Способ выделения теанина

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки Настоящее изобретение относится к способу отделения теанина от водного раствора с доминирующим катионом, включающего примеси. Способ включает стадии введения водного раствора в колонку в количестве в пределах от 2 до 20% объема колонки, где колонка заполнена катионообменной смолой катиона того же типа, что и доминирующий катион; затем введения водной подвижной фазы с рН в пределах от 2,5 до 8,5 в колонку для элюирования зоны, богатой примесями, следующей за зоной, богатой теанином; и затем выделения по меньшей мере одной фракции зоны, богатой теанином. Бодуэн Станислас Ксавье (FR) Медведев В.Н. (RU) 015601 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу очистки аминокислоты теанина. Уровень техники, предшествующий изобретению Становятся очень популярными пищевые продукты или напитки, которые могут усиливать умственные или физические аспекты организма человека. В частности, особенно ценными с коммерческой точки зрения являются продукты, которые обеспечивают состояние повышенной умственной активности. Теанин представляет собой аминокислоту, которая в растительном мире встречается только в чае(Camellia sinensis). Было установлено, что теанин оказывает положительное воздействие на организм человека и умственную деятельность. Например, сообщается, что теанин стимулирует -волны в мозгу млекопитающих, что позволяет расслабиться без изменения состояния психики индивидуума. Эти физиологические воздействия, по существу, заметны при определенных дозах. Например, в Международной патентной заявкеPCT/EP2005/012464 (Unilever PLC и др.) описываются употребляемые в пищу композиции с определенным уровнем теанина и кофеина, демонстрирующие видимое улучшение концентрации и умственного сосредоточения и/или умственной активности при потреблении. Хотя чай относительно богат теанином, в действительности теанин составляет только около 2 мас.% от экстрагируемых сухих веществ чая из растительного материала чая. Следовательно, синтетический теанин (например, Suntheanine, производимый Taiyo Kagaku) был разработан для удовлетворения возросшего спроса на продукты с повышенным содержанием теанина. Однако современный потребитель интересуется натуральными здоровыми напитками, которые составляют часть современного здорового образа жизни. Чай хорошо подходит с точки зрения натуральности, содержащихся в нем среди прочего антиоксидантов. Следовательно, сохраняется необходимость в обеспечении способов концентрирования натурального теанина без добавления синтетических соединений. Среди попыток решения этой проблемы были использованы способы мембранной фильтрации для получения концентрата теанина из экстрактов чая. Например, Международная патентная публикацияPCT/EP2005/010376, в которой описывается способ получения экстракта чая, богатого теанином,включающий стадии проведения экстракции горячей водой растительного материала чая с последующим проведением экстракции на стадии нанофильтрации. В результате получают пермеат с сухими веществами чая, богатый теанином. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что даже такой пермеат может содержать значительное количество примесей. В частности, таких примесей, как сахариды и аминокислоты, которые трудно удалить из пермеата в силу их физико-химической схожести с теанином. Дополнительно, наличие некоторых примесей делает традиционную сушку (например, распылительную сушку) пермеата очень проблематичной. В патентной заявке США, опубликованной как US 2005/0084544 (ProcterGamble Co. Inc.), описывается способ, при котором экстракт чая контактирует с материалом, абсорбирующим полифенольные соединения. Этот способ позволяет получить богатый теанином экстракт, по существу, свободный от полифенолов. Однако в этом случае экстракт также все еще содержит множество примесей, для удаления которых требуется дополнительная стадия фильтрации. В патенте США 5922380 (Ito En Ltd.) описывается способ, при котором экстракт чая контактирует с катионообменной смолой, ионносвязанно с ионами калия. Целью способа является удаление ионов двухвалентных металлов из экстракта чая при сохранении других компонентов, которые формируют вкус и аромат