Комплексное микробиологическое удобрение и способ его получения

005716 Изобретение относится к области биологии, а именно, к почвенной микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, в частности, при производстве бактериальных удобрений. Известен бактериальный препарат фосфоробактерин, используемый в качестве бактериального удобрения, в состав которого входит споровая палочка, близкая к Вас. Megatherium (var. Phosphaticum). Действующие компоненты фосфоробактерина переводят фосфорноорганические соединения в форму,доступную растениям [I]. Недостатком бактериального удобрения фосфоробактерин является то, что он насыщает почву только одним компонентом растительного питания - фосфором. Известен также способ приготовления фосфоробактерина, включающий разводку бактерий на картофельной среде, смешивание с наполнителем, в качестве которого используют сухой порошок каолина,и сушку полученной смеси при температуре 35-40 С [1]. Однако указанный способ является достаточно трудоемким и сложным, так как только в правильно приготовленном фосфоробактерине гарантирован устойчивый титр бактерий, минерализующих фосфорноорганические соединения. Кроме этого, повышение урожайности при его использовании отмечалось только на торфяных и дерново - подзолистых почвах, в то время как на кислых подзолистых почвах использование фосфоробактерина оказалось совершенно неэффективным. Известно органоминеральное удобрение на основе торфа. Указанное удобрение включает торф, известь, минеральные добавки, бактериальную маточную культуру АМБ и азотобактерин, причм в качестве минеральных добавок присутствует суперфосфат,калий хлористый, магний хлористый, цинк хлористый, медь сернокислая, кислота борная, аммоний молибденовокислый, калий марганцовокислый, а также железо сернокислое закисное, гидросульфат натрия, перекись водорода и мочевина [2]. Указанное органоминеральное удобрение на основе торфа не обладает достаточной эффективностью и теряет большую часть жизнеспособных клеток при хранении. Известен также способ получения органоминерального удобрения на основе торфа, который включает нейтрализацию, внесение минеральных добавок и мочевины и микробиологическую инокуляцию торфа с последующим компостированием [2]. Данный способ имеет недостаток в связи с трудоемкостью его осуществления. Наиболее близким к заявляемому техническому решению является бактериальное удобрение АМБ. Указанное удобрение включает торф, известняк, азотобактерин и маточную культуру АМБ, представляющую собой экологическую группировку микроорганизмов, в которую входят аммонифицирующие, денитрофицирующие,аэробные целлюлозоразлагающие бактерии (типа миксобактерий), нитрифицирующие и тионовые бактерии. Эта экологическая группировка была названа аутохтонной микрофлорой Б (АМБ) [3]. Недостатком бактериального удобрения АМБ является то, что он не может в полной мере усваиваться почвой, так как не является чисто микробиологическим удобрением и, поэтому, для повышения урожайности требуется довольно значительное внесение его в почву. Наиболее близким к заявляемому техническому решению является также способ получения бактериального удобрения АМБ, который включает выращивание нужных микроорганизмов на гуматной среде путм заражения е плодородной почвой, внесение полученной разводки бактерий с добавлением азотобактерина в разложившийся низинный торф, нейтрализованный известью, выдерживание торфа для размножения бактерий при температуре 20-25 С в течение трех недель [3]. Недостатком способа получения бактериального удобрения АМБ является его трудомкость, заключающаяся в наличии большого количества операций (размельчение, просеивание, увлажнение, перелопачивание) в течение длительного промежутка времени. В связи со сложившейся в последние годы неблагоприятной экологической обстановкой, плодородные почвы иногда превращаются в истощенные, засоленные и загрязненные хозяйственной деятельностью человека почвы, нуждающиеся в восстановлении. В результате чего возникает необходимость создания универсального почвоудобрительного препарата, с помощью которого можно было бы провести рекультивацию нарушенных земель и повысить плодородие почв. Задачей изобретения является создание эффективного и экологически чистого, универсального для всех видов почв удобрения, упрощения