал криптический ген глюкуронидазы (GUS)(Onouchi и др., 1992). Согласно настоящему описанию R-рекомбиназа, введенная в клетки кукурузы и табака биобаллистическим методом,функционирует аналогичным образом, хотя и с более низкой эффективностью (эффективность может быть повышена с помощью оптимизации параметров), активируя криптический ген люциферазы путем удаления его промотора. Кроме того, применение мРНК, а не ДНК для продуцирования рекомбиназы гарантирует то, что она будет быстро продуцироваться после интродукции ДНК-субстрата в клетку. Сайт-мишень RS 46 содержит палиндромную нуклеотидную последовательность длиной 31 пара оснований, состоящую из двух инвертированных повторов длиной 14 пар оснований, разделенных асимметричным центральным участком длиной 3 пары оснований (Matsuzaki и др., 1988). Для получения трансгенных растений целесообразно использовать рекомбиназную мРНК, а не ДНК с той целью, чтобы избежать встраивания R-гена в геном растения и таким образом гарантировать только кратковременную экспрессию рекомбиназы в течение ранних стадий трансформации. Ниже представлен способ совместной интродукции мРНК,кодирующейRрекомбиназу, и мишени: RS-содержащей конструкции ДНК криптической люциферазы, что вызывает кратковременную рекомбиназную активность, активирующую экспрессию гена люциферазы. В. Материалы и методы. 1. Растительный материал Клетки кукурузы Суспензионные культуры кукурузы (Zeamays L.) первоначально получали из хранившегося в криогенных условиях эмбриогенного каллюса типа II, взятого из незрелых зародышей элитной линии, родственной В 73. Хранившиеся в криогенных условиях каллюсы (DiMaio иShillito, 1992) подвергали быстрому оттаиванию и приблизительно 1 г этого продукта добавляли к 50 мл жидкой среды N6 (Chu и др., 1975), дополненной 30 г/л сахарозы и 2 мг/л 2,4 дихлорфеноксиуксусной кислоты(2N63S). Культуры инкубировали при 25 С в темноте на орбитальном шейкере при 150 об/мин. Суспензионные культуры пересевали каждые 7 дней путем переноса 2 мл клеточной массы в 50 мл свежей жидкой среды 2N63S. Аликвоты, содержащие по 200 мг клеток,равномерно наносили на стерильные фильтры типа Durapore и помещали на среду 2N6, дополненную 12% сахарозы в качестве осморегулятора. Посеянные клетки выдерживали в течение 4 ч при комнатной температуре до бомбардировки и в течение 24 ч после бомбардировки. Клетки табака Линию клеток Nicotiana tabacum NT-1 (An,1985) выращивали в среде Мурасига и Скуга(Murashige и Skoog), дополненной 2 мл/л 2,4-Д и сахарозой (30 г/л) (MS3S). Клетки пересевали один раз в неделю, добавляя 5 мл инокулята к 100 мл свежей среды в колбы объемом 500 мл. Колбы инкубировали при 27 С на роторном шейкере при 125 об/мин. Аликвоты по 0,5 мл четырехдневных культур после пересева наносили на стерильные фильтры (Whatman4). Затем фильтры переносили на MS-среду, дополненную 12% сахарозы, и выдерживали при комнатной температуре в течение 4 ч до бомбардировки и в течение 24 ч после бомбардировки.T7LUCA50-матрицу (фиг. 4 А) для транскрипции in vitro мРНК люциферазы светляка конструировали путем присоединения сначала гена luc к промотору Т 7 с последующим встраиванием фрагмента Т 7/luc в плазмиду, полученную из pUC18, с поли-(A)-вставкой. Для присоединения промотора Т 7 к кодирующей области luc вырезали промотор Т 7 из pET3 (Rosenberg и др., 1987) в виде BglII-фрагмента и клонировали в сайте BamHI плазмиды pUC19, получаяpAT26. Последовательность от +9 до +26 нуклеотида замещали сайтом BamHI путем делеции, осуществляемой с помощью ПЦР, получаяpAT27. Фрагмент 35S-лидер-люцифераза, вырезанный из плазмиды pCIB1711 (фиг. 4 В, см. ниже), интродуцировали в виде фрагментаBamHI/Asp718 в pAT27, получая Т 7/luc. Вставку Т 7/luc из этой плазмиды встраивали в плазмидуpUC18, содержит олигонуклеотидную пару с 50 А-остатками, фланкированными выступающими концами Asp718(5') и HindIII(3'), в которых сайтpT7RecA50 (фиг. 4 Б) получена из плазмиды pUC18A50X и помимо своей поли-(А)кодирующей области содержит промотор Т 7,лидерную последовательность 35S и кодирующую область рекомбиназы. Лидер 35S/фрагмент рекомбиназы из pRec (см. ниже) вырезали в виде фрагмента BamHI/Asp718 и лигировали сpCIB710 (Rothstein и др., 1987), в которую интродуцировали кодирующую область люциферазы из плазмиды pJD204 (De Wet и др., 1987) в виде HindIII-BamHI-фрагмента в сайт BamHI вектора с олигонуклеотидным адапторомpCIB701. У фрагмента промотор 35S/лидер образовавшейся плазмиды обрезали хвост до положения сайта BamHI точно в точке инициации транскрипции, замещая его EcoRV-BamHIфрагментом из плазмиды pDO435 (Ow и др.,1986) и получая pCIB1700. Гибрид лидер 35S(50 пар оснований)/лидер люциферазы (22 пары оснований) из pCIB1700 был удален в виде PstINarI гена luc и замещен синтетическим олигонуклеотидом, соответствующим лидеру 35S длиной 58 пар оснований и началу ОРС гена luc(для уточнения деталей этой конструкции см.pCIB1711, и в ней сохранены промотор 35S,лидер и терминирующая последовательность, но в ней кодирующая область люциферазы