Эритропоэтины длительного действия, которые сохраняют тканезащитную активность эндогенного эритропоэтина

007812 Перекрестная ссылка, соотнесенная с родственными заявками Данная заявка претендует на приоритет по предварительной заявке США 60/409020, зарегистрированной 9 сентября 2002, которая включена в настоящее описание в полном объеме в виде ссылки. Область изобретения Настоящее изобретение относится к эритропоэтинам длительного действия, которые преимущественно сохраняют тканезащитные свойства после модификации. В частности, настоящее изобретение относится к эритропоэтинам длительного действия, которые химически модифицированы таким образом,что не только продлевается период их полужизни в сыворотке, но также и сохраняется тканезащитная функция нативного белка in vivo. Настоящее изобретение также относится к лечению анемии и родственных заболеваний посредством эритропоэтинов длительного действия согласно настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к анализам, которые используют для того, чтобы определить, проявляет ли эритропоэтин тканезащитные свойства. Предпосылки к созданию изобретения Природный или эндогенный эритропоэтин (ЕРО) является гормоном гликопротеиновой природы,вырабатываемым, главным образом, в почках. Эндогенный ЕPO состоит из 165 аминокислот и имеет молекулярный вес (у человека) приблизительно от 30000 до 34000 Да. Гликозильные остатки в молекуле ЕPО, которые состоят из трех N-связанных олигосахаридных цепей и одной О-связанной олигосахаридной цепи, составляют приблизительно 40% общего веса белка. N-связанные олигосахаридные цепи присоединены к амидным азотам аспарагина, находящегося в положениях 24, 38 и 83, в то время как О-связанная олигосахаридная цепь присоединена к кислороду у серинового остатка, расположенного в положении 126. Белок ЕРО может существовать в трех формах: ,и асиало. Формыиимеют одинаковую эффективность, биологическую активность и молекулярный вес, но незначительно отличаются по углеводным компонентам, в то время как асиало-форма представляет собойили -форму с удаленной из углеводных цепей концевой сиаловой кислотой, которая защищает углеводную цепь от распознавания печенью. До недавнего времени считалось, что основная функция эндогенного ЕРО заключается в том, чтобы совместно с другими факторами роста стимулировать пролиферацию и созревание эритроидных клетокпредшественников костного мозга и поддерживать гематокрит индивида (процент цельной крови, содержащей эритроциты). Процесс образования эритроцитов называют эритропоэзом, который строго контролируется посредством физиологического механизма, обусловливающего оптимизацию количества эритроцитов для характерной тканевой оксигенации без задержки кровообращения. Например, когда транспорт кислорода эритроцитами снижается, ЕРО способствует повышению продукции эритроцитов путем стимуляции превращения клеток-предшественников в костном мозге в зрелые эритроциты, которые затем высвобождаются в кровоток. Когда количество эритроцитов в кровотоке превышает количество, необходимое для нормальной циркуляции в ткани, ЕРО в кровотоке уменьшается. Таким образом,когда организм находится в здоровом состоянии, ЕРО присутствует в плазме в очень низких концентрациях, которых достаточно для стимуляции возмещения эритроцитов, утраченных в норме при старении. Уровни ЕРО в плазме в норме варьируют от 0,01 до 0,03 единиц/мл. Установлено, что поскольку почки продуцируют большую часть ЕРО у индивида, то нарушение функции почки, такое как хроническая почечная недостаточность (CRF), затрудняет образование ЕРО и часто приводит к анемии. Подобным образом, анемия может появляться в результате других хронических состояний, таких как раковое заболевание, или методов лечения, связанных с такими заболеваниями, таких как химиотерапия. Таким образом, введение рекомбинантного ЕРО (обсуждаемого более подробно ниже), который имеет, по существу, такие же биологические эффекты, как и эндогенный ЕРО,оказалось благоприятным для восстановления гематокритного числа у индивида со сниженным количеством эритроцитов. Помимо роли рекомбинантного ЕРО в сохранении гематокритного числа в случае хронических заболеваний, рекомбинантный ЕРО используют для поддержания уровней эритроцитов до факультативной или запланированной операции, тем самым уменьшая или устраняя необходимость в переливании крови. Например, рекомбинантный ЕРО можно вводить больному при проникновении в его организм вируса или патогена при кровоснабжении, или когда возникают проблемы религиозных ограничений в отношении переливания крови. Кроме того, некоторые последние данные свидетельствуют о том, что ЕРО как член надсемейства цитокинов имеет другие важные терапевтические свойства, которые опосредованы взаимодействием с рецептором ЕРО (EPO-R). Например, ЕРО и его рецептор могут играть важную роль в ослаблении тканевого повреждения, так как взаимодействие между ЕРО и рецептором приводит к компенсаторным реакциям, которые способствуют улучшению гипоксического микроокружения клетки, а также регуляции запрограммированной гибели клеток, вызванной метаболическим стрессом. В действительности, больные с хронической почечной недостаточностью и/или больные раковым заболеванием обычно испытывают ощущение улучшения здоровья и повышенной остроты ума после лечения эритропоэтином - эффект, который ранее приписывали повышению гематокритного числа у больного. Однако, согласно по-1 007812 следним данным, эти явления приписывают защитным и усиливающим эффектам ЕРО в ткани, обсуждаемым в международной публикацииWO/02053580 и патентных публикациях США 2002/0086816 и 2003/0072737. Недавние исследования показали, что системно введенный ЕРО может преодолевать интактный гематоэнцефалический барьер, поскольку капилляры, формирующие гематоэнцефалический барьер, также экспрессируют рецептор ЕРО. Как таковая, анатомическая база для опосредованного рецептором трансцитоза создается из периферического кровообращения в мозг. Рекомбинантный человеческий ЕРО (эпоэтин альфа), который был коммерчески доступен под торговыми названиями PROCRIT (из Ortho Biotech Inc., Raritan, NJ) и EPOGEN (из Amgen, Inc., ThousandOaks, CA), применяли для лечения анемии, возникающей на последней стадии почечного заболевания,для лечения ВИЧ-инфицированных больных при совместном использовании с терапией посредствомAZT (зидовудин), и для нейтрализации действия химиотерапии. Хотя рекомбинантный человеческий ЕРО проявляет множество терапевтических эффектов, основное применение рекомбинантного человеческого ЕРО было направлено на хроническую анемию. В этой связи рекомбинантный человеческий ЕРО обычно вводят в первоначальной дозе между 50-150 единиц/кг 3 раза в неделю в течение от 6 до 8 недель либо посредством внутривенной, либо подкожной инъекции, чтобы восстановить гематокритное число у больного. После достижения у больного желаемого уровня гематокрита, такого, который составляет приблизительно от 30 до 36%, такой уровень можно удерживать поддерживающими дозами ЕРО, количеством, достаточным для поддержания и вводимым с частотой, достаточной для поддержания нормальных уровней гематокрита, достигнутых при введении первоначальных доз ЕРО, в отсутствие дефицита железа и сопутствующих заболеваний. Хотя дозировки могут изменяться в зависимости от индивидуальных потребностей больного, обычно поддерживающие дозировки могут вводиться приблизительно 3 раза в неделю (меньше, если даются большие дозировки). Дозированное количество и частоту введения рекомбинантного ЕРО устанавливают отчасти по периоду полужизни молекулы, который может быть ограниченным, когда молекула находится in vivo. Например, внутривенно введенный препарат EPOGEN, как сообщают, элиминируется со скоростью, согласующейся с кинетикой реакции первого порядка, с периодом полужизни в кровотоке, колеблющимся приблизительно от 4 до 13 ч у взрослых больных и детей и подростков с CRF. Таким образом, чтобы средство было терапевтически эффективным, его дозированное количество и частота дозировки должны быть сопоставлены с относительно коротким периодом полужизни рекомбинантного ЕРО. Кроме того, поскольку рекомбинантный ЕРО вводят путем внутривенной или подкожной инъекции,то для введения больному рекомбинантного ЕРО часто требуется медсестра или врач. Это обстоятельство причиняет неудобство больному, и также существует другая причина, почему желательно продлить период полужизни молекулы. Попытки увеличить период полужизни рекомбинантного ЕРО вызывали интерес исследователей в последние 10 лет на основании предположения, что продление периода полужизни даст возможность снизить дозировку, обеспечивая в то же время такое же или улучшенное терапевтическое действие. В действительности, проведенные в последнее время эксперименты по ЕРО человека показали, что существует взаимосвязь между углеводным составом ЕРО, содержащим сиаловую кислоту, его периодом полужизни в кровотоке и биоактивностью in vivo. Как показано в публикации РСТWO95/05465, остатки сиаловой кислоты закрывают концы сахарных цепей и препятствуют обнаружению галактозы печенью. Обычно N-связанные олигосахаридные цепи имеют вплоть до 4 остатков сиаловой кислоты на цепь и О-связанные олигосахаридные цепи имеют вплоть до 2 остатков сиаловой кислоты на цепь. Таким образом, немодифицированный полипептид ЕРО может содержать всего вплоть до 14 остатков сиаловой кислоты. Со временем указанные остатки сиаловой кислоты могут отщепляться от белка, и, таким образом,открытые остатки галактозы распознаются печенью. Поскольку печень распознает остатки галактозы,белок фильтруется из крови. По существу, постепенное повышение содержания сиаловой кислоты на молекулу ЕРО, как полагают, способствует лучшему экранированию остатков галактозы для достижения соответствующего постепенного повышения биологической активности (измеренной по способности эквимолярных концентраций выделенных изоформ эритропоэтина повышать гематокритное число нормальной мыши). Поскольку немодифицированный ЕРО содержит только 14 участков сиаловой кислоты,этот подход имеет ограниченную возможность для продления периода полужизни ЕРО. Подобные рассуждения приводят к предположению, что полученный инженерным способом аналог ЕРО, содержащий дополнительные олигосахаридные цепи, должен обладать повышенной биологической активностью. Посредством получения дополнительных участков гликозилирования дополнительные олигосахаридные цепи, имеющие терминальные окончания, затем могут быть модифицированы остатками сиаловой кислоты. См. публикации РСТWO 91/05867, WO 94/09257 и WO 01/81405. Например, модифицированный аналог ЕРО может иметь по меньшей мере одну дополнительную Nсвязанную углеводную цепь и/или по меньшей мере одну дополнительную О-связанную углеводную цепь. В частности, в публикации WO 01/81405 описано добавление N-связанных углеводных цепей к молекуле в положениях аминокислот 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 и/или 138. Модифицированные молекулы-2 007812 ЕРО могут иметь от 1 до 4 дополнительных участков гликозилирования, которые позволяют добавить от 2 до 16 остатков сиаловой кислоты на молекулу. Кроме того, попытки увеличить время полужизни ЕРО включают в себя присоединение полиэтиленгликолей (ПЭГ) к аминокислотному остову белка ЕРО. См. публикации РСТ WO 00/32772, WO 01/02017 и WO 03/029291; патентные публикации СШАUS 2003/077753, US 2003/0120045, 2003/01666566; и патенты США 6,583,272 и 6,340,272. Конструкции слияния, присоединяющие другие белки к ЕРО, также использовались для увеличения времени полужизни ЕРО. См., например, патентные публикации СШАUS 2004/000009902, 2003/0124115,2003/0113871 и патент США 6,242,570. Однако, хотя попытки продлить период полужизни ЕРО в сыворотке оказались успешными и полезными в поддержании уровней гематокритного числа, внимание исследователей не было обращено на эффекты, которые эти дополнительные модификации могли оказывать на другие функции ЕРО. Таким образом, получение модифицированного ЕРО с продленным периодом полужизни в сыворотке (длительного действия), который сохраняет функциональность эндогенного ЕРО, представляет огромную важность. В частности, в данной области существует потребность в соединении ЕРО длительного действия с функциональностью эритропоэтина и тканезащитной функцией для использования в фармацевтических композициях с целью лечения индивидов, страдающих анемией и/или родственными заболеваниями. Кроме того, существует необходимость в анализах, с помощью которых удастся установить, является ли отдельный ЕРО антагонистическим по отношению к тканезащитным свойствам эндогенного ЕРО. Краткое описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к способу регуляции гематокритного уровня у человека, включающему в себя стадии получения эритропоэтинового продукта, имеющего более длительный период полужизни в сыворотке, чем рекомбинантный эритропоэтин человека (rhuEPO), и обладающего тканезащитной функцией, и подразумевающему введение терапевтически эффективного количества эритропоэтинового продукта, называемого здесь далее ЕРО длительного действия. В одном аспекте, стадия получения ЕРО длительного действия дополнительно включает в себя стадию модификации рекомбинантного эритропоэтина по меньшей мере с одной химической модификацией по меньшей мере одной из N-связанных олигосахаридных цепей или О-связанной олигосахаридной цепи, где химические модификации включают в себя окисление, сульфатирование, фосфорилирование, присоединение цепей ПЭГ или их комбинации. Кроме того, стадия введения терапевтически эффективного количества ЕРО длительного действия может включать в себя введение ЕРО длительного действия при более низком молярном количестве, чемrhuEPO, для достижения сопоставимого гематокритного числа. В одном аспекте, период полужизни ЕРО длительного действия в сыворотке по меньшей мере приблизительно на 20% дольше, чем период полужизни в сыворотке rhuEPO. В другом аспекте, период полужизни ЕРО длительного действия в сыворотке по меньшей мере приблизительно на 40% дольше, чем период полужизни в сыворотке rhuEPO. Настоящее изобретение также относится к искусственно полученному эритропоэтиновому продукту (ЕРО длительного действия), включающему в себя по меньшей мере одно производное эритропоэтина, где по меньшей мере одна N-связанная олигосахаридная цепь или по меньшей мере одна О-связанная олигосахаридная цепь имеет по меньшей мере одну химическую модификацию в результате окисления,сульфатирования, фосфорилирования, присоединения цепей ПЭГ или их комбинаций и где указанный ЕРО длительного действия имеет более длительный период полужизни в сыворотке, чем rhuEPO. Полученный в результате модификации ЕРО длительного действия предпочтительно проявляет тканезащитную функцию. В одном аспекте, по меньшей мере одна химическая модификация включает в себя окисление по меньшей мере одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере одной О-связанной олигосахаридной цепи с образованием по меньшей мере одного дополнительного остатка кислоты. Например, по меньшей мере одна химическая модификация может включать в себя сульфатирование по меньшей мере одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере одной О-связанной олигосахаридной цепи с увеличением отрицательного заряда на продукте ЕРО. В другом аспекте, по меньшей мере одна химическая модификация включает в себя фосфорилирование по меньшей мере одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере одной О-связанной олигосахаридной цепи с увеличением отрицательного заряда на продукте ЕРО длительного действия. В другом аспекте, по меньшей мере одна химическая модификация включает в себя добавление по меньшей мере одной полиэтиленгликолевой цепи по меньшей мере к одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере к одной Освязанной олигосахаридной цепи. Настоящее изобретение также относится к способу получения ЕРО длительного действия, имеющего более продолжительный период полужизни в сыворотке и проявляющего тканезащитную активность,включающему в себя стадии получения по меньшей мере одного эритропоэтина или производного эритропоэтина; и модификацию по меньшей мере одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере одной О-связанной олигосахаридной цепи по меньшей мере в молекуле одного эндогенного-3 007812 или рекомбинантного эритропоэтина или эритропоэтинового производного путем окисления, сульфатирования, фосфорилирования, присоединения цепей ПЭГ или их комбинаций. Стадия модификации также может включать в себя стадию замещения по меньшей мере одного смежного гидроксила по меньшей мере у одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере у одной О-связанной олигосахаридной цепи по меньшей мере одним остатком кислоты. В одном аспекте стадия замещения по меньшей мере одного смежного гидроксила по меньшей мере у одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере у одной О-связанной олигосахаридной цепи по меньшей мере одним остатком кислоты также включает в себя замещение множества смежных гидроксилов по меньшей мере у одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере у одной Освязанной олигосахаридной цепи множеством остатков кислоты. В другом аспекте, стадия модификации также включает в себя стадии приготовления органического растворителя; растворения эритропоэтина или производного эритропоэтина в органическом растворителе с образованием раствора; приготовления по меньшей мере одного конденсирующего агента; приготовления по меньшей мере одного донора сульфата и смешивания по меньшей мере одного конденсирующего агента и по меньшей мере одного донора сульфата в растворе. В другом аспекте, стадия модификации также включает в себя стадии приготовления органического растворителя; растворения эритропоэтина или производного эритропоэтина в органическом растворителе с образованием раствора; приготовления по меньшей мере одного конденсирующего агента; приготовления фосфорной кислоты и смешивания по меньшей мере одного конденсирующего агента и по меньшей мере одной фосфорной кислоты в растворе. В другом аспекте, стадия модификации также включает в себя стадии приготовления органического растворителя; растворения эритропоэтина или производного эритропоэтина в органическом растворителе с образованием первого раствора; приготовления по меньшей мере одного окислителя; добавления по меньшей мере одного окислителя к первому раствору, с образованием второго раствора; приготовления по меньшей мере одной полиэтиленгликолевой цепи и перемешивания по меньшей мере одной полиэтиленгликолевой цепи во втором растворе. Стадия приготовления по меньшей мере одной полиэтиленгликолевой цепи может включать в себя приготовление по меньшей мере одной полиэтиленгликолевой цепи по меньшей мере с одним фрагментом первичного амина на конце цепи. Настоящее изобретение относится также к способу лечения анемии у больных с риском повреждения ткани, включающему в себя стадии получения ЕРО длительного действия по меньшей мере с одной химической модификацией по меньшей мере в одной из N-связанных олигосахаридных цепей или О-связанной олигосахаридной цепи, где химическая модификация включает в себя окисление, сульфатирование, фосфорилирование, присоединение цепей ПЭГ (ПЭГилирование) или их комбинации; введения терапевтически эффективного количества ЕРО длительного действия, где ЕРО длительного действия вводят при меньшем молярном количестве, чем rhuEPO, для достижения сопоставимого гематокритного уровня, где ЕРО длительного действия имеет тканезащитную функцию. В данном аспекте изобретения, ЕРО длительного действия предпочтительно имеет более продолжительный период полужизни в сыворотке, чем rhuEPO. В одном аспекте изобретения, период полужизни в сыворотке по меньшей мере на 20% продолжительнее периода полужизни в сыворотке rhuEPO. В другом аспекте, период полужизни в сыворотке по меньшей мере на 40% продолжительнее периода полужизни в сыворотке rhuEPO. Настоящее изобретение дополнительно связано с фармацевтической композицией, включающей в себя терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ЕРО длительного действия, где по меньшей мере одна N-связанная олигосахаридная цепь или по меньшей мере одна О-связанная олигосахаридная цепь имеет по меньшей мере одну химическую модификацию как результат окисления,сульфатирования, фосфорилирования, присоединения цепей ПЭГ (ПЭГилирование) или их комбинаций,где по меньшей мере один ЕРО длительного действия имеет более продолжительный период полужизни в сыворотке, чем рекомбинантный эритропоэтин, и имеет тканезащитную функцию. В одном воплощении, фармацевтическая композиция дополнительно включает в себя по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. По меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель может включать в себя по меньшей мере один разбавитель, адъювант, наполнитель, растворитель или их смеси. В другом воплощении, фармацевтическая композиция дополнительно включает в себя по меньшей мере один увлажняющий агент, эмульсифицирующий агент, рН-забуферивающий агент или их сочетание. Еще в одном воплощении, фармацевтическая композиция дополнительно включает в себя по меньшей мере один тканезащитный цитокин. Краткое описание фигур Дальнейшие характеристики и преимущества изобретения могут быть выявлены на основе последующего подробного описания, которое дается с представленным ниже графическим материалом: фиг. 1 представляет собой иллюстрацию данных, которые свидетельствуют о том, что гипергликозилированный аналог ЕРО способен преодолевать гематоэнцефалический барьер, как показано при взятии спинно-мозговой жидкости; и на фиг. 2 представлены данные сравнения эффективностей различных форм ЕРО, проявляемых в-4 007812 защите против гибели клеток, инициированных воздействием триметилолова. