Полицистронная экспрессия антител
Формула / Реферат
1. Полицистронный вектор для экспрессии функциональных антител в эукариотических хозяйских клетках, причем указанный вектор содержит полицистронную транскрипционную систему, включающую в себя следующие элементы, оперативно связанные в ориентации от 5' к 3':
(i) промотор, оперативный в эукариотической клетке;
(ii) первый цистрон, содержащий первую последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь антитела, которая необязательно содержит на своем 5'-конце сигнальную последовательность, кодирующую пептид, оперативную в эукариотических клетках, где указанная первая последовательность ДНК не содержит на своем 3'-конце поли-А-последовательность и где указанная первая последовательность ДНК содержит 5'-инициирующий кодон и терминирующий 3'-стоп-кодон;
(iii) IRES (internal ribosome entry site), полученный из члена, выбранного из группы, состоящей из кардиовируса, вируса герпеса и полиовируса; и
(iv) по меньшей мере второй цистрон, содержащий следующие элементы: (а) вторую последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела, где указанная вторая ДНК содержит на своем 5'-конце кодирующую сигнальный пептид последовательность, оперативную в эукариотических клетках, и где указанная вторая последовательность ДНК содержит на своем 3'-конце поли-А-последовательность только в случае, если последовательность ДНК является наиболее приближенной к 3'-концу полицистрона кодирующей последовательностью, и дополнительно содержит инициирующий кодон и стоп-кодон соответственно на 5'- и 3'-концах указанной второй последовательности ДНК;
где первая последовательность ДНК экспрессируется по отношению ко второй последовательности ДНК в соотношении, варьирующем от 10:1 до 1:1 в эукариотической хозяйской клетке, содержащей полицистронный вектор.
2. Полицистронный вектор по п.1, где первая и вторая последовательности ДНК кодируют константные области соответственно тяжелой и легкой цепей антитела, источником которых являются приматы.
3. Полицистронный вектор по п.2, где указанным приматом является человек.
4. Полицистронный вектор по п.1, где первая и вторая последовательности ДНК кодируют вариабельные области соответственно тяжелой и легкой цепей антитела, источником которых являются приматы.
5. Полицистронный вектор по п.4, где указанным приматом является человек.
6. Полицистронный вектор по п.5, где вариабельные области тяжелой и легкой цепей гуманизированы.
7. Полицистронный вектор по п.1, где первая и вторая последовательности ДНК кодируют константные области соответственно тяжелой и легкой цепей антитела, источником которых являются грызуны.
8. Полицистронный вектор по п.7, где указанным грызуном является мышь.
9. Полицистронный вектор по п.1, где первая и вторая последовательности ДНК кодируют вариабельные области соответственно тяжелой и легкой цепей антитела, источником которых являются грызуны.
10. Полицистронный вектор по п.9, где последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, имеют мышиную природу.
11. Полицистронный вектор по п.1, где эукариотический промотор является промотором млекопитающих или вирусным промотором.
12. Полицистронный вектор по п.11, где промотором является промотор CMV.
13. Полицистронный вектор по п.1, где IRES получен из кардиовируса.
14. Полицистронный вектор по п.13, где кардиовирус представляет собой вирус энцефаломиокардита человека.
15. Полицистронный вектор по п.1, где функциональные антитела, экспрессируемые полицистронным вектором, специфически связываются с ассоциированным с опухолью антигеном, антигеном, экс-прессированным на В-клетке, или антигеном, экспрессированным на Т-клетке.
16. Полицистронный вектор по п.15, где функциональные антитела, экспрессируемые полицистронным вектором, специфически связываются с антигеном, выбранным из группы, состоящей из TAG-72, CD4, CD11, CD19, CD20, CD22, CD23, CD37, CD40, CD45, CD80, CD86 и CD154.
17. Полицистронный вектор по п.16, где антигеном является TAG-72.
18. Полицистронный вектор по п.16, где функциональное антитело представляет собой человеческое, гуманизированное, приматизированное или химерное антитело, специфичное в отношении TAG-72.
19. Полицистронный вектор по п.15, где антитело представляет собой ритуксимаб или ибритумомаб.
20. Полицистронный вектор по п.1, где последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь антитела, экспрессируется в соотношении, варьирующем между 3:1 и 1:1 по отношению к тяжелой цепи антитела.
21. Эукариотическая клетка, содержащая полицистронный вектор по любому из пп.1-20, где эукариотическая клетка секретирует приблизительно от 5 до 100 пг функционального антитела в день.
22. Эукариотическая клетка по п.21, где эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего или дрожжевую клетку.
23. Клетка млекопитающего по п.22, где клетка млекопитающего является членом, выбранным из группы, состоящей из клетки почки хомячка, фибробластной, миеломной клетки и клеток яичника китайского хомячка (клетки СНО).
24. Клетка млекопитающего по п.22, которая представляет собой клетку СНО.
25. Дрожжевая клетка по п.23, где указанная дрожжевая клетка выбрана из группы, состоящей из Saccharomyces, Schizosacchoriomyces, Hansenula, Yarrowia, Pichia и Candida.
26. Дрожжевая клетка по п.25, где указанный штамм Pichia представляет собой Pichia pastoris.
27. Способ продуцирования функциональных антител, включающий в себя культивирование эукариотических клеток по п.21 в клеточной культуре для получения функциональных антител и изъятие функциональных антител из культуры эукариотических клеток.
28. Способ по п.27, где культивируемые эукариотические клетки продуцируют, по меньшей мере, приблизительно от 1 до 5 пг антител на клетку в день.
29. Способ по п.28, где указанная эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего или дрожжевую клетку.
30. Способ по п.28, где функциональные антитела извлекают из среды культивирования клеток.
31. Способ по п.28, где функциональные антитела специфически связываются с TAG-72.
32. Способ по п.31, где указанное функциональное антитело включает в себя гуманизированное человеческое или химерное антитело HuCC49 против СН2-домена с удаленным доменом.
33. Способ по п.28, где указанное химерное антитело представляет собой ритуксимаб или ибритумомаб.
34. Способ по п.27, где продуцирование функциональных антител дополнительно включает в себя стадию гомологической рекомбинации.
35. Способ по п.28, где функциональные антитела продуцируются в клеточных культурах с подпиткой.
Текст
007905 Настоящая заявка претендует на приоритет и связана с предварительной патентной заявкой 60/331481, поданной 16 ноября 2001 г., и предварительной патентной заявкой 60/400687, поданной 5 августа 2002 г., обе из которых во всей своей полноте включены в настоящее описание в виде ссылки. Кроме того, в настоящей заявке заявлен приоритет, соответствующий публикации PCT/US02/02373 иPCT/US02/02374, обе из которых были поданы 29 января 2002 г. Область изобретения Настоящее изобретение связано с новой полицистронной экспрессирующей системой и способами продуцирования антител в эукариотических клетках с использованием указанной экспрессирующей системы. Более конкретно, изобретение связано с эукариотической полицистронной экспрессирующей системой, в которой гены тяжелой и легкой цепей антитела транскрибируются из одного и того же промотора, и предпочтительно, чтобы гены тяжелой и легкой цепей были разделены одним или более IRES (internal ribosome entry site). Основа изобретения Методы экспрессии выбранных генов в рекомбинантных хозяйских клетках с использованием полицистронных экспрессирующих векторов хорошо известны. Исторически использовались полицистронные экспрессирующие векторы, включающие в себя последовательность гена требуемого продукта на 5'-конце транскрибируемой области и 3'-последовательность гена селективного маркера. Такие векторы обнаруживают неэффективную трансляцию 3'-селективного гена, хотя и предпочтительную трансляцию последовательности требуемого гена на 5'-конце полицистронной мРНК. Рекомбинантные хозяйские клетки, экспрессирующие высокие уровни требуемых продуктов гена, получают одноступенчатым методом, включающим в себя культивирование исходных трансфектантов в селективной среде. Недостатком таких векторов является непредсказуемое влияние, которое может оказать считывание рамки в обратном направлении на трансляцию последовательности селектируемого маркера. См. Kaufman, Meth. Enzymol., 185: 487 (1990). Например, в патенте США 4713339, выданном на имя Levinson et al. (переуступленного от его лица на имя Genentech, Inc.), описана полицистронная экспрессирующая система, способная продуцировать представляющий интерес продукт гена в эукариотических клетках в качестве хозяев. В системе, запатентованной Levinson et al., последовательность гена второго цистрона кодирует белок, который обеспечивает детектирование трансфектантов или трансформантов, которые экспрессируют представляющий интерес ген, кодируемый первым цистроном. Определенные условия роста индуцируют амплифицированную экспрессию детекторного гена в хозяйской клетке, которая тем самым усиливает экспрессию ассоциированных последовательностей, кодирующих требуемый ген, содержащийся на полицистронной транскрипционной единице. В частности, Левинсоном были сконструированы полицистронсодержащие векторы, в которых последовательность, кодирующая поверхностный антиген вируса гепатита B, была расположена выше последовательности, кодирующей маркер скрининга дигидроксифолат-редуктазы. В результате полицистронной аранжировки векторов Левинсона происходит неравная экспрессия находящейся ниже по течению последовательности маркерного гена второго цистрона по сравнению с экспрессией последовательности первого цистрона. Кроме того, полицистронные экспрессирующие системы использовались для экспрессии многозвенных полипептидов. Полицистронная экспрессия многозвенных полипептидов опубликована, например, в патенте США 6060273 (выданном на имя Dirks et al.); в патенте США 6033670 (выданном на имяBublot); в патенте США 6096505 (выданном на имя Selby et al.); в патенте США 6143520 (выданном на имя Marasco et al.); в патенте США 6153199 (выданном на имя Audonnet et al.) и в патенте 6156558 (выданном на имя Johnston et al.). Исследователями было определено, что уровни экспрессии второго гена в полицистроне улучшаются при встраивании IRES (internal ribosome entry site) между генами в полицистроне. Элементы IRES,сначала идентифицированные в пикорнавирусах, опосредуют инициацию трансляции путем прямого рекрутмента и связывания рибосом с транскриптом, обходя 7-метилгуанозиновый кэп, участвующий в обычном рибосомном сканировании. Присутствие последовательности IRES может повысить уровень кэп-независимой трансляции требуемого белка. В ранних публикациях встречались описательные ссылки на последовательности IRES как на "трансляционные энхансеры". Например, "трансляционные энхансеры" кардиовирусной РНК описаны в патенте США 4937190 (выданном на имя Palmenberg, et аl.) и в патенте США 5770428 (выданном на имя Boris-Lawrie). Были запатентованы некоторые IRES, содержащие репортерные цистроны, такие как XIAP IRES(патенты США 6171821 и 6159709 (выданные на имя Korneluk. Одной из последовательностей IRES, о которых известно, что они используются в полицистронных экспрессирующих векторах, является последовательность вируса герпеса; могут быть использованы также и другие вирусы (см. патент США 6193980). У Korneluk описаны бицистронные векторы, сконструированные путем включения репортерных последовательностей -галактозидазы и хлорамфениколацетилтрансферазы в плазмиду, имеющую промотор CMV, такой, что эти два цистрона разделены областью интерцистронного линкера в 100 п.н.,содержащей последовательность IRES. Первый цистрон, кодирующий -галактозидазу, был транслиро-1 007905 ван с помощью общепринятого кэп-зависимого механизма. Второй цистрон, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу, был транслирован только тогда, когда предшествующая линкерная область содержала сайт IRES. Таким образом, Korneluk было показано, что последовательностями IRES может быть опосредована трансляция второй открытой рамки считывания в бицистронных мРНК-конструктах,созданных для оценки клеточных ответов на стресс. Однако во втором цистроне были использованы только маркерные последовательности, поскольку на предшествующем уровне техники было известно о неэффективности, ассоциированной с экспрессией вторых последовательностей при бицистронных аранжировках. Кроме того, была описана коэкспрессия амплифицируемых маркеров с помощью полицистронных экспрессирующих систем. Например, в международной заявке WO 92/17566 описан способ котрансфекции хозяйских клеток интрон-модифицированного селективного гена и гена, кодирующего представляющий интерес белок. Ген, модифицированный интроном, вырабатывается путем инсерции интрона в транскрибируемую область селективного гена так, чтобы интрон был подвергнут корректному сплайсингу из мРНК с редуцированной эффективностью. Неэффективный сплайсинг такой природы приводит к образованию низких количеств селективного маркерного белка, продуцируемого из интронмодифицированного селективного гена по сравнению с немодифицированными последовательностями селективного гена. Поскольку редуцированные количества селективного гена продуцируются конкурентно с представляющим интерес белком, в этой модели не используется транскрипционный линкер между последовательностями селективного гена и требуемой последовательностью представляющего интерес гена, поскольку эти две последовательности находятся под влиянием отдельных промоторов. Было описано продуцирование антител с помощью дицистронного экспрессирующего вектора, с использованием векторов, экспрессирующих транскрипционный линкер между дигидрофолатредуктазой (DHFR) и нуклеотидной последовательностью, кодирующей требуемый антительный продукт. См. патент США 5561053 (выданный на имя Crowley). В методе Crowley используются ДНКконструкты, имеющие единственный промотор для регуляции экспрессии последовательности селективного маркера и единственная последовательность, кодирующая представляющий интерес белок. Тяжелая цепь требуемого антитела была встроена ниже по течению от селектируемого гена, DHFR, который был помещен внутри интрона на 5'-конце ДНК-конструкта. Интрон был размещен между непосредственным ранним промотором цитомегаловируса (CMV) и последовательностью, кодирующей тяжелую цепь антитела. Легкая цепь антитела была помещена во второй вектор, сконструированный таким образом, чтобы последовательность легкой цепи находилась под контролем промотора/энхансера вируса SV40, а последовательность селективного гена устойчивости гигромицина В находилась под контролем промотора/энхансера CMV и поли-А SV40. Векторы, содержащие последовательности легкой и тяжелой цепей,были линеаризованы и котрансфицированы в хозяйские клетки для экспрессии и последующего образования дисульфидных мостиков между легкой и тяжелой цепями. Таким образом, в порядке получения завершенной структуры антител, согласно Crowley, два вектора должны быть сконструированы таким образом, чтобы происходила раздельная экспрессия компонентов тяжелой и легкой цепей антитела. Этот метод неэффективен для применения в случае множественных векторов. Метод Crowley представляет собой пример ограничений, накладываемых на экспрессию белка,имеющего множественную субъединичную структуру, позиционным эффектом, ассоциированным с традиционными полицистронными экспрессирующими системами. Дисбаланс экспрессии между 5'- и 3'генами в полицистроне снижает эффективность, с которой продукция многозвенных белков или представляющих интерес сходных с ними продуктов может быть выработана в промышленных масштабах. В патенте США 6060273 (выданном на имя Dirks) описаны полицистронные экспрессирующие единицы, с помощью которых получают эквимолярную экспрессию генов, локализованных в соответствующих цистронах. Согласно Dirks, бицистронные экспрессирующие векторы могут иметь конфигурацию для экспрессии двух представляющих интерес генов, таких как PDGF-A и PDGF-B, с помощьюIRES. IRES-зависимая трансляция в бицистронных экспрессирующих векторах производится с помощью последовательности 5'-UTR -глобина Xenopus laevis, которая усиливает экспрессию второго цистрона,так, чтобы была достигнута эквимолярная экспрессия цистронов 1 и 2. Бицистронные векторы могут быть аранжированы следующим образом: промотор-первый цистронIRES-последовательность -глобина-второй цистрон. Несмотря на то, что способ, описанный Dirks, предполагает возможность обойти неэффективность,ассоциированную с полицистронной экспрессией некоторых субъединиц многозвенных белков, тем не менее специалисты в данной области не считают такой подход удовлетворительным решением из-за непредсказуемости экспрессии расположенного ниже по течению цистрона. Mizuguchi et al. (IRESdependent second gene expression is significantly lower than cap-dependent first gene expression in a bicistronicvector. Mol. Therapy, 1 (4): 376-382 (April, 2000 изучали эффективность IRES-зависимой экспрессии второго гена по сравнению с кэп-зависимой экспрессией первого гена in vitro в нескольких культивируемых линиях клеток, а также в мышиной печени in vivo. IRES-зависимая экспрессия второго гена колеблется, составляя от 6 до 100% экспрессии первого гена, в зависимости от того, какие типы клеток и какие-2 007905 репортерные гены используются в векторных конструкциях. А помимо этого, в зависимости еще и от того, селекция каких генов была позиционирована сначала в бицистронных векторах, испытывающих влияние экспрессии гена, расположенного ниже по течению. Более того, Borman et al. отмечали, что эффективность IRES в плане регуляции кэп-независимой трансляции второй цистронной последовательности в большой степени зависела от типа клеток, выбранных в качестве экспрессирующего хозяина. (Comparison of picornaviral IRES-driven internal initiation oftranslation in cultured cell of different origins. Nucleic Acids Res, 25 (5): 925-932 (1997. Исключительную вариабельность в активности наблюдали у индивидуальных элементов IRES векторов, трансфицированных в клетки различных линий. Все это согласуется с тем, что непредсказуемость трансляции последовательностей, находящихся ниже по течению в полицистронных экспрессирующих системах, связана с эффективной продукцией антител, поскольку отношение экспрессии легкой цепи к экспрессии тяжелой цепи является ключевым моментом, обеспечивающим правильную пространственную упаковку (фолдинг) и секрецию антитела. В связи с этим Horwitz и соавторы сделали заключение, что поскольку в природе легкие цепи некоторых антител являются слабо секретируемыми, коэкспрессия и правильная ассоциация легкой и тяжелой цепей является принципиальной для эффективной секреции во всяком случае некоторых антител как целого. (Chimeric immunoglobulin light chains are secreted at different levels: influence of framework-1 amino acids. Mol. Immun. 