заменена кодирующей областью рекомбиназы. Для осуществления этого 5'-конец гена рекомбиназы 48 из pGAHR (Onouchi и др., 1991) клонировали в виде фрагмента BamHI/BglII в соответствующих сайтах pSP72 (фирма Promega) и ДНК между сайтами вектора XhoI и вставки PvuII замещали на олигонуклеотид 5'-TCGAGTTGCATGCAG-3'(SEQ ID NO: 9) таким образом, что стартовый кодон рекомбиназы (подчеркнут) превращался в сайт SphI. Вектор pCIB1711 был аналогичным образом модифицирован для встраивания сайтаSphI на конце лидера 35S следующим образом: фрагмент РstI/EcoRI, содержащий промотор 35S/лидерную последовательность, субклонировали в векторе pSGpoly11 для создания уникального сайта BamHI. После разложения с помощью BamHI/XbaI интродуцировали линкер,содержащий сайт SphI 5'-GATCGCAGCATGC(CTAG)-3' (SEQ ID NO: 10; указанная в скобках часть соответствует последовательности,комплементарной цепи олигонуклеотида). Образовавшийся модифицированный фрагмент РstI/EcoRI возвращали в каркас pCIB1711 с помощью тройного лигирования. Далее ген рекомбиназы интродуцировали вместо гена luc с помощью двух последовательных лигирований вследствие наличия внутреннего сайта SphI.pCIB1711, и в нее был интродуцирован сайт RS длиной 31 пара оснований между промотором 35S и лидером 35S гена люциферазы. Фрагмент промотора между сайтами HindIII и PstI сначала субклонировали в pSGpoly7, получая pSG35S, и в уникальном сайте BamHI лигировали олигонуклеотидную пару, соответствующую следующей последовательности, в которую входит Выбирали клон, в котором встроенный олигонуклеотид по данным секвенирования имел по ходу часовой стрелки указанное выше строение, а его RS-содержащий субфрагментpCIB1711, и в нее были интродуцированы синтетические сайты RS по обеим сторонам промотора 35S в противоположной ориентации, а встроенный промотор 35S имел противоположную ориентацию по отношению к остальной части гена luc. Описанный выше субклон Образовавшийся клон разлагали с помощью BamHI и вторую копию RS интродуциро 49 вали лигированием в олигонуклеотидную пару,описанную в предыдущем параграфе. Выбирали клон, в котором ориентация второго сайта RS была противоположной таковой первого сайтаNO: 13, в ориентации против часовой стрелки). Ориентацию палиндромной последовательностиRS определяют по подчеркнутому центральному асимметричному тринуклеотиду CGT (илиACG на другой цепи). Из образовавшегося клона промотора 2RS вырезали фрагментHindIII/PstI и возвращали в каркас pCIB1711 с помощью двойного лигирования, изменяя ориентацию фрагмента промотора 35S, с получением p2RSLuc. 3. Синтез мРНК. Плазмиды T7lucA50 и pT7RecA50 (фиг. 4 А и 4 Б) линеаризировали с помощью HindIII, делая разрезы сразу после участка поли-(А) по ходу транскрипции. Линеаризованную ДНК экстрагировали фенолом/хлороформом и затем осаждали этанолом. Транскрипцию in vitro линеаризованной ДНК проводили с использованием полимеразы Т 7 из набора Т 7 Cap-Scribe, содержащего [m7G(5')ppp(5')] (фирма Boehringer). В некоторых экспериментах продукт транскрипции сразу же обрабатывали РНКазой, свободной от ДНКазы (0,03 ед./мл, фирмаrRNasin (1 ед./мл, фирма Promega) в течение 5 мин при 37 С и окончательно экстрагировали фенолом/хлороформом и осаждали этанолом. Целостность и концентрацию мРНК определяли с помощью гель-электрофореза на агарозе. 4. Стерилизация биобаллистических носителей. Частицы золота (размером 1,0 мкм - фирмаBiorad, 0,3 мкм - фирма Heraeus) стерилизовали,помещая 60 мг частиц в 100%-ный этанол и 0,1%-ный DEPC. Частицы трижды промывали водой, свободной от РНКазы, и затем ресуспендировали в 1 мл воды, свободной от РНКазы,или в 1 мл лишенного РНКазы 50%-ного раствора глицерина. Для 6 выстрелов использовали аликвоты приготовленных частиц объемом 50 мкл. Макроносители погружали в 100%-ный этанол и 0,1%-ный DEPС, затем трижды промывали в 100%-ном этаноле и сушили на воздухе. Задерживающие экраны автоклавировали. 5. Осаждение нуклеиновой кислоты. ДНК осаждали на 50 мкл суспензии золотых частиц (60 мг/мл) в соответствии с инструкциями фирмы BioRad. мРНК осаждали на 50 мкл суспензии золотых частиц в различных,указанных в описании условиях. Все реагенты для осаждения не содержали РНКазы и их добавляли к суспензии золотых частиц при непрерывном перемешивании при 4 С. По завершении добавления всех реагентов перемешивание продолжали в течение 3 мин, после чего части 001039 50 цы подвергали седиментации путем кратковременного микроцентрифугирования (1 мин). Супернатант удаляли и частицы однократно промывали холодным 100%-ным этанолом и ресуспендировали в 60 мкл 100%-ного этанола. Эту смесь перемешивали и аликвоты объемом 10 мкл наносили с помощью пипетки на диск макроносителя и давали высохнуть на воздухе в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха. 6. Введение микроснарядов в растительные клетки. Микроснаряды вводили в растительные клетки с помощью ускорителя частиц (прибор типа PDS-1000/He) с использованием дисков,разрушаемых при давлении 1100-1500 фунтов/кв. дюйм, помещая образец на расстоянии 5,5 см от пусковой установки. Экран из нержавеющей стали с размерами пор 100 мкм помещали на середине расстояния между задерживающей пластиной и тканью. Пластины-мишени подвергали бомбардировке 1 раз (клетки табака) или 2 раза (клетки кукурузы). 