Способ определения состояния организма посредством измерения пептидов

1 Предметом настоящего изобретения является способ определения состояния организма посредством измерения пептидов в пробе организма. Для определения состояния организма применяют различные аналитические методы. Так, например, в диагностике более высоко организованных организмов в случае патологических результатов пытаются найти причину патологических изменений на основе симптоматики, чтобы спланировать каузальную терапию. Затем стараются секвенированием геномов организмов и введением "геномов дикого типа" разработать эталон среднего, "здорового" организма, чтобы затем индивидуальные отклонения, которые могут указывать на возможное патогенное развитие, обнаруживать соответствующим генным анализом. Недостатком первой методики является невозможность проведения безгипотезной диагностики, так как при этом устанавливают диагноз, который основывается на предположениях. Недостаток второй методики заключается в отсутствии с точки зрения перспективы, возможности диагностировать важные или даже все заболевания, вызванные генетическими нарушениями. Другой недостаток последней методики может состоять также в том, что мутация на гене не приводит непременно к экспрессии связанных с этим фенотипов. Следовательно, было бы желательно иметь в распоряжении универсальный способ диагностики, с помощью которого можно избежать описанных недостатков и, в частности, проводить свободную от гипотез диагностику. Кроме того, способ диагностики должен быть универсальным в применении, не ограничиваться высокоорганизованными системами, а чтобы его можно было одновременно применять и для определения состояния низших организмов. К тому же он должен легко реализовываться и осуществляться уже известной техникой. Задачей настоящего изобретения является разработка такого способа. Поставленная техническая задача достигается простым образом при помощи способа с признаками, указанными в п.1. Зависимые пункты формулы изобретения относятся к предпочтительным вариантам осуществления способа согласно изобретению. Способ определения состояния организма согласно изобретению исходит из того, что берут пробу исследуемого организма. Проба может быть также полным организмом. Проба должна содержать низкомолекулярные пептиды,при этом не является помехой, если проба наряду с низкомолекулярными пептидами содержит также высокомолекулярные пептиды или протеины. При этом выявляют низкомолекулярные пептиды и непосредственно характеризуют согласно изобретению, и они служат в качестве индикатора состояния организма. При этом 2 можно измерительной техникой непосредственно определить отдельные пептиды, множество пептидов, включая все имеющиеся в пробе и определяемые измерительной техникой низкомолекулярные пептиды. Иначе, чем при обычных аналитических или диагностических методах, таких как гель-электрофорез или двумерный электрофорез, и, например, клинические диагностические методы, здесь исследовали не высокомолекулярные структуры, как например,протеины. В противоположность известным методам диагностики, как например, радиоиммунный анализ или другие конкурирующие анализы измерения пептидных гормонов и им подобных, низкомолекулярные пептиды согласно изобретению измеряют непосредственно, а не косвенно, как в названных методах. Эталоном служит распределение низкомолекулярных пептидов при типичном поперечном срезе определенных контрольных образцов. В способе согласно изобретению исследуемую пробу тканей или жидкостей можно брать у организма, состояние которого должно быть определено, или это может быть сам организм или его части. В случае исследования низших организмов предпочтительно сам организм служит пробой. В качестве низших организмов принимают во внимание особенно одноклеточные организмы, как прокариотные системы или простые эукариотные системы, как дрожжи или другие микроорганизмы. Согласно изобретению низкомолекулярные пептиды, которые должны быть привлечены для измерения, предпочтительно имеют молекулярный вес максимально 30.000 Дальтон. Нижний предел не является критическим, однако дипептиды представляют собой нижний предел низкомолекулярных пептидов, которые должны контролироваться