31 (9): 683-699(1994. Интересно, что Kolb et al. сообщали о неэффективности экспрессии второго цистронного гена в следующем дицистронном экспрессирующем векторе геномной ДНК: промотор CMVпоследовательность гена легкой цепи антитела-IRES-последовательность гена тяжелой цепи антителасигнал полиаденилирования (Expression of a recombinant monoclonal antibody from a bicistronic mRNA.Hybridoma, 16 (5): 421-426 (1997. Результаты Вестерн-блоттинга свидетельствовали о том, что существенное количество легкой цепи продуцировалось этой конструкцией после трансфекции в мышиных миеломных клетках, но при этом белок тяжелой цепи был едва различим. Исследователи создавали этот дицистронный конструкт специально для неэффективной экспрессии тяжелой цепи в связи с токсичностью в отношении хозяйских клеток, вызываемой неспаренными тяжелыми цепями. Полностью укомплектованные функционирующие антитела были обнаружены в супернатанте этих клеток только после очистки на колонке, что свидетельствует о том, что такая комбинация вектор IRES/клетка является плохой моделью для продукции тех или иных антител для использования в коммерческих масштабах. Насколько изобретателям известно, до сих пор в литературе не опубликовано данных об эффективных средствах для продуцирования функциональных многозвенных белков, таких как антитела, с использованием единой полицистронной экспрессирующей системы, подходящей для схем коммерческого продуцирования. Таким образом, существует потребность в эффективных средствах продуцирования коммерчески приемлемых количеств антител в рекомбинантных системах клеток-хозяев, в которых может быть использован единый конструкт для экспрессии двух или более требуемых белковых продуктов,таких как легкие и тяжелые цепи требуемых антител. Краткое содержание изобретения Данное изобретение относится к экспрессии функциональных (антигенсвязывающих) антител на адекватных уровнях экспрессии через полицистронную экспрессирующую систему в эукариотической хозяйской клетке. Более конкретно, изобретение связано с экспрессией функциональных молекул антител в эукариотических клетках, предпочтительно клетках млекопитающих, клетках грибов или дрожжей или, еще более предпочтительно, клетках СНО (клетки яичника китайского хомячка), с использованием полицистронной экспрессирующей системы. Одним из аспектов этого предпочтительного воплощения данного изобретения является экспрессия функциональных антител в клетках млекопитающих с использованием полицистронной экспрессирующей системы, содержащей эукариотический промотор, оперативно связанный, по меньшей мере, с последовательностью, кодирующей легкую цепь антитела, и, по меньшей мере, с последовательностью,кодирующей тяжелую цепь антитела, где такие кодирующие антитело последовательности разделены по меньшей мере одним IRES. В такой экспрессирующей системе ген, ближайший от 3'-конца промотора,имеет на своем 3'-конце поли-А-последовательность, остальные кодирующие последовательности полицистрона лишены поли-А-последовательности, и каждый ген начинается с инициирующего кодона и заканчивается стоп-кодоном. В другом воплощении настоящего изобретения представлена полицистронная экспрессирующая единица, содержащая в направлении от 5' к 3' промотор CMV, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей легкую цепь антитела, которая фланкирована инициирующим кодоном и стопкодоном, за которым следуют одна или более последовательностей, кодирующих тяжелую цепь антитела. Каждая последовательность, кодирующая тяжелую цепь антитела, также фланкирована инициирующим кодоном и стоп-кодоном. Каждая пара последовательностей, кодирующих тяжелую цепь антитела,разделена по меньшей мере одним IRES, предпочтительно IRES кардиовируса, такого как вирус человеческого энцефаломиокардита или полиовирус.-3 007905 Последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь антитела, предпочтительно экспрессируется в соотношении, варьирующем между 10:1 и 1:2 по отношению к последовательности ДНК, кодирующей тяжелую цепь антитела. Более предпочтительно, если легкая цепь антитела будет экспрессироваться в соотношениях, более сбалансированных по отношению к тяжелой цепи, т.е. приблизительно от 5/1 до 1/1, а еще более предпочтительно приблизительно от 3/1 до 1/1, и еще более предпочтительно приблизительно от 1,5/1 до 1/1. Другим воплощением настоящего изобретения является эукариотическая линия клеток, такая как линия клеток СНО, которая секретирует антитело, где экспрессия указанного антитела происходит через полицистрон, как описано в настоящей заявке. В одном аспекте изобретения полицистрон содержит в направлении от 5' к 3' после промотора CMV следующее: сигнал, благоприятствующий секреции; последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, которая содержит инициирующий кодон и стопкодон, но которая не содержит поли-А-последовательности; IRES, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из кардиовируса, полиовируса и вируса герпеса; по меньшей мере одну последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, каждая из которых оперативно связана с сигнальной последовательностью, благоприятствующей секреции; и в 3'-положении каждой последовательности, кодирующей тяжелую цепь, один IRES, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из кардиовируса,полиовируса и вируса герпеса, IRES, и поли-А-последовательность, содержащуюся на 3'-конце гена, локализованного на 3'-конце полицистрона. Предпочтительно, если эукариотическая клетка, содержащая полицистрон, будет секретировать приблизительно 5-100 пг функционального антитела на клетку в день. Предпочтительно по меньшей мере 1-5 пг антитела на клетку в день, по меньшей мере, в течение 3-4 дневного периода без перерыва. В предпочтительных воплощениях, эукариотическая клетка представляет собой клетку СНО или дрожжевую клетку, например, Pichia. Другим воплощением настоящего изобретения является культура клеток млекопитающих или дрожжевых клеток, содержащая полицистронную экспрессирующую систему, способную продуцировать функциональные антитела. Векторы, содержащие полицистронные последовательности согласно изобретению, могут быть включены в клетки млекопитающих или дрожжевые клетки. В процессе культивирования клеток необходимые последовательности экзогенных ДНК могут быть введены для нацеливания на клетки млекопитающих или дрожжевые клетки так, чтобы экзогенная ДНК была встроена в геном клетки млекопитающего или дрожжевой клетки путем гомологической рекомбинации. В зависимости от используемой последовательности, функциональные антитела могут быть получены из биомассы клеточной культуры или из среды культивирования клеток. Способы интеграции генов в специфические сайты в эукариотических клетках, например клетках млекопитающих, путем гомологической рекомбинации, и векторы, подходящие для таких рекомбинантных процессов, описаны в патентах США 5998144,5830698 и 6413777, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылок. Еще одним воплощением является способ продуцирования функционального антитела, включающего в себя культивирование эукариотических клеток, предпочтительно клеток млекопитающих или дрожжевых клеток, содержащих полицистронную экспрессирующую систему, которая экспрессирует последовательности легкой и тяжелой цепей, и получение функциональных антител из культуры этих клеток. Функциональные антитела могут быть получены в клеточных культурах с подпиткой на уровнях,подходящих для терапевтического использования, в условиях, оптимизированных для максимальной коммерческой производительности. Например, клетки СНО, растущие в клеточных культурах с подпиткой, в которых уровни глюкозы непрерывно контролируются, могут продуцировать рекомбинантный протеин, по меньшей мере, в течение 12 или более дней. См., например, патент США 6180401 в связи с обсуждением, связанным с производительностью рекомбинантного протеина клетками, растущими в клеточных культурах с подпиткой. Краткое описание чертежей Изобретение дополнительно проиллюстрировано на фигурах, описанных здесь, где на фиг. 1 схематически изображен чертеж полицистронного экспрессирующего конструкта, кодирующего HuCC49, гуманизированное анти-TAG72-антитело; на фиг. 2 схематически изображен чертеж вектора NEOSPLA и сайты IRES между последовательностями легкой и тяжелой цепей; на фиг. 3 схематически изображен чертеж вектора NEOSPLA, в котором последовательности генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина локализованы в независимых транскрипционных кассетах; на фиг. 4 изображен Саузерн-блоттинг полицистронных HuCC49 G418-резистентных клеточных изолятов 22 Е 6 и 22 В 6, зондируемых тяжелой цепью HuCC49; на фиг. 5 изображен Саузерн-блоттинг полицистронных HuCC49 G418-резистентных клеточных изолятов 25 А 2 и 22 Н 10, зондируемых тяжелой цепью HuCC49; и на фиг. 6 показана последовательность экспрессирующей конструкции HuCC49, которая представляет собой гуманизированное антитело, которое связывается с TAG-72; на фиг. 7 схематически изображена конструкция полицистронного экспрессирующего конструкта согласно изобретению. L означает лидерную последовательность, VL означает ДНК, кодирующую вариабельную легкую цепь антитела, а VH означает ДНК, кодирующую вариабельную тяжелую цепь антитела;-4 007905 на фиг. 8 изображена плазмида PCEMPTY A4, используемая для конструкции полицистронного вектора согласно изобретению; фиг. 9 отражает последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды PCEMPTY A4; на фиг. 10 изображена плазмида PCEMPTY В, используемая для конструкции полицистронного вектора согласно изобретению; на фиг. 11 изображена последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды PCEMPTY В; на фиг. 12 изображен полицистронный вектор согласно изобретению, Polycis 2, который экспрессирует HuCC49 Gly/Ser; на фиг. 13 изображена последовательность нуклеиновой кислоты HuCC49 Gly/Ser, содержащаяся в векторе Polycis 2. Подробное описание воплощений Прежде чем представить подробное описание предпочтительных воплощений, следует ввести следующие определения."IRES", или internal ribosome entry sites, означает область молекулы нуклеиновой кислоты, например, молекулы мРНК, которая дает возможность войти в рибосому/связаться с ней, и которой достаточно, чтобы инициировать трансляцию при анализе кэп-независимой трансляции, такой как анализ бицистронного репортера, описанный в патенте США 6715821. Наличие IRES в составе молекулы мРНК дает возможность реализации кэп-независимой трансляции соединенной кодирующей белок последовательности, которая в противном случае транслироваться не будет. Впервые IRES были идентифицированы в пикорнавирусах и с тех пор считаются образцом кэп-независимой трансляции. 5'UTRS всех пикорнавирусов являются длинными и опосредуют инициацию трансляции напрямую путем рекрутинга и связывания рибосом, обходя таким образом начальную стадию кэп-связывания. Элементы IRES часто обнаруживаются в вирусных мРНК и редко обнаруживаются в невирусных мРНК. На сегодняшний день, показано, что невирусные мРНК содержат функциональные элементыIRES в их соответствующих 5'UTRS, включая такие, которые кодируют белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина (BIP) (Macejak, D.J. et al., Nature 353: 90-94 (1991; Drosophila Antennapedia (Oh,S.K. et al., Genes Dev. 6: 1643-53 (1992; и Ultrabithoran (Ye, X. et al., Mol. Cell. Biol. 17: 1714-21 (1997; фактор роста фибробластов 2 (Vagner et al., Mol. Cell. Biol. 15: 35-47 (1915); фактор инициации (Gan et al.,J.Biol. Chem. 273: 5006-12 (1992; белок-онкоген c-myc (Nambru et al., J. Biol. Chem. 272: 32061-6 (1995;Stonely M. Oncogene 16: 423-8 (1998; фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) (Stein J. et al., Mol.Cell. Biol. 18: 3112-9 (1998. Клеточные элементы IRES не имеют четко идентифицированной последовательности или структурного сходства последовательностей IRES между собой, и следовательно, их идентификация связана с изучением трансляции. Другим известным IRES является XIAP IRES, описанный в патенте США 6171821, который в полном объеме включен в настоящее описание в виде ссылки."Кэп-зависимая трансляция" означает, что 7-гуано,7-метилгуанозиновый кэп обязательно должен присутствовать на 5'-конце молекулы мРНК для инициации трансляции мРНК в белок."Кэп-независимая трансляция" означает, что 7-метилгуанозиновый кэп не является необходимым для трансляции молекулы мРНК. Механизмы кэп-независимой трансляции включают в себя реинициацию рибосом, шунтирование рибосом и внутреннее связывание рибосом."Цистрон" означает "кодирующую последовательность", или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует единственный белок или полипептид."Репортерный цистрон" означает сегмент нуклеиновой кислоты, который кодирует детектируемый генный продукт, который может быть экспрессирован под трансляционным контролем IRES."Репортерный ген" означает любой ген или транслируемую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует продукт, экспрессия которого может быть детектирована и/или оценена количественно с помощью иммунологических, химических, биохимических или биологических методов анализа. Репортерный ген может иметь, например, один из следующих признаков: флуоресценцию (например,зеленый флуоресцирующий белок), токсичность (например, рицин), ферментативную активность (например, lacz/бета-галактозидаза, люцифераза, хлорамфениколтрансфераза), и способность связываться со второй молекулой (например, биотин или детектируемое меченое антитело)."Промотор" означает минимальную последовательность, достаточную для прямой транскрипции,предпочтительно в эукариотической клетке. Сюда входят, в частности, промоторные элементы, которых достаточно для реализации промотор-зависимой экспрессии гена, контролируемой на уровне клеточной специфичности, тканеспецифичности или временной специфичности, или же индуцируемой внешними сигналами или агентами, такие элементы могут быть локализованы на 5'- или 3'-конце последовательности или же в области интронной последовательности конкретного гена. Предпочтительные промоторы для использования в данном изобретении включают в себя вирусные промоторы, промоторы млекопитающих и дрожжевые промоторы, которые могут обеспечить высокий уровень экспрессии, например,промотор CMV млекопитающих, дрожжевая алкогольоксидаза, фосфоглицерокиназный промотор, лактозо-индуцибельные промоторы, галактозидазный промотор, адено-ассоциированный вирусный промотор, бакуловирусный промотор, поксвирусный промотор, ретровирусные промоторы, аденовирусные промоторы, промотор SV40, промотор HMG (гидроксиметилглутарилкоэнзим А), промотор ТК (тими-5 007905 динкиназа), поксвирусные промоторы 7.5K или H5R, поздний МРС-промотор аденовируса типа 2, альфаантитрипсиновый промотор, промотор фактора IX, иммуноглобулиновый промотор, поверхностноактивный промотор CFTR, альбуминовый промотор и трансферриновый промотор."Экспрессирующий вектор" означает ДНК-конструкт, содержащий по меньшей мере один промотор, оперативно связанный с геном, расположенным ниже по течению, цистроном или областью, кодирующей РНК. Здесь подразумевается, что промотор может быть оперативно связан с одним или более генов или цистронов, каждому из которых предшествует инициирующий кодон или стоп-кодон. Трансфекция экспрессирующего вектора в реципиентные клетки, например эукариотическую клетку, например, клетку млекопитающего, грибную клетку, дрожжевую клетку, дает возможность клетке экспрессировать РНК, кодируемую экспрессирующим вектором. Экспрессирующие векторы включают в себя, например, генно-инженерные плазмиды или вирусы."