7. Анализ люциферазы. Люциферазу определяли в экстрактах ткани с использованием системы для анализа люциферазы фирмы Promega в соответствии с рекомендациями поставщика. Люциферазную активность выражали в виде единиц света, обнаруживаемого прибором Analytical Luminescence модели 2001 Luminometer, при интегрировании в течение 10 с при 25C. Для вычисления удельной активности определяли концентрацию протеина, используя набор для анализа протеина фирмы Bio-Rad. Г. Результаты. 1. Осаждение интактной мРНК на золотые частицы. С целью оптимизировать введение мРНК и последующую экспрессию были опробованы несколько методов осаждения мРНК на золотые частицы и проанализированы условия и восстановление мРНК в осадке и супернатанте с помощью электрофореза в агарозных гелях. Фракции были обозначены как супернатант (снят пипеткой непосредственно после начальной реакции осаждения), золотая (золотые частицы, суспендированные в воде после осаждения мРНК) и водный элюат (супернатант, полученный после центрифугирования покрытых мРНК золотых частиц, суспендированных в воде). Водный элюат оценивали с целью определить насколько легко осажденная мРНК может повторно растворяться после введения в растительную клетку. При использовании метода осаждения ДНК фирмы DuPont с использованием 1,0 МCaCl2 и 16 мМ спермидина мРНК сильно разлагалась (данные не приведены). Свободное от спермидина основание, вероятно, вызывает щелочной гидролиз РНК. Поэтому для осаждения мРНК на золотые частицы были изучены раз 51 личные концентрации CaCl2 (1,0 М, 0,3 М и 0,07 М) без спермидина. При использовании 1,0 М CaCl2 были получены лучшие результаты и было установлено, что инкубация в течение ночи золотых частиц, покрытых РНК, в 1,0 МCaCl2 при -20 С повысила эффективность до 90100%. мРНК более легко смывалась с частиц в водный элюат после двух промывок этанолом,чем после одной, вероятно, вследствие удаленияCaCl2. 2. Кратковременная экспрессия мРНК люциферазы после биобаллистического введения. С целью определить, может ли мРНК, осажденная на золотые частицы при использовании этого способа, выжить после процесса биобаллистического введения и сможет ли она функционировать в растительных клетках в течение короткого промежутка времени, в растительные клетки вводили синтезированную invitro мРНК люциферазы. Лидерную последовательность CaMV35S и поли-(А)-хвост с 50 остатками аденина включали в конструкцию матрицы T7LucA50 для усиления экспрессии люциферазы в растительных клетках. Кэппированную мРНК люциферазы осаждали на золотые частицы с помощью 1,0 М CaCl2 и инкубировали в течение ночи при -20 С, а затем частицами бомбардировали суспензии клеток кукурузы и табака. Анализ люциферазной активности проводили через 2, 6 и 24 ч после введения. Результаты приведены ниже в табл. 3. Через 2 ч была выявлена выраженная люциферазная активность. Активность увеличилась через 6 ч, но снизилась через 24 ч. В отличие от этого кратковременная экспрессия ДНК плазмиды, содержащей 35S-ген люцифразы (pCIB1711), осажденной на золотые частицы с использованием режима для ДНК фирмы BioRad, оказалась наиболее высокой через 24 ч. Таблица 3 Данные о люциферазной активности в клетках табака и в клетках кукурузы после бомбардировки РНК люциферазы. Приведены результаты измерений люциферазной активности (единицы света/мкг протеина) через 2, 6 и 24 ч после бомбардировки Название РНК люциферазы 3. Подтверждение функционирования рекомбиназной системы R/RS в кукурузе: инвертированный промотор удаляют, активируя кратковременную экспрессию люциферазы. С целью изучить, будет ли сайтспецифическая рекомбиназная система R/RS из Z. rouxii 52 функционировать в кукурузе так же, как и по литературным данным она функционирует в табаке (Onouchi и др., 1991), был проведен анализ кратковременной парной экспрессии, при котором рекомбиназа R, экспрессируемая в течение короткого периода времени в клетках кукурузы, требовалась для удаления промотора для того, чтобы активировать кратковременную экспрессию совместно введенного криптического гена люциферазы. В качестве положительного контроля был проведен анализ кратковременной парной экспрессии в клетках табака. Плазмиду pRec (фиг. 4 Г), содержащую фрагмент 35S-ген рекомбиназы, совместно вводили путем бомбардировки микроснарядами в клетки кукурузы вместе с плазмидой p2RLuc (фиг. 4 Е),содержащей криптический ген люциферазы. Удаление промотора из p2RS должно сохранить копию RS (длиной 31 пара оснований) между промотором и геном luc, действие которой на экспрессию luc было неизвестно. Поэтому также конструировали плазмиду p1RSLuc, являющуюся положительным контролем (фиг. 4 Д), с целью имитировать ожидаемый продукт p2RSLuc,инвертированный с помощью рекомбиназы.p1RSLuc содержит промотор CaMV35S, ориентированный в