Противовирусный агент

006762 Область техники Настоящее изобретение относится к противовирусному агенту (AVA, anti-virus agent), действующему против однонитевых (+)РНК-содержащих вирусов. В частности, настоящее изобретение относится к противовирусному агенту, содержащему конструкцию, включающую нуклеотидную последовательность, способную направлять синтез комплементарной цепи, и токсинкодирующий ген, связанный с регулоном, где токсинкодирующий ген в данной конструкции ориентирован в обратном направлении. Настоящее изобретение относится также к применению указанного противовирусного агента для изготовления лекарства для лечения вирусных болезней. Предшествующий уровень техники Однонитевые (+)РНК-содержащие вирусы представляют собой вирусы с положительной (смысловой) нитью и с отсутствием стадии ДНК в процессе размножения вируса в хозяйской клетке. Вирусы этой группы воспроизводят свою геномную РНК с помощью ферментов, кодируемых самим вирусом, и которые обозначают в общем как РНК-зависимые РНК-полимеразы (RdRp, RNA-dependent RNApolymerase). В большинстве случаев упомянутые RdRp представляют собой комплекс так называемых неструктурных (НС) белков, которые не принимают участия в образовании вириона. Этот ферментный комплекс НС-белков распознает нетранслируемые последовательности/участки вирусной РНК (обозначаемые как UTR-последовательности), которые в основном располагаются на 5'и/или 3'-конце вирусного генома и осуществляют синтез комплементарной цепи, т. е. (-)-цепи, на однонитевой (+)РНК (Ekland et al., Nature 382 (1986), 373-376). Кроме того, этот комплекс также отвечает за синтез многочисленных копий геномной вирусной РНК в ответ на образующуюся двунитевую РНК, которая представляет собой дуплекс смысловой (+) и антисмысловой (-)РНК-цепи (Bartenschlager et al., J.Gen. Vir. 71 (2000), 1497-1505). Одним из наиболее известных членов таких ss(+)РНК-содержащих вирусов (ss - single strand, однонитевой) является вирус гепатита, несколько подгрупп которого было обнаружено совсем недавно. Наиболее распространенный тип вируса, вирус гепатита С (HCV - hepatitis С virus), представляет собой снабженный оболочкой вирус с положительной нитью, который эволюционно родственен флавивирусам и пестивирусам. Геном HCV состоит из 5'-нетранслируемой области (5'-UTR), длинной открытой рамки считывания (ORF) от 9030 до 9099 нуклеотидов и 3'-UTR. 3'-конец генома, как сообщалось, содержит короткий участок поли(А) в цепях I типа, присутствие которого, однако, еще не подтверждено в цепях II,III или IV типа. Сообщалось также, что 5'-UТR-последовательности осуществляют негативный трансляционный контроль над экспрессией вирусных генов. Было обнаружено, что RdRp-комплекс HCV взаимодействует с участком между 27 и 45 нуклеотидами в 3'-UТР-последовательности, который функционирует в качестве направляющей нити для инициации комплементарной цепи -)-цепи) и, в конечном счете, репликации вирусного генома. Группа вирусов гепатита С отвечает за большинство случаев гепатита не-А-, не-В-типа. Хотя гепатит не-А-, не-В-типа может вызываться многими различными вирусами, основной причиной являетсяHCV. Инфекция передается при переливании крови (гемотрансфузии), при чрескожном вливании в результате использования запрещенных веществ (наркотиков), при трансплантации почек и от матери новорожденному. До 20% спорадических вспышек гепатита вызываются HCV. Связь вируса гепатита С с посттрансфузионным гепатитом (95% случаев) и последующее наблюдение, что инфицирование этим вирусом в большей степени, чем вирусом гепатита В, строго коррелируется с развитием гепатоцеллюлярной карциномы и цирроза печени, привели к интенсивному изучению молекулярной биологии этих вирусных генов. До сих пор нет сильнодействующего лекарственного препарата, пригодного для лечения вирусных болезней, вызванных ss(+)РНК-содержащими вирусами, таких как, например, ящур или лихорадка Денге. В случае гепатита, вызванного HCV, известная терапия включает введение лекарственных препаратов,содержащих -интерферон (IFN-) и/или -интерферон (IFN-). Однако введение этих лекарственных препаратов, само по себе, оказалось не очень эффективным, а комбинированное применение обоих веществ также не дало желаемых результатов (Samuel et al., Virology 130 (1983), 474-484). Таким образом, в данной области существует сильная потребность в реально действующем лекарственном средстве для лечения вирусных болезней, вызванных ss(+)РНК-содержащими вирусами, например, HCV. Сущность изобретения В процессе широких исследований, приведших к настоящему изобретению, автор настоящего изобретения предложил новую концепцию лечения вирусных болезней, вызванных ss(+)РНК-содержащими вирусами, воплощением которой явилось создание противовирусного агента (AVA) согласно настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает противовирусный агент, направленный против однонитевых (+)РНК-содержащих вирусов, содержащий компоненты (А) и (В), где компонент(А) представляет собой нуклеотидную последовательность, направляющую синтез комплементарной цепи однонитевого (+)РНК-содержащего вируса, и где компонент (В) представляет собой нуклеотидную последовательность, содержащую, по меньшей мере, регуляторный участок, оперативно связанный со-1 006762 структурным геном, кодирующим токсин, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая токсин, ориентирована в обратном направлении относительно (+)-цепи (смысловой цепи). Согласно другой предпочтительной форме осуществления изобретения, компонент (А) получают из 5'- или 3'-нетранслируемой области ss(+)PHK-содержащего вируса, например вируса гепатита В, С, D и/или Е, вируса Денге, неклассифицированных флавивирусов, вируса краснухи, вируса желтой лихорадки, вируса диареи крупного рогатого скота, вируса лихорадки свиней, вируса ящура. Согласно еще более предпочтительной форме осуществления изобретения, указанный компонент (А) получают из 3'-UТРпоследовательности HCV или из ее части. Согласно другой предпочтительной форме осуществления изобретения, регуляторный участок содержит последовательность Шайна-Далгарно или внутренний сайт связывания рибосом (IRBS - internalribosome binding site) геномной РНК полиовирусного вакцинного штамма Sabin 2. Токсин может представлять собой любой токсин, LD50 (летальная доза) которого для позвоночных составляет не более 100 нг/кг веса тела, и который допущен для применения в отношении индивидуумов,таких как человек или животные или даже растения (ср. последние Правила Центра химической дезактивации и очистки - CDC Final Rules). Согласно предпочтительной форме осуществления изобретения токсин выбирают из группы, включающей дифтерийный экзотоксин, А-субъединицу дифтерийного экзотоксина, токсин шигеллы или дизентерийный нейротоксин. Противовирусный агент по настоящему изобретению может применяться для изготовления лекарства (медикамента) для лечения вирусных болезней, которые могут вызываться вирусами гепатита А, В,С, D и/или Е, вирусом Денге, неклассифицированными флавивирусами, вирусом краснухи, вирусом желтой лихорадки, вирусом диареи крупного рогатого скота, вирусом лихорадки свиней, вирусом ящура. Для того чтобы доставить конструкцию в хозяйскую клетку, эту конструкцию вносят в подходящую галеновую форму и затем вводят пациенту. Такие галеновые формы включают в себя растворы для инъекций или подкожных введений, для назального введения (инстилляции, т.е. капельного введения),пероральные лекарственные формы, инкапсуляцию в липосомы, целевые микроинкапсулированные препараты или включение в вирусный геном. Для обеспечения улучшенной устойчивости этих конструкций против ферментативной или химической деградации (т.е. их стабильности), нуклеотиды могут быть представлены в модифицированной форме, которая хорошо известна специалистам в данной области. Примерами таких способов стабилизации являются кэппинг, метилирование или использование аналогов обычных нуклеотидов. Краткое описание графических материалов Принцип создания генетической структуры для AVA (противовирусного агента) согласно настоящему изобретению будет проиллюстрирован со ссылками на чертеж, не будучи ограниченным этим чертежом. Чертеж демонстрирует пример AVA с сокращениями, обозначающими следующее. Промотор CMV - промотор цитомегаловируса (CMV) человека, необходим для экспрессии генов(ns2, ns3, ns4a, ns4b) AVA в клетках человека. Промотор Т 7 - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т 7, необходим для транскрипции in vitro последовательности AVA (не активен в эукариотических клетках). 