и удешевления способа его получения. Поставленная задача решается тем, что комплексное микробиологическое удобрение включает питательную среду, бактериальную маточную культуру АМБ и культивируемую природную ассоциацию микроорганизмов (ПАМ), представлена аэробными, анаэробными, денитрофицирующими, аммонифицирующими, молочнокислыми бактериями, микромиценами, актиномицетами и водорослями, а питательная среда имеет следующие соотношение компонентов (в г/л): Пшеничные отруби 10-15 Рисовые отруби 10-15 Минеральные соли 1,5-3,0 (по азоту) Сахар 10-15-1 005716 Мд 10-12 Вода остальное Причм аэробные бактерии представлены видами: Bacillus megatherium (var. phosphaticum). Bacillusmicoedes, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas liguida, Pseudomonas litoralis, Pseudomonas radiobacter, Pseudomonas stutzeri, Azotobacter vinelandi, Bacillus agri, Bacillus flavus,Bacillus denitrificum, Bacillus pumilis, Bacillus liguefaciens, Micrococcuc candicans, Stichococcus, Micrococcus agilis, Micob album, Micob mucosum, Pseudobacterium rubricum, Pseudomonas xanthe, Rhizobium simplex, Bacillus cereus. С деятельностью этих микроорганизмов связано образование многих органических кислот, в частности лимонной, щавелевой, уксусной, молочной, подкисляющих почвенную среду. Выделенные микроорганизмы участвуют в гумусообразовании и минерализации органических кислот. Анаэробные бактерии представлены следующими видами: Clostridium butricum, Clostridium pasterianum, Clostridium felsineum, Methanobacterium, Acetobacterium. Данные бактерии способны разлагать труднорастворимые органические соединения фосфора, обладают антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам. Денитрофицирующие и аммонифицирующие бактерии представлены следующими видами: Achromobacter delicatulum, Bacillus nitrificans, Cheomobacterium flavum, Cheromobacterium cheni, Thiobacillusthioxidans, Thiobacillus denitrificans. Выделенные бактерии способствуют денитрификации субстратов с газообразованием нитратов и аммиака. Наряду с этим, выделенные бактерии обладают и аммонифицирующими способностями. Молочнокислые бактерии представлены следующими видами:lactomorbus, Lactobacillus casei. Микромицеты представлены следующими видами: Penicillium canescens, Penicillium notatum, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Trichoderma lignorum, Penicillium cyaneum. Выделенные микромицеты обладают способностью разлагать труднодоступные органические соединения фосфора. Актиномицеты представлены следующими видами: Streptomices albus, Streptomices griseus, Actinomices elephantis. Актиномицеты продуцируют в почве биологически активные вещества, синтезируют витамины B1, В 3, В 6, B12, инозит, РР, аминокислоты, глютаминовую кислоту, лизин, аланин, триптофан,антибиотические вещества. Водоросли представлены следующими видами: Chlorella vulgaris, Scenedesmus obliguus, Chlorellaterricola, Nostoc linckis. При помощи процесса фотосинтеза, используя водород и кислород, выявленные микроорганизмы участвуют в процессе образования почвы и являются азотофиксаторами, оказывают стимулирующие действия на рост растений и формирования органических веществ. Поставленная задача решается также тем, что способ получения комплексного микробиологического удобрения включает инокулирование питательной среды маточной культурой АМБ с последующим культивированием природной ассоциации микроорганизмов (ПАМ), причм культивирование природной ассоциации микроорганизмов (ПАМ) проводят в течение 7 сут при температуре 30-35 С и Рн 6,2-6,5. В результате решения поставленной задачи получен технический результат, заключающийся в превращении неусвояемых форм калия и фосфора в легкоусвояемую форму; фиксировании минерального азота до 30-45%; закрепление его в органической форме до 25-32%; вырабатывании аминокислоты, микро и макроэлементов; обеспечении постоянным питанием сельскохозяйственных культур в течение всего периода вегетации, переводе органических остатков растений и животных в минерализат и постоянном улучшении плодородия практически всех почв, в том числе засоленных и загрязненных химическими и промышленными отходами; получении низкой стоимости удобрения при минимальном его расходе на 1 гектар и значительного повышения урожайности; получении экологически