Внутриклеточный полипептид (cari) и способы его применения

009956 Область изобретения Данное изобретение относится к взаимодействующему с каспазой-8 полипептиду (Cari), способам его получения и его применению. Предпосылки изобретения Фактор некроза опухолей (TNF-альфа) и лимфотоксин (TNF-бета) являются полифункциональными провоспалительными цитокинами, образуемыми, в основном, мононуклеарными лейкоцитами, которые оказывают многочисленные действия на клетки (Wallach, D. (1986) In: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; и Beutler and Cerami (1987. Как TNF-альфа, так и TNF-бета начинают действовать в результате связывания со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Некоторые из этих действий, по-видимому, являются благоприятными для организма; они могут, например,разрушать опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки и усиливать антибактериальные активности гранулоцитов. Таким образом TNF способствует защите организма против опухолей и инфекционных агентов и способствует восстановлению после повреждения. Таким образом, TNF может быть использован в качестве противоопухолевого агента, при применении которого он связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток и посредством этого инициирует события, приводящие к гибели опухолевых клеток. TNF может быть также использован в качестве противоинфекционного агента. Однако TNF-альфа оказывает вредное действие. Имеется доказательство, что сверхпродуцированиеTNF-альфа может играть главную патогенную роль в нескольких заболеваниях. Например, известно, что действие TNF-альфа, прежде всего на сосудистую систему, является главной причиной симптомов септического шока (Tracey et al., 1994). При некоторых заболеваниях TNF может вызывать избыточную потерю веса (кахексию), подавляя активности адипоцитов и вызывая анорексию, и поэтому TNF-альфа назвали кахектином. Он был описан также как медиатор повреждения тканей при ревматических заболеваниях (Beutler and Cerami, 1987) и как главный медиатор повреждения, наблюдаемого в реакциях "трансплантат против хозяина" (Grau G.E. et al., 1989). Кроме того, известно, что TNF участвует в процессе воспаления и во многих других заболеваниях. Два различных, независимо зкспрессируемых рецептора, TNF-рецепторы р 55 (CD120a) и р 75(CD120b), которые специфически связывают как TNF-альфа, так и TNF-бета, инициируют и/или опосредуют отмеченные выше биологические эффекты TNF. Эти два рецептора имеют структурно непохожие внутриклеточные домены, что предполагает, что они различным образом передают сигнал (см. Hohraannal., 1990; Smith et al., 1990). Однако клеточные механизмы, например различные белки и, возможно, другие факторы, которые участвуют во внутриклеточной передаче сигнала CD120a и CD120b, пока еще не выяснены. Речь идет о внутриклеточной передаче сигнала, которая происходит обычно после связывания лиганда, т.е. TNF (альфа или бета), с рецептором, который является ответственным за начало каскада реакций, приводящих в конце концов к наблюдаемой реакции клетки на TNF. Что касается вышеупомянутого разрушающего (цитоцидного) действия на клетки TNF, в большинстве клеток, исследованных до настоящего времени, это действие запускается, в основном, CD120a. Антитела против внеклеточного домена (лигандсвязывающего домена) CD120a могут сами запускать цитоцидное действие (см. ЕР 412486), которое коррелирует с эффективностью перекрестного связывания рецептора антителами, которое, как считают, является первой стадией в генерировании внутриклеточного процесса передачи сигнала. Кроме того, мутационные исследования (Brakebush et al., 1992; Tartaglia etal., 1993) показали, что биологическая функция CD120a зависит от целостности его внутриклеточного домена, и, следовательно, было сделано предположение, что инициация внутриклеточной передачи сигнала, приводящая к цитоцидному действию TNF, происходит как следствие ассоциации двух или более внутриклеточных доменов CD120a. Кроме того, TNF (альфа и бета) встречается в виде гомотримера, и предположили, что в таком виде он индуцирует внутриклеточную передачу сигнала через CD120a посредством его способности связываться с рецепторными молекулами и сшивать их, т.е. вызывать агрегацию рецептора (Engelman H. et al., 1990). Другой член суперсемейства рецепторов TNF/NGF представляет собой рецептор FAS/APO1 (CD95).CD95 опосредует гибель клеток в форме апоптоза (Itoh et al., 1991) и, по-видимому, служит в качестве агента негативной селекции аутореактивных Т-клеток, т.е. во время созревания Т-клеток CD95 опосредует апоптозную гибель Т-клеток, распознающих аутоантигены. Было также обнаружено, что мутации в гене CD95 (lpr) вызывают нарушение лимфопролиферации у мышей, которое является похожим на аутоиммунное заболевание системную красную волчанку (SLE) человека (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Лиганд для CD95 является связанной с клеточной поверхностью молекулой, переносимой, среди прочего, Т-клетками-киллерами (или цитотоксическими Т-лимфоцитами - CTL), и, следовательно, когда такиеCTL контактируют с клетками, несущими CD95, они способны индуцировать апоптотическую клеточную гибель несущих CD95 клеток. Далее, были получены моноклональные антитела, которые являются специфическими в отношении CD95, причем эти моноклональные антитела способны индуцировать апоптотическую клеточную гибель в клетках, несущих CD95, в том числе мышиных клетках, трансформированных кДНК, кодирующей CD95 человека (например, Itoh et al., 1991).-1 009956 Механизмы передачи сигнала TNF-рецептора и Fas, содержащие различные рецепторы, их регуляция и идентифицированные молекулы передачи сигнала далее по ходу процесса рассматриваются подробно в обзоре Wallach et al. (1999). Было обнаружено, что определенные злокачественные клетки и ВИЧ-инфицированные клетки несут CD95 на своей поверхности и антитела против CD95 или лиганд CD95 могут быть использованы для запуска опосредованных CD95 цитотоксических эффектов в этих клетках и, следовательно, обеспечивают средство для борьбы с такими злокачественными клетками или ВИЧ-инфицированными клетками(см. Itoh et al., 1991). Таким образом, нахождение еще и других путей для усиления цитотоксической активности CD95 может также иметь терапевтическое значение. В течение длительного времени ощущалась потребность в обеспечении способа модуляции клеточной реакции на TNF (альфа или бета) и CD95-лиганд. Например, в упомянутых выше патологических ситуациях, где сверхэкспрессируется TNF или CD95-лиганд, желательно ингибировать индуцируемыеTNF или CD95-лигандом цитоцидные эффекты, тогда как в других ситуациях, например при применениях в заживлении ран, желательно усилить действие TNF или, в случае CD95, в опухолевых клетках или ВИЧ-инфицированных клетках, желательно усилить опосредованное CD95 действие. Авторами данного изобретения был предпринят ряд подходов (см., например, описания европейских патентов с номерами ЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 412486) для регуляции вредных действий TNF ингибированием связывания TNF с его рецепторами с использованием анти-TNF-антител или с использованием растворимых рецепторов TNF (являющихся, по существу, растворимыми внеклеточными доменами этих рецепторов) для конкуренции за связывание TNF со связанными с клеточной поверхностью TNF-рецепторами (TNF-R). Далее, на основе того, что связывание TNF с его рецепторами является необходимым для TNF-индуцируемых клеточных эффектов, авторами данного изобретения были разработаны подходы (см., например, ЕР 568925) для модуляции действия TNF посредством модулирования активности TNF-R. ЕР 568925 относится к способу модулирования трансдукции сигнала и/или расщепления в TNF-R,посредством которого пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать либо с самим рецептором, либо с эффекторными белками, взаимодействующими с этим рецептором, модулируя таким образом нормальную функцию TNF-R. В ЕР 568925 описано конструирование и характеристика различных мутантных форм CD120a, имеющих мутации в его внеклеточном, трансмембранном и внутриклеточном доменах. Таким образом, области в вышеупомянутых доменах CD120a были идентифицированы как существенные для функционирования этого рецептора, т.е. связывания лиганда (TNF) и последующей передачи трансдукции сигнала и внутриклеточной передачи сигнала, которая в конечном счете приводит к наблюдаемому действию TNF на клетки. Кроме того, также описан ряд способов выделения и идентификации белков, пептидов или других факторов, которые способны связываться с различными областями в вышеупомянутых доменах CD120a, причем указанные белки, пептиды и другие факторы могут участвовать в регуляции или модуляции активности TNF-R. Ряд способов выделения и клонирования ДНК-последовательностей, кодирующих такие белки и пептиды, для конструирования экспрессирующих векторов для получения указанных белков и пептидов и получения антител или их фрагментов, которые взаимодействуют с CD120a или с вышеупомянутыми белками и пептидами, которые связывают различные области CD120a, также описаны в ЕРО 368925. Однако в ЕР 568925 не указаны фактические белки и пептиды, которые связываются с внутриклеточными доменами TNF-R. Также в ЕР 568925 нет описания специфических белков или пептидов, способных связывать внутриклеточный домен CD95. Таким образом, когда желательно ингибировать действие TNF или CD95-лиганда требуется уменьшение количества или активности TNF-R или CD95 на клеточной поверхности, тогда как увеличение количества или активности TNF-R или CD95 может быть желательным, когда требуется усиленное действие TNF или CD95-лиганда. Для этой цели промоторы как CD120a, так и CD120b были секвенированы,анализированы, и был обнаружен ряд ключевых мотивов последовательности, которые являются специфическими для различных регулирующих транскрипцию факторов, и экспрессия указанных TNF-R, как таковая, может регулироваться на уровне их промоторов, т.е. возможно ингибирование транскрипции на промоторах для уменьшения количества рецепторов и усиление транскрипции на промоторах для увеличения количества рецепторов (ЕР 606869 и WO 9531206). Хотя известно, что рецепторы фактора некроза опухолей (TNF) и структурно родственный рецепторCD95 запускают в клетках после стимуляции продуцируемыми лейкоцитами лигандами деструктивные активности, которые приводят к их собственной гибели, механизмы этого запуска являются все еще малопонятными. Мутационные исследования показывают, что в передаче сигнала в отношении цитотоксичности CD95 и CD120a участвуют различные области в их внутриклеточных доменах (Brakebush et al.,1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). Указанные области ("домены гибели") имеют сходство последовательности. "Домены гибели" как CD95, так и CD120a склонны к самоассоциации. Их самоассоциация, по-видимому, способствует агрегации рецептора, которая необходима для инициации передачи сигнала (см. Bigda et al., 1994; Boldin et al., 1995), и при высоких уровнях экспрессии рецептора может приводить к запуску лиганднезависимой передачи сигнала (Boldin et al., 1995). Некоторые из цитотоксических действий лимфоцитов опосредованы взаимодействием продуци-2 009956 руемого лимфоцитами лиганда с CD95 в клетках-мишенях (см. также Nagata and Goldstein, 1995). В уничтожении клеток мононуклеарными фагоцитами участвует TNF и его рецептор CDl20a (см. такжеVandenabeele et al., 1995). Подобно другим индуцируемым рецепторами эффектам, индукция гибели клеток TNF-рецепторами и CD95 происходит через серию межбелковых взаимодействий, ведущих от связывания лиганд-рецептор к конечной активации ферментативных эффекторных функций, которые, как было показано, включают неферментативные межбелковые взаимодействия, инициирующие передачу сигнала гибели клеток: связывание молекул тримерного TNF или CD95-лиганда с рецепторами и в результате того взаимодействие их внутриклеточных доменов (Brakebush et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh andNagata, 1993), усиливаемое склонностью мотивов доменов гибели к самоассоциации (Boldin et al., 1995a),и индуцированное связывание двух цитоплазматических белков (которые могут также связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов - MORT-1 (или FADD) с CD95 (Boldin et al., 1995b;Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) и TRADD с CDl20a (Hsu et al., 1996). Кроме их связывания сCD95 и CD120a MORT-1 и TRADD способны также связываться друг с другом, а также с другими содержащими домен гибели белками, такими как RIP (Stanger et al., 1995), что обеспечивает функциональное "перекрестное общение" между CD95 и CD120a. Указанные связывания происходят через консервативный мотив последовательности, "модуль домена гибели", общий для рецепторов и их ассоциированных белков. Кроме того, хотя в дрожжевом двухгибридном тесте было показано, что MORT-1 связывается спонтанно с CD95 в клетках млекопитающих, указанное связывание имеет место только после стимуляции рецептора, что предполагает, что MORT-1 участвует в инициации событий передачи сигналаCD95. MORT-1 не содержит никакого мотива последовательности, характерного для ферментативной активности, и, следовательно, в его способность запускать гибель клеток, по-видимому, не вовлечена активность, свойственная самому MORT-1, а, скорее, активация некоторого другого белка (белков), который связывает MORT-1 и действует далее по ходу процесса в каскаде передачи сигнала. Было показано, что клеточная экспрессия мутантов MORT-1 без N-концевой части молекулы блокирует индукцию цитотоксичности посредством CD95 или CD120a (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), указывая на то,что N-концевая область передает сигнал цитоцидного действия обоих рецепторов через межбелковые взаимодействия. Недавние исследования предполагают участие группы цитоплазматических тиоловых протеаз, которые являются структурно родственными протеазе CED3 Caenorhabditis elegans и превращающему интерлейкин-1 бета ферменту (ICE), в возникновении различных физиологических процессов гибели клеток (обзор в Kumar, 1995 и Henkart, 1996). Имеется также доказательство того, что протеаза (протеазы) данного семейства участвует в клеточной цитотоксичности, индуцируемой CD95 и TNF-R. Было обнаружено, что специфические пептидные ингибиторы этих протеаз и два кодируемых вирусами белка, которые блокируют их функцию, белок crmA вируса коровьей оспы и белок р 35 бакуловируса, обеспечивают защиту клеток против указанной клеточной цитотоксичности (Enari et al., 1995; Tewari et al., 1995;Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). Быстрое расщепление некоторых специфичных клеточных белков,по-видимому, опосредованное протеазой (протеазами) семейства CED3/ICE (каспазами), может быть продемонстрировано в клетках вскоре после стимуляции CD95 или TNF-R. Одна такая протеаза и ее различные изоформы (в том числе ингибиторные), известная как МАСН (в настоящее время каспаза-8), которая является MORT-1-связывающим белком, была выделена, клонирована, охарактеризована, и были также описаны ее возможные применения, как подробно изложено и включено в данное описание в качестве ссылки в полном объеме, в находящейся в совместной собственности заявке PCT/US96/10521 и в публикации авторов данного изобретения (Boldin et al., 1996). Другая такая протеаза и ее различные изоформы (в том числе ингибиторные), названная Mch4 (также называемая каспазой-10), была также выделена и охарактеризована авторами данного изобретения (неопубликованные данные) и другими (Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996). Каспаза-10 является также MORT-1-связывающим белком. Таким образом, подробности, касающиеся всех аспектов, признаков, характеристик и применений каспазы-10, описаны в приведенных выше публикациях, все из которых включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Следует отметить, что каспазы, каспаза-8 и каспаза-10, которые имеют одинаковые продомены (см.Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincent and Dixit, 1997), взаимодействуют через их продомены с MORT-1, причем указанное взаимодействие происходит через "эффекторный домен гибели", DED, присутствующий в N-концевой части MORT-1, и присутствуют в двух копиях в каспазе-8 и каспазе-10 (см. Boldin et al., 1995b; Chinnlyan et al., 1995). Каспазы (цистеин-аспартат-специфические протеиназы) являются растущим семейством цистеиновых протеаз, которые имеют несколько общих признаков. Было обнаружено, что большинство каспаз участвуют в инициации и осуществлении запрограммированной гибели клеток, или апоптозе, тогда как оказалось, что другие участвуют в продуцировании провоспалительных цитокинов (Nicholson D.W. et al.,1997; Salvesen G.S. et al., 1997; Cohen G.M. 1997). Они синтезируются в виде каталитически почти неактивных предшественников и обычно активируются расщеплением после специфических внутренних остатков аспартата, присутствующих в междоменных линкерах. Сайты расщепления каспаз определяются тетрапептидными последовательностями (X-X-X-D), и расщепление всегда происходит ниже аспарагино-3 009956 вой кислоты. В результате определенные зрелые активные каспазы могут процессировать и активировать сами себя, а также другие неактивные предшественники (Fernandes-Alnemri T. et al., 1996; SrinivasulaS.M. et al., 1996). Активация процесса запрограммированной гибели клеток обычно является специфической и включает в себя последовательный процессинг находящихся далее по ходу процесса каспаз, называемых каспазами-"палачами", находящимися выше по ходу процесса каспазами, называемыми каспазами-"инициаторами". Функциональные характеристики этих двух классов каспаз отражены также в их структуре. Действительно, каспазы-"инициаторы" содержат более длинные области продоменов в сравнении с каспазами-"палачами" (Salvesen G.S. et al., 1997, Cohen G.M. 1997). Длинный продомен позволяет инициаторным или "апикальным" каспазам активироваться запуском рецепторов гибели семейства TNF-рецепторов. При индуцированной лигандом тримеризации рецепторов гибели каспазы-"инициаторы" рекрутируются через их длинный N-концевой продомен для взаимодействия со специфическими адапторными молекулами с образованием индуцирующего гибель комплекса передачи сигнала (Cohen G.M. 1997,Kischkel F.C. et al., 1995). Например, каспаза-8/МАСН и, возможно, каспаза-10, которая содержит дваDED, рекрутируются в рецепторный комплекс адапторными молекулами FADD/MORT-1, тогда как каспаза-2, предположительно, рекрутируется CRADD/RAIDD и RIP (Nagata S. et al., 1997, MacFarlane M. etal., 1997, Ahmad M. et al., 1997, Duan H. et al., 1997). Считается, что вследствие трехмерной природы активированного рецепторого комплекса по меньшей мере 2 молекулы каспазы подходят близко друг к другу, что приводит к их активации посредством аутокаталитического процессинга (Yang et al., 1998;Muzio et al., 1998). Каспазы синтезируются в виде проферментов, состоящих из трех основных субъединиц, N-концевого продомена и двух субъединиц, которые иногда разделены линкерным пептидом. Две субъединицы названы "длинной" или субъединицей 1 (Sub-1), содержащей основную часть активного ферментативного сайта, и "короткой" или субъединицей 2 (Sub-2). Для полной активации фермента он процессируется с образованием продомена и двух субдоменов. Две субъединицы образуют гетеродимер. На основе выведенной трехмерной структуры каспазы-3 оказалось, что С-конец длинного домена, а также N-конец короткого субдомена должны быть освобождены и С-конец короткой субъединицы должен быть приведен в тесную близость с N-концом длинной субъединицы, чтобы получить правильно свернутый и активный фермент (Rotonda et al., 1996, Mittl et al., 1997, Srinivasula et al., 1998). Хотя пути, приводящие к апоптозу или некрозу, всегда считались совершенно различными, недавние открытия позволили предположить, что каспазы, которые представляют собой основные медиаторы