Система обнаружения полинуклеотидов

009302 Связанные заявки Заявка на данное изобретение заявляет преимущество предварительной заявки США 60/471827,поданной 20 мая 2003 г., которая включена здесь полностью посредством ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способам, композициям и системам анализа для обнаружения полинуклеотидов. Уровень техники Существует большая потребность в идентификации и количественном определении полинуклеотидов. Существующие способы идентификации мишеневых полинуклеотидов, таких как полинуклеотиды,связанные с патогенами, с патогенной инфекцией, со связанными с болезнями и нарушениями генами человека, с генетически модифицированными организмами (ГМО) (GMO), со средствами биологической борьбы, с применениями в ветеринарии и сельском хозяйстве, в настоящее время основаны на таких способах, как полимеразная цепная реакция (PCR), NASBA, ТМА или bDNA. Эти способы требуют квалифицированного персонала и специализированного оборудования. Соответственно, существует большая потребность в удобных и экономичных методах обнаружения, идентификации и количественного определения мишеневых полинуклеотидов. Данное изобретение удовлетворяет эту и другие потребности. Сущность изобретения В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в образце. В следующем аспекте один способ включает в себя следующие стадии. Аналог нуклеиновой кислоты, который связывается специфичным образом с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты мишеневого полинуклеотида в одну последовательность, и краситель, у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, объединяют так, чтобы получилась смесь. Скорость изменения оптической характеристики красителя в этой смеси сравнивают с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, содержащей известное количество гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством определнного мишеневого полинуклеотида в образце. В другом аспекте способ включает в себя следующие стадии: пептидная нуклеиновая кислота(PNA), которая связывается специфичным образом с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты мишеневого полинуклеотида в одну последовательность, и краситель, у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/PNA, объединяют так, чтобы получилась смесь. Скорость изменения оптической характеристики красителя в этой смеси сравнивают с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, содержащей известное количество гибрида мишеневый полинуклеотид/PNA, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством определнного мишеневого полинуклеотида в образце. В других аспектах аналог нуклеиновой кислоты может представлять собой замкнутую нуклеиновую кислоту (LNA), треозовую нуклеиновую кислоту (TNA) или сцепленную с металлом нуклеиновую кислоту. Скорость изменения оптической характеристики красителя может быть различной в присутствии и в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты и когда на смесь воздействуют световым стимулом. Образец может представлять собой ткань, совокупность клеток, клеточный лизат, очищенный полинуклеотид, или выделенный полинуклеотид, вирус, пробу окружающей среды, промышленную пробу,медицинскую пробу, пищевую пробу, агротехническую пробу, ветеринарную пробу, животноводческий образец, пробу воды, почвенную пробу, пробу воздуха, пробу, связанную со средством биологической борьбы, или пробу, связанную со средством сельскохозяйственной борьбы. В одном аспекте мишеневый полинуклеотид может представлять собой ДНК. В некоторых случаях мишеневый полинуклеотид может быть получен из тотальной клеточной ДНК, ядерной ДНК, митохондриальной ДНК, рибосомной ДНК, хлоропластной ДНК, или вирусной ДНК, плазмидной ДНК, искусственной ДНК, эпигеномной ДНК, эпигенетической ДНК, in vitro амплифицированной ДНК или из химерной ДНК. В другом аспекте мишеневый полинуклеотид может представлять собой РНК. В некоторых случаях РНК может быть получена из рибосомной РНК (rRNA), матричной РНК (mRNA), транспортной РНК(tRNA), защищенной РНК, вирусной РНК, микроРНК, siPHK, искусственной РНК или из химерной РНК. Мишеневый полинуклеотид может быть получен из организма. В одном варианте осуществления организмом может быть человек. В другом варианте осуществления организм может представлять собой патоген. В ещ одном варианте осуществления мишеневый полинуклеотид может происходить из пато-1 009302 гена, такого как вирус, бактерия или грибок. Неограничивающие примеры таких вирусов или бактерий включают в себя Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Brucellae, Vibrio cholera, Clostridium perfringes,вирус Эбола, Yersinia pesits, Coxiella burnetii, вирус оспы, вирус гепатита С, вирус гепатита В и вирус иммунодефицита человека. Аналог нуклеиновой кислоты может быть частично комплементарным мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты. Альтернативно, аналог нуклеиновой кислоты может быть полностью комплементарным мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты. Аналог нуклеиновой кислоты может иметь более чем примерно 4 нуклеотидных основания в длину и (или) менее чем примерно 24 нуклеотидных основания в длину. В следующем варианте аналог нуклеиновой кислоты может также иметь примерно 12 нуклеотидных оснований в длину. Аналог нуклеиновой кислоты или мишеневый полинуклеотид могут быть иммобилизованными на тврдом субстрате. Иммобилизация может осуществляться через нековалентное взаимодействие, такое как между биотином и стрептавидином. В следующем варианте аналог нуклеиновой кислоты может быть ковалентно связан с биотином. В ещ одном варианте нековалентное взаимодействие может представлять собой взаимодействие антиген-антитело. Аналог нуклеиновой кислоты или мишеневый полинуклеотид могут также быть ковалентно связаны с тврдым субстратом. В следующем аспекте краситель является цианиновым красителем. Примерами цианиновых красителей являются 3',3'-диэтилтиакарбоцианин йодид, 3',3'-диэтилтиадикарбоцианин йодид и 3',3'диэтилтиатрикарбоцианин йодид. Краситель может иметь более высокую скорость изменения оптической характеристики в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/мишеневый полинуклеотид, чем в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/мишеневый полинуклеотид. Альтернативно, краситель может иметь меньшую скорость изменения оптической характеристики в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/мишеневый полинуклеотид, чем в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/мишеневый полинуклеотид. Скорость изменения оптической характеристики красителя может быть определена измерением оптической характеристики красителя. Примеры таких оптических характеристик включают в себя спектральную поглощающую способность, флуоресценцию, отражательную способность или хемилюминесценцию. Оптическая характеристика может определяться за один или за несколько раз. В другом аспекте оптическую характеристику красителя измеряют множество раз. В следующем аспекте оптическая характеристика измеряется однократно. В дальнейшем аспекте изобретение направлено на способ обнаружения организма в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество организма в образце. В следующем аспекте изобретение направлено на способ обнаружения класса организмов в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце,причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество класса организмов. В ещ одном аспекте изобретение направлено на способ обнаружения штамма организма в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце,причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество штамма. В следующем аспекте изобретение направлено на способ обнаружения генетически модифицированного организма (GMO) в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество генетически модифицированного организма. Настоящее изобретение также направлено на способ обнаружения наличия болезненного состояния у субъекта посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида, причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на болезненное состояние. Настоящее изобретение также направлено на способ обнаружения наличия генетической вариации у субъекта посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида, причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на генетическую вариацию. В другом аспекте настоящее изобретение направлено на обнаружение заражения хозяина патогеном посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида, причм мишеневая нуклеиновая кислота является рибонуклеиновой кислотой (RNA) и присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на заражение хозяина патогеном. В другом аспекте изобретение направлено на способ обнаружения сингулярного нуклеотидного полиморфизма (SNP) в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество SNP. В другом аспекте изобретение направлено на способ обнаружения генетической последовательно-2 009302 сти в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество генетической последовательности. В другом аспекте изобретение направлено на способ обнаружения амплифицированной in vitro последовательности в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество амплифицированной in vitro последовательности. В другом аспекте изобретение направлено на способ обнаружения изменений пар оснований в образце посредством обнаружения присутствия или количества мишеневого полинуклеотида в этом образце, причм присутствие или количество мишеневого полинуклеотида указывает на присутствие или количество изменений пар оснований. Данное изобретение также направлено на способ обнаружения мишеневого полинуклеотида в двух или более образцах посредством обнаружения мишеневого полинуклеотида в первом образце в первом сайте мультисайтной конструкции с помощью первой молекулы аналога нуклеиновой кислоты и обнаружения мишеневого полинуклеотида во втором образце во втором сайте мультисайтной конструкции с помощью второй молекулы аналога нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулы аналога нуклеиновой кислоты иммобилизованы на тврдом субстрате. Способ включает в себя обнаружение двух или более последовательностей мишеневого полинуклеотида в двух или более образцах. Альтернативно, образцы могут быть иммобилизованы на тврдом субстрате. Настоящее изобретение также направлено на наборы для обнаружения мишеневого полинуклеотида. Набор может включать в себя один или более образцов, которые включают в себя мишеневый полинуклеотид, один или более аналогов нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, частично комплементарных мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты мишеневого полинуклеотида, и один или несколько красителей. Опционально, набор может включать в себя источник стимула. Набор может включать в себя инструкции по его использованию. Краткое описание чертежей На фиг. 1 изображена схематическая версия системы анализа с использованием PNA. На фиг. 2 показано структурное различие между молекулой ДНК и молекулой PNA образца. На фиг. 3 схематически представлена активируемая светом основанная на PNA система анализа. На фиг. 4 показана активируемая светом анализируемая реакция. Фиг. 5 изображает временной ход эмиссии 3',3'-диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя после экспозиции PNA и световому стимулу для различных концентраций мишеневого полинуклеотида. Фиг. 6 показывает процентное изменение эмиссии 3',3'-диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя для различных концентраций ДНК. На фиг. 7 сравнивается процентное изменение эмиссии 3',3'-диэтилтиакарбоцианин-йодидного красителя в тестируемом образце, когда для стимуляции использовались световые стимулы с различной длиной волны. На фиг. 8 сравнивается процентное изменение эмиссии красителя в образце ДНК из GMO сои и ДНК из не-GMO сои. На фиг. 9 изображен чувствительность анализа при изменении концентрации тестируемой ДНК с использованием источника света со смешанными длинами волн. Каждая линия показывает процентное изменение эмиссии красителя после экспозиции световому стимулу при различных концентрациях ДНК. В качестве PNA использовалась последовательность N' CACTGCTGCCTCCCCGTAG-Lys (SEQ IDNO: 1). Полинуклеотидной последовательностью являлась 5' CTACGGGAGGCAGCAGTG 3' (SEQ IDNO: 2). На фиг. 10 показано время, за которое наступает 20%-ное изменение эмиссии 3',3'диэтилтиакарбоцианин йодида при различных концентрациях мишеневого полинуклеотида. Фиг. 11 показывает процентное изменение эмиссии красителя в образце ДНК и образцах с различными концентрациями РНК. На фиг. 12 сравнивается процентное изменение эмиссии для 3',3'-диэтилтиакарбоцианин йодида в образце, содержащем PNA, и ДНК либо в отсутствие загрязнений в приготовляемой среде, либо в присутствии загрязнений в приготовляемой среде. Фиг. 13 показывает дополнение PNA клиньями. На фиг. 14A-D сравнивается эмиссия после применения волн различной длины для серий образцов. Фиг. 15 изображает иммобилизованные реакции во времени с помощью универсального бактериального PNA-зонда. На фиг. 16 показано обнаружение SRY человека. На фиг. 17 схематически представлено обнаружение аналогов нуклеиновой кислоты с использованием иммобилизации на поверхности и активирования светом. На фиг. 18A-D изображены различные схемы интродуцирования гибридов полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты. На фиг. 19 показано действие светового стимула с различными длинами волн.-3 009302 На фиг. 20 показано обнаружение различных концентраций ДНК сои. На фиг. 21 показано процентное изменение оптической характеристики от числа геномов GMOположительной сои. На фиг. 22 показано действие различных концентраций Tween-20. На фиг. 23 показано процентное изменение эмиссии при различных концентрациях Tween-20. На фиг. 24 сравниваются реакция с использованием PNA-зондов и реакция с использованием LNAзондов в жидком формате с различными концентрациями Tween-20. На фиг. 25 показано процентное изменение эмиссии с использованием PNAs в зависимости от эмиссии с использованием LNAs. На фиг. 26 показано обнаружение вируса гепатита С при использовании различных количеств вирусной РНК. Фиг. 27 показывает эмиссию различных копий плазмы через 1 мин после экспозиции световому стимулу. На фиг. 28 показано процентное изменение эмиссии при использовании бактерий и аналогов нуклеиновой кислоты, которые являются специфичными либо к бактериям, либо к HCV. На фиг. 29 показано процентное изменение эмиссии при использовании коротких аналогов нуклеиновой кислоты или соединнных вместе коротких аналогов нуклеиновой кислоты. