Способ обнаружения и анализа полинуклеотидов с помощью светособирающих полихромофоров

007652 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способам, изделиям и композициям для обнаружения и анализа полинуклеотидов в образце. Предпосылки создания изобретения Методы, позволяющие обнаруживать последовательность ДНК в реальном времени и с высокой чувствительностью, представляют большой научный и экономический интерес 1,2,3. Их применение включает медицинскую диагностику, идентификацию генетических мутаций, мониторинг доставки генов и специфические геномные методы 4. Катионные органические носители, такие как этидий бромид и тиазол оранжевый, излучают при включении их в желобки двухнитевой (двухцепочечной) ДНК (днДНК,dsДНК) и служат в качестве непосредственных гибридизационных зондов ДНК, но у них отсутствует специфичность в отношении последовательностей 5,6. Существуют пары хромофоров для переноса энергии/электрона для анализов, специфических в отношении нити, но они требуют химического мечения двух ядерных кислот или двойной модификации той же самой изменнной нити (например, "молекулярные маяки")7,8. Трудности мечения двух сайтов ДНК приводят к низким выходам, высокой стоимости и примесям с одной меткой, что понижает чувствительность обнаружения 9. Недавнее появление пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК) сделало возможным новые исследования и диагностические применения 10,11. В ПНК отрицательно заряженные фосфатные связи в ДНК заменены нейтральными амидными связями пептидомиметиков. Комплексы ПНК/ДНК образуются быстрее, имеют более высокую энергию связывания и являются более специфичными, чем аналогичные комплексы ДНК/ДНК 12. Эти повышенные свойства являются результатом отсутствия кулоновского отталкивания,которое возникает между двумя отрицательно заряженными нитями ДНК. Следовательно, комплексы ПНК являются термически более устойчивыми и, благодаря своему каркасу, менее чувствительными к биологическому расщеплению нуклеазами, протеазами и пептидазами 13,14. Кроме того, их общая нечувствительность к ионной силе и рН в процессе гибридизации обеспечивает более широкую платформу для обнаружения ДНК 18. В технике существует необходимость в способах обнаружения и анализа конкретных полинуклеотидов в образце и в композициях и промышленных изделиях, применимых в таких методах. Сущность изобретения Изобретением охватываются способы, композиции и промышленные изделия для обнаружения и анализа целевого полинуклеотида в образце. Образец, предположительно содержащий целевой полинуклеотид, контактирует с поликатионным полихромофором и сенсорной пептидно-нуклеиновой кислотой(ПНК), комплементарной к целевому полинуклеотиду. Сенсорная ПНК конъюгируется с сигнальным хромофором. Не желая связывать себя теорией, полагают, что в присутствии целевого полинуклеотида в образце передающий сигнал (сигнальный) хромофор близко подходит к катионному полихромофору за счт электростатического взаимодействия с каркасом целевого полинуклеотида, который гибридизован с сенсорной ПНК (см. фиг. 1). Затем сигнальный хромофор может получать энергию от возбужднного поликатионного полихромофора и излучать свет, который можно обнаружить. Целевой полинуклеотид(полинуклеотид-мишень) можно анализировать в том виде, в каком он встречается в образце, или его можно амплифицировать перед или одновременно с анализом. Изобретением охватывается раствор, содержащий реагенты, пригодные для осуществления способов по изобретению, а также наборы, содержащие такие реагенты. Способы можно использовать в различных вариантах, в которых множество различных сенсорных ПНК используют для анализа множества различных целевых полинуклеотидов. Способы,необязательно, можно осуществлять на поверхности, например, используя связанный с поверхностью полихромофор; поверхность может быть сенсорной. Способы также могут осуществляться в гомогенном формате. Способы и изделия по данному изобретению можно использовать в качестве альтернативы другим методам обнаружения полинуклеотидов. Краткое описание фигур На фиг. 1 иллюстрируется способ по изобретению, использующий поликатионный полимер в качестве светособирающего полихромофора. Создана сенсорная ПНК (ПНК-С), содержащая сигнальный хромофор и имеющая основную последовательность, комплементарную представляющему интерес целевому полинуклеотиду. При контактировании с целевым полинуклеотидом в образце поликатионный полихромофор оказывается в близости с сигнальным хромофором вследствие электростатического взаимодействия с целевым полинуклеотидом. Затем возбуждение полихромофора вызывает эмиссию света сигнальным хромофором. На фиг. 2 представлены, соответственно, спектры поглощения (зелный и оранжевый) и эмиссии(красный и синий) полимера 1 (см. ниже) и сенсорной пептид-нуклеиновой кислоты ПНК-С. Возбуждение осуществляют при 380 и 480 нм для 1 и ПНК-С соответственно. На фиг. 3 представлены спектры излучения ПНК-С в присутствии комплементарной (красный цвет) и некомплементарной (чрный цвет) ДНК с помощью возбуждения полимера 1. ПНК-С и соответствующую ДНК добавляют вместе в воде при рН=5,5. Спектры нормализуют относительно эмиссии (излучения) полимера 1. На фиг. 4 представлены спектры излучения ПНК-С в присутствии комплементарной (красный-1 007652 цвет) и некомплементарной (чрный цвет) ДНК с помощью возбуждения олигомера 2. ПНК-С и соответствующую ДНК добавляют вместе в воде при рН=5,5. Спектры нормализуют относительно эмиссии(излучения) олигомера 2. Подробное описание изобретения Настоящие методы для ДНК и РНК сенсоров (включая "генные чипы" и "ДНК-чипы") зависят от ковалентного связывания флуоресцентных меток (люмофоров) с одиночными нитями ДНК. Большинство этих сенсоров вынуждено зависеть от мечения образца аналита, что вызывает неизбежные проблемы,возникающие в результате изменения эффективности реакции мечения от образца к образцу, что требует кросс-калибровки. Другие системы опираются на метод "молекулярного маяка", требующего связывания люмофоров и тушителей флуоресценции с последовательностями, точно созданными методами рекомбинантной ДНК. Один способ по изобретению заключается в контактировании образца по меньшей мере с двумя компонентами в преимущественно водном растворе: (a) светособирающей полихромофорной системой,например, такой как конъюгированный полимер, полупроводниковая квантово-точечная или дендритная структура, которая является водорастворимой; и (b) сенсорной ПНК, конъюгированной с люминесцентным сигнальным хромофором, или "ПНК-С". Излучение света с длиной волны, характерной для сигнального хромофора-С при возбуждении полихромофора указывает на присутствие в растворе целевого нуклеотида. Применяя множество различных сенсорных ПНК, каждая с различной основной последовательностью и различным сигнальным хромофором (ПНК 1-C1, ПНК 2-С 2, ПНК 3-С 3, ПНК 4-С 4 и т.