апоптоза, могут также участвовать в некрозе как положительным, так и отрицательным образом. Действительно, было показано, что сверхэкспрессия ингибитора каспаз CrmA в клетках L929 увеличивает в 1000 раз чувствительность этих клеток к некротической активности TNF (Vercammen et al., 1998), что указывает на ингибиторную роль каспаз в отношении TNF-индуцированной некротической активности. Кроме того, недавно было высказано предположение, что TNFR1- и Fas-ассоциированные домены гибели, которые играют решающую роль в индукции апоптоза указанными лигандами (обзор в Wallach et al.,1999), играют важную роль в индукции некроза (Boone et al., 2000). Интересно, что было показано, что индуцированный Fas-L некроз печени блокируется ингибиторами каспаз (Kunstle et al., 1997). Поскольку опосредованный каспазами протеолиз является решающим и центральным элементом апоптозного процесса (Nicholson, D.W. and Thornberry, N.A. (1997), Villa et al., (1997) и Salvesen, G.S., andDixit, V.M. (1997, идентификация важных расположенных далее по ходу процесса молекулярных мишеней указанных протеаз является неизбежной для понимания трансдукции сигнала апоптоза. Было показано, что различные структурные и сигнальные белки расщепляются каспазами во время апоптотической гибели (Nicholson, D.W. and Thornberry, N.A. (1997), Villa, P. et al. (1997, в том числе ICAD, ингибитор активируемой каспазой ДНКазы, которая является важной для деградации межнуклеосомной ДНК,но не для осуществления апоптоза (Enari, M. et al., (1998) и Sakahira et al. (1998. Предполагается, что гельсолин, регуляторный белок актина, который модулирует превращение гель-золь цитоплазматического актина (Yin, H.L. and Stossel, Т.P. (1979, участвует в апоптозе на основе (i) его расщепления во время апоптоза in vivo (Kothakota, S. et al. 1997, (ii) предупреждения апоптоза его сверхэкспрессией (Ohtsu, M.et al. (1997 и (iii) индукции апоптоза одним из расщепленных продуктов (Kothakota, S. et al. (1997. Гельсолин имеет Са+2-активируемые множественные активности, разделяет филаменты актина и кэпирует быстро растущие концы филаментов, а также служит затравкой при полимеризации актина (Yin,H.L. and Stossel, T.P. (1980), Kurth, M., and Bryan, J. (1984), Janmey, P.A., and Stossel, T.P. (1987. В заявке WO 0039160 описаны взаимодействующие с каспазой-8 белки, способные взаимодействовать с Sub-1 и/или Sub-2 каспазы-8. Взаимодействующие с каспазой белки были обнаружены двухгибридным скринингом с использованием одноцепочечной конструкции каспазы-8. В заявке WO9839582 (Jacobs et al.) описаны нуклеотидная и предсказанная аминокислотная последовательность секретируемого или мембранного белка DF5183, выделенного из библиотеки кДНК головного мозга взрослого человека. Белок был идентифицирован с использованием способов, которые являются селективными для кДНК, кодирующих секретируемые белки (US 5536637), и был также идентифицирован в качестве секретируемого или трансмембранного белка на основе компьютерного анализа-4 009956 аминокислотной последовательности кодируемого белка. Белок согласно данному изобретению отличается от DF51823 по его местоположению (внутриклеточный, а не мембранный/секретируемый) и по его аминокислотной последовательности (имеет одну неконсервативную замену аминокислоты в остатке 230 Е вместо G). В заявке WO многочисленные неродственные активности, которые не подтверждаются никакими данными, приписываются DF5183. Сущность изобретения Данное изобретение относится к внутриклеточному полипептиду (Cari), способному взаимодействовать с прокаспазой или ее мутеином или фрагментом, причем полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или ее изоформу, мутеин, за исключением DF51823, аллельный вариант, фрагмент, слитый белок или производное. В одном варианте полипептид согласно изобретению является расщепляемым in vitro и in vivo каспазами, предпочтительно каспазой-8. Кроме того, в данном изобретении предлагается мутеин полипептида Cari, имеющий доминантнонегативное действие на активность эндогенного полипептида Cari, и мутеины, способные ингибировать или увеличивать цитотоксическое действие каспазы, более предпочтительно каспазы-8. В одном варианте данного изобретения предлагается нерасщепляемый мутантный полипептид Cari(Cari D600E), в котором аминокислотный остаток, в котором находится остаток D600 в полипептиде Cari,заменен остатком глутаминовой кислоты. Этот полипептид способен увеличивать цитотоксическое действие каспазы-8. В другом варианте данного изобретения предлагается пептиды, производные Cari, ответственные за связывание каспазы-8, такие как пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5. Кроме того, данное изобретение относится к ДНК-последовательности, кодирующей полипептидCari или его изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеин (например, Cari D600E), слитый белок или производное, к ДНК-последовательности, способной гибридизоваться в условиях умеренной жесткости,с ДНК-последовательностью, кодирующей полипептид Cari или его изоформу, аллельный вариант,фрагмент, мутеин, слитый белок или производное, или с ДНК-последовательностью, соответствующейSEQ ID NO: 2. Более конкретно данное изобретение относится к ДНК-последовательности, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 3. Данное изобретение также относится к ДНК нерасщепляемого мутанта Cari (например, Cari D600E) и ДНК, кодирующей пептиды (например, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5). Кроме того,данное изобретение также относится к рибозиму и антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере 9 нуклеотидов, соответствующему вышеупомянутой ДНК-последовательности, предпочтительно антисмысловому олигонуклеотиду SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7. В данном изобретении также предлагаются векторы, содержащие ДНК-последовательность, кодирующую полипептид Cari или его изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеин, слитый белок или производное, и способы получения полипептида Cari или его изоформы, аллельного варианта, фрагмента, мутеина, слитого белка или производного, введением указанного вектора в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, предпочтительно в клетку млекопитающего, насекомого или дрожжей и более предпочтительно в клетки, выбранные из HeLa, 293 T HEK и CHO, и выращиванием клеток, и выделением продуцированного белка. Кроме того, в данном изобретении предлагаются вирусный вектор, кодирующий полипептид Cari или его изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеин, слитый белок, рибозим, антисмысловой олигонуклеотид или производное, и его применение для введения в клетки млекопитающих полипептида Cari,его изоформы, аллельного варианта, фрагмента, мутеина, слитого белка. Кроме этого, в данном изобретении предлагается вектор, пригодный для направления к мишени регуляторных последовательностей, функциональных в клетках, для активации экспрессии эндогенногоCari или ингибитора Cari. В другом аспекте данное изобретение относится к поликлональному или моноклональному антителу, химерному антителу, полностью гуманизированному антителу, анти-анти-Id-антителу или его фрагменту, направленным на эпитоп полипептида Cari, или его изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеин, слитый белок или производное, и его применению для диагностических целей или разработки иммуноанализов для детектирования полипептида Cari или его изоформы, аллельного варианта, фрагмента,мутеина, слитого белка или производного в биологических жидкостях. Кроме того, данное изобретение относится к клетке-хсзяину, выбранной из прокариотических или эукариотических клеток, предпочтительно HeLa, 293 T HEK и CHO, содержащей вектор, кодирующийCari, и способу получения Cari или его изоформы, мутеина, аллельного варианта, фрагмента, слитого белка или производного. Альтернативно, данное изобретение относится к способу получения Cari или его изоформы, мутеина, аллельного варианта, фрагмента, слитого белка или производного, включающему получение трансгенного животного и выделение белка, полученного из жидкостей организма этого животного. В одном аспекте данного изобретения предлагается способ генотерапии для лечения воспалительного заболевания, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного HCV хрони-5 009956 ческого гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительнотканной болезни (MCTD), болезни Крона или язвенного колита, включающий индукцию экспрессии Cari или мутеина (например, Cari D600E), фрагмента (например, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 4), антисмыслового олигонуклеотида, предпочтительно SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7, и рибозима Cari в желаемом участке в пациенте-человеке, нуждающемся в этом. Кроме того, в данном изобретении предлагается способ лечения воспалительного состояния, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита,диабета, системной красной волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного HCV хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительно-тканной болезни (MCTD), болезни Крона или язвенного колита, включающий регуляцию эндогенного Cari или ингибитора Cari нацеливанием вектора, имеющего регуляторные ДНК-последовательности, функциональные в клетках, для обеспечения возможности активации эндогенного гена Cari или эндогенного ингибитора Cari в желаемом участке организма пациента-человека, нуждающегося в этом. Кроме того, изобретение относится к применению полипептида Cari, его мутеина, изоформы, аллельного варианта, фрагмента (например, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 4), слитого белка или производного, антисмыслового олигонуклеотида (например, SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7), вектора, кодирующего Cari и его фрагменты, и антител против Cari для понижающей регуляции каспазы, в ситуациях, где имеет место избыточная гибель клеток посредством апоптоза, например, индукцией TNF-рецепторого пути передачи сигнала. Данное изобретение также относится к применению полипептида Cari или его мутеина (например,Cari D600E), изоформы, аллельного варианта или фрагмента, слитого белка или производного, вектора,кодирующего Cari или его фрагменты, ДНК, кодирующей Cari или его фрагменты и мутеины, вектора,содержащего ДНК, кодирующую Cari или фрагмент или мутеины, векторов для эндогенной активацииCari и антиидиотипических антител Cari для повышающей регуляции активности каспазы и увеличения апоптоза в ситуациях, где требуется избыточная гибель клеток. В другом аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество полипептида Cari или его мутеина (например, Cari D600E), изоформы, аллельного варианта, фрагмента (например, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 4), слитого белка или производного, ДНК или вектора, кодирующего Cari или мутеины или фрагменты, вектора для эндогенной активации Cari или его ингибитора, антисмыслового олигонуклеотида, рибозима или антитела, специфического в отношении Cari, для лечения воспалительного заболевания, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного HCV хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительнотканной болезни (MCTD), болезни Крона или язвенного колита. Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество полипептида Cari или его мутеина (например, Cari D600E), изоформы,аллельного варианта, фрагмента, слитого белка или производного, ДНК или вектора, кодирующего Cari,или мутеины, или фрагменты, вектора для эндогенной активации Cari или антиидиотипического антитела, специфического в отношении Cari, для лечения злокачественной опухоли. В другом варианте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество ингибитора Cari для лечения или профилактики заболевания, в котором участвует активность Cari. Далее, в данном изобретении предлагается способ выделения, идентификации и клонирования другого полипептида того же класса, к которому относится Cari, включающий использование ДНК, кодирующей Cari или его мутеины или фрагменты, для скрининга библиотеки ДНК или каспаза-специфического антитела, пригодного для коиммунопреципитации каспазы и связанного полипептида или аффинной очистки таких полипептидов из проб, выбранных из жидкостей организма, клеточных экстрактов и экспрессионных библиотек ДНК, Cari-специфическими антителами или с использованием полипептида Cari или его мутеина, изоформы, аллельного варианта, фрагмента, слитого белка или производного, в качестве добычи или приманки в дрожжевой двухгибридной системе. Изобретение относится также к способу выделения полипептида или фактора, участвующего в процессах внутриклеточной передачи сигнала, из проб, выбранных из клеточных экстрактов, жидкостей человека и экспрессионных библиотек, включающему коиммунопреципитацию Cari и полипептидов или факторов, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала, с использованием антитела, распознающего Cari. Кроме того, в данном изобретении предлагается способ скрининга пептида или малой молекулы,являющихся антагонистами Cari, включающий высокопроизводительный скрининг и отбор таких молекул, способных ингибировать взаимодействие Cari с прокаспазой-8, или на мутеин (например, CariD600E), изоформу, аллельный вариант, фрагмент (например, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5), слитый белок или производное, или отбор молекул, способных ингибировать апоптоз, усиленный Cari или его мутеином, изоформой, аллельным вариантом, фрагментом, слитым белком или производным.-6 009956 Кроме того, данное изобретение относится к способу лечения и/или профилактики нарушения, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита,диабета, волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного HCV хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительно-тканной болезни (MCTD), болезни Крона или язвенного колита, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества полипептида Cari или его мутеина (например, Cari D600E), изоформы,аллельного варианта, фрагмента (например, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5), слитого белка, или производного, или ДНК, или векторов, кодирующих Cari или его мутеин или фрагменты, или векторов для эндогенной активации генов Cari, или ингибитора Cari, или специфического антитела для Cari. Краткое описание фигур Фиг. 1 показывает аминокислотную последовательность прокаспазы-8. Пептидные последовательности каспазы-8, используемые для получения mAb, показаны жирным шрифтом и подчеркнуты. Пептид 179 - пептид CQGDNYQKGIPVETD, соответствующий С-концу большой субъединицы каспазы-8 (Sub-1). Пептид 182 - пептид LSSPQTRYIPDEAD, соответствующий N-концу малой субъединицы каспазы-8(Sub-2, остатки Lys385-Gly399). Пептид 183 - пептид SESQTLDKVYQMKSKPR, соответствующий N-концу Sub-1 (остатки Ser217Gly234). Фиг. 2 показывает эффективную иммунопрецигитацию незначительных количеств каспазы-8, обнаруженных в лизатах клеток BJAB с использованием моноклонального антитела против эпитопа 179. Истощение каспазы-8 из лизатов клеток BJAB (полученных до, -, и после, +, стимуляции Fas-рецептора) при помощи иммунопреципитации различными антителами показано слева направо. Дорожки 3 и 4, mAb 179: моноклональное антитело, полученное против пептида, соответствующего С-концу Sub-1 (большой субъединицы каспазы-8, остатков Cys360-Asp374). Дорожки 5 и 6, mAb 183.1 и дорожки 7 и 8, mAb 183.2, два моноклональных антитела, полученных против пептида, соответствующего N-концу Sub-1 (остатков Ser217-Gly234). Дорожки 9 и 10, mAb 182, моноклональное антитело, полученное против пептида, соответствующего N-концу Sub-2 (малой субъединицы каспазы-8) (остатков Lys385-Asp399). Дорожка 11, NMS - нормальная сыворотка мыши. Фигура показывает оценку Вестерн-блоттингом количеств каспазы-8, оставшейся в клеточных лизатах после иммунопреципитации указанными антителами и общих клеточных лизатах (дорожки 1 и 2). Фиг. 3 а показывает элюцию каспазы-8, иммунопреципитированной, как на фиг. 2, посредством конкуренции с пептидами, против которых были получены различные антитела. Каспазу-8 в элюатах из этих иммунопреципитатов, образованных указанными антителами, детектируют Вестерн-блот-анализом(как на фиг. 2). Фиг. 3b показывает элюцию каспазы-8, иммунопреципитированной, как на фиг. 2, посредством конкуренции с пептидами, против которых были получены различные антитела. Каспазу-8 в элюатах из этих иммунопреципитатов, образованных указанными антителами, детектируют окрашиванием серебром. Фиг. 4 показывает эффективную иммунопреципитацию незначительных количеств каспазы-8, обнаруженных в лизатах клеток BJAB, с использованием поликлональной сыворотки, полученной иммунизацией пептидом, соответствующим С-концу Sub-1 (большой субъединицы каспазы-8, остатки Cys360Asp-374). Истощение каспазы-8 из лизатов клеток BJAB (полученных до, -, и после, +, стимуляции Fasрецептора) иммунопреципитацией различными антителами показано слева направо. Каспазу-8, оставшуюся в лизате, детектируют Вестерн-блот-анализом после иммунопреципитации следующими антителами. Дорожки 3 и 4, NMS - нормальная сыворотка мышей. Дорожки 5 и 6, поликлональные анти-179-антитела, кроличье поликлональное антитело, полученное против С-конца Sub-1 (большой субъединицы каспазы-8, остатков Cys360-Asp374). Дорожки 7 и 8, mAb 182.TL - общий лизат клеток. Фиг. 5 показывает иммунопреципитированную и элюированную каспазу-8 из лизатов нестимулированных клеток BJAB с использованием различных антител. Слева направо показаны уровни каспазы-8,детектируемые Вестерн-блот-анализом после элюции иммунопреципитатов, проводимым со следующими антителами. Дорожка 1, анти-183-сыворотка против N-конца Sub-1 (остатки Ser217-Gly234). Дорожка 2, mAb 183.2, моноклональное антитело против N-конца Sub-1 (остатки Ser217-Gly234). Дорожка 3, mAb 179, моноклональное антитело против С-конца Sub-1 (большой субъединицы каспазы-8, остатки Cys360-Asp374). Небольшой (5,6 кДа) фрагмент каспазы-8, продуцируемый в соответствии с новым режимом процессинга, обусловленного mAb 179, отмечен стрелкой. Фиг. 6 показывает каспазу-8 и связанный каспазой-8 полипептид (p72/Cari), которые иммунопреципитировались mAb179 из лизатов клеток BJAB до и после одночасовой стимуляции Fas-лигандом и элюировались пептидом 179. Иммунопреципитированную каспазу-8 и связанные полипептиды с mAb 179-7 009956 элюировали (как на фиг. 3b), разделяли электрофорезом в SDS-ПААГ и окрашивали серебром. Дорожки 1 и 2 показывают контроли, в которых клеточные лизаты иммунопреципитировали MIgG1 (мышиным иммуноглобулином IgG1). Фиг. 7 показывает схематическое представление мотивов полипептида р 72 (Cari). Один мотив скрученной спирали (С) и два тандемно расположенных "мотива SURP" (S) расположены вблизи N-конца этого полипептида, и один мотив "G-участок" локализован на С-конце полипептида (G-мотив). Указан также остаток аспарагиновой кислоты D600 внутри G-мотива. D600- является мутантом, в котором остаток D600 в полипептиде заменен остатком глутаминовой кислоты. Фиг. 8 показывает схематическое представление подхода, используемого для получения полноразмерной кДНК р 72 (Cari). EST-клон IMAGE 2964545, купленный из Incyte Genomics, в котором отсутствует последовательность первых 21 нуклеотида (кодирующих первые 7 аминокислот), использовали в качестве матрицы для первой полимеразной цепной реакции (ПЦР) вместе с парой праймеров: прямым праймером, Р 2, содержащим перекрывающиеся нуклеиновые кислоты с клоном 5' EST и дополнительные 15 нуклеотидов из 21 отсутствующего нуклеотида, и обратным праймером, Р 3, содержащим перекрывающиеся последовательности с 3' EST. Полученный продукт ПЦР использовали в качестве матрицы для второй ПЦР вместе с парой праймеров: прямым праймером, Р 1, содержащим весь 21 отсутствующий нуклеотид и 5 нуклеиновых кислот EST, и обратный праймер, Р 3, содержащий перекрывающиеся последовательности с 