Трансформация" или "трансфекция" означает введение полицистронного вектора или конструкта в соответствующие эукариотические клетки для экспрессии в них генов. Термин "эукариотические клетки" относится к любой эукариотической клетке, которая продуцирует или экспрессирует представляющие интерес гены с помощью полицистронной экспрессирующей системы согласно изобретению. В качестве примеров сюда могут быть включены такие клетки млекопитающих, как клетки СНО, миеломные клетки, ВНК, иммунные клетки, клетки насекомых, клетки птиц,клетки амфибий, например, ооциты лягушек, грибные и дрожжевые клетки. Применимые для экспрессии дрожжи включают в себя, в качестве примера, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida,Torulopsis, Yarrowia, Pichia и пр. Особенно предпочтительные для экспрессии дрожжи включают в себя метилотрофные дрожжевые штаммы, например, Pichia pastoris, Hansenula, polymorpha, Pichia guillermordii, Pichia methanolica, Pichia inositovera и пр. (см., например, патенты США 4812405, 4818700,4929555, 5736383, 5955349, 5888768 и 6258559). В этих и других патентах дополнительно описаны промоторы, терминаторы, энхансеры, сигнальные последовательности и другие регуляторные последовательности, используемые для облегчения экспрессии в дрожжах гетерологичных генов, например генов антител, как в настоящем изобретении. Как следует из данного описания, генетические последовательности, используемые для продуцирования антител с помощью полицистронной экспрессирующей системы согласно изобретению, могут быть получены из целого ряда различных источников. Например, различные гены человеческих антител можно приобрести в депозитариях, имеющих публичный доступ. Многие последовательности антител и кодирующих антитела генов опубликованы, и соответствующие антительные гены могут быть синтезированы из этих последовательностей, в основном, как описано здесь. Альтернативно, антителопродуцирующие клеточные линии могут быть отобраны и культивированы с использованием технологий, хорошо известных специалистам в данной области. Такие технологии описаны в различных лабораторных справочниках и оригинальных публикациях. В этой связи описанные далее технологии, подходящие для применения в связи с настоящим изобретением, описаны также и в Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991) публикации, которые в полном объеме, включая и приложения, включены в настоящее описание в виде ссылки. Кроме того, предпочтительно, чтобы объем настоящего изобретения дополнительно охватывал все аллели, варианты и мутации последовательностей ДНК, описанных в настоящей заявке. Как хорошо известно, РНК, кодирующие антитела, могут быть выделены из первичных антителопродуцирующих гибридомных клеток или из других трансформированных клеток с помощью стандартных технологий, таких как экстракция гуанидиний-изотиоцианатом, а затем центрифугирование или хроматография. Если необходимо, мРНК может быть выделена из суммарной РНК с помощью стандартных технологий, таких как хроматография на oлигodT-цeллюлoзe. Технологии, отвечающие этим целям,хорошо известны в данной области и описаны в указанных выше ссылках. кДНК, которые кодируют легкую и тяжелую цепи антитела, могут быть получены либо совместно,либо порознь, с помощью обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы, в соответствии с общеизвестными методиками. Процесс может быть инициирован праймерами консенсусной константной области или же более специфичными праймерами на основе опубликованных аминокислотных последовательностей и ДНК-последовательностей тяжелой и легкой цепей. Как было сказано выше, можно использовать также PCR для выделения клонов ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепи антитела. В этом случае можно сделать скрининг библиотек консенсусными праймерами или более крупными гомологичными зондами, такими как зонды мышиной константной последовательности. ДНК, кодирующая легкую и тяжелую цепи, может быть выделена, обычно в виде плазмидной ДНК,как здесь описано, из клеток, рестрикционно картированных и секвенированных в соответствии со стандартными, хорошо известными технологиями, подробно описанными в цитируемых выше ссылках, связанных с технологиями рекомбинантных ДНК. Безусловно, ДНК может быть модифицирована, в соответствии с настоящим изобретением, в любой точке в процессе выделения или последующего анализа. Несмотря на то, что композиции и способы согласно изобретению подходят для любого антитела или же на самом деле любого многозвенного (многоцепочечного) белка, здесь описаны предпочтитель-6 007905 ные последовательности антител. Технологии олигонуклеотидного синтеза, совместимые с этим аспектом изобретения, хорошо известны специалистам в данной области и могут быть выполнены с использованием любого из нескольких коммерчески доступных автоматизированных синтезаторов. Кроме того,последовательности ДНК, кодирующие несколько типов описанных здесь тяжелых и легких цепей, могут быть получены посредством услуг, предоставляемых коммерческими фирмами, торгующими ДНК. Генетический материал, полученный с помощью любого из упомянутых выше способов, может быть затем изменен или модифицирован с целью получения антител, совместимых с настоящим изобретением и требуемым применением таких антител. Многообразие различных типов антител может быть экспрессировано согласно настоящему изобретению. Здесь термины "антитело" и "антитела" относятся к макромолекулярному ансамблю, который обладает значительной известной специфической иммунореактивностью в отношении антигена (например, ассоциированного с опухолью антигена), содержащему легкие и тяжелые цепи, содержащему или не содержащему ковалентную связь между ними и, таким образом, включающему в себя одноцепочечные антитела, и тому подобное. Под "модифицированными антителами" согласно настоящему изобретению подразумеваются иммуноглобулины, антитела или их иммунореактивные фрагменты или рекомбинанты,в которых, по меньшей мере, часть одного или более доменов константной области исключена или иным способом изменена так, чтобы обеспечить требуемые биохимические характеристики, такие как способность к нековалентной димеризации, повышенная опухолевая локализация или модифицированное время полужизни в сыворотке, по сравнению с цельным, неизмененным антителом приблизительно такой же иммуногенности (scAb). Для целей, преследуемых в настоящей заявке, конструкции иммунореактивного одноцепочечного антитела, в котором исключены или изменены домены константных областей, могут считаться модифицированными антителами. Как обсуждалось выше, в предпочтительных модифицированных антителах или же антителах с удаленными доменами, экспрессируемыми с использованием полицистронной системы согласно изобретению, может быть исключена, по меньшей мере, часть одного из константных доменов. Более предпочтительно, если один домен константной области будет исключен полностью, или даже еще более предпочтительно, если целиком будет исключен СH2-домен. Основные иммуноглобулиновые структуры (например, антитела и тому подобное) в системах позвоночных относительно хорошо изучены. Как будет более подробно обсуждаться ниже, общий термин"иммуноглобулин" включает в себя пять различных классов антител, которые можно отличить друг от друга по их биохимическим свойствам. Несмотря на то, что все пять классов полностью охватываются настоящим изобретением, последующее обсуждение в целом будет направлено на молекулы класса IgG. Что касается IgG, иммуноглобулины включают в себя две идентичные легкие полипептидные цепи с молекулярной массой приблизительно в 23000 Да и две идентичные тяжелые цепи с молекулярной массой в 53000-70000. Эти четыре цепи связаны дисульфидными мостиками, образуя "Y-подобную конфигурацию, где легкие цепи охватывают тяжелые цепи, начиная от начала развилки "Y" и вплоть до окончания вариабельной области. Димерные ансамбли, описанные здесь, по два, в ассоциации с Y-подобными структурами (H4L4), так, чтобы они образовывали четыре сайта связывания. Отсюда и термин "тетравалентные" антитела. Более конкретно, обе цепи - и тяжелая, и легкая - разделены на области структурной и функциональной гомологии. Термины "константная" и "вариабельная" используются функционально. В этом отношении очень важно, что вариабельные домены обеих цепей - легкой (VL) и тяжелой (VH) - определяют узнавание и специфичность антитела. И наоборот, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи(СH1, СH2 или СH3) ответственны за очень важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарное движение, связывание Fc-рецептора, связывание комплемента и тому подобное. По договоренности, нумерация доменов константных областей возрастает по мере их отдаления от сайта связывания антигена, или от аминоконца антитела. Таким образом, СH3- и СL-домены на самом деле включают в себя карбоксиконец тяжелой и легкой цепей, соответственно. Легкие цепи классифицируются либо как каппа-, либо как лямбда-цепи (, ). Каждый класс тяжелой цепи может быть связан либо с легкой каппа-цепью, либо с легкой лямбда-цепью. Обычно легкая и тяжелая цепи ковалентно связаны друг с другом, и "хвостовые" части тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями, когда иммуноглобулины вырабатываются либо гибридомами, либо В-клетками, либо генно-инженерными хозяйскими клетками. В тяжелой цепи отсчет аминокислотных последовательностей начинается от N-конца на разветвленных концах Y-конфигурации к С-концу внизу каждой цепи. На N-конце находится вариабельная область, а на С-конце находится константная область. Специалистам в данной области известно, что тяжелые цепи классифицируются как гамма-, мю-, альфа-, дельта-, или эпсилон- (, , , , ), с целым рядом промежуточных подклассов."Класс" антитела определяется природой такой цепи, например, IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. Подклассы иммуноглобулинов (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и т.д., достаточно хорошо охарактеризованы и известны тем, что придают им функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов очень хорошо различаются специалистами в данной области в том отношении, которое связано с настоящим описанием, и, соответственно, охватываются объемом данного-7 007905 изобретения. Как было сказано выше, вариабельная область позволяет антителу селективно распознавать и специфически связываться с эпитопами на иммунореактивных антигенах. То есть, VL-домен и VH-домен антитела объединяются, образуя вариабельную область, которая определяет трехмерный антигенсвязывающий сайт. Такая четвертичная структура антитела обеспечивает сайт связывания антигена, находящийся на конце каждого из плечей "Y". Более конкретно, антигенсвязывающий сайт определяется тремя определяющими комплементарность областями (CDR) на каждой из VH- и VL-цепей. Эти шесть областей CDR, присутствующих на каждом мономерном антителе (H2L2), представляют собой короткие, не непрерывные последовательности аминокислот, которые специфически расположены, образуя антигенсвязывающий сайт, когда антитело принимает свою трехмерную конфигурацию в водном окружении. Остальные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей обладают меньшей межмолекулярной вариабельностью аминокислотной последовательности и заканчиваются структурными областями. Структурные области, в основном, принимают конформацию складчатой -структуры, и CDR образуют петли, связанные со складчатой -структурой, а в некоторых случаях и образующие часть складчатой -структуры. Таким образом, эти структурные области образуют структурную основу, которая обеспечивает позиционирование шести CDR в правильной ориентации путем межцепьевых нековалентных взаимодействий. В любом случае антигенсвязывающий сайт, образованный позиционированными CDR, определяет поверхность, комплементарную эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с иммунореактивным эпитопом антигена. Для целей, преследуемых в настоящем изобретении, важно, чтобы антитела, экспрессируемые с помощью полицистронной экспрессирующей системы согласно изобретению, могли содержать любой тип вариабельной области, который обеспечит ассоциацию антитела с выбранным антигеном. В этом отношении вариабельная область может содержать или быть получена из любого типа млекопитающего,у которого может быть индуцирован повышенный гуморальный ответ и выработка иммуноглобулинов против требуемого антигена. Как таковая, вариабельная область модифицированных антител может иметь природу, например, человеческую, мышиную, нечеловекообразных приматов (например, обезьянcynomolgus, макак и т.д.), а также волчью. В особо предпочтительных воплощениях, обе, вариабельная и константная, области совместимых с настоящим изобретением модифицированных антител имеют человеческую природу. В других отдельных воплощениях, вариабельные области совместимых с настоящим изобретением антител (полученных обычно не из человека) могут быть сконструированы генноинженерным путем или специально наращены, с тем, чтобы обеспечить свойства связывания или же уменьшить иммуногенность молекулы. В этом отношении вариабельные области, применимые в настоящем изобретении, могут быть гуманизированы или изменены иным способом через включение импортированных последовательностей ДНК или аминокислотных последовательностей. Для целей, преследуемых в настоящей заявке, термин "гуманизированное антитело" будет означать антитело, полученное из антитела нечеловеческой природы, обычно мышиное антитело, которое сохраняет или в существенной мере сохраняет антигенсвязывающие свойства родительского антитела, но которое является менее иммуногенным у человека. Это может быть достигнуто различными путями, включая (а) пересадку внутренних вариабельных доменов нечеловеческой природы к человеческим константным областям для образования химерных антител; (b) пересадку, по меньшей мере, части одной или более из определяющих комплементарность областей (CDR) нечеловеческой природы в человеческую структурную область и константные области, с сохранением или без сохранения критических остатков структурной области; или (с) трансплантацию внутренних вариабельных доменов нечеловеческой природы, но "скрывая" их "человекоподобным" отрезком путем замены поверхностных остатков. Такие способы описаны у Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-5 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28: 489-498 (1991);Padlan, Molec. Immun. 31: 169-217 (1994), и в патентах США 5585089, 5693761 и 5693762, все из которых в полном объеме включены в настоящее описание в виде ссылок. Специалистам в данной области будет понятно, что с помощью технологии, изложенной в варианте(а) , указанном выше, будут продуцироваться "классические" химерные антитела. В контексте настоящей заявки, термин "химерные антитела" будет относиться к любому антителу, в котором иммунореактивная область или сайт получен или произведен из представителя первого вида, а константная область (которая может быть интактной, частичной или модифицированной в соответствии с настоящим изобретением) получена из представителя второго вида. В предпочтительных воплощениях, антигенсвязывающая область или сайт будет получен из нечеловеческого источника (например, мыши), а константная область будет человеческой. В то время как иммуногенная специфичность вариабельной области обычно не зависит от ее источника, человеческая константная область с наименьшей вероятностью будет вызывать иммунную реакцию у человека, чем, если бы константная область была получена из нечеловеческого источника. Определенные химерные антитела могут быть получены сначала путем иммунизации обезьян требуемым антигеном, затем выделения антител, образовавшихся в ответ на антиген, и наконец, замеще-8 007905 нием константной области тяжелой и легкой цепей константной областью (например, человеческой),обладающей требуемой функцией (например, человеческой эффекторной функцией, и т.п.). Такие "Приматизированные" антитела и способы их получения дополнительно описаны в патенте США 5658570 в полном объеме, включенном в настоящее описание в виде ссылки. Предпочтительно, чтобы вариабельные домены обеих - и тяжелой, и легкой - цепей химерных антител были изменены путем, по меньшей мере, частичной замены одного или более CDR и, если необходимо, путем частичной замены структурной области и изменения последовательности. Хотя CDR могут быть получены из антитела того же класса или даже того же подкласса, что и антитело, из которого получены структурные области, считается, что лучше, если CDR будут получены из антитела другого класса и предпочтительно из антитела, принадлежащего другому виду. Следует подчеркнуть, что необязательно заменять все CDR полноразмерными CDR из вариабельной области донора для того, чтобы перенести антигенсвязывающую способность одного вариабельного домена на другой. Скорее может быть необходимо перенести только те остатки, которые необходимы для сохранения активности антигенсвязывающего сайта. С учетом объяснений, приведенных в патентах США 5585089, 5693761 и 5693762, вопрос о том, проводить ли рутинное экспериментирование или же методом проб и ошибок получить функциональное антитело с пониженной иммуногенностью, остается на усмотрение специалистов в данной области. Несмотря на изменения в вариабельной области, специалистам в данной области будет понятно, что модифицированные антитела, совместимые с настоящим изобретением, будут включать в себя антитела или их иммунореактивные фрагменты, в которых, по меньшей мере, часть одного или более доменов константных областей удалена или же изменена каким-либо другим образом, так, чтобы обеспечить необходимые биохимические характеристики, такие как повышенная опухолевая локализация или модифицированное (например, сокращенное) время полужизни в сыворотке по сравнению с антителом приблизительно такой же иммуногенности, содержащим нативную или неизмененную константную область. В предпочтительных воплощениях, константная область антител, экспрессируемых с использованием полицистронных векторов согласно изобретению, будет содержать человеческую константную область. Модификации константной области, совместимые с настоящим изобретением, включают в себя добавки,делеции или замены одной или более аминокислот в одном или более доменах. Таким образом, описанные здесь модифицированные антитела могут содержать изменения или модификации одного или более из трех константных доменов тяжелых цепей (СH1, СH2 или СH3) и/или константного домена легкой цепи(CL). Как будет более подробно обсуждаться позднее и как будет показано в примерах, в определенных воплощениях настоящего изобретения подразумевается экспрессия антител, имеющих модифицированные константные области, где один или более доменов являются частично или полностью удаленными("антитела с удаленным доменом"). В особо предпочтительных воплощениях, совместимые модифицированные антитела будут содержать конструкции с удаленным доменом или их варианты, где удален полноразмерный СH2-домен (конструкции СН 2). В других предпочтительных воплощениях удаленный домен может быть замещен коротким аминокислотным спейсером для обеспечения гибкости и свободы движений вариабельной области. Как было сказано ранее, субъединичные структуры и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулинов хорошо изучены. Например, если использовать обычные схемы нумерации, СH2-домен Fc-области человеческого IgG обычно простирается приблизительно от остатка 231 до остатка 340. СH2-домен является уникальным в том отношении, что он не полностью спарен с другим доменом. Скорее две N-связанные разветвленные углеводные цепи вставлены между двумя СH2-доменами нативной интактной молекулы IgG. Документировано также и то, что СH3-домен простирается от СH2-домена до С-концевой части молекулы IgG и содержит приблизительно 108 остатков, тогда как шарнирная область молекулы IgG связана с СH2-доменом посредством СH1-домена. Эта шарнирная область охватывает порядка 25 остатков и является гибкой, давая таким образом возможностьN-концевым антигенсвязывающим областям двигаться независимо. Помимо своей конфигурации, константная область, как известно, опосредует несколько эффекторных функций. Например, связывание C1-компонента комплемента с антителами активирует систему комплемента. Активация комплемента играет важную роль в опсонизации и лизисе клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и