чая. Этот способ включает последующее прохождение через колонку, заполненную смолой, в условиях, когда механизмом разделения служит только катионообмен. Следовательно способ,описанный в США 5922380, не приводит в результате к отделению теанина от примесей, иных, чем ионы многовалентных металлов. Следовательно, продолжает существовать необходимость в обеспечении простого способа очистки теанина от смеси, содержащей примеси, включая некоторые нейтральные и/или анионные примеси. Также необходимо, чтобы способ не требовал применения синтетических химических веществ и/или органических растворителей. Определения Примеси Используемый здесь термин "примеси" относится к веществам, иным, чем теанин или вода. Доминирующий катион Используемый здесь термин "доминирующий в растворе катион" относится к катиону, присутствующему в растворе в высокой молярной концентрации по сравнению с любым другим катионом раствора. Зона, богатая примесями Зона, богатая примесями, представляет собой хроматографическую зону, где концентрация примесей (выраженная как процент от общих сухих веществ зоны) больше, чем концентрация примесей в водном растворе (выраженная как процент от общих сухих веществ водного раствора) в начале процесса.-1 015601 Зона, богатая теанином Зона, богатая теанином, представляет собой хроматографическую зону, где концентрация теанина(выраженная как процент от общих сухих веществ зоны) больше, чем концентрация теанина в водном растворе (выраженная как процент от общих сухих веществ водного раствора) в начале процесса. Экстракт чая Используемый здесь термин "экстракт чая" относится к сухому материалу из листьев и/или стеблейCamellia sinensis var. sinensis и/или Camellia sinensis var. assamica. Листья и /или стебли могут быть подвергнуты стадии, так называемой "ферментации", на который они окисляются под воздействием определенных эндогенных ферментов, которые выделяются во время проведения предшествующих стадий получения "черного чая". К этому окислению еще может быть добавлено воздействие экзогенных ферментов, таких как оксидазы, лакказы и пероксидазы. В качестве альтернативы листья могут быть частично ферментированы (чай "оолонг") или, по существу, не ферментированы ("зеленый чай"). Термины, относящиеся к хроматографии Используемые здесь термины "подвижная фаза"," колонка", "объем колонки", "элюат" и "зона" являются стандартными терминами, используемыми в хроматографии, как определено в "Compendium ofAnalytical Nomenclature: Definitive Rules 1997", IUPAC, 3rd Edition, Chapter 9. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу очистки теанина от водного раствора с доминирующим катионом, включающего примеси. Способ включает следующие стадии:a) введение водного раствора в колонку в количестве (Va) в пределах от 2 до 20% объема колонки(Vc), где колонка заполнена катионообменной смолой катиона того же типа, что и доминирующий катион; затемb) введение водной подвижной фазы с pH в пределах от 2,5 до 8,5 в колонку для элюирования зоны,богатой примесями, следующей за зоной, богатой теанином; затемc) выделение по меньшей мере одной фракции зоны, богатой теанином; и затемd) необязательно концентрирование и/или сушку по меньшей мере одной фракции зоны, богатой теанином. Проведение способа гарантирует, что доминирующий механизм отделения является эксклюзией ионов и в результате приводит к отделению теанина и примесей, по существу, в различных зонах. Детальное описание изобретения Водный раствор, от которого очищают теанин, содержит примеси. Примеси могут включать катионы, анионы, нейтральные молекулы или их смесь. Как правило, примеси включают сахариды, аминокислоты или их смеси. Сахариды могут представлять собой моносахариды, дисахариды, олигосахариды,полисахариды или их смесь. Дополнительно или в качестве альтернативы примеси включают полифенолы, кофеин или их смесь. Предпочтительно теанин является теанином из натурального источника. Наиболее предпочтительно источником теанина является чай. Следовательно, в предпочтительных вариантах воплощения настоящего изобретения водный раствор представляет собой водный экстракт чая. По существу, предпочтительно экстракт чая представляет собой экстракт черного чая. Водный экстракт чая может быть