5'-UTR представляет собой 5'-нетранслируемую концевую область (UTR -Untraslatable Terminal Region) РНК-генома HCV.ns2, ns3, ns4a, ns4b представляют собой гены, кодирующие неструктурные белки HCV NS2, NS3,NS4A, NS4B.ns5 представляет собой поврежденный ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразуIRES представляет собой регуляторную последовательность полиовируса, которая необходима для трансляции А-субъединицы дифтерийного экзотоксина в клетках человека (IRES - internal ribosomeentry site, внутренний сайт посадки рибосом).dta представляет собой ген, кодирующий А-субъединицу дифтерийного экзотоксина. Теr означает стоп-кодон, необходимый для регуляции экспрессии гена А-субъединицы дифтерийного экзотоксина.XhoI, EcoRI, XbaI, HindIII, SalI и NotI представляют собой рестрикционные сайты, по которым осуществляли клонирование. Горизонтальные стрелки обозначают направление транскрипции генов. Примечания:- последовательность плазмиды pCI-neo (Promega), - повреждение этого гена (которое приводит к отсутствию синтеза нормального RdRp-фермента),необходимо для блокирования синтеза комплементарных цепей РНК в "здоровых" клетках, - эта последовательность работает только в комплементарной цепи РНК, - А-субъединица дифтерийного экзотоксина, необходимая для разрушения клетки.-2 006762 Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Геномы всех (+)РНК-содержащих вирусов построены сходным образом. Геном HCV, в частности,состоит из четырех последовательно расположенных цепей: 5'-UTR; участка, кодирующего структурные белки (С, Е 1, Е 2, р 7); участка, кодирующего неструктурные белки (NS2 - NS5); и 3'-UTR. Значительные делеции, затрагивающие ns-участки и UTR, могут блокировать репликацию вирусной РНК. Удаление же или замена генов структурных белков в любом случае не влияет на репликацию вируса. Однако если повреждают ген, кодирующий RdRp, но сохраняют обе последовательности UTR, то репликация дефектной(+)РНК возможна только тогда, когда клетка инфицируется таким же полнофункциональным вирусомпомощником, который обеспечивает поступление вирус-специфической RdRp. Дефектная (+)РНК способна образовывать вирусные частицы. Вместо удаленных последовательностей генов, кодирующих структурные белки, могут быть встроены другие гены, например, ген А-субъединицы дифтерийного экзотоксина в антисмысловой ориентации. Токсин может представлять собой любой токсин, LD50 которого для позвоночных составляет не более 100 нг/кг веса тела, и который допущен для применения в отношении индивидуумов, таких как человек или животные или даже растения (ср. последние Правила Центра химической дезактивации и очистки). Согласно предпочтительной форме осуществления изобретения, токсин выбирают из группы,состоящей из дифтерийного экзотоксина, А-субъединицы дифтерийного экзотоксина, токсина шигеллы или дизентерийного нейротоксина. На 5'-конце этого гена должна присутствовать IRES-последовательность, несущая первый стартовый кодон AUG в смысловой ориентации, тогда как на 3'-конце должна присутствовать последовательность с кодоном, терминирующим трансляцию. РНК, полученная таким образом, должна соответствовать структуре AVA, представленной на чертеже. Структура AVA разрешает экспрессию гена Асубъединицы дифтерийного экзотоксина только в клетках, инфицированных тем же вирусом, который приводит к их неизбежной смерти. На чертеже представлен AVA, основой которого может быть плазмида pCl-neo (Promega). AVA состоит из 3 частей: первая часть содержит 5'-UTR-последовательность; вторая - ген А-субъединицы дифтерийного экзотоксина, dta; и третья состоит из генов, кодирующих белки NS2, NS3, NS4A и NSB (ns2,ns3, ns4a, ns4b) и часть белка NS5 (ns5) с 3'-UТР-последовательностью. Последовательности фрагментов генома HCV могут быть получены с помощью реакции обратной транскрипции, RT (reverse transcription), с последующей амплификацией методом ПЦР. РНК HCV может быть легко экстрагирована из плазмы индивидуумов, инфицированных HCV, хорошо известными методами. К 5'-концам праймеров для амплификации AC 5'-UTR могут быть добавлены рестрикционные сайты, например, для рестриктаз XhoI и EcoRI на 5'- и 3'-концах вставки соответственно. Оба праймера для амплификации 3'-UTR-последовательности могут иметь рестрикционные