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к применению ЕРО длительного действия, молекул ЕРО с более продолжительным периодом полужизни в сыворотке (длительного действия), которые являются продуктами химической модификации, относящейся к углеводным цепям, прикрепленным к аминокислотному остову ЕРО, так, чтобы сохранялась функциональность эндогенного ЕРО. Как описано в предпосылках к созданию изобретения, попытки исследователей продлить период полужизни ЕРО были сосредоточены на добавлении к аминокислотному остову ЕРО углеводных цепей, ПЭГ, белков и т.д. Однако полагают,что эти добавки влияют на функциональность аналога ЕРО таким образом, что функциональность нарушается и достижение более длительного периода полужизни становится затруднительным. Хотя известны аналоги ЕРО с более продолжительными периодами полужизни, чем рекомбинантный ЕРО, проявляющие активность эритропоэтина, указанные аналоги не сохраняют другие недавно обнаруженные терапевтические эффекты ЕРО, например тканезащитную активность. Например, было показано, что состоящий из 17 аминокислот фрагмент ЕРО, соответствующий аминокислотам в положениях 30-47, также называемый пептидом O'Brien, проявляет тканезащитную активность in vitro, но не обладает активностью эритропоэтина in vitro. Саmраnа, W.M., Misasi, R.O'Brien, J.S., Int. J. Mol. Med., 1, 235-41 (1998). Поэтому полагают, что модифицированный аналог ЕРО,имеющий добавки в пределах последовательности пептида O'Brien, может не проявлять тканезащитную активность при других исследованиях in vitro. Кроме того, поскольку трехмерная ориентация ЕРО является важной для проявления ее функциональности, добавки в молекуле могут нарушать общую функциональность результирующего аналога ЕРО. Таким образом, настоящее изобретение относится к молекулам ЕРО длительного действия, проявляющим по меньшей мере одну из активностей: эритропоэтическую активность, тканезащитную активность, способность к трансцитозу, или комбинации активностей. Предпочтительно ЕРО длительного действия согласно изобретению проявляет активность эритропоэтина и по меньшей мере одну тканезащитную активность или способность к трансцитозу. В одном аспекте, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению имеет период полужизни в сыворотке, который по меньшей мере приблизительно на 20% продолжительнее, чем период полужизни в сыворотке рекомбинантного ЕРО. В другом аспекте, период полужизни в сыворотке ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению по меньшей мере приблизительно на 30% продолжительнее, чем период полужизни рекомбинантного ЕРО. В другом аспекте, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению имеет период полужизни в сыворотке, который по меньшей мере приблизительно на 40% продолжительнее, чем период полужизни в сыворотке рекомбинантного ЕРО. Коротко, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению включают в себя аналоги ЕРО с углеводными цепями, которые изменяются посредством по меньшей мере одной модификации по сравнению с нативным (эндогенным) ЕРО, предпочтительно по сравнению с нативным ЕРО человека. В одном аспекте, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению подвергается множественным модификациям углеводных цепей. В одном аспекте, смежные гидроксилы углеводной цепи нативного ЕРО превращаются посредством окисления в кислотные остатки, при этом образуются молекулы ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению. В другом аспекте, остатки сиаловой кислоты молекулы ЕРО замещаются менее лабильными кислотными остатками. В другом аспекте, сульфатирование и/или фосфорилирование углеводной цепи ЕРО приводит к образованию ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению. В другом аспекте, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению образуется в результате добавления полиэтиленгликоля к углеводной цепи ЕРО. Любая комбинация из вышеприведенных модификаций также рассматривается настоящим изобретением. И, как упомянуто выше, настоящее изобретение также охватывает композиции, включающие в себя фармацевтические композиции, которые содержат одну или более из вышеупомянутых молекул ЕРО длительного действия. Молекулы ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению рассматриваются с целью включения их в фармацевтические композиции, предназначенные для лечения анемии и родственных заболеваний, особенно таких, которые имеют осложнения в результате расстройств, таких как, но не ограничиваясь ими, острая почечная недостаточность, сепсис, ВИЧ, расстройства в результате химиотерапии и т.п. Настоящее изобретение также относится к способам лечения анемии и родственных заболеваний, а также к наборам, используемым для лечения. Употребляемый в тексте термин "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, где целью является предотвращение или ослабление (замедление) установленного патологического состояния или расстройства. Индивиды, нуждающиеся в лечении, включают в себя индивидов, которые уже имеют расстройство, а также индивидов, которые предрасположены к заболеванию или у которых заболевание нужно предотвратить. Настоящее изобретение предполагает применение ЕРО длительного действия для хронического введения, острого лечения и/или чередующегося введения. В описании "хроническое введение" относится к введению агента(ов) в непрерывном режиме, в противоположность острому типу, с тем, что-5 007812 бы сохранить первоначальный терапевтический эффект (активность) в течение продолжительного периода времени, и "чередующееся введение" является лечением, которое не проводится постоянно без перерыва, а, скорее, является цикличным по природе. ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению применяют к любым млекопитающим. Употребляемый в тексте термин "млекопитающее" относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, и зоологических животных, спортивных или прирученных животных, таких как собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи, козы, кролики и т.д. Предпочтительно млекопитающим является человек. Введение ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению включает в себя, не ограничиваясь этим, пероральное, внутривенное, интраназальное, местное, внутрипросветное введение, ингаляцию или парентеральное введение, причем последнее включает в себя внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное введение, введение под слизистую, внутрикожное введение и их комбинации. Настоящее изобретение также относится к применению молекул ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению в качестве носителя для других молекул в те области тела, которые имеют рецепторы ЕРО. Например, поскольку некоторые молекулы плохо проникают через гематоэнцефалический барьер, связывание таких молекул с молекулами ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению приводит к надежной и эффективной системе транспорта указанных молекул в мозг. И, как будет обсуждаться более подробно позднее, поскольку другие области тела, такие как сетчатка, сердце и легкие, экспрессируют рецепторы ЕРО, молекулы ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению могут действовать как система транспорта молекул, обладающих низкой проникающей способностью через такие области. Кроме того, настоящее изобретение относится к исследованиям, позволяющим установить, сохраняет ли отдельный препарат ЕРО функциональность эндогенного ЕРО. Например, исследование согласно настоящему изобретению позволяет установить, проявляет ли модифицированный ЕРО тканезащитную функцию, т.е. является ли он агонистом эндогенного ЕРО. Употребляемый в тексте термин "агонист" применяют в самом широком смысле слова, и он включает в себя молекулы, которые имитируют биологическую активность нативного ЕРО. Подобным образом, термин "антагонист" применяют в самом широком смысле этого слова, и он включает в себя любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность нативного ЕРО. В одном аспекте,исследование отдельного ЕРО осуществляют с помощью анализа in vitro, такого как анализ, включающий в себя клетки Р 19 и/или двигательные нейроны крысы. В другом аспекте, исследование согласно настоящему изобретению включает в себя оценку отдельного ЕРО in vivo с помощью различных анализов на таких моделях, как фокальная ишемия крысы, ишемия сетчатки крысы, травма спинного мозга и эпилептический припадок, вызванный бикукуллином. Функциональность. Как обсуждали в разделе "Предпосылки к созданию изобретения", различные попытки продлить период полужизни ЕРО оказались успешными в том, что аналоги ЕРО имели более продолжительный период полужизни и сохраняли активность эритропоэтина. И, как обсуждалось, аналоги ЕРО с более длительными периодами полужизни, главным образом, включали в себя добавки к аминокислотной последовательности ЕРО. Такие добавки включают в себя углеводные цепи, ПЭГ и белковые последовательности. Однако было высказано предположение, что указанные дополнительные углеводные цепи могут мешать проявлению других терапевтических эффектов ЕРО, таких как тканезащитная функция и способность молекулы к трансцитозу. Не связывая себя какой-либо определенной теорией, авторы изобретения предположили, что включение добавочных углеводных цепей в последовательность пептидаO'Brien может повлиять на функциональность на основании того, что указанный пептид является важным для проявления тканезащитной функции. Кроме того, полагают, что добавленные углеводные цепи,находятся ли они в пределах последовательности пептида O'Brien или вне последовательности пептидаO'Brien, влияют на трехмерную ориентацию молекулы. Например, в трехмерной конфигурации молекулы дополнительные углеводные цепи могут блокировать участок молекулы, который является существенным для проявления функции. Кроме того, полагают, что метод введения добавок может также влиять на функциональность гликопротеина. Хотя специалисты в данной области и могут быть знакомы с целым рядом способов добавления или присоединения дополнительных углеводов, полиэтиленгликолей,белков и т.д. к аминокислотному остову ЕРО, упоминание о дополнительных углеводах будет относится также и к другим добавкам к аминокислотному остову ЕРО. Тканезащитное свойство. Для того чтобы оценить возможность влияния дополнительных углеводных цепей на функциональность гликопротеина, авторы настоящего изобретения изучали формы аналогов ЕРО, которые имели 5 Nсвязанных углеводных цепей (по сравнению с 3 N-связанными углеводными цепями рекомбинантного ЕРО). В частности, авторы изобретения использовали аналог ЕРО, где аналог имел дополнительный участок гликозилирования у аминокислоты в положении 32, что привело приблизительно к трехкратному увеличению периода полужизни по сравнению с рекомбинантным ЕРО (эритропоэтин альфа).-6 007812 Хотя указанный аналог ЕРО появлялся в спинно-мозговой жидкости после системной инъекции(фиг. 1), он не проявлял тканезащитной функции при оценке с помощью последующего анализа на клетках Р 19 in vitro (фиг. 2). Такое отсутствие тканезащитной активности было непредвиденным. Кроме того,отсутствие тканезащитной активности может вызывать осложнения при лечении больных анемией, если больные имеют другие заболевания, требующие тканевой защиты. Например, если аналог ЕРО, не проявляющий тканезащитную активность, конкурирует с эндогенным ЕРО, обладающим тканезащитной активностью, за рецептор, который инициирует тканевой защитный ответ, степень повреждения в результате травмы, в действительности, может усилиться при использовании таких аналогов ЕРО. В действительности, если больной испытывал удар при использовании такого аналога ЕРО, то объем инфаркта в результате удара может действительно быть больше, чем у индивида, которого не лечили аналогом ЕРО. Хотя авторы и не желают связывать себя какой-либо определенной теорией, полученные данные позволили им предположить, что по меньшей мере один дополнительный вариант рецептора ЕРО функционально существует в нервных тканях, где передача сигнала отличается от передачи сигнала предшественников эритроцитов, и что существует риск, что некоторые аналоги ЕРО могут противодействовать способности эндогенного ЕРО связываться с указанным вариантом рецептора. Разница в биологических активностях между эндогенным ЕРО и данными аналогами ЕРО свидетельствуeт о том, что рецепторная передача сигнала осуществляется посредством функционально различных рецепторов ЕРО, реагирующих на различные домены молекулы ЕРО. В действительности, было показано, что, хотя белковая последовательность, кодируемая геном рецептора ЕРО, идентична последовательности, экспрессируемой эритроидными предшественниками, сродство связывания рецептора нейронального типа с ЕРО in vitro намного ниже, чем рецептора ЕРО проэритроцита. См., например, Masuda, S., et al., J. Biol. Chem., 268,11208-16 (1993). По-видимому, указанные различия возникают из-за дополнительных белков, и полученные результаты могут свидетельствовать о том, что, скорее, реализуются различные пути передачи сигнала, чем они активируются в процессе созревания эритроцитов. Интересно, что указанная разница в сродстве не меняется при полном дегликозилировании ЕРО, причем такой результат не является неожиданным, поскольку активное связывание в нервной ткани происходит в нормальной негликозилированной области петли АВ молекулы ЕРО. Там же. Кроме того, ЕРО, продуцируемый астроцитами (который преимущественно представляет собой такой же продукт, продуцируемый другими клетками, такими как нейроны), представляет собой меньший по размеру вариант, чем продуцируемый почками. Masuda, S., etal., J. Biol. Chem., 269, 19488-93 (1994). Эта разница является, по-видимому, результатом различной степени гликозилирования. Там же. Проявляет ли десиалированный природный лиганд различия в сродстве к указанным известным рецепторным белкам, до сих пор не установлено, но это представляет собой важную проблему. Помимо существования ЕРО - рецептормодифицирующих дополнительных белков, рецептор ЕРО является продуктом комплексного гена, кодирующего также ряд известных вариантов рецептора, включая укороченный, растворимый рецептор. Yamaji, R., et al., Eur. J. Biochem., 239, 494-500; Yamaji, R., etWestenfelder, C., Biddle, D.L.Baranowski, R.L., Kid. Internat., 55, 808-820 (1999). Способствуют ли какие-либо из этих вариантов рецептора проявлению эффектов ЕРО в нервной ткани, также требует выяснения. Кроме того, как обсуждалось в разделе "Предпосылки к созданию изобретения", было показано, что пептид O'Brien проявляет тканезащитную активность in vitro, но не проявляет активности эритропоэтинаin vitro. В действительности, исследование, выполненное с аналогом ЕРО, который содержит добавочную углеводную цепь в пептиде O'Brien, показало, что аналог ЕРО лишен тканезащитных свойств. На основании полученных результатов исследователи предполагают, что некоторые модификации пептидаO'Brien, такие как добавление углеводных цепей, влияют на функциональность белка. Аналог ЕРО с модификациями пептида O'Brien, вероятно, действует как антагонист по отношению к эндогенному ЕРО организма, поскольку он частично или полностью блокирует способность эндогенного ЕРО связываться с рецептором ЕРО. По существу, риск повышения степени повреждения в результате травмы, вероятно,связан с применением такого аналога ЕРО. Таким образом, полагают, что у аналогов ЕРО, имеющих модификации в пептиде O'Brien, также должны отсутствовать тканезащитные свойства при проверке с помощью других анализов in vitro, таких как анализ на модели двигательных нейронов крысы, и анализовin vivo, таких как анализы с использованием моделей фокальной ишемии крысы, эпилептического приступа, вызванного бикукуллином, ишемии сетчатки крысы и травмы спинного мозга. Трансцитоз, опосредованный рецептором. Авторы изобретения изучали способность аналога ЕРО преодолевать гематоэнцефалический барьер, используя такой же аналог ЕРО, как упомянутый выше, т.е. аналог ЕРО с 5 N-связанными углеводными цепями (в отличие от 3 N-связанных углеводных цепей рекомбинантного ЕРО). Аналог ЕРО появлялся в спинно-мозговой жидкости после системной инъекции (фиг. 1 и 2). Не связывая себя какой-либо отдельной теорией, авторы изобретения полагают, что аналог ЕРО способен преодолевать интактный гематоэнцефалический барьер, поскольку формирующие гематоэнцефалический барьер капилляры также-7 007812 экспрессируют рецептор ЕРО и создают анатомическую основу для рецептор-опосредованного трансцитоза из периферического кровообращения в мозг. По существу, полагают, что другие системно вводимые аналоги ЕРО также способны преодолевать гематоэнцефалический барьер, а также другие барьеры с сетью капилляров, экспрессирующих рецептор ЕРО. В итоге было показано, что поскольку аналоги ЕРО предыдущего уровня техники сохраняют активность эритропоэтина при потере по меньшей мере какой-то из функций эндогенного ЕРО, существует необходимость создания в данной области препарата ЕРО длительного действия, который сохраняет все из известных функций эндогенного ЕРО. Преимущественно настоящее изобретение направлено на получение ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению, который не только продлевает период полужизни в сыворотке по сравнению с рекомбинантным ЕРО, но также сохраняет функциональность эндогенного ЕРО, т.е. тканезащитную функцию и способность к трансцитозу. Различные способы модификации ЕРО для получения такого белка, проявляющего положительный эффект, представлены в следующем разделе. Модификация нативного ЕРО. Препараты ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению могут быть получены различными способами. Вообще, ЕРО длительного действия могут быть получены путем химической модификации, относящейся к углеводным (сахарным) цепям, присоединенным к ЕРО. Употребляемый в тексте термин "углеводные цепи" относится к N-связанным и О-связанным олигосахаридным цепям, обнаруженным в эндогенном ЕРО, дополнительным N-связанным и О-связанным олигосахаридным цепям,найденным в аналогах ЕРО, и к любым другим углеводным цепям, особенно сахарным цепям, присоединенным к ЕРО. В одном аспекте, молекулы эндогенного или рекомбинантного ЕРО применяют для модификации,чтобы не допустить какого-либо влияния на тканезащитные свойства эндогенного ЕРО. Кроме того, аналоги ЕРО предлагаются для модификации согласно настоящему изобретению, при условии, что дополнительные участки гликозилирования не расположены вблизи пептида O'Brien, т.