нужном направлении, но отделенный одним сайтом RS от лидера и последовательности, кодирующей люциферазу. Было установлено, что уровень экспрессии p1RSLuc близок к таковому для pCIB1711 как в табаке,так и в кукурузе (данные не приведены); таким образом, RS-след в гене оказывает только небольшое воздействие на экспрессию luc. Смесь плазмид p2RSLuc и pRec, а также контрольные плазмиды: однуp2RSLuc,p1RSLuc и p1RSLuc плюс pRec осаждали на золотые частицы в соответствии с протоколом фирмы BioRad и вносили с использованием бомбардировки в клетки табака и кукурузы(табл. 4). В то время как рекомбиназа R в клетках табака активировала ген luc с эффективностью, составляющей через 24 ч, по крайней мере, 4% (ср. 26000 и 597000 ед. света/мкг протеина), в кукурузе, вероятно, процесс был существенно менее эффективным, и его эффективность составляла только 0,27% (ср. 53 и 20000 ед. света/мкг протеина). Обнаружено, что очень низкая активность, выявленная в клетках кукурузы,является достоверной и воспроизводимой. Причины, ограничивающие рекомбиназную активность в кукурузе в этом эксперименте, могут быть ядерного происхождения (медленная транскрипция, сайты неправильного сплайсинга, неспособность мРНК проникнуть в ядро) или цитоплазматического происхождения (прекращение трансляции, использование редкого кодона, нестабильность мРНК и т.д.). Если проблема связана с ядром, можно предположить,что она может быть преодолена с помощью биобаллистического введения мРНК рекомбиназы, которое, вероятно, должно обеспечить введение транскрипта непосредственно в цитоплазму. Таблица 4 Рекомбиназная активность в клетках табака и кукурузы после бомбардировки Результаты представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением люциферазной активности (ед. света/мкг протеина), полученных по 6 повторностям для клеток табака и по 3 повторностям для клеток кукурузы. без ДНК Сайт-мишень для рекомбиназы Z. rouxii был предварительно укорочен до области длиной 58 пар оснований (Matsuzaki и др.,Molecular and Cellular Biology, 8: 955-962(1988, включающей примененную в настоящем описании палиндромную последовательность длиной 31 пара оснований. Полученные результаты свидетельствуют о том, что палиндром длиной 31 пара оснований является достаточным для опосредуемого R-геном удаления промотора криптической люциферазной конструкции по изобретению. Таким образом, эта укороченная последовательность RS является достаточной для сайтспецифической рекомбинации как в клетках табака, так и в клетках кукурузы. 4. Кратковременная экспрессия ДНК люциферазы с помощью рекомбиназной активности мРНК. мРНК рекомбиназы совместно осаждали с ДНК p2RSLuc на золотые частицы в условиях,оптимальных для восстановления РНК: 1,0 МCaCl2 и инкубация в течение ночи при -20 С. Частицы вводили в клетки кукурузы с помощью бомбардировки и люциферазную активность измеряли через 2 и 24 ч после этого. Результаты приведены ниже в табл. 5. Экспрессия люциферазы через 2 ч после бомбардировки была незначительной. Через 24 ч экспрессия люциферазы стала заметной как в случае обработки с использованием мРНК рекомбиназы, так и в случае обработки с использованием ДНК фрагмента с 35S-геном рекомбиназы, полученным из плазмиды 2RS с криптическим геном люциферазы. Когда реакция инверсии достигала равновесия, то в этом стационарном состоянии 50% промоторов имели ориентацию on и 50% имели ориентацию off. Таким образом, максимальный ожидаемый уровень экспрессии люциферазы должен составлять 50% от активности в плазмиде p1RSLuc. Удаление промотора, контролируемое мРНК, позволило достичь неожиданно высокой эффективности, составляющей 67% от этого теоретического максимума. Эффективность контролируемой ДНК инверсии 54 также существенно улучшилась, однако чрезвычайно низкий уровень экспрессии p1RSLuc показал, что разработанный для мРНК метод осаждения оказался очень неэффективным для ДНК. Поэтому были изучены дополнительные условия осаждения с целью подбора оптимальных компромиссных условий, эффективных как для ДНК, так и для РНК. Таблица 5 Активность рекомбиназной мРНК в клетках кукурузы Люциферазная активность выражена в виде ед. света/мкг протеина и была измерена через 2 и 24 ч после бомбардировки. Название только матрица мишень+только матрица 5. Эффективное совместное осаждение мРНК и ДНК на золотые частицы. С целью улучшить эффективность совместного введения ДНК и мРНК было пересмотрено применение спермидина в смеси для осаждения, при этом дополнительно был включен трис-буфер с более низким значением рН, повидимому, позволяющий избежать разложения РНК. В присутствии 50 мМ трис-буфера с рН 7,5 ДНК и мРНК совместно осаждали на частицы,используя 1,0 М CaCl2 и 2, 4, 10 или 16 мМ спермидин. Эффективность осаждения нуклеиновых кислот оценивали с помощью гельэлектрофореза на агрозе, как описано выше. Интактные ДНК и мРНК эффективно осаждались на частицы при всех концентрациях спермидина (данные не приведены). Самая низкая концентрация позволяла достичь большей эффективности при повторном