сайты для рестриктазы NotI. Длины кДНК-фрагментов, как ожидается для этой конструкции, имели, соответственно, 350 и 7500 нуклеотидов. Открытая рамка считывания (ORF) гена dta находится под контролем регуляторного участка IRES полиовируса (вакцинный штамм Sabin 2). Последовательности могут быть амплифицированы с помощью ПЦР в соответствии с протоколом производителя. Рестрикционные сайты для рестриктаз HindIII и ХbаI были добавлены к 5'-концам праймеров в случае гена dta, для рестриктаз HindIII и SalI - для IRESпоследовательности полиовируса. Стоп-кодон Теr был добавлен к 3'-концу праймера для гена dta. ORF для dta может быть получена после обработки амплифицированной смеси dtaTer и IRES рестрикционным ферментом HindIII с последующим лигированием. Последовательности ns-генов могут быть клонированы в промежуточном векторе pGEM5Z(f+)(Promega), и затем с помощью рестрикционного сайта для рестриктазы Aat2 в гене ns5 может быть осуществлена делеция. Затем все три части конструкции могут быть успешно встроены в векторный полилинкер с использованием соответствующих ферментов для фланкирующих рестрикционных сайтов(XhoI, EcoRI, XbaI, SalI и NotI) и лигазы бактериофага Т 4. ORF гена dta находится в антисмысловой ориентации. Для того чтобы доставить конструкцию в хозяйскую клетку, эту конструкцию вносят в подходящую галеновую форму и затем вводят пациенту. Такие галеновые формы включают в себя растворы для инъекций или подкожных введений, для назального введения (инстилляции, т.е. капельного введения),пероральные лекарственные формы, инкапсуляцию в липосомы, целевые микроинкапсулированные препараты или включение в вирусный геном. Для обеспечения лучшей стабильности этой конструкции от ферментативной или химической деградации, нуклеотиды могут быть представлены в модифицированной форме, которая хорошо известна специалистам в данной области. Примерами таких способов стабилизации являются кэппинг, метилирование или использование аналогов обычных нуклеотидов. Как указано выше, при попадании конструкции в клетку тела индивидуума, подлежащего лечению,нуклеотидная последовательность, расположенная в нисходящем направлении (т.е. в 5'3'-направлении) от промотора, может транскрибироваться с помощью клеточных ферментов в молекулу РНК, которая содержит токсин в антисмысловом направлении. Но поскольку указанная выше молекула РНК подверга-3 006762 ется нормальным процессам деградации в клетке, она исчезнет со временем. Однако когда вирус, подлежащий лечению, присутствует в указанной клетке, то он поставляет RdRp-комплекс, способный осуществлять синтез (-)-цепи на (+)-цепи конструкции, или любой молекулы РНК, содержащей указанный компонент. Поэтому в последнем случае будет образовываться молекула РНК, которая теперь содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую токсин в правильном для считывания направлении и, таким образом, в клетке будет синтезироваться токсин, который в конце концов убивает эту клетку. Вследствие этого, настоящее изобретение обеспечивает избирательное уничтожение (киллинг) клеток, инфицированных вирусом (подлежащим лечению), поскольку только в этих клетках антисмысловой токсин будет транскрибироваться в смысловом направлении с последующей его трансляцией в полипептид. В клетках, свободных от вируса, (-)-цепь, содержащая ген, кодирующий токсин в смысловом направлении, не будет образовываться, поэтому неинфицированные клетки не будут разрушаться. В настоящее время, не вдаваясь в какую-либо теорию, полагают, что в процессе умирания части инфицированной клетки могут становиться частью вирионов, при этом происходит включение одной или более копий реплицированной конструкции в вирион и его перенос в другие клетки, подлежащие инфицированию. Поэтому настоящая конструкция может не только избирательно убивать клетки, инфицированные вирусами, но также обеспечивает перенос конструкции в другие инфицированные клетки. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает следующие преимущества. Во-первых, имеет место избирательный киллинг клеток, инфицированных ss(+)РНК-содержащими вирусами. Во-вторых,эту конструкцию можно вводить в клетку либо в виде ДНК, когда она является частью векторной плазмиды, либо в виде РНК, когда она вводится после ее транскрипции, а также в результате ранней репликации. В-третьих, эта конструкция неспособна образовывать токсин без вирусного ферментативного аппарата, что делает данную систему безопасной. В-четвертых, эта конструкция способна реплицироваться внутри клетки-хозяина, поэтому индивидууму можно вводить минимальные дозы. Далее изобретение проиллюстрировано следующими не ограничивающими его примерами. Пример 1. ДНК-плазмиды (pCl-neo/AVA) вводили в клетки линии HepG2 путем их трансформации методомTransfectin (частота 2550-1200 клонов на 105 клеток). Трансформированные клетки отбирали в средеPRMI 1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки и генетицином (0,5 мг/мл). Генетицин-устойчивые(G418) клоны использовали для определения специфических для HCV антигенов и РНК AVA. Через 24-72 ч после трансформации в G418-клетках начинали определять специфические дляHCV антигены и РНК, а также дифтерийный токсин. Было показано, что никаких морфологических признаков смерти G418-клеток от воздействия дифтерийного токсина не наблюдалось ни через 72 ч, ни через больший период времени (вплоть до 14 дней). На 14-й день в культуральной среде от G418 клеток определяли HCV-подобные частицы, содержащие SPHKHCV. Клетки гепатокарциномы человекаHepG2, экспрессирующие NS-белки (линия HepG2NS), оказались высокочувствительными к среде, в которой культивировали G418-клетки, разбавленной до титра 1:1600. Пример 2.AVA использовали в качестве противовирусной РНК. Амплификацию проводили с помощью ПЦР в присутствии термополимеразы Pwo II и плазмиды pCl-neo/AVA. Ампликон использовали для транскрипции с помощью РНК-полимеразы бактериофага Т 7. Полученную РНК вводили в клетки линии HepG2NS путем электропорации. Через 24 ч после электропорации в этих клетках можно было обнаружить дифтерийный токсин. Дифтерийный токсин был обнаружен в течение 5 первых 48-52 ч после электропорации и продолжал выявляться в течение 120 ч. Через 6 ч в этих клетках можно было обнаружить специфические для HCV антигены и SPHKHCV, а также дифтерийный токсин. Токсин можно было обнаружить с помощью иммуноферментного анализа(ELISA - enzyme-linked 10 immunosorbent assay). Очевидные морфологические признаки клеточной деструкции выявляли через 28 ч после электропорации. HCV-подобные частицы, содержащие SPHKHCV, были обнаружены в культуральной среде от клеток линии HepG2NS, подвергнутых электропорации, через 14 дней. Необработанные клетки линии HepG2NS оказались высокочувствительными к среде, в которой культивировали клетки, подвергнутые электропорации, разбавленной до титра 1:100. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Противовирусный агент против вируса гепатита, содержащий следующие компоненты (А) и (В):(A) нуклеотидную последовательность, направляющую синтез комплементарной цепи вируса гепатита;(B) нуклеотидную последовательность, содержащую, по меньшей мере, регуляторный участок, оперативно связанный со структурным геном, кодирующим токсин, летальная доза LD50 которого для позвоночных составляет не более 100 нг/кг веса тела,в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая токсин, расположена в антисмысловом направлении.-4 006762 2. Противовирусный агент по п.1, отличающийся тем, что компонент (А) получают из 5'- и/или 3'нетранслируемых областей вируса гепатита В, С, D и/или Е. 3. Противовирусный агент по п.2, отличающийся тем, что компонент (А) получают из 3'нетранслируемой области вируса HCV. 4. Противовирусный агент по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что регуляторный участок содержит последовательность Шайна-Далгарно или внутренний сайт связывания рибосом (IRBS) геномной РНК полиовирусного вакцинного штамма Sabin 2. 5. Противовирусный агент по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что токсин выбирают из группы, включающей дифтерийный экзотоксин, А-субъединицу дифтерийного экзотоксина, токсин шигеллы,дизентерийный токсин. 6. Противовирусный агент по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что он содержит ДНК- или РНК-вектор. 7. Применение противовирусного агента, охарактеризованного в любом из пп.1-6, для изготовления лекарства для лечения гепатита. 8. Применение по п.7, отличающееся тем, что вирусное заболевание вызвано вирусом гепатита В, С,D и/или Е.