может быть вовлечена также в механизм аутоиммунной гиперчувствительности. Кроме того, антитела связываются с клетками через Fcобласть, посредством связывания Fc-рецепторного сайта на Fc-области антитела с Fc-рецептором (FcR) на клеточной поверхности. Существует целый ряд Fc-рецепторов, которые специфичны в отношении различных классов антител, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эта-рецепторы), IgA (альфарецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с Fc-рецепторами на клеточной поверхности запускает целый ряд важных и разнообразных клеточных ответов, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клетокмишеней киллерными клетками (так называемая антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность, или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, перенос через плаценту и контроль продукции иммуноглобулинов. Несмотря на то, что Fc-рецепторы и рецепторные сайты в определенной сте-9 007905 пени изучены, все еще очень многое неизвестно относительно их локализации, структуры и функционирования. Как было сказано выше, модификация константной области некоторыми из описанных здесь способов создает возможность у описанных модифицированных антител для спонтанной самосборки или ассоциации в стабильные антитела. Более того, без ограничения объема настоящего изобретения, предполагается, что антитела, содержащие константные области, модифицированные, как здесь описано, обеспечивают измененные эффекторные функции, которые, в свою очередь, оказывают влияние на биологический профиль вводимого антитела. Например, делеция или инактивация (в результате точечных мутаций или какими-либо иными способами) домена константной области может ослабить связывание Fcрецептора циркулирующего модифицированного антитела, тем самым увеличивая опухолевую локализацию. В других случаях может оказаться, что модификации константной области, совместимые с настоящим изобретением, способствуют умеренному связыванию комплемента и тем самым сокращают время полужизни в сыворотке и неспецифическую ассоциацию конъюгированного цитотоксина. Другие модификации константной области могут быть использованы для элиминации дисульфидных связей или подвижности олигосахаридов, что дает возможность усиления локализации в результате повышенной специфичности антител или гибкости антител. В целом специалистам в данной области должно быть понятно, что антитела, модифицированные, как здесь описано, могут оказывать целый ряд слабых воздействий, которые могут быть оценены или которые трудно оценить. Однако полученный в результате физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты, связанные с модификациями, такие как опухолевая локализация и время полужизни в сыворотке, могут легко быть измерены и оценены количественно с помощью хорошо известных иммунологических технологий, без излишнего экспериментирования. Сходным образом, модификации константной области согласно изобретению могут быть легко выполнены с использованием биохимических или молекулярно-биоинженерных технологий, хорошо известных специалистам в данной области. В этой связи в приведенных здесь примерах предлагаются различные конструкции, имеющие константные области, модифицированные в соответствии с настоящим изобретением. Более конкретно, приведенные в примерах конструкции содержат химерные или гуманизированные антитела, содержащие человеческие константные области, которые были получены генноинженерным способом, с удаленным СH2-доменом. Специалистам в данной области должно быть понятно, что такие конструкции особенно предпочтительны из-за регуляторных свойств СH2-домена в отношении скорости катаболизма антитела. Антитела с удаленным СH2-доменом, описанные в документах PCT/US02/02373 иPCT/US02/02374, оба из которых поданы 29 января 2002 г. и в полном объеме включены в настоящее описание в виде ссылки, получены из химерного антитела С 2 В 8, которое является иммуноспецифическим в отношении СD20-пан-В-клеточного антигена, и гуманизированного антитела СС 49, которое является специфическим в отношении антигена TAG-72. Как более подробно описано ниже, обе конструкции с удаленным доменом были получены из соответствующего вектора (IDEC Pharmaceuticals, San Diego),кодирующего человеческий константный домен IgG1. По существу, этот вектор был сконструирован для удаления СH2-домена и получения модифицированного вектора, экспрессирующего константную область IgG1 с удаленным доменом. Гены, кодирующие мышиную вариабельную область антитела С 2 В 8 или вариабельную область гуманизированного антитела СС 49, были затем встроены в модифицированный вектор и клонированы. При экспрессировании в трансформированных клетках эти векторы обеспечивают, соответственно, huCC49.CH2 или С 2 В 8.СН 2. Как проиллюстрировано далее, эти конструкции проявляли целый ряд свойств, которые делали их особенно привлекательными в качестве кандидатов на роль мономерных субъединиц. Следует отметить, что приведенные выше примерные конструкции были сконструированы таким образом, чтобы слить СH3-домен напрямую с шарнирной областью соответствующих модифицированных антител. В других конструкциях может возникнуть необходимость во введении пептидного спейсера между шарнирной областью и модифицированными СH2- и/или СH3-доменами. Например, могут быть экспрессированы совместимые конструкции, в которых удален СH2-домен, а оставшийся СH3-домен (модифицированный или немодифицированный) присоединен к шарнирной области с помощью спейсера,насчитывающего от 5 до 20 аминокислот. Такой спейсер может быть добавлен, например, для гарантии того, что регуляторные элементы константного домена остаются свободными и доступными или что шарнирная область сохраняет гибкость. Однако следует отметить, что аминокислотные спейсеры в некоторых случаях могут оказаться иммуногенными или ингибирующими требуемую димеризацию мономерных субъединиц. Например, конструкция СС 49 с удаленным доменом, имеющая короткий аминокислотный спейсер GGSSGGGGSG (Seq. ID No. 1), заменяющий СH2-домен (СС 49.СН 2 [Gly/Ser]), использована в примерах в качестве контроля, поскольку она спонтанно не преобразуется в димерную форму. Соответственно, любой спейсер, совместимый с настоящим изобретением, будет относительно неиммуногенным и не будет ингибировать нековалентную ассоциацию модифицированных антител. Кроме делеции полноразмерных доменов константной области, было бы предпочтительно, чтобы- 10007905 конструкции полицистронных антител согласно изобретению можно было бы обеспечить путем частичной делеции или замены нескольких или даже единственного аминокислотного остатка, поскольку это допускает требуемую нековалентную ассоциацию между мономерными субъединицами. Например, мутация единственной аминокислоты в выбранных областях СH2-домена может оказаться достаточной для существенного уменьшения Fc-связывания, а следовательно, увеличения опухолевой локализации. Сходным образом, может оказаться желательным просто удалить ту часть одного или более доменов константной области, которая контролирует модуляцию эффекторной функции (например, связывание комплемента CLQ). Такие частичные делеции константных областей могут избирательно улучшать характеристики антитела (время полужизни в сыворотке), оставляя при этом остальные требуемые свойства, ассоциированные с данным константным доменом, неизмененными. Более того, как было упомянуто выше, константные области описанных антител могут быть модифицированы с помощью мутации или замены одной или более аминокислот, которые усиливают профиль полученной в результате конструкции. В этом отношении, возможно нарушить активность, обеспечиваемую консервативным сайтом связывания (например, связывание Fc), при этом в существенной мере сохранив конфигурацию и иммуногенный профиль модифицированного антитела. Другие предпочтительные воплощения могут быть связаны с добавкой к константной области одной или более аминокислот для усиления требуемых характеристик, таких как эффекторная функция, или для обеспечения лучшего прикрепления цитотоксинов или углеводов. В таких воплощениях может оказаться желательным встраивание репликативных специфических последовательностей, полученных из избранных доменов константной области. После манипуляций по выделению генетического материала для получения генов антител и модифицированных антител, как было сказано выше, эти гены затем встраивали в полицистронные экспрессирующие векторы согласно изобретению для интродуцирования их в хозяйские клетки, которые могут быть использованы для продуцирования требуемого количества антител. Ниже в подробностях описано конструирование таких конструкций. Термин "вектор" или "экспрессирующий вектор" используется здесь в описании и в формуле изобретения для обозначения векторов, применяемых согласно изобретению в качестве носителя для введения в клетку и экспрессирования требуемого гена в этой клетке. Как известно специалистам в данной области, такие векторы легко могут быть отобраны из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. Обычно векторы, совместимые с настоящим изобретением, будут включать в себя селективный маркер, соответствующие сайты рестрикции для облегчения клонирования нужного гена и возможности встраивания и/или репликации в эукариотических или прокариотических клетках. Для целей настоящего изобретения может быть использован целый ряд полицистронных систем экспрессирующих векторов. Например, полицистронный вектор может содержать элементы ДНК, которые получены из животных вирусов, таких как бычий вирус папилломы, полиомавирус, аденовирус, вирус коровьей оспы, бакуловирус, ретровирусы (RSV, MMTV или MOMLV) или вирус SV40. Кроме того,клетки, которые содержат в своих хромосомах интегрированный ДНК-конструкт, могут быть отобраны путем введения одного или более маркеров, которые позволяют осуществить селекцию трансфицированных хозяйских клеток. Такой маркер может обеспечить прототрофию ауксотрофным клеткам хозяина,биоцидную резистентность (например, антибиотикам) или резистентность к тяжелым металлам, таким как медь. Селективный маркерный ген может либо быть напрямую связан с экспрессируемыми последовательностями ДНК, либо введен в эту же самую клетку путем котрансформации. Дополнительные элементы могут быть необходимы также и для оптимального синтеза мРНК. Эти элементы могут включать в себя сигналы сплайсинга, также как и транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации. В предпочтительных воплощениях согласно изобретению будут экспрессироваться антитела, включая модифицированные антитела, с использованием новых экспрессирующих полицистронных систем согласно изобретению. В этих новых экспрессирующих системах представляющие интерес продукты множественных генов, такие как тяжелые и легкие цепи антител, могут быть продуцированы с единственного полицистронного конструкта. В этих системах преимущественно используется IRES (internalribosome entry site) для обеспечения относительно высоких уровней модифицированных антител в эукариотических хозяйских клетках. Совместимые последовательности IRES описаны в патенте США 6193980, который также в полном объеме включен в настоящее описание. Специалистам в данной области будет совершенно ясно, что такие экспрессирующие системы могут быть использованы для эффективного продуцирования всех возможных модифицированных антител, описанных в настоящей заявке. В целом, как только получены вектор или последовательность ДНК, кодирующая мономерную субъединицу (например, модифицированное антитело), экспрессирующий вектор может быть встроен в соответствующую хозяйскую клетку. То есть, хозяйские клетки могут быть трансформированы. Введение плазмиды в хозяйскую клетку может быть произведено с использованием различных технологий,хорошо известных специалистам в данной области. Такие технологии включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, трансфекцию (включая электрофорез и электропорацию), слияние протопластов, преципитацию фосфатом кальция, слияние клеток с оболочечной ДНК, микроинъецирование и инфицирование интактным вирусом. См. Ridgway, A.A.G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vec- 11007905tors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Наиболее предпочтительно, чтобы встраивание плазмиды в хозяйскую клетку производилось путем электропорации. Трансформированные клетки, растущие в условиях, подходящих для продуцирования тяжелых и легких цепей, тестируют на наличие белкового синтеза тяжелых и/или легких цепей. Примеры технологий тестирования для идентификации и количественной оценки представляющих интерес продуктов гена включают в себя метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммуноанализа (RIA) или метод клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS), иммуногистохимические методы и т.п. Здесь термин "трансформация" будет использован в широком смысле для обозначения любого введения в репициентную хозяйскую клетку ДНК, которое меняет ее генотип и следовательно, вызывает изменения в репициентной клетке. Здесь под "хозяйскими клетками" подразумеваются клетки, которые трансформированы векторами,сконструированными с использованием технологий рекомбинантных ДНК и кодирующими по меньшей мере один гетерологичный ген. Согласно принятому здесь определению, антитела или их модификации продуцируются хозяйской клеткой, которая благодаря этой трансформации является рекомбинантной. В описании процессов выделения антител из рекомбинантных хозяйских клеток термины "клетка" и "клеточная культура" используются взаимозаменяемым образом для обозначения источника антител, если специально не оговорено иначе. Иными словами, под получением антитела из этих "клеток" может подразумеваться все, начиная от осаждения в результате центрифугирования цельных клеток или от клеточной культуры, содержащей и среду, и суспендированные клетки. Линия хозяйских клеток, используемая для экспрессии белка, в наиболее предпочтительном варианте должна быть получена из млекопитающего; специалисты в данной области могут с легкостью определить линию хозяйских клеток, которые наиболее хорошо подходят для экспрессии необходимого генного продукта. Примеры линий хозяйских клеток включают в себя, не ограничиваясь перечисленным,линии DG44 и DUXB11 (линии клеток яичника китайского хомячка, DHFR-минус), HELA (карцинома шейки матки человека), CVI (линия клеток почки обезьяны), COS (дериват CVI с Т-антигеном SV40),R1610 (фибробласты китайского хомячка) BALBC/3T3 (мышиные фибробласты), НАК (линия почечных клеток хомяка), SP2/0 (мышиная миелома), Р 3.times.63-Ag3.653 (мышиная миелома), BFA-1c1BPT (бычьи эндотелиальные клетки), RAJI (лимфоциты человека) и 293 (почки человека). Клетки СНО являются особенно предпочтительными. Линии хозяйских клеток обычно можно получить из коммерческих источников, Американской Коллекции Тканевых Культур или с использованием литературных публикаций. Продуцирование in vitro позволяет получить большие количества требуемого полипептида, продуцируемого с использованием полицистронных экспрессирующих систем, предпочтительно антитела. Технологии культивирования эукариотических клеток, например клеток млекопитающих и дрожжевых клеток, в условиях тканевой культуры хорошо известны специалистам и включают в себя культуру гомогенных суспензий, например, в реакторе с воздушным потоком или в реакторе с непрерывным перемешиванием, или иммобилизованную или "захваченную в ловушку" клеточную культуру, например, в полых волокнах, микрокапсулах, на агарозных микробусинках или керамических картриджах. Для выделения и получения антител иммуноглобулины в культуральных супернатантах могут сначала быть сконцентрированы, например, путем осаждения сульфатом аммония, диализованы против гигроскопичного материала, такого как PEG, отфильтрованы через селективные мембраны и так далее. Если это необходимо и/или желательно, концентрированные растворы поливалентных антител очищаются общепринятыми способами с использованием хроматографических методов, например, гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, хроматографии на DEAE-целлюлозе или (иммуно-) аффинной хроматографии. Описанная здесь система является новой экспрессирующей системой для получения представляющих интерес продуктов множественных генов с единственного полицистронного конструкта. В отличие от известных ранее полицистронных конструкций, изобретенная экспрессирующая система продуцирует достаточные для коммерческого использования количества требуемых генов как в первичном, так и в последующих цистронах. Это явилось неожиданностью, поскольку генные последовательности, расположенные после первого цистрона в полицистронной экспрессирующей системе, экспрессировались на очень низких уровнях по сравнению с генными последовательностями, экспрессируемыми в первом цистроне. Соответственно, предшествующие полицистронные экспрессирующие системы были обычно ограничены экспрессией маркерной последовательности во втором цистроне, а не представляющей интерес генной последовательностью. Альтернативно, экспрессия второго цистронного гена была неэффективной, предотвращая таким образом получение продуктов детектируемой трансляции с генов, содержащихся в каждом цистроне. В отличие от этого, полицистронный конструкт согласно изобретению может содержать два, три или более цистронов, каждый из которых кодирует, если это требуется, представляющий интерес ген. Настоящее изобретение, в своем предпочтительном воплощении, связано с экспрессией антител,которые могут быть модифицированы, как здесь описано, и, кроме того, включают в себя димерные антитела, с использованием полицистронной экспрессирующей системы, где два или более антительных гена экспрессируются с одного и того же эукариотического промотора, причем такие антительные гены- 12007905 выделены с помощью одного или более IRES. В частности, как обсуждалось выше, настоящее изобретение включает в себя экспрессию антител с удаленным доменом и других модифицированных антител,как описано в документах PCT/US02/02373 и PCT/US02/02374, каждый из которых подан 29 января 2002 г. и в полном объеме включен в настоящее описание. Используемые для экспрессии эукариотические клетки предпочтительно представляют собой клетки млекопитающих или дрожжевые клетки, наиболее предпочтительно клетки СНО и другие клетки, которые могут быть эффективно культивируемы для получения высоких уровней продукции антител. Как было отмечено выше, получение или клонирование генов тяжелой и легкой цепей антитела для встраивания в полицистронные экспрессирующие системы согласно изобретению входит в компетенцию рядовых специалистов в данной области. Как было указано, такие антительные гены могут кодировать гены тяжелой или легкой цепи зрелого антитела, например, мышиного, кроличьего, человеческого, хомячьего и т.