3' EST. Фиг. 9 показывает коиммунопреципитацию каспазы-8 и р 72 (Cari) посредством mAb 179 из лизатов клеток BJAB в нулевой временной точке и после 20 мин стимуляции Fas-лигандом. Полипептиды, элюированные после иммунопреципитации mAb 179, разделяли электрофорезом в SDS-ПААГ и детектировали окрашиванием серебром. Полосу с предположительной молекулярной массой приблизительно 72,5 кДа,соответствующую р 72 (Cari), копреципитировали с прокаспазой-8 перед стимуляцией Fas-лигандом (дорожка 3). После 20 мин стимуляции уровень полосы 72,5 кДа уменьшается и детектируется новая полоса,соответствующая полипептиду более низкой молекулярной массы приблизительно 68 кДа (дорожка 4). Дорожки 1 и 2 показывают отрицательные контроли, содержащие иммунопреципитацию клеточных лизатов мышиным IgG1 (MIgG1). Фиг. 10 показывает расщепление Cari активной каспазой-8. Полипептид, кодируемый кДНК р 72(Cari), экспрессировали in vitro в лизатах ретикулоцитов в присутствии 35S-метионина с использованием сопряженной системы TnT T7 лизата ретикулоцитов и испытывали после инкубации в течение 1 ч при 37 С в присутствии или в отсутствие рекомбинантной активной каспазы-8. Кроме того, расщепление Cari исследовали с продуктами TnT, кодируемыми 2 различными мутантами кДНК р 72: одним, кодирующимCari, в котором остаток D600, который считают предполагаемым остатком-мишенью для каспазы-8, мутирован в Е [р 72 (D600E)], и другим, в котором этот ген делетирован, и полученный укороченный полипептид не имеет остатков ниже по ходу транскрипции [р 72 D600 (1-600)]. Полученные полипептиды разделяли электрофорезом на SDS-ПААГ и результаты выявляли фосфовизуализацией. Фиг. 11 показывает каспазу-8 и р 72 (Cari), которые коиммунопреципитировали при помощи mAb 179 из лизатов клеток BJAB до (0') или после 5, 10, 20, 40 и 60 мин стимуляции Fas-лигандом. Пептиды элюировали, разделяли электрофорезом в SDS-ПААГ и детектировали окрашиванием серебром. Пептид с предположительной молекулярной массой 72,5 кДа детектировали перед стимуляцией (0'). После 5 и 10 мин стимуляции появляется новый полипептид с более низкой предположительной молекулярной массой 68 кДа. После 40 мин стимуляции полоса 72,5 кДа полностью исчезает и детектируется только 68 кДа. При 60 мин ни один из вышеупомянутых полипептидов не копреципитировался с каспазой-8. Фиг. 12 а показывает действие р 72 (Cari) на апоптозную гибель клеток, индуцируемую посредствомTNF-рецепторного пути передачи сигнала. кДНК р 72 (Cari) (p72) или антисмысловую кДНК p72 (a/s) встраивали в экспрессирующий вектор pcDNA 3.1 и котрансфицировали с TNF-рецептором р 55, встроенным в вектор pcDNA 3.1, и с зеленым флуоресцентным белком (GFP), экспрессируемым из вектораpEGFPC1, в клетках HEK 293, конститутивно экспрессирующих Т-антиген (в качестве отрицательного контроля использовали вектор без вставки кДНК р 72 (pc. Спустя 24 ч трансфицированные клетки исследовали под флуоресцентным микроскопом и гибель клеток оценивали определением количества клеток, обнаруживающих апоптотическую морфологию, из общей популяции флуоресцентных клеток. Фиг. 12b показывает индукцию гибели клеток вследствие сверхэкспрессии р 72 (Cari) в комбинации со стимуляцией Fas-лигандом. Действие сверхэкспрессии Cari на опосредованную Fas-лигандом гибель клеток наблюдали в клетках HEK 293, конститутивно экспрессирующих Т-антиген. В этом эксперименте клетки котрансфицировали вектором pcDNA3.1 (контрольная группа) или pcDNA3.1, кодирующим Cari,или его антисмысловую последовательность (pc, р 72 или р 72 a/s, соответственно), и вектором pSBC-2,кодирующим секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP). Спустя 24 ч трансфицированные клетки индуцировали Fas-лигандом в течение 16 ч и среду для выращивания заменяли свежей средой для выращивания. Гибель клеток измеряли определением количества SEAP, секретируемого в среду для выращивания, во время следующих 24 ч. Фиг. 13 показывает выравнивание между последовательностью полипептида, полученной в сообщении ТНС (ТНС 510568 SEQ ID NO: 1), содержащей консенсус всех EST, и полипептидом, предсказан-8 009956 ным на основе полученной полноразмерной кДНК (SEQ ID NO: 3). Фиг. 14 показывает кинетику регуляции гибели клеток нерасщепляемым мутантом Cari p72 D600E. Выживание клеток BJAB подвергали мониторингу после применения Fas-лиганда в контрольных клетках(В 1), клетках, конститутивно экспрессирующих трансфицированный р 72 (В 2), и клетках, конститутивно экспрессирующих трансфицированный р 72 D600E (В 3). Фиг. 15 показывает минимальную аминокислотную последовательность полипептида Cari, ответственную за связывание каспазы-8. Идентификацию минимального полипептида в Cari, который является ответственным за связывание с прокаспазой-8, выполняли с использованием детального делеционного исследования и копреципитации с прокаспазой-8. Фиг. 16 показывает ингибирование апоптоза посредством экспрессии антисмысловой молекулыCari, pSuper-Cari. Апоптоз клеток индуцировали сверхэкспрессией каспазы-8 (Mach a1) или химеры внеклеточной части TNF R1 р 55, слитой с трансмембранной и внутриклеточной частью Fas-рецептора (CI) несколькими независимыми трансфекциями, проводимыми с векторами, кодирующими указанные полипептиды, и ингибирование посредством антисмысловой молекулы Cari оценивали котрансфекцией сpSuper-Cari (столбцы, заполненные горизонтальными линиями) или с pSuper-вектором (контроль, столбцы, заполненные вертикальными линиями). Подробное описание изобретения Данное изобретение относится к внутриклеточному связывающему каспазу полипептиду р 72 (илиCari) или его изоформе, мутеину, аллельному варианту или фрагменту. С одной стороны, Cari связывается с прокаспазой-8 и усиливает превращение прокаспазы-8 в активную каспазу-8, с другой стороны, активная каспаза-8 расщепляет Cari и, следовательно, активностьCari отрицательно регулируется активной каспазой-8.Cari может связываться, кроме связывания с прокаспазой-8, с другой каспазой или ее мутеином или фрагментом и также влиять на активность такой каспазы. Кроме того, изобретение относится к фрагменту Cari или к мутеину, имеющему доминантно-отрицательное действие на активность эндогенного полипептида Cari, и к полипептиду Cari или его мутеину или фрагменту, способным усиливать цитотоксическое действие каспазы, предпочтительно каспазы-8. Например, получили нерасщепляемый мутантный полипептид Cari (Cari D600E), в котором аспарагиновая кислота 600 заменена глутаминовой кислотой. Этот полипептид индуцирует более высокую цитотоксичность, чем вариант дикого типа. Были также получены небольшие пептиды, производные CariCari, который, как было показано, является ответственным за связывание каспазы-8. Такие пептиды могут ингибировать связывание Cari с прокаспазой-8 и, следовательно, ингибировать цитотоксическое действие каспазы-8. Для идентификации связанных с каспазой полипептидов (например, Cari) клетки могут быть лизированы до или после стимуляции лигандом (например, Fas-лигандом) и подвергнуты иммунопреципитации подходящим специфическим в отношении каспазы антителом. Подходящее моноклональное антитело для иммунопреципитации получали против пептида из Сконцевого домена каспазы-8 Sub-1. Это антитело способно иммунопреципитировать прокаспазу-8 вместе с каспаза-8-связанным белком (например, Cari), и как каспаза-8, так и каспазасвязанный белок могут эффективно элюироваться из иммунного комплекса и восстанавливаться в супернатанте посредством конкуренции с пептидом, полученным из каспазы, который первоначально использовали для образования указанных антител. Таким образом, каспазасвязанные полипептиды могут быть коиммунопреципитированы в соответствии с данным изобретением такими каспазаспецифическими подходящими антителами из проб, выбранных из клеточных лизатов покоящихся или стимулированных клеток, из экспрессионных кДНК-библиотек и из геномных или комбинированных пептидных библиотек. Стимуляция клеток может осуществляться лимфокинами, например Fas-лигандом, TNF, факторами окружающей среды, такими как голодание, тепловой шок и т.д. Могут быть созданы антитела против каспазасвязанных белков (например, Cari), обнаруженных в соответствии с данным изобретением. Антитела, специфические для Cari, в том числе их фрагменты, могут быть использованы также для количественного или качественного детектирования Cari в пробе или для детектирования присутствия клеток, экспрессирующих Cari. Это может выполняться иммунофлуоресцентными способами, использующими флуоресцентно меченное антитело (см. ниже), в сочетании со световым микроскопом, проточной цитометрией или флуорометрическим детектированием. Получение поликлональных антител против полипептидов описано в главе 2 Current Protocols inImmunology, Wiley and Sons Inc. Получение антител против пептидов может потребовать некоторых изменений в протоколе вследствие обычно более низкой антигенности пептидов в сравнении с полипептидами. Получение поликлональных антител против пептидов описано в вышеупомянутых Current Protocolsin Immunology, chapter 9. Антитела, полученные против Cari, могут быть использованы для изменения активности белка внутри клетки, например селективным нацеливанием Cari на клетки, включающим трансдукцию клеток-9 009956 внутриклеточно экспрессируемым антителом, или интрателом, против Cari. Получение интрател описано в WO 9914353. Моноклональные антитела могут быть получены из В-клеток, взятых из селезенки или лимфатических узлов иммунизированных животных, в частности крыс или мышей, слиянием иммортализованных В-клеток в условиях, которые благоприятствуют росту гибридных клеток. Для слияния мышиных В-клеток предпочтительной является клеточная линия Ag-8. Способ получения моноклональных антител описан во многих статьях и справочниках, таких какCurrent Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc. chapter 2. Глава 9 в этой ссылке описывает иммунизацию животных пептидами. Клетки селезенки или лимфатических узлов этих животных могут быть использованы таким же образом, что и клетки селезенки и лимфатических узлов иммунизированных полипептидом животных, для получения моноклональных антител, как описано в главе 2 в этой ссылке. Способы, используемые для получения моноклональных антител, дополнительно описаны в Kohlerand Milstein (1975) и в патенте США 4376110. Получение антител из банка генов антител человека, гипервариабельные области которых заменены почти случайными последовательностями, описано в патенте США 5840479. Такие антитела являются предпочтительными, если трудно иммунизировать животное конкретным пептидом или полипептидом. Некоторые структуры являются слабоиммуногенными и могут оставаться такими, несмотря на добавление адъювантов и связывание с другими полипептидами в слитых конструкциях. Антитела, описанные вUSP 5840479, являются также предпочтительными, если желательно использовать антитела со структурой, сходной с антителами человека, например, когда желательными являются антитела, которые имеют низкую иммуногенность у человека. После идентификации подходящего антитела может быть желательным изменение его свойств. Например, химерное антитело может достигать более высоких выходов при получении. Химерные антитела, в которых константные области заменены константными областями человеческих антител, могут быть также желательными, когда требуется, чтобы это антитело имело низкую иммуногенность у людей. Получение химерных антител описано в ряде публикаций, таких как Cabilly et al., 1984; Morrison et al.,1984; Boulianne et al., 1984; EP 125023, EP 171496, EP 173494, EP 184187, WO 86/01533, WO 87/02671 и"Полностью гуманизированные антитела" являются молекулами, содержащими как вариабельную,так и константную область человеческого иммуноглобулина. Полностью гуманизированные антитела могут потенциально использоваться для терапевтического применения, когда периодическое введение требуется при хронических и рецидивирующихся заболеваниях, таких как аутоиммунные заболевания. Один способ получения полностью человеческих антител заключается в "гуманизации" мышиной гуморальной иммунной системы, т.е. получении мышиных штаммов, способных продуцировать человеческийIg (ксеномышей), введением локусов человеческого иммуноглобулина (Ig) мышам, у которых были инактивированы эндогенные гены Ig. Эти локусы Ig являются чрезвычайно сложными в смысле их физической структуры и реаранжировки генов и процессов экспрессии, требуемых для получения в конечном счете обширной иммунной реакции. Разнообразие антител главным образом возникает в результате комбинаторной реаранжировки между различными генами V, D и J, присутствующими в локусах Ig. Эти локусы содержат также рассеянные в них регуляторные элементы, которые управляют экспрессией антител, аллельным исключением, переключением классов и созреванием аффинности. Введение нереаранжированных трансгенов Ig человека в мышей показало, что аппарат рекомбинации мыши является совместимым с генами человека. Кроме того, гибридомы, секретирующие антигенспецифические hu-mAb различных изотипов, могут быть получены иммунизацией ксеномышей антигеном. Полностью гуманизированные антитела и способы их получения известны в данной областиTomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727 (2000), патент WO 98/24893). Другим типом антитела является антиидиотипическое антитело. Антиидиотипическое (анти-Id) антитело является антителом, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Id-антитело может быть получено иммунизацией животного того же самого вида и генетического типа (например, мышиного штамма), что и источник mAb, для которых получают анти-Id. Иммунизированное животное будет распознавать и отвечать на идиотипические детерминатны иммунизирующего антитела продуцированием антитела к указанным идиотипическим детерминатам (анти-Id-антитела). См., например, патент США 4699880, который включен в данное описание в качестве ссылки в его полном виде. Анти-Id-антитело может быть также использовано в качестве "иммуногена" для индукции иммунной реакции еще и у другого животного с получением так называемого анти-анти-Id-антитела. Это антианти-Id может быть эпитопно идентичным исходному mAb, которое индуцировало анти-Id. Таким образом, с использованием антител к идиотипическим детерминантам mAb можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности. Термин "антитело" обозначает как интактные молекулы, так и их фрагменты, такие как, например,Fab и F(ab')2, которые способны связывать антиген. У фрагментов Fab и F(ab')2 отсутствует Fc-фрагмент- 10009956 интактного антитела, они выводятся более быстро из кровотока и могут иметь меньшее неспецифическое связывание в тканях, чем интактное антитело (Wahl et al., 1983). Понятно, что Fab, и F(ab')2, и другие фрагменты антител, применимые в данном изобретении, могут быть использованы для детектирования и количественного определения Cari в соответствии с описанными здесь способами для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают протеолитическим расщеплением с использованием таких ферментов, как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2-фрагментов). Говорят, что антитело "способно связывать" молекулу, если оно способно специфически взаимодействовать с молекулой, связывая в результате этого молекулу с антителом. Термин "эпитоп" относится к части любой молекулы, способной быть связываемой антителом, которая может также распознаваться таким антителом. Эпитопы или "антигенные детерминанты" обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Антитела (или их фрагменты), применимые в данном изобретении, могут использоваться гистологически, например, в иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии, для детектированияCari in situ. Детектирование in situ может выполняться взятием гистологического образца у пациента и внесением меченого антитела данного изобретения в такой образец. Антитело (или фрагмент) предпочтительно вносят нанесением или наслаиванием меченого антитела (или фрагмента) на биологическую пробу. Посредством такого способа можно определять не только присутствие полипептида Cari, но также его распределение на исследуемой ткани. С использованием данного изобретения специалисты в данной области легко поймут, что любой из большого разнообразия гистологических способов (например,процедур окрашивания) может быть модифицирован для достижения такого детектирования in situ. Такие анализы на полипептид Cari данного изобретения обычно предусматривают инкубирование биологической пробы, такой как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые инкубировались в культуре ткани, в присутствии детектируемо меченного антитела, способного идентифицировать полипептид Cari, и детектирование этого антитела любым из ряда способов, хорошо известных в данной области."Биологическая жидкость" или биологическая проба означает любую жидкость, полученную из клеток, клеточных компонентов или клеточных продуктов или содержащую клетки, клеточные компоненты или клеточные продукты. Биологические жидкости включают в себя, но не ограничиваются ими,супернатанты культур клеток, клеточные лизаты, осветленные клеточные лизаты, клеточные экстракты,тканевые экстракты, кровь, плазму, сыворотку, молоко и их фракции. Биологическая проба может быть обработана с использованием твердофазной подложки или твердофазного носителя, такого как нитроцеллюлоза, или другой твердой подложки или твердого носителя,которые способны иммобилизовать клетки, частицы клеток или растворимые полипептиды. Затем подложка или носитель могут быть промыты подходящими буферами с последующей обработкой детектируемым меченым антителом в соответствии с данным изобретением, как отмечалось выше. Затем твердофазная подложка или носитель могут быть промыты буфером второй раз для удаления несвязанного антитела. Количество связанной метки на указанной твердой подложке или твердом носителе могут затем детектироваться общепринятыми способами. Термины "твердофазная подложка", "твердофазный носитель", "твердая подложка", "твердый носитель", "подложка" или "носитель" обозначают любую подложку или любой носитель, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол,полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы,полиакриламиды, габбро и магнетит. Природа носителя может быть либо растворимой до некоторой степени, либо нерастворимой для целей данного изобретения. Подложка может иметь фактически любую возможную структурную конфигурацию, при условии, что связанная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Таким образом, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, например в виде гранулы, цилиндрической, например в виде внутренней поверхности пробирки или наружной поверхности стержня. Альтернативно, эта поверхность может быть плоской, как лист,тест-полоска и т.д. Предпочтительные подложки или носители включают в себя полистироловые шарики. Специалистам в данной области будут известны другие подходящие носители для связывания антитела или антигена, или они смогут определить их с использованием рутинного экспериментирования. Связывающая активность конкретной партии антитела данного изобретения, как отмечалось выше,может быть определена в соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в данной области смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого определения при помощи рутинного экспериментирования. Другие стадии, такие как промывание, перемешивание, встряхивание, фильтрование и т.