смыве ДНК и мРНК с частиц в воду, что может оказаться предпочтительным для кратковременной экспрессии и трансформации. Для окончательного уточнения изменяли концентрацию трис-буфера и при этом определяли эффективность по критерию биологической активности: мРНК Luc осаждали, используя 2 мМ спермидин и 5 мМ (обработка А) или 50 мМ (обработка Б) трис-буфера с рН 7,5, и с помощью бомбардировки вводили в клетки кукурузы. Через 5 ч после бомбардировки уровни кратковременной экспрессии составляли 1,091 и 8000 ед. света/мкг протеина для обработок А и Б соответственно. Более высокая активность мРНК, достигнутая с использованием 50 мМ трис-буфера, свидетельствует о 3-4-кратном улучшении осаждения по сравнению с осаждением, проведенным в предыдущих условиях с использованием 1,0 М CaCl2 и инкубации при Обработки А и Б применяли для осаждения мРНК рекомбиназы с ДНК p2RSLuc и их вводили с помощью бомбардировки в клетки кукурузы и табака. Люциферазную активность измеряли через 24 ч, и полученные результаты приведены ниже в табл. 6. Экспрессия ДНК улучшилась при использовании как 5 мМ, так и 50 мМ трис-буфера, но эти уровни были ниже таковых, достигнутых при использовании процедуры осаждения, рекомендованной фирмойBioRad (табл. 4). При оптимальных для экспрессии мРНК условиях, а именно, при использовании 50 мМ трис-буфера, была достигнута наиболее высокая эффективность рекомбиназной активности, которая составила 18,9 и 9,4% для кукурузы и табака соответственно. Хотя рекомбиназная активность оказалась ниже, чем таковая, приведенная в табл. 5, более высокий уровень экспрессии ДНК важен для достижения стабильной трансформации. Сделано заключение о том, что для более высокой экспрессии РНК и ДНК может применяться низкая концентрация спермидина, забуференного трис. Таблица 6 Экспрессия мРНК рекомбиназы в клетках табака и кукурузы мРНК (4 мкг/6 выстрелов), ДНК p2RSLuc (2 мкг/6 выстрелов) и ДНК p1RSLuc (2 мкг/6 выстрелов) вводили с помощью бомбардировки в клетки табака и кукурузы. В контрольных экспериментах использовали мРНК, синтезирующуюся на генах глюкуронидазы. Люциферазная активность выражена в виде ед. света/мкг протеина и была измерена через 24 ч после бомбардировки. Табак Д. Обсуждение. В настоящем описании представлен способ совместного введения мРНК и ДНК с помощью бомбардировки частицами, что позволяет осуществить кратковременное действие кодируемого мРНК протеина на молекулу ДНК. Совместное введение мРНК и ДНК позволяет интродуцировать в клетку компоненты, обладающие кратковременным действующими функциями,без осуществления постоянной экспрессии,происходящей при стабильной трансформации. Кодируемая мРНК рекомбиназа активна только в течение короткого периода во время введения. Это подход может использоваться для сайтспецифической интродукции донорной ДНК в сайтRS в геноме растения без осложнения, связанного с экспрессией рекомбиназы в образовавшемся растении. Как исследования на агарозном геле, так и изучение экспрессии люциферазы показывают, 56 что условия, предпочтительные для введения ДНК, не являются оптимальными для мРНК и наоборот. Выбирая различные условия осаждения, можно отдавать предпочтение любой из двух нуклеиновых кислот, достигая оптимальных уровней преобразования ДНК в растительной клетке-мишени. Электрофоретический анализ нуклеиновой кислоты на золотых частицах после ее осаждения оказался изящным способом количественной и качественной оценки эффективности различных условий осаждения. Этот подход может применяться для дальнейшего окончательного уточнения условий введения нуклеиновой кислоты с помощью бомбардировки частицами. Однако окончательным критерием должна быть биологическая активность, поскольку гель-электрофорез позволяет выявить только крупные повреждения. Интродуцируемые экзогенные молекулы ДНК по настоящему изобретению конструировали с учетом трех особенностей, которые, как известно, играют определенную роль в эффективной экспрессии транскрипта. К 5'-концу добавляли кэп с той целью, чтобы он действовал в качестве сайта узнавания при связывании эукариотического фактора инициации, наиболее ранней и существенной стадии трансляции. Во время транскрипции in vitro на 3'-конце синтезировали поли-(А)-хвост, состоящий из 50 остатков остатков аденина, поскольку неаденилированные мРНК транслируются приблизительно в 100-200 раз менее эффективно по сравнению с их аденилированными копиями в подвергнутых электропорации протопластах табака, моркови,кукурузы и риса (Gallie и др., Plant сell, 1989). Также было показано, что эффективность полиаденилированной мРНК усиливается на порядок в присутствии 5'-кэпа (Gallie, 1991). Было показано, что включение нетранслируемой лидерной последовательности CaMV35S усиливает экспрессию в клетках как табака, так и кукурузы(Gallie и др., Plant сell, 1989; Dawson Day и др.,1993). Непосредственное введение мРНК в растительные клетки создает преимущества при изучении клеточных функций. Стабильность мРНК и трансляционная эффективность может быть оценена in vivo независимо от факторов транскрипции, процессинга и транспорта в цитоплазму. Доказано, что пригодными и эффективными методами интродукции мРНК в протопласты растений являются электропорация (Higgs и(Gallie, Plant cell reports, 1993). Однако эти методы введения ограничены протопластами, в то время как биобаллистическое введение широко применимо для многих типов растительных клеток и органов. Протеины, которые могут оказаться ненужными или даже вредными при их стабильной экспрессии в трансгенном растении, могут кратковременно экспрессироваться мРНК, введенной биобаллистическим методом. 