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает способы, композиции и системы анализа для обнаружения полинуклеотида, имеющего мишеневую последовательность нуклеиновой кислоты, с помощью аналогов нуклеиновой кислоты.I. Общие методы. При реализации настоящего изобретения используются, если не указано иначе, традиционные методы молекулярной биологии (в том числе рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии, иммунологии, кинетики протеинов и масс-спектроскопии, которые хорошо знакомы специалистам. Такие методы во всей полноте описаны в литературных источниках, таких как MolecularGene Transfer Vectors for Mammaian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987 including supplements through May 1, 2004); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds.,1991); и Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999), которые все включены здесь полностью посредством ссылки. Кроме того, процедуры, в которых используются коммерчески доступные наборы для анализа и реагенты, как правило, осуществляются в соответствии с протоколами, предписанными производителями, если не оговорено иначе.II. Определения. Термин мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты, как правило, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, обнаруживаемой с использованием способов, композиций и систем анализа согласно изобретению. Вся или часть этой мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты может связываться с молекулой аналога нуклеиновой кислоты посредством аналогов специфичной гибридизации последовательности. Мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты может иметь любую длину, но, как правило, она имеет длину менее 1 тыс. оснований, менее 500 оснований, менее 24 оснований или менее 12 оснований. В следующем варианте осуществления мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты может быть длиной 10, 12, 14 или 18 оснований. В другом варианте осуществления мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты может быть длиной по меньшей мере 4,по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 18,по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 50 оснований. Мишеневая последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению может включать в себя последовательность, кодирующую протеин, и(или) некодирующую последовательность (например, регуляторные последовательности, интроны и т.д.). Термин полинуклеотид относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидам, либо к рибонуклеотидам, либо к их аналогам. Следующие примеры являются неограничивающими примерами полинуклеотидов: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мессенджерная РНК (mRNA), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды,разветвлнные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, нуклеиновые кислоты-зонды, праймеры и амплифицированная ДНК. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как мети-4 009302 лированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид также может быть модифицирован до или после полимеризации, например путм конъюгации с меченым компонентом. Полинуклеотид может представлять собой амплифицированную область в более длинном полинуклеотиде. Термин мишеневый полинуклеотид относится к полинуклеотиду, который включает в себя мишеневую последовательность нуклеиновой кислоты. Термин аналог нуклеиновой кислоты включает в себя любой аналог нуклеиновой кислоты,имеющий одно или более оснований, которые отличны от гуанина, тимидина, аденозина, цитозина или урацила, и (или) имеющий одно или более отличий в фосфорибозе скелета РНК или фосфодезоксирибозе скелета ДНК. Аналоги нуклеиновой кислоты включают в себя - но не ограничиваются ими - пептидные нуклеиновые кислоты (PNAs), замкнутые нуклеиновые кислоты (LNA), такие как раскрытые вTrends in Biotechnology 21:74-81, 2003, сцепленные с металлом нуклеиновые кислоты, модифицированные полинуклеотиды, такие как антрахинон-модифицированные (как раскрывается у Yamana et al., 2003),треозовые нуклеиновые кислоты (TNAs), такие как раскрытые у Chaput et al., Journal of the AmericanChemical Society, 125, 856-857, (2003), и химерные нуклеиновые кислоты. Термин пептидная нуклеиновая кислота, или PNA, включает в себя любой аналог нуклеиновой кислоты, у которого дезоксирибозо-фосфатный скелет нуклеиновой кислоты замещн синтетическим пептидоподобным скелетом, включающим в себя, например, блоки n-(2-аминоэтил)глицина, такие, без ограничений, как показанный на фиг. 2 (Nielsen et al., 1991), и такие, как раскрытые в патентах США 5786461; 6357163; 6107470; 5773571; 6441130; 6451968; 6228982; 5641625; 5766855; 5736336; 5719262; 5714331; 5719262 и 6414112. Пуриновые и пиримидиновые основания могут быть присоединены любой ковалентной связью, включая, например, метилен-карбонильные связи. В используемом здесь значении молекулы PNA могут иметь дополнительные атомы между PNA-скелетом и нуклеотидным основанием. Эти аналоги включают в себя, например, цепочки D-лизина, циклические структуры, такие как циклопентановые или пирролидиновые кольца, и (или) хиральные заместители, включая PNA-молекулы, описанные в патенте США 6403763, в патентной заявке США 2003/0162699 и в патентной заявке США 2003/0157500. Скелет PNAs может включать в себя замещения или вставки в пептидном скелете. PNAs могут включать в себя основанные на пептиде мимики (PENAMS), такие как раскрытые, например, в патенте США 5705333, атомы, имеющие необычные хиральные центры, такие как D-хиральные центры и квазихиральные центры, и замещения атомов в скелете PNA. Термины гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид и гибрид полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты являются синонимами и относятся к аналогу нуклеиновой кислоты и полинуклеотида, специфическим образом гибридизованных в последовательность. Термины гибрид PNA/полинуклеотид и гибрид полинуклеотид/PNA являются синонимами и относятся к PNA и полинуклеотиду, специфическим образом гибридизованных в последовательность. Комплементарная означает, что однонитевая молекула аналога нуклеиновой кислоты имеет способность связываться с полинуклеотидами специфическим образом основаниями. Молекула аналога нуклеиновой кислоты может быть синтезированной, чтобы связываться с мишеневым полинуклеотидом,таким как полинуклеотидная нить полной длины или е часть. Молекула аналога нуклеиновой кислоты,которая является комплементарной, может иметь одну или несколько единичных ошибочных для спаривания пар оснований, вставок и (или) делеций, но вс ещ оставаться способной связываться с мишеневым полинуклеотидом при выбранных условиях гибридизации. В одном варианте осуществления комплементарные последовательности могут гибридизоваться посредством Уотсон-Криковского (WatsonCrick) взаимодействия (А-Т или A-U и C-G). В следующем варианте осуществления комплементарные последовательности могут гибридизоваться посредством Hoogstein-спаривания оснований аналога нуклеиновой кислоты и нуклеотидными основаниями полинуклеотида. Под строгой комплементарностью подразумевается, что однонитевая молекула аналога нуклеиновой кислоты имеет способность связываться с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты и не содержит ошибочных для спаривания оснований. Молекула аналога нуклеиновой кислоты не является полностью комплементарной мишеневому полинуклеотиду, если будет иметься единственное несовпадение в спариваемых парах оснований между аналогом нуклеиновой кислоты и мишеневым полинуклеотидом. Термин скорость относится к изменению (например, свойства композиции или соединения). Скорость может быть описана в терминах определнной размерности скорости. Скорость может быть определена проведением изменений в течение периода времени. Скорость может быть описана проведением измерений, определяемых в двух временных точках процесса (например, до и после определнного стимула, добавления компонента и т.д.), или проведением измерений по меньшей мере в трх, по меньшей мере в четырх или по меньшей мере в пяти временных точках. Скорость может быть выражена количественными или качественными оценками (например, изменение является быстрым или медленным). Скорость может быть определена путм сравнения характеристики или состава с эталонной скоростью или посредством других методов. В используемом здесь значении термин относительная скорость относится к скорости одного-5 009302 процесса по сравнению со скоростью другого процесса. Относительная скорость может быть приблизительной (например, скорость одного процесса может быть быстрее или медленнее, чем скорость другого процесса) или качественной (например, сравнивая измеренные скорости двух процессов). В используемом здесь значении термин краситель относится к соединению, которое имеет измеряемую оптическую характеристику или которое может быть превращено в соединение с измеряемой оптической характеристикой. Измеряемые оптические характеристики включают в себя - но не ограничиваются ими - цвет, спектр поглощения, флюоресценцию, отражательную способность и хемилюминесценцию. Краситель может обнаруживать оптическое свойство в определнных условиях, таких как связывание с гибридом полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты или отсутствие связывания с гибридом полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты. Защищнная РНК (Armored RNA) относится к РНК, которая является устойчивой к рибонуклеазе благодаря капсидированию РНК в протеины бактериофагов. Защищенная РНК также описана,например, в патентах США 6399307; 6214982; 5939262; 5919625 и 5677124. Неспецифический полинуклеотид-переносчик в используемом здесь значении относится к немишеневым полинуклеотидным молекулам, которые увеличивают сродство к связыванию аналогов нуклеиновой кислоты с определнными мишеневыми полинуклеотидами и (или) усиливают чувствительность системы анализа. В используемом здесь значении термин сайт связывания аналога нуклеиновой кислоты относится к точке присоединения одной или более молекул аналога нуклеиновой кислоты к тврдому субстрату. В используемом здесь значении термин сайт связывания PNA относится к точке присоединения одной или более PNA молекул к тврдому субстрату. Образец относится к образцу жидкости любого типа (например, к крови, сыворотке, воде или урине) и (или) к тврдому образцу любого типа (например, к клеткам, пищевому продукту, льду, воздуху, грунту или зерну) и (или) образцу воздушной взвеси любого типа. Термин субъект относится к животному, такому как позвоночное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человек. Термин субъект также относится к растению. Термин патоген относится к любому агенту, вызывающему болезнь, нарушение и (или) к любому патологическому условию и (или) симптомам. К примеру, патоген может представлять собой организм(или ассоциированный с ним токсин), находимый в природе или создаваемый в лаборатории, который вызывает болезнь в каком-либо другом организме или развитие патологического условия или симптома в нм или понижает его жизнеспособность, ослабляет и (или) умерщвляет его. Патогены включают в себя без ограничения ими - вирусы, бактерии, грибки, эукариоты и (или) прокариоты, а также средства биологической борьбы, инфекционные болезни, находящиеся в воде патогены и пищевые патогены. Термин средство биологической борьбы относится к любому организму (или ассоциированному с ним токсину), находимому в природе или создаваемому в лаборатории, главная цель использования которого состоит в том, чтобы вызвать болезнь в каком-либо другом живом организме, понизить его жизнеспособность или умертвить его. Примеры средств биологической борьбы включают в себя - но не ограничиваются ими - патогенные бактерии, грибки, протозоа, риккетсии и вирусы. В используемом здесь значении термин заражение относится к присутствию патогена в хозяине. Заражение может быть в скрытой или острой форме. В одном варианте осуществления на присутствие патогена указывает изменение в экспрессии полинуклеотида и (или) полипептида в хозяине. Заражение может возникать такими путями - но не ограничиваясь ими - как воздушно-капельный, прямой контакт,перенос животными или насекомыми и заражнный пищевой продукт или напиток. В используемом здесь значении термин полинуклеотид, являющийся ответом хозяина относится к полинуклеотиду, который изменн, или к полинуклеотиду, экспрессия которого в хозяине изменяется в ответ на стимул, такой как инфекция и (или) контакт с патогеном. Термин хозяин в используемом здесь значении относится к животным и растениям. Животное может быть млекопитающим. Примеры млекопитающих включают людей, приматов, не являющихся людьми, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, мышей и крыс. Примеры растений включают в себя - но не ограничиваются ими - сельскохозяйственные культуры.III. Способы обнаружения полинуклеотидов. Настоящее изобретение обеспечивает способы, композиции и системы анализа для обнаружения полинуклеотида, содержащего мишеневую последовательность нуклеиновой кислоты, с помомщью аналогов нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления (i) образец, предположительно содержащий или предположительно не содержащий мишеневый полинуклеотид, (ii) аналог нуклеиновой кислоты, который связывается с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты этого полинуклеотида в последовательность специфичным образом, и (iii) краситель, у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, объединяются для получения смеси. Смесь может далее включать в себя неспецифический полинуклеотид-переносчик, такой как - но без ограничения - неспецифическая растительная ДНК, дрожжевая ДНК, ДНК спермы лосося или тРНК. Скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси сравнивается с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в-6 009302 подобной смеси, содержащей известное количество (включая нулевое количество) гибрида полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством мишеневого полинуклеотида в образце, чтобы определить присутствие или количество мишеневого полинуклеотида в образце. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы, композиции и системы анализа для обнаружения полинуклеотида, содержащего мишеневую последовательность нуклеиновой кислоты, с помощью молекулы пептидной нуклеиновой кислоты (PNA). В одном варианте осуществления (i) образец, предположительно содержащий или предположительно не содержащий мишеневый полинуклеотид,(ii) пептидная нуклеиновая кислота (PNA), которая связывается с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты этого полинуклеотида в последовательность специфичным образом, и (iii) краситель,у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида полинуклеотид/PNA, объединяются для получения смеси. Смесь может далее включать в себя неспецифичный полинуклеотид-переносчик, такой как - но не ограничиваясь им - неспецифичная растительная ДНК, дрожжевая ДНК, ДНК спермы лосося или тРНК. Скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси сравнивается с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, содержащей известное количество (включая нулевое количество) гибрида полинуклеотид/PNA, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством определнного полинуклеотида в образце, чтобы определить присутствие или количество мишеневого полинуклеотида в образце. Эталонное значение может представлять собой значение характеристики композиции или соединения, которое известно. Например, в различных выполнениях эталонное значение может быть определено,используя смесь, которая не содержит гибрида полинуклеотид/нуклеиновая кислота; содержит определнное количество (например, известное количество) гибрида полинуклеотид/нуклеиновая кислота; содержит нулевое количество гибрида полинуклеотид/нуклеиновая кислота; или реакционную смесь, в которой отсутствуют один или более компонентов (например, аналог нуклеиновой кислоты, мишеневый полинуклеотид или краситель). Следующие неограничивающие примеры эталонного значения включают в себя значение оптической характеристики смеси, которая не подвергалась световому стимулу или, в альтернативном выполнении, оптической характеристики смеси, которая подвергалась световому стимулу. Вышеупомянутые примеры приведены для иллюстрации и не направлены на ограничение изобретения, и другие примеры будут очевидными для специалиста-практика, руководствующегося приведнным здесь раскрытием. Должно быть понятным, что эталонное значение может быть, но необязательно должно быть, определено эмпирически (например, если известно, что оптические характеристики композиции, содержащей краситель, не изменяются или изменяются минимально в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, эталонное значение может быть вычислено или логически выведено, а не измерено). Эталонное значение может быть константой. Хотя в некоторых случаях может оказаться удобным подвергать анализу контрольный образец параллельно с тестируемыми образцами, делать так необязательно. Эталонное значение может быть определено в одной временной точке, это значение записывается для сравнения со значениями в более поздних временных точках. Будет понятно, что вышеупомянутые примеры даны для иллюстрации, но не для ограничения изобретения. Множество эталонных значений приводится по всему дальнейшему описанию изобретения. В одном аспекте эталонное значение представляет собой скорость изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, не содержащей гибрида полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления эталонное значение может быть охарактеризовано оптической характеристикой красителя до объединения всех компонентов в смесь. В другом варианте осуществления эталонное значение может быть стандартным значением. Для вариантов осуществления, в которых смесь подвергается световому стимулу, эталонное значение может являться оптической характеристикой красителя до применения светового стимула. Будет совершенно понятным, что эталонное значение необязательно определять одновременно с оптической характеристикой красителя в образце, аналоге нуклеиновой кислоты и окрашенной смеси. Кроме того, понятно, что эталонное значение может являться константой. Ссылка на характерный пример поможет в понимании изобретения. Основанная на жидкости версия этого способа с использованием PNA иллюстрируется в примере 1 и на фиг. 4. 