п., могут быть добавлены к анализам, как это принято или необходимо для конкретной ситуации. Одним из способов, в котором антитело согласно данному изобретению может быть детектируемо мечено, является связывание его с ферментом и использование в иммуноферментном анализе (EIA). Этот фермент, в свою очередь, при последующем экспонировании с подходящим субстратом, будет взаимо- 11009956 действовать с субстратом таким образом, что образуется химический компонент, который может быть детектирован, например, спектрофотометрическим, флуорометрическим или визуальным способами. Ферменты, которые могут быть использованы для детектируемого мечения антитела, включают, но не ограничиваются ими, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу,дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфа-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Детектирование может выполняться колориметическими способами, которые используют хромогенный субстрат для фермента. Детектирование может также выполняться визуальным сравнением степени ферментативной реакции субстрата в сравнении с таким же образом приготовленными стандартами. Детектирование может выполняться с использованием любого из различных других иммуноанализов. Например, радиоактивное мечение антител или фрагментов антител можно детектировать R-РТРазой посредством применения радиоиммуноанализа (RIA). Хорошее описание RIA может быть найдено вCompany, NY (1978) с особой ссылкой на главу под названием "An Introduction to Radioimmune Assay andRelated Techniques" by Chard, Т., включенной в данное описание в качестве ссылки. Радиоактивный изотоп может детектироваться такими способами, как применение g-счетчика или сцинтилляционного счетчика или радиоавтография. Антитело согласно данному изобретению может быть также помечено флуоресцентным соединением. Затем при действии на флуоресцентно меченное антитело светом подходящей длины волны его присутствие может быть детектировано вследствие флуоресценции. Наиболее часто используемыми флуоресцентно метящими соединениями являются флуоресцеинизотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, альдегид о-фталевой кислоты и флуорескамин. Антитело может быть также детектируемо мечено с использованием испускающих флуоресценцию металлов, таких как 153 Е, или других из ряда лантанидов. Указанные металлы могут быть присоединены к антителу с использованием таких хелатирующих металлы групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА). Антитело может быть детектируемо мечено связыванием с хемилюминесцентным соединением. Затем присутствие хемилюминесцентно меченного антитела определяют детектированием присутствия люминесценции, которая возникает в ходе химической реакции. Примерами особенно применимых хемилюминесцентно метящих соединений являются люминол, изолюминол, сложный ароматический эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и оксалатный эфир. Подобным образом, биолюминесцентное соединение может быть использовано для мечения антитела данного изобретения. Биолюминесценция является типом хемилюминесценции, обнаруженной в биологических системах, в которых каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют детектированием присутствия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями для целей мечения являются люциферин, люцифераза и экворин. Молекула антитела данного изобретения может быть адаптирована для использования в иммунометрическом анализе, также известном как "двухсайтный" или "сэндвич"-анализ. В обычном иммунометрическом анализе количество немеченого антитела (или фрагмента антитела) связывают с твердой подложкой или с носителем и количество детектируемо меченного растворимого антитела добавляют для обеспечения возможности детектирования и/или количественного определения тройного комплекса,образованного между твердофазным антителом, антигеном и меченым антителом. Обычно и предпочтительно иммунометрические анализы включают "прямые" анализы, в которых антитело, связанное с твердой фазой, сначала контактирует с испытуемой пробой для экстракции антигена из этой пробы образованием бинарного твердофазного комплекса антитело-антиген. После подходящего периода инкубации твердую подложку или твердый носитель промывают для удаления остатка жидкой пробы, в том числе непрореагировавшего антигена, если он имеется, и затем контактируют с раствором, содержащим неизвестное количество меченого антитела (которое функционирует как "репортерная молекула"). После второго периода инкубации для обеспечения возможности образования комплекса меченого антитела с антигеном, связанным с твердой подложкой или с твердым носителем через немеченое антитело, твердую подложку или твердый носитель промывают второй раз для удаления непрореагировавшего меченого антитела. В другом типе "сэндвич"-анализа, который может быть применим с антигенами данного изобретения, используют так называемые "одновременные" и "обратные" анализы. Одновременный анализ включает единственную стадию инкубации, когда антитело, связанное с твердой подложкой или с твердым носителем, и меченое антитело добавляют к испытуемой пробе одновременно. После завершения инкубации твердую подложку или твердый носитель промывают для удаления остатка жидкой пробы и не вошедшего в комплекс меченого антитела. Затем присутствие меченого антитела, связанного с твердой подложкой или с твердым носителем, определяют, как и в обычном "прямом" сэндвич-анализе .- 12009956 В "обратном" анализе используют ступенчатое добавление сначала раствора меченого антитела к жидкой пробе с последующим добавлением немеченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, после подходящего периода инкубации. После второй инкубации твердую фазу промывают обычным образом для освобождения ее от остатка испытуемой пробы и раствора непрореагировавшего меченого антитела. Затем определение меченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, осуществляют, как в "одновременном" и "прямом" анализах. Создание иммуноанализов, таких как RIA или ELISA, было описано во многих статьях, руководствах и других публикациях. Делается ссылка на WO 97/03998, со стр. 48, строка 4 по стр. 52, строка 27. Иммуноанализы согласно изобретению могут быть двух типов: во-первых, иммуноанализы с использованием иммобилизованного полипептида Cari или эквивалентного пептида могут быть использованы для количественного определения Cari. Во-вторых, для количественного определения полипептидов Cari могут быть использованы иммуноанализы с использованием иммобилизованных антител против эпитопа полипептида Cari. Такие анализы могут найти применение в диагностике, так как оценка уровня Cari и других полипептидов, участвующих в путях апоптоза, может быть необходимой при ряде нарушений или синдромов,когда существует возможность участия таких путей. Термины белок и полипептид в данном описании являются взаимозаменяемыми. Было обнаружено, что полипептид данного изобретения - полипептид 72 кДа - специфически связывает прокаспазу-8. Затем полипептид анализировали дополнительно частичным секвенированием и анализом масс-спектра. Затем полученную таким образом последовательность вводили в программу поиска базы данных и при помощи компьютерного поиска были идентифицированы перекрывающиеся последовательности и EST. Используемые программы хорошо известны специалистам в данной области и содержат, например, пакет программ GCG (генетической компьютерной группы). Предпочтительно используют программу поиска, такую как Basic Local Alignment Search Tool (ELAST), доступную из сервера EMBL (например, http://dove.embl-heidelberg.de/Blast2/). Команда Blastn может быть использована для поиска нуклеотидных последовательностей, которые являются перекрывающимися или сходными с идентифицированным клоном. Альтернативно или наряду с вышеупомянутыми способами поиска в базах данных, библиотека, например геномная библиотека или кДНК-библиотека, может быть подвергнута скринингу для идентификации полных клонов. Такие способы скрининга описаны в вышеупомянутых руководствах Sambrook etal. и Ausubel et al. Альтернативно или в дополнение, могут быть использованы способы клонирования на основе ПЦР, такие как быстрая амплификация концов кДНК (5'- и 3'-RACE, Graham et al., 1991 и приведенные ими ссылки). В данном варианте обнаруженную EST-последовательность подвергали поиску в TIGR Human geneindex и получали сообщение ТНС. Был получен консенсус всех EST, которые соответствуют этим последовательностям, THC510568 (SEQ ID NO: 1). Эта консенсусная последовательность не имела нуклеотидов, кодирующих первый метионин и следующие 6 аминокислот Cari, как было оценено из мышинойEST, которая проявляет высокое сходство с человеческой EST (идентичность приблизительно 90%). Первый метионин и последующие 6 аминокислот соответствующего мышиного белка, которые не отсутствовали в мышиных EST, сравнивали с рабочими последовательностями генома человека для дополнения отсутствующей последовательности человека. Получали совпадение, соответствующее последовательности клона LLNLR-232E12 хромосомы 19 Homo sapiens. Этот клон подтверждал отсутствующие 7 аминокислот р 72. Полноразмерную кДНК белка р 72 получали при помощи ПЦР, схематически представленной на фиг. 8. Полноразмерную ДНК, кодирующую р 72, выделяли, секвенировали (SEQ ID NO: 2) и выводили аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 3). Было обнаружено, что полипептид р 72 содержит три консервативных мотива (фиг. 7): мотив С,спиральный мотив, два расположенных тандемно 'SURP' (также называемых мотивами 'SWAP', обозначенных как S на фиг. 7) (Denhez, F. and Lafyatis, R., 1994) вблизи N-конца полипептида и один расположенный на С-конце 'G-участок' (обозначенный как G на фиг. 7) (Aravind, L. and Koonin, E.V., 1999). Считают, что как мотив SURP, так и мотив G-участок способствуют связыванию РНК, что позволяет предполагать, что мишенью р 72 может быть молекула РНК. Таким образом р 72 был переименован в Cari (Кари) (название образовано как аббревиатура каспаза-8-ассоциированный полипептид с РНКсвязывающими мотивами). Таким образом, термины Cari и р 72 являются в данном описании взаимозаменяемыми. Полоса, соответствующая полному полипептиду Cari, исчезает после стимуляции клеток, и вместо нее появляется новый полипептид меньшей молекулярной массы. Возможность того, что Cari может расщепляться активированной каспазой-8, исследовали анализом in vitro, включающим в себя инкубирование рекомбинантно полученной каспазы-8 и меченого полипептида Cari. Cari может быть получен введением его кодирующей последовательности в экспрессирующий вектор, содержащий сильный промотор, и трансфекцией в клетку млекопитающего. Альтернативно, Cari может быть получен in vitro с использованием системы трансляции in vitro. Способ трансляции in vitro хорошо известен специалистам в данной области, и реагенты и подробные- 13009956 протоколы для этого способа являются доступными, например, из Stratagene, La Jolla, USA. В данном варианте Cari метили с использованием радиоактивного изотопа. Предпочтительно при использовании изотопного мечения тестируемый полипептид экспрессируют in vitro и меченную изотопом аминокислоту, предпочтительно меченную изотопом 35S, вместе с немеченой аминокислотой добавляют во время реакции трансляции in vitro. Кроме того, предпочтительно, чтобы меченая аминокислота была 35S-метионином, а отношение между меченой и немеченой аминокислотами было равно от 1:1 до приблизительно 1:1000. Затем меченный радиоактивным изотопом полипептид Cari и рекомбинантно полученный фермент каспазу-8 объединяли в подходящем буфере и выдерживали в течение периода времени, достаточного для осуществления расщепления. Предпочтительный буфер и другие предпочтительные параметры анализа описаны в публикации Boldin et al., 1996. Предпочтительный период зремени составляет обычно от 10 мин до несколько часов, предпочтительно от 30 мин до 1 ч. После обеспечения времени для осуществления расщепления реакционную смесь разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле. Гель сушили и изотоп детектировали с использованием фотографической пленки или фосфовизуализации. Испытуемый полипептид может быть помечен и может детектироваться также с использованием специфических для метки антител в Вестерн-блоте. Появление дополнительных низкомолекулярных полос в реакциях, в которых добавляют каспазу-8,в сравнении с контрольными реакциями без каспазы-8 указывает на расщепление Cari каспазой-8. Рассчитанный размер полосы с более низкой молекулярной массой, детектируемой после расщепления, дает указание на приблизительное местоположение сайта расщепления. Проводили исследования с использованием мутационного анализа для нахождения точного остатка-мишени в Cari. Было обнаружено, что D-600 является мишенью расщепления, так как мутант Cari,имеющий мутацию в остатке 600 DЕ, не расщепляется каспазой-8 (р 72/мутант D600E Cari). Данное изобретение относится также к ДНК-последовательности, кодирующей Cari. Кроме того,данное изобретение относится также к ДНК-последовательностям, кодирующим биологически активные изоформу, мутеин, аллельный вариант, фрагмент или слитый белок Cari. Получение таких мутеинов и фрагментов и производных является стандартной процедурой (см., например, Sambrook et al., 1989), в которой в ДНК-последовательностях, кодирующих Cari, один или более кодонов могут быть делетированы, добавлены или заменены другими с образованием мутеинов, имеющих изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка относительно природного полипептида, за исключением мутеина,имеющего глицин в аминокислотном остатке 230 вместо глутаминовой кислоты, как в полипептидеDF51823 в WO 9830582. ДНК-последовательности данного изобретения кодируют Cari, изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеины или производное, ДНК-последовательности, способные гибридизоваться с кДНК-последовательностью, произведенной из кодирующей области нативного полипептида Cari, при проведении такой гибридизации в условиях умеренной жесткости, причем эти гибридизуемые ДНК-последовательности кодируют биологически активный полипептид Cari. Таким образом, гибридизуемые ДНК-последовательности содержат ДНК-последовательности, которые имеют относительно высокое сходство с кДНК-последовательностью нативного Cari и как таковые представляют Cari-подобные последовательности, которые могут быть, например, природно полученными последовательностями, кодирующими различные изоформы Cari, или последовательностями природного происхождения, кодирующими полипептиды, принадлежащие к группе Cari-подобных последовательностей, кодирующих полипептид,имеющий активность Cari. Далее, указанные последовательности могут также включать в себя, например, не встречающиеся в природе, полученные синтетически последовательности, которые имеют сходство с кДНК-последовательностью природного Cari, но содержат ряд желаемых модификаций. Такие синтетические последовательности включают все возможные последовательности, кодирующие мутеины, фрагменты и производные Cari, все из которых имеют активность Cari. В применении в данном описании, условия жесткости являются функцией температуры, используемой в гибридизационном эксперименте, молярности одновалентных катионов и процента формамида в гибридизационном растворе. Для определения степени жесткости, присутствующей в любом конкретном наборе условий, сначала используют уравнение Meinkoth et al. (1984) для определения стабильности гибридов 100% идентичности, выражаемой в виде температуры плавления Tm гибрида ДНК-ДНК:Tm=81,5 С+16,6 (LogM)+0,41 (% GC)-0,61 (% форм.)-500/L где M означает молярность одновалентных катионов, % GC означает процент нуклеотидов G и С в ДНК,% форм. означает процент формамида в гибридизационном растворе и L означает длину гибрида в парах оснований (п.н.). Для каждого 1 С, на который Tm уменьшается от рассчитанной Tm для гибрида со 100% идентичностью, количество допускаемого ошибочного спаривания увеличивается приблизительно на 1%. Таким образом, если Tm, используемая для любого конкретного гибридизационного эксперимента при указанных концентрациях соли и формамида, на 10 С ниже Tm, рассчитанной для 100% гибрида по уравнению Meinkoth, гибридизация будет происходить даже в том случае, когда имеется приблизительно 10% ошибочное спаривание."Умеренно жесткие условия" являются условиями, которые обеспечивают Tm, которая не более чем- 14009956 на 20 С ниже Tm, которая существовала бы в случае точно спаренного дуплекса с последовательностьюмишенью, либо рассчитанной по приведенной выше формуле, либо фактически измеренной. Без ограничения, для умеренно жестких (на 15-20 С ниже рассчитанной или измеренной Tm гибрида) условий используют промывочный раствор 2SSC (стандартный раствор цитратной соли) и 0,5% SDS (додецилсульфат натрия) при подходящей температуре, более низкой, чем рассчитанная Tm гибрида. Конечная жесткость условий обусловлена, прежде всего, условиями промывки, в частности, при использовании условий гибридизации, которые позволяют образовываться менее стабильным гибридам вместе со стабильными гибридами. Затем условия промывки при более высокой жесткости удаляют менее стабильные гибриды. Обычной гибридизацией, которая может быть использована с умеренно жесткими условиями промывки, описанными выше, является гибридизация в растворе 6SSC (или 6SSPE) (стандартный фосфатно-солевой раствор ЭДТА), 5 реагент Денхардта, 0,5% SDS, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре приблизительно на 20-25 С ниже Tm. При применении смешанных зондов предпочтительно использовать тетраметиламмонийхлорид (ТМАС) вместо SDS(Ausubel, 1987, 1999). Для получения различных вышеупомянутых природно встречающихся Cari-подобных последовательностей могут быть использованы стандартные процедуры скрининга и выделения проб природных ДНК или РНК, полученных из различных тканей с использованием природной кДНК Cari или ее части в качестве зонда (см., например, стандартные процедуры, описанные в Sambrook et al., 1989). Связывающий каспазу полипептид данного изобретения мог бы быть идентифицирован описанной выше иммунопреципитацией mAb 179, специфическим в отношении С-конецевого домена Sub-1 каспазы-8. Однако в приведенном выше анализе иммунопреципитации может использоваться антитело, специфическое в отношении С-концевого домена Sub-1 из каспазы, отличающейся от каспазы-8. Данное изобретение относится также к полипептиду или белку, по существу, соответствующему Cari. Термин"по существу, соответствующий" включает в себя не только полипептид Cari, но также полипептиды или белки, которые являются его мутеинами. Они могут также включать "слитые белки", т.е. полипептиды,содержащие Cari или его мутант, слитые с другим белком и имеющие более продолжительный период полужизни в жидкостях тела. Таким образом, Cari может быть слит с другим белком, таким как, например, иммуноглобулин, высокомолекулярным полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), или т.п. Мутеины, которые, по существу, соответствуют полипептиду Cari, являются полипептидами, в которых одна или более аминокислот взаимодействующей с каспазой-8 аминокислотной последовательности белка была заменена другой аминокислотой, делетирована и/или инсертирована, за исключением мутеина, содержащего глицин в аминокислотном остатке 230 вместо глутаминовой кислоты, и при условии, что полученный полипептид проявляет, по существу, такую же или более высокую активность, что и Cari, которому он соответствует. Для того, чтобы полипептид, по существу, соответствовал Cari, изменения в последовательностиCari, например в изоформах, являются обычно относительно небольшими. Хотя число изменений может быть более чем десять, предпочтительно имеются не более чем десять изменений, более предпочтительно не более чем пять изменений и наиболее предпочтительно не более чем три таких изменения. Хотя может быть использован любой способ для нахождения потенциально биологически активных полипептидов, которые, по существу, соответствуют полипептиду Cari, одним из таких способов является применение общепринятых способов мутагенеза на ДНК, кодирующей этот полипептид, приводящих к небольшому числу модификаций. Затем полипептиды, экспрессируемые такими клонами, могут быть подвергнуты скринингу на их способность связываться с каспазой-8 и/или модулировать активность каспазы-8 в модуляции/опосредовании внутриклеточных путей, описанных выше."