Новые фитазы и способ их получения

007461 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение касается новых фитаз, в частности фитаз, происходящих из грибов, а также соответствующих способов их получения. Настоящее изобретение, в частности, касается новых фитаз,происходящих из грибов рода Penicillium, в особенности штамма Penicillium CBS 109899, а также полинуклеотидов, кодирующих эти фитазы. Изобретение также касается векторов, содержащих эти полинуклеотиды, и трансформированных организмов, экспрессирующих данные фитазы в своих тканях. В частности, фитазы настоящего изобретения особенно пригодны для применения в кормовых композициях, предназначенных для питания животных. Такая пригодность связана с их свойствами, в частности с активностью в условиях температуры и рН, соответствующих условиям получения данных композиций, а также условиям, встречающимся в пищеварительной системе млекопитающих. Уровень техники Фосфор - элемент, необходимый для жизни всех организмов. В частности, он имеет особое значение для тех, кто разводит домашних животных с тем, чтобы животные получали его в достаточном количестве для оптимального роста и развития. Большинство домашних животных получает кормовые композиции на основе растений. Эти растения содержат большое количество фосфата, который они запасают в своих тканях в виде запасного соединения - фитиновой (инозитгексафосфорной) кислоты. В среднем, в фитиновой кислоте содержится от 50 до 70% фосфора, находящегося в растениях. Фитиновая кислота подвергается естественной мобилизации, и содержащийся в ней фосфат высвобождается у большинства домашних животных, в особенности жвачных. Однако фитиновая кислота не метаболизируется у животных с неразделенным желудком, таких как свиньи и птицы. Поэтому у таких животных фитиновая кислота, поступившая с кормом, выделяется с экскрементами, и животноводам приходится добавлять в корма неорганический фосфат для того, чтобы животные получали достаточное количество фосфора. Такой подход влечет дополнительные расходы и вызывает загрязнение от попадания неусвоенной животными фитиновой кислоты в окружающую среду. Такое загрязнение еще больше возрастает в местах интенсивного разведения домашних животных. К тому же известно, что фитиновая кислота является хелатором таких важных питательных элементов, содержащихся в корме, как магний, кальций, цинк или железо. Это свойство ведет к уменьшению пищевой ценности корма, что придает фитиновой кислоте свойства противопитательного вещества. Для того чтобы справиться с различными недостатками, связанными с отсутствием усваивания фитиновой кислоты у животных с неразделенным желудком, было предложено введение фермента фитазы в корма этих домашних животных. Фитаза гидролизирует фитиновую кислоту с освобождением инозита и неорганического фосфата. Фитазы и гены, кодирующие их, были выделены из многих организмов. В основном, фитазы выделяли из грибов (Howson and Davis, 1983, Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382;Wyss et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65(2), 359-366). Из грибов, вырабатывающих фитазу, можно отметить грибы рода Aspergillus, в частности A. ficcum (Ullah and Gibson, 1987, Preparative Biochemistry 17(1), 63-91; Ullah and Dischinger, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 192(2), 747-753), A. terreuset al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64(11), 4423-4427), рода Monascus, в частности М. аnkа. Фитазы также обнаружены у бактерий. К примеру, можно отметить бактерии рода Bacillus, в частности В. subtilisMicrobiol. 46, 59-71), рода Enterobacter (Yoon et al., 1996, Enzyme and Microbiol. Technol. 18, 449-454) или рода Streptomyces. Также выделяли фитазы дрожжей (Dvorakova et al., 1998, Folia Microbiol. 43(4), 323338), например фитазы из дрожжей Schwaniiomyces occidentalis и Saccharomyces cerevisiae. Наконец, фитазы обнаружены у растений, в частности у сои (Ullah and Gibson, 1988, Arch. Biochem. Biophys. 260(2),514-20), кукурузы (Maugenest et al., 1999, Biochem. J., 322 (Pt 2), 511-7; Maugenest et al., 1999, Plant Mol.Biol., 39(3), 503-14) или Arabidopsis (Mullaney and Ullah, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., 251(1),252-5). Свойства, дающие возможность охарактеризовать фитазы, включают константу Михаэлиса (Кm) в отношении фитиновой кислоты, оптимум рН и температурный оптимум для активности, а также стабильность этой активности при данном рН и температуре. Можно использовать и данные, касающиеся структуры фитаз, такие как молекулярный вес (м.в.), изоэлектрическая точка (pI) и пептидная последовательность. Для того чтобы фитазы можно было использовать для кормления животных, они должны иметь свойства, совместимые с той обработкой, которой подвергаются корма для такого кормления. В частности, должна сохранятся активность фитаз и, по возможности, она должна быть оптимальной в условиях температуры и рН процессов, применяющихся для получения этих кормов, а также в условиях-1 007461 пищеварительного тракта животных, потребляющих эти корма. Эти ограничения, в основном, ведут к поиску таких фитаз, активность которых выдерживает условия высокой температуры типа тех, что применяются в процессах получения кормовых композиций, и выдерживает условия кислых значений рН типа тех, что существуют в пищеварительном тракте домашних животных. Для того чтобы удовлетворить этим критериям, проводился поиск фитаз у организмов, в частности микроорганизмов, развивающихся в таких местах, в которых условия температуры и рН соответствуют этим критериям. Такой подход позволил выделить фитазы, выдерживающие высокие температуры, например фитазы, описанные в патентных заявках WO 97/35016 или ЕР 0 684 313, а также фитазы, имеющие низкие