д., или же эти гены тяжелой и/или легкой цепи могут быть модифицированы, например, путем химеризации, гуманизирования, исключения домена или сайт-направленного мутагенеза. В данном изобретении подразумевается также экспрессия любой последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, которая при экспрессировании с использованием полицистронной экспрессирующей системы согласно изобретению ассоциирована с продукцией функционального антитела, например, такого,которое специфически связывается с антигеном-мишенью, например, ассоциированным с опухолью антигеном. Как было сказано, количество копий генов тяжелой цепи и легкой цепи в полицистронной конструкции может быть выбрано таким образом, чтобы можно было получить предпочтительное соотношение легкой/тяжелой цепей, например, чтобы легкая цепь экспрессировалась в количествах, которые обычно составляли бы 10/1, более предпочтительно 5/1 и еще более предпочтительно приблизительно от 3/1 до 1/1 по отношению к тяжелой цепи. В предпочтительном воплощении, такая экспрессирующая система продуцирует антитела в эукариотических клетках, предпочтительно клетках млекопитающих, таких как клетки яичников китайского хомячка (СНО), почечные клетки хомячка (ВНК), линии фибробластных клеток и миеломные линии клеток. Например, клетки СНО используются в качестве хозяев для экспрессирующей системы, содержащей полицистрон, содержащий в ориентации от 5' к 3', по меньшей мере, следующие последовательности: последовательность эукариотического промотора, которая функциональна в конкретной эукариотической клетке, используемой для экспрессии, такой как CMV, последовательности раннего или актинового промотора SV40, предпочтительно CMV; последовательность ДНК, кодирующей легкую цепь антитела,и предпочтительно на его 5'-конце, эукариотическую секреторную лидерную последовательность; IRES(internal ribosome entry sites), предпочтительно таковые кардиовируса, полиовируса или вируса герпеса,расположенные таким образом, чтобы следовать за последовательностью легкой цепи антитела; по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела, причем предпочтительно, чтобы каждая последовательность тяжелой цепи антитела предшествовала эукариотической секреторной лидерной последовательности и была фланкирована 5'-инициирующим кодоном и 3'-стопкодоном, где некоторые или все ДНК, кодирующие тяжелую цепь антитела, отделены от последующих последовательностей тяжелой цепи посредством IRES, и где последняя последовательность, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит на своем 3'-конце поли-А-последовательность. Примером подходящей локализации сайта IRES между последовательностями тяжелой и легкой цепей является таковая в векторе NEOSPLA, приведенном на фиг. 2. Как было сказано, эукариотическая клетка предпочтительно включает в себя клетку млекопитающего, и более предпочтительно клетку СНО. В предпочтительном воплощении промотор представляет собой промотор CMV, a IRES получен из кардиовируса, такого как вирус энцефаломиокардита, вирусMengo, вирус Mous-Elberfiell, ММ-вирус и Columbia SK-вирус, наиболее предпочтительно человеческий вирус энцефаломиокардита (hEMCV). Полицистрон согласно изобретению предпочтительно содержит последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, и одну или две последовательности, кодирующие тяжелую цепь антитела. Однако подразумевается, что полицистронные конструкции согласно изобретению могут включать в себя 3 или 4 генных последовательности или цистрона, например, последовательности одной легкой цепи и двух или более тяжелых цепей. Кроме того, полицистрон согласно изобретению предпочтительно будет содержать поли-А-последовательность, предпочтительно последовательность гена бычьего гормона роста (bGH). Полицистронная система необязательно может быть использована в локусах, нацеленных путем гомологической рекомбинации. В данном воплощении полицистронная конструкция будет содержать последовательности, которые облегчают гомологическую рекомбинацию в прицельном сайте, например, в гене, который инактивируется после рекомбинации. В предпочтительном воплощении, полицистрон согласно изобретению содержит одну или две копии кодирующей последовательности тяжелой цепи, в зависимости от стохиометрии экспрессии конкретных генов тяжелой и легкой цепей антитела. В этой связи, хорошо известно, что в полицистронных экспрессирующих системах второй ген обычно экспрессируется с меньшей эффективностью, чем первый- 13007905 ген. Соответственно, в одном воплощении, полицистрон согласно изобретению, в котором первый цистрон кодирует легкую цепь антитела, может, если это необходимо, охватывать второй цистрон, кодирующий две или более кодирующие последовательности тяжелой цепи для облегчения достаточной экспрессии тяжелой цепи относительно легкой цепи. Обычно предпочтительно, чтобы тяжелая цепь была экспрессирована на уровнях, которые, по меньшей мере, эквивалентны уровням, наблюдаемым при неполицистронной коэкспрессии тяжелой и легкой цепей при экспрессии в той же самой эукариотической клетке с использованием неполицистронной экспрессирующей системы. Допустимо и фактически даже желательно, чтобы экспрессировалось больше легких цепей антитела по сравнению с количеством тяжелых цепей, потому что эта ситуация аналогична той, которая имеет место в клетках, эндогенно продуцирующих антитела. Неравноценные уровни экспрессии существуют по той причине, что легкая цепь является инструментом, направляющим соответствующую (подходящую) сборку тяжелых и легких цепей антитела, и считается, что избыточная, неспаренная тяжелая цепь индуцирует клеточную токсичность. Легкая цепь является также критической в том отношении, что она направляет процесс фолдинга (т.е. пространственной упаковки) сгруппированных тяжелых и легких цепей антитела, продуцируя функциональное (антигенсвязывающее) антитело в эндоплазматическом ретикулуме. Предпочтительно, чтобы легкая цепь антитела была экспрессирована в соотношении приблизительно от 10/1 до 1/1 относительно тяжелой цепи антитела. При этом, однако, уровни тяжелой цепи не должны быть минимальными, и они должны присутствовать в достаточном количестве по отношению к легким цепям, чтобы могли вырабатываться функциональные, секретируемые антитела в коммерчески приемлемых количествах. Таким образом, нежелательно, чтобы экспрессия тяжелой цепи была слишком мала по сравнению с таковой легкой цепи, поскольку недоэкспрессия приводит к неадекватному выходу функциональных антител. Для целей индустриального использования, неадекватный выход функциональных антител делает экспрессирующую систему нежизнеспособной и делает получение укомплектованных молекул антитела из культур с подпиткой труднодостижимым. Обычно функциональное антитело из культивируемых клеток получают в количестве,варьирующем приблизительно от 5-100 пг на клетку в день, однако, можно достичь и более высоких уровней экспрессии. Например, культивируемые клетки могут секретировать по меньшей мере 1-5 пг функционального антитела на клетку в день или по меньшей мере 3-10 мг/л в течение по меньшей мере 3-4 дней. В соответствии со сказанным выше, обычно трудно предсказать, будет ли данная полицистронная экспрессирующая система давать адекватные уровни продукции антитела по отношению к другим экспрессирующим системам. Такая непредсказуемость возникает по той причине, что в некоторых случаях второй представляющий интерес ген в полицистронном комплексе может быть экспрессирован на очень низких уровнях по сравнению с первым геном. Следовательно, в предпочтительных воплощениях полицистронные векторы должны обеспечивать отношение экспрессии легкой цепи антитела к экспрессии тяжелой цепи антитела, заключенное в интервале приблизительно от 10:1 до 1:1. Более предпочтительно,отношение экспрессии гена легкой цепи к экспрессии гена тяжелой цепи составляет приблизительно от 3:1 до 1,5:1. Исходные конструкции IRES были созданы таким образом, чтобы они содержали последовательность легкой цепи антитела в первом цистроне, затем две спаренные последовательности: последовательность IRES-последовательность тяжелой цепи антитела с удаленным СН 2-доменом, чтобы таким образом обеспечить достаточный уровень продукции белка тяжелой цепи для обеспечения соответствующих уровней антитела для его продукции и секреции из хозяйских клеток. Полицистронные векторы согласно изобретению дают возможность достичь требуемых уровней экспрессии тяжелой и легкой цепи путем селекции соответствующих последовательностей тяжелой цепи антитела, путем селекции результативных IRES, таких как таковые для hEMCV, или путем встраивания множественных копий генов тяжелой цепи антитела. Кроме того, ДНК, соответствующая 5'-концевому гену тяжелой цепи, может быть модифицирована путем сайт-направленного мутагенеза таким образом,чтобы кодирующая структура вокруг ATG-кодона оставалась неизмененной, обычно первые 10 кодонов,но так, чтобы модификация привела к измененной экспрессии последовательности, кодирующей тяжелую цепь, по сравнению с немодифицированным геном тяжелой цепи. Выход тяжелой цепи при использовании полицистронной экспрессирующей системы согласно изобретению обычно ниже, чем выход легкой цепи, что отражает обычное их соотношение в клетках, эндогенно продуцирующих антитела. Отношение выхода легкой цепи к выходу тяжелой цепи должно быть достаточным для реализации секреции и фолдинга (приобретения пространственной упаковки) белка. Отношение экспрессии легкой цепи к экспрессии тяжелой цепи можно варьировать, например, путем увеличения IRES-связанных последовательностей ниже по течению после последовательности легкой цепи первого цистрона. Конкретные IRES и комбинация экспрессирующих клеток могут быть выбраны для оптимального увеличения количества экспрессии второго цистрона в системе. Антитело, которое экспрессировано в соответствии с экспрессирующей системой согласно изобретению, может обладать специфичностью в отношении любого требуемого антигена. Предпочтительно,чтобы антитело было функциональным антителом, которое оказывает терапевтическое действие, таким- 14007905 как антитело, используемое для лечения аутоиммунных, воспалительных, инфекционных, аллергических или неопластических заболеваний. Такое антитело можно комбинировать с другими терапевтическими агентами для инициации синергических эффектов. Например, такое антитело можно комбинировать с веществом - источником радиоактивности для использования в качестве противоопухолевого химиотерапевтического агента. Обычно антитела, экспрессируемые согласно настоящему изобретению, могут быть использованы в любой из целого ряда конъюгированных (имеются в виду иммуноконъюгаты) или неконъюгированных форм. В частности, антитела согласно настоящему изобретению могут быть конъюгированы с цитотоксинами, такими как радиоизотопы, терапевтическими агентами, цитостатическими агентами, биологическими токсинами или пролекарствами. Альтернативно, антитела согласно изобретению могут быть использованы в неконъюгированном или в чистом виде с целью подключения у индивида природных защитных механизмов для уничтожения злокачественных клеток. Особо предпочтительны воплощения,при которых антитела, продуцируемые в соответствии с экспрессирующей системой согласно настоящему изобретению, могут быть модифицированы, например, путем конъюгирования с радиоизотопами. Примеры радиоизотопов, используемых в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя 90Y,125 131 123 111I, I, I, In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re и 188Re, с использованием любого из целого ряда известных хелатобразующих соединений или путем прямого мечения. Конъюгированные и неконъюгированные антитела могут быть использованы вместе в одном и том же терапевтическом режиме,например, как это делается в общепринятом в настоящее время терапевтическом режиме, в соответствии с которым используется зевалин (Zevalin) для лечения определенных не-ходжкинских лимфом. В другом воплощении, антитела согласно изобретению могут быть включены в композиции, которые содержат модифицированные антитела, соединенные с лекарственными средствами, пролекарствами или модификаторами биологических ответов, такими как метотрексат, адриамицин, и лимфокины, такие как интерферон. Еще в одном воплощении согласно изобретению последнее включает в себя применение модифицированных антител, конъюгированных со специфическими биотоксинами, такими как рицин или дифтерийный токсин. В других воплощениях модифицированные антитела могут образовывать комплексы с другими иммунологически активными лигандами (например, антителами или их фрагментами),где полученная в результате молекула может быть одновременно связана как с неопластической клеткой,так и с эффекторной клеткой, такой как Т-клетка. Выбор того, какое именно конъюгированное и/или неконъюгированное модифицированное антитело следует использовать, будет зависеть от типа и стадии ракового заболевания, от того, какое именно проводится дополнительное лечение (например, химиотерапия или внешняя рентгенотерапия) и состояния больного. Специалист в данной области должен уметь с легкостью осуществлять указанный выбор, используя приведенные выше рекомендации. Здесь под "цитотоксином или цитотоксическим агентом" подразумевается любой агент, который способствует понижению роста и/или пролиферации клеток и который может действовать, уменьшая,ингибируя или разрушая клетку или злокачественное новообразование при контакте с ним. Примеры цитотоксинов включают в себя, не ограничиваясь этим, радионуклиды, биотоксины, ферментативно активные токсины, цитостатики или цитотоксические терапевтические агенты, пролекарства, иммунологически активные лиганды и модификаторы биологического ответа, такие как цитокины. Как будет более подробно обсуждаться ниже, радионуклидные цитотоксины являются особо предпочтительными для применения в настоящем изобретении. Однако любой цитотоксин, который действует таким образом,что способствует приостановлению или замедлению роста иммунореактивных клеток или злокачественных клеток, или же способствует элиминации этих клеток, или который может быть ассоциирован с полученными из полицистрона описанными здесь функциональными антителами, входит в объем защиты настоящего изобретения. Желательно, чтобы на предшествующих стадиях противоопухолевые антитела, меченные указанными выше изотопами, были успешно использованы для разрушения клеток в солидных опухолях, а также в лимфомах/лейкемиях на животных моделях, а также у человека. Радионуклиды действуют путем продуцирования множественных разрывов цепи ядерной ДНК, приводящих к клеточной гибели. Изотопы, используемые для продуцирования терапевтических конъюгатов, обычно продуцируют высокоэнергетические - или -частицы, которые имеют короткую длину пробега. Такие радионуклиды обычно убивают клетки, которые находятся в непосредственной близости от них, например неопластические клетки, к которым конъюгат был прикреплен или в которые он был введен. Они мало затрагивают или же вообще не оказывают никакого действия на клетки, которые не находятся в непосредственной близости от них (т.е. клетки, на которые они не направлены). По существу, радионуклиды не являются иммуногенными. В соответствии с применением радиоактивно меченных конъюгатов в связи с настоящим изобретением, модифицированные антитела могут быть помечены напрямую (например, путем йодирования) или же могут быть помечены непрямым способом, с применением хелатобразующих (хелатирующих) агентов. Здесь под фразами "непрямое мечение" и "приемы непрямого мечения" подразумевается, что хелатобразующий агент ковалентно связан с антителом и по меньшей мере один радионуклид ассоциирован с хелатобразующим агентом. Такие хелатобразующие агенты обычно относятся к бифункциональным хе- 15007905 латирующим агентам, поскольку они связываются с обоими - и с полипептидом, и с радиоактивным изотопом. Предпочтительные хелатобразующие агенты включают в себя, в частности, производные 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусной кислоты ("MX-DTPA") и циклогексилдиэтилентриаминпентауксусной кислоты ("CHX-DTPA"). Остальные хелатобразующие агенты включают в себя производные Р-DOTA и EDTA. Особенно подходящие радионуклиды для непрямого мечения включают в себя 111In и 90Y. Здесь под фразами "прямое мечение" и "приемы прямого мечения" подразумевается, что радионуклид непосредственно образует ковалентную связь с антителом (обычно через аминокислотный остаток). Более конкретно, такие технологии связывания включают в себя неспецифическое мечение и сайтнаправленное мечение. В последнем случае введение метки направлено на специфические сайты на антителе, такие как N-связанные сахарные остатки, присутствующие только на Fc-фрагменте конъюгатов. Направленное введение метки может приводить к образованию связанных с метками мультимерных антител. С настоящим изобретением совместимы самые разные технологии и методики прямого мечения. Например, меченные Технецием-99m тетравалентные антитела могут быть получены в результате применения способов лигандного обмена, восстановления пертехната (TcO4) ионным раствором олова, хелатообразования и восстановления технеция на колонке с Сефадексом и нанесения на эту колонку антител,или с помощью технологий мечения с подпиткой, например, путем инкубирования с пертехнатом восстанавливающего агента, такого как SnCl2, буферного раствора, такого как раствор натрий-калийфталата, и антител. В любом случае предпочтительными радионуклидами для непосредственного мечения антител являются радионуклиды, хорошо известные в данной области, а особо предпочтительным для прямого мечения радионуклидом является 131I, который может быть ковалентно связан через тирозиновые остатки. Модифицированные антитела согласно изобретению могут быть получены, например, с помощью радиоактивного натрия или йодида калия и химического окисляющего агента, такого как гипохлорит натрия, хлорамин Т или прочие, или ферментативного окисляющего агента, такого как лактопероксидаза, глюкозоксидаза и глюкоза. Однако для целей настоящего изобретения приемы прямого мечения в целом являются более предпочтительными. Патенты, связанные с хелаторами и хелаторными конъюгатами, хорошо известны в данной области. Например, патент США 4831175 (выданный на имя Gansow) направлен на хелат полизамещенной диэтилентриаминпентауксусной кислоты и содержащие его белковые конъюгаты, а также способы их получения. Патенты США 5099069, 5246692, 5286850, 5434287 и 5124471 (выданные на имя Gansow) связаны также с полизамещенным хелатом DTPA. Эти патенты в полном объеме включены в настоящее описание. Другими примерами совместимых хелаторов металлов являются этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DPTA), 1,4,8,11-тетраазатетрадекан, 1,4,8,11 тетраазатетрадекан-1,4,8,11-тетрауксусная кислота,1-окса-4,7,12,15-тетраазагептадекан-4,7,12,15 тетрауксусная кислота и так далее. Циклогексил-DTPA или CHX-DTPA является особо предпочтительным и широко представлен в качестве примеров ниже. Другие совместимые хелатобразующие агенты,включая и те, которые еще предстоит описать, могут быть без особого труда выбраны специалистами в данной области, и все они считаются охваченными объемом настоящего изобретения. Совместимые хелатобразующие агенты, включая специфический бифункциональный хелатобразующий агент, используемый для облегчения хелатообразования в совместно поданных заявках под серийными номерами 08/475813, 08/475815 и 08/478967, предпочтительно выбраны для обеспечения высокой аффинности в отношении трехвалентных металлов, проявления повышенных соотношений опухоль/не опухоль и пониженного поглощения костной тканью, а также повышения удерживания радионуклида in vivo в сайтах-мишенях, т.