д.),можно независимо обнаружить и проанализировать множество различных полинуклеотидов. Светособирающий хромофор и сигнальный хромофор (С) выбирают таким образом, чтобы полосы поглощения двух хромофоров имели минимальное перекрывание и чтобы спектры люминесценции двух видов были с разной длиной волны. Приготовленная в водном растворе светособирающая люминесцентная полихромофорная система является положительно заряженной, или катионной, и, предпочтительно,поликатионной (например, поликатионный конъюгированный полиэлектролит). Так как сенсорная ПНК не имеет заряда, существует минимальное кулоновское взаимодействие между сенсорной ПНК и катионной светособирающей люминесцентной полихромофорной системой. При добавлении целевого полинуклеотида, комплементарного последовательности сенсорной ПНК, целевой полинуклеотид гибридизуется с сенсорной ПНК. Так как целевой полинуклеотид заряжен отрицательно, сенсорная ПНК ассоциируется с поликатионным полихромофором, что делает возможным перенос энергии с поликатионного полихромофора на сигнальный хромофор, например, по механизму переноса энергии Ферстера. Если добавляют полинуклеотид с основной последовательностью, не комплементарной последовательности сенсорной ПНК, не происходит гибридизации пары оснований и не имеет места опосредованное электростатическими взаимодействиями комплексообразование между полихромофором и сенсорной ПНК. Так как среднее расстояние между поликатионным полихромофором и сигнальным хромофором в отсутствие гибридизации слишком велико для эффективного переноса энергии, сигнальный хромофор либо излучает слабо, или эмиссия отсутствует. Вся схема служит для обнаружения присутствия целевого полинуклеотида в испытуемом растворе. Кроме того, ПНК также способна образовывать триплексные структуры за счт связывания с и внедрения в днДНК и замены нити ДНК той же последовательности 15,16,17. Такие платформы сенсорная ПНК/поликатионный полихромофор могут быть встроены в системы для непосредственного обнаружения днДНК. Помимо описанного метода изобретение включает преимущественно водный раствор, содержащий по меньшей мере два компонента: (a) катионный полихромофор и (b) "сенсорную ПНК" (ПНК-С), содержащую пептидно-нуклеиновую кислоту, конъюгированную с сигнальным хромофором. Как показано в примерах, оптическую амплификацию, обеспечиваемую водорастворимым полихромофором, таким как конъюгированный полимер, можно использовать для обнаружения гибридизации полинуклеотида с ПНК сенсором. Амплификацию можно повысить, применяя более высокомолекулярные водорастворимые конъюгированные полимеры или другие структуры в качестве поликатионных полихромофоров по данному описанию. Изобретение может осуществляться в гомогенном формате, который использует лгкость методов обнаружения флуоресценции и более активную гибридизацию, основанную на взаимодействии ПНК-ДНК. Изобретение можно применять для обнаружения амплифицированных целевых полинуклеотидов или, вследствие повышенной амплификации сигнала, в качестве самостоятельного анализа, не требующего амплификации полинуклеотида. Таким образом, уникальные преимущества данного изобретения перед современным методом "генного чипа" включают обход требования перед анализом сначала метить каждый анализируемый образец с помощью ковалентного связывания люмофоров или хромофоров с полинуклеотидами, содержащимися в образце или выделенными из образца. Эти методы связывания имеют собственные сложности при воспроизведении эффективности связывания и приводят к необходимости кросс-калибровки от образца к образцу. Изобретение по данному описанию применимо к любому анализу, в котором к образцу могут возникнуть вопросы, касающиеся целевого полинуклеотида. Типичные анализы включают определение присутствия целевого полинуклеотида в образце или его относительного количества, или анализы могут-2 007652 быть количественными или полуколичественными. Все способы по изобретению могут осуществляться в многочисленных форматах. Множество различных сенсорных ПНК можно применять для обнаружения соответствующих различных целевых полинуклеотидов в образце при использовании различных сигнальных хромофоров, конъюгированных с соответствующими сенсорными ПНК. Создано много методов с применением 3, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50,100, 200, 400 или более различных сенсорных ПНК, которые можно одновременно использовать для анализа соответствующих различных целевых полинуклеотидов. Методы можно осуществлять на субстрате (подложке), а также в растворе, хотя полагают, что формат раствора более быстр вследствие диффузии. Так, анализ можно проводить, например, в определнном формате в субстрате (подложке), который может быть сенсором. Это можно осуществлять с помощью "заякоривания" или другим образом вводить компонент для анализа, например сенсорный полинуклеотид, поликатионный полихромофор или оба, в субстрат (подложку). Эти подложки могут представлять собой поверхности стекла, силикагеля, бумаги, пластика или поверхности оптоэлектронных полупроводников (таких как, но без ограничения, нитрид галлия с добавкой индия или полимерные полианилины и т.д.), используемых в качестве оптоэлектронных датчиков. Локализация данного сенсорного полинуклеотида может быть известна или определяется в определнном формате и определнный формат может быть доступен для микро- или наноизмерений. Прежде чем настоящее изобретение будет описано более подробно, следует понять, что данное изобретение не ограничивается конкретными описанными методами, приборами, растворами или аппаратами, так как такие методы, приборы, растворы и аппараты, естественно, могут меняться. Также следует понимать, что терминология, применяемая в данном описании для характеристики конкретных вариантов изобретения, не претендует на ограничение объма настоящего изобретения. Применение формы единственного лица включает ссылки на множественное число, если в тексте не указано иначе. Так, например, ссылка на "целевой полинуклеотид, полинуклеотид-мишень" включает ряд целевых полинуклеотидов, ссылка на "сигнальный хромофор" включает ряд таких хромофоров,ссылка на "сенсорную ПНК" включает ряд сенсорных ПНК и т.п. Кроме того, применение ссылок на конкретное множественное число, таких как "два", "три" и т.д., если в тексте точно не указано иначе,относится к большему числу таких же объектов. Термины, такие как "связанный", "присоединнный", "соединнный" и "конъюгированный" попеременно применяются в данном описании и охватывают прямое (непосредственное), а также непрямое соединение, присоединение, связывание или конъюгацию (сопряжение), если в тексте ясно не указано иначе. Если датся интервал значений, следует понимать, что также конкретно датся каждое входящее в этот интервал значение и каждый его отрезок между его верхним и нижним пределами, наряду с каждым субинтервалом между этими значениями. Верхний и нижний пределы любого интервала могут независимо включаться в этот интервал или исключаться из этого интервала, и каждый интервал, в который включены любой, ни один или оба предела, охватываются данным изобретением. Если обсуждаемое значение имеет собственные, присущие ему интервалы, например, если компонент может присутствовать в концентрации 0-100% или если рН водного раствора может изменяться в интервале 1-14, эти собственные интервалы также охватываются. Если значение датся точно, следует понимать, что значения около этой величины или количества также входят в объм данного изобретения, так же как и интервалы,включающие это значение. Если охватывается комбинация, также конкретно охватывается каждая субкомбинация элементов этой комбинации. И напротив, если охватываются различные элементы или группы элементов, также охватываются их комбинации. Если любой элемент изобретения описывается как имеющий множество альтернатив, примеры этого изобретения, в котором каждая альтернатива исключается, одна или в любой комбинации с другими альтернативами, тем самым также охватываются; более одного элемента по изобретению может иметь такие исключения, и все комбинации элементов, имеющих такие исключения, тем самым охватываются. Если не указано иначе или если контекст чтко не предписывает иного, все технические и научные термины, применяемые в данном описании, имеют общепринятые и обычно понятные рядовому специалисту в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя любые методы и материалы, аналогичные или эквивалентные представленным в данном описании, можно использовать при практическом применении настоящего изобретения или при испытании по данному изобретению, в данном описании представлены предпочтительные методы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном описании, вводятся в него ссылкой с целью раскрытия и описания конкретных материалов и методологий, для которых приводится ссылка. Публикации, обсуждаемые в данном описании, приводятся единственно по причине их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Определения При описании настоящего изобретения применяются следующие термины, и предполагается, что они определяется как указано ниже. Термины "полинуклеотид", "олигонуклеотид", "нуклеиновая