получен непосредственно экстракцией чайных листьев водой. В качестве альтернативы после экстракции водный экстракт чая может быть подвергнут одной или более стадии очистки и/или концентрирования. Например, экстракт чая может быть подвергнут нанофильтрации с использованием способа, описанного в PCT/EP2005/010376, который введен здесь ссылкой. Водный экстракт содержит один или более катион. В большинстве случаев (и в частности, если водный раствор представляет собой водный экстракт чая) доминирующий катион представляет собой калий (K+). Предпочтительно водный раствор, по существу, свободен от многовалентных катионов. Многовалентные катионы трудно удалить из смолы и, таким образом, они засоряют колонку, уменьшая срок службы смолы. Следовательно, предпочтительно водный раствор включает более чем 80% моновалентных катионов по массе катионов раствора, более предпочтительно более чем 90% и наиболее предпочтительно в пределах от 95 до 99,99%. Поскольку водный раствор вводят в колонку в относительно малом количестве, предпочтительно раствор имеет высокое содержание сухих веществ для максимизации эффективности отделения и минимизации количества удаляемой воды, если фракцию после стадии с) подвергают сушке. Следовательно,водный раствор имеет общее содержание сухих веществ по меньшей мере 2 мас.% раствора, более предпочтительно по меньшей мере 5%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 10%. Содержание сухих веществ не должно быть слишком высоким, иначе образец становится слишком вязким и/или во время отделения возникают проблемы с нерастворимым материалом. Следовательно, предпочтительно содержание сухих веществ составляет менее чем 50 мас.% раствора, более предпочтительно менее чем 40% и наиболее предпочтительно менее чем 30%. Для максимизации выхода теанина предпочтительно, чтобы общие сухие вещества включали теанин в количестве по меньшей мере 1 мас.% сухих веществ, более предпочтительно по меньшей мере 2%,еще более предпочтительно по меньшей мере 4% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 6%. Как-2 015601 правило, общие сухие вещества включают менее чем 80% теанина по массе сухих веществ. Способ, по существу, подходит для очистки теанина от водных растворов, где общие сухие вещества включают менее чем 60% теанина от общей массы сухих веществ или даже менее чем 40%. Для гарантии того, что механизм отделения является эксклюзией ионов, теанин элюируют при pH,близком к его изоэлектрической точке. Предпочтительно рН водного раствора составляет в пределах от 2,5 до 8,5, более предпочтительно от 3,5 до 7,5, еще более предпочтительно от 4 до 7 и наиболее предпочтительно от 5 до 6. Очень важно, чтобы рН раствора находился в этих пределах, если подвижную фазу не забуферивают. Водный раствор вводят в колонку в количестве (Va) в пределах от 2 до 20% от объема колонки(Vc). Это гарантирует, что водный раствор займет только небольшую часть колонки и, следовательно,позволит провести отделение теанина от примесей при элюировании. Количество не должно быть слишком маленьким, в противном случае процесс не пройдет. Предпочтительно Va составляет в пределах от 3 до 15% от Vc, более предпочтительно от 5 до 10%. Колонку заполняют катионообменной смолой катиона того же типа, что и доминирующий катион. Как правило, это значит, что в смоле доминирующий катион представляет собой калий (K+). Подходящие смолы включают те, которые имеют функциональные группы для катионного обмена,такие как группа сульфоновой кислоты (-SO3 М), группа фосфорной кислоты (-PO(OM)2), или карбоксильная группу (-COOM); где M представляет собой доминирующий катион. По существу, предпочтительными являются смолы, имеющие группу сульфоновой кислоты, такие как сульфированные полистиреновые смолы. Такие смолы включают смолы на основе сополимеров стирола и дивинилбензола. Подходящие коммерчески доступные смолы включают Diaion UBK, включая ряд UBK530, UBK535,UBK550 и UBK555 (производимые Mitsubishi Kagaku Co.). Как только водный раствор вводят в колонку, затем вводят водную подвижную фазу для элюирования раствора. Для отделения теанина от примесей необходимо, чтобы подвижная фаза имела состав, отличный от водного раствора. В частности, подвижная фаза должна быть, по