10 мкМ молекул PNA,комплементарной 35S промотору вируса мозаики цветной капусты (35S PNA), и 1 мкМ 35S ДНК промотора (35S ДНК) смешивались в трубчатой микроцентрифуге и добавлялось 150 мкМ красителя. Трубка подвергалась световому стимулу, и по истечении 1 мин наблюдалось изменение цвета (фиг. 4) - изменение оптической характеристики красителя. В контрольных трубках мишеневый полинуклеотид отсутствовал, и цвет оставался розовым даже спустя 24 ч (без светового стимула), указывая на очень медленную скорость изменения оптической характеристики. В трубках, где либо отсутствует 35S PNA (трубка 3),либо отсутствует специфическая мишень (трубка 1), наблюдается небольшое изменение характеристики(в данном случае изменение цвета).-7 009302 Следующий пример, с использованием PNA-зонда, иллюстрируется на фиг. 1. А) Мембранную полоску с дискретно нанеснными PNA-последовательностями, комплементарными одной или более последовательностям мишеневого полинуклеотида, помещают в лизис/гибридизационную трубку 1. В) К лизис/гибридизационному буферу добавляют образец, и смесь нагревают до 95 С в течение 3 мин, и С) охлаждают до комнатной температуры. D) Полоску помещают в свежую трубку (трубка 2), в которой содержится промывочный буфер для инкубации. Несвязавшиеся ДНК, РНК и другой клеточный дебрис удаляются. Е) Полоска помещается в свежую трубку (трубка 3), содержащую обнаруживаемый краситель, где она инкубируется примерно в течение 1 мин. F) Содержимое трубки быстро промывается в буфере для промывки (трубка 4) для удаления остатка несвязавшегося красителя. G) В этой мембранной системе только краситель связывается с комплексами PNA/мишеневый полинуклеотид. На основании рисунка гибридизации можно определить присутствие конкретных мишеневых полинуклеотидов. Сравнивая изображения известных рисунков можно определить присутствие и идентифицировать вещество. Следующий пример иллюстрируется фиг. 22. 10 мкМ молекул PNA, комплементарной мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты, и 1 мкМ мишеневого полинуклеотида смешивались в трубчатой микроцентрифуге. Затем добавлялось 2 мкМ красителя и различные количества Tween-20. Трубки подвергались воздействию светового стимула, и через 10 мин наблюдалось изменение оптических характеристик (фиг. 22). Когда добавлялось более 1,0% Tween-20, наблюдалось небольшое изменение оптической характеристики для образцов, содержащих краситель и не содержащих гибрида мишеневый полинуклеотид/нуклеиновая кислота. Когда воздействию светового стимула подвергался образец, содержащий гибрид мишеневый полинуклеотид/нуклеиновая кислота, изменялась флюоресценция (или другая оптическая характеристика) красителя. Присутствие или количество мишеневого полинуклеотида обнаруживается наблюдением за изменением флюоресценции (или другой оптической характеристики). Будет понятно, что присутствие или количество полинуклеотида может быть определено посредством единичного измерения. В следующем варианте осуществления множество последовательностей аналога нуклеиновой кислоты может быть объединено в смесь для обнаружения множества мишеневых полинуклеотидов посредством одновременного множественного измерения. Описание мультиплексных реакций, включающих известные системы анализа нуклеиновых кислот, можно найти, например, в патенте США 5582989. Безотносительно к какому-либо конкретному механизму или теории, в одном аспекте изобретения гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид может катализировать химическую реакцию, в которую вовлечен краситель. Краситель связывается с малым желобком гибридов аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, который действует как каталитический сайт. Применение светового стимула добавляет энергию в смесь и вызывает изменение оптической характеристики красителя у гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид с большей скоростью, чем в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. Например, 3',3'-диэтилтиакарбоцианин йодид становится светлым при применении светового стимула. Более высокая скорость изменения оптической характеристики красителя соответствует повышенному содержанию мишеневого полинуклеотида в образце. В последующих разделах аспекты изобретения раскрываются более подробно. А. Конструирование последовательностей аналога нуклеиновой кислоты. Для использования согласно настоящему изобретению аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, чтобы быть комплементарными или строго комплементарными к последовательности нуклеиновой кислоты в мишеневом полинуклеотиде. В одном варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты имеет более примерно 4 нуклеотидов в длину, но менее примерно 24 оснований нуклеиновой кислоты в длину, исключая линкеры, аминокислоты и метки. В других вариантах осуществления аналог нуклеиновой кислоты может иметь длину 5-100, 8-60 или 10-25 оснований нуклеиновой кислоты. В следующем варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты может быть длиной примерно 8, 10, 12, 14 или 18 оснований нуклеиновой кислоты, исключая линкеры, аминокислоты и метки. В другом варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты может быть длиной по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 18, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 50 оснований. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь часть, которая не является комплементарной мишеневому полинуклеотиду, такую как последовательность, которая свешивается от конца полинуклеотида. Последовательность молекул аналога нуклеиновой кислоты может быть сконструирована множеством способов. К примеру - но не ограничиваясь им - молекулы аналога нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что они будут иметь последовательности, основанные на известных праймерах, используемых для PCR-амплификации и обнаружения специфических мишеневых последовательностей. Молекула аналога нуклеиновой кислоты также может быть сконструирована таким образом, что она будет комплементарной или строго комплементарной любой мишеневой последовательно-8 009302 сти нуклеиновой кислоты полинуклеотида. К примеру, последовательность молекулы аналога нуклеиновой кислоты может быть основана на последовательности PCR-праймеров, используемых для обнаружения полинуклеотидов, ассоциированных с патогенами, присутствия патогена в хозяине, гена болезни или генетического условия. Молекула аналога нуклеиновой кислоты также может быть комплементарной или строго комплементарной всей или части последовательности, кодирующей активные или функциональные домены протеина или интактного протеина, и (или) некодирующей последовательности (например, регуляторным последовательностям, интронам и т.д.). В одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть использованы для различения полинуклеотидов, имеющих строго комплементарную последовательность, и полинуклеотидов с единичным некомплементарным основанием. К примеру - но не ограничиваясь им - аналоги нуклеиновой кислоты для использования в данном изобретении могут быть сконструированы для обнаружения сингулярного нуклеотидного полиморфизма (SNPs). На гибридизацию аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид оказывает влияние некомплементарность оснований. В соответствии со способами по настоящему изобретению, при добавленном красителе некомплементарность одного основания между мишеневой последовательностью (например, SNP) и аналогом нуклеиновой кислоты приводит к различной скорости изменения оптической характеристики красителя по сравнению с аналогом нуклеиновой кислоты, в котором не имеется некомплементарностей. Идентификация SNPs для диагностики и других применений хорошо известна из уровня техники. В другом варианте осуществления аналог нуклеиновой кислоты может быть сконструирован для обнаружения присутствия или количества классов организмов. Под классом организмов подразумевается, что все организмы имеют одну или более последовательностей, которые комплементарны или строго комплементарны к последовательности аналога нуклеиновой кислоты. Такие классы организмов могут быть отличены от других организмов на основании комплементарности последовательностей нуклеиновых кислот. В другом варианте осуществления молекула аналога нуклеиновой кислоты имеет содержание пуринов, меньшее чем примерно 60%, и имеет максимум 4 пуриновых основания или три гуаниновых основания подряд. Обогащнные пуриновыми основаниями молекулы аналога нуклеиновой кислоты имеют тенденцию образовывать агрегаты и имеют низкую растворимость в водных растворах. Молекулы аналога нуклеиновой кислоты отбираются таким образом, чтобы минимизировать или избежать самокомплементарных последовательностей с инвертированными повторами, шпильками и палиндромами, так как эти типы зондов предрасположены к образованию агрегатов. Молекулы аналога нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться с полинуклеотидами в любой ориентации, но антипараллельная ориентация является предпочтительной. Антипараллельная ориентация является предпочтительной конфигурацией в антисмысловых применениях и применениях типа ДНКзондов. Когда ориентация аналога нуклеиновой кислоты является антипараллельной, зонд Nтерминального конца аналога нуклеиновой кислоты эквивалентен 5'-концу ДНК. В настоящем изобретении используются как N', так и 5' варианты. Любой специалист в данной области техники, руководствуясь приведнным здесь раскрытием, признает, что кроме конкретно перечисленных здесь аналогов нуклеиновой кислоты в способах согласно изобретению могут использоваться другие аналоги нуклеиновой кислоты (в том числе аналоги нуклеиновой кислоты, открытые или разработанные в будущем). Аналоги нуклеиновой кислоты, которые образуют гибрид полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты при определнных, описанных здесь условиях анализа, пригодны для применения в настоящих способах и влияют на скорость изменения оптической характеристики. Аналоги нуклеиновой кислоты, пригодные для применения в данных способах, могут быть идентифицированы при использовании любого из многих методов скрининга. В одном методе, к примеру - но не ограничиваясь им - образец, содержащий тестируемый аналог нуклеиновой кислоты, выборочно при различных концентрациях объединяется с полинуклеотидом, имеющим комплементарную последовательность, при условиях, в которых образуется гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В одном варианте осуществления затем добавляют краситель. После этого определяют скорость изменения оптической характеристики красителя. Эту величину сравнивают с эталонным значением скорости изменения оптической характеристики красителя в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В другом варианте осуществления эталонное значение является признаком отсутствия полинуклеотида. В ещ одном варианте осуществления эталонное значение является признаком присутствия мишеневого полинуклеотида (однонитевого или двунитевого). Следует признать, что порядок введения добавок не является категорическим, и компоненты могут добавляться в другом порядке. В другом варианте осуществления эталонное значение является показателем ненулевой концентрации полинуклеотида. В этом выполнении для использования в заявленных способах отбираются гибриды аналоги нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, проявляющие различную скорость изменения оптической характеристики во времени по сравнению с эталонным значением (например, присутствие двунитевого полинуклеотида, но отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид). Относительную скорость изменения оптической характеристики коррелируют с присутствием или количеством опреде-9 009302 лнного полинуклеотида. В. Пептидные нуклеиновые кислоты (PNAs). В одном аспекте аналогами нуклеиновой кислоты являются PNAs. PNA гибридизуется со всей или с частью мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты в мишеневом полинуклеотиде путм специфичной последовательной гибридизации. Альтернативно, условия можно изменить таким образом, что можно выявить изменение в одной паре оснований.PNA-молекулы могут быстро гибридизоваться с мишеневыми полинуклеотидами. ГибридизацияPNA с полинуклеотидами является независимой от концентрации солей (Demidov et al., 1994). PNAs устойчивы к нуклеазной и протеазной атаке и связываются с полинуклеотидами более специфично, чем обычные ДНК-зонды. Короткие зонды можно использовать с большими последовательностями специфически (Ray and Norden, 2000). Кроме того, гибриды PNA/полинуклеотид имеют более высокую термальную стабильность, чем соответствующие гибриды ДНК/полинуклеотид, и точка плавления гибридовPNA/полинуклеотид относительно нечувствительна к ионной силе, показывая равную термальную стабильность при низких (10 мМ NaCl) и умеренных (500 мМ NaCl) солевых концентрациях. Эта способность гибридов PNA/полинуклеотид образовываться при низких солевых концентрациях является существенной, поскольку внутренняя структура dsPHK и rPHK в значительной мере нестабильна при солевых концентрациях ниже 200 мМ. Следовательно, можно выбирать условия, благоприятные для разрыва мишеневой нуклеиновой кислоты и, в то же время, способствующие сильной гибридизации PNA-молекул(Stefano and Hyldig-Nielsen, 1997). На PNA/полинулеотид-гибридизацию очень сильно влияет некомплементарность оснований, и PNA-молекулы могут поддерживать различимость вплоть до уровня единичной некомплементарности.PNA-молекулы можно приобрести, например, у Eurogentec (UK), Blue Heron Biotechnology (Bothell,WA) и Applied Biosystems Inc. (ABI) или синтезировать методами, известными в данной области техники. С. Условия гибридизации. Обычно, метод и (или) выбор условий гибридизации регулируется параметрами, такими - без ограничения - как степень комплементарности молекулы аналога нуклеиновой кислоты мишеневому полинуклеотиду, длина используемой молекулы аналога нуклеиновой кислоты и самого мишеневого полинуклеотида. Предпочтительные условия гибридизации дают одну или более из следующих возможностей: эффективное связывание аналогов нуклеиновой кислоты с мишеневыми полинуклеотидами, минимизация вторичной структуры РНК или ДНК, минимизация деградации РНК и либо ограничение одного или более изменения пар оснований, либо включение одного или более