57 Экспрессия рекомбиназы, например, в растениях типа R/RS, может привести к мозаичным схемам эксцизии, тогда как генетические скрещивания, проводимые между растениями, содержащими ген рекомбиназы, и растениями,содержащими сайт-мишень, часто приводят к химерной реакомбинантной активности и мозаичной экспрессии в растениях первого поколения (F1) (Russell и др., 1992; Onouchi и др.,1995). Для получения улучшаемых в последующем трансгенных конструкций для культурных растениях может быть использована системаR/RS для замены новым(и) геном(ами) старых генов точно в месте расположения последних. Таким образом, первая трансгенная кассета и ее селектируемый маркер (фланкированный сайтами RS) могут быть замещены второй кассетой с другим селектируемым маркером. В свою очередь вторая кассета может быть замещена третьей с использованием вновь первого селектируемого маркера. Этот подход должен уменьшить количество требуемых селектируемых маркеров и должен позволить избежать влияния изменения положения трансгенной кассеты. Применение сайтспецифических систем рекомбинации в растениях открывает возможность лучшего контроля за инсерцией и экспрессией трансгена. Рекомбиназные системы позволяют осуществлять инсерцию в заранее определенное место в геноме и могут позволить избежать так называемых влияний месторасположения (Fukushige и Sauer, 1992; Lakso и др.,1992; OGorman и др., 1991). Опосредуемые рекомбиназой случаи делеций и инверсий трансгенов дают возможность контролировать экспрессию гена и удалять селектируемые маркерные гены (см. обзор Odell и Russell, 1994). Интродукция рекомбиназной активности в форме мРНК может расширить это применение, увеличивая встречаемость случаев рекомбинации на ранней стадии процесса трансформации и снижая риск возникновения мозаичности. Кроме того, введение мРНК может обеспечить большую степень свободы при конструировании сайтспецифических схем интеграции, что позволяет избежать интродукции рекомбиназной генетической информации в геном. Пример 4. Совместная бомбардировка с использованием мРНК, кодирующей обеспечивающие интеграцию протеины VirD1 и VirD2, и ДНК в клетки табака и кукурузы. Как указывалось в разделе Подробное описание изобретения, можно ожидать, что обеспечивающие интеграцию протеины, введенные в эукариотическую клетку, предназначенную для трансформации с помощью транслируемой РНК, будут продуцироваться в течение ограниченного периода времени до тех пор,пока не будет разложена транслируемая РНК. Можно ожидать, что полученные с помощью 58 этой РНК протеины сохранятся в растительной клетке в течение ограниченного периода времени до тех пор, пока они также не будут разложены в результате нормальных клеточных процессов. Такое введение обеспечивающих интеграцию протеинов в форме транслируемой РНК представляет собой способ кратковременного введения таких протеинов. Кратковременное введение таких протеинов может оказаться предпочтительным в тех случаях, когда продолжительное присутствие этих протеинов может оказывать нежелательные воздействия. В следующем примере описано такое введение протеинов VirD1 и VirD2 в растительные клетки вместе с фрагментом ДНК, связанным с пограничными последовательностями Т-ДНК. Полученные результаты показывают, что эти протеины Vir обладают способностью продуцироваться и им присуща активность, обеспечивающая интеграцию фрагмента ДНК. Использованный растительный материал Клетки кукурузы Суспензионные культуры кукурузы (Zeamays L.) вначале получали из хранившегося в криогенных условиях эмбриогенного каллюса типа II, взятого из незрелых зародышей элитной линии (2717), родственной В 73, и выращивали в жидкой среде N6 (Chu и др., 1975), дополненной 30 г/л сахарозы и 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) (2N63S). Культуры инкубировали при 25 С в темноте на орбитальном шейкере при 150 об./мин. Суспензионные культуры пересевали каждые 7 дней путем переноса 1 мл клеточной массы в 50 мл свежей жидкой среды 2N63S. Суспензии клеток кукурузы, применяемые для экспериментов по бомбардировке, были взяты из 3-дневных выращенных ускоренным методом культур. Перед бомбардировкой приблизительно 0,5 мл клеточной массы фильтровали под вакуумом на 7 сантиметровых фильтрах (Whatman4). Клетки табака Линию клеток Nicotiana tabacum NT-1 выращивали в среде Мурасига и Скуга (MS-среда),дополненной 2 мг/л 2,4-Д и сахарозой (30 г/л). Клетки пересевали один раз в неделю, добавляя 5 мл инокулята к 100 мл свежей среды в колбы объемом 500 мл. Колбы инкубировали при 27 С на роторном шейкере при 125 об./мин. Аликвоты по 0,5 мл четырехдневных культур после пересева наносили на стерильные фильтры(Whatman4). Фильтры затем переносили наMS-среду. Конструирование плазмид 1. Конструирование вектора, содержащего промотор T7 и поли-(А)-хвост. Полилинкер (SphI-EcoRI-NheI-ClaI-BglIIAsp718-HindIII-XhoI-HindIII, инактивирующий сайт HindIII) встраивали в сайты SphI-HindIII плазмиды pT7RecA50 (см. пример 3). Затем в соответствующие сайты встраивали олигонук 59 леотид Asp718-A(50)-DraI-HindIII, получая рT7A50. 