кислота" и "молекула нуклеиновой кислоты" применяются в данном описании попеременно (взаимозаменяемо) в отношении полимерной фор-3 007652 мы нуклеотидов любой протяжнности и могут включать рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, их аналоги или их смеси. Эти термины относятся только к первичной структуре молекулы. Так, термины включают трх-, двух- и однонитевую дезоксирибонуклеиновую кислоту ("ДНК"), так же как трх-,двух- и однонитевую рибонуклеиновую кислоту ("РНК"). Они также включают модифицированные, например, с помощью алкилирования и/или кэширования, и немодифицированные формы полинуклеотида. Модифицированный или немодифицированный, полимерный целевой полинуклеотид должен иметь полианионный остов, предпочтительно углеводно-фосфатный скелет, с достаточным отрицательным зарядом, чтобы электростатически взаимодействовать с поликатионным полихромофором, хотя во взаимодействии могут дополнительно принимать участие другие силы. Сенсорный полинуклеотид датся как пример пептид-нуклеиновой кислоты, хотя можно использовать другие незаряженные полинуклеотиды,которые в минимальной степени взаимодействуют с полихромофором в отсутствие мишени. Подходящие условия гибридизации для данного аналитического формата может определить специалист в данной области техники; параметры, которые можно корректировать, включают, но без ограничения, концентрации компонентов для анализа, рН, применяемые соли и их концентрацию, ионную силу, температуру и т.д. Более конкретно, термины "полинуклеотид", "олигонуклеотид", "нуклеиновая кислота" и "молекула нуклеиновой кислоты" охватывают полидезоксирибонуклеотиды (содержащие 2-дезокси-D-рибозу), полирибонуклеотиды (содержащие D-рибозу), включая тРНК, рРНК, гРНК и мРНК, сплайсированную или несплайсированную, полинуклеотид любого другого типа, который представляет собой N- или Сгликозид пуринового или пиримидинового основания, и другие полимеры, содержащие фосфатный или другой полианионный остов, и другие полимерные синтетические нуклеиновые кислоты со специфической последовательностью, при условии, что полимеры содержат нуклеиновые основания в конфигурации, которая делает возможными спаривание оснований и стекинг (вертикальное взаимодействие) оснований, такие как обнаруженные в ДНК и РНК. Таким образом, эти термины включают, например, 3'дезокси-2',5'-ДНК, олигонуклеотид N3' Р 5' фосфорамидаты, 2'-О-алкилзамещнную РНК, двух- и однонитевую ДНК, так же как двух- и однонитевую РНК и их гибриды, включая, например, гибриды ДНК и РНК, и также включают известные типы модификаций, например, метки, алкилирование, "кэпы", замену одного или более нуклеотидов на аналог, межнуклеотидные модификации, например такие как модификации с отрицательным зарядом связи (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), модификации с боковыми цепями, например такие как белки (включая ферменты (например, нуклеазы), токсины,антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модификации с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т.д.), модификации, содержащие хелаты (например, металлов, радиоактивных металлов,бора, окислительных металлов и т.д.), модификации, содержащие алкиляторы, с модифицированными связями (например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида или олигонуклеотида. Будет понятно, что термины "нуклеозид" и "нуклеотид", применяемые в данном описании, включают фрагменты, которые содержат не только известные пуриновые и пиримидиновые основания, но также другие гетероциклические основания, которые были модифицированы. Такие модификации включают метилированные пурины или пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие гетероциклы. Модифицированные нуклеотиды или нуклеозиды могут также включать модификации углеводного фрагмента, например, в которых одна или более гидроксильных групп замещена на галоген,алифатические группы или функциональные группы, такие как группы простого эфира, амины или т.п. Предполагается, что термин "нуклеотидная единица" охватывает нуклеозиды и нуклеотиды. Кроме того, модификации нуклеотидных единиц включают перегруппировку, присоединение, замену на по-другому меняющиеся функциональные группы в пуриновом или пиримидиновом основании,которые образуют водородные связи с соответствующим комплементарным пиримидином или пурином. Полученная модифицированная нуклеотидная единица, необязательно, может образовывать пару оснований с другими такими модифицированными нуклеотидными единицами, но не с A, T, С, G или U. Могут вводиться АР-сайты, которые не препятствуют функции полинуклеотида; предпочтительно, полинуклеотид не содержит АР-сайтов. Некоторые или все остатки в полинуклеотиде могут, необязательно,быть модифицированы одним или более способов. Стандартные пары оснований А-Т и G-С образуются в условиях, которые делают возможным образование водородных связей между N3-Н и С 4-окси тимидина и N1 и С 6-NH2, соответственно, аденозина и между С 2-окси, N3 и С 4-NH2, цитидина и С 2-NH2, N'-Н и С 6-окси, соответственно, гуанозина. Так,например, гуанозин (2-амино-6-окси-9D-рибофуранозилпурин) может быть модифицирован с образованием изогуанозина (2-амино-6-амино-9D-рибофуранозилпурина). Такая модификация дат в результате нуклеозидное основание, которое более не образует эффективно стандартную пару оснований с цитозином. Однако, модификация цитозина (1D-рибофуранозил-2-окси-4-аминопиримидина) с образованием изоцитозина (1D-рибофуранозил-2-амино-4-оксипиримидина) дат модифицированный нуклеозид, который не образует эффективно пару оснований с гуанозином, но образует пару оснований с изогуанозином. Изоцитозин получают от Sigma Chemical Co. (St. Louis, МО); изоцитидин можно полу-4 007652 чить по методу, описанному Switzer et al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496 и цитируемых в этой статье ссылках; 2'-дезокси-5-метилизоцитидин можно получить по методу, описанному Tor et al. (1993) J. Am.Chem. Soc. 115:4461- 4467 и цитируемых в этой статье ссылках; и изогуаниновые нуклеотиды можно получать по методу, описанному Switzer et al. (1993), см. выше, и Mantsch et al. (1993) Biochem. 14:55935601, или методом, описанным в Патенте США 5780610. Другие неприродные пары оснований можно синтезировать методом, описанным в статье Piccirilli et al. (1990) Nature 343:33-37 для синтеза 2,6 диаминопиримидина и его комплемента (1-метилпиразол-[4,3]пиримидин-5,7-(4 Н,6 Н)-диона). Известны другие такие модифицированные нуклеотидные единицы, которые образуют уникальные пары оснований, такие, как описанные в статье Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 и Switzer et al., см. выше."Комплементарный" или "практически комплементарный" относится к способности гибридизоваться или образовывать пару оснований между нуклеотидами или нуклеиновыми кислотами, например, как между сенсорной пептид-нуклеиновой кислотой и целевым полинуклеотидом. Комплементарными нуклеотидами, как правило, являются А и Т (или А и U), или С и G. Говорят, что два однонитевых полинуклеотида или ПНА являются практически комплементарными, когда основания с одной нитью (цепью),при оптимальном совмещении и сравнении и с соответствующими инсерциями и делециями образуют пару по меньшей мере примерно с 80% оснований другой цепи, обычно по меньшей мере примерно с 9095% и, более предпочтительно примерно с 98-100%. Или же практическая комплементарность имеет место, когда полинуклеотид или ПНК гибридизуется в условиях селективной гибридизации со своим комплементом. Как правило, селективная гибридизация происходит, когда последовательности по меньшей мере примерно на 65% комплементарны на участке протяжнностью по меньшей мере 14-25 оснований, предпочтительно примерно на 75%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% комплементарны. См. М. Kanehisa Nucleic Acids"Предпочтительное связывание" или "предпочтительная гибридизация" относится к повышенной склонности одного полинуклеотида или одной ПНК связываться со своим комплементом в