значения Кm, например, описанные в патентной заявке ЕР 0 960 934. Другой подход заключался в искусственной модификации последовательности известных фитаз путем направленного мутагенеза с целью придания им полезных свойств. Этот подход, в частности, описан в патентных заявках WO 99/48380, ЕР 0 897 985 и ЕР 0 897 010. Краткое описание фигур Фиг. 1. Активность фитазы Penicillium sp. CBS 109899 в зависимости от рН. Величина 100% относительной активности соответствует оптимуму активности фитазы при данном значении рН. Фиг. 2. Активность фитазы Penicillium sp. CBS 109899 в зависимости от температуры. Величина 100% относительной активности соответствует оптимуму активности фитазы при данной температуре. Раскрытие изобретения Настоящее изобретение касается выделенных полинуклеотидов, кодирующих фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3. Эта фитаза и кодирующие ее полинуклеотиды происходят из штамма гриба рода Penicillium, в частности штамма Penicillium sp. CBS 109899. В соответствии с настоящим изобретением термин "полинуклеотид" означает молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из природной или искусственной последовательности оснований, которая может представлять собой ДНК или РНК, предпочтительно ДНК, в особенности двухцепочечную. Если данный полинуклеотид природный, то подразумевается, что изобретение охватывает его не в природном окружении, но только выделенный и очищенный полинуклеотид из генома живого организма, в котором он находится в природе. Такой полинуклеотид может быть получен непосредственно, путем экстрагирования и очистки, или косвенно, путем копирования. Однако настоящее изобретение охватывает данный полинуклеотид и в том случае, когда он встроен искусственно в геном другого живого организма, а не того, в котором он находится в природе, или когда он искусственно введен обратно в тот живой организм, из которого он происходит, в виде одной или нескольких копий в геноме этого организма. В том случае, когда этот полинуклеотид является зондом, то он обычно одноцепочечный. Таким образом, изобретение охватывает полинуклеотиды, кодирующие пептидную последовательность фитазы, представленной последовательностью SEQ ID NO: 3. Специалистам в данной области хорошо известно, что такое определение охватывает все полинуклеотиды, в том числе и нуклеотидные последовательности, отличающиеся вследствие вырожденности генетического кода, которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность, то есть одну и ту же фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3. Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, гомологичные вышеописанным полинуклеотидам, причем данные гомологичные полинуклеотиды кодируют фитазы, гомологичные фитазе,представленной последовательностью SEQ ID NO: 3. В соответствии с изобретением термин "гомологичный" означает, что последовательности полинуклеотидов, кодирующих фитазы, содержат модификации по сравнению с полинуклеотидами, кодирующими фитазу, представленную последовательностьюSEQ ID NO: 3. Гомологичные полинуклеотиды отличаются по степени их тождественности полинуклеотидам, кодирующим фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3. Степень тождественности между двумя соответствующими полинуклеотидами определяется путем сравнения их последовательностей и обычно выражается в виде процентного содержания идентичных нуклеотидов между этими последовательностями. Степень тождественности измеряется по определенному отрезку последовательности, причем более короткая из сравниваемых последовательностей определяет тот отрезок последовательности, по которому измеряется степень тождественности гомологичных последовательностей. Таким образом, изобретение охватывает полинуклеотиды, содержащие одну или несколько модификаций последовательности по сравнению с полинуклеотидами, кодирующими фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, и кодирующие фитазы, свойства которых эквивалентны свойствам фитазы,представленной последовательностью SEQ ID NO: 3. В соответствии с изобретением выражение "эквивалентные фитазы" или "фитазы с эквивалентными свойствами", в сущности, означает белки, обладающие фитазной активностью, независимо от присущих им свойств, таких как Кm, оптимум рН или температурный оптимум для активности. Уровень фитазной активности может быть измерен любым методом определения фитазной активности. Термин "фитаза" служит для обозначения фермента, каталитическая активность которого заключается в гидролизе фитиновой кислоты с освобождением инозита и неорганического фосфата. Однако, поскольку большинство фитаз не осуществляют полный гидролиз фитиновой кислоты (содержащей 6 фосфатов), то каталитическая активность фитазы по настоящему изобретению может приводить к освобождению неорганического-2 007461 фосфата и фосфатных эфиров миоинозита, причем данные эфиры, в зависимости от гидролитической способности фитазы, могут представлять собой моно-, ди-, три-, тетра- или пентафосфатные эфиры миоинозита. К примеру, фитазную активность можно измерять по методу Shimizu (1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56(8), 1266-1269), в частности, как описано в примере 2. Однако для измерения фитазной активности можно использовать любой метод определения фитазной активности, измеряя либо уменьшение количества субстрата, либо накопление продуктов ферментативной реакции. В частности, аналогичные методы с применением, к примеру, другого субстрата или других реагентов также позволяют измерять фитазную активность. Модификации последовательности в гомологичных полинуклеотидах могут представлять собой вставки, делеции или замены нуклеотидов, которые могут быть природными или могут осуществляться обычными методами мутагенеза. Известно, что такие гомологичные полинуклеотиды, кодирующие белки с эквивалентными функциями, в природе существуют в геномах различных видов организмов и даже в геномах различных рас, разновидностей или штаммов. Следовательно, специалисты в этой области,руководствуясь сведениями данного изобретения о полинуклеотидах, кодирующих пептидную последовательность, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, смогут легко выделить такие гомологичные полинуклеотиды при помощи хорошо известных методов молекулярной гибридизации (Sambrooket al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan С. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Молекулярная гибридизация - это реакция спаривания, которая имеет место между комплементарными нитями полинуклеотидов, имеющих определенную степень тождественности нуклеотидных последовательностей. Таким образом, гибридизация дает возможность, используя полинуклеотиды, кодирующие фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, идентифицировать полинуклеотиды, гомологичные этим полинуклеотидам, в геноме других живых организмов, чем те организмы, из которых они происходят, например других грибов, в частности других штаммов Penicillium, к примеру P. funiculosumIMI 134756, и кодирующие фитазы, обладающие свойствами, эквивалентными свойствам фитазы, представленной последовательностью SEQ ID NO: 3. Чем более тождественны последовательности полинуклеотидов, тем больше вероятность и легкость гибридизации между данными полинуклеотидами и тем больше вероятность того, что эти полинуклеотиды кодируют белки с эквивалентными свойствами. Методы гибридизации полинуклеотидов широко представлены в литературе (Sambrook et al., 1989, MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) и хорошо известны специалистам в данной области. Так, они могут основываться на скринировании геномной библиотеки или библиотеки кДНК, полученной из живого организма или из ткани этого организма. Скринирование проводится с помощью зонда, состоящего из известного полинуклеотида или его фрагмента, с целью идентификации в этих библиотеках полинуклеотидов, гомологичных данному зонду,которые будут с ним гибридизироваться. В соответствии с изобретением зонд состоит из полинуклеотида, кодирующего фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, или его фрагмента. Для идентификации тех полинуклеотидов, с которыми гибридизируется зонд, на него сажают метку, к примеру, с помощью радиоактивных элементов типа 32 Р. Также можно использовать коммерчески доступные нерадиоактивные метки, хорошо известные специалистам в данной области. Таким образом, настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, способные к избирательной гибридизации с одним из полинуклеотидов, кодирующих фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, или его фрагментом. Предусматривается, что эти полинуклеотиды являются частью настоящего изобретения только в том случае, если они кодируют фитазу, эквивалентную той, что представлена последовательностью SEQ ID NO: 3. Таким образом, в соответствии с изобретением выражение"полинуклеотиды, способные к избирательной гибридизации" означает полинуклеотиды, которые, одним из обычных методов молекулярной гибридизации (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), гибридизируются с меченым зондом, состоящим из одного из полинуклеотидов, кодирующих фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, или его фрагмента, на уровне, превышающем неспецифическую гибридизацию данного зонда с другими, сравнительно негомологичными полинуклеотидами, в частности с другими кДНК, если такие полинуклеотиды происходят из библиотеки кДНК. Уровень гибридизации измеряют по сигналу, исходящему от метки зонда. Уровень сигнала, возникающего при взаимодействии между полинуклеотидами, способными к избирательной гибридизации, и зондом, обычно в 10 раз, предпочтительно в 100 раз превышает интенсивность сигнала, возникающего при взаимодействии зонда с другими полинуклеотидами, создающими "уровень шума". Избирательную гибридизацию обычно проводят при нормальных, предпочтительно строгих или очень строгих условиях гибридизации и отмывки (например, гибридизация в буфере, содержащем как минимум 5xSSC и 1% SDS примерно при 50-60 С, и ряд промывок в 0,1% SDS с постепенным снижением концентрации SSC от 2xSSC до 0,4xSSC и повышением температуры от 20 до 50 С). Специалисты в данной области могут модифицировать условия гибридизации, в основном, температуру и концентрацию солей в буферах, используемых на стадии гибридизации и на стадии отмывки. В частности, эти условия следует модифицировать в зависимости от длины зонда и от степени тождественности полинуклеотидов в библиотеке, скринируемой этим зондом.-3 007461 Условия гибридизации необходимо модифицировать таким образом, чтобы оптимизировать сигнал, возникающий при гибридизации гомологичных последовательностей, и в то же время свести к минимуму уровень шума. Полинуклеотиды, способные к избирательной гибридизации с полинуклеотидами по изобретению,могут быть выделены из геномных библиотек или библиотек кДНК, полученных, к примеру, из штаммов грибов, в частности штаммов рода Penicillium, например штамма P. funiculosum IMI 134756. Выделение таких полинуклеотидов может осуществляться стандартными методами гибридизации (Sambrook et al.,1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York: Cold Spring HarborLaboratory Press), c использованием в качестве зонда полинуклеотида, кодирующего фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, или фрагмента такого полинуклеотида, либо комплементарного к нему полинуклеотида. После выделения полинуклеотида этими методами необходимо определить его последовательность и установить свойства белка, кодируемого