Консервативные" замены являются такими заменами, которые, как ожидается, не изменяют активности полипептида и обычно должны сначала быть подвергнуты скринингу, так как не должно быть ожидания, что они, по существу, изменяют размер, заряд или конфигурацию данного полипептида и,следовательно, не должны изменять его биологические свойства. Консервативные замены полипептида Cari включают мутеин, в котором по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде был консервативно заменен отличающейся аминокислотой. Такие замены предпочтительно получают в соответствии со следующим перечнем, представленным в табл. IA,причем эти замены могут быть определены рутинным экспериментированием для обеспечения структурных и функциональных свойств синтезированной молекулы полипептида при сохранении биологической активности, характерной для полипептида Cari. Альтернативно, другой группой замен Cari являются замены, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде удален, а отличающийся остаток встроен на его место в соответствии со следующей табл. IB. Типы замен, которые могут быть произведены в полипептиде, могут основываться на анализе частот аминокислотных замен между гомологичным полипептидом отличающегося вида, таких как представленные в табл. 1-2 Schulz et al., G.E., Principles of Protein Structure SpringerVerlag, New York, NY, 1798, и на фиг. 3-9 в Creighton, Т.Е., Proteins: Structure and Molecular Properties,W.H. FreemanCo., San Francisco, CA 1983. На основании такого анализа альтернативные консервативные замены определяются здесь как замены в одной из следующих пяти групп. Табл. IB 1. Небольшие алифатические, неполярные или слабо полярные остатки: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly). 2. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu, Gln. 3. Полярные положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys. 4. Большие алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val (Cys). 5. Большие ароматические остатки: Phe, Tyr, Trp. Три аминокислотных остатка в скобках выше имеют особую роль в архитектуре белков. Gly является единственным остатком, не имеющим боковой цепи, и, следовательно, придает гибкость цепи. Однако это склонно активировать образование вторичной структуры, иной, чем -спиральная структура. Pro,вследствие его необычной геометрии, прочно сжимает цепь и обычно склонен способствовать образованию подобных бета-виткам структур, хотя в некоторых случаях Cys может быть способен участвовать в образовании дисульфидных связей, что является важным в укладке (фолдинге) белков. Авторы обращают внимание на то, что Schulz et al., выше, объединяют группы 1 и 2, показанные выше. Авторы обращают внимание на то, что Tyr, вследствие его потенциала в образовании водородных связей, имеет значительное родство с Ser и Thr и т.д. Консервативные аминокислотные замены согласно данному изобретению, например, представленные выше, известны в данной области, и можно было бы ожидать, что они сохраняют биологические и структурные свойства полипептида после замены аминокислоты. Большинство делеций и замен согласно данному изобретению являются делециями и заменами, которые не приводят к радикальным изменениям в характеристиках молекулы белка или полипептида. "Характеристики" определяются, без ограничения,как определяющие как изменения во вторичной структуре, например -спираль или бета-слой, так и изменения в биологической активности, например связывании с каспазой-8 и/или опосредовании действия каспазы-8 на гибель клеток.- 16009956 Примеры получения аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для получения мутеинов взаимодействующего с каспазой-8 полипептида Cari для применения в данном изобретении, включают известные стадии способа, например, представленные в патенте США RE 33653, 4959314,4588585 и 4737462, Mark et al.; 5116943, Koths et al., 4965195, Namen et al.; 4879111, Chong et al.; и 5017691, Lee et al.; a замещенные лизином белки представлены в патенте США 4904584 (Shaw et al.). Предполагается, что, кроме консервативных замен, описанных выше, которые не будут, по существу, изменять активности полипептида Cari, любые консервативные замены или менее консервативные и более случайные изменения, которые приводят к увеличению биологической активности мутеинов полипептида Cari, входят в объем данного изобретения. Когда должно быть подтверждено точное действие замены или делеций, специалисту в данной области будет понятно, что действие замены (замен), делеций (делеций) и т.д. будет оцениваться рутинными анализами связывания и гибели клеток. Скрининг с использованием такого стандартного теста не потребует чрезмерного экспериментирования. Приемлемыми мутеинами Cari являются мутеины, которые сохраняют, по меньшей мере, способность взаимодействия с прокаспазой-8 и посредством этого регулируют активность каспазы-8 во внутриклеточных путях. В одном варианте было обнаружено, что Cari усиливает гибель клеток, опосредуемуюFas, возможно, увеличением скорости превращения прокаспазы-8 в активную каспазу-8. После образования каспазы-8 она расщепляет Cari, возможно, вызывая его инактивацию. Был получен нерасщепляемый мутеин Cari (мутант Cari D600E), и было показано, что он является более сильнодействующим, чем полипептид дикого типа, в индукции гибели клеток. Нерасщепляемые мутанты и предпочтительно мутант р 72 D600E могут быть использованы в определенных ситуациях, где может быть желательным увеличение активности каспазы-8. Могут быть получены полипептиды-мутеины, которые имеют так называемое доминантно-негативное действие, а именно полипептид, который является дефектным либо по связыванию с каспазой-8, либо по последующей передаче сигнала или другой активности после такого связывания. Мутеины могут быть использованы, например, для ингибирования цитотоксического действия каспазы-8 или для увеличения его, в зависимости от того, желательно ли увеличивать гибель клеток или выживание клеток, и в зависимости от того, какая из этих активностей является главной активностью,модулируемой взаимодействием Cari и каспазы-8 (см. выше), и это выполняется такими мутеинами посредством конкуренции с природным полипептидом Cari за связывание с каспазой-8 или взаимодействие с каспазой-8. На генетическом уровне мутеины обычно получают сайт-направленным мутагенезом нуклеотидов в ДНК, кодирующей полипептид Cari, с получением посредством этого ДНК, кодирующей мутеин, с последующим синтезом ДНК и экспрессией полипептида в культуре рекомбинантных клеток. Мутеины обычно проявляют такую же или увеличенную качественную биологическую активность, что и природно встречающийся полипептид, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications andWiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Получение Cari в соответствии с этим или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот же самый полипептид, но отличающейся от природной последовательности вследствие изменений, допускаемых известной вырожденностью генетического кода, может достигаться сайт-специфическим мутагенезом ДНК, кодирующей ранее полученные мутеины или природную версию полипептида Cari. Сайт-специфический мутагенез позволяет получать мутеины посредством применения специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют ДНК-последовательность желаемой мутации, а также достаточное число соседних нуклеотидов для обеспечения праймерной последовательности достаточного размера и достаточной сложности последовательности для образования стабильного дуплекса на обеих сторонах пересекаемого делеционного сочленения. Обычно предпочтительным является праймер из приблизительно 20-25 нуклеотидов в длину, причем изменяются приблизительно 5-10 комплементирующих нуклеотидов на каждой стороне изменяемой последовательности. Обычно способ сайт-специфического мутагенеза хорошо известен в данной области, как показано на примерах таких публикаций, как статья Adelman et al. (1983), описание которой включено здесь в качестве ссылки. Как будет понятно, способ сайт-специфического мутагенеза обычно использует фаговый вектор, который существует в одноцепочечной и двухцепочечной форме. Типичные векторы, применимые в сайтнаправленном мутагенезе, включают такие векторы, как фаг М 13, например, описанный Messing et al.,Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam(1981), описание которой включено здесь в качестве ссылки. Указанные фаги являются легко доступными коммерчески, и их применение обычно хорошо известно специалистам в данной области. Альтернативно, для получения одноцепочечной ДНК могут быть использованы плазмидные векторы, которые содержат сайт инициации репликации одноцепочечного фага (Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3, 1987). Обычно сайт-направленный мутагенез в соответствии с данным изобретением выполняют получением сначала одноцепочечного вектора, который содержит в своей последовательности ДНК-последовательность, которая кодирует релевантный полипептид. Олигонуклеотидный праймер, несущий желательную мутированную последовательность, получают синтетически при помощи автоматического син- 17009956 теза ДНК/олигонуклеотидов. Затем праймер отжигают с содержащим одноцепочечную кодирующую белок последовательность вектором и подвергают действию ДНК-полимеризующих ферментов, таких как фрагмент кленоваполимеразы I E. coli, для завершения синтеза несущей мутацию цепи. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь несут желаемую мутацию. Затем этот гетеродуплексный вектор используют для трансформации подходящих клеток, таких как клетки Е. coli JM101, и отбирают клоны, которые включают в себя рекомбинантные векторы, несущие аранжировку мутированной последовательности. После отбора такого клона мутированная последовательность Cari может быть выделена и помещена в подходящий вектор, обычно вектор-переносчик или экспрессирующий вектор типа, который может использоваться для трансфекции подходящего хозяина. Таким образом, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие Cari, могут быть обнаружены, получены и/или модифицированы in vitro, in situ и/или in vivo с использованием известных способов амплификации ДНК или РНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и химический синтез олигонуклеотидов. ПЦР делает возможной амплификацию (увеличение в количестве) специфических последовательностей ДНК при помощи повторяемых реакций ДНК-полимеразы. Эта реакция может быть использована в качестве замены клонирования; все, что для нее требуется, это знание последовательности нуклеиновой кислоты. Для проведения ПЦР конструируют праймеры, которые являются комплементарными представляющей интерес последовательности. Затем праймеры создают автоматическим ДНК-синтезом. Поскольку праймеры могут быть сконструированы для гибридизации с любой частью гена, могут быть созданы такие условия, что ошибочные спаривания в спаривании комплементарных оснований могут быть переносимыми. Амплификация этих ошибочно спаренных областей может приводить к синтезу мутагенизированного продукта, приводящему к созданию пептида с новыми свойствами (т.е. сайт-направленному мутагенезу). См. также, например, Ausubel, supra, Ch. 16. Кроме того, могут быть сконструированы праймеры ПЦР для включения новых сайтов рестрикции или других признаков, таких как терминирующие кодоны на концах амплифицируемого генного сегмента. Это помещение сайтов рестрикции на 5'- и 3'-концах амплифицированной последовательности гена позволяет получать сегменты гена, кодирующие полипептид Cari или его фрагмент, являющиеся специально сконструированными для лигирования других последовательностей и/или сайтов клонирования в векторах. ПЦР и другие способы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны в данной области и могут быть использованы в соответствии с данным изобретением без чрезмерного экспериментирования на основе описания и руководства, представленных здесь. Известные способы амплификации ДНК или РНК включают, но не ограничиваются ими, полимеразную цепную реакцию и родственные способы амплификации (см., например, U.S. patent Nos. 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, to Mullis et al.; 4795699 and 4921794 to Tabor et al.; 5142033 to Innis; 5122464 to Wilson et al.; 5091310 to Innis; 5066584 to Gyllensten etal.; 4889818 to Gelfand et al.; 4994370 to Silver et al.; 4766067 to Biswas; 4656134 to Ringold; и Innis et al.,eds., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) и РНК-опосредованную амплификацию, которая использует антисмысловую РНК относительно последовательности-мишени в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США 5130238, Malek et al., с товарным названием NASBA); и иммуно-ПЦР, которая комбинирует применение амплификации ДНК с мечением антителом (Ruzicka etal. (1993); Sano et al. (1992; Sano et al. (1991), полные содержания которых включены в данное описание в качестве ссылки. Аналогичным образом, биологически активные фрагменты Cari (например, фрагменты любых полипептидов Cari или его изоформ) могут быть получены, как описано выше в отношении мутеинов Cari. Подходящими фрагментами Cari являются фрагменты, которые сохраняют способность белка к связыванию прокаспазы-8 и которые опосредуют биологическую активность Cari или других белков, ассоциированных с каспазой-8, прямо или опосредованно. Альтернативно, подходящими фрагментами Cari являются фрагменты, которые сохраняют способность белка к связыванию прокаспазы-8 и которые могут ингибировать биологическую активность Cari или других белков, ассоциированных с каспазой-8, прямо или опосредованно. Таким образом, могут быть получены фрагменты Cari, которые имеют доминантнонегативное или доминантно-позитивное действие, как это отмечалось выше в отношении мутеинов. Следует отметить, что эти фрагменты представляют особый класс мутеинов согласно изобретению, а именно они являются определенными частями Cari, производными полной последовательности Cari (например,части любого белка Cari или его изоформы), причем каждая такая часть или каждый фрагмент имеет любую из вышеупомянутых желаемых активностей. Такой фрагмент может быть, например, пептидом. Подобным образом могут быть получены производные посредством стандартных модификаций боковых групп одного или более аминокислотных остатков полипептида Cari, его мутеинов или фрагментов или посредством конъюгации полипептида Cari, его мутеинов или фрагментов с другой молекулой,например антителом, ферментом, рецептором и т.д., которые хорошо известны в данной области. Таким образом, термин "производные" в применении в данном описании охватывает производные, которые могут быть получены из функциональных групп, встречающихся в качестве боковых цепей на остатках,или N- или С-концевых групп с использованием способов, известных в данной области, и они включены- 18009956 в данное изобретение. Производные могут иметь химические части молекул, такие как углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция имеет ту же самую или более высокую биологическую активность в сравнении с полипептидом Cari. Например, производные могут включать алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные реакцией с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Nацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными радикалами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами), или O-ацилпроизводные свободной гидроксильной группы (например, гидроксильной группы остатков серила или треонила),образованные с ацильными радикалами. Термин "производные" включает в себя только те производные, которые не изменяют одну аминокислоту на другую из 20 обычно встречающихся природных аминокислот. Как описано выше, анализы расщепления могут быть использованы для определения того, расщепляются ли полипептид Cari и мутеины каспазой-8. В варианте данного изобретения сайт расщепления (D600) дополнительно определяют получением делеционных мутантов или точковых мутаций Cari и испытанием каждого делеционного или точкового мутанта на их чувствительность к расщеплению каспазой-8, как описано выше. Делеционные мутанты могут быть сконструированы при помощи ПЦР-клонирования желаемых фрагментов испытуемого полипептида с использованием ДНК-последовательности клона, кодирующего указанный испытуемый полипептид, в качестве матрицы. Затем амплифицированные ПЦР фрагменты могут быть встроены в экспрессирующие векторы, посредством чего должны быть обеспечены стартовый кодон ATG и предпочтительно последовательность Козака (Kozak, M, 1984). Дополнительные подробности относительно экспрессии полипептидов могут быть найдены в вышеупомянутой информации Qiagen, касающиеся His-меченых белков, а также экспрессии белков вообще. Другой ссылкой относительно экспрессии белков являются также вышеупомянутые Current Protocols, и в частности глава 16. Таким образом, сайт расщепления испытуемого полипептида может быть определен получением из него различных делеционных мутантов и определения наименьшего такого делеционного мутанта, который расщепляется каспазой-8. Другой путь идентификации сайта расщепления использует пептиды, которые получают в соответствии с предсказанной полипептидной последовательностью испытуемого клона. Пептиды можно синтезировать химически, например, как подробно описано в Bodanszky and Bodanszky, The practice of peptidesynthesis, Springer, New York, ISBN 0-387-13471-9, and Bodanszky, The principles of peptide synthesis,Springer, New York, ISBN 0-387-12359-4. Специальный синтез пептидов по заказу доступен также из нескольких коммерческих компаний, например SynPep Corp., Dublin, CA USA, and California Peptide Research,Inc., Napa, CA, USA. Пептиды могут быть также получены либо в виде слияния с другими белками, либо в неслитом состоянии экспрессией рекомбинантной ДНК, кодирующей их, как подробно описано в указанной выше главе 16 Current Protocols. Для использования пептидов для картирования сайта расщепления испытуемого полипептида предсказанную аминокислотную последовательность указанного полипептида делят на зоны и синтезируют пептид, соответствующий каждой зоне. Кроме того, синтезируют пептиды, содержащие приблизительно половину аминокислот одной зоны и смежно содержащие дополнительно приблизительно половину аминскислот непосредственно соседней зоны, так что имеется перекрывание границы между двумя зонами. Зоны содержат 5-100 аминокислот, предпочтительно 9-40 аминокислот и наиболее предпочтительно 20-30 аминокислот. Таким образом, после реакции расщепления они могут анализироваться непосредственно электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле с УФ-детектированием или визуализацией окрашиванием, например, с использованием Кумасси голубого. Альтернативно, пептиды могут быть мечены для более легкого детектирования, например, изотопным мечением концов (см., например,Shevchenko A., et al., 1997). После завершения скрининга пептидов, как описано выше, пептид, который, как теперь известно,содержит сайт расщепления для каспазы-8, может быть исследован дополнительно повторением того же самого способа, но с выбором меньших зон, выбранных из последовательности пептида, который был идентифицирован. Фактический сайт расщепления пептидов должен соответствовать последовательности расщепления каспазы XXXD (см. Boldin et al., Cell 1996 и Nicholson et al., 1997). Вклад каждой аминокислоты в пептид может оцениваться получением пептидов, которые являются мутированными в одной аминокислоте, и испытанием этих мутированных пептидов на их чувствительность к расщеплению каспазой-8. Аминокислоту, которая должна быть мутирована, предпочтительно заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из заряженных неполярных аминокислот (см. Lehninger, Biochemistry, Worth,NY, 1979, глава 4), наиболее предпочтительно выбранной из глицина или аланина. Посредством мутирования критических аминокислот можно получить пептиды, которые связывают прокаспазу-8, но не являются чувствительными к расщеплению ею. Связывание может быть испытано разделением по размеру комплексов пептид-каспаза-8 при неденатурирующих условиях с использованием электрофореза в акриламидном геле или копреципитацией каспаза-8-специфическими антителами.