е. вблизи аминокислотной последовательности 30-47. Употребляемый в тексте термин "аналоги ЕРО" относится к модифицированным молекулам ЕРО, которые имеют по меньшей мере одну дополнительную N-связанную углеводную цепь и/или по меньшей мере одну дополнительную О-связанную углеводную цепь. В другом аспекте, используемый для модификации аналог ЕРО не содержит каких-либо дополнительных участков гликозилирования приблизительно в пределах 5 аминокислот от пептида O'Brien. В другом аспекте, аналог ЕРО не содержит каких-либо дополнительных участков гликозилирования приблизительно в пределах 3 аминокислот от пептида O'Brien. И еще в другом аспекте, аналог ЕРО не содержит каких-либо дополнительных участков гликозилирования в пептиде O'Brien. Аналог ЕРО также может быть использован для модификации согласно настоящему изобретению,при условии, что аналог имеет установленную трехмерную конфигурацию, и подтверждено, что ни одна из дополнительных углеводных цепей не блокирует пептид O'Brien и не вызывает потерю тканезащитной функции. В другом аспекте, аналог ЕРО предполагают использовать для модификации согласно настоящему изобретению, при условии, что способ гликозилирования не вызывает ингибирования тканезащитной функции пептида. И еще в другом аспекте, аналог ЕРО может быть использован для модификации согласно настоящему изобретению при условии, что в пептиде O'Brien имеется одна (или менее) углеводная цепь. Например, эндогенный ЕРО содержит углеводную цепь у 38 аминокислоты, и дополнительная углеводная цепь в пептиде O'Brien, как было показано, ингибирует тканезащитную активность белка. Таким образом, аналог ЕРО, имеющий одну углеводную цепь или не имеющий углеводных цепей в пептиде O'Brien, предполагают использовать для модификации. В одном аспекте, углеводная цепь, соединенная с 38 аминокислотой, может быть перемещена в какой-либо другой участок белка. Неограничивающие примеры модификаций согласно настоящему изобретению включают в себя(1) образование дополнительных кислотных остатков на углеводных цепях посредством окисления смежных гидроксилов; (2) замещение остатков сиаловой кислоты менее лабильными остатками; (3) увеличение отрицательного заряда на молекуле эритропоэтина путем сульфатирования и/или фосфорилирования; и/или (4) присоединение к концам углеводных цепей более сложных молекул. Таким образом,модификации по отношению к углеводным цепям ЕРО могут включать в себя окисление, сульфатирование, фосфорилирование и/или ПЭГилирование, наряду с другими процедурами, которые будут обсуждаться более подробно ниже и далее иллюстрированы в примере 1. Окисление сахарных цепей и замещение остатков сиаловой кислоты. Химически модифицированный ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению может включать в себя молекулы ЕРО, у которых углеводы (сахара) окислены, с образованием дополнительных кислотных остатков. В другом аспекте, остатки сиаловой кислоты замещены менее лабильными кислотными остатками. Модификации такого типа приводят к увеличению периода полужизни молекулы по сравнению с эндогенным ЕРО, поскольку галактозные цепи, по которым печень узнает, и пропускает,и удаляет из кровообращения связанный белок, защищены от обнаружения. Более существенная химическая модификация углеводных цепей молекулы ЕРО приводит к более значительному увеличению периода полужизни в сыворотке ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению. Например,-8 007812 чем больше смежных гидроксилов замещено кислотами, тем больше увеличение периода полужизни в сыворотке. Хотя рядовому специалисту в данной области известно существование нескольких подходящих способов превращения галактозных единиц эритропоэтина, следует отметить, что подходящий способ включает в себя (1) модификацию сахарных молекул со смежными гидрокислами периодатом с образованием альдегидов; и (2) окисление альдегидов с получением кислот. Реагенты, подходящие для окисления сахарной цепи с образованием альдегидов, известны специалистам в данной области и включают в себя, не ограничиваясь ими, периодаты, такие как периодат натрия, и оксидазы cахаров, такие как галактозооксидаза. Кроме того, специалисты в данной области должны быть осведомлены о подходящих реагентах для превращения альдегидов, таких как реактив Бенедикта (коммерчески доступный от Fisher). В одном из аспектов, молекулы сахара окисляют периодатом натрия и далее обрабатывают реактивом Бенедикта (Fisher) с превращением альдегидов в кислоты. В другом аспекте, изомер ЕРО, имеющий приблизительно 0-13 остатков сиаловой кислоты, или аналог ЕРО, имеющий по меньшей мере одну углеводную цепь, у которой отсутствует остаток сиаловой кислоты, подвергают окислению, используя галактозооксидазу. Асиало-форму ЕРО можно использовать согласно данному аспекту изобретения, т.е. - или -форму ЕРО с удаленными всеми одиночными остатками сиаловой кислоты с концевых участков углеводных цепей. Предпочтительно применяют именно такой асиалоэритропоэтин. После окисления ЕРО подвергают действию другого окислительного агента,такого как реактив Бенедикта, для превращения альдегидов в кислоты. В другом аспекте, система с четырехокисью рутения может быть использована для образования кислот на углеводных цепях. При условии, что такая система модифицирует галактозную цепь, даже если результирующие кислоты удаляются из молекулы ЕРО, молекула должна все еще продолжать избегать возможности быть удаленной печенью, поскольку галактозная цепь, которая является компонентом, который печень распознает, не будет более существовать. Увеличение отрицательного заряда. В другом аспекте настоящего изобретения молекула ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению образуется при добавлении сульфатов и/или фосфатов к молекуле ЕРО, что приводит к увеличению отрицательного заряда молекулы и, тем самым, к повышению периода полужизни молекулы. Другими словами, отрицательный заряд молекулы ЕРО можно увеличить путем сульфатирования,которое включает в себя перенос сульфурильной группы от сульфатного донора. А также отрицательный заряд можно увеличить путем введения фосфорной группы в углевод. Подходящий способ сульфатирования инсулина обсуждается в публикации S.Pongor et al., Preparationof High-Potency, Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure, Diabetes, Vol. 32, No. 12, December 1983. Например, сульфатирование инсулина проводили в органическом растворителе, таком как диметилформамид (DMF), в присутствии конденсирующих агентов, таких как N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC), и сульфатного донора. Степень сульфатирования можно регулировать на уровне свыше восьмикратного путем изменения количества конденсирующего агента. Хотя полученный обычным способом сульфатированный инсулин теряет основную биоактивность инсулина, биоактивность сульфатированного по способу Ponger инсулина составляет между 78 и 87% активности немодифицированного инсулина. Инспользуя такую же процедуру для ЕРО, обычный специалист в данной области сможет проконтролировать степень сульфатирования и, следовательно, период полужизни в сыворотке химически модифицированного ЕРО. Например, отрицательный заряд ЕРО можно увеличить путем добавления сульфатов к белку путем растворения ЕРО или аналога ЕРО по меньшей мере в одном водорастворимом карбодиимиде, предпочтительно DCC, при температуре приблизительно 4 С. Хотя DCC и предпочтителен в качестве конденсирующего агента, специалисты в данной области легко определят другие подходящие конденсирующие агенты для применения согласно настоящему изобретению. Подобные процедуры можно использовать для регуляции степени фосфорилирования ЕРО фосфорной кислотой (Н 3 РО 4) в качестве фосфатного донора. И вновь, хотя фосфорная кислота является предпочтительной, квалифицированные специалисты в данной области смогут легко выбрать другие фосфатные доноры для фосфорилирования ЕРО. Присоединение цепей ПЭГ к концам углеводных цепей. Углеводные цепи ЕРО могут быть модифицированы путем добавления по меньшей мере одного полиэтиленгликоля (ПЭГ), соединения с длительной и надежной клинической историей, который имеет следующую общую формулу: ПЭГ может быть метоксиПЕГ (мПЭГ), имеющий следующую общую формулу: В одном аспекте, ПЭГ является аминоПЭГ, предпочтительно метоксиПЭГ с первичными аминогруппами на концах (мПЭГ-NH2). Цепи полиэтиленгликоля с первичными аминогруппами на концах являются весьма пригодными полимерами, проявляющими функциональную активность. Концевые аминогруппы мПЭГ-NH2 более активны в отношении ацилирующих агентов, чем гидроксильные группы, которые имеются в молекулах обычных ПЭГ, и они также легко подвергаются реакциям восстановительного аминирования. В другом аспекте, ПЭГ является электрофильно активированным ПЭГ, таким как мПЭГ-сукцинимидилпропионат (мПЭГ-SPA) или мПЭГ-сукцинимидилбутаноат (мПЭГ-SBA), оба из которых являются коммерчески доступными от компании Nektar Therapeutics of Birmingham, Alabama. В другом аспекте, ПЭГ является метоксиПЭГ-гидразидом. В одном аспекте, добавление по меньшей мере одного типа ПЭГ достигается через окисление периодатом (как описано выше) с последующим использованием цианоборгидрида и аминоПЭГ. Например, молекула ЕРО в растворе может быть вначале окислена периодатом, например периодатом натрия, в течение предварительно заданного периода времени при комнатной температуре, что приводит к образованию альдегидов в углеводных цепях. Подходящим периодатом является мета-периодат натрия, который коммерчески доступен от фирмы Sigma. Затем периодат может быть удален посредством буферного обмена, затем окисленные группы сиаловой кислоты на N-связанных олигосахаридных группах молекулы ЕРО могут быть подвергнуты действию по меньшей мере одного типа ПЭГ - аминоПЭГ, в присутствии цианоборгидрида. Подходящие для использования типы ПЭГ включают в себя, не ограничиваясь ими,метокси-ПЭГ-гидразиды, которые являются коммерчески доступными от компании Nektar Therapeutics. В другом аспекте, добавление по меньшей мере одного типа ПЭГ выполняли путем присоединения групп молекулы ПЭГ к концевым галактозным остаткам после окисления галактозооксидазой. Например, асиало-форма ЕРО (имеющая незащищенные концевые галактозные остатки) в буфере вначале подвергается действию галактозооксидазы (коммерчески доступна от фирмы Sigma) с образованием альдегидов в углеводных цепях. Затем буфер может быть удален путем буферного обмена, после этого окисленные галактозные остатки могут быть подвергнуты действию по меньшей мере одного типа ПЭГ аминоПЭГ, в присутствии цианоборгидрида. Описанные выше способы не рассматриваются как ограничивающие, так как эти или другие способы можно использовать для получения соединений согласно изобретению. Например, квалифицированный специалист в данной области должен признать, что указанные химические модификации можно применять для создания вариантов других производных ЕРО длительного действия, таких как цитокины с тканезащитной функцией, описанные в международной публикацииWO/02053580 и патентных публикациях США 2002/0086816 и 2003/0072737, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки. Получение молекул ЕРО. Ряд экспрессирующих векторных систем хозяина может быть использован для получения ЕРО для продуцирования ЕРО длительного действия и молекул ЕРО согласно изобретению. Такие экспрессирующие системы хозяина представляют собой носители, с помощью которых молекулы ЕРО длительного действия могут быть произведены и впоследствии очищены, но также представляют собой клетки,которые, будучи трансформированы или трансфицированы соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями, могут экспонировать ген модифицированного эритропоэтина in situ. Указанные системы включают в себя, не ограничиваясь ими, клетки бактерий, насекомых, растений,млекопитающих, включая системы человека-хозяина, такие как, не ограничиваясь ими, клеточные системы насекомых, инфицированные экспрессирующими векторами рекомбинантного вируса (например,бакуловируса), содержащими последовательности, кодирующие ЕРО длительного действия; клеточные системы растений, инфицированные экспрессирующими векторами рекомбинантного вируса (например,вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса табачной мозаики, TMV) или трансформированные экспрессирующими векторами рекомбинантной плазмиды (например, плазмиды Ti), содержащими последовательности, кодирующие эритропоэтин-родственные молекулы; или клеточные системы млекопитающих, содержащие клеточные системы человека, например НТ 1080, COS, СНО, ВНК, 293, 3 Т 3, рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих, например промотор металлотионеина, или из вирусов млекопитающих, например поздний промотор аденовируса; 7,5 К промотор вируса коровьей оспы. Кроме того, может быть выбран хозяйский клеточный штамм, который регулирует экспрессию введенных последовательностей или модифицирует и подвергает процессингу генный продукт специфическим желаемым образом. Такие модификации и процессинг белковых продуктов могут оказаться важными для функции белка. Как известно специалистам в данной области, различные хозяйские клетки имеют специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и генов.- 10007812 Соответствующие клеточные линии или хозяйские системы могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга экспрессированного чужеродного белка. С этой целью могут быть использованы эукариотические хозяйские клетки, которые обладают клеточным аппаратом для характерного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие хозяйские клетки млекопитающих, включая хозяйские клетки человека, включают в себя, не ограничиваясь ими, НТ 1080, СНО, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3 Т 3 и WI38. Для продуцирования рекомбинантных белков в течение длительного времени и с высоким выходом стабильная экспрессия является предпочтительной. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют рекомбинантный генный продукт, кодирующий молекулу ЕРО, могут быть получены генноинженерным способом. Вместо использования экспрессирующих векторов, которые включают в себя вирусные источники репликации, хозяйские клетки могут быть трансформированы посредством ДНК,причем трансформация регулируется соответствующими элементами, контролирующими экспрессию,например промотором, энхансером, последовательностями, терминаторами транскрипции, участками полиаденилирования и т.п., и селективным маркером. После введения чужеродной ДНК полученные генно-инженерным способом клетки растут в течение 1-2 дней в обогащенной среде, и затем их переносят в селективную среду. Селективный маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к отбору и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в их хромосомы и расти с образованием центров, которые, в свою очередь, можно клонировать и увеличивать их массу в клеточных линиях. Указанный способ можно с успехом использовать для получения генно-инженерных клеточных линий, которые экспрессируют генный продукт, родственной мутеину ЕРО молекулы. Такие генно-инженерные клеточные линии могут оказаться особенно пригодными в скрининге и при оценке соединений, которые влияют на эндогенную активность генного продукта родственной ЕРО молекулы. В качестве альтернативы, экспрессию, характерную для эндогенного гена мутеина ЕРО в клеточной линии или микроорганизме, можно модифицировать путем вставки регуляторного элемента гетерологичной ДНК в геном стабильной клеточной линии или клонированный микроорганизм таким образом,что введенный регуляторный элемент эффективно связывается с эндогенным геном мутеина эритропоэтина. Например, эндогенный ген мутеина ЕРО является обычно "транскрипционно молчащим", т.е. ген ЕРО, который обычно не экспрессируется или экспрессируется только на очень низком уровне в клеточной линии, может быть активирован путем введения регуляторного элемента, который способен стимулировать экспрессию экспрессированного генного продукта в такой клеточной линии или микроорганизме. В качестве альтернативы, транскрипционно молчащий, эндогенный ген ЕРО может быть активирован путем введения неоднородного регуляторного элемента, который работает в разных типах клеток. Гетерологичный регуляторный элемент может быть встроен в стабильную клеточную линию или клонированный микроорганизм, таким образом, чтобы он был оперативно связан с эндогенным геном эритропоэтина таким способом, как заданная гомологичная рекомбинация, который хорошо известен специалистам в данной области и также описан во французском патенте 2646438, патентах США 4215051 и 5578461 и международных публикациях WO93/09222 и WO91/06667, полное описание которых включено в данное описание в виде ссылки. Фармацевтические композиции. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим молекулы ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению. Поскольку молекулы ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению преимущественно проявляют эритропоэтическую активность, а также тканезащитные свойства и способность к трансцитозу, они предлагаются для использования при лечении анемии и родственных заболеваний у индивидов с риском возникновения различных повреждений ткани, таких как удар и инфаркт миокарда. Кроме того, молекулы ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению предлагаются для использования при лечении анемии и родственных заболеваний у индивидов, также испытывающих ухудшение умственных способностей, - таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и т.п. Кроме того, молекулы ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению предлагаются для использования при лечении анемии у индивидов, испытывающих состояния, возникающие в результате нормального процесса старения, например проблемы равновесия, приводящие к падению, легкие ушибы и т.п. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению молекул ЕРО длительного действия в качестве носителей для других молекул, которые имеют низкую проходимость через барьеры с капиллярами, имеющими рецепторы для ЕРО. Например, любая из описанных выше молекул ЕРО длительного действия может быть включена в фармацевтические композиции согласно изобретению. Кроме того, различные аналоги ЕРО могут быть включены в фармацевтические композиции согласно изобретению в смеси по меньшей мере с одним тканезащитным цитокином, что будет обсуждаться более подробно ниже. Фармацевтические композиции согласно изобретению содержат терапевтически эффективное количество ЕРО длительного действия, предпочтительно в очищенном виде. Композиция должна соответствовать типу введения. Другими словами, фармацевтическая композиция согласно изобретению включает в себя такое количество ЕРО длительного действия согласно изобретению, что состояние, подвергаемое лечению, поддается излечиванию при условии, что используются соответствующая доза и страте- 11007812 гия. И, как будет обсуждаться более подробно ниже, фармацевтические композиции должны быть доставлены в нетоксическом дозированном количестве. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут включать в себя терапевтически эффективное количество ЕРО длительного действия и подходящее количество фармацевтически приемлемого носителя для получения соответствующей лекарственной формы для введения больному. В отдельном аспекте, термин "фармацевтически приемлемое" означает соединение, утвержденное регулирующим ведомством федерального значения, или находящимся в системе власти штата, или перечисленное в фармакопее США или другой общепризнанной иностранной фармакопее для использования у животных, и особенно у человека. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или связующему веществу, с которым вводят терапевтический препарат. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как физиологические растворы в воде и маслах, включая масла из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Физиологический раствор является предпочтительным носителем при введении фармацевтической композиции внутривенно. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно применять в качестве жидких носителей, особенно для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Фармацевтические композиции согласно изобретению также могут содержать небольшие количества смачивающего реагента, или эмульгатора, или регулирующих рН буферных реагентов. Указанные композиции могут быть приготовлены в виде растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул,порошков, композиций с пролонгированным действием и т.п. Соединения согласно изобретению могут быть получены в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли, в образовании которых участвуют свободные аминогруппы, такие как соли, образованные с соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винно-каменной кислотой и т.д., и соли, в образовании которых участвуют свободные карбоксильные группы, такие как соли, образованные с гидроокисями натрия, калия, аммония, кальция, железа, а также соли с изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т.д. Композиция, содержащая ЕРО длительного действия. Как кратко изложено выше, любая из молекул ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению рассматривается для использования в фармацевтических композициях. В одном аспекте,молекула ЕРО длительного действия, полученная в результате окисления смежных гидроксилов, включена в фармацевтическую композицию согласно изобретению. В другом аспекте, фармацевтическая композиция согласно изобретению включает в себя по меньшей мере один ЕРО длительного действия, который образуется в результате замещения остатков сиаловой кислоты менее лабильными остатками. В другом аспекте, ЕРО длительного действия, включенный в фармацевтическую композицию, образуется в результате увеличения отрицательного заряда на молекуле ЕРО путем сульфатирования и/или фосфорилирования. Еще в другом аспекте, вариант ЕРО длительного действия, образованный посредством присоединения к концам углеводных цепей более сложных молекул, например цепей ПЭГ, включен в фармацевтические композиции согласно изобретению. Кроме того, в настоящем изобретении предполагается использование смеси молекул ЕРО длительного действия, полученных любым из способов согласно настоящему изобретению, в фармацевтических композициях согласно изобретению. Например, фармацевтическая композиция согласно изобретению может включать в себя по меньшей мере один ЕРО длительного действия, который образуется в результате замещения остатков сиаловой кислоты менее лабильными остатками, и по меньшей мере один ЕРО длительного действия, который образуется в результате увеличения отрицательного заряда на молекуле ЕРО путем сульфатирования и/или фосфорилирования. Система транспорта. Как обсуждалось ранее, молекулы ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению способны преодолевать барьеры с сетью капилляров, имеющих рецепторы ЕРО. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения представляет собой транспортную систему с использованием ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению в качестве носителей для молекул, обладающих низкой проницаемостью в отношении области-мишени тела, имеющей рецепторы ЕРО. Такие транспортные системы преимущественно представляют собой новый и надежный способ доставки через интактные барьеры. В одном аспекте, транспортная система включает в себя ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одну молекулу с низкой проницаемостью в мозг с тем, чтобы предоставить новый и надежный способ доставки через интактный гематоэнцефалический барьер. Другими словами, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению способствуют тому, что молекулы с низкой проницаемостью в мозг действуют как молекулярный "троянский конь" для того,чтобы повысить включение в мозг малой или большой молекул для диагностики или терапевтических- 12007812 молекул. В действительности, важная проблема в лечении опухолей мозга человека диктуется необходимостью доставки терапевтических средств к отдельным областям мозга, распределения их в опухолях мозга и нацеливания их на опухоли мозга. Молекулы, которые могут в других случаях быть эффективны в диагностике и терапии, либо не могут преодолеть гематоэнцефалический барьер (ВВВ) в участках мозга,примыкающих к опухоли, либо не могут преодолевать в надлежащих количествах барьер между кровеносной системой и опухолью (ВТВ). Таким образом, до сих пор имеется потребность в новых стратегиях доставки, которые будут уникальными для мозга и которые позволят обойти сосудистую сеть. Например,антитела, которые могли бы быть использованы либо в качестве диагностических, либо терапевтических молекул, не могут преодолеть ВТВ в достаточных для их эффективновного действия количествах из-за их размера. По существу, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению могут быть использованы в качестве носителя для таких молекул, чтобы способствовать преодолению ВВВ или ВТВ. Один пример молекулы, которую можно использовать с ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению, представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который обычно применяют либо для ингибирования онкогенных сигналов, либо для отображения генной экспрессии в мозге in vivo. Кроме того, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению могут быть включены в различные композиции для генной терапии (вирусные или невирусные композиции), которые часто являются слишком большими для преодоления ВТВ без вспомогательных средств. Кроме того, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению могут быть использованы в качестве опосредованного носителем переносчика для различных химиотерапевтических средств. Поскольку активные переносчики лекарственного средства, которые экспрессируются у ВВВ и ВТВ, эффективно переносят химиотерапевтические средства из мозга обратно в кровь, распределение указанных средств в мозге может ингибироваться или предотвращаться. Отчасти по этой причине большая часть классических химиотерапевтических молекул, которые применяют для лечения опухолей вне центральной нервной системы (CNS), является не эффективной в лечении опухолей мозга. Таким образом, применение ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению в качестве носителя для таких химиотерапевтических средств может оказаться полезным не только в переноске средств в мозг, но также и для сохранения средств в мозге для терапевтического действия. В другом аспекте, ЕРО длительного действия может быть связан с лекарственным средством, которое тормозит активный переносчик, чтобы далее обеспечить утилизацию химиотерапевтических средств, которые обычно поступают из мозга в кровь. Кроме того, настоящее изобретение также предполагает применение модифицированных ЕРО в качестве носителей для молекул с низкой проницаемостью в другие области тела, имеющие рецепторы ЕРО. Неограничивающие примеры таких клеток включают в себя клетки сетчатки, мышцы, сердца, легкого, печени, почки, тонкого кишечника, коры надпочечника, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичка, яичника, поджелудочной железы, кости, кожи и эндометрия. В частности, чувствительные клетки включают в себя, без ограничения, нейронные клетки; клетки сетчатки: фоторецептор (палочки и колбочки), ганглий, биполярные, горизонтальные клетки, клетки сетчатки, лишенные аксона, и клетки Мюллера; мышечные клетки; сердечные клетки: миокарда, клетки водителя ритма, синусно-предсердного узла, синусового узла и клетки соединительной ткани (предсердно-желудочковый узел и его связка); клетки легкого; клетки печени: гепатоциты, звездчатые клетки и клетки Купфера; клетки почки: мезангий, почечные эпителиальные клетки и трубчатый интерститиоцит; клетки тонкого кишечника: бокаловидные клетки, клетки кишечной крипты (крипты) и тонкокишечные эндокринные клетки; клетки коры надпочечника: клетки клубочковой зоны коры надпочечников, пучковые клетки и ретикулярные клетки; клетки мозгового вещества надпочечников: хромаффинные клетки; клетки капилляров: перициты; клетки яичка: клетки Лейдига, клетки Сертоли и спермии и их предшественники; клетки яичника: фолликулярные клетки графова пузырька и клетки первичного яичникового фолликула; клетки поджелудочной железы: островки Лангерганса, -клетки, -клетки, -клетки и F-клетки; костные клетки: преостеобласты, остеокласты и остеобласты; клетки кожи; клетки эндометрия: эндометриальная строма и эндометриальные клетки; а также стволовые и эндотелиальные клетки, присутствующие в перечисленных выше органах. Композиционная смесь аналога ЕРО и тканезащитного цитокина. Как кратко упомянуто выше, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может включать в себя аналог ЕРО, имеющий по меньшей мере одну дополнительную N-связанную углеводную цепь и/или по меньшей мере О-связанную углеводную цепь (который имеет продленный период полужизни в сыворотке, но у которого отсутствует тканезащитная активность), в смеси по меньшей мере с одним тканезащитным цитокином. Например, аналог ЕРО, имеющий по меньшей мере две дополнительные N-связанные углеводные цепи, где одна из дополнительных углеводных цепей локализована в пептиде O'Brien, в комбинации с тканезащитным цитокином может образовывать композицию согласно изобретению. В другом аспекте, фармацевтическая композиция согласно изобретению может включать в себя по меньшей мере один тканезащитный цитокин и по меньшей мере один аналог ЕРО, содержащий дополнительные углеводные цепи, которые, как известно исходя из установленной трехмерной конформации аналога, блокируют последовательность пептида O'Brien. Еще в другом аспекте, фармацевтиче- 13007812 ская композиция согласно изобретению включает в себя по меньшей мере один тканезащитный цитокин и по меньшей мере один аналог ЕРО, не проявляющий тканезащитную функцию в результате добавления дополнительных углеводных цепей к белку. Аналог ЕРО с перемещенным участком гликозилирования предполагают использовать в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению. Не связывая себя какой-либо отдельной теорией, авторы изобретения полагают, что если природный участок гликозилирования у аминокислоты 38 переместить в другое место молекулы аналога ЕРО, вне 30-47 аминокислотного сегмента, то тканезащитные свойства аналога ЕРО должны повыситься по сравнению с аналогом ЕРО, у которого участок гликозилирования расположен у аминокислоты 38. Таким образом, фармацевтическая композиция согласно изобретению может включать в себя аналог ЕРО с перемещенным участком гликозилирования, с аминокислоты 38 в другой сайт в молекуле. Перемещенный участок гликозилирования может находиться у аминокислот в положениях 51, 57, 69, 88, 89, 136 или 138, как предлагается в публикации РСТWO 01/81405. В одном аспекте, последовательность пептида O'Brien содержит 1 или менее углеводных цепей. Подходящие тканезащитные цитокины, применяемые согласно данному аспекту настоящего изобретения, являются предпочтительно такими цитокинами, которые не оказывают влияние на костный мозг, но они сохраняют тканезащитный эффект эндогенного ЕРО, однако, любой цитокин, который проявляет тканезащитные свойства, рассматривают для использования согласно настоящему изобретению. Например, подходящие тканезащитные цитокины включают в себя химически модифицированные ЕРО,полученные путем гуанидирования, амидирования, карбамилирования (карбамоилирования), тринитрофенилирования, ацилирования (ацетилирования или сукцинилирования), нитрования или их комбинаций. Кроме того, молекулы ЕРО с модификацией по меньшей мере одного остатка аргинина, лизина, тирозина, триптофана или цистеина или карбоксильных групп также предлагают использовать в качестве тканезащитных цитокинов согласно данному аспекту настоящего изобретения. Кроме того, дополнительные тканезащитные цитокины для использования согласно настоящему изобретению могут быть получены путем ограниченного протеолиза, удаления аминогрупп и/или мутационного замещения остатков аргинина, лизина, тирозина, триптофана или цистеина с помощью молекулярно-биологических методов, как описано в публикации Satake et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1038:125-9, которая в полном объеме включена в данное описание посредством ссылки. Например, подходящие тканезащитные цитокины включают в себя по меньшей мере один или более мутированных ЕРО, имеющих участок мутации у C7S, R10I, V11S, L12A, Е 13 А, R14A, R14B, R14E, R14Q, Y15A, Y15F,Y15I, К 20 А, К 20 Е, Е 21 А, C29S, C29Y, C33S, C33Y, P42N, T44I, К 45 А, K45D, V46A, N47A, F48A, F48I,Y49A, Y49S, W51F, W51N, Q59N, Е 62 Т, L67S, L70A, D96R, S100R, S100E, S100A, S100T, G101A, G101I,L102A, R103A, S104A, S104I, L105A, Т 106 А, T106I, Т 107 А, T107L, L108K, L108A, S126A, F142I, R143A,S146A, N147K, N147A, F148Y, L149A, R150A, G151A, К 152 А, L153A, L155A, C160S, I6A, С 7 А, В 13 А,N24K, A30N, Н 32 Т, N38K, N83K, Р 42 А, D43A, К 52 А, К 97 А, К 116 А, Т 132 А, I133A, Т 134 А, К 140 А,Р 148 А, R150B, G151A, K152W, К 154 А, G158A, С 161 А и/или R162A. Примеры вышеприведенных модификаций описаны в патентных публикациях США, находящихся одновременно на рассмотрении, 2003/0104988, 2002/0086816 и 2003/0072737, которые включены в данное описание посредством ссылки в их полном объеме. В номенклатуре мутеинов, которая использована в описании, замененная аминокислота обозначает сначала однобуквенным кодом, обозначающим нативную аминокислоту, затем указывается ее положение в молекуле ЕРО, а затем однобуквенным кодом указывается аминокислота, на которую производят замену. Например, S100E относится к молекуле ЕРО человека, в которой в положении 100 серин заменен глутаминовой кислотой. В другом аспекте, тканезащитный цитокин может включать в себя один или более из указанных выше участков мутации, при условии, что участки мутации не содержат I6A, С 7 А, К 20 А, Р 42 А, D43A,K45D, К 45 А, F48A, Y49A, К 52 А, К 49 А, S100B, R103A, К 116 А, Т 132 А, I133A, К 140 А, N147K, N147A,R150A, R150E, G151A, К 152 А, К 154 А, G158A, С 161 А или R162A. В другом аспекте, тканезащитные цитокины могут включать в себя комбинации участков мутации,такие как K45D/S100E, A30N/H32T, K45D/R150E, R103E/L108S, К 140 А/К 52 А, К 140 А/К 52 А/К 45 А,К 97 А/К 152 А,К 97 А/К 152 А/К 45 А,К 97 А/К 152 А/К 45 А/К 52 А,К 97 А/К 152 А/К 45 А/К 52 А/К 140 А,К 97 А/К 152 А/К 45 А/К 52 А/К 140 А/К 154 А, N24K/N38K/N83K и N24K/Y15A. Еще в другом аспекте, тканезащитные цитокины не содержат каких-либо из вышеуказанных комбинаций. В другом аспекте, тканезащитные цитокины могут содержать любые из вышеперечисленных участков мутации, при условии, что участки мутации не содержат каких-либо из следующих комбинаций замещений: N24K/N38K/N83K и/или A30N/H32T. Некоторые модификации или комбинации модификаций могут влиять на способность мутеина связываться с его рецептором, таким как рецептор ЕРО или вторичный рецептор. Примеры таких модификаций или комбинаций модификаций включают в себя, не ограничиваясь ими, K152W, R14A/Y15A, I6A,С 7 А, D43A, Р 42 А, F48A, Y49A, Т 132 А, I133A, Т 134 А, N147A, Р 148 А, R150A, G151A, G158A, С 161 А иR162A. Соответствующие мутации в гормоне роста человека являются известными специалистам в данной области как вредоносные. Таким образом, в одном аспекте, тканезащитный цитокин не включает в себя одну или более модификаций или комбинаций модификаций, которые могут влиять на способность- 14007812 мутеина связываться с его рецептором. Дискуссия по поводу таких тканезащитных цитокинов включена в параллельно рассматриваемую патентную заявку США 10/612,665, зарегистрированную 1 июля 2003, озаглавленную "Рекомбинантные тканезащитные цитокины и кодирующие их нуклеиновые кислоты для защиты, восстановления и увеличения чувствительных к ним клеток, тканей и органов", универсальное раскрытие которой включено в данное описание посредством ссылки. В заключение, любое из надсемейств цитокинов, которые проявляют тканезащитные свойства, могут быть также использованы, поскольку они не влияют на свойственные эритропоэтину эффекты или период полужизни в сыворотке ЕРО длительного действия. Примеры включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-5 (IL-5), колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GMCSF), фактор пигмента-эпителия (PEDF) и фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF). В другом аспекте настоящего изобретения, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может включать в себя аналог ЕРО, имеющий по меньшей мере одну дополнительную Nсвязанную углеводную цепь и/или по меньшей мере одну дополнительную О-связанную углеводную цепь (который имеет продленный период полужизни в сыворотке, но у которого отсутствует тканезащитная активность), в смеси по меньшей мере с одной малой молекулой, которая проявляет тканезащитное свойство. Подходящие малые молекулы включают в себя, не ограничиваясь ими, стероиды (например, лазароиды и глюкокортикоиды), антиоксиданты (например, коэнзим Q10, альфа-липоевая кислота иNADH), антикатаболические ферменты (например, глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза, синтетические каталитические очистители, а также миметики), производные индола (например, индоламины, карбазолы и карболины), азотную кислоту, нейтрализующие агенты, аденозин/агонисты аденозина, вещества растительного происхождения (флавоноиды), экстракты трав (гинкго билоба и куркума длинная), витамины (витамины А, Е и С), электронакцепторные ингибиторы оксидазы (например, электронные ингибиторы ксантиноксидазы), минералы (например, медь, цинк и магний), NSAIDS (например,аспирин, напроксен и ибупрофен) и их комбинации. Кроме того, фармацевтическая композиция согласно изобретению может включать в себя аналог ЕРО, тканезащитный цитокин и малую молекулу, проявляющую тканезащитную функцию. Тканезащитные цитокины и/или малые молекулы предпочтительно присутствуют в фармацевтических композициях согласно изобретению в количестве, достаточном для сохранения или повышения такой же активности в невральных или других чувствительных клеточных системах, какая проявляется эндогенным ЕРО. В одном аспекте, тканезащитный цитокин и/или малая молекула присутствует в количестве, достаточном для усиления защиты ткани индивида путем защиты, сохранения или повышения жизнеспособности и функции чувствительных к эритропоэтину клеток индивида. Например, фармацевтическая композиция согласно данному аспекту настоящего изобретения предпочтительно включает в себя эффективное, нетоксическое количество тканезащитного цитокина, например приблизительно 1 нг или больше. В одном аспекте, тканезащитный цитокин присутствует в фармацевтической композиции в количестве приблизительно 5 мг или менее. В другом аспекте, тканезащитный цитокин присутствует в фармацевтической композиции в количестве приблизительно от 500 нг до 5 мг. В другом аспекте, фармацевтическая композиция включает в себя приблизительно от 1 мкг до 5 мг тканезащитного цитокина,предпочтительно приблизительно от 500 мкг до 5 мг. В альтернативном аспекте, большее количество тканезащитного цитокина содержится в фармацевтической композиции согласно изобретению, например приблизительно от 1 до 5 мг. Как известно специалистам в данной области, количество фармацевтической композиции, вводимой больному, зависит от ряда факторов, включающих в себя, не ограничиваясь перечисленным, состояние больного и частоту дозирования. Относительно дозирования обсуждение более подробно будет описано ниже. Способы лечения и введения. Вышеупомянутые ЕРО длительного действия и фармацевтические композиции, содержащие ЕРО длительного действия, предназначены для терапевтического или профилактического лечения анемии,заболеваний человека, включая либо анемию, либо анемические состояния, или заболевания или способы лечения, которые приводят к анемии. Вообще, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению способствует менее частому введению или применению меньших доз эритропоэтина для лечения указанных выше заболеваний, давая возможность больным излечиться от других тканевых повреждений, в частности повреждений других ЕРО-зависимых клеток, тканей или органов. Неограничивающие примеры таких ЕРО-зависимых клеток включают в себя клетки сетчатки, клетки мышц, сердца, легких,печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового слоя надпочечников, капиллярного эндотелия, яичек, яичников, поджелудочной железы, кости, кожи и эндометрия. В частности, ЕРОзависимые клетки включают в себя, без ограничения, нейрональные клетки; ретинальные клетки; фоторецепторы (палочки и колбочки), ганглии, биполярные, горизонтальные, амакринные клетки и Мюллеровские клетки; мышечные клетки; сердечные клетки: миокардиальные клетки, клетки водителя ритма; клетки синусно-предсердного узла; синусного узла и клетки соединительной ткани (атриовентрикулярного узла и пучка Гиса); клетки легких; клетки печени: гепатоциты, звездчатые клетки и Купферовские клетки; почечные клетки: мезангиальные, клетки почечного эпителия и интерстициальные клетки почечных канальцев; клетки тонкого кишечника: бокаловидные клетки, клетки кишечных лимфоузлов (крипт)- 15007812 и энтеральные эндокринные клетки; клетки коры надпочечников: клетки клубочков, клетки пучков и ретикулярные клетки; клетки мозгового слоя надпочечников: хромаффинные клетки; капмллярные клетки: перициты; клетки семенников: клетки Лейдига, Сертоли и их предшественники; клетки яичек: клетки граафова пузырька и клетки первичного яичникового фолликула; клетки поджелудочной железы: клетки островков Лангерганса, -клетки, -клетки, -клетки и F-клетки; клетки кости; предшественники костных клеток, остеокласты и остеобласты; клетки кожи; клетки эндометрия: клетки стромы эндометрия и эндометриальные клетки; а также стволовые и эндотелиальные клетки, присутствующие в перечисленных выше органах. Индивидуумам, подверженным инсульту, повреждению спинного мозга, повреждениям периферических нервов, диабетической нефропатии, заболеваниям сетчатки, включая, без ограничения, макулярный отек, диабетическую ретинопатию и т.