согласно изобретению. Особенно предпочтительны молекулярные веса низкомолекулярных пептидов от 100 до 10.000 Дальтон. В случае необходимости, например, если это обусловлено измененным измерительным устройством, может быть предпочтительным удалять из пробы высокомолекулярные пептиды или протеины, а также другие биополимеры,которые могут интерферировать при измерении. Это не требуется, в частности, если посредством применяемого способа измерения согласно изобретению высокомолекулярные пептидные соединения не определяются. Предпочтительно для определения низкомолекулярных пептидов используют согласно изобретению масс-спектроскопию. При этом особенно пригодным оказался так называемый МАЛДИ-метод (поддерженная матрицей лазерно-десорбционно-ионизационная масс-спектроскопия). Если масс-спектрометрию применяют как метод, рекомендуется использовать данные,определяемые масс-спектроскопией, для характеристики низкомолекулярных пептидов, на 3 пример, их молекулярный вес. При определенных обстоятельствах можно также анализировать другие параметры, как, например, заряд пептидов, или характеристическое время удерживания на хроматографических колонках, или фрагментарный образец низкомолекулярных пептидов, или комбинации массы низкомолекулярных пептидов и их зарядов. В зависимости от постановки вопроса, связанного с определением состояния организма,может быть предпочтительно разделить пробу на несколько фракций, и проанализировать пробы в свете различных вопросов или с помощью различных измерительных устройств, и тем самым определить состояние организма. В качестве организмов пригодны особенно прокариоты, эукариоты, многоклеточные организмы, клетки тканевых культур, клетки животных и человека. Так, согласно способу по изобретению можно исследовать состояние генетически измененных или трансформированных и/или кондиционированных организмов. Это может быть особенно предпочтительно при повторных контролях трансформированных систем, чтобы знать, в какой мере в трансформированных организмах могут развиваться неожиданные или нежелательные свойства, в которых образуются, например, пептиды, которые указывают на нежелательные или неожиданные свойства, например токсические свойства. В частности, каждое сознательно или несознательно проведенное манипулирование(кондиционирование) организма может оказывать влияние на его состояние, хотя бы в пределах назначения лекарственных средств, генной терапии, при инфекциях, на рабочем месте в результате контакта с химическими веществами,при опытах с животными, особенно с трансгенными животными и "knock-out"-мутантами. В особенности при таких способах путем внутрии межиндивидуального сравнения, например,путем хронологического взятия проб из организма перед или в ходе проведения вышеназванного мероприятия или путем сравнения с необработанными контрольными организмами можно проверить, появились ли в самом деле предсказанные, желательные изменения в состоянии и появились ли кроме этого или вместо этого непредсказанные, нежелательные или также желательные изменения, которые определяют свободным от гипотез способом согласно изобретению. Поэтому способ согласно изобретению пригоден также, например, для сопровождения клинических исследований, токсикологических исследований при опробовании лекарственных средств любого вида, для анализа (определения продуктов расщепления, для идентификации генных продуктов). В ветеринарии и в медицине человека способ согласно изобретению имеет огромное значение, заключающееся в том, что стал возмож 001033 4 ным безгипотезный контроль состояния упомянутого организма. Следовательно, анализ уже не осуществляют, руководствуясь предвзятым мнением, а составляют истинную общую картину состояния исследуемого организма. Способ согласно изобретению, который может быть назван дифференциальным индикатором пептидов (Differential Peptide Display), исходит при этом из того, что в здоровом организме имеется определенный пептидный образец и поэтому он может служить эталонным стандартом. Если определить пептидное состояние индивидуума и сравнить его с эталоном, то можно, с одной стороны, установить отклонения, свидетельствующие уже о первом указании на возможное патогенное состояние. Если