этим полинуклеотидом, в частности проверить, что этот белок представляет собой фитазу, эквивалентную фитазе, представленной последовательностью SEQ ID NO: 3. Вышеуказанные методы гибридизации, таким образом, дают возможность выделить полинуклеотиды, гомологичные полинуклеотидам, кодирующим фитазу, представленную последовательностью SEQID NO: 3. Такие полинуклеотиды и кодируемые ими фитазы могут быть легко идентифицированы специалистами в области биотехнологии, владеющими стандартными методами молекулярной биологии. Таким образом, изобретение охватывает полинуклеотиды, гомологичные полинуклеотидам, кодирующим фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3. Предпочтительно степень тождественности гомологичных полинуклеотидов должна составлять не менее 45% относительно полинуклеотидов, кодирующих фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, предпочтительно не менее 50%, не менее 70%, не менее 80%, более предпочтительно не менее 90% и предпочтительно не менее 95%. Методы измерения и установления степени тождественности последовательностей хорошо известны специалистам в данной области. К примеру, можно воспользоваться программами PILEUP, BLAST (в частности, Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10) илиMathematics, 1981, No. 2, 482-489). Такие гомологичные полинуклеотиды можно также получить искусственно при помощи стандартных методов мутагенеза. Предпочтительно полинуклеотид, кодирующий фитазу, представленную последовательностью SEQID NO: 3, выбирают из последовательностей, представленных SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В качестве примера гомологичного полинуклеотида можно отметить полинуклеотид, представленный последовательностью SEQ ID NO: 4. В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения полинуклеотиды, кодирующие вышеописанную фитазу, происходят из гриба рода Penicillium. В предпочтительном воплощении они происходят из штамма Penicillium sp. CBS 109899 или из штамма Penicillium funiculosum IMI 134756. В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения полинуклеотиды по изобретению кодируют фитазу, обладающую следующими свойствами:(c) Km = 550 мкМ Настоящее изобретение также касается фрагментов вышеописанных полинуклеотидов. Термин"фрагмент", в частности, означает фрагмент, состоящий, по меньшей мере, из 20 нуклеотидов, в особенности, по меньшей мере, из 50 нуклеотидов и предпочтительно, по меньшей мере, из 100 нуклеотидов. Такие фрагменты обычно называют олигонуклеотидами. Они могут использоваться как гибридизационные зонды для идентификации гомологичных полинуклеотидов или как праймеры для идентификации и амплификации таких гомологичных полинуклеотидов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано в Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, edit. John WileySons, Section 6.3-6.4. Термин "фрагмент" также означает фрагменты полинуклеотидов по изобретению, кодирующих фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, или фрагмент фитазы, гомологичный или эквивалентный фитазе, представленной последовательностью SEQ ID NO: 3. Настоящее изобретение также касается полинуклеотидов, включающих, по меньшей мере, один из вышеописанных полинуклеотидов. Все полинуклеотиды, описанные выше, кодируют либо фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, либо гомологичную фитазу, либо активный фрагмент этих фитаз. Следовательно,изобретение распространяется на все фитазы, кодируемые всеми этими полинуклеотидами. Данное определение, таким образом, включает фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, фитазы,гомологичные этой фитазе, и активные фрагменты этих фитаз. В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения фитаза представляет собой белок,включающий, по меньшей мере, пептидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.-4 007461 Таким образом, изобретение также охватывает фитазы, гомологичные фитазе, представленной последовательностью SEQ ID NO: 3. В соответствии с изобретением термин "гомологичные фитазы" означает фитазы, последовательности которых содержат модификации по сравнению с фитазой, представленной последовательностью SEQ ID NO: 3. Подобно гомологичным полинуклеотидам, гомологичные фитазы - это фитазы, пептидные последовательности которых проявляют определенную степень тождественности, при этом степень тождественности обычно выражается процентным содержанием идентичных аминокислот. Таким образом, изобретение охватывает фитазы, содержащие одну или несколько модификаций последовательности по сравнению с фитазой, представленной последовательностью SEQ IDNO: 3, и свойства которых эквивалентны свойствам фитазы, представленной последовательностью SEQID NO: 3. Эти модификации могут представлять собой вставки, делеции или замены аминокислот, как природные, так и полученные обычными методами мутагенеза. Предпочтительно степень тождественности гомологичных фитаз должна составлять не менее 35% относительно фитазы, представленной последовательностью SEQ ID NO: 3, предпочтительно не менее 50%, не менее 70%, не менее 80%, более предпочтительно не менее 90% и предпочтительно не менее 95%. Методы измерения и установления степени тождественности последовательностей хорошо известны специалистам в данной области. К примеру,можно воспользоваться программами PILEUP, BLAST (в частности, Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10) или BestFit (Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711, используя алгоритм, описанный Smith and Waterman, Applied Mathematics, 1981, No. 2, 482-489). В качестве примера фитазы, гомологичной фитазе, представленной последовательностью SEQ IDSEQ ID NO: 4. В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения фитаза по изобретению