д., также может быть показано применение ЕРО длительного действия. Кроме того, применение ЕРО длительного действия при лечении заболеваний и для получения тканезащитного эффекта обсуждается также и в совместно поданной 3 июля 2002 патентной заявке США 10/188,905, а также в заявке 10/512,665, поданной 1 июля 2003, обе из которых во всей своей полноте включены в настоящее описание в виде ссылки. Настоящее изобретение предполагает применение ЕРО длительного действия для систематического или хронического введения, острого введения и/или чередующегося типа введения. В одном аспекте,фармацевтические композиции согласно изобретению вводят хронически для защиты или "оздоровления" клеток-мишеней, ткани или органа. В другом аспекте, фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены "остро", т.е. для однократной обработки в течение повреждения. В другом аспекте, фармацевтические композиции согласно изобретению вводят в циклическом режиме. Введение композиции может быть парентеральным, например посредством внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутриартериальным, внутримышечным, интрадермальным или подкожным введением; посредством ингаляции; через слизистую оболочку, например пероральным, назальным, ректальным, внутривлагалищным, подъязычным, подслизистым и чрескожным; или комбинированным. Предпочтительно введение фармацевтической композиции согласно изобретению является парентеральным. Такое введение может быть осуществлено в дозе приблизительно от 0,01 пг до 5 мг,предпочтительно от 1 пг до 5 мг. В одном аспекте, доза составляет приблизительно от 500 пг до 5 мг. В другом аспекте, доза составляет приблизительно от 1 нг до 5 мг. В другом аспекте, доза составляет приблизительно от 500 нг до 5 мг. Еще в другом аспекте, доза составляет приблизительно от 1 мкг до 5 мг. Например, доза может составлять приблизительно от 500 мкг до 5 мг. В другом аспекте, доза может составлять приблизительно от 1 до 5 мг. Фармацевтические композиции согласно изобретению, приспособленные для парентерального введения, включают в себя водные и неводные стерилизованные инъецируемые растворы или суспензии,которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты и растворенные вещества, которые делают композиции в значительной степени изотоническими по отношению к крови данного реципиента. В данном аспекте изобретения, фармацевтические композиции могут также включать в себя воду, спирты, многоатомные спирты, глицерин, растительные масла и их смеси. Фармацевтические композиции, приспособленные для парентерального введения, могут быть представлены в виде контейнеров с единичной дозой или множеством доз, например герметично закрытых ампул и пузырьков, и могут храниться в лиофилизированном (высушенном при температуре ниже 0 С) состоянии, для инъецирования которых требуется только добавление стерилизованного жидкого носителя, например стерилизованного физиологического раствора, немедленно перед употреблением. Приготовленные для немедленного приема инъецируемые растворы и суспензии могут быть получены из стерилизованных порошков, гранул и таблеток. В одном аспекте, автоматическое устройство для инъекции, содержащее инъецируемый раствор ЕРО длительного действия согласно изобретению, приспосабливают для случаев крайней необходимости в автомобилях скорой помощи, кабинетах неотложной помощи и в условиях боевых действий. В одном аспекте, фармацевтическую композицию согласно изобретению получают в соответствии с обычными способами как фармацевтическую композицию, приспособленную для внутривенного введения человеку. Например, фармацевтическая композиция может быть в виде раствора в стерилизованном изотоническом водном буфере. Когда необходимо, фармацевтическая композиция также может включать в себя солюбилизирующий агент и/или местно-анестезирующее средство, такое как лидокаин, для ослабления боли на участке инъекции. Ингредиенты могут быть добавлены либо отдельно, либо смешаны вместе в стандартной лекарственной форме, например в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или маленький мешочек,на котором указано количество активного ингредиента. Когда фармацевтические композиции согласно изобретению следует вводить посредством инфузии, бутыль для инфузии со стерилизованной водой,предназначенной для фармацевтических целей, или физиологическим раствором можно приспособить для распределения композиции. И, когда фармацевтическую композицию следует вводить посредством инъекции, ампула со стерилизованным физиологическим раствором может быть использована для смешивания перед введением. Фармацевтические композиции, приспособленные для перорального введения, могут быть приготовлены в виде капсул или таблеток; порошков или гранул; растворов; сиропов или суспензий (в водных- 16007812 или неводных жидкостях); пригодных в пищу пен или взбитых сливок; эмульсий, или их комбинаций. Пероральная композиция может включать в себя приблизительно от 10 до 95 мас.% активного ингредиента. В одном аспекте, активный ингредиент включен в пероральную композицию в количестве приблизительно от 20 до 80 мас.%. В другом аспекте, пероральная композиция включает в себя приблизительно от 25 до 75 мас.% активного ингредиента. Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут включать в себя лактозу, крахмал или его производные, стеарат магния, сахарат натрия, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислоту и ее соли. Мягкие желатиновые капсулы могут включать в себя растительные масла, воски, жиры, полутвердые,жидкие многоатомные спирты или их смеси. Растворы и сиропы могут включать в себя воду, многоатомные спирты, сахара или смеси перечисленных ингредиентов. Кроме того, активный ингредиент, предназначенный для перорального введения, может быть покрыт материалом или смешан с материалом, который замедляет дезинтеграцию и/или всасывание активного ингредиента в желудочно-кишечном тракте. Например, активный ингредиент может быть смешан или покрыт глицерилмоностеаратом, глицерилдистеаратом или их комбинациями. Таким образом, замедленное высвобождение активного ингредиента может быть достигнуто в течение многих часов и,если необходимо, активный ингредиент может быть защищен от деградации в желудке. Фармацевтические композиции для перорального введения также могут быть приготовлены, чтобы облегчить высвобождение активного ингредиента в отдельном участке желудочно-кишечного тракта в условиях специфических рН и ферментативной реакции. Фармацевтические композиции, приспособленные для чрескожного введения, могут быть в виде отдельных пластырей, предназначенных для длительного контакта с эпидермисом реципиента. Кроме того, фармацевтические композиции, приспособленные для местного введения, могут быть приготовлены в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей, масел, глазных капель, лепешек, пастилок и жидкостей для полоскания рта и их комбинаций. Когда местное введение предназначено для кожи, рта, глаз или других наружных тканей, то предпочтительно применять местно мазь или крем. И когда фармацевтическую композицию приготавливают в виде мази, то активный ингредиент, т.е. ЕРО длительного действия, может быть использован с парафиновой или смешиваемой с водой основой для мази. В качестве альтернативы, активный ингредиент может содержаться в креме с основой масло-в-воде или вода-в-масле. Когда местное введение осуществляют с помощью глазных капель, фармацевтические композиции согласно изобретению предпочтительно включают в себя активный ингредиент, который растворяют или суспендируют в подходящем носителе, например в водном растворителе. Фармацевтические композиции, приспособленные для введения в нос и легкие, могут включать в себя твердые носители, такие как порошки (предпочтительно имеющие размер частиц приблизительно от 20 до 500 мкм). Порошки могут быть введены путем быстрой ингаляции через нос из контейнера с порошком, который держат близко к носу. В качестве альтернативного аспекта, фармацевтические композиции, предназначенные для введения в нос согласно настоящему изобретению, могут включать в себя жидкие носители, например назальные спреи или назальные капли. Предпочтительно фармацевтические композиции согласно изобретению вводят прямо в носовую полость. Прямая ингаляция в легкие может сопровождаться глубокой ингаляцией через наконечник в ротовую часть глотки и осуществляться с помощью других специально приспособленных устройств, включая, но не ограничиваясь ими, аэрозоли под давлением, распылители или инсуффляторы, которые могут быть сконструированы так, чтобы доставлять предопределенные дозировки активного ингредиента. Фармацевтические композиции, предназначенные для ингаляции в легкие, могут включать в себя водные или масляные растворы активного ингредиента. Предпочтительно фармацевтические композиции согласно изобретению вводят посредством глубокой ингаляции прямо в ротовую часть глотки. Фармацевтические композиции, приспособленные для ректального введения, могут быть приготовлены в виде суппозиториев или клизм. В одном аспекте, суппозитории согласно изобретению включают в себя приблизительно от 0,5 до 10 мас.% активного ингредиента. В другом аспекте, суппозиторий включает в себя приблизительно от 1 до 8 мас.% активного ингредиента. В другом аспекте, активный ингредиент содержится в суппозитории в количестве приблизительно от 2 до 6 мас.%. В данном аспекте изобретения, фармацевтические композиции согласно изобретению могут включать в себя связующие вещества и носители, такие как триглицериды. Фармацевтические композиции согласно изобретению, приспособленные для вагинального введения,могут быть получены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или распыляемых препаратов. Фармацевтические композиции согласно изобретению также могут вводиться с помощью перфузата, инъекции в орган или местного введения. В таких аспектах, фармацевтическая композиция предпочтительно содержит приблизительно от 0,01 до 30 пМ, предпочтительно приблизительно от 15 пМ до 30 нМ, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению. В одном аспекте, раствором для перфузии является раствор (с рН приблизительно от 7,4 до 7,5 и осмотическим давлением приблизительно 320 мОСм/л) University of Wisconsin (UW), который содержит приблизительно от 1 Ед/мл до 25 Ед/мл ЕРО; 5% гидроксиэтилкрахмала (предпочтительно имеющий молекулярный вес приблизительно от- 17007812 200000 до 300000 и, в основном, свободный от этиленгликоля, этиленхлоргидрина, хлорида натрия и ацетона), 25 мМ KН 2 РО 4, 3 мМ глутатиона; 5 мМ аденозина; 10 мМ глюкозы; 10 мМ HEPES-буфера; 5 мМ глюконата магния; 1,5 мМ СаСl2; 105 мМ глюконата натрия; 200000 единиц пенициллина; 40 единиц инсулина; 16 мг дексаметазона и 12 мг фенолового красного. Раствор UW описан подробно в патенте США 47 98824, который включен в данный текст во всей полноте посредством ссылки. В другом аспекте,раствор UW может содержать приблизительно от 0,01 пг/мл до 400 нг/мл, предпочтительно приблизительно от 40 до 300 нг/мл рекомбинантного тканезащитного цитокина. В некоторых ситуациях желательно вводить фармацевтические композиции согласно изобретению локально в область, которую необходимо лечить. Такое введение может быть достигнуто путем локальной инфузии во время операции; местного применения, например вместе с раневой повязкой после операции; путем инъекции; посредством катетера; посредством суппозитория или посредством имплантата,который может быть пористым, непористым или желатинообразным материалом, включающим в себя мембраны, такие как мембраны из силастика, или волокна. Кроме того, как кратко описано выше относительно чрескожного введения, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению может быть доставлен в системе с контролируемым высвобождением. Например, полипептид может быть введен с помощью внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, чрескожного пластыря, липосом или других способов введения. В одном аспекте,может быть использован насос, такой как описан в публикации Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574. В другом аспекте, соединение может быть доставлено в пузырьке, в частности в липосоме, такой, как описанная в международной публикацииWO 91/04014 и патенте США 4704355, универсальное раскрытие которых включено в данный текст в виде ссылки. В другом аспекте, полимерные материалы могут быть использованы для создания системы с контролируемым высвобождением, такие как материалы, описанные в публикации Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105. Такие системы с контролируемым высвобождением могут быть помещены вблизи терапевтической мишени, т.е. целевых клеток, ткани или органа, для чего требуется только часть системной дозы. См.,например, публикацию Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138, 1984. Другие системы с контролируемым высвобождением, которые предполагается использовать согласно настоящему изобретению, описаны в обзоре Langer, Science 249:1527-1533, 1990. Дозирование. Выбор предпочтительно эффективной и нетоксичной дозы для способов введения, описанных выше, будет определяться квалифицированным экспериментатором в данной области на основе факторов,известных обычному специалисту в данной области. Примеры таких факторов включают в себя отдельную форму ЕРО длительного действия; фармакокинетические параметры ЕРО, такие как биодоступность, метаболизм, период полужизни и т.д. (определенные квалифицированным экспериментатором); состояние или заболевание, которое подвергается лечению; полезное воздействие, которого следует достичь у нормального индивида; массу тела больного; способ введения; частоту введения, т.е. хроническое,острое, чередующееся введение; сопутствующее терапевтическое лечение и другие факторы, которые,как хорошо известно, влияют на эффективность вводимых фармацевтических средств. Таким образом,точная дозировка должна быть установлена согласно решению практического врача и условиям отдельного больного. Например, в настольном справочнике врача (Physicians Desk Reference (PDR указано, что в зависимости от популяции больных, подвергаемой лечению посредством ЕРО, достигаются различные гематокритные уровни, чтобы избежать токсичности. Physicians Desk Reference, 54th Ed., 519-525 and 21252131 (2000) . В действительности, у больных с CRF PDR рекомендует дозирование ЕРО для достижения нетоксических заданных гематокритных чисел, колеблющихся от 30 до 36%. В противоположность этому, для больных раковыми заболеваниями, принимающих химиотерапию, в PDR рекомендуется регулировать дозировку при различном гематокритном уровне, т.е. если гематокритный уровень превышает 40%. В PDR указано, что практические врачи контролируют гематокритное число у больных в течение терапии ЕРО и, чтобы избежать токсичности, регулируют дозу и/или останавливают лечение, если гематокритное число больного достигает или превышает верхних пределов заданной области. Поэтому квалифицированный практический врач, который приобрел знания и опыт на основе настоящего изобретения, сможет вводить дозы ЕРО, достаточные для достижения терапевтического эффекта, и в то же время избежать каких-либо осложнений, связанных с токсичностью. В одном аспекте, ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению вводят хронически или системно при дозировке приблизительно от 0,1 до 100 мкг/кг веса тела на одно введение. Например,приблизительно от 1 до 5 мкг/кг веса тела предлагают для дозирования 1 раз в неделю при лечении раковых больных, получающих химиотерапию. В другом аспекте, дозировка ЕРО длительного действия составляет приблизительно от 5 до 50 мкг/кг веса тела на введение. В другом аспекте, ЕРО длительного действия вводят в количестве приблизительно от 10 до 30 мкг/кг веса тела на введение. Еще в другом аспекте, ЕРО длительного действия вводят в количестве приблизительно 1 мкг/кг веса тела или меньше. Например, дозировки приблизительно от 0,45 до 0,75 мкг/кг веса тела ЕРО длительного действия могут быть эффективными при введении 1 раз в неделю для лечения анемии у больных с CRF.