теперь отклонения, которые были установлены путем сравнения с подобными патогенными состояниями, определяют из соответствующих проб заболевшего, то уже можно путем сравнения отклонений в образце пептидов пробы индивидуума и в соответствии с отклонениями с тождественной картиной заболевания идентифицировать данное заболевание непосредственно в результате анализа. При этом согласно изобретению можно осуществлять следующее. Для получения пробы-эталона можно использовать сначала ультрафильтраты жидкостей организма и тканевые экстракты. Осуществляют получение фильтратных пептидов и их разделение на фракции, в результате чего получают фракции низкомолекулярных пептидов. Характеризовать пептидные фракции можно, например, на основании режима удерживания и молекулярного веса,определяемого хроматографией или массспектроскопией. Если используют, например,ультрафильтрат пациентов, которые страдают известным заболеванием, и сравнивают его с установленным ранее спектром здорового испытуемого, можно провести благодаря отклоняющемуся образцу сопоставление специфического заболевания с состоянием соответствующей смеси пептидов. Способ можно использовать также известным традиционным образом, причем, например, сразу запрашивают соответствующий пептидный образец, указывающий на патогенные изменения. В отдельном случае это может быть даже пептид, характерный для соответствующего заболевания. Если анализируют например, пробу пациента, у которого распознают определенную картину заболевания и существует гипотеза причины этого заболевания, можно, например, этот специфический пептид запрашивать также при анализе согласно изобретению и при положительном исходе намечать соответствующее лечение. Так, возможно сначала взять пробу у пациента, с помощью способа по изобретению определить картину состояния, чтобы затем при наличии отклонения, указывающего на патогенное состояние,или провести контрольное измерение известным 5 подтверждающим анализом, с привлечением обычных клинических анализов, или провести контрольное измерение путем специфического скрининга после индикатора патогенного состояния. При этом пептиды можно получать известными специалисту способами, как например, ультрафильтрация соответствующего исходного материала. При этом применяют фильтры с молекулярным размером отверстий,которые лежат в обсуждаемой согласно изобретению области, а именно между молекулярным весом пептида и максимально 30.000 Дальтон. Подходящим выбором соответствующих мембран можно получать также определенные молекулярно-весовые фракции. Предпочтительно путем фильтрации получают от 0,2 мл до 50 л фильтрата, который, например, сразу после окончания фильтрации подкислением разбавленной соляной кислотой доводят до величины рН от 2 до 4. Названные количества служат, в частности, для того, чтобы исследовать в сборниках пробы 1, во-первых, для обнаружения эталонных проб здоровых испытуемых или для определения специфических относительно заболевания пептидных маркеров для составления банка данных пептидов. Пептиды, находящиеся в фильтрате после ультрафильтрации, получают путем адсорбции на хроматографических материалах, особенно катионообменных смолах, как например, фрактогель, анионообменный фрактогель (ТМАЕ) и материалы с обращенной фазой (ОФ), с последующим элюированием линейными градиентами или ступенчатыми градиентами. Для дальнейшей очистки можно проводить, в случае необходимости, другие хроматографические разделения, особенно на материале с обращенными фазами. Определение пептидных фракций осуществляют предпочтительно масс-спектрометрическим анализом, особенно при помощи МАЛДИ - масс-спектрометрами или ЭРИ - массспектрометрами (электрораспылительно-ионизационной масс-спектрометрии). Это методы,которые применяют для анализа пептидов. При этом работают предпочтительно в диалоговом режиме ОФ-разделения с микроотверстиями с масс-спектрометрией (АС-МС-связь). Из полученных данных составляют многомерную таблицу по режимам удержания, молекулярному весу и интенсивности сигналов в качестве предпочтительных главных параметров. Однако можно определять также другие величины, определяемые с помощью названных методов. Данные о пациентах с известным основным