образце по сравнению с некомплементарным полимером в образце. Условия гибридизации, как правило, включают концентрации солей менее примерно 1 М, более типично, менее примерно 500 мМ, и предпочтительно менее примерно 200 мМ. В случае гибридизации между пептид-нуклеиновой кислотой и полианионным полинуклеотидом гибридизацию можно проводить в растворах, содержащих мало соли или совсем не содержащих соли. Температура гибридизации может быть ниже 5 С, но, как правило, составляет выше 22 С, более типично - выше примерно 30C, и,предпочтительно выше примерно 37 С. Для специфической гибридизации более длинных фрагментов может потребоваться более высокая температура гибридизации. Другие факторы могут влиять на жсткость условий гибридизации, включая состав основания и протяжнность комплементарных нитей, наличие органических растворителей и степень неспаривания оснований, и комбинация параметров является более важной, чем абсолютная величина любого из них по отдельности. Другие условия гибридизации, которые можно контролировать, включают тип и концентрацию буфера, рН раствора, наличие и концентрацию блокаторов для уменьшения связывания остова, таких как растворы последовательностей повторов или блокирующих белков, тип(ы) и концентрацию детергентов, молекулы, такие как полимерные молекулы, которые повышают относительную концентрацию полинуклеотидов, ион(ы) металлов и их концентрацию, хелатирующий(-ие) агент(-ы) и их концентрацию и другие условия, известные в технике."Многократность" ("множественность") в данном описании относится к анализу или другому аналитическому методу, при котором одновременно можно анализировать множество аналитов."Необязательный" или "необязательно" означает, что описанное затем событие или обстоятельство может или не может произойти и что описание включает примеры, в которых это событие или обстоятельство происходит, и примеры, в которых этого не происходит. Образец Часть образца, содержащая, или предположительно содержащая целевой полинуклеотид, может представлять собой любой источник биологического материала, содержащий полинуклеотиды, которые можно получить от живого организма непосредственно или опосредованно, включая клетку, ткань или жидкость, и отложения в этом организме, включая вирусы, микоплазму и органические остатки. Образец может также содержать целевой полинуклеотид, полученный синтетическим методом, полностью или частично. Как правило, образец получают или диспергируют преимущественно в водной среде. Примеры образца, без ограничения, включают кровь, мочу, сперму, молоко, мокроту, слизь, буккальный (ротовой) мазок, соскоб из влагалища, ректальный мазок, аспирационный материал, биопсию иглой, срез ткани,полученной, например, хирургическим путм или при вскрытии (аутопсия), плазму, сыворотку, ликвор,лимфу, внешнюю секрецию кожи, дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы, слзы, слюну, опухоли, органы, образцы составляющих in vitro клеточных культур (включая, но без ограничения, кондиционированную среду, полученную в результате роста клеток в клеточной культуральной среде, клетки, предположительно инфицированные вирусом, рекомбинантные клетки и кле-5 007652 точные компоненты) и рекомбинантную библиотеку, содержащую полинуклеотидные последовательности. Образец может быть позитивным контрольным образцом, заведомо содержащим целевой полинуклеотид или его заменитель. Можно также использовать негативный контрольный образец, который, хотя не ожидают, что он содержит целевой полинуклеотид, но предполагают, что содержит его (за счт примеси одного или более реагентов) или другой компонент, способный давать ложный позитивный продукт, и его тестируют, чтобы подтвердить отсутствие примеси целевого полинуклеотида в реагентах,используемых в данном анализе, а также определить, образуются ли при данном наборе условий анализа ложные позитивы (сигнал позитива в отсутствие целевого полинуклеотида в образце). Образец может быть разведнным, растворнным, суспендированным, экстрагированным или обработанным иным способом, чтобы солюбилизировать и/или очистить любой присутствующий целевой полинуклеотид или сделать его приемлемым для реагентов, которые применяются в схеме амплификации, или для реагентов для обнаружения. Если реагент содержит клетки, клетки можно лизировать или пермеабилизировать, чтобы выделить полинуклеотиды, содержащиеся в клетках. Для лизиса клеток можно использовать буферы для одностадийной пермеабилизации, что позволяет осуществлять следующие стадии, например, полимеразную цепную реакцию, непосредственно после лизиса. Целевой полинуклеотид и получаемые из него продукты амплификации Целевой полинуклеотид может быть однонитевым, двухнитевым или с числом более высокого порядка нитей и может быть линейным или кольцевым. Примеры одноцепочечных (однонитевых) целевых полинуклеотидов включают мРНК, рРНК, тРНК, гяРНК, вирусные геномы онРНК или онДНК, хотя эти полинуклеотиды могут содержать внутренне комплементарные последовательности и значительную вторичную структуру. Примеры двухнитевых целевых полинуклеотидов включают вирусные геномную ДНК, митохондриальную ДНК, хлоропластную ДНК, вирусные геномы днРНК или днДНК, плазмиды,фаг и вироиды. Целевой полинуклеотид можно получать синтетически или очищать (выделять) из биологического источника. Целевой полинуклеотид можно очищать, удаляя или снижая содержание одного или более нежелательных компонентов или концентрируя целевой полинуклеотид. И напротив, если целевой полинуклеотид является слишком концентрированным для конкретного анализа, его можно разбавить. После сбора образца и необязательного извлечения нуклеиновой кислоты нуклеотидную часть образца, содержащую целевой полинуклеотид, можно подвергнуть одной или более препаративных реакций. Эти препаративные реакции могут включать in vitro транскрипцию (IVТ), мечение, фрагментацию,амплификацию и другие реакции. мРНК сначала можно обработать обратной транскриптазой и праймером, чтобы создать кДНК перед обнаружением и/или амплификацией; это можно сделать in vitro с помощью очищенной мРНК или in situ, например, в клетках или тканях, прикреплнных к предметному стеклу. Амплификация нуклеотида увеличивает число копий представляющей интерес последовательности, такой как целевой полинуклеотид. Для применения пригоден ряд методов амплификации, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию на основе нуклеотидной последовательности,применение Q бета репликазы, обратная транскрипция, ник-трансляция и т.п. Если целевой полинуклеотид является однонитевым (одноцепочечным), в первом цикле амплификации образуется продукт удлинения праймера, комплементарный целевому полинуклеотиду. Если целевой полинуклеотид является однонитевой РНК, при первой амплификации для обратной транскрипции РНК в ДНК применяется полимераза с активностью обратной транскриптазы, и можно осуществить дополнительные циклы амплификации, чтобы реплицировать продукты удлинения праймера. Конечно,праймеры для ПЦР должны быть созданы таким образом, чтобы гибридизоваться с областями на соответствующей им матрице, которые дают амплифицируемый сегмент; следовательно, каждый праймер должен гибридизоваться таким образом, что его 3' нуклеотид образует пару с нуклеотидом в нити его комплементарной матрицы, которая локализована 3' от 3' нуклеотида праймера, используемого для репликации этой комплементарной матричной нити при ПЦР. Как правило, кольцевой полинуклеотид амплифицируют путм контактирования целевого полинуклеотида с праймером и полимеразой с подходящей активностью с целью удлинения праймера и репликации целевого полинуклеотида с образованием полноразмерного комплементарного полинуклеотида или его меньшего участка. Можно использовать любой фермент, обладающий полимеразной активностью, который позволяет реплицировать целевой полинуклеотид, включая ДНК-полимеразы, РНКполимеразы, обратные транскриптазы, ферменты, имеющие более одного типа полимеразной активности, и фермент может быть термолабильным или