изменения пар оснований. Реакции гибридизации могут быть осуществлены при условиях различной строгости. Условия,которые влияют на строгость реакции гибридизации, широко известны и опубликованы в уровне техники. См., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook et. al., 2000) ColdSpring Harbor Press. Примеры соответственных условий включают в себя - но не ограничены ими - солевые концентрации, рН (буферы) и температура. Гибридизационные условия с использованием более низких солевых концентраций обычно увеличивают нестабильность ДНК и стабильность гибридаPNA/полинуклеотид. Примеры буферов, которые могут быть использованы, включают в себя - но не ограничены ими - Na3PO4, NaHSO4, K2HPO4, K2SO4 или CaSO4. К примеру, молярность буферов может изменяться между примерно 10 мМ и примерно 0,5 М, и они могут иметь рН между примерно 4 и примерно 10 или между примерно 7 и примерно 10, такой как примерно 7,0 или примерно 7,5. Например,Na3PO4 может использоваться между примерно 0,5 мМ и примерно 0,5 М, например 2,5 мкМ, и при рН между примерно 4 до примерно 10 или между примерно 7 и примерно 10, таком как, например, примерно 7,0 или примерно 7,5. Примеры образцов условий включают в себя - но не ограничиваются ими - (в порядке увеличения строгости): температуры инкубации 25, 37, 50 и 68 С; концентрации буфера 10 X SSC, 6 X SSC, 4 X SSC,1 X SSC, 0,1 X SSC (где SSC составляет 0,15 М NaCl и мкМ любого буфера, которые здесь описываются) и их эквиваленты, использующие другие буферные системы; концентрации формамида 0, 25, 50 и 75%; время инкубации от 5 мин до 24 ч; 1, 2 или более стадий промывки; время промывочной инкубации 1, 2 или 15 мин; и растворы для промывки 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC или деионизированная вода. В предпочтительном варианте осуществления гибридизация и условия промывки осуществляются при высокой строгости. Например, гибридизация может быть проведена при 50%-ном формамиде и концентрации буфера 4 X SSC с последующими промывками в растворе 2 X SCC/формамид при 50 С и 1 х SSC. Буферы могут содержать ионы или другие соединения, или другие буферные компоненты. Альтернативно, компонент в буфере может иметь стабилизационную способность; например, неомицин или другие аминогликозиды, которые стабилизируют триплексную ДНК (Arya et al., 2003) или нафтален диимиды, которые увеличивают стабильность триплекса (Gianolio and McLaughlin, 2001), или нафтилхинолиновые димеры (Keppler et al., 1999).D. Красители. Присутствие или количество полинуклеотида можно определить, используя один или более красителей, у которых скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии гибрида ана- 10009302 лог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид по сравнению с известной концентрацией гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В одном аспекте изменение оптической характеристики может представлять собой изменение цвета, спектра поглощения, флюоресценции, отражательной способности или хемилюминесценции. Оптическая характеристика во время анализа может измеряться за один или за множество примов. Скорость изменения оптической характеристики красителя можно сравнить с эталонным значением показателя скорости изменения оптической характеристики красителя в смеси, содержащей известное количество гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид или гибрида полинуклеотид/PNA, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Эталонное значение может быть качественной или приблизительной величиной (например, наличие или отсутствие цвета). Альтернативно, эталонное значение может быть численной величиной. В другом примере эталонное значение может быть измерено или определено до, во время или после определения скорости изменения оптической характеристики красителя в образце. В следующем примере эталонное значение может быть постоянной, такой как константная скорость. Эталонное значение может также представлять собой скорость изменения оптической характеристики красителя в отсутствие мишеневого полинуклеотида или гибридов полинуклеотид/нуклеиновая кислота (т.е. известное количество гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид равно нулю). В некоторых случаях краситель имеет более высокую скорость изменения оптической характеристики красителя в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, чем эталонное значение показателя характеристики в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. Присутствие или количество полинуклеотида может, таким образом, быть обнаружено по увеличению относительной скорости изменения оптической характеристики сравнительно с эталонным значением. Примеры красителей, у которых оптическая характеристика изменяется более быстро в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/ДНК, включают в себя карбоцианиновые красители, которые являются полициклическими ароматическими соединениями. Эти красители интенсивно поглощают видимый спектр и связываются предпочтительно с гибридами аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид в растворе, изменяя цвет при связывании. Примеры цианиновых красителей включают в себя - но не ограничиваются ими - 3',3'-диэтилтиацианин йодид, 3',3'-диэтилтиакарбоцианин йодид, 3',3'-диэтилтиадикарбоцианин йодид и 3',3'-диэтилтиатрикарбоцианин йодид. В одном варианте осуществления при описываемых здесь условиях анализа 3',3'диэтилтиакарбоцианин йодид изменяет свою окраску от ярко-розовой до бесцветной при световом стимуле в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот и комплементарной PNA. В отсутствие мишеневых нуклеиновых кислот скорость изменения цвета красителя более медленная. Световой стимул также уменьшает флуоресцентное свечение красителя в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот и комплементарной PNA. В отсутствие светового стимула краситель сразу же изменяет окраску с ярко-розовой на темно-розовую в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот, а флуоресцентное свечение сразу же уменьшается в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот. При описываемых здесь условиях анализа 3',3'-диэтилтиадикарбоцианин йодид изменяет свою окраску с голубой на пурпурную в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот. При описываемых здесь условиях анализа 3',3'-диэтилтиатрикарбоцианин йодид сохраняет цвет морской воды в присутствии мишеневых нуклеиновых кислот и становится бесцветным в отсутствие мишеневых нуклеиновых кислот. В других случаях краситель имеет более низкую скорость изменения оптической характеристики в присутствии гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, чем в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. Присутствие или количество полинуклеотида может, таким образом,быть обнаружено по уменьшению относительной скорости изменения оптической характеристики сравнительно с эталонным значением показателя величины в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. Краситель может быть выбран из, например, молекул, которые соединяются с нуклеиновыми кислотами любым из множества способов. Полезные красители включают в себя такие, которые связываются с малыми желобками, с большими желобками, интеркаляторы и другие полинуклеотидсвязывающие молекулы, их производные и конъюгаты с ними. Некоторые красители, полезные в способах согласно настоящему изобретению, связываются с малым желобком гибридов аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. Эти красители включают в себя карбоцианиновые красители, такие как 3',3'диэтилтиакарбоцианин йодид, 3',3'-диэтилтиадикарбоцианин йодид и 3',3'-диэтилтиатрикарбоцианин йодид. Примеры включают в себя - но не ограничиваются ими - этидий бромид (Fiebig et al., 1999), флуоресцин, фенотиазиновые красители, такие как метиленовый синий (Wagner, 2002), DAPI (Kapuscinski,1995), тиазоловый оранжевый (Boger and Tse, 2001, Carreon et al., 2004), Hoechst 33258 (Adhikary et al.,2003, Maiti et al., 2003, Morozkin et al., 2003, Tanious et al., 2004, Tawar et al., 2003), SYBR Green II(Morozkin et al., 2003), BEBO, ВЕТО, BOXTO, BO, BO-PRO, TO-PRO, YO-PRO (Karlsson et al., 2003,Eriksson et al., 2003), PicoGreen (Tolu and Myers, 2003), TO-PRO-3 (Sovenyhazy et al., 2003), бисцианиновый краситель (Schaberle et al., 2003), метил-гринпиронин Y (Prento and Lyon, 2003), этидий бро- 11009302 мид и акридиновый оранжевый (Johnson et al., 2003, Lauretti et al., 2003, Luedtke et al., 2003), нейтральный красный (Wang et al., 2003), BO (Karlsson et al., 2003), моно- и бис-лекситропсины и пентамидин (Puckowska et al., 2004), 2-(метилтио)фенилсалицилальдимин Schiff-щелочной медистый (II) (Reddy et al.,2004), бифункциональный платиновый (II) комплекс (Ма and Che, 2003), бис(9-аминоакридин-4 карбоксиамиды) (Wakelin et al., 2003), бис-имидазоакридоны (Tarasov et al., 2003), карбоксиамидсвязывающиеся параллельно или антипараллельно с малыми желобками (Boutorine et al., 2003), конъюгаты олиго(2'-О-метилрибонуклеотидов) со связывающимися с малыми желобками (Novopashina et al.,2003), пирролимидазол полиамины (Briehn et al., 2003, Dervan and Edelson, 2003, Reddy et al., 2003, Renneberg and Dervan, 2003), пиррол (Huang et al., 2000), бис-пиррол (Carrasco et al., 2003), рутениевый комплекс (Kuwabara et al., 2003), таллий (Ouameur et al., 2003), ароматический диамидин (Nguyen et al.,2002), шартрезин (Barcelo et al., 2002), платиновый комплекс (Silverman et al., 2002), S-3-нитро-2 пиридинсульфенил-N-ацетил-цистеин (Shim et al., 2004), эфиры метилсульфоната (Varadarajan et al.,2003), пептидный бис-интеркалятор (Guelev et al., 2001), металлоинтеркаляторы (Proudfoot et al., 2001),2,2'-бинафтален (Kondo et al., 2004), интеркалирующие нуклеиновые кислоты (Christensen and Pedersen,2002, Nielsen et al., 2004), рутениевый (II) комплекс (Liu et al., 2004), комплекс неотриен/медистый (II) циклического полиамина (Biver et al., 2004), антрахинон 2,6-дисульфоновой кислоты (Wong and Gooding,2003), ферроценил антрацен, ферроценил и другие производные нафталендиимида (Gianolio andal., 2003), акридин-9-илтиомочевая кислота (Baurah and Bierbach, 2003), нафтален димид (Nojima et al.,2001, Nunez et al., 2000), митоксантрон (Wang et al., 2003), криптолепин и неокриптолепин (Guittat et al.,2003), связанные с иминодиуксусной кислотой полиамиды (Woods et al., 2002), дендритовые полиаминовые конъюгаты (Brana et al., 2002), дельта-дельта бис-интеркалятор [mu-C49cpdppz(2)-(phen)(4)Ru(2)](Inoue et al., 1999), 5,6-кризенхинон дииминовые комплексы родия (III) (Jackson and Barton, 2000), синийNile (Chen et al., 1999), узамбарензин (Dassonneville et al., 1999), 3-метозибензантрон (Yang et al., 1999),1,8-дигидроксиантрахиноны (Mueller and Stopper, 1999), циклопропапирролоиндол (Dempcy et al., 1999),антрацен (Ostaszewski et al., 1998), пирролизины и имидазолы (Atwell et al., 1998), антрациклиновые комплексы (Milano et al., 1998), гетеродимеры, такие как атизоловый оранжевый - тиазоловый синий, тиазоловый оранжевый - этидий и флуоресцин - этидий (Benson et al., 1993a, Benson et al., 1993b). Кроме того,компании (например, Molecular Probes) многие виды препаратов нуклеиновых кислот, которые могут быть совместимы с данной системой анализа. Другие классы цианиновых красителей и стандартных красителей для реакций можно найти в Journal of the American Chemical Society 125:4132-4145 (2003) и вBioconjugate Chemistry 13:387-391 (2002). Примеры других красителей включают в себя - но не ограниваются ими - триадные комплексы меди (II) (Dhar et al., 2003), дистамицин A (Hiraku et al., 2002, Woods etal., 2002), индоло[2,3-b]хинолизин бромид (Viola, 2002), эктейнасцидины (Anthoney and Twelves, 2001),металл амины (Bary et al., 2002) или 2-ферилхинолинкарбокиднатные гибриды (Toshima et al., 1999). В некоторых вариантах осуществления краситель не является соединением, вызывающим расщепление. Красители также могут включать в себя малахитовый зелный, красный двумышьяковистый и флуоресцин. В некоторых вариантах осуществления красители не являются малахитовым зелным, красным двумышьяковистым и флуоресцином. Специалист в данной области техники поймт, что красители можно скринировать, чтобы идентифицировать те из них, которые могут быть использованы в рассматриваемых способах. Красители, которые связываются с гибридами аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид и обнаруживают изменение оптической характеристики во времени, опционально, после обработки стимулом, можно легко идентифицировать и отобрать. Специалист в данной области техники, руководствуясь данным раскрытием, признает, что дополнительно к перечисленным здесь красителям в этих способах могут быть использованы другие красители(в том числе красители, открытые или разработанные в будущем). Красители, у которых скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты, при описанных здесь условиях анализа пригодны для рассматриваемых способов. Подходящие красители могут быть идентифицированы с помощью любого из множества способов скрининга. Например - но не ограничиваясь этим - образец, содержащий аналог нуклеиновой кислоты,объединяют с полинуклеотидом, имеющим комплементарную последовательность, при условиях, в ко- 12009302 торых образуется гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В одном варианте осуществления затем добавляют заданный краситель, в различных выбранных концентрациях. Порядок добавления компонентов не является категорическим, и они могут добавляться в другом порядке. Затем определяется скорость изменения оптической характеристики во времени. Эту величину сравнивают с эталонной величиной показателя изменения оптической характеристики в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид. В одном варианте осуществления эталонное значение является показателем отсутствия полинуклеотида. В одном варианте осуществления эталонное значение является показателем присутствия полинуклеотида (однонитевого или двунитевого). В другом варианте осуществления эталонное значение является показателем ненулевой концентрации полинуклеотида. Красители, которые обнаруживают разную скорость изменения оптической характеристики во времени по сравнению с эталонным значением, отбираются для использования в заявленных способах. Относительную скорость изменения оптической характеристики коррелируют с присутствием или количеством определнного полинуклеотида.E. Световой стимул. Световой стимул может быть применн к образцу, аналогу нуклеиновой кислоты и окрашенной смеси либо одновременно с изготовлением смеси, либо в определнное время после изготовления смеси. Световой стимул вызывает изменение скорости изменения оптической характеристики красителя. Световой стимул может относиться к видимой части спектра или к невидимой части спектра. Световой стимул может быть белым светом со множеством волн разной длины. Альтернативно, световой стимул может представлять собой свет определнной длины волны или диапазона длин волн. Световой стимул может также иметь определнную интенсивность. Источники света известны в уровне техники. Различные источники света приводят к разным скоростям реакций из-за различия в интенсивности или длине волны источника света. Примеры источников света в порядке возрастания скорости реакции включают в себя Sylvania Cool White T-8CW, General Electric T8-C50 и Fritz Aurora 50/50. Другие источники света включают в себя Sylvania dulux S9W CF9DS/blue и Osram F9TT/50K, которые оба ведут к более быстрой стимуляции скоростей реакции, чем General Electric T8-C50. Специалист в данной области техники поймт, что оптимальный световой стимул может быть определн без чрезмерного экспериментирования для определнного красителя или для определнного аналога нуклеиновой кислоты, полинуклеотида и окрашенной