2. Конструирование pT7D1A50. Фрагмент EcoRI-BglII, содержащий кодирующую область virD1 и предварительно клонированный во фрагменте EcoRI-BamHI плазмиды pSG5 (из фрагмента EcoRI-BamHIBamHI-HaeIII во фрагменте BamHI-EcoRV плазмиды pSK, полученной из pBluescript, для его превращения во фрагмент BamI-ClaI. Синтез мРНК Плазмиды T7D1A50 и T7D2A50 линеаризировали с помощью XhoI, делая разрезы сразу после участка поли-(А) по ходу транскрипции. Линеаризованную ДНК экстрагировали фенолом/хлороформом и затем осаждали этанолом. Транскрипцию in vitro линеаризованной ДНК проводили, используя полимеразу Т 7 из набора Т 7 Cap-Scribe, содержащего [m7G(5')ppp(5')](фирма Boehringer). Целостность и концентрацию мРНК, кодирующей VirD1 и VirD2, определяли с помощью гель-электрофореза на агарозе. Стерилизация биобаллистических носителей Частицы золота (размером 0,3 мкм - фирмаHeraeus) стерилизовали, помещая 60 мг частиц в 100%-ный этанол и 0,1%-ный DEPC. Частицы промывали трижды водой, свободной от РНКазы, и затем ресуспендировали в 1 мл свободного от РНКазы 50%-ного раствора глицерина. Для 6 выстрелов использовали аликвоты объемом 50 мкл приготовленных частиц. Макроносители погружали в 100%-ный этанол и 0,1%-ныйDEPC, а затем трижды промывали в 100%-ном этаноле и сушили на воздухе. Задерживающие экраны автоклавировали. Осаждение нуклеиновой кислоты ДНК (1 мкг) и мРНК (приблизительно 8 мкг: 4 мкг virD1 и 4 мкг virD2 или 8 мкг неспецифической мРНК в качестве контроля) осаждали на 50 мкл суспензии золотых частиц (60 мг/мл; 0,3 мкм), добавляя последовательно 0,5 мкл трис-буфера (1 М), 50 мкл CaCl2 (2,5 М) и 2,5 мкл 0,1 М спермидина. По завершении добавления всех реагентов перемешивание продолжали в течение 3 мин, после чего частицы подвергали седиментации путем кратковременного микроцентрифугирования (1 мин). Супернатант удаляли и частицы однократно промывали холодным 100%-ным этанолом и ресуспендировали в 60 мкл 100%-ного этанола. Эту смесь перемешивали и аликвоты объемом 10 мкл наносили с помощью пипетки на диск макроносителя и давали высохнуть на воздухе в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха. 60 Введение микроснарядов в растительные клетки Микроснаряды вводили в растительные клетки с помощью ускорителя частиц (прибор типа PDS-1000/He; DuPont) с использованием дисков, разрушаемых при давлении 1100 фунтов/кв. дюйм, помещая образец на расстоянии 5,5 см от пусковой установки. Экран из нержавеющей стали с размерами пор 100 мкм помещали на середине расстояния между задерживающей пластиной и тканью. Пластины-мишени подвергали бомбардировке 2 раза. Анализ люциферазы Люциферазу определяли в экстрактах ткани с использованием системы для анализа люциферазы фирмы Promega в соответствии с рекомендациями поставщика. Люциферазную активность выражали в виде единиц света, обнаруживаемого прибором Analytical Luminescence модели 2001 Luminometer, проинтегрированного в течение 10 с при 25C. Для вычисления удельной активности определяли концентрацию протеина, используя набор для анализа протеина фирмы Bio-Rad. Результаты Анализ люциферазной активности проводили через 24 ч после бомбардировки. мРНКvirD1 и virD2 вводили с помощью совместной бомбардировки с использованием плазмидыp35SRBLuc, которая содержит правую пограничную последовательность, встроенную между промотором 35S и кодирующей последовательностью люциферазы. В контрольном эксперименте p35SRBLuc вводили в результате совместной бомбардировки с неспецифической мРНК. Результаты первого эксперимента приведены ниже в табл. 7. Результаты следующего эксперимента описаны в примере 8 и приведены в табл. 14. Таблица 7 Бомбардировка растительных клеток мРНКvirD1 и virD2 Числа в скобках обозначают молярное соотношение плазмид и мРНК. В каждом эксперименте с помощью совместной бомбардировки также вводили рGUS. После инкубации в течение 24 ч ткани гомогенизировали и определяли активность ферментов. Активность выражали в виде отношения активности люциферазы (Luc) к активности -глюкуронидазы (Glu). Анализировали независимые бомбардировки и данные представлены в виде средних значений по 3 повторностямстандартное отклонение (СО). Табак Среднее СО значение 9,3 0,4 Кукуруза Среднее СО значение 8,6 1,0
МПК / Метки
МПК: C12N 15/82, A01H 5/00
Метки: клетки, получения, фертильного, интеграции, экзогенной, способ, днк, растения, трансгенного, геном, растительной, интегрированной