происходит из гриба рода Penicillium. В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения фитаза обладает следующими свойствами:(c) Кm = 550 мкМ Изобретение также распространяется на фрагменты фитазы, представленной последовательностьюSEQ ID NO: 3, и на фрагменты гомологичных фитаз. Термин "фрагмент", в основном, означает биологически активный фрагмент, то есть фрагмент, обладающий фитазной активностью, эквивалентной активности целой фитазы, при измерении методом, описанным в примере 2, или сходным методом. Настоящее изобретение также касается химерного гена, включающего функционально связанные друг с другом, по меньшей мере, один промотор, функционирующий в организме хозяина, полинуклеотид, кодирующий фитазу по изобретению, и элемент-терминатор, функционирующий в том же организме хозяина. Разнообразные элементы, которые могут содержаться в обычном гене, - это, во-первых, элементы, регулирующие транскрипцию, трансляцию и созревание белков, такие как промоторы, последовательности, кодирующие сигнальный пептид или транзитный пептид, или элементы-терминаторы, составляющие сигнал полиаденилирования, а, во-вторых, - полинуклеотид, кодирующий пептид. Выражение "функционально связанные друг с другом" означает, что данные элементы химерного гена связаны друг с другом таким образом, что на функционирование одного из этих элементов влияет функционирование другого. К примеру, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он способен оказывать влияние на экспрессию данной кодирующей последовательности. Конструирование химерного гена по изобретению и сборка его различных элементов могут осуществляться методами,хорошо известными в данной области, в частности методами, описанными в Sambrook et al., 1989, MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Выбор регуляторных элементов, входящих в состав химерного гена, в основном, зависит от организма хозяина, в котором они должны функционировать, и специалисты в этой области способны выбрать регуляторные элементы, функционирующие в данном организме хозяина. Термин "функционирующий" означает способный к функционированию в данном организме хозяина. Промоторы, содержащиеся в химерном гене по изобретению, могут быть конститутивными либо индуцибельными. Например, промоторы для экспрессии в бактериях могут быть выбраны из промоторов, указанных ниже. Для экспрессии в Escherichia coli можно указать промоторы lac, trp, lpp, phoA, recA,araBAD, proU, cst-1, tetA, cadA, nar, tac, trc, lpp-lac, Psyn, cspA, PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, PL-PT7, T3-lac,T5-lac, T4 гена 32, nprM-lac, VHb и промотор белка A (Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538; CurrentOpinions in Biotechnology, 1996, 7; Weickert et al., 1996, Current Opinions in Biotechnology, 7: 494-499) либо же промотор Ptrp (WO 99/64607). Для экспрессии в таких грам-положительных бактериях, как Corynebacteria или Streptomyces, можно указать промоторы PtipA (Holmes et al., 1993, EMBO J. 12: 3183-3191), или PS1 иPS2 (FR 91/09870), либо промоторы, описанные в заявке ЕР 0629699 А 2. Для экспрессии в дрожжах и грибах можно указать промотор PLAC4 K. lactis (Van den Berg et al., 1990, Bio/Technology 8: 135-139), или промотор Ppgk К. lactis (патентная заявка FR 91/05294), либо промотор tef1 или cbh1 у Trichoderma (WOal., 1987, Bio/Technology 5: 713-719). Химерный ген также может содержать последовательность субклеточной адресации, кодирующую сигнальный пептид или транзитный пептид. Такая последовательность, находящаяся впереди или позади от полинуклеотида, кодирующего фитазу, позволяет направить данную фитазу в клеточный компартмент организма хозяина или направить ее на секрецию во внеклеточное пространство. Например, химерный ген может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид или транзитный пептид, для направления фитазы в определенный компартмент цитоплазмы, такой как митохондрии, пластиды, эндоплазматический ретикулум или вакуоли. Предпочтительно последовательность адресации кодирует сигнальный пептид, направляющий фитазу в апопласт или внеклеточный матрикс. В соответствии с одним из воплощений транзитный пептид может представлять собой сигнал хлоропластной, вакуольной или митохондриальной адресации, который впоследствии отщепляется в хлоропластах, вакуолях или митохондриях. Такие пептиды широко представлены в литературе: Neuhaus andRodgers, 1998, Plant Molecular Biology 38: 127-144; транзитный пептид EPSPS, описанный в патенте USP 5188642; транзитный пептид малой субъединицы рибулозобискарбоксилазы/оксигеназы (ЕР 189707). В соответствии с другим воплощением транзитный пептид может состоять из сигнального пептида для адресации в периплазму бактерий типа пептидов генов рас (Schumacher et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 5713-5727), ompA (Bowden and Georgiou, 1990, J. Biol. Chem. 265: 16761-16766) и phoA (Chang et al.,1986, Gene 44: 121-124) или из якорного пептида для поверхности бактерий типа пептидов генов PS1 иPS2 (FR91/09870). Транзитные пептиды могут быть одинарными или сдвоенными. Сдвоенные транзитные пептиды необязательно разделены промежуточной последовательностью. В качестве примера хлоропластного транзитного пептида можно отметить сдвоенный транзитный пептид, включающий, в направлении транскрипции, последовательность, кодирующую транзитный пептид растительного гена, кодирующего фермент, находящийся в пластидах, часть последовательности зрелого N-концевого участка растительного гена, кодирующего фермент, находящийся в пластидах, а затем последовательность, кодирующую второй транзитный пептид растительного гена, кодирующего фермент, находящийся в пластидах. Такие двойные хлоропластные транзитные пептиды описаны, к примеру, в патентной заявке ЕР 0508909. В соответствии с одним из воплощений транзитный пептид может состоять из разных элементов для увеличения количества определенного белка, секретируемого в среду. При этом можно отметить комбинацию из белка-переносчика и сайта протеолитического расщепления, слитую с данным белком(USP 6130063). Согласно изобретению химерный ген также может включать другие регуляторные последовательности, расположенные между промотором и кодирующей последовательностью, такие как активаторы транскрипции (энхансеры). Настоящее изобретение также касается векторов для клонирования, экспрессии и/или трансформации, включающих химерный ген по изобретению. Вектор по изобретению пригоден для трансформации организма хозяина и экспрессии фитазы в этом организме. Вектор может представлять собой плазмиду,космиду, бактериофаг или вирус. Предпочтительно вектор для трансформации по изобретению представляет собой плазмиду. В общем, главным качеством такого вектора должна быть способность к сохранению и саморепликации в клетках организма хозяина, в частности, благодаря наличию начала репликации и к экспрессии в них фитазы. В целях стабильной трансформации организма хозяина вектор также может встраиваться в геном. При этом состав вектора может ограничиваться элементами, необходимыми для синтеза фитазы в организме хозяина. Выбор такого вектора, а также методы включения в него химерного гена по изобретению подробно описаны в Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, и входят в общие познания специалистов в данной области. Предпочтительно вектор, используемый в настоящем изобретении, наряду с химерным геном по изобретению, также содержит химерный ген, кодирующий селекционный маркер. Такой селекционный маркер дает возможность проводить отбор эффективно трансформированных организмов хозяина, то есть тех, что содержат вектор. Из числа селекционных маркеров, которые могут быть использованы, можно отметить маркеры, содержащие гены устойчивости к антибиотикам, например такие, как ген гигромицинфосфотрансферазы (Gritz et al., 1983, Gene 25: 179188; Punt et al., 1987, Gene 56: 117-24), ген стрептотрицинацетилтрансферазы, ген, кодирующий полипептид, придающий устойчивость к флеомицину, ген мутированного -тубулина, придающего устойчивость к беномилу (Gold et al., 1994, Gene 142: 225-30), или ген биалафосацетилтрансферазы (Avalos et al., 1989,Curr. Genet. 16: 369-72). Другие маркеры могут быть генами, восполняющими ауксотрофию, такие как гены pyrA, pyrB, pyrG, pyr4 (Buxton and Radford, 1983, Mol. Gen. Genet. 190: 403-405), arg4, argB (Berse etal., 1983, Gene 25: 109-117) и trpC (Coosen et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219: 282-88), ген молибдоптеринсинтазы (Appleyard et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 14869-76; Unkles et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 1928693) или ген ацетамидазы (Beri and Turner, 1987, Curr. Genet. 11: 639-41). Другая категория селекционных маркеров состоит из генов устойчивости к гербицидам, таких как ген bar устойчивости к биалафосу(White et al., NAR 18: 1062, 1990), ген EPSPS устойчивости к глифозату (US 5 188 642), ген HPPD устой-6 007461 чивости к изоксазолу (WO 96/38567) или ген глифозатоксидоредуктазы (US 5463175). Также можно отметить гены, кодирующие легко определяемые ферменты типа фермента GUS, или гены, кодирующие пигменты или ферменты, регулирующие выработку пигментов в трансформированных клетках. Такие гены селекционных маркеров, в частности, описаны в патентных заявках WO 91/02071, WO 95/06128,WO 96/38567 и WO 97/04103. Настоящее изобретение также касается трансформированных организмов хозяина, содержащих, по меньшей мере, один химерный ген по изобретению, встроенный в геном либо находящийся на внехромосомном генетическом элементе, к примеру плазмиде. Термин "организм хозяина" служит для обозначения любых низших или высших, одноклеточных или многоклеточных организмов, в которые может быть введен химерный ген по изобретению для продукции фитазы по изобретению. Предпочтительно организм хозяина представлен микроорганизмом, в частности грибом, например, из рода Penicillium, Aspergillus,Chrysosporium или Trichoderma, либо бактерией, например, из рода Escherichia, в частности Е. coli, или из рода Corynebacterium, Bacillus или Streptomyces, либо дрожжевым организмом, в частности из родаSaccharomyces, Kluyveromyces или Pichia, либо бакуловирусом или растительными клетками. Организм хозяина также может быть представлен растением или частью растения. Выражение "трансформированный организм хозяина" служит для обозначения организма хозяина,в который был введен, в геном или во внехромосомный генетический элемент, например плазмиду, по меньшей мере, один химерный ген по изобретению, вследствие чего он продуцирует фитазу в тканях или в культуральной жидкости. Для получения организмов хозяина по изобретению специалисты в данной области могут воспользоваться одним из многих известных методов трансформации. Один из этих методов заключается в обработке подлежащих трансформации клеток или тканей организма хозяина полиэтиленгликолем (ПЭГ) вместе с вектором по изобретению (Chang and Cohen, 1979,Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). Другой метод это электропорация, которая заключается в воздействии на подлежащие трансформации клетки или ткани вместе с вектором по изобретению электрического поля (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Следующий метод заключается в непосредственном введении векторов в клетки или ткани при помощи микроинъекции (Gordon andRuddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). Можно с выгодой использовать "биолистический" метод. Он заключается в бомбардировке клеток или тканей