чистого урожая сельскохозяйственной продукции, выращенной без применения искусственных минеральных удобрений и химических веществ и обладающей улучшенными вкусовыми качествами и более длительным сроком хранения; получении комплексного микробиологического удобрения, основой которого является природная ассоциация микроорганизмов, где впервые отмечено совместное существование аэробных и анаэробных микроорганизмов в симбиозе с различными группами эффективных микроорганизмов, способствующих образованию биологически активных веществ в почве. Способ осуществляют в следующей последовательности: на 1 л воды вносили 10-15 г пшеничных отрубей, 10-15 г рисовых отрубей, 1,5-3,0 г минеральных солей (по азоту), 10-15 г сахара и 10-12 г мда. Содержимое вносили в колбу Эрленмейера и стерилизовали при 1 атм в течение 20 мин. После охлаждения в среду вносили маточную культуру АМБ (по 1 мл засеянных по примерам 1-7, приведенным ниже-2 005716 культуральных жидкостей). Вновь засеянные культуры инкубировались на качалке при 120 об./мин. Процесс культивирования осуществляли при температуре 30-35 С и Рн 6,2-6,5 в течение 7 суток. Для более полного понимания сущности изобретения предлагается аминокислотный состав белков заявляемого микробиологического удобрения (табл. 1), биохимический состав микробиологического удобрения и фракционный состав белка сухого препарата к сухому весу (табл. 2). Таблица 1. Аминокислотный состав белков микробиологического удобрения в % сухого веса Содержание аминокислот общей Аминокислота биомассы 1 Лизин 3,40 2 Гистидин 4,04 3 Аргинин 4,80 4 Аспарагиновая кислота 8,40 5 Треонин 3,82 6 Серин 3,86 7 Глютаминовая кислота 12,40 8 Пролин Следы 9 Глицин 4,94 10 Аланин 7,52 11 Валин 3,78 12 Цистин+метионин 3,84 13 Изолейцин 3,20 14 Лейцин 2,80 15 Тирозин+фенилаланин 5,20 16 Общая сумма аминокислот 66,50 17 Сумма незаменимых аминокислот 27,04 Таблица 2 Фракционный состав белка Биохимический состав микро-3 005716 Далее приведены примеры конкретного выполнения заявляемого изобретения. Пример 1. Среда, содержащая на 1 л дистиллированной воды (NH4)PO4 - 1 г; MgSO4 -0,5 г; KН 2 РO4 - 1 г; СаСО 3 - 5 г; пептон - 1. Готовые среды разливались по 10 мл в пробирки размером 16 х 160 мм. Пробирки со средой закрывали пробками и стерилизовались при 1 aтм в течение 20 мин. После охлаждения в пробирки вносили по 1 мл почвенной болтушки с последнего разведения, приготовленной следующим образом: 1 г почвы: 10 мл воды 1:1001:1.0001:10.0001:100.0001:1.000.000. Инкубацию питательной среды с почвенной болтушкой проводили в термостате при 28 С в течение 7 сут. Через 7 сут. в питательной среде развивался природная ассоциация микроорганизмов. Выявленные микроорганизмы представлены следующими видами: Pseudomonas agile, Ps. Fluorescens, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Azotobacter oligonitrophilus, Nicrococcus nitrificans, Pseudomonas herbicola,Azolobacter galophium, Azotobacter nigricans, Azotobacter chrococcum, Bacillus micoldes. Соответственно полученному видовому составу можно судить о том, что в данном случае создаются благоприятные условия для развития аэробных бактерии. Пример 2. Среда, содержащая на 1 л дистиллированной воды экстракта дрожжей 5 г, хлоргидрата цистеина 0,5 г, мясного экстрата - 6 г; MgSO4 - 0,5 г; СаСО 3 - 5 г; пептон - 1 г; раствор лактата натрия - 605-8,5 мл; рН - 6. Заливали в пробирки размером 16 х 160 мм по 10 мл, стерилизовали при 0,75 атм в течение 20 мин. Для засевания почвенные болтушки готовили методом предельных разведений, как указано в примере 1. После засева пробирки закрываются парафиновой пробкой толщиной 2-3 см. Среды с почвенной болтушкой инкубируются в термостате при температуре 30-35 С в течение 10 сут. Через 10 сут. в питательной среде наблюдается образование природных ассоциаций микроорганизмов, представленные следующими видами: Clostridium butricum, Clostriolium pasterianum, Clostridiumfelsineum. Соответственно полученному видовому составу можно судить о том, что в данном случае создаются благоприятные условия для развития анаэробных бактерий. Пример 3. Для определения денитрофицирующих бактерий, содержащихся в почвенной болтушке, готовили среду следующего состава: 1 л дистиллированной воды содержал K2HPO4 2 г; MgSO4X7H2O 2 г; CaCl2-200 