термостабильным. Можно также применять смеси ферментов. Примеры ферментов включают: ДНК-полимеразы, такие как ДНК-полимераза I ("Pol I"), фрагмент Клнова ДНК-полимеразы Pol I, Т 4, Т 7, Секвеназа Т 7, Секвеназы Т 7 Вариант 2.0, ДНКполимеразы Tub, Taq, Tth, Pfx, Pfu, Tsp, Tfl, Tli и Pyrococcus sp GB-D; РНК-полимеразы, такие как РНКполимеразы Е. coli, SP6, Т 3 и Т 7; и обратные транскриптазы, такие как обратные транскриптазы AMV,М-MuLV, MMLV, РНК-аза H-MMLV (SuperScript, SuperScript II, ThermoScript, ВИЧ-1 и RAV2. Примеры полимераз со многими видами специфичности включают RAV2 и Tli (экзо-)полимеразы. Примеры термостабильных полимераз включают ДНК-полимеразы Tub, Taq, Tth, Pfx, Pfu, Tsp, Tfl, Tli и Pyrococcussp. GB-D. Выбирают подходящие условия реакции, при которых возможна амплификация целевого полинуклеотида, включая рН, ионную силу, присутствие и концентрацию одной или более солей, присутствие и концентрацию реагентов и кофакторов, таких как нуклеотиды и ионы магния и/или других металлов (например, марганца), необязательные сорастворители, температуру, термический профиль циклов для схем амплификации, включающих полимеразную цепную реакцию, амплификация также может частично зависеть от применяемой полимеразы, а также от характера образца. Сорастворители включают формамид(как правило, в количествах около 2-10%), глицерин (как правило, около 5-10%) и ДМСО (как правило,около 0,9-10%). Методы могут быть использованы в схеме амплификации, чтобы свести к минимуму продукцию ложных позитивов или артефактов, продуцированных в процессе амплификации. Таковые включают методы "touchdown" ПЦР, методы "горячего старта", применение внутригенных праймеров или создание ПЦР праймеров таким образом, чтобы они образовывали структуру стебель-петля в событиях образования праймер-димера и, таким образом, не амплифицировались. Можно использовать методы ускорения ПЦР, например "центрифужную" (centrifugal) ПЦР, которая делает возможной более интенсивную конвекцию в образце, и содержащую стадии инфракрасного нагревания для быстрого нагревания и охлаждения образца. Можно осуществлять один или более циклов амплификации. В процессе ПЦР можно использовать избыток одного продукта удлинения праймера; предпочтительно, продукт удлинения праймера, полученный в избытке, представляет собой продукт амплификации, который надо обнаружить. Для амплификации различных целевых полинуклеотидов или различных областей конкретного целевого полинуклеотида в образце можно использовать множество различных праймеров. Амплифицированные целевые полинуклеотиды можно подвергнуть послеамплификационной обработке. Например, в некоторых случаях может быть желательна фрагментация целевого полинуклеотида перед гибридизацией, чтобы получить сегменты, которые более доступны. Фрагментацию нуклеиновых кислот можно проводить любым методом, продуцирующим фрагменты такого размера, который пригоден для осуществляемого анализа; подходящие физические, химические и ферментативные методы известны в уровне техники. Реакцию гибридизиции можно осуществлять в условиях, которые позволяют сенсорному полинуклеотиду гибридизоваться с продуктом амплификации, по меньшей мере, в течение части цикла амплификации. Когда анализ проводят таким образом, может иметь место обнаружение этого события гибридизации в реальном времени с помощью мониторинга изменения излучения (эмиссии) света сигнальным хромофором, которое происходит при такой гибридизации в процессе схемы амплификации. Поликатионный полихромофор Показано, что светособирающие полихромофорные системы являются эффективными поглотителями света за счт того, что они содержат множество хромофоров. Примеры включают, но без ограничения, конъюгированные полимеры, агрегаты конъюгированных молекул, люминесцентные красители,связанные через боковую цепь с насыщенными полимерами, полупроводниковые квантово-точечные или дендритные структуры. Например, каждую единицу повтора в конъюгированном полимере можно рассматривать как вносящую вклад в хромофор, квантовые точки состоят из многих атомов, насыщенный полимер может быть функционализован в боковых цепях многими молекулами люминесцентного красителя, и можно синтезировать дендримеры, содержащие многие ковалентно связанные отдельные хромофоры. Связывание хромофорных ансамблей с тврдыми носителями (подложками), такими как полимерные гранулы (бусины) или поверхности, также можно использовать для светособирания. Светособирающая полихромофорная система может эффективно переносить энергию в соседние люминесцентные частицы (например, в "сигнальные хромофоры"). Механизмы переноса энергии, например резонансного переноса энергии (резонансный перенос энергии по механизму Ферстера (или резонансный перенос энергии флуоресценции), FRET), квантовый перенос заряда (перенос энергии по методу Декстера) и т.п. Однако, как правило, эти механизмы переноса энергии имеют относительно короткие пределы; т.е. для эффективного переноса энергии требуется тесная близость светособирающей полихромофорной системы с сигнальным хромофором. В условиях эффективного переноса энергии амплификация эмиссии из сигнального хромофора происходит тогда, когда количество отдельных хромофоров в светособирающей полихромофорной системе велико; т.е. эмиссия из сигнального хромофора более интенсивна, когда длина волны падающего света ("светового пучка накачки"), такова, что свет поглощается светособирающей полихромофорной системой, нежели когда сигнальный хромофор непосредственно возбуждается световым пучком накачки. Конъюгированные полимеры (КП, CP) характеризуются делокализованной электронной структурой и могут быть использованы в качестве высокочувствительных оптических контрольных веществ для химических и биологических мишеней 19,20. Вследствие того, что эффективная длина конъюгации значительно короче, чем длина полимерной цепи, остов содержит большое количество конъюгированных сегментов, находящихся в тесной близости. Таким образом, полимеры эффективны для светосбора и делают возможной оптическую амплификацию по механизму переноса энергии по Ферстеру 21. Водорастворимые КП проявляют исключительную эффективность тушения флуоресценции в присутствии заряженных противоположным зарядом акцепторов и представляют особый интерес для трансдукции событий биоло-7 007652 гического распознавания 22,23. Самопроизвольное межмолекулярное комплексообразование между катионными полиэлектролитами и ДНК описано и является в значительной степени результатом совместного действия электростатических сил 24,25,26. Также недавно открыты гидрофобные взаимодействия между ароматическими полимерными единицами и основаниями ДНК 27,28. Свободная энергия взаимодействий полиэлектролит/ДНК контролируется структурой участвующих частиц, в сочетании с растворами с различными переменными характеристиками, такими как рН, ионная сила и температура 29. Сила и специфичность таких взаимодействий недавно были совместно применены для распознавания третичной структуры плазмидной ДНК 30. Полихромофоры, применяемые по данному изобретению, являются поликатионными, так что они могут электростатически взаимодействовать с целевым полинуклеотидом, что делает возможной близость, обеспечивающую получение энергии, сигнального хромофора на незаряженной сенсорной ПНК с помощью гибридизации между сенсорной ПНК и целевым полинуклеотидом. В описанных методах можно использовать любой поликатионный полихромофор, который может поглощать свет и переносить энергию на сигнальный хромофор на сенсорной ПНК. Примеры полихромофоров, которые можно применять, включают конъюгированные полимеры (которые включают олигомеры), насыщенные полимеры или дендримеры, включающие множественные хромофоры любым практически осуществимым способом, и полупроводниковые нанокристаллы (SCNC). Можно получать конъюгированные полимеры, насыщенные полимеры и дендримеры так, чтобы они включали сложные катионные частицы, или их можно дериватизировать, чтобы сделать их поликатионными после синтеза; полупроводниковые