частицами, на которых адсорбированы векторы изобретения(Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3), 286291; US Patent No. 4 945 050). В литературе описано несколько методов трансформации бактерий - Escherichia coli и других грамотрицательных бактерий (Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,New York; Inoue et al., 1990, Gene 96: 23-28; Chung et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2172-2175). Также можно воспользоваться конъюгацией (Cameron et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 547-557). Для грамположительных бактерий можно использовать электропорацию, а также трансформацию протопластов, в особенности для бактерий рода Streptomyces (Bonamy et al., 1990, FEMS Microbiol. Lett. 66: 263-270;Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. John Innes Foundation,Norwich). В литературе также описано несколько методов трансформации грибов (Talbot, 2001, Molecular andcellular biology of filamentous fungi, Oxford University Press, New York). Трансформация протопластов с помощью ПЭГ описана для Aspergillus в ЕР 0260762, и адаптация этого метода для вида Penicillium funiculosum описана в WO 00/36120. Также известна трансформация методом встраивания с помощью рестрикционных ферментов (REMI) (Sanchez et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 258, 89-94), а также трансформация протопластов с помощью бактерий рода Agrobacterium (de Groot et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 839-842). Методы трансформации дрожжей также описаны в литературе, в частности Ausubel et al., 1995,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York; и Van den Berg et al., 1990,Bio/Technology 8: 135-139. В особом случае, когда подлежащий трансформации организм хозяина имеет растительное происхождение, клетки или ткани растения лучше всего трансформировать с помощью бактерий рода Agrobacterium, предпочтительно путем инфицирования клеток или тканей данных растений A. tumefaciens (Knopf,1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23(3): 315-330) или A. rhizogenes (Bevan andChilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16: 357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28). Предпочтительно трансформация растительных клеток или тканей с помощью Agrobacterium tumefaciens проводится по методике, описанной Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14(6), 745-750). Специалисты в данной области могут выбрать соответствующий метод в зависимости от природы подлежащего трансформации организма хозяина. Настоящее изобретение также касается способа получения экстракта, обладающего фитазной активностью. В соответствии с одним из воплощений изобретения этот способ включает стадии:(a) культивирования организма, обладающего от природы полинуклеотидом по изобретению в своем геноме, в условиях, позволяющих экспрессию данной фитазы,(b) концентрирования организма, выращенного на стадии (а),-7 007461(c) разрушения клеток организма, выделенного на стадии (b),(d) центрифугирования экстракта из разрушенных клеток, полученного на стадии (с),(e) выделения супернатанта, обладающего фитазной активностью, полученного на стадии (d). Стадия (с) может осуществляться методами, известными специалистам в данной области, такими как механическое измельчение (посредством давления, воздействия ультразвука, растирания), энзиматический лизис или осмотический шок, причем эти методы могут применяться поодиночке или в сочетании. Данный способ также может стать способом получения фитазы по изобретению при добавлении дополнительной стадии очистки (f). Стадия (f) такого способа получения фитазы по изобретению заключается в очистке фитазы из супернатанта, полученного на стадии (е). Очистка фитазы может проводиться любым методом концентрирования или разделения белков, в частности методами микрофильтрации,ультрафильтрации, электрофореза или хроматографии, хорошо известными в этой области. Для получения очищенной фитазы специалисты в данной области могут воспользоваться вышеуказанным методом измерения фитазной активности для того, чтобы идентифицировать фракции, содержащие данную фитазу. В соответствии с этим способом полученная фитаза может иметь чистоту предпочтительно в 50, 60,70, 80, 90, 95, 99 или предпочтительно 100%. В соответствии со следующим воплощением способа по изобретению, в частности, когда фитаза по изобретению секретируется в культуральную среду, данный способ включает стадии:(a) культивирования организма, обладающего от природы полинуклеотидом по изобретению, в условиях, позволяющих экспрессию данной фитазы,(b) получения культуральной жидкости путем удаления данного организма. Выражение "организм, обладающий от природы полинуклеотидом по изобретению в своем геноме" служит для обозначения любого организма, в природном состоянии обладающего полинуклеотидом, кодирующим фитазу, представленную последовательностью SEQ ID NO: 3, или гомологичный полинуклеотид в своем геноме. В соответствии с одним из воплощений способов, описанных выше, данный организм представлен микроорганизмом. В предпочтительном воплощении данный микроорганизм представляет собой гриб, в частности гриб из рода Penicillium, в особенности штамм Penicillium sp. CBS 109899. В соответствии с этими способами организм культивируют в среде, пригодной для получения фитазы методами, известными в этой области. Данный организм, особенно когда он представлен микроорганизмом, в частности грибом, можно культивировать в конической колбе со встряхиванием, в лабораторном ферментере или промышленном ферментере (периодическое культивирование, подпитываемое культивирование или культивирование в твердой среде). Культуральная среда должна содержать источники углерода и азота и неорганические