смеси.IV. Создание гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты. Анализы для обнаружения мишеневых полинуклеотидов могут выполняться с использованием множества гибридизационных схем. В одном формате полинуклеотидная последовательность может быть идентифицирована по гибридизации мишеневого полинуклеотида непосредственно с аналогом нуклеиновой кислоты для создания гибрида мишеневый полинуклеотид/аналог нуклеиновой кислоты. В одном формате аналогом нуклеиновой кислоты может быть PNA. PNA/PNA имеет расстояние,которое отличается от расстояний в ДНК/ДНК и от расстояний в PNA/ДНК. Детальная структура дуплексных гибридов PNA/PNA и PNA/ДНК различается с помощью ЯМР и рентгеновской кристаллографии. Дуплексные гибриды PNA/PNA имеют очень широкий и глубокий главный желобок и очень узкий и мелкий малый желобок, и дуплексы имеют очень большой шаг в 18 пар оснований на виток спирали и большую высоту шага (56,6). Каноническая спираль В-формы, видимая для дуплексного гибрида ДНК/ДНК, имеет шаг в 10 пар оснований на виток и высотой 34, в то время как гибридный дуплексPNA/ДНК имеет шаг в 13 пар оснований на виток и высотой 42. Поскольку пары оснований в дуплексном гибриде PNA/ДНК обладают иной геометрией по сравнению с двойной спиралью ДНК, ожидается,что сила стэкинг-взаимодействия в дуплексных гибридах PNA/ДНК отличается от таковой в дуплексных гибридах ДНК/ДНК. Предполагается, что CD-спектры 10, 12 и 16 mer дуплексных гибридов PNA/ДНК отличаются и конфигурацией своих оснований. В зависимости от красителя и сайта его связывания на гибриде аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид можно влиять на прохождение реакции. Например, красители, которые связываются с главным или малым желобком гибрида, могут требовать, чтобы гибрид содержал определнное количество пар оснований для эффективного связывания. Минимальное количество пар оснований может быть легко определено специалистом в области техники. В одном аспекте молекула аналога мишеневой нуклеиновой кислоты комплементарна к частично комплементарному аналогу нуклеиновой кислоты. Аналог нуклеиновой кислоты гибридизуется как с молекулой аналога нуклеиновой кислоты, так и с мишеневым полинуклеотидом, как изображено на фиг. 18 А. Это может быть осуществлено в одну стадию или в многостадийном процессе. В одностадийном процессе мишеневый полинуклеотид и аналоги нуклеиновой кислоты объединяются в одном шаге. В многостадийном процессе мишеневый полинуклеотид и аналоги нуклеиновой кислоты объединяются последовательно. В следующем аспекте присутствие мишеневого полинуклеотида может быть обнаружено созданием разветвлнной крестообразно реакционной структуры, пример которой изображен на фиг. 18 В. В этом формате мишеневый полинуклеотид гибридизуется с двумя промежуточными полинуклеотидами, кото- 13009302 рые частично комплементарны мишеневому полинуклеотиду. Промежуточные полинуклеотиды образуют разветвлнные структуры, которые гибридизуются с мишеневым полинуклеотидом и первичной молекулой аналога нуклеиновой кислоты. Гибридизующиеся с мишенью области промежуточных полинуклеотидов могут быть сконструированы таким образом, чтобы они были слишком короткими для того,чтобы краситель связывался с молекулой аналога нуклеиновой кислоты отдельно, но достаточно большими для того, чтобы связываться с молекулами аналога нуклеиновой кислоты при гибридизации. Затем может быть определена величина оптического изменения красителя. В одном варианте осуществления единичная молекула аналога нуклеиновой кислоты может являться универсальным аналогом нуклеиновой кислоты, который используется для всех анализов и оптимизирован для эффективных изменений оптической характеристики красителя. Универсальный аналог нуклеиновой кислоты можно было бы использовать для любой мишеневой нуклеиновой кислоты, а промежуточные последовательности могли бы меняться. Эта схема может быть адаптирована к формату с помощью иммобилизованного аналога нуклеиновой кислоты. В другом формате множество молекул аналога нуклеиновой кислоты образуют гибрид аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид со смежными областями мишеневого полинуклеотида. В этом формате каждая молекула аналога нуклеиновой кислоты является слишком короткой для того, чтобы краситель связывался и приводил к изменению величины оптической характеристики красителя, но множество молекул аналога нуклеиновой кислоты может обеспечить достаточно большую область, чтобы привести к изменению величины оптической характеристики. Как изображено на фиг. 18 С, мишеневый полинуклеотид, как единичная молекула, может связываться с образованием дуплекса аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид с помощью трх отдельных молекул аналога нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются смежными последовательностями. Однако если центральная молекула аналога нуклеиновой кислоты не может гибридизоваться как показано на фиг. 18D, тогда изменение оптической характеристики наблюдать нельзя. В этом формате одна из молекул аналога нуклеиновой кислоты может быть иммобилизованной.V. Определение количества мишеневого полинуклеотида. Рассматриваемые способы, композиции и системы могут быть использованы для определения количества мишеневого полинуклеотида в образце. В одном варианте осуществления количество мишеневого полинуклеотида может быть обнаружено путм осуществления серийных разведений молекулы аналога нуклеиновой кислоты добавлением разных количеств образцов мишеневого полинуклеотида и сравнения образцов с контрольными образцами известной концентрации. В другом варианте осуществления количество мишеневого полинуклеотида может быть обнаружено осуществлением серийных разведений мишеневого полинуклеотида добавлением разных количеств молекул аналога нуклеиновой кислоты и сравнением образцов с контрольными образцами известной концентрации. Альтернативно, количество мишеневого полинуклеотида может быть обнаружено измерением кинетики анализа, основанной на времени. Измерения красителя в объединнной смеси проводятся через периодические интервалы времени после приготовления смеси или после применения светового стимула. Краситель может быть обнаружен в разное время после приготовления смеси или после применения светового стимула. Время может быть временным периодом, например, общим временем для изменения оптической характеристики, или временем, необходимым для того, чтобы оптическая характеристика изменилась на определнный процент, такой как - но не ограничиваясь им - примерно 20%. Реакции могут быть заморожены (дальнейшее изменение прекращается), например, добавлением растворителей,таких как 20%-ный метанол, 15%-ный изопропанол, 15%-ный DMSO или 10%-ный бутанол. Реакция может также включать в себя ряд буферов и растворителей. Эти буферы и растворители включают в себя фосфатные буферы, воду, 0,1%-ный SDS, 0,1%-ный Triton X, 0,1%-ный Tween-20,3%-ный бутанол, 10%-ный метанол, 10%-ный изопропанол, 10%-ный DMSO, 1X кровяной лизисный буфер (0,15 М NH4Cl, 10 мМ NaHCO3, 0,1 мМ EDTA рН 7,4) и сахарозный лизисный буфер (0,32 М сахарозы, 10 мкМ Tris, 1%-ный Triton Х-100, 5 мМ MgCl2). Количество полинуклеотида в образце может быть определено после его экспозиции световому стимулу. Изменение оптической характеристики красителя может быть измерено до начала экспозиции световому стимулу - для стартовой световой характеристики. Измерения могут быть проведены в другое время (например, через 30-секундные интервалы) после экспозиции световому стимулу. Реакции могут быть заморожены (дальнейшее изменение прекращается), как описано выше. Изменения в образце благодаря экспозиции световому стимулу может наблюдаться несколькими способами. Изменение оптической характеристики может наблюдаться как изменение цвета, спектра поглощения, флуоресценции, отражательной способности, хемилюминесценции или их комбинации. Альтернативно, изменение оптической характеристики может быть считано с помощью считывающего устройства. Это изменение измеряется с использованием спектрофотометра, такого как Tecan Genios илиTecan Safire. Можно наблюдать определнную длину волны, например, с помощью фильтра. Положительный контроль показывает изменение спектра поглощения быстрее, чем негативный тест. Он может быть измерен как разность скоростей изменения или различия в изменении за определнное время. Если используется световой стимул и наблюдаются показатели флуоресценции, световой стимул, обеспечи- 14009302 ваемый образцу, будет более высоко энергетическим (низкая длина волны), чем наблюдаемая эмиссия. Возбуждение может быть, например, при 535 нм, а эмиссия может читаться при 590 нм. Флуоресценция может быть измерена как разница в скорости изменения или разница в изменении в установленное время. Кроме того, смесь может иметь изменения, которые происходят до экспозиции световому стимулу. Эти различия могут наблюдаться либо в спектрофотометрической системе, либо в системе флуоресцентной эмиссии, либо в хемилюминесцентной системе.VI. Форматы анализа. А. Жидкостные системы анализа. Как продемонстрировано в примерах 1-4, способы и системы анализа для обнаружения мишеневого полинуклеотида могут быть основаны на жидкости. Образец, аналог нуклеиновой кислоты, который связывается с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты полинуклеотида в последовательность специфичным образом, и краситель, у которого скорость изменения оптической характеристики различна в присутствии и в отсутствие гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, объединяются, чтобы приготовить смесь в жидком растворе. Скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси сравнивается с эталонным значением показателя изменения оптической характеристики красителя в подобной смеси, содержащей известное количество гибрида аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, чтобы определить относительную скорость изменения оптической характеристики. Относительную скорость изменения оптической характеристики красителя в смеси коррелируют с присутствием или количеством определнного полинуклеотида в образце для определения присутствия или количества полинуклеотида в образце. Способ и система анализа могут также быть осуществлены в любом сосуде, таком как микроцентрифужные трубки, тестовые пробирки и чипы, в которых жидкость удерживается поверхностным натяжением. Способы и система анализа могут также быть осуществлены в многолуночных микропланшетах. Планшеты могут содержать любое количество лунок. В одном формате используется 96-луночный планшет. В другом формате используется 384-луночный планшет. Когда формат анализа представляет собой микролуночный формат, жидкость содержится в каждой лунке титрационного микропланшета. В. Системы анализа на тврдом носителе. Способы и система анализа могут быть осуществлены на тврдой среде (например, один или более компонентов иммобилизованы на тврдом носителе). Чаще всего аналог нуклеиновой кислоты или мишеневый полинуклеотид иммобилизуют. Существует много типов тврдых носителей, к которым могут быть присоединены молекулы аналога нуклеиновой кислоты или мишеневого полинуклеотида, в том числе - но не ограничиваясь ими - проницаемые для жидкости мембраны (нитроцеллюлозные, нейлоновые), керамические носители, протравленные мембраны (ТЕМ), поливинилидендифлорид, латекс, парамагнитные шарики, пластиковые носители всех типов, стекло, порошковый кремний или алюминий на подложечной матрице. Если используется сетчатый рисунок, молекула аналога нуклеиновой кислоты/тврдый носитель образует микроанализ. В другом варианте осуществления молекулы аналога нуклеиновой кислоты или мишеневого полинуклеотида могут быть ковалентно модифицированы, чтобы включать в себя связывающее средство, такое как биотиновое или амидное звено, которые связываются с мембранами. В следующем варианте осуществления молекулы аналога нуклеиновой кислоты или мишеневого полинуклеотида могут быть иммобилизованы через последовательную специфическую гибридизацию с одной или более последовательностями. На фиг. 17 схематически представлено обнаружение, с активированием световым стимулом и иммобилизацией на поверхности, аналогов нуклеиновой кислоты. А) Стрепавидиновая лунка. В) В лунку добавлены биотинилированные аналоги нуклеиновой кислоты и обеспечена возможность присоединения к носителю. С) Лунка промыта и избыток аналогов нуклеиновой кислоты удалн. D) Внесн полинуклеотидный образец, и специфическая мишеневая последовательность присоединяется к комплементарному аналогу нуклеиновой кислоты. Е) Неспецифичный и избыточный полинуклеотид удален. F) Краситель добавлен и экспонирован световому стимулу. Настоящее изобретение предполагает любые средства присоединения молекулы аналога нуклеиновой кислоты к носителю. В одном аспекте молекула аналога нуклеиновой кислоты может быть присоединена непосредственно к мембране. Аналогом нуклеиновой кислоты может являться PNA (например,A.Giger, Lester A., Kleiber J. And Orum H., 1998, PNA array technology in molecular diagnostics. Nucleotidesand Nucleoside, 17(1717-1724. Раствор молекул аналога нуклеиновой кислоты (в воде) просто прикладывается к заряженному или химически модифицированному фильтру и оставляется сушиться на воздухе. Фильтр затем используется для гибридизации. В другом аспекте меченная биотином молекула аналога нуклеиновой кислоты может быть присоединена к покрытой стрепавидином поверхности, такой как шарик или лунка (см., например, Chandler,D.P., Stults, J.R., Anderson, K.K., Cebula, S., Schuck, B.L., and Brockman, F.J., 2000. Affinity Capture andRecovery of DNA at Femtomolar Concentrations with Peptide Nucleic Acid Probes. Analitical Biochem. 