нанокристаллы можно сделать поликатионными, помещая катионные частицы на их поверхность. В предпочтительном варианте изобретения в качестве поликатионного полихромофора используют конъюгированный полимер. Конкретный пример представляет структура 1, где катионный водорастворимый конъюгированный полимер представляет собой поли(9,9-бис(6'-N,N,N-триметиламмоний)гексил)-флуоренфенилен) с иодид-противоионами (показан ниже как полимер 1)23. Конкретный размер этого полимера не важен до тех пор, пока полимер способен поглощать свет и переносить энергию на сигнальные хромофоры, находящиеся поблизости. Типичные значения "n" находятся в интервале от 2 до примерно 100000. Эта конкретная молекулярная структура не является важной; можно применять любой водорастворимый катионный конъюгированный полимер с относительно высокой эффективностью кванта люминесценции. Водорастворимые конъюгированные олигомеры также могут использоваться в качестве поликатионного полихромофора. Пример такого водорастворимого катионного люминесцентного конъюгированного олигомера с йодидными противоионами показан ниже (обозначается в данном описании как олигомер 2): Хотя олигомер 2 с меньшим молекулярным весом не визуализует большой амплификации сигнала,характерной для полимера с более высоким молекулярным весом, такие более низкомолекулярные молекулы пригодны для деконволюции соотношения структура-свойства, которые трудно определить при собственной полидисперсности полимеров и их изменениях от партии к партии. Кроме того, в водных средах олигомеры, такие, как 2, более растворимы, чем их полимерные аналоги, и полагают, что гидрофобные взаимодействия с нейтральными ПНК менее важны для 2, чем для полимерных структур. Таким образом, совокупности олигомеров могут быть желательны для специфических применений. Сенсорная ПНК Получена сенсорная ПНК, комплементарная целевому полинуклеотиду, который требуется анализировать, и она имеет заданную последовательность. Сенсорная ПНК может быть разветвлнной, полимерной или кольцевой, но, как правило, линейна, и может содержать неприродные основания. Молекулярные структуры ПНК хорошо известны. ПНК можно получать с любой известной последовательностью оснований. Химические методы присоединения сигнального хромофора к сенсорной ПНК хорошо известны 10. Структуры конкретных сенсорных ПНК, включая структуры, конъюгированные с хромофорами, можно получать готовыми из промышленных источников или можно синтезировать химически.-8 007652 Сигнальный хромофор Хромофоры, применимые по данному изобретению, включают любое вещество, которое в соответствующем растворе может поглощать энергию поликатионного полихромофора и излучать свет. Для множества анализов можно использовать множество различных сигнальных хромофоров со значительно различающимися спектрами излучения. Хромофор может быть люминофором или флуорофором. Типичные флуорофоры включают флуоресцентные красители, полупроводниковые нанокристаллы, хелаты лантаноидов и зелный флуоресцентный белок. Примеры флуоресцентных красителей включают флуоресцеин, 6-FAM, родамин, Техас красный,тетраметилродамин, карбоксиродамин, карбоксиродамин 6G, карбоксиродол, карбоксиродамин 110, Cascade Blue (каскад синий), Cascade Yellow (каскад жлтый), кумарин, Су 2, Су 3, Су 3.5, Су 5, Су 5.5,Су-Chrome, фикоэритрин, РеrСР (перидинин хлорофилл-а протеин), PerCP-Cy5.5, JOE (6-карбокси-4',5'дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин), NED, ROX(5-(и 6-)карбокси-Х-родамин), HEX, Люцифер жлтый,синий морской, Орегон зелный 488, Орегон зелный 500, Орегон зелный 514, Alexa Fluor 350, AlexaTMR, BODIPY TR, их конъюгаты и их комбинации. Примеры хелатов лантаноидов включают хелаты европия, хелаты тербия и хелаты самария. Большой ряд флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов ("SCNS") известен в технике: методы получения и применения полупроводниковых нанокристаллов описаны в международной заявке РСТ WO 99/26299, опубликованной 27 мая 1999 г.; патенте США 5990479, выданном 23 ноября 1999 г.; иBruchez et al., Science 281:2013, 1998. Полупроводниковые нанокристаллы можно получать с очень узкими полосами эмиссии с чтко определнными длинами волн с максимальным пиком эмиссии, что позволяет в том же анализе в качестве сигнальных хромофоров применять широкий ряд различных SCNS, необязательно в комбинации с другими сигнальными хромофорами не-SCNS типа. Термин "зелный флуоресцентный белок " относится как к нативному Aequorea зелному флуоресцентному белку, так и к мутантным вариантам, которые были идентифицированы как проявляющие изменнные характеристики флуоресценции, включая изменнные максимумы возбуждения и эмиссии, а также спектры возбуждения и эмиссии различного профиля (Delagrave, S. et al. (1995) Bio/Technology 13:151-154; Heim, В. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504; Heim, R. et al. (1995) Nature 373:663-664). Delgrave et al. выделили мутанты клонированного Aequorea victoria GFP, спектр возбуждения которого имеет сдвиг в красную область. Bio/Technology 13:151-154 (1995). Heim, R. et al. сообщил о мутантной форме (Туr66 на His), имеющей полосу флуоресценции в голубой области спектра (Proc. Natl.Acad. Sci. (1994) USA 91:12501-12504). Субстрат (подложка) Субстрат (подложка) может представлять собой широкий ряд материалов, как биологических, небиологических, органических, неорганических, либо любую их комбинацию. Например, подложка может представлять собой плнку Ленгмюра-Блоджетт (Langmuir Blodgett, ПЛБ) функционализованное стекло,Si, Ge, GaAs, GaP, SiO2, SiN4, модифицированный кремний или любой из обширного разнообразия гелей или полимеров, таких как (поли)тетрафторэтилен, (поли)винилиденфторид, полистирол, сшитый полистирол, полиакриловая кислота, полимолочная кислота, полигликолевая кислота, сополимер лактида с гликолидом, полиангидрид, полиметилметакрилат, сополимер этилена с винилацетатом, полисилоксаны,полимерный диоксид кремния, латексы, полимеры декстрана, эпоксисоединения, поликарбонаты или их комбинации. Можно применять полимерные проводники и фотопроводниковые материалы. Субстраты (подложки) могут быть планарными кристаллическим субстратами, такими как субстраты на основе диоксида кремния (например, стекло, кварц и т.п.), или кристаллическими субстратами,применяемыми, например, в полупроводниковой и микропроцессорной технике, такими как кремний,арсенид галлия с добавкой индия и т.п. и включают полупроводниковые нанокристаллы. Субстрат может принимать форму фотодиода, оптоэлектронного сенсора, такого, как оптоэлектронный полупроводниковый чип или оптоэлектронный тонкоплночный полупроводник, или биочип. Расположение индивидуального(-ых) сенсорного(-ых) полинуклеотида(-ов) на субстрате может быть адресуемым; это может быть совершено в формате с высокой плотностью, и расположение может быть микроадресуемым или неадресуемым. Аэрогели диоксида кремния также можно использовать в качестве субстрата и их можно получать методами, известными из уровня техники. Субстраты-аэрогели можно использовать в качестве свободностоящих подложек или в виде покрытия субстрата из другого материала. Подложка может иметь любую форму и, как правило, представляет собой плашку, предметное стекло, гранулу, пеллету, пластину, частицу, микрочастицу, наночастицу, нить, осадок, необязательно пористый гель, листы, ампулу, сферу, контейнер, капилляр, подкладку (слой), полупроводниковую пластину(кристалл), плнку, чип, многолуночный планшет или плашку, оптическую нить и т.д. Подложка может быть любой формы, которая является жстко или полужстко закреплнной. Субстрат (подложка) может-9 007652 содержать выпуклые или вогнутые участки, на которых локализован сенсорный полинуклеотид или другой аналитический компонент. Поверхность субстрата можно протравить, используя хорошо известные методы, чтобы получить заданные особенности поверхности, например, борозды, V канавки, мезаструктуры и т.