мг; FeСl3-следы. Приготовленная данным способом среда разливалась по 10 мл в пробирки размером 16 х 160 мм,стерилизовались при 1 атм в течение 20 мин. После охлаждения в пробирки заливалась почвенная болтушка, приготовленная методом предельных разведений, как указано в примере 1. Затем пробирки со средой и почвенной суспензией ставились в термостат при температуре 28C на 10 сут. По истечении указанного времени выявленные микроорганизмы были представлены следующими видами: Achromobacter delicatulum, Bacilus nitrificans, Chomobacterium flavum, Chromobacterium cheni,Bact. Agile, Bact. aguamarinum. Пример 4. Среда для определения микромицетов содержала в 1 л дистиллированной воды NaNO3, - 2,5 г; КH2PO4 - 0,5 г; MgSO4 - 0,3 г; КСl - 0,4 г; FеС 13 - следы; сахароза - 25 г. Готовая среда разливалась в пробирки размером 16 х 160 мм по 10 мл. Пробирки со средами стерилизовалась при 0,75 атм в течение 20 мин. В охлажденные пробирки со средами заливалась почвенная суспензия с третьего разведения(1:1000), как указано в примере 1. Пробирки ставились в термостат при температуре 28 С, в течение 7 суток. В среде развиваются природные ассоциации микроорганизмов, выявленные следующими видами:Penicillium canescens, Penicillium notatum, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Penicillium coremia, Aspergillus fumigatus. Пример 5. Для выявления актиномицетов, имеющихся в почвенной суспензии, готовили среду, содержащую на 1 л дистиллированной воды (NH4)2SO4 - 1 г; K2HPO4 - 1 г; MgSO4x7H2O - 1 г; NaCl - 1 г; СаСО 3 - 3 г; крахмал растворимый -10 г. Приготовленная таким образом среда разливалась по 10 мл в пробирки размером 16 х 160 мм, после этого пробирки стерилизовались при 1 атм в течение 20 мин. Засевание почвенной суспензии производили с 4-го разведения (1:10.000), как указано в примере 1. Инкубацию проводили в термостате при температуре 28 С в течение 10 сут. По истечении 10 сут. в питательной среде развивались природные ассоциации микроорганизмов,представленные следующими видами: Streptomices albus, Streptomices griseus, Actinomices elephantis.-4 005716 Пример 6. Среда, содержащая в 1 л дистиллированной воды (NH4)2SO4 - 0,2 г; MgSO4x7H2O - 0,08 г; KCl - 0,03 г; СаНРO4 - 0,03 г. Приготовленная таким образом питательная среда разливалась в колбы Эрленмейера по 100 мл,стерилизовалась при 1 атм в течение 20 мин. В охлажденные среды заливалась почвенная суспензия со второго разведения (1:100), как показано в примере 1. Колбы со средой и почвенной суспензией инкубировали в освещенном термостате при 28 С в течение 10 сут. При истечении указанного времени, в среде развиваются ассоциации водорослей, выявленные следующими видами: Chlorella vulgaris, Scenedesmus obliguus. Пример 7. Для выделения молочнокислых бактерий брали зеленые стебли кукурузы в количестве 100 г и экстрагировали в фарфоровой ступке с 200 мл воды до получения водного экстракта. В 1000 мл гидролизованного молока добавляли 25 мл 0,4% раствора цистина, 5 г дрожжевого автолизата, 8 г сульфата аммония, разливали по 15 мл в пробирки 16 х 160 мм и закрывали ватными пробками. Стерилизовали при 1 атм в течение 20 мин. После охлаждения в каждую пробирку вносили по 1 мл водной суспензии кукурузного экстракта и ставили в термостат на 10 сут. при температуре 37-40 С. При этом были выявлены следующие молочнокислые бактерии:Lаctobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus arabinosus, Bacillus lactomorbus. Молочнокислые бактерии производят молочную кислоту из сахара и из других углеводов, произведенных фотосинтезирующими бактериями и дрожжами. Она подавляет развитие вредных микроорганизмов и ускоряет разложение органического вещества. Пример 8. Способ получения микроудобрения. Для получения комплексного микроудобрения на 1 л воды вносили 10 г пшеничных отрубей, 10 г рисовых отрубей, 1,5-3,0 г минеральных солей, 15 г сахара и 10 г мда при Рн 6,2-6,5. Содержимое вносили в колбу Эрленменера размером 250 мл по 100 мл и стерилизовали при 0,75 атм в течение 20 мин. После охлаждения в среду вносили по 1 мл засеянных по семи приведенным выше примерам культуральных жидкостей. Вновь засеянные культуры инкубировались на качалке при 120 об/мин при температуре 30-35 С, в течение 7 сут. По истечении указанного времени выявлялись природные