- 19009956 Испытуемый полипептид или его пептидный фрагмент могут быть дополнительно охарактеризованы введением указанного полипептида или пептида в клетку млекопитающего и измерением действия индуцирующих апоптоз реагентов в указанной клетке. Экспрессия полипептида или пептида Cari в клетке млекопитающего может быть выполнена встраиванием ДНК, кодирующей Cari, в вектор, содержащий промотор, необязательно интронную последовательность и донорный/акцепторный сигналы сплайсинга и дополнительно необязательно содержащий последовательность терминации. Эти способы описаны в общем виде в вышеупомянутых CurrentProtocols, глава 16. Вышеуказанные последовательности промотора, интрона и терминации являются функциональными в клетках млекопитающих. Промотор является предпочтительно сильным промотором, таким как вышеуказанный промотор RSV, CMV или MPSV. Промотором может быть также ранний промотор SV40(Everett, et al., 1983 и ссылки в этой статье) или клеточный промотор, такой как промотор бета-актина или промотор ELF-1 (Tokushige, et al., 1997). Может использоваться также гибридный промотор, такой как гибрид между оператором lac и промотором ELF-1 альфа человека, как описано Edamatsu et al., 1997,гибридный промотор CMV-бета-актина, описанный Akagi et al., 199), или гибрид между операторными последовательностями tet и промотором CMV (Furth et al., 1994 и ссылки в этой статье). Последовательности интронов, которые могут быть встроены в виде полных последовательностей,т.е. включающих донорный и акцепторный сайты сплайсинга, могут быть встроены в кодирующую последовательность полипептида, который желательно экспрессировать. Встраивание таких последовательностей интронов может усиливать стабильность РНК и, следовательно, повышать продуцирование желаемого полипептида. Хотя, в принципе, подходящие последовательности интронов могут быть выбраны из любого гена, содержащего интроны, предпочтительными последовательностями интронов являются интрон бета-актина, интрон SV40 и интрон TNF-рецептора р 55. Последовательность интрона может содержать энхансерные элементы, которые могут усиливать транскрипцию от вышеупомянутых промоторов. Последовательности интронов могут часто содержать также регуляторные последовательности транскрипции или трансляции, которые придают тканеспецифическую экспрессию. Таким образом, когда желательно экспрессировать полипептид данного изобретения тканеспецифическим образом, такие последовательности интронов могут применяться выгодным образом. Примером интрона, содержащего тканеспецифические энхансерные элементы, является эритроид-специфический энхансер, расположенный в интроне 8 гена 5-аминолевулинатсинтазы 2 человека (Surinya et al., 1998), а обсуждение принципа усиленной продукции белков с использованием последовательностей интронов вместе с примерами интронных последовательностей описано у Huang et al., 1990. На 3'-конце ДНК, кодирующей полипептид, который желательно экспрессировать, могут быть добавлены последовательности терминации транскрипции и сигналы полиаденилирования. Такие последовательности могут быть обнаружены во многих генах или даже в большинстве генов. Предпочтительно может быть использован сигнал полиаденилирования SV40 (Schek et al., 1992 и ссылки в этой статье). Для экспрессии Cari в клетке млекопитающего мог бы, например, использоваться вектор pcDNA3.1(Invitrogen), который содержит промотор CMV для запуска экспрессии гена, кодирующего желаемый полипептид, и векторы pMPSVEH с промоторами MPSV. Рекомбинантные полипептиды могут быть получены либо в бактериальных, либо в эукариотических (например, СНО) культивируемых клетках-хозяевах, трансфицированных векторами, кодирующими такие полипептиды, или в трансгенных животных. При использовании трансгенных животных особенно предпочтительным является получение гетерологичных полипептидов в их молоке. Дающие молоко животные, такие как крупный рогатый скот, овцы и козы, являются, следовательно, предпочтительными хозяевами. См., например, описания патентных заявок WO 88/00239, WO 90/05188, WO 91/02318 иWO 92/11757 и патенты США 4873191, 4873316 и 5304489, которые включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. С использованием рекомбинантной экспрессии тестируемого полипептида полипептид может теперь оцениваться в отношении его действия на сигнал апоптоза, который опосредуется каспазой, например каспазой-8. Для этой цели апоптоз может быть индуцирован либо сверхэкспрессией индуцирующего апоптоз белка, такого как р 55 TNFR, белок MORT-1, каспаза-8 или их эквивалент; либо активацией сигнала апоптоза запуском TNFR p55, CD120a, CD95, TRAMP/DR3 или эквивалентным рецептором. В одном варианте апоптоз индуцируют сверхэкспрессией TNFR p55. Активация рецептора может быть достигнута также контактированием рецепторов со специфическими лигандами или перекрестным связыванием рецепторов с антителами, предпочтительно поликлональными антителами (см. Engelmann et al., 1990). В одном варианте сверхэкспрессия Cari сопровождается стимуляцией Fas-лигандом. Хотя обычно запуск рецептора, подобного CD95, Fas-лигандом требует добавления ингибитора белкового синтеза, такого как циклогексимид, для достижения сильного сигнала апоптоза сверхэкспрессия внутриклеточных доменов рецептора или белков, участвующих в передаче сигнала апоптоза, не требуют этого (см. Boldin et al., 1996). В противоположность этому, при проведении стимуляции Fas-лиган- 20009956 дом клеток, сверхэкспрессирующих Cari, циклогексимид не требовался для получения сильного сигнала апоптоза. Детектирование апоптоза, время инкубации и другие подробности и параметры этого анализа описаны в указанной выше статье Boldin et al. Гибель клеток в случае клеток, сверхэкспрессирующих Cari, в сравнении с контрольными клетками может оцениваться любыми способами, такими как способы, основанные на фрагментации ДНК или детектировании апоптозспецифических антигенов и эпитопов. Реагенты и протоколы для детектирования апоптоза в форме наборов являются доступными из вышеупомянутых Boehringer Mannheim и других компаний. Гибель клеток может быть также определена оценкой морфологического вида клеток. Гибель клетки в результате апоптоза характеризуется волнистой клеточной мембраной и сморщиванием клеток в отсутствие лизиса клеток. Предпочтительно в клетках млекопитающих экспрессируется репортерный ген для обеспечения маркера успешной трансфекции. Когда процедура трансфекции сама приводит к некоторой гибели клеток, в том числе гибели клеток, которые не были трансфицированы, выгодным является оценивать только клетки, которые были трансфицированы. Предпочтительным репортерным геном для этой цели является GFP, зеленый флуоресцентный белок, который может быть использован для прямого детектирования без необходимости цветной реакции, этот репортерный ген требует применения флуоресцентного микроскопа. Однако может быть использован любой другой известный репортерный ген, предпочтительно ген, продукты которого легко детектируются с использованием простой цветной реакции, например ген lacZ легко детектируется инкубацией трансфицированных клеток с Xgal или подобным реагентом, свидетельствующим об активной бета-галактозидазе, результаты чего могут оцениваться с использованием микроскопа. Таким образом, с учетом только тех клеток, которые были трансфицированы, т.е. которые экспрессируют репортерный ген, и подсчетом процента клеток, демонстрирующих апоптотическую морфологию, можно оценивать действие конкретного трансфицированного клона и полипептида, экспрессируемого в нем, на апоптоз. Клетки млекопитающих, используемые для трансфекции и испытания апоптоза, выбирают из клеток HeLa, хронических миелогенных клеток с морфологией лимфобластов европеоидной расы человека(K562), клеток Т-клеточной лимфомы человека с морфологией лимфобластов (Hut78), клеток лимфомы Беркитта с морфологией лимфобластов негроидной расы (Raji), клеток Namalva лимфомы Беркитта с морфологией лимфобластов человека (Nalm), клеток промиелоцитарного лейкоза с промиелоидной морфологией европеоидной расы человека (HL-60), клеток острого лимфобластного лейкоза с морфологией лимфобластов (СЕМ) и Т-клеток с морфологией лимфобластов человека (Е 9) и предпочтительно клеток 293 эмбриональных почек человека (HEK), сверхэкспрессирующих Т-антиген клеток. Трансфекцию предпочтительно выполняют кальций-фосфатным способом, описанным в Current Protocols выше. Морфологию клеток оценивают через 1-150 ч после трансфекции, предпочтительно через 4-35 ч и наиболее предпочтительно в течение 24 ч после трансфекции. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенного продуцирования Cari или ингибитора Cari, обычно молчащего, также рассматривается данным изобретением. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функциональные в клетках, в которых желательно зкспрессироватьCari или ингибитор Cari. Такими регуляторными последовательностями могут быть, например, промоторы или энхансеры. Затем регуляторная последовательность может быть введена в правильный локус генома гомологичной рекомбинацией, т.е. функциональным связыванием регуляторной последовательности с геном, экспрессия которого должна быть индуцирована или усилена. Технологию обычно называют"активацией эндогенного гена" (EGA), и она описана, например, в WO 91/09955. Специалисту в данной области будет понятно, что можно также подавить экспрессию Cari с использованием того же самого способа, т.е. введением элемента отрицательной регуляции, такого как,например, вызывающий молчание гена элемент, в локус гена Cari, что приводит, следовательно, к отрицательной регуляции или предотвращению экспрессии Cari. Специалисту в данной области будет понятно, что такая отрицательная регуляция или вызывание молчания экспрессии Cari будет оказывать такое же действие, какое оказывает ингибитор Cari, для профилактики и/или лечения заболевания. Клоны, полученные при скрининге на связывающие каспазу полипептиды по способу данного изобретения, могут быть частичными клонами. Получение полноразмерных клонов, если необходимо, было описано дополнительно выше. ДНК-последовательности полноразмерного клона и частичного клона,первоначально обнаруженного при скрининге согласно данному изобретению, могут найти разнообразные применения. Например, для манипулирования экспрессией Cari может быть желательным получение антисмысловой РНК в клетке. Для этой цели полную или частичную кДНК, предпочтительно из 9 нуклеотидов,кодирующую полипептид Cari, встраивают в экспрессирующий вектор, содержащий промотор, как отмечалось дополнительно выше. 3'-Конец этой кДНК встраивают посредством этого смежно с 3'-концом промотора, причем 5'-конец кДНК отделен от 3'-конца промотора указанной кДНК. При экспрессии кДНК в клетке получают, следовательно, антисмысловую РНК, которая неспособна кодировать этот по- 21009956 липептид. Присутствие антисмысловой РНК в клетке уменьшает экспрессию клеточной (геномной) копии Cari. Для получения антисмысловой РНК может быть использована полная кДНК. Альтернативно, может быть использован ее фрагмент, который предпочтительно имеет длину 9-2000 нуклеотидов, более предпочтительно 15-500 нуклеотидов и наиболее предпочтительно 20-150 нуклеотидов. В качестве антисмыслового олигонуклеотида может быть использован синтетический олигонуклеотид. Этим олигонуклеотидом является предпочтительно ДНК-олигонуклеотид. Длина антисмыслового олигонуклеотида равна предпочтительно 9-150, более предпочтительно 12-60 и наиболее предпочтительно 20-50 нуклеотидам, например последовательности SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7. Механизм действия антисмысловой РНК и существующее состояние области применения антисмысловых инструментов рассмотрены в обзоре Kumar et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, p. 1415-1434, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов в ингибировании синтеза рецептора BMP было описаноYeh et al., 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза зависимого от напряжения гена калиевого канала Kv1.4 было описано Meiri et al., 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза Bcl-x было описано Kondo et al., 1998. Терапевтическое применение антисмысловых лекарственных средств обсуждается Stix 1998,Flanagan, 1998, Guinot and Temsamani, 1998, и в ссылках в этих статьях. При конструировании антисмысловых олигонуклеотидов используют обычно модификации олигонуклеотидов, которые усиливают желаемые свойства. Например, используют фосфоротиоатные связи вместо фосфоэфирных связей, природно встречающихся в ДНК, в основном, потому, что такие фосфоротиоатные олигонуклеотиды менее склонны к деградации клеточными ферментами. Peng et al. описывают,что нежелательные побочные действия in vivo фосфоротиоатных олигонуклеотидов могут быть уменьшены при использовании смешанного фосфодиэфирного-фосфоротиоатного скелета. Предпочтительно используют 2'-метоксирибонуклеотидные модификации в 60% олигонуклеотида. Такие модифицированные олигонуклеотиды способны индуцировать антисмысловое действие, сравнимое с действием, наблюдаемым с фосфоротиоатными олигонуклеотидами. Peng et al. утверждают далее, что олигонуклеотидные мутеины, неспособные поддерживать активность рибонуклеазы Н, являются неактивными. Таким образом, предпочтительный антисмысловой олигонуклеотид данного изобретения имеет смешанный фосфодиэфирный-фосфоротиоатный скелет. Наиболее предпочтительно используют 2'-метоксирибонуклеотидные модификации в приблизительно 30-80%, наиболее предпочтительно в приблизительно 60% олигонуклеотида. В антисмысловой олигонуклеотид может быть введена дополнительная модификация. Например,молекула олигонуклеотида может быть связана с группой, содержащей необязательно частично ненасыщенную алифатическую углеродную цепь и одну или более полярных или заряженных групп, таких как карбоксильные группы, сложноэфирные группы и спиртовые группы. Альтернативно, олигонуклеотиды могут быть связаны с пептидными структурами, которые предпочтительно являются мембранотропными пептидами. Такие модифицированные олигонуклеотиды легче проникают через мембраны, что является решающим для их функции, и могут, следовательно, значительно повышать их активность. Проницаемость мембраны является особенно желательной для антисмысловых лекарственных средств, которые предпочтительно должны достигать головного мозга. Пальмитилсвязанные олигонуклеотиды были описаны Gerster et al., 1998. Гераниолсвязанные олигонуклеотиды были описаны Shoji et al., 1998. Олигонуклеотиды, связанные с пептидами, например мембранотропными пептидами, и их получение были описаны Soukchareun et al., 1998. Модификации антисмысловых молекул или других лекарственных средств,которые нацеливают такую молекулу на определенные клетки и усиливают поглощение олигонуклеотида указанными клетками, описаны Wang, J., 1998. С использованием известной последовательности мРНК гена могут быть сконструированы рибозимы,которые являются молекулой РНК, специфически связывающей и расщепляющей указанную молекулу мРНК (см., например, Chen et al., Zhao and Pick, 1993, Shore et al., 1993, Joseph and Burke, 1993, Shimayamaet al., Cantor et al., 1993). Таким образом, может быть сконструирована кодирующая рибозим последовательность РНК, которая расщепляет мРНК полипептида Cari данного изобретения. Точка расщепления предпочтительно находится в кодирующей области или в 5'-нетранслируемой области, более предпочтительно в 5'-части кодирующей области вблизи стартового кодона трансляция AUG. ДНК, кодирующая рибозим, в соответствии с данным изобретением может быть введена в клетки посредством поглощения ДНК, поглощения модифицированной ДНК (см. модификации олигонуклеотидов и белков, которые приводят к повышенной проницаемости через мембраны, как описано здесь ниже) или с использованием переноса гена, опосредованного вирусным вектором, как описано подробно ниже. Таким образом, данное изобретение представляет Cari, его производные пептиды, мутанты, специфические антитела, ДНК, кодирующую белок, рибозим, антисмысловые молекулы ДНК и олигонуклеотиды. Терапевтическое или связанное с научно-исследовательской работой применение этих инструментов требует введения в клетки живого организма. Для этой цели желательно улучшить проницаемость через мембраны пептидов, полипептидов и олигонуклеотидов. В создании пептидов и полипептидов с- 22009956 увеличенной проницаемостью мембран может быть использована дериватизация липофильными структурами. Например, к последовательности пептида или полипептида может быть добавлена последовательность известного мембранотропного пептида, как указывалось выше. Далее, пептид или полипептид может быть дериватизован частично липофильными структурами, такими как вышеупомянутые углеводородные цепи, которые замещены по меньшей мере одной полярной или заряженной группой. Например, лауроилпроизводные пептидов были описаны Muranishi et al., 1991. Дополнительные модификации пептидов и полипептидов включают окисление остатков метионина для создания посредством этого сульфоксидных групп, как описано Zacharia et al., 1991. Zacharia et al. описывают также пептид или производные, в которых относительно гидрофобная пептидная связь заменена ее сложным кетометиленовым изоэфиром (СОСН 2). Эти и другие модификации, известные специалистам в области химии полипептидов и пептидов, усиливают проницаемость через мембраны. Другим путем усиления мембранной проницаемости является применение рецепторов, таких как рецепторы вирусов, на клеточных поверхностях для индукции клеточного поглощения пептида или полипептида. Этот механизм используется часто вирусами, которые специфически связываются с определенными молекулами клеточной поверхности. После связывания клетка поглощает этот вирус в свое внутреннее пространство. Такую молекулу клеточной поверхности называют рецептором вируса. Например, молекулы интегринов CAR и AdV были описаны в качестве рецепторов вирусов для аденовируса, см. Hemmi et al., 1998 и ссылки в этой статье. Молекулы CD4, GPR1, GPR15 и STRL33 были идентифицированы как рецепторы/корецепторы для ВИЧ, см. Edinger et al., 1998 и ссылки в этой статье. Таким образом, конъюгация пептидов, полипептидов или олигонуклеотидов с молекулами, о которых известно, что они связываются с рецепторами клеточной поверхности, будет усиливать мембранную проницаемость указанных пептидов, полипептидов или олигонуклеотидов. Примерами подходящих групп для образования конъюгатов являются сахара, витамины, гормоны, цитокины, трансферрин, асиалогликопротеин и подобные им молекулы. Low et al., USP 5108921, описывают применение указанных молекул для цели усиления мембранной проницаемости пептидов, полипептидов и олигонуклеотидов и получение указанных конъюгатов. Кроме того, Low et al. утверждают, что такие молекулы, как фолат или биотин, могут быть использованы для нацеливания конъюгата на множество клеток в организме вследствие обильной и неспецифической экспрессии рецепторов для этих молекул. Описанное выше применение белков клеточной поверхности для увеличения мембранной проницаемости пептида, полипептида или олигонуклеотида данного изобретения может быть также использовано в нацеливании указанных пептида, полипептида или олигонуклеотида данного изобретения на определенные типы клеток или ткани. Например, если желательным является нацеливание на раковые клетки,предпочтительно использовать белок клеточной поверхности, который экспрессируется более обильно на поверхности этих клеток. Примерами являются рецептор фолата, антигены муцина MUC1, MUC2,MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B и MUC7, гликопротеиновые антигены KSA, канцероэмбриональный антиген, простатаспецифический мембранный антиген (PSMA), HER-2/neu и хорионический гонадотропин-бета человека. Вышеуказанная статья Wang et al., 1998 сообщает о применении фолата для нацеливания на раковые клетки и Zhang et al., 1998 сообщают об относительном изобилии каждого из других указанных выше антигенов в различных типах злокачественных опухолей и в нормальных клетках. Таким образом, полипептид, пептид или олигонуклеотид данного изобретения может быть, с использованием вышеописанных способов конъюгации, нацелен на определенный тип клеток, если желательно. Например, если желательно усилить апоптоз в клетках лимфоцитарного направления дифференцировки, пептид Cari, его фрагмент, мутанты и производные согласно изобретению могут быть нацелены на такие клетки, например, с использованием молекул МНС класса II, которые экспрессируются на этих клетках. Это может быть достигнуто связыванием антитела или его антигенсвязывающего сайта, направленного против константной области указанной молекулы МНС класса II, с полипептидом или пептидом данного изобретения. Кроме того, были описаны многочисленные рецепторы клеточной поверхности для различных цитокинов и других коммуникационных молекул клетки, и многие из этих молекул экспрессируются более или менее ограниченным типом ткани или типом клеток образом. Таким образом, когда желательным является нацеливание на подгруппу Т-клеток, молекула CD4 Т-клеточной поверхности может быть использована для получения конъюгата согласно изобретению. CD4-связывающие молекулы обеспечиваются вирусом ВИЧ, поверхностный антиген gp42 которого способен специфически связываться с молекулой CD4. Усиливающий апоптоз Cari, мутант или пептид данного изобретения может быть преимущественно нацелен на Т-клетки при лечении пациента, который страдает от аутоиммунных реакций, основанных на Т-клетках, такого как пациент с системной красной волчанкой. Полипептиды, пептиды и антисмысловые последовательности данного изобретения могут вводиться в клетки с использованием вирусного вектора. Применение в качестве вектора вируса коровьей оспы подробно описано в вышеупомянутой главе 16 Current Protocols in Molecular Biology. Применение аденовирусных векторов описано, например, Teoh et al., 1998, Narumi et al., 1998, Pederson et al., 1998, GuangLin et al., 1998, и приведенных в них ссылках, Nishida et al., 1998, Schwarzenberger et al., 1998, и Cao et al.,1998. Ретровирусный перенос антисмысловых последовательностей был описан Daniel et al., 1998.