е. в опухолевых сайтах при В-клеточной лимфоме. Однако известны в данной области и другие бифункциональные хелатирующие агенты, которые могут обладать, а могут и не обладать всеми указанными здесь характеристиками, и они также могут быть полезны при проведении опухолевой терапии. Следует отметить также, что в соответствии с настоящим изобретением, модифицированные антитела могут быть конъюгированы с различными радиоактивными метками в диагностических и терапевтических целях. Могут быть получены радиоактивно меченные терапевтические конъюгаты для диагностической "визуализации" опухолей перед назначением терапевтического антитела. Конъюгат "In2 В 8" содержит мышиное моноклональное антитело 2 В 8 (ритуксимаб), специфичное в отношении человеческого антигена CD20, который привязан к 111In через бифункциональный хелатобразующий агент, т.е.MX-DTPA, который содержит смесь 1:1 соединений 1-изотиоцианатобензил-3-метил-DTPA и 1-метил-3 изотиоцианатобензил-DТРА. 111In является особенно предпочтительным в качестве диагностического радионуклида, потому что его можно без всяких опасений вводить приблизительно между 1 и 10 мКи без детектируемой токсичности; и потому что данные по визуализации обычно подтверждаются характером распределения метки при последующем введении 90Y-меченного антитела. В большинстве случаев при визуальном изучении используют приблизительно 5 мКи 111In-меченного антитела, поскольку эта доза является одновременно и безопасной, и способствует улучшенной визуализации по сравнению с более низкими дозами, с оптимумом визуализации, наступающим от третьего до шестого дня после введения антитела. См., например, Murray, J.Nuc. Med. 26: 3328 (1985) и Carraguillo et al., J. Nuc. Med. 26: 67(1985). Как было сказано выше, в настоящем изобретении можно применять целый ряд радионуклидов, и специалисты в данной области без какого-либо затруднения могут определить, какой именно радионуклид наиболее приемлем при тех или иных обстоятельствах. Например, 131I является хорошо известным радионуклидом, используемым для нацеленной иммунотерапии. Однако клиническое применение 131I может быть ограничено несколькими факторами, включающими в себя восьмидневный период физической полужизни; дегалогенизация йодированного антитела как в крови, так и в опухолевых сайтах; и эмиссионные характеристики (например, большая доля гамма-компонента), которые могут быть субоптимальными для дозы, локализованной в области расположения опухоли. С приходом превосходных хелатобразующих агентов возможность прикрепления групп хелатов металлов к белкам повысила возможности использования других радионуклидов, таких как 111I и 90Y. 90Y обеспечивает целый ряд преимуществ при использовании в радиоиммунотерапевтических целях: время полужизни 90Y, составляющее 64 ч, является достаточно большим, дающим антителу возможность накопиться в районе опухоли, и, в отличие, например, от 131I, 90Y продуцирует высокоэнергетическое исключительно бета-излучение, не сопровождающееся при его разложении гамма-излучением, с радиусом действия в тканях порядка от 100 до 1000 клеточных диаметров. Более того, минимальное количество проникающей радиации дает возможность введения 90Y-меченных антител негоспитализированным пациентам. Кроме того, интернализация меченого антитела не является необходимой для того, чтобы убить клетку, и значит, локальное излучение ионизирующей радиации должно быть летальным для близлежащих опухолевых клеток, непосредственно не связанных с нацеленным на них антигеном. Эффективные однократно вводимые дозы (например, терапевтически эффективные количества) 90Y-меченных модифицированных антител колеблются приблизительно от 5 и до 75 мКи, более предпочтительно приблизительно от 10 и до 40 мКи. Эффективные не поражающие мозг дозы 131I-меченных антител для однократного введения колеблются приблизительно от 5 и до 70 мКи, более предпочтительно приблизительно от 10 и до 40 мКи. Эффективные вводимые дозы 131I-меченных антител, поражающие мозг (т.е. когда может потребоваться трансплантация аутологичного костного мозга), колеблются приблизительно между 30 и 600 мКи, более предпочтительно приблизительно между 50 и менее чем 500 мКи. При конъюгировании с химерным антителом, что дает возможность более длительной циркуляции мышиных антител с большей продолжительностью полужизни, эффективные не поражающие мозг дозы 131I-меченных химерных антител для однократного введения колеблются приблизительно от 5 и до 40 мКи, более предпочтительно приблизительно менее чем 30 мКи. Несмотря на обширное клиническое применение 131I и 90Y, в данной области известны также и другие радиоактивные метки, которые также используются для подобных терапевтических целей. Для визуализации все еще используются и другие радиоактивные изотопы. Например, дополнительные радиоактивные изотопы, которые совместимы с настоящим изобретением, включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, 123I, 125I, 32P, 57 Со, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi,177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211At и 213Bi. В этой связи, с настоящим изобретением совместимы все радиоактивные изотопы, излучающие альфа-, гамма- и бета-излучение. Кроме того, следует отметить, что любой специалист в данной области может с легкостью, без чрезмерного экспериментирования, определить, какие именно радионуклиды являются совместимыми с выбранным курсом лечения. В этой связи, дополнительные радионуклиды, которые уже применялись в клинической диагностике, включают в себя 125I, 123I, 99 Тс, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, а также 111In. Антитела метили также различными радионуклидами для потенциального применения в прицельной иммунотерапии. Peirersz et al., Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987). Такие радионуклиды включают в себя 188Re и 186Re, а также в меньшей степени и 199Au и 67Cu. В патенте США 5460785 представлены дополнительные данные относительно таких радиоактивных изотопов, и этот патент включен в настоящее описание в виде ссылки. Вдобавок к радионуклидам, функциональные антитела согласно настоящему изобретению могут быть конъюгированы или ассоциированы с любым каким-нибудь одним из целого ряда модификаторов биологического ответа, фармацевтических агентов, токсинов или иммунологически активных лигандов. Специалистам в данной области прекрасно известно, что такие нерадиоактивные конъюгаты могут быть образованы с использованием различных технологий, в зависимости от выбранного цитотоксина. Например, конъюгаты с биотином получены, например, в результате реакции димерных антител с активированным сложным эфиром или биотином, таким как сложный эфир биотина N-гидроксисукцинимида. Сходным образом, конъюгаты с флуоресцентным маркером могут быть получены в присутствии спаривающих агентов, таких как те, которые были перечислены выше, или же в результате реакции с изотиоцианатом, предпочтительно с флуоресцеин-изотиоцианатом. Конъюгаты тетравалентных антител согласно изобретению с цитостатическими/цитотоксическими веществами и хелатами металлов получают аналогичным способом. Предпочтительными агентами для использования в настоящем изобретении являются цитотоксические лекарственные средства, в частности, такие, которые используются для раковой терапии. Такие лекарственные средства обычно включают в себя цитостатические агенты, алкилирующие агенты, антиме- 17007905 таболиты, антипролиферативные агенты, тубулин-связывающие агенты, гормоны и антагонисты гормонов, и тому подобное. Примеры цитостатиков, которые совместимы с настоящим изобретением, включают в себя алкилирующие вещества, такие как мехлорэтамин, триэтиленфосфорамид, циклофосфамид,ифосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, мелфалан или триазихон, также как и соединения нитрозомочевины, такие как кармустин, ломустин или семустин. Другие предпочтительные классы цитотоксических агентов включают в себя, например, лекарственные средства семейства антрациклинового ряда, лекарственные средства семейства ряда алкалоидов барвинка, митомицины, блеомицины, цитотоксические нуклеозиды, лекарственные средства птеридинового ряда, диинены и подофиллотоксины. Особенно полезные члены этих классов включают в себя, например, адриамицин, карминомицин, даунорубицин (дауномицин), доксорубицин, аминоптерин, метотрексат, метоптерин, митрамицин, стрептонигрин, дихлорометотрексат, митомицин С, актиномицин-D, порфиромицин, 5-фторурацил, флоксуридин, фторафур, 6 меркаптопурин, цитарабин, цитозина арабинозид, подофиллотоксин или производные подофиллотоксина, такие как этопозид или этопозид-фосфат, мелфалан, винбластин, винкристин, лейрозидин, виндезин,лейрозин и тому подобное. Другие цитотоксины, которые являются совместимыми с настоящим изобретением, включают в себя таксол, таксан, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, тенопозид, колхицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и его аналоги или гомологи. Также подходящими для применения в настоящем изобретении цитотоксинами являются миатансиноиды. Гормоны и антагонисты гормонов, такие как кортикостероиды, например преднизон, прогестины, например гидроксипрогестерон или медропрогестерон, эстрогены,например диэтилстилбестрол, антиэстрогены, например тамоксифен, андрогены, например тестостерон,и ингибиторы ароматазы, например аминоглютетимид, также совместимы с представлениями настоящего изобретения. Как было указано ранее, специалист в данной области может внести в соответствующее соединение химические модификации, с тем, чтобы сделать это соединение более подходящим для того,чтобы получить конъюгаты согласно настоящему изобретению. Один из примеров особенно предпочтительных цитотоксинов включает в себя члены или производные энедиинового семейства противоопухолевых антибиотиков, включая калихеамицин, эсперамицины или динемицины. Эти токсины являются исключительно сильными и действуют путем расщепления ядерной ДНК, вызывая клеточную гибель. В отличие от белковых токсинов, которые могут подвергнуться расщеплению in vivo, с получением множества неактивных, но иммуногенных полипептидных фрагментов, токсины наподобие калихеамицина, эсперамицинов и других энедиинов представляют собой малые молекулы, которые, в основном, являются неиммуногенными. Эти непептидные токсины химически связаны с димерами или тетрамерами с помощью технологий, которые использовались ранее для того, чтобы связать метку с моноклональными антителами и другими молекулами. Такие технологии связывания включают в себя сайт-специфическое связывание через N-связанные сахарные остатки, присутствующие только на Fc-части конструктов. Такие способы сайт-направленного связывания имеют преимущества, которые выражаются в уменьшении возможного влияния такого связывания на свойство связывания конструкций. Как было упомянуто ранее, подходящие цитотоксины могут включать в себя пролекарство. Здесь под термином "пролекарство" подразумевается предшественная или производная форма фармацевтически активного вещества, которая менее цитотоксична в отношении опухолевых клеток по сравнению с родительской формой этого вещества и которая может быть ферментативно активирована или переведена в более активную родительскую форму. Пролекарства, совместимые с настоящим изобретением,включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, лактамсодержащие пролекарства, необязательно замещенные феноксиацетамидсодержащие пролекарства или необязательно замещенные фенилацетамидсодержащие пролекарства, 5-фторцитозиновые и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активные свободные цитотоксические лекарственные средства. Дополнительные примеры цитотоксических лекарственных средств, которые могут быть дериватизированы в пролекарственную форму для применения в настоящем изобретении, включают в себя химиотерапевтические агенты, которые были описаны выше. Следует отметить, что помимо прочих цитотоксинов, антитела могут быть ассоциированы с биотоксином, таким как субъединица А рицина, абрин, дифтерийный токсин, ботулинум, циангинозины,сакситоксин, шигатоксин, столбнячный токсин, тетродотоксин, трихотецен, веррукологен или токсический фермент. Предпочтительно, чтобы такие конструкции были получены генно-инженерным способом, что создает возможность для непосредственной экспрессии конструкта токсин-антитело. Другие модификаторы биологического ответа, которые могут быть ассоциированы с модифицированными антителами согласно изобретению, включают в себя цитокины, такие как лимфокины и интерфероны. Следует отметить, что в соответствии с настоящим изобретением любой специалист в данной области без какого-либо затруднения может создать такие конструкции с использованием общеизвестных технологий. Другим классом совместимых цитотоксинов, которые могут быть использованы в сочетании с описанными антителами, являются радиосенсибилизирующие лекарственные средства, которые могут быть- 18007905 эффективно направлены на опухоль или иммунореактивные клетки. Такие лекарственные средства усиливают чувствительность к ионизирующей радиации, повышая таким образом эффективность радиационной терапии. Конъюгат антитела, интернализованный опухолевой клеткой, будет способствовать доставке радиосенсибилизатора ближе к ядру клетки, где чувствительность к радиоактивности будет максимальной. Несвязанные модифицированные антитела, соединенные с радиосенсибилизатором, будут быстро покидать кровяное русло, способствуя локализации оставшегося радиосенсибилизирующего агента в опухоли-мишени и обеспечивая минимальное поглощение нормальными тканями. После быстрого клиренса из крови, следует применить добавочную радиотерапию, используя один из трех путей: 1) внешнюю лучевую терапию, направленную специально на опухоль, 2) радиоактивность, непосредственно имплантированную в опухоль, или 3) системную радиоиммунотерапию с использованием того же самого нацеливающего антитела. Потенциально привлекательной вариацией такого подхода должно быть прикрепление терапевтического радиоизотопа к радиосенсибилизированному иммуноконъюгату,обеспечивая таким образом однократное введение лекарственного средства для удобства больного. К вопросу о том, будут ли использованы описанные функциональные антитела в конъюгированной или в неконъюгированной форме, следует отметить, что основное преимущество настоящего изобретения состоит в том, что описанные антительные конструкции можно использовать в применении к больным, у которых наблюдается миелосупрессия, особенно тем из них, которые подвергаются или же были подвергнуты дополнительному терапевтическому лечению, такому как лучевая терапия или химиотерапия. Таким образом, предпочтительный профиль доставки (т.е. относительно короткое время жизни в сыворотке, высокая аффинность связывания и повышенная степень локализации) димерных антител делает их особенно полезными для лечения больных, у которых снижены резервы красного ростка костного мозга и которые чувствительны к миелотоксичности. В этом отношении, уникальный профиль доставки функциональных антител делает их очень эффективными для введения радиоактивно меченных конъюгатов раковым больным с миелосупрессией. Как таковые модифицированные антитела полезны в конъюгированной и неконъюгированной форме для применения у больных, которые предварительно были подвергнуты дополнительным терапевтическим воздействиям, таким как внешняя лучевая терапия или химиотерапия. Функциональные антитела, продуцируемые согласно изобретению, могут связываться с опухолеспецифическим или ассоциированным с опухолью антигеном, антигеном, экспрессированным на особых типах клеток, таких как Т-клетки или В-клетки, с вирусным антигеном, бактериальным антигеном или с паразитами. Подходящие антигены включают в себя TAG-72, CD4, CD11, CD19, CD20, CD22, CD23,CD37, CD40, CD45, CD80, CD86 и CD154. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения,такое антитело будет связываться с антигеном, экспрессируемым Т-клеткой или В-клеткой, таким какCD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD40, CD80 и CD154. В другом предпочтительном воплощении, это антитело направлено на раковый антиген, такой как СЕА, антиген, специфический в отношении предстательной железы, HER-2 (erbB2), молекула опухолевой адгезии и т.