ассоциации микроорганизмов. Пример 9. Способ получения микроудобрения. Для получения комплексного микроудобрения на 1 л воды вносили 15 г пшеничных отрубей, 15 г рисовых отрубей, 1,5-3,0 г минеральных солей, 15 г сахара и 12 г мда при Рн 6,2-6,5. Содержимое вносили в колбу Эрленмейера размером 250 мл по 100 мл и стерилизовали при 0,75 атм в течение 20 мин. После охлаждения в среду вносили по 1 мл засеянных по семи приведенным выше примерам культуральных жидкостей. Вновь засеянные культуры инкубировались на качалке при 120 об/мин при температуре 30-35 С, в течение 7 сут. По истечении указанного времени выявлялись природные ассоциации микроорганизмов. Пример 10. Способ получения микроудобрения. Для получения комплексного микроудобрения на 1 л воды вносили 8 г пшеничных отрубей, 8 г рисовых отрубей, 1,5-3,0 г минеральных солей, 8 г сахара и 5 г мда при Рн 6,2-6,5. Содержимое вносили в колбу Эрленмейера размером 250 мл по 100 мл и стерилизовали при 0,75 атм в течение 20 мин. После охлаждения в среду вносили по 1 мл засеянных по семи приведенным выше примерам культуральных жидкостей. Вновь засеянные культуры инкубировались на качалке при 120 об/мин при температуре 30-35 С в течение 7 сут. По истечении указанного времени природные ассоциации микроорганизмов была выделена не полностью (относительно примеров 8 и 9), т.е. содержания компонентов питательной среды в примерах 8 и 9 являются наиболее благоприятными. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Комплексное микробиологическое удобрение, включающее питательную среду, бактериальную маточную культуру АМБ и культивируемую природную ассоциацию микроорганизмов, отличающееся тем, что культивируемая природная ассоциация микроорганизмов представлена аэробными, анаэробными, денитрофицирующими, аммонифицирующими, молочнокислыми бактериями, микромицетами, актиномицетами и водорослями, а питательная среда имеет следующие соотношения компонентов, г/л: Пшеничные отруби 10-15 Рисовые отруби 10-15 Минеральные соли 1,5-3,0 (по азоту)-5 005716 Сахар 10-15 Мд 10-12 Вода Остальное 2. Комплексное микробиологическое удобрение по п.1, отличающееся тем, что аэробные бактерии представлены видами: Bacillus megatherium (var. phosphaticum), Bacillus mesentcricus panis viacosi, Azotobacter galophium, Azotobacter nigricans, Azotobacter chrococcum, Bacillus micoedes, Bacillus brevis, Bacillusmucosum, Pseudobacterium rubricum, Pseudomonas xanthe, Rhizobium simplex, Bacillus cereus. 3. Комплексное микробиологическое удобрение по пп.1-2, отличающееся тем, что анаэробные бактерии представлены следующими видами: Clostridium butricum, Clostridium pasterianum, Clostridium felsineum, Methanobacterium, Acetobacterium. 4. Комплексное микробиологическое удобрение по пп.1-3, отличающееся тем, что денитрофицирующие и аммонифицирующие бактерии представлены следующими видами: Achromobacter delicatulum,Bacillus nitrificans, Cheomobacterium flavum, Cheromobacterium cheni, Thiobacillus thioxidans, Thiobacillusdenitrificans. 5. Комплексное микробиологическое удобрение по пп.1-4, отличающееся тем, что молочнокислые бактерии представлены следующими видами: Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillusarabinosus, Lactobacillus lactis, Bacillus lactomorbus, Lactobacillus casei. 6. Комплексное микробиологическое удобрение по пп.1-5, отличающееся тем, что микромицеты представлены следующими видами: Penicillium canescens, Penicillium notatum, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Trichoderma lignorum, Penicillium cyaneum. 7. Комплексное микробиологическое удобрение по пп.1-6, отличающееся тем, что актиномицеты представлены следующими видами: Streptomices albus, Streptomices griseus, Actinomices elephantis. 8. Комплексное микробиологическое удобрение по пп.1-7, отличающееся тем, что водоросли представлены следующими видами: Chlorella vulgaris, Scenedesmus obliguus, Chlorella temcola, Nostoc linckis. 9. Способ получения комплексного микробиологического удобрения по пп.1-8, включающий инокулирование питательной среды маточной культурой АМБ с последующим культивированием природной ассоциации микроорганизмов, отличающееся тем, что культивирование природной ассоциации микроорганизмов проводят в течение 7 суток при температуре 30-35 С и pH 6,2-6,5.