заболеванием, полученные вышеназванными операциями, сравнивают с полученными одновременно данными здоровой эталонной популяции. При этом устанавливают как качественные изменения (например, появление новых пептидов или отсутствие пептидов), так и 6 количественные изменения (увеличенное или уменьшенное появление отдельных пептидов). Мишени, определенные сравнительным анализом, можно, если требуется, очищать и идентифицировать дальше методами, известными специалисту из химии пептидов. Полученную информацию о последовательностях можно затем сравнивать с банками данных протеинов и нуклеиновых кислот и потом с литературными данными. Релевантность представленных пептидов относительно исследованного заболевания проверяют функциональными исследованиями и последовательным скринингом на подходящих группах пациентов. Пример 1. Применение жидкостей организма, здесь: фильтрат крови (гемофильтрат,ГФ). 1. Получение гемофильтрата. Гемофильтрат получают путем артериовенозной или также вено-венозной гемофильтрации известными специалисту методами у выбранных пациентов или испытуемых. ГФ получают способом, который, в принципе, применяют обычно для пациентов с хроническим заболеванием почек. Через артериальный отвод и венозный приток (артерио-венозный ГФ) или венозный отвод с венозным притоком (веновенозный ГФ) кровь пациента, при аппаратурной поддержке, направляют через гемофильтрующий прибор (например, гемопроцессор,Сарториус Гттинген; АК IO HFM, Гамбро Гехинген) через гемофильтр (например ГемофлоуF 60 или Гемофлоу HF 80 S, Фрезиниус, Бад Гомбург; Гемофлоу FH 77 Н и Гемофлоу HF 88 Н, Гамбро), который имеет молекулярный размер пор вплоть до 30 кД. Взятый у пациента объем фильтрата замещают раствором электролита (например SH 01, SH 05, SH 22, SH 29,Шива, Кландорф). Согласно настоящему изобретению проводят диагностическую гемофильтрацию с целью получения от I до 30 л ГФ у пациента в течение гемофильтрации. Гемофильтрат во избежание протеолиза сразу с помощью разбавленной кислоты (например I M HCl) доводят до величины рН между 2 и 4 и охлаждают до 4 С. 2. Получение ГФ-пептидов и разделение на фракции. 2.1. Экстракция пептидов ступенчатым элюированием. 10 л гемофильтрата разбавляют деионизированной водой до проводимости 6 мс/см и устанавливают с помощью соляной кислоты рН 2,7. Затем наносят ГФ на хроматографическую колонку. После связывания ГФпептидов элюируют связанные пептиды с помощью ступенчатого элюирования с соответствующим значением рН. При этом применяют 7 буферных растворов с возрастающей величиной рН. Условия хроматографии: поток при нанесении: 100 мл/мин; поток при элюировании: 30 мл/мин; детектирование: 214, 280 нм; колонка: Вантаже (Амикон, Виттен), диаметр 6 см, высота наполнения 7 см; материал колонки: фрактогель TSK SP 650 М (Мерк, Дармштадт); установка: БиоСАО 250, Perseptive Biosystems, Висбаден-Норденштадт. Буферный раствор Элюирующий буферный раствор I Элюирующий буферный раствор 2 Элюирующий буферный раствор 3 Элюирующий буферный раствор 4 Элюирующий буферный раствор 5 Элюирующий буферный раствор 6 Элюирующий буферный раствор 7 Элюаты 1-7 собирают отдельно. 2.2. Второе хроматографическое разделение. Элюаты 1-7 хроматографируют отдельно на колонке с обращенной фазой. Условия хроматографии: поток или нанесение: 10 мл/мин; поток при элюировании: 4 мл/мин; детектирование: 214 нм; колонка: стальная, кислотная для высокоэффективной жидкостной хроматографии (диаметр 1 см, высота заполнения 12,5 материал колонки: источник хроматографии с обращенными фазами 15 мкм (Фармация, Фрайбург),Установка: БиоСАD, Perseptive Biosystems,Висбаден-Норденштадт. Элюат собирают фракциями по 4 мл. 3. Составление картотеки пептидных фракций. 3.1. Полученные в 2.2. аликвотные фракции наносят на колонку с обращенными фазами и элюируют в градиенте. Обнаружение проводят ультрафиолетовым детектором в диалоговом режиме с электрораспылительным массспектрометром. Условия хроматогрфии: поток при нанесении: 20 мкл/мин; поток при элюировании: 20 мкл/мин; детектирование: 220 нм; колонка: С 18 AQS, 3 мкм, 120 А, диаметр 1 мм, длина 10 см УМС; Шермбек). Установка: ABI 140 В система с двойным растворителем. Буферный раствор А: 0,06% трифторуксусной кислоты в воде. Буферный раствор В: 80% ацетонитрила в А.API III с поверхностью раздела электрораспылителя (Перкин-Елмер, Вайтерштадт). Положительный ион модус. Диапазон измерения: м/z от 300 до 2.390. Время сканирования: 7 с. Окно сканирования: 0,25 м/z. Регистрацию данных осуществляют при помощи математического обеспечения MacSpec или MultiView (Перкин-Аймер). 