283:241-249). Меченные биотином молекулы аналога нуклеиновой кислоты смешиваются со стрепавидином, меченным латексом или шариками поликарбоната. Биотин прочно связывается со стрепавидином,- 15009302 позволяя молекуле аналога нуклеиновой кислоты односторонне связываться с шариком. Затем шарики опускают на незаряженную мембрану с размером отверстий на 25-30% больше диаметра шарика. Шарики остаются в отверстиях, образуя локализованный участок присоединнных молекул аналога нуклеиновой кислоты. Прямой синтез молекул аналога нуклеиновой кислоты на тврдом носителе, таком как полипропиленовая мембрана, может быть выполнен с использованием стандартной химии синтеза 9 флуоренилметоксикарбоил (Fmoc) протеина (см., например, Matysiak S., Reuthner F. And Hoheisel J.D.Automating parallel peptide synthesis for production of nucleic acid analog library arrays, BioTechniques 31:896-904). В другом аспекте молекулы аналога нуклеиновой кислоты могут быть присоединены к стеклу или другому тврдому носителю приложением водного раствора молекул аналога нуклеиновой кислоты непосредственно к стеклу или другому носителю, позволяя ему высохнуть на воздухе. В одном варианте молекула аналога нуклеиновой кислоты конструируется таким образом, чтобы она имела суммарный положительный заряд и могла связываться отрицательно заряженной мембраной. Например, положительно заряженный лизин или глицин на 5' и 3' концах молекулы аналога нуклеиновой кислоты может быть использован для присоединения этой молекулы аналога нуклеиновой кислоты к отрицательно заряженной нейлоновой мембране. Отрицательно заряженная мембрана отталкивает любую нуклеиновую кислоту, которая не является комплементарной и (или) частично комплементарной к аналогу нуклеиновой кислоты, таким образом минимизируя неспецифическое связывание. Посредством системы, основанной на тврдом носителе, можно обнаружить любой мишеневый полинуклеотид или группу мишеневых полинуклеотидов. В этом случае тврдый носитель содержит множество молекул аналога нуклеиновой кислоты, иммобилизованных на тврдом носителе. Контрольный аналог нуклеиновой кислоты, который не образует гибридных молекул аналог нуклеиновой кислоты/полинуклеотид, не гибридизуется. Он также может быть включн в тврдый носитель. Система, основанная на тврдом носителе, может быть использована для обнаружения по меньшей мере одного мишеневого полинуклеотида. В других вариантах система, основанная на тврдом носителе,обнаруживает или измеряет экспрессию по меньшей мере примерно 8, по меньшей мере примерно 10, по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 30, по меньшей мере примерно 40, по меньшей мере примерно 50 или по меньшей мере примерно 60 разных мишеневых полинуклеотидов. В другом варианте система, основанная на тврдом носителе, обнаруживает или и распознает экспрессию по меньшей мере примерно 60 или более мишеневых полинуклеотидов. В качестве примера - но не ограничиваясь им - на фиг. 3 изображена основанная на тврдом носителе версия этого анализа, в которой в качестве тврдого носителя используется мембрана. Анализ показывает присутствие мишеневого полинуклеотида. Эта система позволяет идентифицировать и (или) определять количественно малые количества определнного мишеневого полинуклеотида в пределах нескольких минут без необходимости использования большого количества оборудования и дат визуальный сигнал (например, розовая окраска изменяется на бесцветную). После довольно быстрого лизиса образца, гибридизации и введения красителя применяется световой стимул, и наблюдается скорость изменения цветового рисунка на мембране. Скорость изменения в рисунке окрашенных полос на мембране дат возможность пользователю легко обнаруживать и идентифицировать мишеневые полинуклеотиды. Опционально, этот способ или его вариант могут быть осуществлены на портативном устройстве, получающем питание от небольшой батареи. В автоматическом роботизированном варианте все стадии могут быть осуществлены машиной без вмешательства человека. Система анализа, основанная на тврдом носителе, может быть реализована в титрационном микропланшете. Может быть использован любой титрационный микропланшет. В такой системе анализа его компоненты могут оставаться жидкими. В одном формате используются 96-луночные микропланшеты. В другом формате используются 384-луночные планшеты. Когда анализ производят в микротитровальном формате, все компоненты, за исключением тех, которые связываются с тврдым носителем, остаются в растворе в каждой лунке титрационного микропланшета.VI. Мишеневые полинуклеотиды и источники мишеневых полинуклеотидов. Мишеневый полинуклеотид может быть любым полинуклеотидом, в том числе встречающимся в природе, синтетическим и амплифицированным. Другие типы полинуклеотидов могут быть однонитевыми или двунитевыми. Не ограничивающие примеры мишеневых полинуклеотидов включают в себя ДНК, РНК, регуляторную РНК, мРНК, регуляторную микроРНК, siPHK, искусственную РНК и химерную РНК. Другие неограничивающие примеры мишеневых полинуклеотидов включают в себя эпигеномную ДНК, эпигенетическую ДНК, in vitro амплифицированную ДНК и химерную ДНК. Мишеневый полинуклеотид может содержать SNPs, который идентифицируют и определяют количественно раскрытыми здесь способами. Описанные здесь способы, системы и анализы имеют множество применений. Неограничивающие примеры этих применений включают в себя обнаружение и количественное определение организмов,патогенов, таких как патогены в пище, патогены окружающей среды, патогены в воде или патогены,применяемые в агротерроризме. Другие неограничивающие примеры применений включают в себя диагностику заболеваний, такую как диагностика заболеваний, передаваемых половым путм, обнаружение- 16009302 генов, придающих устойчивость к антибиотикам, обнаружение генов, придающих предрасположенность к ответу на лекарство, обнаружение генов, вовлечнных в эффективный ответ на лекарство, обнаружение генетически модифицированных организмов и обнаружение неместной флоры или фауны. Дополнительные неограничивающие применения включают в себя сельскохозяйственные применения и применения в ветеринарии. Ниже описываются примеры для иллюстрации, а не ограничения. А. Патогены. В одном аспекте изобретение относится к способам, композициям и системам анализа для обнаружения присутствия патогена и (или) заражения хозяина патогеном. Как правило, присутствие патогена и(или) присутствие патогена в хозяине обнаруживается анализом мишеневых полинуклеотидов в образце. Более конкретно, изобретение относится к способам, композициям веществ и системам анализа для анализа мишеневых полинуклеотидов с помощью последовательной специфической гибридизации с молекулой аналога нуклеиновой кислоты и добавления красителя для образования смеси. Затем наблюдается скорость изменения оптической характеристики красителя, чтобы обнаружить присутствие или количество мишеневого полинуклеотида. Примеры патогенов или присутствия патогена в хозяине, которые могут быть обнаружены настоящими способами и системами анализа, включают в себя - но не ограничиваются ими - Staphylococcusaureus, Staphylococcus hominis, Enterococcus faecalis, Pseusomonas aeruginosa, Staphylococcus capitis,Staphylococcus warneri, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influnzae, Staphylococcus simulans, Streptococcus pneumoniae и Candida albicans. Дополнительные примеры включают в себя - но не ограничиваются ими - Bacillus anthracis (сибирская язва), Clostridium botulinum (ботулизм), Brucellae (бруцеллез), Vibrio cholera (холера), Clostridiumperfringens (газовая гангрена, клостридийный мионекроз, некротический энтерит), вирус Эбола (геморрагическая лихорадка Эбола), Yersinia pestis (чума), Coxiella burnetii (Q-лихорадка) и вирус оспы (оспа). В предпочтительном варианте обнаруживают Bacillus anthracis. Примеры полинуклеотидов ответа хозяина для Bacillus anthracis включают в себя - но не ограничиваются ими - те, которые раскрыты Mock M., Mignot Т. Anthrax toxins and the host: a story of intimacy. CellSep. 1; 49(1): 1-7, или легко получаемые методами, известными в данной области. Патогены можно отличить от других патогенов на основании их мишеневых полинуклеотидов. Определнные патогены имеют специфические мишеневые полинуклеотиды, которые не обнаруживаются в других патогенах. Конструируются молекулы аналога нуклеиновой кислоты, комплементарные или строго комплементарные одному или более мишеневым полинуклеотидам, которые характерны для определнного патогена. Контактируя с мишеневыми полинуклеотидами патогена, молекула аналога нуклеиновой кислоты гибридизуется с полинуклеотидами, содержащими мишеневый полинуклеотид, но не с полинуклеотидами, которые не содержат мишеневого полинуклеотида. Таким образом, определнные патогены, которые содержат мишеневый полинуклеотид, могут быть отличены от патогенов, не содержащих мишеневого полинуклеотида. Кроме того, можно различить разные штаммы одного и того же патогена. Разные штаммы одного и того же патогена имеют разные полинуклеотидные последовательности. Часто различия настолько малы,что сводятся к единичному нуклеотиду. Конструируются молекулы аналога нуклеиновой кислоты, комплементарные или строго комплементарные одному или более мишеневым полинуклеотидам, которые идентифицируют определнный штамм патогена. Контактируя с мишеневыми полинуклеотидами патогена, молекула аналога нуклеиновой кислоты гибридизуется с полинуклеотидами, содержащими мишеневый полинуклеотид, но не с полинуклеотидами, которые не содержат мишеневого полинуклеотида. Когда мишеневый полинуклеотид является специфичным для определнного патогенного штамма, молекулы аналога нуклеиновой кислоты гибридизуются с мишеневыми полинуклеотидами, содержащимися в патогенном штамме, но не гибридизуются с мишеневыми полинуклеотидами другого штамма. Примеры клинически важных патогенов и данные по их обнаружению с использованием PCR перечислены ниже. Молекулы аналога нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом,что будут иметь последовательность PCR-праймера к последовательностям определнных патогенов, и могут быть использованы в комбинации во многих описанных здесь вариантах осуществления изобретения. В одном варианте осуществления патоген может быть Staphylococcus epidermidis. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Staphylococcus epidermidis. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техникиtool for Staphylococcus spp. J Clin Microbiol 38(12):4351-5). Патогеном может быть Escherichia coli. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Escherichia coli. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, L. С. Heller, С. R. Davis, K. K. Peak, D.PCR) to the detection of Enterococcus spp. and Escherichia coli in water samples. J Microbiol Methods 52(1):123-31). Патогеном может являться устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MSRA). Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Staphylococcus aureus (MSRA). Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, W. В. van Leeuwen, С. van Pelt, A. Luijendijk, H. A. Verbrugh, and W. H. Goessens. 1999. Rapid detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus isolates by the MRSA-screen latex agglutination test. J Clin Microbiol 37(9):3029-30, P. Francois, D. Pittet, M. Bento, B. Pepey, P. Vaudaux, D. Lew,and J. Schrenzel. 2003. Rapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Directly from Sterile orpolarization. Comb Chem High Throughput Screen 6(3):225-34). Патогенами могут являться Candida. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Candida. Примеры этих PCRпраймеров раскрыты в уровне техники (см., например, S. Ahmad, Z. Khan, A. S. Mustafa, and Z. U. Khan. 2002. Seminested PCR for diagnosis of candidemia: comparison with culture, antigen detection, and biochemical methods for species identification. J Clin Microbiol 40(7):2483-9, and U. H. Tirodker, J. P. Nataro, S.il1 neonates and children. J Perinatol 23(2): 117-22). Патогеном может являться Candida albicans. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей,подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Candida albicans. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, P. L. White, A. Shetty, and R. A. Barnes. 2003. Detection of seven Candida species using the Light-Cycler system. J Med Microbiol 52(Pt 3):229-38,M. Grijalva, R. Horvath, M. Dendis, J. Erny, and J. Benedik. 2003. Molecular diagnosis of culture negative infective endocarditis: clinical validation in a group of surgically treated patients. Heart 89(3):263-8, и В. Willinger, А. Obradovic, B. Selitsch, J. Beck-Mannagetta, W. Buzina, H. Braun, P. Apfalter, A. M. Hirschl, A. Makristathis, and M. Rotter. 2003. Detection and identification of fungi ftom fungus balls of the maxillary sinus bymolecular techniques. J Clin Microbiol 41(2):581-5). Патогеном может являться Staphylococcus aureus. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Staphylococcusamplicons without the need for cloning. J Appl Microbiol 94(2): 197-206). Патогеном может являться Staphylococcus hominis. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Staphylococcusdehydrogenase-encoding gene as a useful taxonomic tool for Staphylococcus spp. J Clin Microbiol 38(12):43515, и M. Wieser, and H. J. Busse. 2000. Rapid identification of Staphylococcus epidermidis. Int J Syst Evol Microbiol 50 Pt 3: 1087-93). Патогеном может являться Enterococcus faecalis. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Enterococcus faecalis. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, С. R. Hudson, P. J. Fedorka-Cray, M. С. Jackson-Hall, and L. M. Hiott. 2003. Anomalies in species identification of enterococci fromPCR amplification and direct sequencing of DNA from valve tissue. J Clin Micrjbiol 41(2):763-6). Патогеном может являться Pseudomonas aeruginosa. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации PseudomonasMicrobiol Lett 218(1):51-7). Патогеном может являться Staphylococcus capitis. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Staphylococcus capitis. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, М. Wieser, and H. J. Busse. 2000. Rapid identification of Staphylococcus epidermidis. Int J Syst Evol Microbiol 50 Pt 3:1087-93, и F. Martineau, F. J. Picard, P. H. Roy, M. Ouellette, and M. G. Bergeron. 1996. Species-specific and ubiquitous DNAbased assays for rapid identification of Staphylococcus epidermidis. J Clin Microbiol 34(12):2888-93). Патогеном может являться Staphylococcus warneri. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Staphylococcus warneri. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, M. Wieser, and H. J.the structure. Biosci Biotechnol Biochem 64(11):2420-8). Патогеном может являться Klebsiella pneumoniae. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Klebsiella pneumoniae. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, Perez-Perez, F. J., and N.for Clinical Laboratory Standards extended-spectrum betalactamase detection methods. J Clin Microbiol 39(8):2864-72, and Carter, J. S., and D. J. Kemp. 2000. A colorimetric detection system for Calymmatobacterium granulomatis. Sex Transm Infect 76(2): 134-6). Патогеном может являться Haemophilus influnzae. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Haemophilus influnzae. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, S. Shoma, M. Rahman, and- 19009302 Патогеном может являться Staphylococcus simulans. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Staphylococcus simulans. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, J. Yugueros, A.Purif 22(3):467-71). Патогеном может являться Streptococcus pneumoniae. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации Staphylococcus pneumoniae. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, J. Xu, В. С.detection of Streptococcus pneumoniae in nasopharyngeal secretions by real-time PCR. J Clin Microbiol 39(9):3129-34, и С. E. Corless, M. Guiver, R. Borrow, V. Edwards-Jones, A. J. Fox, and E. B. Kaczmarski. 2001. Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR. J Clin Microbiol 39(4): 1553-8). Патогеном может быть Coronavirus, РНК-вирус, для обнаружения SARS. Последовательность коронавируса можно найти, например, на вебсайте Центра по контролю за заболеваниями. Примеры этих мишеневых полинуклеотидов раскрыты в уровне техники (см., например, Т. G. Ksiazek, D. Erdman, С. S.Novel Coronavirus in Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome. N Engl J Med 10:10). Патогеном может быть Bordetella pertussis, или судорожный кашель. Примеры этих мишеневых полинуклеотидов раскрыты в уровне техники (см., например, F. Doucet-Populaire, N. Bourgeois, О. Charara,M. Bellaiche, F. Richardin, J. L. Salomon, L. Berardi-Grassias, J. С. Ghnassia, and P. Foucaud. 2002. [Routineor dot blot hybridization. J Clin Microbiol 40(8):2908-12). Патогеном может быть Phytophtora ramorum (причина внезапного омертвения дуба). Примеры этих мишеневых полинуклеотидов раскрыты в уровне техники (см., например, L. Levy, and V. Mavrodieva. 2003. Evaluation of the PCR Detection and DNA isolation methods for use in the Phytophthora ramorum. National Pilot Survey, vol. 2003, available at the Purdue University website; B. A. McPherson, D. M. Rizzo, M.California at Davis website). Патогеном может быть Norwalk-вирус. Примеры этих мишеневых полинуклеотидов раскрыты в уровне техники (см., например, A. S. Khan, С. L. Moe, R. I. Glass, S. S. Monroe, M. K. Estes, L. E. Chapman,X. Jiang, С. Humphrey, E. Pon, J. K. Iskander, and et al. 1994. Norwalk virus-associated gastroenteritis traced tooutbreak of gastroenteritis on a cruise ship in Hawaii. J Clin Microbiol 32(4):861-6). Патогеном может быть ВИЧ. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации HIV. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, K. М. Smith, K. A. Crandall, M. L. Kneissl, and В. A. Navia. 2000. PCR detection of host and HIV-1 sequences from archival brain tissue. J Neurovirol 6(2): 16471;Cuchacovich, R., S. Quinet, and A. M. Santos. 2003. Applications of polymerase chain reaction in rheumatology. Rheum Dis Clin North Am 29(1): 1-20, v; P. Cunningham, D. Marriott, С. Harris, S. Hancock, A. Carr,and D. Cooper. 2003. False negative HIV-1 proviral DNA polymerase chain reaction in a patient with primary- 20009302 Патогеном может быть Mycobacterium tuberculosis. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать последовательности или фрагменты последовательностей, подобные или идентичные PCR-праймерам, используемым для идентификации туберкулеза. Примеры этих PCR-праймеров раскрыты в уровне техники (см., например, M. J. Torres, A. Criado, M. Ruiz, А. С. Llanos, J. С. Palomares, and J. Aznar. 2003. Improved real-time PCR for rapid detection of rifampin andsamples. Int J Tuberc Lung Dis 6(8):732-7). В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты сконструированы таким образом,что будут связываться с мишеневыми полинуклеотидами, общими для целой группы патогенов. Например, аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы так, чтобы обнаруживать бактерии(ВР 6), грамположительные бактерии (ВР 19), грамотрицательные бактерии (ВР 3) и грибки (FP8). Примеры последовательностей аналогов нуклеиновых кислот для ВР 6, ВР 19, ВР 3 и FP8 показаны ниже. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть использованы в клинических применениях для диагностики микробной причины сепсиса или в других применениях, где содержание микробов в продуктах важно при оценке их срока хранения и устойчивости или в других продуктах, для которых оценивается стерильность. Мишеневые полинуклеотиды могут быть специфичными к последовательностям рибосомной РНК,такой как 16S РНК из Е. coli. Рибосомная РНК содержит специфические последовательности, которые характерны для организма-хозяина. Используя последовательности аналога нуклеиновой кислоты, которые комплементарны или строго комплементарны к мишеневому полинуклеотиду, присущему последовательности рибосомной РНК, можно диагностировать патогены на основании последовательностей их рибосомной РНК. Последовательности рибосомной РНК, присущие различным патогенам или штаммам патогенов, можно найти, например, у Dinshaw J. Patel, Asif K. Suri, Feng Jiang, Licong Jiang, Pei FanR.Mol. Biol. (1997) 272, 645-664). В. Полинуклеотиды ответа хозяина. Мишеневый полинуклеотид может также являться полинуклеотидом ответа хозяина. После того как хозяин инфицирован патогеном, его гены в ответ на патоген могут экспрессироваться по-разному, давая определнный рисунок мРНК (профиль генной экспрессии). Гены хозяина, чей рисунок экспрессии коррелирует с инфицированием определнным патогеном, называют диагностическими маркерными генами для данного агента. мРНК, как правило, происходит из белых кровяных телец образца. Способы идентификации ответа хозяина и изменнные профили экспрессии можно найти, например, у: 1) Das, R.,- 21009302Mendis, С., Yan, Z., Neill, R., Boyle, Т., and Jett, M. (1998) Alterations in gene expression show unique patterns in response to agents. In Proceeings of the 21st Army Science Conference, F-P9, и 2) Mendis, C., Das, R.,Yang, D., and Jett, M. (1998) Identification of alterations in gene expression in response to Staphylococcal enterotoxin В (SEB) using differential display (DD). In the ASCB 38th Annual Meeting, San Francisco, CA. Методы профилирования генной экспрессии разработаны для различных медицинских состояний,как описано, например, в патентных документах США 5723290 (Eberwine et al.), США 6218122(Friend et al.), WO 99/10536 (Yarramilli et al.) и WO 99/57130 (Prashar et al.). Вкратце, такой способ включает в себя получение уровня экспрессии мРНК в клетках, отобранных в связи с выбранным условием, и сравнение полученных относительных уровней с установленными контрольными. Затем на основании сравнения уровней экспрессии мРНК ставится диагноз. мРНК выделяется из клеток с помощью какоголибо из множества методов, хорошо известных из уровня техники, но в общем, лизируя клетки и обогащая их мРНК или выделяя из них мРНК. Затем любыми известными в данной области средствами получают профили генной экспрессии, включая - но не ограничиваясь ими - способы, раскрытые: Prashar et al. в WO 97/05286; Liang et al. в Science 257:967-971 (1992); Ivanova et al. в Nucleic Acids Res. 23:2954-2959(1995); и Prashar et al. в Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:659-663 (1996). С помощью этих методов обычно получают профили генной экспрессии, используя Northern-анализ, FRET-детекцию, гибридизацию с анализом олигонуклеотидов, гибридизацию с анализом кДНК, с кДНК-последовательностями, кДНКфингерпринтингом и т.п. Часто профилями генной экспрессии называют представление экспрессии образцов мРНК в том виде, как их можно обнаружить на ауторадиограмме меченых фрагментов кДНК, полученных из тотальной клеточной мРНК, выделенной на основании размера путм слоевого гельэлектрофореза, капиллярного гель-электрофореза, HPLC и другими методами выделения. Системы анализа и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают альтернативный путь оценки экспрессии мРНК. Как описано ниже, уровни экспрессии мРНК (т.е. профили генной экспрессии) сравнивают,или, напротив, изменения в экспрессии мРНК от диагностических маркерных генов обнаруживают, анализируя гибридизацию ответа мРНК хозяина по их комплементарности или строгой комплементарности аналогам нуклеиновой кислоты. С. Пищевые патогены и патогены окружающей среды. Согласно настоящему изобретению могут быть обнаружены любые пищевые патогены или патогены окружающей среды. Пищевые патогены включают в себя - не ограничиваются ими - Listeria, Campylobacter, E. coli и Salmonella. Раскрываемые здесь способы с использованием аналогов нуклеиновой кислоты легко позволяют обнаруживать конкретные пищевые патогены. Например, Listeria можно легко отличить от Salmonella. Кроме того, можно обнаруживать конкретные штаммы пищевых патогенов, таких как конкретные штаммы L. monocytogenes. Любой мишеневый полинуклеотид, ассоциированный с пищевыми патогенами, может быть идентифицирован способами согласно настоящему изобретению. Мишеневые полинуклеотиды, которые характеризуют конкретные патогены и штаммы патогенов, могут быть идентифицированы, как обсуждается выше. Данный способ может быть использован для обнаружения мишеневых полинуклеотидов, ассоциированных с Listeria, Campylobacter, E. coli и Salmonella. Например, специфичные для Listeria гены,которые могут быть идентифицированы раскрытыми здесь способами, включают гены hly (листериолизина О) и iap (протеина, ассоциированного с инвазией) и мРНК (HLYPNA и IAPPNA, соответственно). Мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующиеSalmonella spp., могут быть обнаружены согласно настоящему изобретению. Последовательности, специфичные для Salmonella spp., известны в уровне техники (см., например, Perez-Perez, P. J., and N. D.Prot 66(2): 182-7). В другом варианте осуществления могут быть определены мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие Escherichia coli. Последовательности, специфичные для Escherichia coli, известны в уровне техники (см., например, L. С. Heller, С. R. Davis, K. K.(TaqMan PCR) to the detection of Enterococcus spp. and Escherichia coli in water samples. J Microbiol Methods 52(1): 123-31. В другом варианте осуществления могут быть определены мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие Campylobacter spp. Последовательности, специфичные для Campylobacter spp., известны в уровне техники (см., например, J. S. Carter and D. J. Kemp.and Campylobacter coli in environmental samples. Mol Cell в другом варианте осуществления могут быть определены мишеневые полинуклеотиды, имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие Bacillus spp. Последовательности, специфичные для Bacillus spp., известны в уровне техникиPseudomonas spp., также могут быть обнаружены. Последовательности, специфичные для PseudomonasEnterocccus spp., также могут быть обнаружены. Последовательности, специфичные для Enterocccus spp.,известны в уровне техники (см., например, С. R. Hudson, P. J. Fedorka-Cray, М. С. Jackson-Hall, and L. M.Chemother 47(4): 1423-6). Мишеневые полинуклеотиды могут также иметь полинуклеотидные последовательности, соответствующие Е. coli O157. Последовательности, специфичные для Е. coli O157, известны в уровне техникиD., Wallace B.J., Kelly M., Halse T., Musser K.A., Smith P.F., Morse D.L., Limberger R.J. Detection, Isolation,and Molecular Subtyping of Escherichia coli O157:H7 and Campylobacter jejuni Associated with a Large Waterborne Outbreak, J Clin Microbiol. 2003 Jan;41 (1): 174-80; Ibekwe A.M., Grieve C.M. Detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in environmental samples by real-time PCR, J Appl Microbiol. 2003; 94(3):421-31). Мишеневые полинуклеотиды могут также иметь полинуклеотидные последовательности, соответствующие Listeria spp. и L. monocytogenes. Последовательности, специфичные для Listeria spp. и L.- 23009302 формам Escherichia, также могут быть обнаружены. Последовательности, специфичные для форм Escherichia, известны в уровне техники (см., например, Casas N., Sunen E. Detection of enteroviruses, hepatitisBernhard A.E., Field K.G. Identification of nonpoint sources of fecal pollution in coastal waters by using hostspecific 16S ribosomal DNA genetic markers from fecal anaerobes. Appl Environ Microbiol. 2000 Apr; 66(4): 1587-94). В ещ одном варианте осуществления могут быть обнаружены мишеневые полинуклеотиды,имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие Vibrio cholerae и V. parahemolyticus. Последовательности, специфичные для Vibrio cholerae и V. parahaemolyticus, известны в уровне техникиMicrobiol Methods. 2003 May; 53(2): 149-155; и Lyon W.J. TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae O1,0139, non-O1, and non-O139 in pure cultures, raw oysters, and synthetic seawater.Appl Environ Microbiol. 2001 Oct; 67(10):4685-93). В следующем варианте осуществления могут быть обнаружены мишеневые полинуклеотиды,имеющие полинуклеотидные последовательности, соответствующие плесневым грибкам. Последовательности, специфичные для плесневых грибков, известны в уровне техники (см., например, Zur G., Shimoni E., Hallerman E., Kashi Y. Detection of Alternaria fungal contamination in cereal grains by a polymeraseMethods. 2000 Aug; 41(3):259-65; и Vanittanakom N., Vanittanakom P., Hay R.J. Rapid identification of Penicillium marneffei by PCR-based detection of specific sequences on the rRNA gene, J Clin Microbiol. 2002 May; 40(5): 1739-42). Мишеневые полинуклеотиды могут иметь полинуклеотидные последовательности, соответствующие Legionella. Последовательности, специфичные для Legionella, известны в уровне техники (см., например, Aoki S., Hirakata Y., Miyazaki Y., Izumikawa K., Yanagihara K., Tomono K., Yamada Y., Tashiro T.,Kohno S., Kamihira S. Detection of Legionella DNA by PCR of whole-blood samples in a mouse model. J MedOct; 191(2): 119-25; и Alexiou-Daniel S., Stylianakis A., Papoutsi A., Zorbas I., Papa A., Lambropoulos A.F.,Antoniadis A. Application of polymerase chain reaction for detection of Legionella pneumophila in serum samples. Clin Microbiol Infect. 1998 Mar; 4(3):144-148). мРНК ответа хозяина может быть также обнаружена при ответе на инфицирование пищевыми патогенами.D. Патогены водного происхождения. Раскрытые здесь способы обеспечивают также быстрые и чувствительные диагностические тесты на присутствие и определение патогенов водного происхождения. Патогены водного происхождения включают в себя бактерии, вирусы и простейших. Примеры патогенов водного происхождения включают в себя Enterococci, E. coli, Bacillus spp., Pseudomonas spp., Cryptosporidium и Giardia. Патогены водного происхождения могут быть получены из образцов воды, в том числе - но не ограничиваясь ими - из плавательных бассейнов, аквапарков, колодцев, бытовой питьевой воды, резервуаров, с берегов водомов, из озер, океанов, ферм по разведению рыбы и моллюсков, сельскохозяйственной воды, воды для растворов, обработанной восстановлением воды, воды очистных сооружений, на круизных судах, на действующих космических кораблях и кипячной воды. Раскрытые здесь способы позволяют легко обнаруживают патогены, происходящие из воды. Могут быть, в частности, обнаружены конкретные штаммы. Например, среди прочих могут быть обнаружены конкретные штаммы Enterococci, включая Enterococci avium, E. casseliflaus, E.cecorum, Е. columbae, E.raffinosus, E. saccharolyticus, and E. sulfurous. Любые полинуклеотиды, связанные с патогенами водного происхождения, могут быть обнаружены способами согласно настоящему изобретению. Данные способ может быть использован для обнаружения генов, связанных с Enterococcus spp., E. coli, Bacillus spp. и Pseudomonas spp., которые уже описаны (см.,например, Escherichia coli: L. С. Heller, С. R. Davis, K. K. Peak, О. Wingfield, А. С. Cannons, Р. Т. Amuso,and J. Cattani. 2003, Comparison of Methods for DNA Isolation from Food Samples for Detection of ShigaMackinson, E. Debess, J. Madden, P. Angulo, and M. J. Zervos. 2003. Molecular characterization of gentamicinresistant Enterococci in the United States: evidence of spread from animals to humans through food. J Clin Microbiol 41(3):1109-13, и S. В. Vakulenko, S. M. Donabedian, A. M. Voskresenskiy, M. J. Zervos, S. A. Lerner,and J. W. Chow. 2003. Multiplex PCR for detection of aminoglycoside resistance genes in enterococci. Antimicrob Agents Chemother 47(4): 1423-6. Например, конкретные гены Enterococci, которые могут быть идентифицированы раскрытыми здесь способами, включают в себя последовательности 16S рибосомной РНК, которые являются консервативными в Enterococci. мРНК ответа хозяина может быть также обнаружена при ответе на инфицирование патогенами,имеющими водное происхождение. Е. Агротерроризм. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на PCR обнаружения конкретных патогенов, вовлечнных в агротерроризм. Примеры патогенов, имеющих клиническое значение, и ссылочные документы по основанному на PCR обнаружению перечислены ниже. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности специфичных PCRпраймерных последовательностей и могут быть использованы в комбинации во многих выполнениях настоящего изобретения, описанных ниже. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы, например, таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на PCR обнаружения Toxoplasma gondii. Toxoplasma gondii имеет очень низкую хозяйскую специфичность и, вероятно, инфицирует любое млекопитающее. Она также передатся от птиц и обнаруживается фактически в каждой стране мира. Подобно большинству представителей Apicomplexa, Toxoplasma является облигатным интрацеллюлярным паразитом. У большинства людей, инфицированных Toxoplasma, заболевание бессимптомно. Однако при некоторых условиях, токсоплазмоз может вызвать серьезную патологию,включая гепатит, пневмонию, слепоту и серьезные нейрологические нарушения. Праймеры, используемые в основанном на PCR обнаружении Toxoplasma gondii, в уровне техники известны (см., например, Т.of Toxoplasma gondii in cured meats. Int J Food Microbiol 45(3):211-5). В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на PCR обнаружения Shingella spp., грамотрицательной бактерии. Праймеры, используемые в основанном на PCR обнаружении Shingella spp., в уровне техники известны (А. В. Hartman, Essiet, II, D.detection of invasive Shigella flexneri in food. Appl Environ Microbiol 56(6): 1536-40). В следующем варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на PCR обнаружения Cyclospora cayetanensis. Cyclospora cayetanensis является одноклеточным паразитом, слишком маленьким, чтобы его можно было видеть в микроскоп. О первых известных случаях заболевания человека, вызванного инфекцией Cyclospora (т.