- 23009956 Для лечения и/или профилактики заболеваний, в которых участвует Cari, генотерапевтический вектор, содержащий последовательность ингибитора Cari, если требуется ингибирование апоптоза, или альтернативно содержащий последовательность Cari, если требуется усиление апоптоза, для ингибирования или индуцирования продуцирования и/или активности Cari, соответственно, может быть инъецирован непосредственно, например, в больной сустав, что позволяет избежать проблем, связанных с системным введением генотерапевтических векторов, таких как разбавление векторов, достижение клеток или тканей-мишеней и нацеливание на клетки или ткани-мишени и побочные действия. При применении вирусов в качестве векторов обычно используют вирусные поверхностные белки для нацеливания вируса. Поскольку многие вирусы, такие как вышеупомянутый аденовирус, являются довольно неспецифичными в их клеточном тропизме, может быть желательным придание им дополнительной специфичности с использованием клеточноспецифического или тканеспецифического промотора.Griscelli et al., 1998 сообщают о применении специфического для желудочков промотора легкой цепи кардиомиозина для кардиоспецифического нацеливания гена, перенос которого опосредуется аденовирусом. Альтернативно, может быть сконструирован вирусный вектор для экспрессии дополнительного белка на его поверхности, или поверхностный белок вирусного вектора может быть изменен включением желательной пептидной последовательности. Таким образом может быть сконструирован вирусный вектор для экспрессии одного или более дополнительных эпитопов, которые могут быть использованы для нацеливания указанного вирусного вектора. Например, эпитопы цитокинов, МНС класс II-связывающие пептиды или эпитопы, производные хоминг-молекул, могут быть использованы для нацеливания вирусного вектора в соответствии с данным изобретением. Таким образом, Cari может быть использован для генотерапии посредством уменьшения или увеличения эндогенного количества Cari в желательном месте организма пациента-человека. Взаимодействие Cari с каспазой-8 имеет несколько возможных последствий. Во-первых, происходит модуляция апоптоза. Это демонстрируется в данной работе в анализе inp55TNFR, сверхэкспрессией р 72 или стимуляцией Fas-лигандом. В одном варианте было показано, что нерасщепляемый мутант р 72 D600E является более сильнодействующим в потенциировании Fas-лигандом гибели клеток, чем Cari дикого типа. Одним из возможных объяснений этого результата может быть то, что Cari участвует в превращении прокаспазы-8 в активную каспазу-8. Таким образом, нерасщепляемый Cari будет непрерывно индуцировать превращение прокаспазы-8 в активную каспазу-8 и увеличивать апоптоз, в отличие от Cari дикого типа, который может прогрессирующим образом расщепляться и инактивироваться активной каспазой-8. Cari имеет мотивы связывания РНК, и, следовательно, механизм его действия может включать в себя изменения в скорости трансляции и/или оборота различных мРНКтранскриптов, которые затем влияют на экспрессию ключевых белков, участвующих в модуляции гибели клеток. Во-вторых, активность Cari может модулироваться. Это демонстрируется в данной работе способностью каспазы-8 расщеплять Cari. Вероятным является то, что Cari инактивируется расщеплением. Однако возможно также, что активность Cari изменяется, что происходит индукция новых активностей или что полипептид Cari активируется расщеплением, как и сами каспазы. Таким образом, Cari, мутанты, предпочтительно мутант Cari/p72 D600E, пептиды, например домен связывания каспазы-8 в Cari, содержащий аминокислотные остатки 414-437 (SEQ ID NO: 4) и остатки 422-437 (SEQ ID NO: 5), олигонуклеотиды, такие как антисмысловая последовательность Cari, и специфические антитела против Cari применимы в модуляции активности каспазы-8 и апоптоза. Понижающая регуляция каспазы-8 является желательной в ситуациях, когда имеет место избыточная гибель клеток. Например, в воспалительных заболеваниях, таких как рассеянный склероз с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунный увеоретинит, диабет, системная красная волчанка, аутоиммунный миокардит I, острая печеночная недостаточность независимо от этиологии, HCV-опосредованный хронический гепатит, хронический гастрит, например гастрит типа А, смешанная соединительнотканная болезнь (MCTD), болезнь Крона и язвенный колит, предполагается, что разрушение ткани организма вызывается сигналами апоптоза. Таким образом, может быть полезным для пациентов, страдающих от этих заболеваний, модулировать понижающим образом активность каспазы-8 в клетках, которые разрушаются посредством апоптотической гибели клеток. Подобным образом, пептиды или полипептиды данного изобретения, такие как Cari 414-437 и Cari 422-437, могут быть нацелены на другой тип клеток, участвующий в других заболеваниях, перечисленных выше, и других заболеваниях, где было показано, что избыточная апоптотическая гибель клеток опосредует повреждение в наблюдаемой ткани тела. Повышающая регуляция активности каспазы-8 и усиление апоптоза полипептидом Cari могут использоваться в ситуациях, когда требуется избыточная гибель клеток. Например, в случае вышеупомянутой олигодендропатии желательным является ингибирование активности каспазы-8 в олигодендроцитах. Рецептор фосфолипида-лизофосфатидной кислоты, связанной сG-белком клеточной поверхности, экспрессируется в олигодендроцитах и в различных других клетках головного мозга, но не в других тканях тела. Поскольку в одном из вариантов было показано, что пути- 24009956 передачи сигнала TNF-рецептора или каспаза-8-зависимый апоптоз требует активности Cari, небольшой пептид Cari, например полипептид Cari из 24 аминокислот (Cari 414-437), который, как было обнаружено, связывает каспазу-8, может быть нацелен на олигодендроциты для ингибирования апоптоза, опосредованного каспазой-8. Это может достигаться либо связыванием указанного пептида или полипептида с фосфолипидом-лизофосфатидной кислотой, либо введением последовательности антитела, которое специфически узнает указанный рецептор фосфолипида-лизофосфатидной кислоты, в вирусный вектор, так что указанный вирусный вектор связывается с указанным рецептором фосфолипида-лизофосфатидной кислоты. Антисмысловая РНК, антисмысловой олигонуклеотид с последовательностями, производными кДНК Cari человека, такими как AAGAGGATAAGGTAGAGCTCC (1169-1190) (SEQ ID NO: 6), и/или из 3'-нетранслируемого района AATGACCAACCGTCCCTGGAC (3' 26-47 п.н.) (SEQ ID NO: 7), и рибозим данного изобретения могут быть нацелены подобным образом на вышеописанные олигодендроциты или соответствующие клетки при других заболеваниях. В этом случае ингибируется экспрессия полипептидаCari, а не экспрессия самой каспазы-8. Ингибирование экспрессии Cari может уменьшать апоптотическое действие каспазы-8. Однако уменьшение экспрессии полипептидов Cari может фактически увеличивать действие каспазы-8, так как некоторые эндогенные полипептиды Cari способны действовать в качестве негативного регулятора активности каспазы-8. Таким образом, эффект применения антисмысловых олигонуклеотидов и антисмысловых РНК и рибозимов должен быть сначала испытан, например, в описанном выше анализе, перед рассмотрением применения таких агентов для лечения. С другой стороны, имеются определенные ситуации, в которых может быть желательным увеличение активности каспазы-8. Это может иметь место при том же самом заболевании, как упоминалось выше, например в случае системной красной волчанки. Однако типы клеток, на которые должно проводиться нацеливание, являются другими. Например, в случае системной красной волчанки популяция Тклеток может содержать аутореактивные клетки, которые не разрушаются в вилочковой железе. Таким образом, агент повышающей регуляции каспазы-8 данного изобретения должен быть нацелен на Тклетки. Предпочтительно нацеливать агент повышающей регуляции каспазы-8 на аутореактивные клетки. В некоторых заболеваниях, таких как рассеянный склероз, некоторые клоны Т-клеток играют предположительно критическую роль в развитии заболевания. Таким образом, положительно регулирующий каспазу-8 агент согласно изобретению может быть нацелен на такие клетки с использованием одного или более антител, специфически направленных на вариабельную область Т-клеточного рецептора аутореактивных Т-клеточных клонов, для нацеливания положительно регулирующего каспазу-8 агента данного изобретения, которым может быть полипептид Cari, мутанты или пептид в соответствии с данным изобретением. Увеличение активности каспазы-8 и апоптоза при помощи Cari могут быть использованы для лечения рака. Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим активное вещество,выбранное из одного или более следующих веществ: полипептида Cari, мутантов, предпочтительно р 72D600E, пептида, такого как пептид, содержащий аминокислотные остатки 414-437 (SEQ ID NO: 4) и аминокислотные остатки 422-437 (SEQ ID NO: 5), векторов, кодирующих такие Cari, его мутеины и фрагменты, антитела, специфического для Cari, рибозима, антисмысловой РНК или антисмыслового олигонуклеотида в соответствии с данным изобретением. Терапевтически эффективные количества активного белка (белков) будут функцией многих переменных, например пути введения, клинического состояния пациента."Терапевтически эффективным количеством" является такое количество, которое при введении Cari или его антагониста проявляет биологическую активность. Доза, вводимая в виде однократной или многократных доз индивидууму, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, в том числе фармакокинетических свойств, пути введения, состояния и характеристик пациента (пола, возраста, веса тела, здоровья, размера), степени симптомов, сопутствующего лечения, частоты введения и желаемого эффекта. Коррекция и манипуляция установленных диапазонов доз находятся вполне в рамках компетентности специалистов в данной области, так же, как и способы in vitro и in vivo определения действия в индивидууме. Далее, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим вирусный вектор, способный инфицировать клетки млекопитающих, причем указанный вектор содержит функционально связанные промотор и ДНК-последовательность данного изобретения, кодирующую Cari, мутанты (например, р 72 D600E), пептид (например, Cari 414-437 или Cari 422-437), рибозим, антисмысловую РНК, антисмысловой олигонуклеотид или антитело Cari в соответствии с данным изобретением. Вирусный вектор может необязательно содержать кодирующую последовательность, функционально связанную с промотором, которая кодирует пептид или белок, локализованный на поверхности вируса и который способен связывать поверхностный белок клетки млекопитающего. Поверхностный белок предпочтительно является белком, который обеспечивает поглощение вирусного вектора и предпочтительно экспрессируется тканеспецифическим или специфическим для типа клеток образом, так что он способен обеспечить нацеливание вирусного вектора.Cari, его мутеины, фрагменты или производные, мутант р 72 D600E, пептиды Cari 414-437 или Cari 422-437, рибозим, антисмысловая РНК, антисмысловой олигонуклеотид или антитело Cari в соответствии с данным изобретением могут быть также использованы для выделения, идентификации и клонирования других полипептидов того же самого класса, т.е. полипептидов, связывающихся с каспазой-8, или для выделения функционально родственных протеаз или белков, участвующих в процессах внутриклеточной передачи сигнала. Для этой цели может быть использована описанная выше система иммунопреципитации или может быть использована разработанная система, использующая гибридизацию по Саузерну в нежестких условиях с последующим ПЦР-клонированием (Wilks et al., 1989). В публикации Wilks et al. описаны идентификация и клонирование двух предположительных протеинтирозинкиназ посредством применения нежестких условий гибридизации по Саузерну с последующим клонированием при помощи ПЦР на основе известной последовательности мотива киназы, рассматриваемой последовательности киназы. Этот подход может быть использован в соответствии с данным изобретением с применением последовательности полипептида Cari для идентификации и клонирования родственных Cari полипептидов. Другой подход использования полипептида Cari, его мутеинов, фрагментов или производных или антител Cari данного изобретения заключается в применении их в способах аффинной хроматографии для выделения и идентификации других полипептидов или факторов, с которыми они способны связываться, например других полипептидов или факторов, участвующих в процессе внутриклеточной передачи сигнала. Cari, его мутеины, фрагменты или производные, антитела Cari могут быть индивидуально присоединены к матриксам для аффинной хроматографии и затем приведены в контакт с клеточными экстрактами, жидкостями человека или выделенными полипептидами или факторами, предположительно участвующими в процессе внутриклеточной передачи сигнала. После проведения процедуры аффинной хроматографии другие полипептиды или факторы, которые связываются с полипептидом Cari или его мутеинами, фрагментами или производными данного изобретения, могут быть элюированы, выделены и охарактеризованы. Данное изобретение относится также к применению Cari и его пептидов, таких как домен связывания каспазы-8 в Cari (остатки 414-437 или остатки 422-437), или антител Cari для получения молекулантагонистов Cari, имеющих потенциальную терапевтическую ценность. Эти способы включают использование Cari и его фрагментов для выделения природных антагонистов, малых пептидных антагонистов и непептидных химических антагонистов. Высокопроизводительный скрининг использует роботов для тестирования связывающей активности тысяч соединений (пептидов или химических соединений, например, созданных комбинаторной химией) в отношении мишени-Cari. Тестируемые соединения могут быть получены не только посредством комбинаторной химии, но также из других высокопроизводительных способов синтеза. Автоматизированные способы позволяют осуществить быстрый синтез библиотек молекул, больших коллекций отдельных соединений, которые могут быть подвергнуты скринингу. Соединения могут быть также подвергнуты скринингу на ингибирование взаимодействия Cari или Cari(414-437) и каспазы-8. Антагонистические молекулы могут быть детектированы по их способности ингибировать связывание Cari с прокаспазой-8 или по ингибированию гибели клеток, опосредованной Cari,каспазой-8 или лигандами семейства TNF-рецепторов. Получение более крупных и более разнообразных библиотек соединений увеличивает вероятность открытия применимого лекарственного средства в такой библиотеке. Как отмечалось выше, Cari, его мутеины, фрагменты или производные могут быть также использованы в качестве иммуногенов (антигенов) для получения специфических антител к ним. Эти антитела могут быть также использованы для целей очистки полипептида Cari либо из клеточных экстрактов, либо из среды трансформированных клеточных линий, продуцирующих полипептид Cari или его мутеины или фрагменты. Далее, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей для идентификации нарушений, связанных с аномальным функционированием опосредуемой каспазой-8 системы Fas или TNF. Таким образом, если такие нарушения связаны с нарушением функционирования внутриклеточной системы передачи сигнала, включающей в себя каспазу-8 или полипептид Cari, такие антитела могли бы служить в качестве важного диагностического инструмента. Такие антитела, полученные с использованием Cari, особенно полностью гуманизированные антитела (например, интратела, см. выше),могут также иметь терапевтическую ценность. Следует также отметить, что выделение, идентификацию и характеристику полипептида данного изобретения или полипептида того же класса можно выполнять с использованием любой из хорошо известных стандартных процедур скрининга. Например, одной из таких процедур является дрожжевая двухгибридная процедура (см. Stanger et al., 1995). Также, как отмечается выше и ниже, могут быть использованы другие процедуры, такие как аффинная хроматография, процедуры гибридизации ДНК и т.д.,как хорошо известно в данной области, для выделения, идентификации и характеристики полипептида данного изобретения или для выделения, идентификации и характеристики дополнительных полипептидов, факторов, рецепторов и т.