существу, свободна от теанина. Предпочтительно подвижная фаза включает менее чем 0,01% теанина по массе подвижной фазы,более предпочтительно менее чем 0,001% и оптимально менее чем 0,0001%. Водная подвижная фаза имеет рН в пределах от 2,5 до 8,5 для того, чтобы теанин был в нейтральной форме. Предпочтительно pH подвижной фазы составляет в пределах от 3,5 до 7,5, более предпочтительно от 4 до 7 и наиболее предпочтительно от 5 до 6. Если водный раствор очень кислый или очень щелочной (например, имеет рН за пределами от 2,5 до 8,5), то может возникнуть необходимость в забуферивании подвижной фазы. В этом случае подвижная фаза включает буферные соли. Например, подвижная фаза может включать фосфатный буфер. Однако предпочтительно избегать применения каких-либо химических добавок. Следовательно, в предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения подвижная фаза представляет собой, по существу, чистую воду. Например, подвижная фаза может включать менее чем 1000 ч./млн сухих веществ, более предпочтительно менее чем 500 ч./млн и наиболее предпочтительно в пределах от 1 ч./млрд до 100 ч./млн. В наиболее предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения подвижная фаза представляет собой деионизированную воду. Также предпочтительно подвижная фаза, по существу, свободна от многовалентных катионов. Многовалентные катионы трудно удалить из смолы и, таким образом, они засоряют колонку, уменьшая срок службы смолы. Следовательно, предпочтительно подвижная фаза включает более чем 80% моновалентных катионов по массе катионов раствора, более предпочтительно более чем 90% и наиболее предпочтительно в пределах от 95 до 99,99%. Во избежание образования пузырьков воздуха в колонке, которые могут проникнуть при отделении,предпочтительно, чтобы подвижная фаза подвергалась дегазированию перед введением в колонку. Могут быть использованы любые известные средства дегазирования, включая обработку ультразвуком или барботирование водонерастворимым газом, таким как азот. По мере прохождения подвижной фазы через колонку нейтральный теанин задерживается и/или слабо абсорбируется смолой, пока другие молекулы, отличающиеся размером и/или зарядом, задерживаются смолой. В результате зона, богатая примесями, образуется перед образованием зоны, богатой теанином. Предпочтительно зоны элюируют при высокой температуре для снижения воздействия на скорость потока вязкости относительно концентрированных зон. Как правило, температура составляет в пределах от 45 до 90C, более предпочтительно от 55 до 80C. Также высокая температура снижает риск микробного загрязнения колонки. Следующая стадия способа включает выделение по меньшей мере одной фракции зоны, богатой теанином. Как правило, это достигается сбором фракций элюата, выходящего из колонки, и хранением этих фракций, включающих значительное количество теанина. Множество собранных фракций могут быть объединены. Как правило, фракции зон, богатых примесями, отбрасывают. Однако, если эта зона богата ценны-3 015601 ми примесями, такими как полифенолы, способ может включать дополнительную стадию выделения по меньшей мере одной фракции зоны, богатой примесями. По меньшей мере одну фракцию зоны, богатой теанином, выделенную на стадии c, можно использовать непосредственно без дополнительной обработки. Например, она может быть непосредственно добавлена в пищевой продукт или напиток. В частности, при высокой эффективности отделения, как правило, нет необходимости в дополнительной очистке фракции, например, мембранной фильтрацией перед применением и/или сушкой. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения по меньшей мере одна фракция зоны, богатой теанином, подвергается концентрированию и/или сушке. Это позволяет достичь стабильности фракции при длительном ее хранении. Как правило, фракция может быть высушена до достижения содержания влаги менее чем 20 мас.%, более предпочтительно менее чем 10% и оптимально в пределах от 1 до 7% влаги. Пример Этот пример демонстрирует выделение теанина от концентрированного водного экстракта чая. Получение водного экстракта чая. Высевки из резанного чайного листа (BMF) черного чая экстрагируют водой. Полученный в результате экстракт центрифугируют, подвергают нанофильтрации и сушат с получением экстракта чая, включающего 6 мас.