- 18007812 Предпочтительно, чтобы эффективной дозы было достаточно для достижения в сыворотке уровней ЕРО длительного действия, которые составляют выше чем приблизительно 10000 мЕд/мл (80 нг/мл). В одном из аспектов, эффективная доза достигает в сыворотке уровня ЕРО длительного действия приблизительно 15000 мЕд/мл (120 нг/мл) или выше. В другом аспекте, эффективная доза достигает в сыворотке уровня ЕРО длительного действия приблизительно 20000 мЕд/мл (160 нг/мл). Уровни ЕРО в сыворотке предпочтительно измеряют во времена 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 часов или их комбинациях после введения. Дозировки могут быть повторены, если обычный специалист в данной области сочтет это необходимым. Например, введение может быть повторено ежедневно, пока это клинически необходимо, или после соответствующего интервала, например каждые 1-12 недель, предпочтительно каждые 1-3 недели. Поскольку ЕРО длительного действия согласно изобретению имеют продленный период полужизни в сыворотке, их эффективность в организме также повышается. Например, когда больное млекопитающее подвергается системной химиотерапии с целью лечения ракового заболевания, включая радиационную терапию, введение в процессе лечения фармацевтических композиций, содержащих ЕРО длительного действия, согласно настоящему изобретению может ослабить анемические состояния посредством уменьшения частоты введения доз и количеств доз по сравнению с частотой и количеством применяемых в настоящее время композиций, содержащих рекомбинантный ЕРО. И, как описано выше, когда фармацевтические композиции согласно изобретению включают в себя ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению или аналог ЕРО в смеси с тканезащитным цитокином, композиции могут быть использованы для лечения анемии и родственных заболеваний у больных с риском тканевого повреждения. Например, больной с анемией, у которого наблюдается высокий риск сердечного заболевания, может подвергаться лечению фармацевтическими композициями согласно изобретению вместо имеющихся в настоящее время аналогов ЕРО, чтобы предотвратить тот ущерб, который может нанести лечение. Наборы для лечения. Изобретение также относится к фармацевтическому пакету или набору, который включает в себя один или более контейнеров, наполненных одним или более ингредиентами фармацевтических композиций согласно изобретению. В одном аспекте, эффективное количество ЕРО длительного действия и фармацевтически приемлемый носитель могут быть упакованы в одном дозовом пузырьке или другом контейнере. Когда фармацевтическая композиция согласно изобретению адаптирована для парентерального введения, композицию можно хранить, например, в лиофилизированном состоянии. Таким образом, набор может включать в себя лиофилизированную композицию, стерильный жидкий носитель и шприц для инъекций. В одном из аспектов, набор включает в себя ампулу, содержащую достаточное количество лиофилизированного материала для нескольких обработок, - медицинский работник, вводящий препарат,должен отвесить определенное количество материала и добавить определенное количество носителя для каждого сеанса лечения. В другом аспекте, набор может содержать множество ампул, каждая из которых содержит определенные количества лиофилизированного материала, и множество контейнеров, каждый из которых содержит определенные количества носителя, так что медицинскому работнику, осуществляющему введение препарата, требуется только смешать содержимое одной ампулы и одного контейнера для каждого сеанса лечения без измерения и взвешивания. В другом аспекте, набор содержит автоматическое устройство для введения, включающее в себя инъецируемый раствор ЕРО длительного действия согласно изобретению. В другом аспекте, набор содержит по меньшей мере одну ампулу с лиофилизированной композицией, по меньшей мере один контейнер с раствором в качестве носителя, по меньшей мере один контейнер с местно-анестезирующим средством и по меньшей мере один шприц (и пр.). Предпочтительно, чтобы ампулы и контейнеры были закрыты герметично. В случаях, когда фармацевтические композиции согласно изобретению вводят путем инфузии, набор предпочтительно включает в себя одну ампулу с фармацевтической композицией и по меньшей мере одну бутыль для инфузии со стерилизованной водой или стерилизованным физиологическим раствором для фармацевтических целей. Набор согласно изобретению также может включать в себя по меньшей мере один наконечник или специально приспособленные устройства для прямой ингаляции в легкие, такие как аэрозоли под давлением, распылители или инсуффлаторы. В одном аспекте изобретения, набор может включать в себя устройство для прямой ингаляции в легкие, которое содержит фармацевтическую композицию, или устройство и по меньшей мере одну ампулу водного или масляного раствора ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению. В случае, когда фармацевтическая композиция согласно изобретению, содержащая ЕРО длительного действия, приспособлена для перорального, чрескожного, ректального, вагинального или назального введения, набор предпочтительно включает в себя одну ампулу, содержащую активный ингредиент и по меньшей мере одно вспомогательное средство для введения. Примеры вспомогательных для введения средств включают в себя, без ограничения, мерные ложки (для перорального введения), стерильные очищающие мягкие прокладки (для чрескожного введения) и назальные аспираторы (для назального введения). Такие наборы могут включать в себя однократную дозу ЕРО длительного действия (острое- 19007812 введение) или множество доз (хроническое введение). Кроме того, набор может быть снабжен одним или более типами растворов. Например, фармацевтические композиции согласно изобретению, содержащие ЕРО длительного действия, могут быть приготовлены в растворе альбумина и растворе полисорбата. Если набор включает в себя раствор полисорбата,то предпочтительно, чтобы слова "свободный от альбумина" были написаны на этикетках контейнеров, а также на основных панелях наборов. Кроме того, набор может включать в себя также сообщение в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, которое сообщение уведомляет о распоряжении органа по производству, применению или продаже препарата для введения человеку. Исследование ЕРО. Настоящее изобретение также относится к исследованиям, позволяющим определить эритропоэтические и тканезащитные свойства ЕРО длительного действия согласно настоящему изобретению, а также аналогов ЕРО, используемых в некоторых фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению. Например, эритропоэтический эффект ЕРО длительного действия может быть определен посредством использования анализа TF-1, который будет обсужден более подробно в примере 2. Тканезащитные свойства соединений ЕРО могут быть проверены с помощью анализов in vitro и анализов in vivo,которые подробнее обсуждаются ниже. Кроме того, настоящее изобретение также предлагает тесты для определения не только того, проявляет ли отдельное соединение ЕРО тканезащитную активность, но также действует ли соединение ЕРО как антагонист в отношении эндогенного ЕРО. Анализы согласно изобретению разработаны предпочтительно для проведения их в короткий период времени с использованием минимального количества соединения ЕРО. Кроме того, разработанные анализы не предназначены для ограничения изобретения, поскольку специалистам известны и другие анализы, применяемые для определения эритропоэтических и тканезащитных свойств соединений ЕРО. Анализы эритропоэтической активности. Свойства эритропоэтина, т.е. способность регулировать гематокритные уровни, у отдельного соединения ЕРО можно определить с помощью различных анализов. В одном аспекте, клеточную линиюTF1 можно использовать, чтобы установить, имеет ли отдельное соединение ЕРО эритропоэтическую активность. Клетки могут быть осаждены, промыты и ресуспендированы при концентрации 105 клеток в 1 мл среды с рекомбинантным ЕРО и представляющим интерес соединением ЕРО с определенными концентрациями. Индивидуальные культуры можно поддерживать в течение 24 ч, при этом времени число клеток определяют с помощью продукта реакции формазана (CellTiter; Promega, Madison, WI). Способность представляющего интерес соединения ЕРО может быть вначале оценена in vivo путем определения его влияния на концентрацию гемоглобина с использованием самок мышей BALB/c. Животным вводят 500 Ед/кг веса тела ЕРО, представляющего интерес соединения ЕРО или равный объем носителя подкожно 3 раза в неделю в течение всего 3 недель (интервал времени, достаточный для наблюдения эритропоэтической реакции). Было установлено, что соединение ЕРО проявляет эритропоэтическую активность, если оно повышает концентрацию гемоглобина в сыворотке мыши. Дальнейшая оценка способности может быть получена in vitro при использовании эритролейкозных клеток TF1. Представляющее интерес соединение ЕРО является эритропоэтическим, если относительное число клеток TF1 становится выше контроля. Кроме того, специалисты в данной области должны признать, что другие анализы, используемые для определения эритропоэтической активности, являются доступными. Например, Европейская фармакопея описывает по меньшей мере два анализа, используемых в определении эритропоэтической активности соединения ЕРО, которые включают исследования на мышах после гипоксии и анализы ретикулоцитов. Исследования тканезащитных свойств на основе рецептора ЕРО. В одном аспекте, исследования тканезащитного свойства согласно настоящему изобретению основаны на тканезащитном рецепторе ЕРО. Поскольку последовательность для тканезащитного рецептора выделена, ряд анализов может быть использован для определения тканезащитного свойства отдельного соединения ЕРО. Как известно специалистам в данной области, тип используемого анализа в значительной степени зависит от веса соединения ЕРО. Например, исследования могут включать в себя конкурентный анализ, или сэндвич-анализ, или анализ стерического ингибирования. Конкурентный анализ основывается на способности аналога, содержащего меченый атом, конкурировать с анализируемым веществом в испытуемом образце за ограниченное число связывающих участков на общем связывающем партнере. Употребляемый в тексте термин "анализируемое вещество" относится к представляющему интерес соединению ЕРО, которое исследуют в отношении тканезащитной активности. Термин "связывающий партнер" относится к любому белку, который связывается с анализируемым веществом (обычно рецепторы ЕРО). Употребляемый в тексте термин"меченое вещество" относится к меченым реагентам, таким как меченый анализируемый аналог, иммобилизованный анализируемый аналог, меченый связывающий партнер, иммобилизованный связывающий партнер и стерические конъюгаты. Используемое в изобретении меченое вещество может иметь любую определяемую функцию, которая не влияет на связывание анализируемого вещества и его связы- 20007812 вающего партнера. Неограничивающие примеры включают в себя фрагменты, которые можно определять непосредственно, такие как флуорохромные, люминесцентные и радиоактивные метки, а также фрагменты, которые должны вступать в реакцию или быть произведенными для обнаружения, такие как ферменты. Подходящими мечеными веществами могут быть радиоактивные изотопы Р 32, С 14, I125, H3, I131 и их смеси; флуорофоры, такие как редкоземельные хелаты, флуоресцеин, производные флуоресцеина,родамин, производные родамина, дансил, умбеллиферонлюцифераза (люцифераза светлячка и бактериальная люцифераза (патент США 4737456, люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза, -галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахаридоксидазы (глюкозооксидаза, галактоозоксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), гетероциклические оксидазы (уратоксидаза и ксантиноксидаза), связанные с ферментом, который использует перекись водорода для окисления красящего предшественника, таким как HRP, лактопероксидаза, микропероксидаза и их смеси; биотин/авидин; спиновые метки, меченые бактериофаги; стабильные свободные радикалы; и их комбинации. В одном аспекте, меченое вещество представляет собой по меньшей мере один из ферментов пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы. Квалифицированный экспериментатор осведомлен о методах ковалентного связывания меченых веществ с белками или полипептидами. Например, связующие агенты, такие как диальдегиды, карбодиимиды, дималеимиды, бис-имидаты, бис-диазотированный бензидин и т.п., могут быть использованы для связывания с вышеописанными флуоресцентными, хемилюминесцентными и ферментативными метками, некоторые из них описаны в патентах США 3940475 и 3645090, универсальное раскрытие которых включено в данный текст в виде ссылки. Иммобилизация реагентов, т.е. отделение связывающего партнера от любого анализируемого вещества, которое остается свободным в растворе, требуется для сэндвич-анализа и может сопровождаться переведением в нерастворимую форму либо связывающего партнера, либо анализируемого аналога до процедуры анализа путем адсорбции на водонерастворимом матриксе или поверхности (патент США 3720760),ковалентного связывания, такого как поперечное связывание посредством глутаральдегида, или переведением позже в нерастворимую форму партнера или аналога, например, путем иммунопреципитации. Таким образом, связывающий партнер может быть переведен в нерастворимую форму до или после конкурентной реакции, и меченое вещество и анализируемое вещество, связанные со связывающим партнером, отделяются от несвязанного меченого вещества и анализируемого вещества. Указанное отделение может сопровождаться декантированием (где связывающий партнер предварительно был переведен в нерастворимую форму) или центрифугированием (где связывающий партнер был осажден после конкурентной реакции). Количество анализируемого вещества в испытуемом образце обратно пропорционально количеству связанного меченого вещества, как измерено по количеству маркерного соединения. Кривые доза-эффект, построенные с известными количествами анализируемого вещества, сравнивали с результатами исследования для количественного определения анализируемого вещества, присутствующего в испытуемом образце. Когда ферменты используют в качестве меченых веществ, анализы обычно называют ELISA. В последующем сэндвич-анализе, например, иммобилизиванный связывающий партнер применяют с тем, чтобы адсорбировать присутствующее в испытуемом образце анализируемое вещество, испытуемый образец удаляют путем промывания, связанное анализируемое вещество применяют для адсорбции меченого связывающего партнера и связанный материал затем отделяют от остаточного меченого вещества. Количество связанного меченого вещества прямо пропорционально количеству анализируемого вещества в испытуемом образце. В "одновременном" сэндвич-анализе испытуемый образец не отделяют до добавления меченого связывающего партнера. В конкурентном методе и сэндвич-анализе применяют стадию разделения фаз как интегральную часть методов, в то время как исследование стерического ингибирования проводят в неразделенной реакционной смеси. Другой вид конкурентного анализа, названный "гомогенным" анализом, однако, не требует разделения фаз. В таком анализе конъюгат фермента с анализируемым веществом получают и используют таким образом, что при связывании антианализируемого вещества с анализируемым веществом присутствие антианализируемого вещества изменяет ферментативную активность. Тканезащитный рецептор конъюгируют посредством бифункционального органического моста с ферментом, таким как пероксидаза. Конъюгаты выбирают для использования с ЕРО таким образом, что связывание ЕРО приводит к ингибированию или потенциированию ферментативной активности метки. Такой тип анализа обычно называют EMIT. Стерические конъюгаты используют в методах исследования стерического препятствия, применяемых для гомогенного анализа. Указанные конъюгаты синтезируют путем ковалентного связывания низкомолекулярного гаптена с малой молекулой анализируемого вещества таким образом, что антитело против гаптена, в основном, не способно связывать конъюгат в течение такого же времени, что и антианализируемое вещество. Анализируемое вещество, присутствующее в испытуемом образце, будет связываться с антианализируемым веществом, тем самым способствуя связыванию антигаптена с конъюгатом, что приводит к изменению свойств конъюгированного гаптена, например изменению флуоресценции, когда гаптен является флюорофором.- 21007812 Более подробная информация относительно исследований тканезащитного свойства изложена в параллельно рассматриваемой патентной заявке США 10/188905, зарегистрированной 3 июля 2002, и в заявке 60/456891, зарегистрированной 25 апреля 2003, причем обе включены в данный текст в их полном объеме. Исследование функции. Поскольку сведения об идентификации последовательности тканезащитного рецептора отсутствуют, тканезащитные свойства ЕРО можно определить с помощью исследования функции, как in vivo, так и in vitro. Предпочтительно специалист в данной области должен выполнить один анализ in vitro или invivo, чтобы определить тканезащитные свойства соединения ЕРО, но в некоторых случаях может потребоваться выполнение обоих анализов, чтобы удостовериться, что соединение проявляет одинаковые тканезащитные свойства in vitro и in vivo. На практике специалист в данной области должен суметь определить, проявляет ли аналог ЕРО,имеющий по меньшей мере одну дополнительную N-связанную углеводную цепь и/или по меньшей мере одну дополнительную О-связанную углеводную цепь, тканезащитные свойства, используя комбинацию анализов, раскрытых настоящим изобретением. Во-первых, испытания in vitro, такие как анализ на модели клеток Р 19 и анализ двигательных нейронов крысы, могут быть проведены, чтобы определить, проявляет ли представляющее интерес соединение ЕРО тканезащитные свойства. Затем исследования in vivo,такие как исследования с применением моделей фокальной ишемии крысы, эпилептического припадка,вызванного бикукуллином, или травмы спинного мозга, могут быть использованы для подтверждения результатов испытания in vitro. Модели in vitro, рассматриваемые в настоящем изобретении, включают в себя, не ограничиваясь ими, модели, применяемые для определения отсутствия тканезащитных свойств гипергликозилированного эритропоэтина: анализ на клетках Р 19, анализ двигательных нейронов крысы и кДНК-микрочипов,которые более подробно описаны ниже и также проиллюстрированы в примере 2. Примеры не предназначены для ограничения изобретения, поскольку специалист в данной области должен признать, что существуют другие подходящие анализы in vitro для определения тканезащитных свойств соединений ЕРО. Вообще, соединение ЕРО следует рассматривать как имеющее тканезащитные свойства, если оно сохраняет или повышает жизнеспособность клетки в сравнении с контролем. Эритропоэтин следует рассматривать как антагонист, если он губительно действует на жизнеспособность клеток в применяемом анализе в сравнении с контролем. А. Анализ in vitro, основанный на линии клеток Р 19. В одном аспекте анализ in vitro тканезащитных свойств основан на линии клеток Р 19. Например,клетки Р 19 могут сохраняться недифференцированными в среде DMEM, обогащенной 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицинсульфата (Gibco) и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone Laboratories), которая содержит 1,2 г/л NaHCO3, 10 мМ HEPES-буфера. Бессывороточная среда может содержать такие же компоненты, как указанные выше, за исключением 5 мкг/мл инсулина, 100 мкг/мл трансферрина, 20 нМ прогестерона, 100 мкМ путресцина и 30 нМ Na2SeO3 (Sigma) вместо эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки с 50%-ной конфлюэнтностью обрабатывают в течение ночи рекомбинантным ЕРО и/или представляющим интерес соединением ЕРО, обрабатывают трипсином для диссоциации, промывают в бессывороточной среде и помещают в 25 см 2 флаконы для выращивания культуры ткани при конечной плотности 104 клеток/см 2 в бессывороточной среде - клеток как таковых или предварительно обработанных добавками. Жизнеспособность клеток может быть определена по исключению трипанового синего. Как известно квалифицированным экспериментаторам, добавление рекомбинантного ЕРО может предотвратить потерю клеток после взятия сыворотки и помещения ее в недифференцированные нейрональноподобные клетки Р 19. Например, рекомбинантный ЕРО способствует сохранению вплоть до 50% нейрональноподобных клеток от гибели, если его используют в концентрации от 0,1 до 100 Ед/мл. Таким образом, для того чтобы утверждать, что ЕРО имеет тканезащитное свойство, представляющее интерес соединение ЕРО должно предотвращать гибель большого количества клеток Р 19 и ограждать по сравнению с контролем, предпочтительно оно должно ограждать приблизительно от 25 до 50% клеток, наиболее предпочтительно приблизительно от 40 до 50% клеток. В. Анализ in vitro двигательных нейронов крысы. В другом аспекте, анализ двигательных нейронов крысы применяют для определения тканезащитных свойств представляющего интерес соединения ЕРО in vitro. Например, первичные двигательные нейроны могут быть выделены из спинного мозга 15-дневных эмбрионов крысы Sprauge Dawley и очищены посредством иммунопэннинга. Клетки предпочтительно высевают при низкой плотности (20000 клеток/см 2) в 24 мм луночные планшеты, предварительно покрытые поли-DL-оринтином и ламинином и содержащие полную культуральную среду (Neurobasal, B27 (2%), 0,5 мМ L-глутамина, 2% лошадиной сыворотки, 25 мкМ 2-меркаптоэтанола, 25 мкМ глутамата, 1% пенициллина и стрептомицина, 1 нг/млBDNF). После периода времени предпочтительно приблизительно через 6 дней ЕРО (10 Ед/мл) и представляющее интерес соединение ЕРО (10 Ед/мл) или носитель могут быть добавлены к культурам (предпочтительно приблизительно 5 дней до определения плотности выживших нейрональных клеток). Затем- 22007812 среду удаляют и клетки фиксируют 4%-ным параформальдегидом в PBS в течение 40 мин, обрабатывают 0,2%-ным тритоном Х-100 для нарушения проницаемости мембраны клеток, блокируют 10%-ной фетальной телячьей сывороткой в PBS, инкубируют с антителами против нефосфорилированных нейрофиламентов (SMI-32; 1:9000) в течение ночи и исследуют визуально с помощью метода, основанного на использовании авидин/биотина с диаминобензидином. Жизнеспособность двигательных нейронов может быть оценена морфологически при подсчете SMI-32 положительных клеток. Смешанные первичные культуры двигательных нейронов претерпевают апоптоз во время поддержания условий культивирования. Добавление рекомбинантного ЕРО (10 Ед/мл) к культуральной среде за 5 дней до оценки числа клеток, как было показано, в значительной степени увеличивает число первичных двигательных нейронов, наблюдаемое на 5 день. Таким образом, для того чтобы утверждать, что соединение ЕРО имеет тканезащитное свойство, представляющее интерес соединение ЕРО предпочтительно должно сохранять жизнеспособность по меньшей мере такому же числу двигательных нейронов,что и в контроле. В одном аспекте, представляющее интерес соединение ЕРО рассматривают как имеющее тканезащитные свойства, если большее число двигательных нейронов ограждается от гибели в течение поддержания культуральных условий по сравнению с контролем. С. Анализ in vitro на основе кДНК-микрочипа. Другим анализом in vitro для определения тканезащитных свойств представляющего интерес соединения ЕРО является кДНК-микрочип. Такой анализ можно использовать, если рекомбинантный ЕРО и представляющее интерес соединение ЕРО по-разному изменяют экспрессию гена в клетках Р 19. мРНК,выделенная из недифференцированных клеток Р 19, может иметь различный характер генной модуляции,устанавливаемый с помощью 1200 кДНК-микрочипа мыши, в зависимости от воздействия ЕРО. Например,экспрессия 1200 генов в клетках Р 19 может быть определена при использовании чипов найлоновых мембран из Clontech (атлас мыши 1.2). Клетки (107/образец) могут быть обработаны в течение ночи физиологическим раствором, рекомбинантным ЕРО, представляющим интерес соединением ЕРО (1 мЕд/мл) или их смесями. Затем клетки подвергают лизису для экстракции РНК или подвергают удалению сыворотки в течение 3 ч (всегда в присутствии одинакового цитокина, добавленного в течение предварительной обработки). После стандартного извлечения тотальной РНК с помощью колоночной хроматографии, с обработкой ДНК-азой на колонке, очищали полиА+РНК. Затем зонды получали в присутствии [Р 32]АТФ. Меченые зонды, имеющие предпочтительно 20 млн импульсов или выше, могут быть гибридизованы с кДНК, имеющимися на нейлоновых мембранах, при 68 С. Мембраны промывают и выдерживают на рентгеновской пленке. Интенсивность радиоактивных сигналов может быть измерена с помощью фосфорного индикатора и анализирована с помощью компьютерной программы Atlas Image 2.0 (Clontech). Анализы in vivo, рассмотренные в настоящем изобретении, включают в себя, не ограничиваясь ими,исследования тканезащитной функции, выполняемые для оценки соединений ЕРО, с помощью таких моделей, как модель фокальной ишемии и модель эпилептического припадка, вызванного введением бикукуллина в гиппокамп. Кроме того, модель in vivo, применяемая для оценки тканезащитной функции,включает в себя модель повреждения спинного мозга. Кроме того, различные анализы, раскрытые в международной публикацииWO/02053580 и патентных публикациях США 2002/0086816 и 2003/0072737, рассматриваются с целью использования в настоящем изобретении.D. Анализы in vivo на основе модели фокальной ишемии. В одном аспекте, анализ in vivo, применяемый для определения тканезащитных свойств отдельного соединения ЕРО, основан на модели фокальной ишемии. Например, самцов крыс линии Sprague-Dawley(250 г) можно использовать для получения модели трехсосудистой фокальной ишемии. Вкратце, крыс анестезируют пентобарбиталом (60 мг/кг веса тела) и поддерживают внутреннюю температуру тела при 37 С, используя водный обогрев. Правая сонная артерия может быть пережата двумя швами и рассечена. Трепанационное отверстие, примыкающее к правой глазнице и направленное на нее, способствует визуализации средней мозговой артерии, которая может быть каутеризованной дистально относительно носовой артерии. Для того чтобы получить полутень, окружающую данное фиксированное МСА повреждение, контралатеральная сонная артерия может быть пережата в течение 1 ч посредством вытяжения с помощью остроконечных пинцетов. Физиологический раствор, рекомбинантный ЕРО (5000 Ед/кг веса тела) или представляющее интерес соединение ЕРО (5000 Ед/кг веса тела) могут быть введены вначале обратимой окклюзии сонной артерии. Через 24 ч мозг удаляют и делают срезы толщиной 1 мм по всему мозгу, используя матриксное устройство для мозга (Harvard Apparatus). Каждый срез впоследствии инкубируют в 2%-ном растворе трифенилтетразолийхлорида (мас./об.) в 154 мМ NaCl в течение 30 мин при 37 С. Объем повреждения можно определить, используя систему компьютеризованного анализа изображений (MCID, Imaging Research,St. Catharines, Ontario, Canada). В данном анализе представляющее интерес соединение ЕРО рассматривают как имеющее нейрозащитные свойства, если оно способствует уменьшению объема инфаркта вследствие МСА фокальной ишемии крысы в такой же или в большей степени, чем рекомбинантный ЕРО. Е. Анализ in vivo на основе модели эпилептического припадка, вызванного введением в гиппокамп бикуллина. В другом аспекте, тканезащитное свойство соединения ЕРО определяют с помощью экспериментовin vivo на модели эпилептического припадка, вызванного введением в гиппокамп бикуллина. Например,самцов крыс линии Sprague-Dawley (250-280 г) держат при постоянной температуре (23 С) и относительной влажности (60%), со свободным доступом к пище и воде и закрепляют в неподвижном состоянии при 12-часовом цикле свет/темнота. Крысам хирургически имплантируют канюлю и электроды под стереотаксическим контролем, как описано в публикации Vezzani, A., et al., J. Neurosci., 19, 5054-65(1999). Вкратце, крыс анестезируют эквитезином (1% фенобарбитала/4% хлоральгидрата; 3 мл/кг внутрибрюшинно). Два винтовых электрода помещают билатерально над корой головного мозга в области темени, наряду с заземленным проводом, расположенным над носовой полостью. Биполярные изолированные электроды с нихромовой проволокой (60 мкм) затем вживляют билатерально в зубчатую извилину дорсального гиппокампа (септальный полюс) и канюлю (22-калибр) помещают с одной стороны на верхнюю часть твердой мозговой оболочки для инфузии лекарственных средств в гиппокамп или в желудочек мозга. Координаты от брегмы для вживления электродов должны быть следующими (мм): передне-задняя - 3,5; латеральная - 2,4 и 3; ниже твердой мозговой оболочки с носовой пластиной - 2,5.Paxinos, G.Watson, С., The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, New York (1986). Электроды соединяют с многоканальной розеткой (March Electronics, NY) и вместе с канюлей для инъекции прикрепляют к черепу акриловым зубным цементом. Эксперименты предпочтительно проводят от 3 до 7 дней после операции, когда животные полностью восстанавливаются. Затем животным вводят рекомбинантный ЕРО или представляющее интерес соединение ЕРО (оба в количестве 5000 Ед/кг веса тела) или носитель внутрибрюшинно, 24 ч, и вновь за 30 мин до индукции припадков, вызванных бикукуллином. Процедуры для записи EEG и внутримозговая инъекция лекарственных средств ранее описаны в публикации Vezzani, A., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.,239, 256-63 (1986). Вкратце, животных оставляют акклиматизироваться в клетках из плексигласса(25x25x60 см) в течение минимум 10 мин до начала EEG записи (4-канальный EEG-детектор, модель ВР 8, Battaglia Rangoni, Bologna, Italy). Приблизительно через 15-30 мин EEG-записи делают постоянно в течение 120 мин после инфузии 0,8 нмоль/0,5 мкл бикукуллинметиодида. Все инъекции делают неанестезированным крысам с помощью иглы (28-калибр), находящейся на 3 мм ниже канюли. Припадки можно измерить посредством EEG-анализа, с помощью которого, как было показано ранее, можно произвести чувствительное измерение противосудорожной активности лекарственных средств. Vezzani, A., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 239, 256-63 (1986). В данном анализе припадки состоят из одновременного проявления по меньшей мере двух из последующих изменений во всех четырех ответвлениях для регистрации: высокая частота, и/или комплексы со множеством пиков, и/или синхронизированная активность пика, или волны высокого напряжения. Синхронный пиковый режим чередуется припадками. Параметры, выбранные для количественной оценки припадков, предпочтительно являются латентными по отношению к первому припадку (начало припадка), общее время, проведенное в состоянии эпилептической активности (определенной путем сложения вместе длительности иктальных эпизодов; длительности припадка), и пиковая активность в течение периода записи EEG (интенсивность припадка). Модель эпилептического припадка, вызванного введением в гиппокамп бикуллина, с использованием EEG активности как индикации данных, как было показано, является чувствительной и специфической моделью, прогнозирующей способности лекарственных средств, предназначенных от припадков.Vezzani, A., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 239, 256-63 (1986). Таким образом, для того чтобы рассматривать испытываемое ЕРО длительного действия как имеющее тканезащитное свойство, оно должно снижать частоту и тяжесть припадков до такой же степени или выше степени, как рекомбинантный ЕРО.F. Анализ in vivo на основе модели острой обратимой глаукомы крысы. В другом анализе in vivo согласно настоящему изобретению модель острой обратимой глаукомы крысы используют для определения тканезащитных свойств отдельных соединений ЕРО, представляющих интерес. Например, поскольку ретинальные клетки являются весьма чувствительными к ишемии,многие из этих клеток погибнут после 30 мин ишемического стресса. По существу, чтобы испытать, проявляют ли периферически вводимые испытываемые соединения ЕРО тканезащитные активности, достаточные для защиты чувствительных к ишемии клеток, модель острой обратимой глаукомы крысы используют в этих целях, как описано в публикации Rosenbaum et al., Vis. Res., 37:3443-51, 1997. В частности, физиологический раствор можно инъецировать в переднюю камеру глаза взрослых самцов крыс,чтобы поднять системное артериальное давление и поддерживать в течение 60 мин. Затем животным вводят физиологический раствор или 5000 Ед ЕРО/кг веса тела внутрибрюшинно за 24 ч до индукции ишемии и продолжают в виде ежедневной дозы в течение 3 дополнительных дней. Электроретинографию проводят на адаптированных к темноте крысах через 1 неделю после обработки для определения, обладает ли представляющее интерес соединение ЕРО тканезащитной активностью. Если ЕРО обладает тканезащитным свойством, на электроретинограмме должны проявиться признаки хорошей защитной активности, в противоположность животным, обработанным только физиологическим раствором.G. Анализ при инфаркте миокарда. Анализы на основе исследования инфаркта миокарда также рассматривают для использования в на- 24007812 стоящем изобретении, чтобы установить, проявляет ли соединение ЕРО тканезащитную активность вообще или, в частности, в сердце. Например, взрослым самцам крыс дают ЕРО (5000 Ед/кг веса тела) за 24 ч до того, как крыс анестезируют и приготавливают для окклюзии коронарной артерии. Дополнительную дозу ЕРО дают в начале процедуры, в это время левую главную коронарную артерию пережимают в течение 30 мин и затем освобождают. Такую же дозу ЕРО дают ежедневно в течение 1 недели после обработки, в это время у животных изучают сердечную функцию. У животных, которые получают фиктивную инъекцию (физиологический раствор), будет наблюдаться значительное увеличение диастолического давления в левом конце, указывающее на расширенное, "жесткое" сердце, дополнительно к инфаркту миокарда, в то время как у животных, получающих ЕРО длительного действия, не должно наблюдаться снижение функции сердца по сравнению с контролем, получающим фиктивную инъекцию (значимое различие при р 0,01), если ЕРО длительного действия обладает тканезащитными свойствами. Н. Исследования повреждений спинного мозга. Исследования спинно-мозговых повреждений также можно использовать в настоящем изобретении для оценки тканезащитных функций испытываемого отдельного соединения ЕРО. В частности, модель компрессии спинного мозга крысы рассматривают для использования в настоящем изобретении. Предпочтительно в указанном исследовании используют крыс линии Wistar (самок), имеющих вес приблизительно от 180 до 300 г. Животных предпочтительно держат на голодной диете в течение 12 ч до операции, и гуманным способом удерживают в неподвижном состоянии, и анестезируют посредством внутрибрюшинной инъекции тиопентала натрия (40 мг/кг веса тела). После инфильтрации кожи (бипивакаин 0,25%) проводят полную одностадийную (Т-3) ламинэктомию посредством разреза в 2 см с помощью микроскопа, применяемого в таких случаях. Травматическое повреждение спинного мозга достигается посредством экстрадурального наложения временного зажима для аневризмы, оказывающего давление 0,6 ньютон (65 г) на спинной мозг в течение 1 мин. После удаления зажима разрез на коже закрывают, и животных оставляют полностью восстанавливаться от анестезии, и возвращают их обратно в клетки. Крыс постоянно проверяют посредством пальпации мочевого пузыря по меньшей мере 2 раза в день до тех пор, пока спонтанное опорожнение пузыря не возобновится. Животные в контрольной группе получают обычный физиологический раствор (посредством внутривенной инъекции) немедленно после того, как разрез на коже закрывают. Остальные животные получают испытываемое соединение ЕРО в количестве 16 мкг/кг веса тела (внутривенно). Затем производят оценку двигательной неврологической функции крыс с помощью шкалы нормативов двигательной способности. По данной шкале животным ставят оценку от 0 (не наблюдается движений задних конечностей) до 21 (нормальная походка). Функциональные нарушения у крыс исследует при временах 1 ч, 12 ч,24 ч, 48 ч, 72 ч и 1 неделя после повреждения один и тот же эксперт, не имеющий представления о лечении, которое животное получает. Если ЕРО длительного действия проявляет тканезащитные свойства,крысы, которым дают ЕРО, должны быстрее и лучше достигать полного восстановления от повреждения,чем крысы, которые получают инъекцию физиологического раствора.I. Исследование ишемии спинного мозга кролика. В другом аспекте, исследование на модели ишемии спинного мозга кролика позволяет выявить тканезащитное свойство. Например, новозеландских белых кроликов (36, 8-12 месяцев, самцы), имеющих вес от 1,5 до 2,5 кг, используют в данном исследовании. Животных держат на голодной диете в течение 12 ч и, не нанося повреждений, удерживают в неподвижном состоянии. Анестезию проводят посредством 3%-ного галотана в 100%-ном кислороде и поддерживают посредством галотана от 0,5 до 1,5% в смеси из 50% кислорода и 50% воздуха. Внутривенный катетер (22-калибр) помещают в вену левого уха. Лактат Рингера подают путем инфузии со скоростью 4 мл/кг веса тела в час в течение хирургической операции. Перед операцией кефазолин в количестве 10 мг/кг веса тела вводят внутривенно для профилактики инфекции. Животных располагают в положении лежа на правом боку, кожу, обработанную повидонйодином, пропитывают бипивакаином (0,25%) и разрез кожи на боку делают параллельно разрезу на позвоночнике на уровне 12 ребра. После рассечения кожи и подкожной грудной фасции длинную поясничную мышцу и подвздошно-реберную мышцу отводят. Абдоминальную аорту обнажают через доступ в забрюшинной области с левой стороны и мобилизуют чуть ниже левой почечной артерии. Кусок трубки РЕ-60 закручивают в виде петли вокруг аорты непосредственно дистально по отношению к левой почечной артерии и оба конца пропускают через большую резиновую трубку. Благодаря растягиванию на РЕ трубке аорта закупоривается без тавматических повреждений в течение 20 мин. Гепарин (400 МЕд) вводят в виде внутривенного болюса для закупорки аорты. После 20-минутной закупорки трубку и катетер удаляют, разрез закрывают и животных проверяют до достижения полного восстановления, после которого у животных оценивают состояние неврологической функции. Контрольная группа животных получает обычный физиологический раствор внутривенно немедленно после освобождения аорты от закупоривания. Другая группа животных получает 6,5 мкг/кг веса тела представляющего интерес соединения ЕРО внутривенно немедленно после реперфузии (n=6 для каждой группы). Двигательную функцию согласно критерию Drummond и Moore оценивает исследователь, не имеющий представления о проведенной обработке, во временах 1, 24 ч и 48 ч после реперфузии. Оценку от 0 до 4 присваивают каждому животному следующим образом: 0 = параплегия с неявно выраженной- 25007812 двигательной функцией нижних конечностей; 1 = низкая двигательная функция нижних конечностей,только слабое антигравитационное движение; 2 = умеренная функция нижних конечностей с хорошей антигравитационной устойчивостью, но неспособностью подтягивать лапки под тело; 3 = превосходная двигательная функция со способностью подтянуть лапки под тело и прыгать, но ненормально; 4 = нормальная двигательная функция. Мочевой пузырь опорожняют у параплегических животных вручную 2 раза в день. Если представляющее интерес ЕРО длительного действия обладает тканезащитным свойством, животные, которым дают ЕРО, должны быстрее и лучше достичь полного выздоровления от повреждения,чем животные, получающие инъекции физиологического раствора.J. Другие потенциально возможные исследования с целью тестирования тканезащитных эффектов ЕРО и его аналогов. Как кратко описано ранее, некоторые типы тканей имеют рецепторы ЕРО и поэтому могут быть чувствительны к тканезащитным эффектам, обусловленным действием ЕРО. Таким образом, в зависимости от предполагаемого клинического применения представляющего интерес соединения ЕРО, квалифицированный специалист в данной области должен признать, что подобные анализы in vitro, включающие в себя указанные дополнительные чувствительные к ЕРО клетки, можно выполнить или in vivo анализы,включающие в себя связанные органы, также можно выполнить. Например, анализы in vitro, основанные на истощении сыворотки, можно выполнить, используя клетки миокарда, клетки сетчатки и клетки Лейдига, а методику, подобную описанной выше для анализа - на клетках Р 19. Анализы in vivo могут быть направлены также на отдельные органы. Например, для оценки действия ЕРО на ретинальные клетки обычный специалист в данной области может выполнить исследование ишемии сетчатки, описанное выше. Кроме того, чтобы оценить влияние ЕРО на клетки миокарда, квалифицированный экспериментатор в данной области сможет легко изменить модель инфаркта миокарда,описанную выше. Специалисты в данной области проявят достаточную квалификацию для выбора соответствующего анализа или модели, чтобы оценить, обладает ли отдельный ЕРО тканезащитной активностью по отношению к клеткам, ткани или органам, чувствительным к эритропоэтину. Примеры Следующие примеры только иллюстрируют предпочтительные аспекты настоящего изобретения и не призваны ограничивать изобретение, область которого определяется прилагаемой формулой изобретения. Пример 1. Химически модифицированный ЕРО. А. Окисление сахарных