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-1039-sposob-integracii-ekzogennojj-dnk-v-genom-rastitelnojj-kletki-i-sposob-polucheniya-fertilnogo-transgennogo-rasteniya-s-integrirovannojj-v-genom-ekzogennojj-dnk.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ интеграции экзогенной днк в геном растительной клетки и способ получения фертильного трансгенного растения с интегрированной в геном экзогенной днк.</a>
Рекомбинантная двухцепочная последовательность днк для экспрессии сахарозофосфорилазы в растении, способ получения трансгенного растения с повышенной экспрессией сахарозофосфорилазы в различных частяхрастения и линия трансформированных клеток растения
Номер патента: 634
Опубликовано: 29.12.1999
Авторы: Девирд Ян Виллем, Бэрри Джерард Фрэнсис, Велдон Марсиа Ли, Кишор Джениш Мерти
МПК: C12N 15/82
Метки: частяхрастения, экспрессией, трансгенного, экспрессии, способ, линия, повышенной, днк, растения, сахарозофосфорилазы, трансформированных, растении, рекомбинантная, последовательность, двухцепочная, клеток, различных, получения
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантная двухцепочечная последовательность ДНК для экспрессии сахарозофосфорилазы в растении, содержащая следующие конструктивные элементы: - промотор, активный в определенных клетках растений; - ген, кодирующий фермент сахарозофосфорилазу Streptococcus mutans, имеющий следующую последовательность нуклеотидов: (SEQ ID NO:5); и 3` - нетранслируемую область, обеспечивающую терминацию транскрипции гена сахарозофосфорилазы и...
Выделенная последовательность днк, вектор для экспрессии последовательности днк и способ получения вирусоподобных частиц
Номер патента: 969
Опубликовано: 28.08.2000
Авторы: Джордж Хью Э., Лехман Дэйл И., Ниппер Майкл П., Джойс Джозеф Г., Хофманн Катрин Дж., Янсен Катрин У.
МПК: A61K 39/12, C07K 16/08, A61P 31/20...
Метки: вирусоподобных, днк, способ, последовательности, получения, экспрессии, вектор, выделенная, частиц, последовательность
Формула / Реферат:
1. Выделенная последовательность ДНК, представляющая собой гибридный ген L1 HPV6/11, кодирующий капсидный белок L1 папилломавируса человека типа 11 и не содержащий внутренних сигналов терминации транскрипции, которые распознаются в клетках дрожжей, имеющая следующую структуру: или ее функциональное производное или аналог. 2. Вектор для экспрессии последовательности ДНК по п.1 формулы в клетках-хозяевах, сконструированный на основе...
Способ получения дипептидов
Номер патента: 736
Опубликовано: 28.02.2000
Авторы: Кондер Майкл Дж., Бонеман В.Скотт, Винси Виктор А., Гойал Анил
МПК: C07K 5/062, C12N 15/12
Метки: получения, способ, дипептидов
Формула / Реферат:
1. Способ получения дипептидов Ala-Pro, представляющий собой а) введение экспрессирующего ДНК-вектора в подходящие клетки-хозяева, при этом указанный экспрессирующий ДНК-вектор содержит молекулу ДНК, кодирующую олигопептид или полипептид, содержащий множественные прямые повторы указанного дипептида Ala-Pro; б) культивирование указанных клеток-хозяев в условиях, необходимых для экспрессии указанных олигопептида или полипептида; в) расщепление...
Cпособ получения замещенных фенолов и способ получения витамина е с их использованием
Номер патента: 28
Опубликовано: 26.02.1998
Авторы: Ансель Жан-Эрик, Бьенейм Юг, Мейллян Пьер
МПК: B01J 31/24, C07C 39/19, A61K 31/355...
Метки: использованием, витамина, способ, замещенных, получения, фенолов, cпособ
Формула / Реферат:
1. Способ получения замещенных фенолов путем конденсации в однофазной среде фенола общей формулы где R обозначает один или несколько одинаковых или различных радикалов, выбранных из группы, включающей водород, гидроксильную группу и C1-C6 алкил, с производным бутадиена в присутствии катализатора на основе Rd+1, фосфинового соединения и основания, отличающийся тем, что в качестве производного бутадиена используют соединение, содержащее по...
Производные 5-0-дезозаминил-6-0-метилэритронолида а, способ их получения и их применение для получения биологически активных продуктов
Номер патента: 575
Опубликовано: 29.12.1999
Авторы: Бонне Алан, Дельтиль Мишель, Мазюри Алан
МПК: C07H 17/08
Метки: применение, способ, производные, получения, активных, биологически, 5-0-дезозаминил-6-0-метилэритронолида, продуктов
Формула / Реферат:
1. Соединения формулы (I): в которой или R1 представляет радикал алкил, содержащий до 8 атомов углерода, замещенный одним или несколькими радикалами алкила, содержащими до 8 атомов углерода, или одним или несколькими радикалами арила, содержащими до 14 атомов углерода, или R1 представляет радикал арил, содержащий до 14 атомов углерода, который может быть замещен одним или несколькими радикалами алкил, алкенил или алкинил, содержащими до 8...
Предыдущий патент: Способ показа неподвижных изображений в телевизионной системе с временным разделением
Следующий патент: Система спутникового прямого радиовещания
Случайный патент: Твердая лекарственная форма, обладающая желчегонным действием (варианты)