п. Поверхность подложки может состоять из того же материала, что и подложка или может быть из другого материала и может быть прикреплена к подложке (субстрату) химическими или физическими способами. Такие присоединнные (связанные) поверхности могут состоять из большого ряда материалов, например, полимеров, пластиков, смол, полисахаридов, диоксида кремния или материалов на основе диоксида кремния, углерода, металлов, неорганических кислот, мембран или любого из вышеперечисленных материалов для субстрата. Поверхность необязательно может быть прозрачной и может иметь поверхность с Si-ОН функциональными группами, такими как группы, находящиеся на поверхности диоксида кремния. Субстрат и/или его оптическую поверхность выбирают таким образом, чтобы обеспечить соответствующие оптические характеристики для используемых синтетических методов и/или методов обнаружения. Субстрат и/или поверхность могут быть прозрачными, чтобы была возможна экспозиция субстрата со светом, поступающим с разных сторон. Субстрат и/или поверхность могут быть созданы с отражающей "зеркальной" структурой для повышения "улавливания" света. Субстрат и/или его поверхность, как правило, устойчивы, или обрабатываются таким образом, чтобы быть устойчивыми, в условиях, в которых они экспонируются при использовании, и могут, необязательно, обрабатываться таким образом, чтобы удалять любой резистентный материал после экспозиции в этих условиях. Сенсорные полинуклеотиды могут быть собраны с субстратом или присоединены к субстрату любым подходящим способом, например, методами, описанными в патенте США 5143854, опубликованной международной заявке РСТ WO 92/10092, патентной заявке США 07/624120, поданной 6 декабря 1990 г.,в статье Fodor et al., Science, 251: 767-777 (1991) и в опубликованной международной заявке РСТ WO 90/15070. Методы синтеза этих сенсорных полинуклеотидов с применением стратегии механических синтезов описаны, например, в опубликованной международной заявке РСТ WO 93/09668 и в патенте США 5384261. Другие дополнительные способы включают методы с применением гранул, такие как методы, описанные в РСТ патентной заявке PCT/US93/04145, и методы с применением штырьков, такие как методы,описанные в патенте США 5288514. Дополнительные проточные методы или споттинг-методы, пригодные для связывания сенсорных полинуклеотидов с субстратом, описаны в патентной заявке США 07/980523, поданной 20 ноября 1992 г., и в патенте США 5384261. Реагенты доставляют к субстрату либо (1) заливкой в заданные или предопределнные области, либо (2) "споттингом" на предварительно определнные области. Для защиты участков субстрата можно применять защитное покрытие, такое как гидрофильное или гидрофобное покрытие (в зависимости от природы растворителя), иногда в комбинации с материалами, которые облегчают смачивание раствором реагента в других областях. Таким образом, дополнительно предотвращается вытекание проточных растворов наружу из их проточных путей. Типичные диспенсеры включают микропипетку, необязательно контролируемую роботом, тврдочернильный лазерный принтер, набор пробирок, набор пипеток и т.п., так чтобы последовательно или одновременно доставлять различные реагенты к реакционным областям. Возбуждение и обнаружение хромофоров Для возбуждения можно применять любой измерительный прибор, который обеспечивает длину волны, способную возбуждать поликатионный полихромофор и более короткую, чем длина(-ы) волны,которую требуется обнаружить. Источник возбуждения, предпочтительно, непосредственно незначительно возбуждает сигнальный хромофор. Источником может быть источник УФ-излучения в широкой полосе, такой как дейтериевая лампа с соответствующим фильтром, выводное устройство источника дневного света, такого как ксеноновая лампа или дейтериевая лампа, после прохождения через монохроматор с целью выделения света с заданными длинами волн, газовый лазер, обеспечивающий непрерывную волну (cw), тврдый диодный лазер или любой из пульсовых лазеров. Свет, излучаемый сигнальным хромофором, можно обнаруживать с помощью любого подходящего устройства или любым методом: в уровне техники известны многие подходящие способы. Например, для обнаружения, действительно ли при возбуждении полихромофора испытуемый образец излучает свет с параметрами длины волны сигнального хромофора, можно применять флуориметр или спектрофотометр. Наборы Изобретением также охватываются наборы, содержащие реагенты для осуществления способов по изобретению. В одном варианте изобретения набор содержит однонитевую сенсорную ПНК, комплементарную представляющему интерес целевому полинуклеотиду, и поликатионный полихромофор. Сенсорная ПНК конъюгирует с сигнальным хромофором. В присутствии в образце полинуклеотида сенсорная ПНК приводится в состояние близости к полихромофору при гибридизации с мишенью, которая электростатически связывается с поликатионным полихромофором.- 10007652 Компоненты набора можно хранить в упаковке. Инструкции по применению набора для осуществления способа по изобретению можно прилагать к упаковке и эти инструкции могут поставляться в любом установленном материале. Инструкции могут находиться внутри упаковки или вне упаковки и могут быть напечатаны на внутренней или внешней стороне любой поверхности, образующей упаковку, чтобы инструкцию было удобно читать. Набор может быть в виде сложной формы, содержащей некоторое количество одной или более различных сенсорных ПНК, которые могут гибридизоваться с соответствующими различными целевыми полинуклеотидами. Примеры Нижеприведнные примеры представлены для того, чтобы дать специалисту в данной области техники полное описание того, как осуществлять и применять настоящее изобретение, и не претендуют на ограничение объма того, что относится к изобретению. Были предприняты усилия для того, чтобы гарантировать точность используемых величин (например, количеств, температуры и т.д.), но следует принять во внимание некоторые погрешности и девиации эксперимента. Если не указано иначе, части представляют собой весовые части, температура выражается в градусах Цельсия, а давление атмосферное или приблизительно атмосферное, и все материалы являются продажными. Пример 1. Идентификация пары полихромофор/сигнальный хромофор для FRET Способность переносить энергию со светособирающей полихромофорной системы на сигнальный хромофор на сенсорной ПНК демонстрируют, используя катионный водорастворимый конъюгированный полимер 9,9-бис(6'-N,N,N-триметиламмоний)гексил)флуоренфенилен), полимер 1 с иодидными противоионами, полученный как описано 23, и сенсорная пептид-нуклеиновая кислота ПНК-С, имеющая последовательность 5'-CAGTCCAGTGATACG-3' и конъюгированная с флуоресцеином (С) в 5' положении. Соответствующие спектры поглощения (зелный и оранжевый) и излучения (голубой и красный) полимера 1 и сенсорной пептид-нуклеиновой кислоты ПНК-С даны на фиг. 2. Возбуждение осуществляют при 380 и 480 нм для 1 ПНК-С, соответственно. Данные показывают, что имеется оптическое окно для специфического возбуждения полимера 1. Кроме того, имеется превосходное перекрывание между эмиссией (излучением) полимера 1 и поглощением С, что делает возможным FRET31. Пример 2. Демонстрация FRET в присутствии целевого полинуклеотида Зонд ПНК-С([ПНК-С]=2.5x10-8 М) контактирует с эквимолярным количеством комплементарной онДНК, содержащей 15 пар оснований, (5'-CGTATCACTGGACTG-3')3, и, аналогичным образом, с некомплементарной онДНК, содержащей 15 пар оснований, (5'-ACTGACGATAGACTG-3')4, в раздельных сосудах в отсутствие полимера 1. Стадию отжига проводят в отсутствие буфера, т.