д., которые способны связываться с полипептидами данного изобретения. Теперь после описания данного изобретения оно будет более легко понято со ссылкой на следующие примеры, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения данного- 26009956 изобретения. Примеры Пример 1. Иммунизация мышей для получения моноклональных антител, специфических в отношении каспазы-8. После активации каспазу-8 расщепляют и собирают в виде двух субъединиц (Sub-1 и Sub-2). Для получения антител, специфических в отношении новых возможных эпитопов, образованных после активации каспазы-8, синтетические пептиды, производные С-конца Sub-1 и N-конца Sub-1 и Sub2, использовали для иммунизации мышей. Следующие пептиды использовали для иммунизации мышей с целью получения моноклональных антител. Пептид 179 - пептид CQGDNYQKGIPVETD, соответствующий С-концу большой субъединицы каспазы-8 (Sub-1, эпитоп, соответствующий остаткам Cys360-Asp374 фиг. 1), синтезировали, очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ и связывали с носителем KLH через его природный цистеин для экспонирования этого пептида относительно поверхности носителя. Пептид 182 - пептид LSSPQTRYIPDEADC, соответствующий N-концу малой субъединицы каспазы-8 (Sub-2, остатки Lys385-Gly399), синтезировали, очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ и связывали с носителем KLH через С, который не является производным последовательности Sub-2. Пептид 183 - пептид SESQTLDKVYQMKSKPRC, соответствующий N-концу Sub-1 (остатки Ser217Gly234), синтезировали, очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ и связывали с носителем KLH через С, который не является производным последовательности Sub-1. Четыре иммунизации и две бустер-иммунизации тем же самым количеством антигена (пептидKLH) проводили с мышами следующим образом. При первой иммунизации 50 мкг комплекса пептид-KLH растворяли в 50 мкл PBS, и гомогенизировали с 50 мкл полного адъюванта Фрейнда, и инъецировали в подошву лапки каждой из пяти 7-недельных самок мышей Balb/C. Для второй иммунизации, проводимой спустя 2 недели после первой иммунизации, мышам внутримышечно делали бустер-инъекцию такого же количества пептида в 50% (об./об.) растворе неполного адъюванта Фрейнда. Для третьей иммунизации, проводимой спустя 2 недели после второй иммунизации, мышам инъецировали внутрибрюшинно 50 мкг пептид-KLH в 50 мкл PBS. Сыворотки инъецированных мышей тестировали спустя 10 дней после второй и третьей иммунизаций. Четвертую иммунизацию (проводимую только для пептидов 182 и 183) выполняли спустя 1 месяц таким же образом, как и третью иммунизацию. Спустя 1 месяц после четвертой иммунизации (или третьей иммунизации для мышей, которым вводили пептид 179) проводили две бустер-инъекции (подобно третьей и четвертой иммунизациям) с 2 дневным интервалом. Спустя 4 дня после этого селезенку и паховые лимфатические узлы двух мышей, проявляющих наивысшую специфическую иммунореактивность, извлекали для слияния с миеломными клетками (EshharZ., 1985). Пример 2. Иммунизация кроликов для получения поликлональных антител, специфических в отношении каспазы-8. Кроликов иммунизировали 179-KLH и 183-KLH для получения специфических поликлональных антител. Первую иммунизацию проводили с использованием 100 мкг пептид-KLH, которые растворяли в 50 мклPBS, и гомогенизировали с 50 мкл полного адъюванта Фрейнда, и инъецировали подкожно. Вторую иммунизацию проводили спустя 2 недели тем же самым количеством пептид-KLH и инъецировали внутримышечно спустя 2 недели с неполным адъювантом Фрейнда. После этих двух иммунизаций следовали две бустер-инъекции тем же самым количеством пептид-KLH, растворенным в PBS и вводимым подкожно с 2-дневным интервалом. Пример 3. Получение гибридомы, отбор продуцирующих антитела клонов и очистка антител из асцитных жидкостей. Процесс слияния и отбор гибридомных клеток выполняли согласно протоколам Eshhar Z., 1985. Вкратце, смесь клеток селезенки и лимфатических узлов из двух иммунореактивных мышей 110106 сливали с 32106 клеток миеломы варианта миеломы NSO/1 посредством кратковременной инкубации с ПЭГ. ПЭГ сначала медленно разбавляли DMEM и затем полностью удаляли центрифугированием. Эти клетки ресуспендировали в среде DMEM-НАТ, распределяли в 96-луночные планшеты при концентрации приблизительно 2,5104 клеток на лунку и инкубировали в термостате с 8% СО 2 при 37 С. Среду во всех лунках с гибридомами заменяли на DMEM, дополненную 10% лошадиной сывороткой (HS). Пробы супернатантов гибридомных культур подвергали скринингу на присутствие специфических mAb спустя 2 недели после слияния с использованием анализа ELISA (описанного в примере 12 ниже). Клетки из лунок, в которых присутствие специфических антител было детектировано в культуральном супернатан- 27009956 те, переносили в 24-луночные планшеты. Положительные клетки субклонировали дважды; на этой стадии было обнаружено, что все эти субклоны являются положительными. Эти клоны размножали в 24 лунках и затем в Т-колбах 25 см 2. Размноженные культуры подвергали мониторингу на секрецию специфических mAb. Ампулы клеток положительных культур замораживали и хранили в жидком азоте. Из приблизительно 700 клонов, подвергнутых скринингу для детектирования специфических антител к пептиду 179, был обнаружен только один положительный клон (mAb 179); из 700 клонов, подвергнутых скринингу для детектирования специфических антител к пептиду 182, был обнаружен только один положительный клон (mAb 182), и из 1100 клонов, подвергнутых скринингу для детектирования специфических антител к пептиду 183, были обнаружены два положительных клона (mAb 183.1 и 183.2). Положительные клоны субклонировали с использованием лимитирующего разведения в 96-луночных планшетах. Супернатанты из растущих клонов тестировали несколько раз на специфические антитела при помощи ELISA (описано в примере 12). Положительные гибридомные клоны выращивали в колбах для культуры ткани в DMEM, содержащей 15% лошадиную сыворотку, и ампулы замораживали из части этих культур. Параллельно клетки различных гибридомных клонов инъецировали, в каждом случае в 2-4 мыши, для получения асцитных жидкостей. Антитела очищали из асцитной жидкости аффинной очисткой с использованием гранулaffigel (Affigel 15 Biorad), сшитых с БСА (Pierce Cat 77116), связанных с синтетическим пептидом, используемым: для иммунизации мышей (пептидом 179, 182 или 183). Для очистки антител асциты, осажденные 50% сульфатом аммония, диализовали против PBS в течение 16 при 0 С. После диализа аликвоты инкубировали с 1 мл гранул affigel-БСА-пептид в течение 16 ч при 0 С и эти предынкубированные гранулы использовали для упаковки 1 мл колонки. Сначала колонку промывали 10 мл PBS с последующей промывкой 10 мМ Трис рН 7,5, содержащим 1 М NaCl, и промывкой PBS. Антитела элюировали из колонки раствором, содержащим 100 мМ глицин-HCl рН 2,7 и 0,5 МNaCl. Фракции 1 мл собирали в пробирки, содержащие 40 мкл Трис-основания для нейтрализации элюента. Из 25 мл асцита получали приблизительно 5-13,6 мг очищенных антител. Пример 4. Изотип моноклональных антител. Изотип моноклональных антител определяли с использованием коммерческого набора для изотипирования (Southern Biotechnology Associates, INC cat 5300-05) в соответствии с процедурой анализа изготовителя. mAb 183 и 179 были идентифицированы как IgG1, тогда как mAb 182 было идентифицировано как антитело класса IgM. Пример 5. Иммунопреципитация каспазы-8 при помощи mAb 179, 182 и 183. Различные моноклональные антитела против каспазы-8, описанные в примере 3 выше, тестировали на их способность иммунопреципитировать каспазу-8 (см. пример 13 ниже) из лизатов покоящихся и активированных клеток Bjab. Линия Bjab является непрерывной линией клеток лимфомы, полученной из Африканской разновидности лимфомы Беркитта (Clements GB et al. 1975). Клетки Bjab стимулировали Fas-лигандом в течение 1 ч. Клеточные лизаты получали из клеток Bjab до и после стимуляции. После иммунопреципитации с использованием mAb 179, 182 и 183 (как описано в примере 13) "истощенный лизат" и каспазу-8, элюированную соответствующими пептидами, анализировали электрофорезом в SDS-ПААГ и окрашиванием серебром или Вестерн-блот-анализом с использованием анти-Sub-1-антитела в качестве первого антитела (Cell Signaling Technology Caspase-8 ICI2 Cat 9746). Фиг. 2 показывает Вестерн-блот-анализ (выполняемый, как описано в примере 11 ниже) тотальных клеточных экстрактов и "истощенных лизатов", полученных после иммунопреципитации с использованием mAb 179, 183.1 и 183.2 и 182. В нестимулированных клетках (дорожки 2, 4, 6, 8 и 10) детектировали дублет полос, соответствующий изоформам 1 и 2 прокаспазы-8 (прокаспазы-8 53/55 кДа), в тотальных клеточных экстрактах (дорожка 2) и в истощенных лизатах, полученных с анти-183- и анти-182-антителами (дорожки 6, 8 и 10), в противоположность этому, прокаспазу-8 не детектировали в истощенных лизатах, полученных с mAb 179 (дорожка 4). Эти результаты показывают, что mAb 179 иммунопреципитирует прокаспазу-8. В стимулированных клетках уровни прокаспазы-8 в целом клеточном экстракте были более низкими (дорожка 1). Дополнительные меньшие полосы, соответствующие фрагментам активированной каспазы-8, появлялись после активации, т.е. дублет частично процессированной каспазы-8, соответствующий изоформам 1 и 2 (частично процессированной каспазы-8 р 41/43 без Sub-2), и меньшая полоса, соответствующая Sub-1 (p 20). Истощение незначительных количеств прокаспазы-8 и фрагментов активированной каспазы-8 с использованием mAb тестировали на лизатах стимулированных Fas-лигандом клеток(фиг. 2, дорожки 3, 5, 7, 9 и 11). Следует отметить, что истощение Sub-1 с использованием mAb 182, специфического к Sub-2, также тестировали, так как активированная каспаза-8 содержит Sub-1, связанную с Sub-2, и, следовательно,удаление Sub-2 иммунопреципитацией с использованием mAb 182 должно в результате приводить к истощению Sub-1. Иммунопреципитация каспазы-8 из стимулированных клеточных лизатов показывает, что mAb 182,- 28009956 183.1 и 183.2, так же, как и контроль сыворотки нормальных мышей (фиг. 2, дорожка 11), не удаляли небольшие количества оставшейся прокаспазы-3 или активных фрагментов каспазы-8 (дорожки 9, 7, 5 и 11, соответственно). В противоположность этим результатам, обработка клеточных лизатов mAb 179(дорожка 3) эффективно удаляла всю прокаспазу-8, а также активные фрагменты каспазы-8. Фиг. 3 а (Вестерн-блот-анализ) и 3b (детектирование белка окрашиванием серебром) показывают,что иммунопреципитированные прокаспаза-8 и активные фрагменты каспазы-8 с использованием антител mAb 179, 182 и 183.1 и 183.2 могли эффективно извлекаться в супернатант посредством конкуренции соответствующими пептидами, против которых были индуцированы разные антитела (пример 13). В нестимулированных клетках (фиг. 3 а, дорожки 2, 4, 6, 8 и 10 и фиг. 3b, дорожки 2, 3, 6, 8 и 10) прокаспаза-8 эффективно извлекается иммунопреципитацией с использованием mAb 179 и конкуренцией с пептидом 179 (фиг. 3 а и 3b, дорожка 8). В стимулированных клетках, несмотря на небольшое количество оставшейся после активации прокаспазы-8, иммунопреципитация антителами mAb 179 приводила к эффективному извлечению белка (фиг. 3 а и 3b, дорожка 9). Некоторое извлечение прокаспазы-8 можно было наблюдать в неактивированных клетках антителами mAb 183.2 (фиг. 3 а, дорожка 6) и в активированных клетках антителами mAb 183.1 (фиг. 3 а, дорожка 5), где активные фрагменты каспазы-8 могли извлекаться в лизатах активированных клеток антителами mAb 182 (фиг. 3 а, дорожка 3), 183.1 (фиг. 3 а,дорожка 5) и 183.2 (фиг. 3 а, дорожка 7 только р 20). Полученные результаты показывают, что mAb 179, полученный против пептида, соответствующего С-концу Sub-1 (эпитопа 179), является очень эффективным для иммунопреципитации и очистки прокаспазы-8, даже присутствующей в следовых количествах, а также для активированной каспазы-8. Поликлональное антитело, специфическое для того же самого эпитопа 179 (полученного, как описано в примере 1 выше), получали для исследования того, имеет ли этот эпитоп 179 уникальную способность индуцировать выработку антител, которые обычно могут быть использованы для эффективной иммунопреципитации и очистки прокаспазы-8 и активной каспазы-8. Сравнивали "истощенные лизаты",полученные иммунопреципитацией поликлональным антителом, специфическим для эпитопа 179 (дорожки 5 и 6 для активированных и неактивированных клеток, соответственно), или моноклональным антителом, специфическим для эпитопа 182 (дорожки 7 и 8 для активированных и неактивированных клеток, соответственно). Результаты на фиг. 4 ясно показывают, что, действительно, прокаспаза-8 и фрагменты каспазы-8 из лизатов стимулированных клеток также эффективно удаляются из клеточного лизата поликлональными анти-179-антителами и даже еще более эффективно, чем моноклональным анти-182-антителом. Параллельно иммунопреципитацию и извлечение прокаспазы-8 из лизатов покоящихся клеток,проводимые с mAb 183 и поликлональным антителом, специфическим для эпитопа 183 (описанного в примере 1), сравнивали с иммунопреципитацией и извлечением, получаемыми с mAb 179. Фиг. 5 показывает, что иммунопреципитация прокаспазы-8 антителом mAb 183 и поли-183 является неэффективной,тогда как иммунопреципитация прокаспазы-8 антителом mAb 179 является явно превосходной. Дополнительный полученный из каспазы-8 фрагмент приблизительно 5,6 кДа наблюдается только в иммунопреципитатах, получаемых с mAb 179 (дорожка 3). Антитела, полученные против области каспазы-8, которая соответствует С-концу большой субъединицы Sub-1 каспазы, имеют уникальную способность придания каспазе нового способа процессинга. Описанные выше результаты показывают, что эпитоп 179 каспазы-8, в отличие от других эпитопов,имеет особую способность вызывать образование специфических антител, которые являются очень эффективными для иммунопреципитации прокаспазы-8 и активированной каспазы-8 и способны индуцировать аутопроцессинг прокаспазы-8. Пример 6. Выделение и идентификация связывающего каспазу-8 полипептида (Cari). Вследствие его способности эффективно иммунопреципитировать каспазу-8, антитело mAb 179 использовали для коиммунопреципитации каспазы-8 и связанных с каспазой-8 белков. Клетки Bjab (Steinitz M., Klein G., 1975) стимулировали Fas-лигандом в течение 1 ч и клеточные лизаты получали из клеток до и после стимуляции. После иммунопреципитации и элюции, как описано в примере 13, извлеченные белки разделяли электрофорезом на SDS-ПААГ и детектировали окрашиванием серебром. Иммунопреципитация мышиным IgG1 служила в качестве отрицательного контроля. Результаты на фиг. 6 показывают, что полипептид с предположительной молекулярной массой приблизительно 72,5 кДа (называемый в описании р 72) копреципитируется с прокаспазой-8 (р 53/55) в лизатах из покоящихся клеток (дорожка 3), но не с активной каспазой-8 в лизатах из стимулированных клеток (дорожка 4). Кроме того, было обнаружено, что полипептид р 72 коиммунопреципитируется с прокаспазой-8 также в лизатах, полученных из нестимулированных клеток HeLa, Raji, H9, K562, HL-60, СЕМ и Hut78(АТСС). Эти результаты предполагают, что полипептид р 72 обычно связан с прокаспазой-8, но не с активной каспазой-8. Полосу в SDS-ПААГ, соответствующую р 72, вырезали, расщепляли трипсином и подвергали анализу ограниченных последовательностей и масс-спектроскопическому анализу. Полученные расщепле- 29009956 нием трипсином 7 пептидов использовали для поиска в базе данных белков, выведенных из нуклеотидных последовательностей (или EST). Белковая последовательность, соответствующая части предсказанной белковой последовательности EST-клона человека (SEQ ID NO: 1), обнаружена в банке генов (номер доступа gi/2988397/gbAAC08052.1/(АС 004475), функция которой была неизвестна. Пример 7. Получение полноразмерной кДНК, кодирующей р 72. Полноразмерную кДНК, кодирующую р 72, получали следующим образом.EST из примера 6 использовали для скрининга каталога генов человека TIGR, и было получено сообщение ТНС (SEQ ID NO: 1 ТНС 510568), содержащее консенсус всех EST, которые соответствуют этой последовательности. Клон ДНК, кодирующий часть предсказанного полипептида, покупали из Incyte Genomics (IMAGE 2964545). В этом клоне отсутствовали нуклеотидные последовательности, кодирующие первый метионин и 6 следующих аминокислот (т.е. 21 нуклеотид). Было обнаружено, что мышиные и человеческие последовательности указанных белков имеют высокое сходство (идентичность приблизительно 90%),поэтому нуклеотидные последовательности, кодирующие первый метионин и 6 следующих аминокислот мышиного белка, которые не отсутствуют в мышиных EST, сравнивали с рабочей предполагаемой последовательностью генома человека для дополнения отсутствующей последовательности человека. Получили совпадение, соответствующее последовательности клона LLNLR-232 Е 12 хромосомы 19 Homosapiens. Указанный клон подтвердил нуклеотидную последовательность, которая кодирует недостающие 7 аминокислот р 72. Полноразмерную кДНК р 72 получали двумя раундами ПЦР (использовали TakaraExTaq, Takara, catR001A), которые схематически представлены на фиг. 8. В первой ПЦР использовали клон, полученный из Incyte Genomics, в качестве матрицы с прямым праймером CTCAAGATGGACAACCGGGATGTTGCAGGAAAGG, синтезированным таким образом, что он содержит 15 (подчеркнутых) из 21 отсутствующего нуклеотида вместе с существующей последовательностью р 72 (фиг. 8, праймер 2), и обратным праймером CCACTCGAGTCAGTAGTAAGGCCGTCTGGGATT,содержащим 3'-область, заканчивающуюся стоп-кодоном (фиг. 8, праймер 3). Вторая ПЦР содержит в качестве матрицы ПЦР-продукт первого раунда ПЦР и прямой праймерAATGGATCCATGAGTCTCAAGATGGACAACCGGGA, содержащий все 21 отсутствующих нуклеотида и 5 существующих нуклеотидов (фиг. 8, праймер 1), и тот же самый обратный праймер (фиг. 8, праймер 3). Полную кДНК, кодирующую р 72, извлекали и секвенировали (SEQ ID NO: 2) и аминокислотную последовательность предсказывали из нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 3). Сравнение последовательности, полученной в сообщении ТНС (SEQ ID NO: 1 THC510568), содержащей консенсус всех EST, и полипептида, предсказанного с использованием полученной полноразмерной кДНК (SEQ ID NO: 3), на фиг. 13 показывает отсутствие 7 первых аминокислот в EST, отсутствие 25 аминокислотной последовательности в EST и неточность аминокислоты 397 (пролин вместо лейцина). Было обнаружено, что полипептид р 72 содержит три консервативных мотива (фиг. 7): мотив С,спиральный мотив, два тандемно расположенных 'SURP' (также называемых мотивами 'SWAP', обозначенных как S на фиг. 7) (Denhez F. and Lafyatis R., 1994) вблизи N-конца этого полипептида, и один локализованный на С-конце полипептида 'G-участок' (обозначенный как G на фиг. 7) (Aravind L. and KooninE.V., 1999). Авторы считают, что мотивы SURP и G-участок участвуют в связывании РНК, что предполагает, что мишенью р 72 может быть молекула РНК. Таким образом, р 72 был переименован в Cari (аббревиатура названия каспаза-8-ассоциированный полипептид с РНК-связывающими мотивами). Пример 8. Расщепление Cari каспазой-8. Как показано в примере 7, Cari связывается только с прокаспазой-8 и не связывается с активной каспазой-8, как было определено спустя 1 ч после стимуляции. Некоторое количество прокаспазы-8 еще может быть детектировано после 20 мин стимуляции. Для определения, может ли Cari копреципитироваться с прокаспазой-8 при более коротких периодах стимуляции, клетки Bjab, активированные в течение только 20 мин, лизировали и иммунопреципитировали mAb 179. После иммунопреципитации и элюции каспазу-8 и связанные полипептиды разделяли электрофорезом в SDS-ПААГ и полипептиды детектировали окрашиванием серебром. Одну полосу 72,5 кДа (фиг. 9, дорожка 3), очевидно, соответствующую Cari, иммунопреципитировали в лизатах из клеток перед стимуляцией, тогда как после 20 мин стимуляции, кроме Cari, детектировали полипептид с более низкой предположительной молекулярной массой приблизительно 68 кДа (фиг. 9, дорожка 4). Оба полипептида, 72,5 и 68 кДа, иммунопреципитированных из клеток Bjab, подвергали масс-спектроскопическому анализу. После трипсинизации оба полипептида проявляли сходный профиль пептидов, за исключением одного ясного различия, заключающегося в том, что дополнительный пептид последовательности FRPNPLNNPR (остатки 632-641) присутствовал в полипептиде 72,5 кДа (Cari) на С-конце, но отсутствовал в полипептиде 68 кДа. Полученный результат предполагает, что при стимуляции клеток фрагмент приблизительно 4,5 кДа удаляется из С-конца Cari, возможно, активированной каспазой-8, приводя к получению меньшего полипептида с предположительной молекулярной массой 68 кДа, который является все еще связанным с оставшейся прокаспазой-8. Возможно, что остаток D600, расположенный на С-конце Cari (фиг. 7), мог бы быть кандидатным остатком для расщепления, так как предположительные фрагменты, происходящие из такого расщепления,- 30