% теанина, 16 мас.% моно- и дисахаридов, 15 мас.% золы, 6 мас.% полифенолов, 6 мас.% аминокислот, иных чем теанин, и 4 мас.% кофеина. Затем экстракт чая повторно разбавляют водой и фильтруют через 5 мкм фильтр с получением водного экстракта чая с общим содержанием сухих веществ 20 мас.% и pH 4,85. Подготовка колонки Используют смолу Diaion UBK550 в форме K+. Эта смола представляет собой сульфированный полистиреновый полимер в форме гранул с узким пределом распределения частиц и средним диаметром 220 мкм. Колонку заполняют наполовину дегазированной деионизированной водой. Затем добавляют смолу,и в течение 30 мин через колонку рециркулирует горячая вода для регулирования уровня смолы. Затем колонку заполняют. Это достигается при использовании двух элюатов, без какого-либо забора проб или записи данных, при скорости потока 4 Vc в 1 ч. Это приводит в результате к уплотнению смолы из-за разбухания и усадки, затем после воды вводят продукт. После двух элюирований уровень смолы регулируют до вершины колонки с использованием поршневого насоса колонки. Заполненная колонка имеет высоту 113 см и диаметр 1,5 см. Следовательно, объем колонки (Vc) составляет 200 мл. Колонка снабжена водной рубашкой, поддерживающей температуру 60C. Отделение экстракта Экстракт чая вводят в колонку в количестве 9 мл (0,05 Vc). Затем через колонку со скоростью 5 мл в 1 мин (1,5 Vc в 1 ч) прокачивают подвижную фазу (дегазированную деионизированную воду). Выходящий из колонки продукт подается в сборник фракции, свежую фракцию собирают каждую минуту (эквивалент каждой 0,025 Vc элюированного продукта). Каждую фракцию анализируют на общие сухие вещества (по шкале Брикса с использованием рефрактометра BellinghamStanley RFM 3000) и содержание теанина (с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии). Результаты приведены в таблице. Как видно из данных таблицы, наибольшее количество примесей элюировано в первых 60% объема колонки, при этом теанин начинает эллюироваться только с этой точки. Следовательно, фракции, собранные после этой точки (далее фракции 14), обогащены теанином, по сравнению с водным экстрактом чая, который вводят в колонку (содержание теанина 6 мас.% по сухому веществу). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ выделения теанина из водного раствора с доминирующим катионом, содержащего примеси, включающий стадии:a) введения водного раствора в колонку в количестве (Va) в пределах от 2 до 20% объема колонки(Vc), где колонка заполнена катионообменной смолой с катионом того же типа, что и доминирующий катион;b) введения водной подвижной фазы с pH в пределах от 2,5 до 8,5 в колонку для элюирования зоны,богатой примесями, перед зоной, богатой теанином; иc) выделения по меньшей мере одной фракции зоны, богатой теанином. 2. Способ по п.1, где общее содержание сухих веществ в водном растворе составляет по меньшей мере 2 мас.% раствора, предпочтительно по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%. 3. Способ по п.2, где общее содержание сухих веществ включает теанин в количестве по меньшей мере 1 мас.% сухих веществ. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где примеси включают сахариды, аминокислоты или их смесь. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где pH подвижной фазы составляет от 4 до 7.-5 015601 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где Va составляет в пределах от 3 до 15% от Vc. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где подвижная фаза представляет собой деионизированную воду. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где доминирующий катион представляет собой калий (K+). 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где водный раствор представляет собой водный раствор экстракта чая. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий дополнительную стадию d) концентрирования и/или сушку по меньшей мере одной фракции зоны, богатой теанином. 11. Способ по п.10, где по меньшей мере одну фракцию не подвергают мембранной фильтрации между стадиями c и d. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где смола представляет собой сульфированную полистиреновую смолу.