цепей. Сахарные единицы ЕРО могут быть превращены в кислоты согласно следующей процедуре. ЕРО и количество периодата натрия, достаточное для достижения желаемой степени окисления (чем выше количество периодата натрия, тем выше степень окисления), помещали в 100 мМ натрийацетатный буфер. Затем этот раствор держали на льду в течение приблизительно 20 мин и тщательно диализовали, используя дистиллированную воду. Затем продукт удаляли из диализной трубки и собирали в свежую трубку(продукт I). Реактив Бенедикта (18 г сульфата меди, 100 г карбоната натрия (безводный), 200 г цитрата калия,125 г тиоцианата калия, 25 г ферроцианида калия) растворяли в дистиллированной воде до конечного объема 1 л. Затем к раствору реактива Бенедикта добавляли несколько капель метиленового синего. Затем к раствору реактива Бенедикта добавляли продукт I до тех пор, пока раствор не становился осветленным, что указывает на то, что раствор полностью окислился. Затем раствор обессоливали и концентрировали, используя Ultrafree Centrifugal Filter Unit. Затем образец (продукт II) тщательно диализовали, используя дистиллированную воду. В. Окисление асиало-формы ЕРО галактозооксидазой. Асиало-форму ЕРО в количестве от 50 до 500 мкг, 10 мкл 1 Ед/мкл галактозооксидазы и 100 мкл 10 мМ натрийфосфатного буфера смешивали в 15 мл конической центрифужной пробирке (110 мкл общий объем). Затем эту смесь инкубировали в течение 2 ч при 37 С, после этого времени раствор тщательно диализовали, используя дистиллированную воду. Продукт удаляли из диализной трубки и собирали в свежей трубке (продукт III). Реактив Бенедикта (как описано выше) растворяли в дистиллированной воде до конечного объема 1 л. Несколько капель метиленового синего затем добавляли к раствору. Продукт III добавляли к раствору реактива Бенедикта до тех пор, пока раствор не осветлялся, что указывает на то, что раствор полностью окислился. Затем раствор обессоливали и концентрировали, используя Ultrafree Centrifugal Filter Unit. Затем образец (продукт IV) тщательно диализовали, используя дистиллированную воду. С. Сульфатирование ЕРО. ЕРО растворяли в N,N-диметилформамиде (DMF-SA) при 4 С. Затем к раствору добавляли N,N'дициклогексилкарбодиимид (DCC), растворенный в DMF, и раствор встряхивали в течение 4 ч при 4 С. Колотый лед добавляли и рН доводили до рН 7,5 с помощью 10 н NaOH. Объем раствора доводили и образец центрифугировали при 1000 хg в течение 15 мин в центрифуге типа HN-S2 (DAMONIEC,Needham Hts., Massachusettes). Затем супернатант тщательно диализовали. Более подробная информация- 26007812 относительно сульфатирования описана в публикации S. Pongor et al., Preparation of High-Potency,Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure, Diabetes, Vol. 32, No. 12, December 1983, полный объем которой включен в данный текст в виде ссылки.D. Присоединение цепей ПЭГ к ЕРО. Молекула ЕРО может быть модифицирована посредством присоединения цепей ПЭГ к окисленным углеводам, таким как те, которые получены выше в разделе А (продукт I). Степень модификации можно регулировать путем изменения концентрации периодата в течение окисления. ПЭГ-ЕРО конъюгаты получали вначале путем окисления ЕРО (2-4 мг/мл в 50 мМ ацетата натрия) посредством мета-периодата натрия (Sigma) в количестве от 1 до 100 мМ в течение 30 мин при комнатной температуре. Фосфатный буфер затем удаляли посредством буферного обмена в 100 мМ ацетата натрия, рН 5,4. Метокси-ПЭГ-гидразин различных молекулярных масс (Nektar Therapeutics) затем добавляли при 5100-кратном молярном избытке (полимер:белок). Промежуточную гидразиновую связь затем восстанавливали путем добавления 15 мМ цианоборгидрида натрия (Sigma) и оставляли для проведения реакции в течение ночи при 4 С. Полученные конъюгаты затем фракционировали/очищали способами, известными в данной области. Е. Присоединение цепей ПЭГ к асиало-форме ЕРО. Асиало-форму ЕРО модифицировали посредством присоединения цепей ПЭГ к вновь созданным концевым галактозным остаткам после окисления галактозооксидазой, получение продукта (продукт III) окисления асиало-формы описано выше в разделе В. Рекомбинантный человеческий ЕРО (rhuEPO) подвергали обработке сиалидазой A (Prozyme, Inc.) с целью удаления сиаловой кислоты в соответствии с техническим протоколом. Для подтверждения осуществления химической модификации реакционный продукт подвергали ЭФ в полиакриламидном геле с ДСН. Окрашивание полос на электрофореграмме показало, что модифицированный ЕРО имеет молекулярный вес приблизительно 31 кДа, в то время как немодифицированный ЕРО имеет молекулярный вес приблизительно 34 кДа. Остатки сиаловой кислоты, остающиеся в молекуле ЕРО, составляют приблизительно менее чем 0,1 моль/моль ЕРО. После получения асиало-формы ЕРО вновь открытые для доступа галактозные остатки на молекуле ЕРО (2-4 мг/мл в 10 мМ натрийфосфатном буфере) окисляли посредством 100 единиц галактозооксидазы в PBS (Sigma) в мл раствора ЕРО. Затем реакционную смесь инкубировали при 37 С в течение 2 ч. Затем фосфатный буфер удаляли путем буферного обмена в 100 мМ ацетата натрия, рН 5,4. Затем добавляли метокси-ПЭГ-гидразид различных молекулярных весов (Nektar Therapeutics) при молярном избытке от 5 до 100 раз (полимер:белок). Затем промежуточную гидразиновую связь предпочтительно восстанавливали путем добавления 15 мМ цианоборгидрида натрия (Sigma) и оставляли для проведения реакции в течение ночи при 4 С. Полученные конъюгаты затем фракционировали/очищали способами,известными в данной области.F. Присоединение цепей ПЭГ к асиало-форме ЕРО. Асиало-форму ЕРО модифицировали посредством присоединения цепей ПЭГ к вновь созданным концевым галактозным остаткам после окисления галактозооксидазой, получение продукта (продукт III) окисления асиало-формы описано выше в разделе В.RhuEPO (1 мг) подвергали обработке с целью удаления сиаловой кислоты нейраминидазой (SeikagakuCorporation of Japan, 1 Ед лиофилизированного порошка растворяли в 100 мкл 75 мМ NaPO4 (рН 6,5 при отношении 1 мг ЕРО на 0,05 единиц нейраминидазы (5 мкл). 5 единиц (5 мкл) галактозоокисдазы (450 мкл растворяли в 75 мМ NaPO4 (рН 6,5) (Sigma затем добавляли к смеси. Затем фосфатный буфер удаляли путем буферного обмена в 100 мМ ацетата натрия, рН 5,4. Затем к смеси добавляли ПЭГ-NH2 (750 молекулярный вес, Nektar Therapeutics) и 15 мМ цианоборгидрида натрия (Sigma) и оставляли для проведения реакции в течение ночи при 4 С. ПЭГ-NH2 добавляли предпочтительно при 250-кратном молярном избытке (полимер:белок) (80 мг ПЭГ-NH2). Полученные конъюгаты затем фракционировали/очищали способами, известными в данной области. Пример 2. Исследования функций. А. Анализ эритропоэтической активности. Свойства эритропоэтина, т.е. способность отдельного соединения ЕРО регулировать гематокритные уровни, определяли, используя следующий анализ.TF1 является линией клеток эритролейкемии с полной зависимостью от факторов роста, включая ЕРО. Kitamura, et al., Blood 73, 375-80. Клетки TF1 получали из АТСС и поддерживали в среде RPMI 1640 со следующими компонентами: 2 мМ L-глутамина, 10 мМ Hepes, 1 мМ пирувата натрия, 4,5 г/л глюкозы,1,5 г/л бикарбоната натрия, 5 нг/мл GM-CSF и 10% эмбриональной бычьей сыворотки до начала эксперимента. Клетки TF1, полученные в фазе активного роста, осаждали, промывали 3 раза только средой и ресуспендировали до концентрации 105 клеток в 1 мл среды, в присутствии или в отсутствие GM-CSF, в присутствии ЕРО или аналога ЕРО, имеющего по меньшей мере одну дополнительную N-связанную углеводную цепь и/или по меньшей мере одну дополнительную О-связанную углеводную цепь, добавленную при определенных концентрациях. Индивидуальные культуры поддерживали в течение 24 ч и число- 27007812 клеток определяли, используя продукт реакции формазан (CellTiter; Promega, Madison, WI) в соответствии с протоколом производителя. Кроме того, способность химически модифицированного соединения ЕРО вначале оценивали invivo путем определения его влияния на концентрацию гемоглобина, используя самок мыши линииBALB/c. Животным вводили 500 Ед/кг веса тела ЕРО, представляющего интерес соединения ЕРО или равный объем носителя подкожно 3 раза в неделю в течение 3 недель (указанного интервала достаточно для наблюдения эритропоэтического ответа). Такие соединения или соединение ЕРО рассматривают как соединение эритропоэтина, если они повышает концентрацию гемоглобина в сыворотке мышей. Дальнейшую оценку способности соединения ЕРО производили in vitro, используя клетки эритролейкемииTF1. Исследования подтвердили, что ЕРО является эритропоэтиновым продуктом, если относительное число клеток TF1 повышается по сравнению с контролем. Специалисты в данной области должны признать, что эти и другие анализы, такие как анализ, проводимый на модели мыши после гипоксии, и анализ ретикулоцитов (European Pharmacopeia), также являются подходящими для использования в настоящем изобретениии с целью определения эритропоэтической активности тканезащитных цитокинов длительного действия. В. Исследование тканезащитной функции. Тканезащитные свойства аналога ЕРО, имеющего по меньшей мере одну дополнительную N-связанную углеводную цепь и/или по меньшей мере одну дополнительную О-связанную углеводную цепь,определяли, используя следующий анализ. Использовали культуры нейронов, происходящих из гиппокампа 18-дневных плодов крыс. Мозг удаляли и освобождали от менингиальных оболочек мозга и гиппокамп изолировали. Затем клетки диспергировали посредством инкубации в течение 5 мин при 37 С в 2,5%-ном растворе трипсина с последующим титрованием. Клеточную суспензию разбавляли в основной бессывороточной среде Neurobasal,содержащей 1% В-27 дополнительного компонента (Gibco, Rockville, MD, USA), и помещали на покрытые полиорнитином покровные стекла при плотности 80000 клеток на покровное стекло. Затем клетки предварительно обрабатывали ЕРО в течение ночи и затем выдерживали в присутствии или в отсутствие 1) ЕРО, 2) аналога ЕРО, имеющего по меньшей мере одну дополнительную N-связанную углеводную цепь и/или по меньшей мере одну дополнительную O-связанную углеводную цепь, или 3) асиало-формы ЕРО, в 5 мкМ ТМТ в течение 24 ч. Культуры использовали между 10 и 14 днями in vitro. Жизнеспособность клеток определяли посредством анализа, используя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ). Denziot, F., and Lang, R. 1986. Rapid Colometric Assay for CellMethods 89: 271-277. Кратко, МТТ соль тетразолия растворяли в бессывороточной среде до конечной концентрации 0,75 мг/мл и добавляли к клеткам в конце обработки в течение 3 ч при 37 С. Затем среду удаляли и формазан экстрагировали смесью 1 н НСl:изопропанол (1:24). Абсорбцию при 560 нм измеряли с помощью аппарата для считывания микропланшетов. Как показано на фиг. 1 и 2, аналог ЕРО, имеющий по меньшей мере одну дополнительную N-связанную углеводную цепь и/или по меньшей мере одну дополнительную О-связанную углеводную цепь,не проявлял тканезащитную функцию. Описанное здесь заявленное изобретение не должно быть ограничено отдельными аспектами, поскольку данные аспекты рассматриваются как иллюстрация некоторых воплощений изобретения. Предполагается, что любые эквивалентные аспекты включены в объем данного изобретения. В действительности, различные изменения изобретения, вносимые вдобавок к тем, которые были продемонстрированы и описаны в тексте, будут очевидны специалистам в данной области из вышеприведенного описания. Такие модификации также должны входить в объем прилагаемой формулы изобретения. Все цитируемые в тексте ссылки в их полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ регулирования гематокритного числа у человека, включающий в себя стадии получения эритропоэтинового продукта, имеющего более продолжительный период полужизни в сыворотке, чем rhuEPO, и проявляющего тканезащитную функцию; и введения терапевтически эффективного количества указанного эритропоэтинового продукта. 2. Способ по п.1, где стадия получения эритропоэтинового продукта дополнительно включает в себя стадию модифицирования rhuEPO посредством по меньшей мере одной химической модификации по меньшей мере одной из N-связанных олигосахаридных цепей или О-связанной олигосахаридной цепи,где химическая модификация включает в себя окисление, сульфатирование, фосфорилирование, ПЭГилирование или их комбинации. 3. Способ по п.1, где стадия введения терапевтически эффективного количества эритропоэтинового продукта включает в себя введение эритропоэтинового продукта в более низком молярном количестве,чем rhuEPO, для достижения сопоставимого заданного гематокритного числа. 4. Способ по п.1, где период полужизни эритропоэтина в сыворотке по меньшей мере приблизи- 28007812 тельно на 20% продолжительнее, чем период полужизни rhuEPO в сыворотке. 5. Способ по п.4, где период полужизни эритропоэтина в сыворотке по меньшей мере приблизительно на 40% продолжительнее, чем период полужизни rhuEPO в сыворотке. 6. Произведенный эритропоэтиновый продукт, включающий в себя по крайней мере одно производное эритропоэтина, где по меньшей мере одна N-связанная олигосахаридная цепь или по меньшей мере одна О-связанная олигосахаридная цепь имеет по меньшей мере одну химическую модификацию в результате окисления, сульфатирования, фосфорилирования, ПЭГилирования или их комбинаций и где эритропоэтиновый продукт имеет более продолжительный период полужизни, чем rhuEPO в сыворотке. 7. Эритропоэтиновый продукт по п.6, где эритропоэтиновый продукт проявляет тканезащитную функцию. 8. Эритропоэтиновый продукт по п.6, где по меньшей мере одна химическая модификация включает в себя окисление по меньшей мере одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере одной О-связанной олигосахаридной цепи с образованием по меньшей мере одного дополнительного остатка кислоты. 9. Эритропоэтиновый продукт по п.6, где по меньшей мере одна химическая модификация включает в себя сульфатирование по меньшей мере одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере одной О-связанной олигосахаридной цепи с получением увеличенного отрицательного заряда на продукте ЕРО. 10. Эритропоэтиновый продукт по п.6, где по меньшей мере одна химическая модификация включает в себя фосфорилирование по меньшей мере одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере одной О-связанной олигосахаридной цепи с получением увеличенного отрицательного заряда на продукте ЕРО. 11. Эритропоэтиновый продукт по п.6, где по меньшей мере одна химическая модификация включает в себя добавление по меньшей мере одной полиэтиленгликолевой цепи по меньшей мере к одной Nсвязанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере к одной О-связанной олигосахаридной цепи. 12. Способ получения эритропоэтинового продукта, имеющего продленный период полужизни в сыворотке и тканезащитную активность, включающий в себя стадии получения по меньшей мере одного эритропоэтина или производного эритропоэтина и модификации по меньшей мере одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере одной O-связанной олигосахаридной цепи в молекуле по меньшей мере одного эндогенного или рекомбинантного эритропоэтина посредством окисления, сульфатирования, фосфорилирования, ПЭГилирования или их комбинаций. 13. Способ по п.12, где стадия модификации дополнительно включает в себя стадию замещения по меньшей мере одного смежного гидроксила по меньшей мере на одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере на одной О-связанной олигосахаридной цепи по меньшей мере одним остатком кислоты. 14. Способ по п.13, где стадия замещения по меньшей мере одного смежного гидроксила по меньшей мере на одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере на одной О-связанной олигосахаридной цепи по меньшей мере одним остатком кислоты дополнительно включает в себя замещение множества смежных гидроксилов по меньшей мере на одной N-связанной олигосахаридной цепи или по меньшей мере на одной О-связанной олигосахаридной цепи множеством остатков кислоты. 15. Способ по п.12, где стадия модификации дополнительно включает в себя стадии приготовления органического растворителя; растворения эритропоэтина или производного эритропоэтина в органическом растворителе с образованием раствора; приготовления по меньшей мере одного конденсирующего агента; приготовления по меньшей мере одного сульфатного донора и смешивания по меньшей мере одного конденсирующего агента и по меньшей мере одного сульфатного донора в растворе. 16. Способ по п.12, где стадия модификации дополнительно включает в себя стадии приготовления органического растворителя; растворения эритропоэтина или производного эритропоэтина в органическом растворителе с образованием раствора; приготовления по меньшей мере одного конденсирующего агента; приготовления фосфорной кислоты и смешивания по меньшей мере одного конденсирующего агента и по меньшей мере одной фосфорной кислоты в растворе. 17. Способ по п.12, где стадия модификации дополнительно включает в себя стадии приготовления органического растворителя; растворения эритропоэтина или производного эритропоэтина в органическом растворителе с образованием первого раствора; приготовления по меньшей мере одного окислительного агента;- 29007812 добавления по меньшей мере одного окислительного агента к первому раствору с образованием второго раствора; приготовления по меньшей мере одной цепи полиэтиленгликоля и смешивания по меньшей мере одной цепи полиэтиленгликоля со вторым раствором. 18. Способ по п.17, где стадия приготовления по меньшей мере одной цепи полиэтиленгликоля включает в себя приготовление по меньшей мере одной цепи полиэтиленгликоля по меньшей мере с одним фрагментом первичного амина на конце цепи. 19. Способ лечения анемии у больных с риском тканевого повреждения, включающий в себя стадии приготовления эритропоэтинового продукта по меньшей мере с одной химической модификацией по меньшей мере на одной из N-связанных олигосахаридных цепей или по меньшей мере О-связанной олигосахаридной цепи, где химическая модификация включает в себя окисление, сульфатирование, фосфорилирование, ПЭГилирование или их комбинации; введения терапевтически эффективного количества эритропоэтинового продукта, где эритропоэтиновый продукт вводят при более низком молярном количестве, чем rhuEPO, для достижения сопоставимого заданного гематокритного числа; где эритропоэтиновый продукт проявляет тканезащитную функцию. 20. Способ по п.19, где эритропоэтиновый продукт имеет более продолжительный период полужизни в сыворотке, чем rhuEPO. 21. Способ по п.20, где период полужизни эритропоэтина в сыворотке по меньшей мере приблизительно на 20% продолжительнее, чем период полужизни rhuEPO в сыворотке. 22. Способ по п.21, где период полужизни по меньшей мере приблизительно на 40% продолжительнее, чем период полужизни rhuEPO в сыворотке. 23. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного производного эритропоэтина, где по меньшей мере одна N-связанная олигосахаридная цепь или по меньшей мере одна O-связанная олигосахаридная цепь имеет по меньшей мере одну химическую модификацию в результате окисления, сульфатирования, фосфорилирования, ПЭГилирования или их комбинаций, где по меньшей мере одно производное эритропоэтина имеет более продолжительный период полужизни в сыворотке, чем рекомбинантный эритропоэтин, и проявляет тканезащитную функцию. 24. Фармацевтическая композиция по п.23, дополнительно содержащая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. 25. Фармацевтическая композиция по п.24, где по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель включает в себя по меньшей мере один разбавитель, адъювант, наполнитель, связующее вещество или их смеси. 26. Фармацевтическая композиция по п.23, дополнительно содержащая по меньшей мере один смачивающий агент, эмульгирующий агент, регулирующий рН буферный агент или их комбинации. 27. Фармацевтическая композиция по п.23, дополнительно содержащая по меньшей мере один тканезащитный цитокин.