д. Выбранное антитело может быть человеческим, гуманизированным или химерным антителом. В частности, это антитело может быть человеческим, гуманизированным или химерным антителом, специфичным в отношении CD20 или TAG72. CD20 представляет собой антиген, специфичный в отношении В-клеток, на которые направлено лечение В-клеточных заболеваний, таких как В-клеточные лимфомы и лейкемии. Rituxan представляет собой химерное антитело против CD20, которое было одобрено FDA в применении к лечению неХоджкинской лимфомы.TAG-72 представляет собой антиген, который известен своей повышенной экспрессией в целом ряде злокачественных опухолей у человека, включая рак пищеварительных органов (рак желудка, прямой и ободочной кишки, поджелудочной железы) и злокачественные опухоли, ассоциированные с репродуктивными органами (рак предстательной железы, яичника, молочной железы), а также другие злокачественные опухоли, включая, например, раковые заболевания головы и шеи и метастазы в лимфатические узлы. (См., например, публикации Galietta et al., Oncol. Rep. 9(1): 135-40 (2002); Meredith et al., CancerBiol. Marker 15(2): 1997-99 (2000) and Altimissi et al., HNO 38(10): 364-66 (1998), все из которых в полном объеме включены в настоящее описание в виде ссылки). Было опубликовано сообщение, что антитела против TAG-72 обладают терапевтической эффективностью при лечении таких форм раковых заболеваний. Последовательности ДНК, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь (цепи) антитела, могут включать в себя модифицированную вариабельную область и константную область. Константная область предпочтительно является человеческой. Вариабельные области могут соответствовать таковым у приматов или могут происходить от грызунов, и могут быть гуманизированы. Приматные вариабельные области могут иметь человеческое происхождение. Вариабельные области грызунов могут, например,иметь крысиное или мышиное происхождение. Как было уже сказано, константные области с удаленным доменом входят в объем, охватываемый настоящим изобретением. Антигены, для которых характерна повышенная экспрессия при особых типах раковых заболеваний, хорошо известны в данной области. Предпочтительные воплощения охватывают экспрессию анти- 19007905 тел, которые распознают CD22 или CD20. В большинстве предпочтительных воплощений антитело будет специфически связываться с CD22. Даже более предпочтительно, если антитело будет включать в себя тяжелую и легкую цепи антитела rituximab (RITUXAN, IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA,USA), как обсуждается, например, в патентах США 5736137; 5776456 и 5843439. Примеры соответствующих антител для применения в данном изобретении описаны в патенте США 6136310 (выданном на имя Hanna et al. (CD4; патенте США 6011138 (выданном на имя Reff (CD23; патенте США 6113898(выданном на имя Anderson (CD80 и патенте США 6001358 (выданном на имя Black (CD54. Полное содержание этих патентов включено в настоящее описание в виде ссылок. Несмотря на то, что данное изобретение проиллюстрировано используемыми антителами, это изобретение предполагает также экспрессию любых многозвенных белков, которые не ухудшали бы жизнеспособность их хозяйских клеток млекопитающих. Отношение продуктов генов первого и последующих цистронов может варьировать так, чтобы увеличивалось число субъединиц, следующих за первым цистроном. Таким образом, например, два или более цистрона, каждый из которых кодирует один и тот же требуемый продукт гена, могут быть встроены в полицистронный экспрессирующий вектор в целях увеличения абсолютного количества пептида, продуцируемого требуемым геном. Однако каждый эффективный цистрон, следующий за первым цистроном, может кодировать, если нужно, разные продукты. Далее изобретение будет проиллюстрировано последующими неграничивающими примерами. Пример 1. Полицистронный экспрессирующий ДНК-вектор был сконструирован согласно изобретению для экспрессии тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела против TAG-72, которое обозначено как HuCC49. А. Экспрессирующая векторная конструкция Экспрессирующая конструкция, изображенная на фиг. 1, содержит основной промотор (бета) мышиного бета-глобулина, расположенный внутри конструкции так, чтобы управлять экспрессией последовательностей, кодирующих ген неомицин-фосфотрансферазы. Ген неомицин-фосфотрансферазы, который имеет бактериальную природу, состоит из двух экзонов, N1 и N2, и содержит искусственный интрон. Способы встраивания интрона селективных маркеров, сконструированного с целью повышения экспрессии продукта гена в системах экспрессирующих векторов, описаны, например, в патенте США 5648267, патенте США 5733779, патенте США 6017733 и патенте США 6159730, все из которых выданы на имя Reff. Содержание каждого из этих патентов полностью включено в настоящее описание в виде ссылки. Выбранное антитело известно специалистам в данной области тем, что оно является подходящим для лечения солидных опухолей. Для того чтобы воздействовать на клетки солидной опухоли, нужна сильно выраженная способность проникновения в ткань, и, следовательно, антитело должно иметь относительно более длинный период полужизни в сыворотке, нежели оно имеет в присутствии Fabфрагментов. Используемый в данном примере конструкт с удаленным доменом содержит человеческий константный домен гамма-1 тяжелой цепи, в котором большая часть СН 2-домена удалена, за исключением первых девяти аминокислот СН 2-домена, следующих за шарнирным участком. Как показано на фиг. 1, после первого экзона экспрессирующей кассеты (N1) неомицинфосфотрансферазы и внутри интрона гена неомицин-фосфотрансферазы локализован ориджин репликации (SVO) вируса обезьян SV40, который облегчает репликацию экспрессирующей конструкции (вектора) в клетках COS после транзиторной трансфекции. После него расположена экспрессирующая кассета для представляющих интерес генных последовательностей, которые в данном случае представляют собой области, кодирующие иммуноглобулин. Первым в кассете установлен промотор человеческого цитомегаловируса (CMV), который направляет экспрессию транскрипта полицистронного иммуноглобулина (Ig). Транскрипт Ig в данной конструкции кодирует гуманизированное антитело против TAG-72 (обозначаемое HuCC49), которое последовательно состоит (в порядке представления) из лидерной легкой цепи (L)/вариабельной легкой цепи HuCC49 (VL)/человеческой константной каппа-цепи (Kappa)/IRES из вируса энцефаломиокардита (IRES)/искусственной лидерной тяжелой цепи (L)/вариабельной тяжелой цепи HuCC49 (VH)/человеческой константной области гамма-1 с удаленным СН 2-доменом (СН 2 linkG1DelCH2). После транскрипта Ig следует сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH). После этого расположена экспрессирующая кассета для области, кодирующей дигидрофолат-редуктазу,в которой основной промотор мышиного бета-глобина (Beta) направляет экспрессию мышиного гена дигидрофолат-редуктазы (DHFR). За последовательностью DHFR следует сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH). После неомицинового интрона следует второй экзон неомициновой экспрессирующей кассеты (N2),за которым, в свою очередь, следует ранний сигнал полиаденилирования SV40 (SV). Этот вектор содержит также последовательности, необходимые для репликации в бактериях, включая ориджин репликации colE1 и ген бета-лактамазы для придания резистентности к ампициллинуEMCV является коммерчески доступным, и был получен из АТСС (штамм VR-129B энцефаломиокардита: ЕМС (адаптированный ТС. Вирусные частицы были разрушены, и с помощью методов, известных в данной области, из них была выделена одноцепочечная вирусная РНК. Была получена специ- 20007905 фическая для области IRES внутри вирусного генома. PCR (полимеразная цепная реакция)амплификация этой кДНК была предпринята с целью амплификации ДНК, а также для добавления 5'- и 3'-концов, подходящих для инсерции между доменами, кодирующими легкую и тяжелую цепь Ig. Сигнал полиаденилирования не был помещен после легкой цепи непосредственно перед IRES. ТринуклеотидATG в положении 834-836 (номер доступа в банке генов Genbank NC-001479) был использован в качестве инициирующего кодона для искусственной лидерной последовательности тяжелой цепи. Поскольку в литературе представлены данные о том, что трансляция открытой рамки считывания вниз по течению от IRES происходит менее эффективно, нежели трансляция открытой рамки считывания вверх по течению (трансляция, инициированная 5'САР), сайты рестрикции были встроены таким образом, чтобы IRES и последовательности тяжелой цепи могли быть дуплицированы внутри вектора. СайтыMun I и Bgl II были встроены вниз по течению от сайта BamH I. После переваривания под действиемEcoR I и BamH I фрагмент, содержащий IRES и последовательность тяжелой цепи, можно было без особых трудностей встроить в сайты Mun I и Bgl II. Полученный в результате всего этого конструкт должен будет содержать CMV-легкую цепь-IRES-тяжелую цепь-IRES-тяжелую цепь. Добавление второй тяжелой цепи было произведено с целью компенсации любой возможной неэффективности, ассоциированной с IRES. В. Экспрессия в клетках СНО Плазмида, содержащая вектор экспрессии, экспрессирующий одну тяжелую цепь с помощью энхансера SV40, была трансфицирована в клетки СНО с использованием как методики транзиторной трансфекции, так и технологии, созданной для получения стабильных трансфицированный клеточных линий, способных к высокоэффективной экспрессии. Такие трансфекции были предприняты параллельно с трансфекциями общепринятыми экспрессирующими конструкциями, содержащими независимые кассеты легкой и тяжелой цепи (CMV-Легкая цепь-BGH) (CMV-Тяжелая цепь-BGH). Результаты экспериментов показывают, что нет заметного различия между возросшими уровнями экспрессии, что свидетельствует об отсутствии снижения уровня трансляции тяжелой цепи в результате неэффективной функции IRES. Соответственно, в одном из воплощений можно ожидать, что полицистронная конструкция согласно изобретению будет экспрессировать последовательности других представляющих интерес генов, содержащихся как в первом, так и в последующих цистронах, в удовлетворительных количествах. Эксперименты показали, что эти конструкции экспрессируют ген тяжелой цепи, расположенный вниз по течению в бицистронной конструкции на уровнях, эквивалентных таковым, полученным с использованием общепринятых неполицистронных экспрессирующих систем, как обсуждается ниже. Пример 2. А. Получение резистентных клеточных линий G418 В этом примере полицистронная экспрессирующая конструкция кодирует модифицированное гуманизированное антитело со специфичностью в отношении к человеческому белку TAG-72. Это антитело содержало гуманизированные мышиные вариабельные домены (обеих - как легкой, так и тяжелой цепей), человеческий константный домен легкой каппа-цепи и человеческую константную область гамма-1 тяжелой цепи, со специфической делецией СН 2-домена. Эта экспрессирующая конструкция названа"HuCC49 CH2 Linker in N5KIRESG1 DelCH2" (линкер HuCC49 CH2 в N5KIRESG1 DelCH2), карта которой показана на фиг. 3 и последовательность которой приведена на фиг. 6. Конструкция HuCC49 CH2Linker in N5KIRESG1 DelCH2 была трансфицирована в клетки родительской линии CHO-DG44. Трансфекции были предприняты с использованием 0,5, 1,0, 2,0 или 4,0 мкг линеаризованной ДНК на 4 х 106 клеток СНО на 96-луночный планшет. Доминантную селекцию стабильно трансфицированных клеток выполняли с помощью маркера резистентности к неомицину, кодируемого экспрессирующей конструкцией, и среды (CHO-S-SFMII + НТ), содержащей G418. Определяли жизнеспособные лунки, подращивали клетки до низкомасштабной (120 мл) спинкультуры с постоянным перемешиванием, и продуктивность клеток устанавливали с помощью методаELISA. Были получены различные изоляты резистентных клеток G418, продуцирующих легко детектируемые секретируемые антитела. В частности, четыре из них, 22 В 6, 22 Е 6, 22 Н 10 и 25 А 2, как было показано, продуцировали от 3 до 10 мг/л за 3-4 дня, или от 1 до 5 пг/клетку/день (pcd). Как показано на фиг. 4 и 5, был предпринят анализ методом Саузерн-блоттинга, и было показано, что каждая из этих четырех линий клеток содержит экспрессирующую конструкцию, интегрированную в единственный сайт внутри клеток каждой линии. Линии, помеченные как М, содержали маркеры размера. Нуклеиновые кислоты клеток яичника китайского хомячка служили в качестве негативного контроля и перемещались в дорожках, помеченных как СНО. Образец 14H9CD соответствовал конструкции NEOSPLA. В. Установление отношения легкой цепи к тяжелой цепи методом ELISA Параллельно с получением указанных клеточных линий была сконструирована и трансфицирована экспрессирующая конструкция NEOSPLA того же самого антитела. Показанная на фиг. 3 конструкцияHuCC49 CH2 Linker in N5KG1 DelCH2 кодирует гены легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина на независимых транскрипционных кассетах, трансляция каждой из которых обусловлена 5'САР-комплексами инициации трансляции. Особая резистентная клеточная линия G418, выделенная путем трансфекции этой экспрессирующей конструкции, была обозначена как 14 Н 9. Изучение культуральных супернатантов- 21007905 линии 14 Н 9 и полицистронного изолята 22 В 6 было предпринято для изучения сравнительных отношений уровня секреции легкой цепи к уровню секреции тяжелой цепи. Анализ был предпринят методомELISA путем захвата и детектирования с помощью вторичных антител, специфичных в отношении легкой или тяжелой цепи. Результаты, полученные на пробах с двойным повтором, показаны в табл. 1, где данные выражены в мг/л против стандартного иммуноглобулина. Общее измеренное количество легкой цеписравнивали с общим измеренным количеством антителав колонке Отношение. Таблица 1 Клеточная линия 14 Н 9 представляет собой линию клеток G418, являющуюся необычайно высокопродуктивной в результате того, что она содержит большое количество копий гена. Здесь интересен приблизительно эквивалентный относительный показатель свободных или связанных с иммуноглобулином легких и тяжелых цепей. Эти данные совершенно неожиданно показали, что экспрессия тяжелой цепи иммуноглобулина внутри полицистронной экспрессирующей системы, встроенной после IRES, незначительно снижена по сравнению с системой NEOSPLA. То наблюдение, что отношения / составляют больше единицы, не является неожиданностью и, по всей видимости, является результатом пермиссивной секреции клеткой свободной легкой цепи. Следовательно, в такой полицистронной экспрессирующей системе направляемая IRES продукция белка тяжелой цепи, по-видимому, является очень эффективной. С. Дополнительный метод ELISA для сравнения отношения экспрессируемой легкой цепи к экспрессируемой тяжелой цепи Позже был предпринят анализ культуральных супернатантов, полученных из различных клеточных линий, содержащих либо NEOSPLA, либо полицистронные экспрессирующие системы, с целью изучения сравнительных отношений секреции легкой цепи к тяжелой цепи. Анализ был предпринят методомELISA путем захвата и детектирования с помощью вторичных антител, специфичных в отношении либо легкой, либо тяжелой цепи. Результаты, полученные на пробах с двойным повтором, приведены здесь и выражены в мг/л против стандартного иммуноглобулина. Метод ELISA выполняли, покрывая 96-луночный микротитрационный планшет "захваченным" антителом, затем связывая культуральный супернатант, потом производя "детектирование" путем связывания вторичного антитела, конъюгированного с HRPO (пероксидаза хрена), и в конце производя колориметрический количественный анализ.означает захват козьим IgG против каппа-цепей человека: детектирование конъюгатом HRPO с козьими IgG против каппа-цепей человекаозначает захват козьим античеловеческим IgG: детектирование конъюгатом HRPO с козьим античеловеческим IgGозначает захват козьим античеловеческим IgG: детектирование конъюгатом HRPO с козьими IgG против каппа-цепей человекаозначает захват козьим IgG против каппа-цепей человека: детектирование конъюгатом HRPO с козьим античеловеческим IgG Эти данные, кроме того, свидетельствуют о том, что совершенно неожиданно экспрессия тяжелой цепи иммуноглобулина внутри полицистронной экспрессирующей системы, расположенной после IRES,уменьшается незначительно по сравнению с системой NEOSPLA. То наблюдение, что отношения / составляют больше единицы, скорее всего является результатом пермиссивной секреции из клетки свободной легкой цепи. Следовательно, в этой полицистронной экспрессирующей системе направляемаяIRES продукция белка тяжелой цепи, по-видимому, является очень эффективной. Пример 3. А. Повышение экспрессии путем амплификации генома Обе экспрессирующие системы - полицистронная и NEOSPLA - содержат экспрессирующую кассету, кодирующую мышиный ген DHFR. Поскольку родительская клеточная линия CHO-DG44, используемая для экспрессии, полностью дефицитна в отношении ферментативной активности дигидрофолатредуктазы (DHFR) (двойная делеция), амплификация интегрированного гена-мишени (мышиной DHFR) возможна в результате селекции роста в среде, содержащей метотрексат (МТХ). В процессе такой амплификации непосредственно соединенные гены иммуноглобулинов попутно амплифицировались. Таким образом, можно выделить клеточные линии, продуцирующие повышенные количества иммуноглобулина. Полученный авторами изобретения первый цикл селекции резистентных клеточных линий G418 был предпринят в 5 нМ МТХ. Были идентифицированы продуценты наиболее высоких уровней (как определялось с помощью метода ELISA), которые затем были подвергнуты двум последовательным циклам амплификации в условиях повышающихся концентраций МТХ (50 нМ, затем 500 нМ). После трех последовательных циклов амплификации в МТХ можно было идентифицировать 500 нМ-резистентные линии клеток. Ниже представлены уровни экспрессии на каждой стадии для различных изолятов полицистронной клеточной линии 25 А 2, полученной из резистентной линии клеток G418. Для сравнения ниже приведены уровни экспрессии иррелевантного антитела (анти-CD23), экспрессируемого с помощью экспрессирующей системы NEOSPLA. Это антитело является приматизированным (Primatized) антителом, несущим полученные из приматов вариабельные домены легкой и тяжелой цепей,- 23007905 человеческую константную область легкой каппа-цепи и полноразмерную человеческую гамма-1 область тяжелой цепи (включая СН 2-домен). Здесь также включено сравнение уровней продукции полицистронной системы и системыNEOSPLA, растущих в контролируемых биореакторах. Для каждой из систем - полицистронной иNEOSPLA - показано время удвоения в биореакторах. Таблица 3 Полицистронная экспрессирующая система Линкер HuCC49 CH2 в N5KIRESGlDelCH2 Как можно видеть из табл. 3, представленной выше, уровни экспрессии на каждой стадии селекции(G418, 5, 50 или 500 нМ МТХ) сравнимы между полицистронной экспрессирующей системой и экспрессирующей системой NEOSPLA. Сравнимы, как видно, также и уровни продукции в условиях роста в контролируемом биореакторе. Следовательно, в этой системе встраивание тяжелой цепи иммуноглобулина под контролем трансляции IRES EMCV ниже по течению от легкой цепи приводит к эффективной продукции иммуноглобулина. Пример 4. Способ получения экспрессирующей конструкции Здесь описан общий способ получения полицистронной экспрессирующей конструкции согласно изобретению. В этой методологии конечный экспрессирующий конструкт получают путем инсерции фрагмента ДНК, кодирующего представляющие интерес гены (т.е. легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина), в одну стадию клонирования. Этот фрагмент ДНК может быть получен с использованием обычных рекомбинантных технологий ДНК, включая олиго-синтез и лигирование, PCR с перекрыванием,полный синтез ДНК, или с помощью любой комбинации этих технологий, как было указано выше. На фиг. 7 представлена схема, на которой суммированы стадии, используемые для получения вектора, подходящего для экспрессии иммуноглобулина (например, HuCC49) в клетках млекопитающих. В этой методологии показано применение PCR с перекрыванием для получения фрагмента ДНК, кодирующего вариабельные домены обеих - как легкой, так и тяжелой - цепей. Затем этот фрагмент клонирован в одну стадию в единственный инсерционный сайт требуемого вектора ДНК для получения конечного экспрессирующего иммуноглобулин конструкта. Однако несмотря на то, что этот метод и является предпочтительным, могут быть использованы также и другие способы, например, гены, соответствующие тяжелой и легкой цепи, могут быть альтернативно встроены в различные инсерционные сайты в векторном конструкте. Может также варьировать и количество генов легкой цепи и тяжелой цепи в полицистронной конструкции.- 24007905 Как было уже сказано, вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина выделен или клонирован из соответствующего источника (т.е. гибридомы, В-клетки, плазмидного клона) и клонирован в соответствующий вектор, такой как PCEMPTY A4, содержащий лидерную последовательность легкой цепи(которая, в зависимости от ситуации, может быть сохранена, а может быть и не сохранена), константный домен легкой цепи, последовательность IRES и лидерную последовательность тяжелой цепи. Также и вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина выделен и клонирован в тот же самый порожний вектор (не содержащий вариабельный домен легкой цепи). Желательно, чтобы первоначально вариабельные домены легкой и тяжелой цепи содержались в отдельных векторах, так как это позволяет производить последующие нуклеотидные модификации одного гена вариабельной области, потенциально не оказывая влияния на остальную вариабельную область. Эти два отдельных вектора, содержащие вариабельные домены легкой цепи и тяжелой цепи, служат в качестве ДНК-матриц для независимых когнитивных реакций PCR-амплификации. Конструирование 5'- и 3'-PCR-праймеров является таким, что между двумя результирующими PCRпродуктами расположена совместная (общая) нуклеиновая последовательность. Эта общая последовательность создает в дальнейшем область перекрывания для последующей стадии PCR-амплификации. Затем продукт этой последней стадии PCR-амплификации кодирует лидерную последовательность легкой цепи/вариабельную последовательность легкой цепи/константную последовательность/IRES/искусственную лидерную последовательность тяжелой цепи/вариабельные домены тяжелой цепи или их фрагменты, например фрагменты с удаленным доменом. На фиг. 7 проиллюстрирован один пример, где единая последовательность ДНК, содержащая легкую и тяжелую цепи, разделенные однимIRES, встроена в единственный сайт рестрикции в векторе. После рационального конструирования указанных выше 5'- и 3'-PCR-праймеров встраивают фланкирующие сайты расщепления рестрикционной эндонуклеазой, такие как Nhe I. Эти сайты Nhe I или другие рестрикционные сайты дают затем возможность клонирования фрагмента ДНК в соответствующий вектор, такой как PCEMPTY В, который содержит все остальные элементы для эффективной экспрессии иммуноглобулина в клетках млекопитающих. Затем производят трансфекцию конечного вектора(например, HuCC49 Gly/Ser in Polycis2) в требуемые клетки для получения продукта представляющего интерес гена, например иммуноглобулина. Пример 5. Повышение экспрессии путем амплификации генома Конструкт HuCC49 in N5KIRESG1 DelCH2 также содержит экспрессирующую кассету, кодирующую мышиный ген DHFR. Поскольку родительская клеточная линия CHO-DG44 полностью дефицитна в отношении ферментативной активности DHFR (двойная делеция), амплификация интегрированного гена-мишени (мышиной DHFR) возможна в результате селекции роста в среде, содержащей метотрексат (МТХ). В процессе такой амплификации непосредственно соединенные гены иммуноглобулиновHuCC49 попутно амплифицировались. Таким образом, можно выделить клеточные линии, продуцирующие повышенные количества иммуноглобулина. Первый цикл селекции резистентных клеточных линийG418 был предпринят в 5 нМ МТХ. Были идентифицированы продуценты наиболее высоких уровней(как определялось с помощью метода ELISA), которые затем были подвергнуты двум последовательным циклам амплификации в условиях повышающихся концентраций МТХ (50 нМ, затем 500 нМ). После трех последовательных циклов амплификации в МТХ были идентифицированы три 500 нМрезистентные линии клеток. Для клеточной линии 25 А 2, полученной из резистентных линий клетокG418, уровни экспрессии на каждой стадии представлены в табл. 4. Для сравнения в табл. 5 показаны уровни экспрессии иррелевантного антитела (анти-СD23), экспрессируемого с помощью экспрессирующей системы NEOSPLA. Это антитело является приматизированным (Primatized) антителом, несущим полученные из приматов вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, человеческую константную область легкой каппа-цепи и полноразмерную человеческую гамма-1-область тяжелой цепи (включая СН 2 домен). Таблица 4 Полицистронная экспрессирующая система Линкер HuCC49 CH2 в N5KIRESG1DeICH2 Как можно видеть из табл. 4 и 5, уровни экспрессии на каждой стадии селекции (G418, 5, 50 или 500 нМ МТХ) сравниваются между полицистронной экспрессирующей системой и системой NEOSPLA. Следовательно, в такой системе расположение тяжелой цепи иммуноглобулина под трансляционным контролем EMCV IRES вниз по течению от легкой цепи создает возможность эффективного продуцирования иммуноглобулина. Несмотря на то, что данное изобретение описано в связи с его специфическими воплощениями и примерами, специалистам в данной области должно быть очевидно, что изобретение, в том виде как оно описано, может включать в себя и дополнительные очевидные модификации. Подразумевается, что настоящее описание охватывает такие очевидные отклонения от предпочтительных воплощений, которые входят в объем знаний и известной в данной области практики и которые могут быть приложимы к описанным здесь выше основным признакам, а также охватываются прилагаемой формулой изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Полицистронный вектор для экспрессии функциональных антител в эукариотических хозяйских клетках, причем указанный вектор содержит полицистронную транскрипционную систему, включающую в себя следующие элементы, оперативно связанные в ориентации от 5' к 3':(ii) первый цистрон, содержащий первую последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь антитела, которая необязательно содержит на своем 5'-конце сигнальную последовательность, кодирующую пептид, оперативную в эукариотических клетках, где указанная первая последовательность ДНК не содержит на своем 3'-конце поли-А-последовательность и где указанная первая последовательность ДНК содержит 5'-инициирующий кодон и терминирующий 3'-стоп-кодон;(iv) по меньшей мере второй цистрон, содержащий следующие элементы: (а) вторую последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела, где указанная вторая ДНК содержит на своем 5'конце кодирующую сигнальный пептид последовательность, оперативную в эукариотических клетках, и где указанная вторая последовательность ДНК содержит на своем 3'-конце поли-А-последовательность только в случае, если последовательность ДНК является наиболее приближенной к 3'-концу полицистрона кодирующей последовательностью, и дополнительно содержит инициирующий кодон и стоп-кодон соответственно на 5'- и 3'-концах указанной второй последовательности ДНК; где первая последовательность ДНК экспрессируется по отношению ко второй последовательности ДНК в соотношении, варьирующем от 10:1 до 1:1 в эукариотической хозяйской клетке, содержащей полицистронный вектор. 2. Полицистронный вектор по п.1, где первая и вторая последовательности ДНК кодируют константные области соответственно тяжелой и легкой цепей антитела, источником которых являются приматы. 3. Полицистронный вектор по п.2, где указанным приматом является человек. 4. Полицистронный вектор по п.1, где первая и вторая последовательности ДНК кодируют вариабельные области соответственно тяжелой и легкой цепей антитела, источником которых являются приматы. 5. Полицистронный вектор по п.4, где указанным приматом является человек. 6. Полицистронный вектор по п.5, где вариабельные области тяжелой и легкой цепей гуманизированы. 7. Полицистронный вектор по п.1, где первая и вторая последовательности ДНК кодируют константные области соответственно тяжелой и легкой цепей антитела, источником которых являются грызуны. 8. Полицистронный вектор по п.7, где указанным грызуном является мышь. 9. Полицистронный вектор по п.1, где первая и вторая последовательности ДНК кодируют вариабельные области соответственно тяжелой и легкой цепей антитела, источником которых являются гры- 26007905 зуны. 10. Полицистронный вектор по п.9, где последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, имеют мышиную природу. 11. Полицистронный вектор по п.1, где эукариотический промотор является промотором млекопитающих или вирусным промотором. 12. Полицистронный вектор по п.11, где промотором является промотор CMV. 13. Полицистронный вектор по п.1, где IRES получен из кардиовируса. 14. Полицистронный вектор по п.13, где кардиовирус представляет собой вирус энцефаломиокардита человека. 15. Полицистронный вектор по п.1, где функциональные антитела, экспрессируемые полицистронным вектором, специфически связываются с ассоциированным с опухолью антигеном, антигеном, экспрессированным на В-клетке, или антигеном, экспрессированным на Т-клетке. 16. Полицистронный вектор по п.15, где функциональные антитела, экспрессируемые полицистронным вектором, специфически связываются с антигеном, выбранным из группы, состоящей из TAG72, CD4, CD11, CD19, CD20, CD22, CD23, CD37, CD40, CD45, CD80, CD86 и CD154. 17. Полицистронный вектор по п.16, где антигеном является TAG-72. 18. Полицистронный вектор по п.16, где функциональное антитело представляет собой человеческое, гуманизированное, приматизированное или химерное антитело, специфичное в отношении TAG-72. 19. Полицистронный вектор по п.15, где антитело представляет собой ритуксимаб или ибритумомаб. 20. Полицистронный вектор по п.1, где последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь антитела, экспрессируется в соотношении, варьирующем между 3:1 и 1:1 по отношению к тяжелой цепи антитела. 21. Эукариотическая клетка, содержащая полицистронный вектор по любому из пп.1-20, где эукариотическая клетка секретирует приблизительно от 5 до 100 пг функционального антитела в день. 22. Эукариотическая клетка по п.21, где эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего или дрожжевую клетку. 23. Клетка млекопитающего по п.22, где клетка млекопитающего является членом, выбранным из группы, состоящей из клетки почки хомячка, фибробластной, миеломной клетки и клеток яичника китайского хомячка (клетки СНО). 24. Клетка млекопитающего по п.22, которая представляет собой клетку СНО. 25. Дрожжевая клетка по п.23, где указанная дрожжевая клетка выбрана из группы, состоящей изSaccharomyces, Schizosacchoriomyces, Hansenula, Yarrowia, Pichia и Candida. 26. Дрожжевая клетка по п.25, где указанный штамм Pichia представляет собой Pichia pastoris. 27. Способ продуцирования функциональных антител, включающий в себя культивирование эукариотических клеток по п.21 в клеточной культуре для получения функциональных антител и изъятие функциональных антител из культуры эукариотических клеток. 28. Способ по п.27, где культивируемые эукариотические клетки продуцируют, по меньшей мере,приблизительно от 1 до 5 пг антител на клетку в день. 29. Способ по п.28, где указанная эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего или дрожжевую клетку. 30. Способ по п.28, где функциональные антитела извлекают из среды культивирования клеток. 31. Способ по п.28, где функциональные антитела специфически связываются с TAG-72. 32. Способ по п.31, где указанное функциональное антитело включает в себя гуманизированное человеческое или химерное антитело HuCC49 против СН 2-домена с удаленным доменом. 33. Способ по п.28, где указанное химерное антитело представляет собой ритуксимаб или ибритумомаб. 34. Способ по п.27, где продуцирование функциональных антител дополнительно включает в себя стадию гомологической рекомбинации. 35. Способ по п.28, где функциональные антитела продуцируются в клеточных культурах с подпиткой.
МПК / Метки
МПК: C07K 16/00, C12N 15/00, C12N 15/63, C12N 15/86, C12N 15/85, C12N 15/12
Метки: полицистронная, антител, экспрессия
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-7905-policistronnaya-ekspressiya-antitel.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Полицистронная экспрессия антител</a>
Способ получения антиидиотипических антител к альфа-фетопротеину
Номер патента: 6649
Опубликовано: 24.02.2006
Авторы: Францева Ирина Александровна, Францев Александр Павлович
МПК: C07K 16/42, A61K 39/395, C12P 21/00...
Метки: антител, антиидиотипических, получения, альфа-фетопротеину, способ
Формула / Реферат:
Способ получения антител, включающий фракционное осаждение белков сыворотки крови сульфатом аммония, отделение осадка центрифугированием и очистку выделенных антител, отличающийся тем, что выделяют антиидиотипические антитела к альфа-фетопротеину, очистку выделенных антител осуществляют гель-фильтрацией, а в качестве биологического материала используют сыворотку крови, лимфу, гемолимфу женских особей в состоянии формирования эмбриона у...
Концентрированный препарат антител
Номер патента: 1860
Опубликовано: 22.10.2001
Автор: Релтон Джулиан Маркус
МПК: C07K 16/28, A61K 39/395
Метки: препарат, антител, концентрированный
Формула / Реферат:
1. Препарат моноклонального антитела для введения человеку, имеющий концентрацию 100 мг/мл или выше, который получен способом, включающим осуществление следующих стадий: а) получение раствора антитела; б) ультрафильтрация раствора антитела со стадии (а); в) рециркуляция фильтрата со стадии (б) со скоростью рециркуляции менее чем 500 мл/мин. 2. Препарат моноклонального антитела по п.1, отличающийся тем, что раствор на стадии (а) имеет...
Пептиды вич, антигены, вакцинные композиции, набор для иммуноанализа и способ обнаружения антител, индуцируемых вич
Номер патента: 6308
Опубликовано: 27.10.2005
Автор: Сёренсен Биргер
МПК: A61K 39/21, C07K 14/16, G01N 33/569...
Метки: вич, обнаружения, способ, набор, антигены, композиции, вакцинные, антител, индуцируемых, иммуноанализа, пептиды
Формула / Реферат:
1. Пептид, происходящий из белков gag p17 и p24 вируса ВИЧ-1, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, которая содержит модификации по сравнению с нативной последовательностью и выбрана из следующих групп аминокислотных последовательностей: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Gln Leu Gln Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 (SEQ ID NO 1), где аминокислоты цепи принимают...
Модифицированные вич-пептиды на основе белка gag p24, антигены, вакцинные композиции, набор для иммуноанализа и способ определения вич-индуцированных антител
Номер патента: 4802
Опубликовано: 26.08.2004
Автор: Сёренсен Биргер
МПК: C07K 14/16, A61K 39/21, A61P 31/18...
Метки: модифицированные, способ, основе, антител, вич-пептиды, набор, вич-индуцированных, вакцинные, композиции, иммуноанализа, антигены, определения, белка
Формула / Реферат:
1. Пептид на основе белка ВИЧ gag p24, включающий по крайней мере девять расположенных подряд аминокислот модифицированной по сравнению с природной аминокислотной последовательности SEQ ID No 1: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Ala Xaa8 Xaa9 Gln Thr Pro Trp Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Val Xaa20 (SEQ ID NO 1), где Xaa в положении 1 пептидного производного означает Lys или Arg; Xaa в положении 2 означает Ala, Gly, Ser или Arg; Xaa в положении 3...
Моноклональные антитела и смесь антител для выявления белка-приона как показателя трансмиссивных губкообразных энцефалопатий
Номер патента: 5239
Опубликовано: 30.12.2004
Автор: О'рурк Кэтрин И.
МПК: C12P 21/04, A61K 39/00, C07K 16/00...
Метки: энцефалопатий, трансмиссивных, антитела, смесь, показателя, антител, губкообразных, моноклональные, выявления, белка-приона
Формула / Реферат:
1. Моноклональное антитело, которое специфично связывается с консервативным эпитопом белков-прионов (PrP-Sc), определенным как Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser (SEQ ID No. 1), и связывается с белком PrP-Sc в фиксированной или нефиксированной ткани, которая была обработана для того, чтобы обнажить указанный скрытый эпитоп белка PrP-Sc и исключить доступность соответствующего эпитопа PrP-C. 2. Моноклональное антитело по п.1, обозначенное F99/97.6.1,...
Предыдущий патент: Раствор для ингаляции на основе солей тиотропия и солей салметерола и его применение для получения медикамента
Следующий патент: Комбинация агониста бета-2-адренорецепторов и аминосахара и их применение для лечения иммуномодуляторных расстройств
Случайный патент: Цитопротекторный комплекс