3.2. Измерение отдельных фракций путем МАЛДИ - масс-спектрометрией. Полученные в 2.2. аликвотные фракции измеряют при помощи различных матричных веществ, например, при добавке L (-)-фукозы в МАЛДИ - масс-спектрометрии. Из необработанных данных составляют многомерную таблицу, учитывая номер сканирования, интенсивность сигнала и после расчета массу многозарядных ионов сканирования. 4. Сравнительный анализ. 4.1. Идентификация новых, отсутствующих или определенно различных пептидов. Путем сравнения полученных в 3.3 блоков данных, которые можно назвать также карточками пептидов, устанавливают качественные и/или количественные различия. При этом, принимая во внимание контроль и пробы, привлекают для сравнения отдельные блоки данных или также группы блоков данных. 4.2. Химическая характеристика пептидов идентифицированных мишеней. Из полученного сырого материала (например, объем препарационного гемофильтрата) очищают идентифицированные мишени в количествах, которые позволяют проводить идентифицирование. Для этого используют различные,известные специалисту хроматографические методы разделения (обращенные фазы, ионообмен, хроматография исключения, гидрофобная интерактивная хроматография и т.д.), используемые, в общем, для разделения смесей пептидов. После каждого хроматграфического разделения фракции идентифицируют мишени во фракциях путем ЭРИ - масс-спектроскопии,МАЛДИ - масс-спектроскопии или также АСмасс-спектроскопии снова. Этот прием при изменении хроматографических параметров повторяют так часто, пока не образуется чистый продукт искомой спецификации, т.е. время удержания и молекулярный вес. После этого проводят определение частичной или полной аминокислотной последовательности или фрагментарного образца. Затем проводят сравнение банка данных с известными банками данных(Швейцария-Прот и банк данных EMBLпептидов и нуклеиновых кислот) с целью идентифицирования частичной или полной аминокислотной последовательности или фрагмен 9 тарного образца. Если данные не внесены в банк данных, поясняют первичную структуру. Пример 2. Использование жидкостей организма, здесь: асцит. 1. Получение асцита. Асцит образуется как внесосудистый экссудат при различных заболеваниях (злокачественные опухоли, нарушения печени и т.д.). В рамках настоящего способа получают пункцией от 10 мл до 10 л асцита и после этого во избежание протеолиза с помощью разбавленной кислоты (например I M HC1) сразу устанавливают величину рН между 2,0 и 4,0 и охлаждают до 4 С. После ультрафильтрации через мембрану из триацетатцеллюлозы с размером пор 30 кD(Сартокон-Мини-аппаратура, Сарториус) фильтрат используют дальше в качестве источника пептидов. 2. Получение пептидного асцита и разделение на фракции. 2.1. Экстракции пептидов с градиентным элюированием. 5 л асцитного фильтрата доводят до величины рН 2,0 и разделяют на колонке с обращенными фазами для препаративной хроматографии. Условия хроматографии: поток при нанесении 40 мл/мин; поток при элюировании: 40 мл/мин; детектирование: 214 нм, 280 нм; колонка: система с фильтрующим элементом "Waters", диаметр 4,7 см, высота наполнения 30 см; материал колонки: Vydac RP-C18, 15 - 20 мкм; установка: БиоСАD, Perseptive Biosystems,Висбаден-Норденштадт,буферный раствор А: 0,1% трифторуксусной кислоты в воде; буферный раствор В: 80% ацетонитрила в А; градиент: 0% В на 100% В в 3,000 мл. Элюат собирают во фракции по 50 мл. Далее определяют характеристики в соответствии с примером 1. Пример 3. Использование жидкостей организма, здесь: моча. 1. Получение мочи. Мочу получают катетором или в виде самопроизвольной мочи у пациентов в количествах от 0,5 до 50 л и во избежание протеолиза при помощи разбавленной кислоты (например IM HC1) доводят рН до величины между 2,0 и 4,0 и охлаждают до 4 С. После ультрафильтрации через мембрану из триацетатцеллюлозы с размером пор 30 кD (Сартокон-Мини-аппаратура, Сарториус) фильтрат используют далее в качестве источника пептидов. 