е. циклоспориаз), сообщалось в 1979 г. Более часто о подобных случаях стали сообщать в середине 1980-х. В последние несколько лет о вспышках циклоспориаза сообщалось в Соединнных Штатах и Канаде. Cyclospora распространяется через употребление воды или пищи, заражнной испражнениями. Вспышки циклоспориаза связывают с различными типами сырых продуктов. Cyclospora требуется время (дни или недели) после прохождения в пищеварительный тракт, чтобы стать инфекционной. Поэтому маловероятно, чтобы Cyclospora передавалась прямо от одного человека другому. Праймеры, используемые в основанном на PCR обнаружении Cyclospora cayetanensis, известны в уровне техники (см., например, М. L. Eberhard, N. J. Pieniazek, and M. J. Arrowood. 1997. Laboratory diagnosis of Cyclospora infections. Arch Pathol Lab Med 121(8):792-7, N. J. Pieniazek, S. B. Slemenda, A. J. daF. Диагностика болезней. Раскрытые здесь способы обеспечивают также быстрый и чувствительный тест на присутствие генов (например, аллелей, связанных с болезнями) или изменнной экспрессии генов. Обнаруживаемые генные последовательности могут быть вовлечены в генетические болезни, нарушения и предрасположенности. Один пример мишеневых полинуклеотидов включает в себя специфические геномные последовательности, в том числе мутации, полиморфизмы, вставки и делеции. Другим примером мишеневых полинуклеотидов являются полинуклеотидные последовательности, которые изменяют генную экспрессию (например, экспрессию, регулируемую против или по ходу транскрипции) при конкретном заболевании или нарушении. Примеры генов, связанных с заболеваниями и нарушениями включают в себя - но не ограничиваются ими - гены, вовлечнные в рак, фиброз мочевого пузыря и синдром Дауна и в заболевания, связанные с полиморфизмами и мутациями. Могут быть также идентифицированы унаследованный гемахроматоз, фактор 11, фактор V и HLA-генотипы тканевых трансплантантов. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемых для основанного на PCR обнаружения мишеневых полинуклеотидов, вовлечнных в рак или изменнную клеточную пролиферацию. Мишеневые полинуклеотиды, соответствующие генам, вовлечнным в рак или изменнную клеточную пролиферацию, могут быть обнаружены. Многочисленные гены, вовлечнные в рак, известны в уровне техники. В одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на PCR обнаружения рака поджелудочной железы. Праймеры, используемые в основанном наPCR обнаружении рака поджелудочной железы, такие как DPC4, известны в уровне техники (см., например, V. М. Barbera, М. Martin, L. Marinoso, A. Murine, A. Carrato, F. X. Real, and M. Fabre. 2000. The 18q21in primary pancreatic adenocarcinomas. Cancer Lett 139(l):43-9, и D. Bartsch, S. A. Hahn, K. D. Danichevski,A. Ramaswamy, D. Bastian, H. Galehdari, P. Barth, W. Schmiegel, B. Simon, and M. Rothmund. 1999. Mutations of the DPC4/Smad4 gene in neuroendocrine pancreatic tumors. Oncogene 18(14):2367-71). В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на PCR обнаружения рака шейки матки. Мишеневые полинуклеотиды, соответствующие всем или части генов, связанных с раком шейки матки, также могут быть идентифицированы (см., например,Н. X. Si, S. W. Tsao, С. S. Poon, L. D. Wang, Y. С. Wong, and A. L. Cheung. 2003. Viral load of HPV in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer 103(4):496-500, и P. E. Castle, M. Schiffman, P. E. Gravitt, H.Kendall, S. Fishman, H. Dong, A. Hildesheim, R. Herrero, M. С. Bratti, M. E. Sherman, A. Lorincz, J. E. Schussler, and R. D. Burk. 2002. Comparisons of HPV DNA detection by MY09/11 PCR methods. J Med Virol 68(3):417-23). Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемых для основанного на PCR обнаружения рака молочной железы. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, имеющие последовательно- 26009302 сти, соответствующие всем или части генов, связанных с раком молочной железы (см., например, С. J.carcinoma. Pathol Int 44(1):34-8). Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на PCR обнаружения меланомы. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, имеющие последовательности, соответствующие всем или части генов, связанных с меланомой (см., например, M. L. Gonzalgo, С. М. Bender, Е. Н. Hou, J. M. Glendening, J. F. Flores, G. J. Walker, N. K. Hayward, P. A. Jones, and J. W. Fountain. 1997.Carcinog 31(1): 16-26, и P. M. Pollock, J. Welch, and N. K. Hayward. 2001. Evidence for three tumor suppressor loci on chromosome 9p involved in melanoma development. Cancer Res 61(3): 1154-61). Кроме того, аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на PCR обнаружения рака прямой кишки. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, имеющие последовательности, соответствующие всем или части генов, связанных с раком прямой кишки (см., например, S.W. M. Smith, N. J. Van Orsouw, E. A. Fox, R. D. Kolodner, J. Vijg, and С Eng. 1998. Accurate, highthroughput "snapshot" detection of hMLH1 mutations by two-dimensional DNA electrophoresis. Genet Test 2(1):43-53). Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на PCR обнаружения ретинобластомы. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, имеющие последовательности,соответствующие всем или части генов, связанных с ретинобластомой (см., например, I. Acikbas, I. Keser,S. Kilic, H. Bagci, G. Karpuzoglu, and G. Luleci. 2002. Detection of LOH of the RB1 gene in bladder cancers byelectrophoresis. Hum Genet 89(l):49-53. В следующем варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров или их фрагментов, используемые для основанного на PCR обнаружения гемофилии. Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды,имеющие последовательности, соответствующие всем или части генов, связанных с гемофилией (см.,например, Mannucci, P. M. 2002. Hamwasserman lecture: hemophilia and related bleeding disorders: a story ofdismay and success. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program): 1-9, и Citron, M., L. Godmilow, T. Ganguly, and A. Ganguly. 2002. High throughput mutation screening of the factor VIII gene (F8C) in hemophilia A: 37 novel mutations and genotype-phenotype correlation. Hum Mutat 20(4):267-74). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с фенилкетилурией (PKU) (см., например, N. Pronina, S. Giannattasio, P. Lattanzio, R. Lugovska, P. Vevere, and A. Kornejeva. 2003. The molecular basis of phenylketonuria in Latvia. Humtrinucleotide repeat expansion. Hum Mutat 13(3):232-6). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с болезнью Хантингтона, например, вследствие увеличенного числа CAGповторов (см., например, R. L. Alford, Т. Ashizawa, J. Jankovic, С. Т. Caskey, and С. S. Richards. 1996. Molecular detection of new mutations, resolution of ambiguous results and compex genetic counseling issues infor the detection of the Huntington disease associated trinucleotide repeat expansion. Hum Mutat 13(3):232-6). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с гемофилией (см., например, P. M. Mannucci, 2002. Hamwasserman lecture:Mutat 20(4):267-74). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с болезнью Тея-Сакса (см., например, J. E. Rice, J. A. Sanchez, K. Е. Pierce,and L. J. Wangh. 2002. Real-time PCR with molecular beacons provides a highly accurate assay for detection ofVan Steirteghem, and I. Liebaers. 1995. Simultaneous amplification of the two most frequent mutations of infantile Tay-Sachs disease in single blastomeres. Hum Reprod 10(8):2214-7). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с множественным склерозом (МС) (см., например, S. Lauwers, H. Vanderexpression analysis. Biotechniques 33(5): 1078, 1080-2, 1084 passim). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с лимфомой Буркитта (см., например, Y. Wu, Y. Chen, J. Xu, and L. Lu. 2002.stored slides. Jpn J Cancer Res 82(7):848-53). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с фиброзом мочевого пузыря (см., например, Tomaiuolo, R., M. Spina, and G.programme based on a two tier protocol (IRT/DNA/IRT) in the Italian population. J Med Screen 9(2):60-3). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с начинающимся в детстве диабетом (см., например, Т. Knerr, R. Repp, J.Ilonen, O. Simell, M. Knip, and H. Hyoty. 2003. Enterovirus infections are associated with the induction of betacell autoimmunity in a prospective birth cohort study. J Med Virol 69(l):91-8). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с болезнью Паркинсона (см., например, J. Hoenicka, L. Vidal, В. Morales, I.Uniacke, L. Liu, N. Pankratz, A. Rudolph, С. Halter, С. Shults, K.Marder, P. M. Conneally, and W. C. Nichols. 2003. Heterozygosity for a mutation in the parkin gene leads to later onset Parkinson disease. Neurology 60(5):796-801). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с болезнью Альцгеймера (см., например, Maresh, G. A., D. Erezyilmaz, С. Е.mutation at codon 219 of the presenilin-1 gene. Neuroreport 10(3):503-7). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с тромбозом (см., например, Sanders Sevall, J. 2000. Factor V Leiden genotyping using real time fluorescent polymerase chain reaction. Mol Cell Probes 14(4):249-53; Ferreira-Gonzalez, A.,L. M. Fisher, С. M. Lehman, M. H. Langley, D. H. Lofland, Q. Xia, N. X. Nguyen, D. Modesto, J. B. Willoughby, D. S. Wilkinson, and С. Т. Garrett. 1997. Detection of a common mutation in factor V gene responsiblefor resistance to activate protein С causing predisposition to thrombosis. J Clin Lab Anal 11(6):328-35; Warshawsky, I., C. Hren, L. Sercia, B. Shadrach, S. R. Deitcher, E. Newton, and K. Kottke-Marchant. 2002. Detection of a novel point mutation of the prothrombin gene at position 20209. Diagn Mol Pathol 11(3):152-6). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с подверженностью туберкулезу (см., например, Bellamy R. Susceptibility toBellamy R. NRAMP1 and susceptibility to tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2002 Sep;6(9):747). Могут быть отобраны мишеневые полинуклеотиды, которые имеют последовательности, соответствующие генам, связанным с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) (HIV) (см., например, Ifergan I.,Bernard N.F., Bruneau J., Alary M., Tsoukas C.M., Roger M. Allele frequency of three functionally active polymorphisms of the MDR-1 Gene in high-risk HIV-negative and HIV-positive Caucasians. AIDS. 2002 Nov 22; 16(17):2340-2; и Farzan M., Mirzabekov T., Kolchinsky P., Wyatt R., Cayabyab M., Gerard N.P., Gerard C.,Sodroski J., Choe H. Tyrosine sulfation of the amino teerminus of CCR5 facilitates HIV-1 entry. Cell 1999 Mar 5; 96(5):667-76). Раскрытые здесь способы обеспечивают также быстрые и чувствительные диагностические тесты на присутствие генов или изменнной экспрессии генов в генетических анализах другого рода. Например, они могут быть использованы для определения идентичности образцов человека, например, в тестах по установлению отцовства, судебной медицине или при сравнении подходящих или неподходящих донорских органов. Диагностика может также проводиться не на образцах от человека, а, например, для установления родословной скота.G. Болезни, передаваемые половым путм. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности или фрагменты последовательностей праймеров, используемые для основанного наPCR обнаружения патогенов, которые вызывают болезни, передаваемые половым путм (STDs). Примеры STDs, имеющих клиническое значение, и ссылочные документы по обнаружению болезней на основеPCR перечислены ниже. Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности специфических последовательностей PCR-праймеров и могут быть использованы в комбинации во многих вариантах осуществления раскрытого здесь изобретения. В одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом,что имеют последовательности праймеров, используемые для основанного на PCR обнаружения хламидий. Многие такие праймеры известны в уровне техники (см., например, Е. Н. Koumans, С. М. Black, L.clinical samples and comparison of real-time quantitative PCR and conventional PCR for detection of Chlamydia pneumoniae. BMC Microbiol. 2002 Jul 9; 2(1): 17). В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом,что имеют последовательности праймеров, используемые для основанного на PCR обнаружения Treponema pallidum. Примеры праймеров, используемых для идентификации Treponema pallidum с использованием основанных на PCR анализов, в уровне техники известны (см., например, А. Centurion-Lara, С.RNA in blood donors with confirmed-positive syphilis tests. Transfusion 42(1):94-9). В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом,что имеют последовательности праймеров, используемых для основанного на PCR обнаружения ВИЧ. Примеры праймеров, используемых для идентификации ВИЧ с использованием основанных на PCR анализов, в уровне техники известны (см., например, L. Gibney, M. Macaluso, K. Kirk, M. S. Hassan, J. Schwebke, S. H. Vermund, and P. Choudhury. 2001. Prevalence of infectious diseases in Bangladeshi women livingrelated to human immunodeficiency virus type 1 in cervico-vaginal secretions. Bjog 108(6):634-41). В ещ одном варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом, что имеют последовательности праймеров, используемых для основанного на PCR обнаружения папиллом авируса человека (HPV). Примеры праймеров, используемых для идентификации HPV с использованием основанных на PCR анализов, в уровне техники известны (см., например, R. L. Winer, S. К.of multiple HPV genotypes in human immunodeficiency virus- infected women in Brazil. J Clin Microbiol 40(9):3341-5; M. Skerlev, M. Grce, M. Sirotkoviae-Skerlev, K. Husnjak, and J. Lipozencic. 2002. Human papillomavirus male genital infections: clinical variations and the significance of DNA typing. Clin Dermatol 20(2): 173-8). В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом,что имеют последовательности праймеров, используемых для основанного на PCR обнаружения Neisseria gonorrhoeae. Примеры праймеров, используемых для идентификации Neisseria gonorrhoeae с использованием основанных на PCR анализов, в уровне техники известны (см., например, С. S. Mgone, Т. Lupiwa, and W. Yeka. 2002. High prevalence of Neisseria gonorrhoeae and multiple sexually transmitted diseasesinfection in a low-prevalence population. J Clin Microbiol 40(11):4056-9). В другом варианте осуществления аналоги нуклеиновой кислоты конструируются таким образом,что имеют последовательности праймеров, используемых для основанного на PCR обнаружения генитального герпеса. Примеры праймеров, используемых для идентификации генитального герпеса с использованием основанных на PCR анализов, в уровне техники известны (см., например, M. H. Wolff, J.Infect Dis 22:166-80; Scoular, A. 2002. Using the evidence base on genital herpes: optimising the use of diagnostic tests and information provision. Sex Transm Infect 78(3): 160-5). Аналоги нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, что будут иметь последовательности праймеров, используемых для основанного на PCR обнаружения Trichomonasvanginalis. Примеры праймеров, используемых для идентификации Trichomonas vanginalis с использованием основанных на PCR анализов, в уровне техники известны (см., например, Wendel, K. А., Е. J. Erbelding, С. A. Gaydos, and A. M. Rompalo. 2002. Trichomonas vaginalis polymerase chain reaction compared