е. при низкой ионной силе, при температуре, на 2 С ниже Тm(Тпл) ПНК-С (72 С при 10-8 М, рН=5,5). Проводят эксперимент в расплаве и мониторинг поглощения осуществляют с помощью УФ-спектроскопии в видимой области(UV/Vis) при 260 нм. Повышение температуры приводит к повышению поглощения при плавлении гибридизованного дуплекса в образце, содержащем комплементарную онДНК, так как две одиночных нити поглощают сильнее, чем гибридизованный дуплекс. Как и ожидали, в образце, содержащем некомплементарную онДНК, не наблюдается такого повышения поглощения, так как он в этом образце не образует никакого дуплекса.FRET определяют в отожжнных образцах, содержащих комплементарную и некомплементарную онДНК и полимер 1 ([1]=2,3x10-7 М). Нормализованные спектры излучения ПНК-С в присутствии комлементарной (красный) и некомплементарной (чрный) ДНК при возбуждении полимера 1 показаны на фиг. 3. Найдено, что величина отношения FRET11 раз выше для гибрида ПНК/ДНК по сравнению с некомплементарной парой 34. Эта разница в значении FRET демонстрирует специфичность описанного метода для данного целевого полинуклеотида. Кроме того, излучение флуоресцеина более чем в 8 раз больше, чем излучение, получаемое при непосредственном С возбуждении в отсутствие 135. Эта повышенная С эмиссия в комплексе для переноса энергии, содержащем сенсорную ПНК, целевой полинуклеотид и поликатионный полихромофор, указывает, что оптическая амплификация обеспечивается полихромофором (полимер 1). Это сенсибилизированное излучение акцептора наблюдается только в присутствии комплементарного целевого полинуклеотида. Пример 3. Оптимизация переноса энергии Оптимизацию переноса энергии осуществляют, изменяя отношение соединения 1 к ПНК-С. При концентрации [ПНК-С]=2,5x10-8 М начальное прибавление 1 вызывает немедленное повышение отношения FRET. Когда [1] намного превышает [ПНК-С], наблюдается понижение. Согласно ранее опубликованным сведениям о молекулярной массе 23 максимум соотношения FRET примерно соответствует 1:1 отношению полимерных цепей к нитям ПНК. Такое соотношение ожидалось, так как когда [1]/[ПНКС]1, не все онДНК/ПНК-С гибридные нити эффективно дают комплекс с независимыми полимерными цепями. Напротив, в режиме, когда [1]/[ПНК-С]1, не все фотоны, испускаемые 1 (донором) могут быть перенесены на гибрид ДНК/ПНК-С (акцептор). Заметим, что С излучение в точке насыщения более чем в 25 раз выше, чем излучение, получаемое при непосредственном С возбуждении (480 нм),что является дополнительным доказательством амплификации сигнала с помощью множественной (поли) хромофорной структуры полимера 1.- 11007652 Пример 4. Применение органического растворителя для понижения фонового сигнала Изучение фиг. 3 показывает слабый сигнал флуоресцеина, излучаемый негибридизованным ПНК зондом, который может возникать в результате гидрофобных взаимодействий между 1 и ПНК-С. Прибавление этанола к анализируемому раствору до конечной концентрации 10% этанола в условиях, идентичных условиям в примере 2, приводит к понижению фонового С излучения. Присутствие органического растворителя уменьшает гидрофобные взаимодействия и снижает фоновое С излучение в 3 раза, в этой точке фоновый сигнал почти не обнаруживается стандартным флуориметром 37. Пример 5. Обнаружение целевого полинуклеотида с применением второго поликатионного полихромофора Водорастворимый конъюгированный олигомер 2, полученный как описано в литературе 23, со средним значением n=20 используют в качестве светособирающего хромофора. Нормализованные спектры излучения ПНКС в присутствии комплементарной (красный) и некомплементарной (чрный) ДНК при возбуждении олигомера 2 показаны на фиг. 4. Анализ проводят, как описано в примере 2, при [2]=6,7 х 10-8 М и [ПНК-С]=2,5 х 10-8 М. На фиг. 4 показано, что С излучение (эмиссия) обнаруживается только тогда, когда присутствует комплементарный целевой полинуклеотид. Сравнение фиг. 3 и 4 показывает, что применение конъюгированных полимеров(олигомеров) с более высокой молекулярной массой дат более высокие соотношения FRET. Таким образом значительно более высоких соотношений FRET и, соответственно, более высокой чувствительности можно ожидать при использовании поликатионных полихромофоров с более высокой молекулярной массой, чем молекулярная масса поликатионных полихромофоров, применяемых в примерах. ССЫЛКИ: 1PTI Quantum Master fluorimeter equipped with a Xenon lamp excitation source and a Hamamatsu PMT. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ анализа полинуклеотдов, заключающийся в приготовлении образца, предположительно содержащего целевой полинуклеотид; получении поликатионного полихромофора, электростатически взаимодействующего с целевым полинуклеотидом и способного при возбуждении переносить энергию на сигнальный хромофор; получении сенсорной пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК), являющейся однонитевой и комплементарной целевому полинуклеотиду, причм сенсорная ПНК конъюгирована с сигнальным хромофором; контактировании образца с сенсорной ПНК и полихромофором в растворе в условиях, при которых сенсорная ПНК может гибридизоваться с целевым полинуклеотидом, если он присутствует; поднесении к раствору источника света, который может возбуждать полихромофор; и обнаружении, излучается ли свет сигнальным хромофором. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полихромофор представляет собой дендример. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что полихромофор представляет собой полупроводниковый нанокристалл. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что полихромофор представляет собой конъюгированный полимер. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что конъюгированный полимер имеет структуру 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что конъюгированный полимер имеет структуру 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что количество света, излучнного сигнальным хромофором при возбуждении полихромофора, больше, чем количество света, полученного при непосредственном возбуждении сигнального хромофора. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что образец контактирует с сенсорной ПНК и полихромофором в присутствии достаточного количества органического растворителя для уменьшения гидрофобных взаимодействий между сенсорной ПНК и полихромофором. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что образец контактирует с рядом сенсорных ПНК, имеющих соответствующие различные последовательности, причм указанные различные сенсорные ПНК содержат различный сигнальный хромофор, и каждая из указанных различных сенсорных ПНК может селективно гибридизоваться с соответствующим различным целевым полинуклеотидом. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что его осуществляют на подложке (субстрате). 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что излучнный сигнальным хромофором свет выше порогового уровня указывает, что целевой полинуклеотид присутствует в образце. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что количество света, из- 13007652 лучнного сигнальным хромофором, измеряют и применяют для определения количества целевого полинуклеотида в образце. 13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что количество света, излучнного сигнальным хромофором при возбуждении полихромофора, по меньшей мере в восемь раз больше, чем количество света, полученного при непосредственном возбуждении сигнального хромофора. 14. Раствор для распознавания полинуклеотида, содержащий сенсорную пептид-нуклеиновую кислоту (ПНК), являющуюся однонитевой и комплементарной целевому полинуклеотиду, причм указанная сенсорная ПНК связана с сигнальным хромофором; поликатионный полихромофор, который может электростатически взаимодействовать с фосфатным остовом целевого полинуклеотида и способен переносить энергию на сигнальный хромофор при возбуждении, когда оказывается вблизи него при гибридизации сенсорной ПНК с целевым полинуклеотидом. 15. Набор для анализа образца на целевой полинуклеотид, включающий сенсорную пептид-нуклеиновую кислоту (ПНК), являющуюся однонитевой и комплементарной целевому полинуклеотиду, причм указанная сенсорная ПНК конъюгирована с сигнальным хромофором; и поликатионный полихромофор, который может электростатически взаимодействовать с фосфатным остовом целевого полинуклеотида и способен переносить энергию на сигнальный хромофор при возбуждении, когда оказывается вблизи него при гибридизации сенсорной ПНК с целевым полинуклеотидом.