2. Получение пептидов мочи и разделение на фракции. 2.1. Экстракция пептидов ступенчатым элюированием. 10 10 л фильтрата мочи разбавляют водой до проводимости 6 м.с/см и при помощи HCl устанавливают рН, равное 2,7. Затем фильтрат мочи наносят на хроматографическую колонку. После связывания пептидов элюируют связанные пептиды с градиентом хлористого натрия. Условия хроматографии: поток при нанесении: 100 мл/мин; поток при элюировании: 30 мл/мин; детектирование: 214 нм,колонка: Вантаже (Амикон, Виттен), диаметр 6 см, высота наполнения 7 см; материал колонки: Мерк фрактогель TSKBiosystems, Висбаден-Норденштадт. Буферный раствор А: 50 нМ NaH2PО 4, pH 3,0. Буферный раствор В: 1,5 М NaCl в А. Градиент: 0% В на 100% В в 2,000 мл. Элюат собирают в 10 сборников по 200 мл. 2.2. Второе хроматографическое разделение. Фракции хроматографируют отдельно через колонку с обращенной фазой. Условия хроматографии: поток при нанесении: 10 мл/мин; поток при элюировании: 4 мл/мин; детектирование: 214 нм; колонка: стальная колонка для высокоэффективной жидкостной хроматографии, диаметр 1 см, высота наполнения 12,5 см,материал колонки: источник хроматографии с обращенными фазами ОФХ 15 мкм, Фармация; установка БиоСаD, Perseptive Biosystems,Висбаден-Норденштадт; буферный раствор А: 0,1% трифторуксусной кислоты в воде; буферный раствор В: 80% ацетонитрила в А; градиент: 0% В на 100% В в 200 мл. Элюат собирают во фракции по 4 мл. Далее определяют характеристики в соответствии с примером 1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ определения состояния организма, в соответствии с которым отбирают пробу исследуемого организма и определяют качественный и количественный состав низкомолекулярных пептидов в этой пробе, а о состоянии организма судят по результатам сравнения этого состава с эталоном. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проба представляет собой ткань или жидкость организма, или сам организм, или его комбинации. 3. Способ по п.1 и/или 2, отличающийся тем, что низкомолекулярные пептиды, которые привлекают для измерения, имеют молекулярный вес максимально 30 000 Дальтон. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что низкомолекулярные пептиды, которые привлекают для измерения, имеют, по меньшей мере,молекулярный вес, который соответствует молекулярному весу дипептидов. 5. Способ по п.3 и/или 4, отличающийся тем, что низкомолекулярные пептиды, которые привлекают для измерения, имеют молекулярный вес от 100 до 10 000 Дальтон. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что высокомолекулярные пептиды отделяют перед измерением низкомолекулярных пептидов или не принимают во внимание при измерении или при обработке данных при анализе пробы. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что анализ низкомолекулярных пептидов проводят путем масс-спектрометрии. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что низкомолекулярные пептиды характеризуют путем измерения их молекулярного веса. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что пробу перед измерением низкомолекулярных пептидов разделяют на различные фракции и измеряют при разных условиях. 12 10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что в качестве организма используют прокариоты, эукариоты, многоклеточные организмы, клетки тканевых культур, клетки животных и человека. 11. Способ по любому из пп.1 - 10, отличающийся тем, что пробу берут из генетически измененных, или трансформированных, и/или кондиционированных организмов. 12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что контроль состояния организма для безгипотезного исследования и картина состояния всего организма служат для обнаружения возможных отклонений от состояния эталона. 13. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что определение состояния трансформированного организма для безгипотезного исследования и картина состояния всего организма служат для обнаружения изменений трансформированного организма, для обнаружения связанного с трансформацией появления пептидов, которые причинно связаны с изменениями обмена веществ.