соли. В предпочтительном воплощении способа с использованием штамма Penicillium sp. CBS 109899 в качестве организма экспрессия фитазы осуществляется в присутствии или в отсутствие солей фитиновой кислоты (например, эти соли могут представлять собой солиNa+, соли Са или сочетание солей Са+ и Mg). Величину рН можно контролировать (рН 3 или 4 предпочтительно) либо оставить как есть. В соответствии с этим способом стадия получения культуральной жидкости путем удаления организма может осуществляться любым способом разделения твердых фракций, заключенных в жидкой фракции. В частности, фильтрация и центрифугирование являются подходящими способами выполнения этой стадии. Данный способ также может стать способом получения фитазы по изобретению при добавлении дополнительной стадии очистки (с). Стадия (с) такого способа получения фитазы по изобретению заключается в очистке фитазы из супернатанта, полученного на стадии (b). Фитаза может быть очищена любым методом концентрирования или разделения белков, в частности методами микрофильтрации,ультрафильтрации, электрофореза или хроматографии, хорошо известными в этой области. Для получения очищенной фитазы специалисты в данной области могут воспользоваться вышеуказанным методом измерения фитазной активности для того, чтобы идентифицировать фракции, содержащие данную фитазу. В соответствии с этим способом полученная фитаза может иметь чистоту предпочтительно в 50, 60,70, 80, 90, 95, 99 или предпочтительно 100%. В соответствии со следующим воплощением изобретения в способе получения экстракта, обладающего фитазной активностью, применяется трансформированный организм хозяина по изобретению,и он включает стадии:(a) культивирования трансформированного организма хозяина по изобретению,(b) концентрирования трансформированного организма хозяина, выращенного на стадии (а),(c) разрушения клеток организма, выделенного на стадии (b),(d) центрифугирования экстракта из разрушенных клеток, полученного на стадии (с),(e) выделения супернатанта, обладающего фитазной активностью, полученного на стадии (d). Стадия (с) может осуществляться методами, известными специалистам в данной области, такими как механическое измельчение (посредством давления, воздействия ультразвука, растирания), энзиматический лизис или осмотический шок, причем эти методы могут применяться поодиночке или в сочетании. Данный способ также может стать способом получения фитазы по изобретению при добавлении-8 007461 дополнительной стадии очистки (f). Стадия (f) такого способа получения фитазы по изобретению заключается в очистке фитазы из супернатанта, полученного на стадии (е). Очистка фитазы может проводиться любым методом концентрирования или разделения белков, в частности методами микрофильтрации,ультрафильтрации, электрофореза или хроматографии, хорошо известными в этой области. Для получения очищенной фитазы специалисты в данной области могут воспользоваться вышеуказанным методом измерения фитазной активности для того, чтобы идентифицировать фракции, содержащие данную фитазу. В соответствии с этим способом полученная фитаза может иметь чистоту предпочтительно в 50, 60,70, 80, 90, 95, 99 или предпочтительно 100%. Предпочтительно трансформированный организм хозяина в этом способе представлен микроорганизмом. В частности, данный микроорганизм может быть представлен грибом, например, из рода Penicillium,Aspergillus, Chrysosporium или Trichoderma, либо бактериями, например, из рода Escherichia, в частности Е. coli, или из рода Corynebacterium, Bacillus или Streptomyces, либо дрожжевым организмом, в частности, из рода Saccharomyces, Kluyveromyces или Pichia, либо бакуловирусом или растительными клетками. В соответствии со следующим воплощением изобретения, в частности, когда фитаза по изобретению секретируется в культуральную среду, данный способ включает стадии:(a) культивирования трансформированного организма хозяина по изобретению,(b) получения культуральной жидкости путем удаления трансформированного организма хозяина. В соответствии с этими способами организм культивируют в среде, пригодной для получения фитазы методами, известными в этой области. Данный организм, особенно когда он представлен микроорганизмом, в частности грибом, можно культивировать в конической колбе со встряхиванием, в лабораторном ферментере или промышленном ферментере (периодическое культивирование, подпитываемое культивирование или культивирование в твердой среде). Культуральная среда должна содержать источники углерода и азота и неорганические соли. В соответствии с этим способом стадия получения культуральной жидкости путем удаления трансформированного организма хозяина может осуществляться любым способом разделения твердых фракций, заключенных в жидкой фракции. В частности, фильтрация и центрифугирование являются подходящими способами выполнения этой стадии. Данный способ также может стать способом получения фитазы по изобретению при добавлении дополнительной стадии очистки (с). Стадия (с) такого способа получения фитазы по изобретению заключается в очистке фитазы из супернатанта, полученного на стадии (b). Фитаза может быть очищена любым методом концентрирования или разделения белков, в частности методами микрофильтрации,ультрафильтрации, электрофореза или хроматографии, хорошо известными в этой области. Для получения очищенной фитазы специалисты в данной области могут воспользоваться вышеуказанным методом измерения фитазной активности для того, чтобы идентифицировать фракции, содержащие данную фитазу. В соответствии с этим способом полученная фитаза может иметь чистоту предпочтительно в 50, 60,70, 80, 90, 95, 99 или предпочтительно 100%. Настоящее изобретение также касается энзиматических композиций, содержащих, по меньшей мере, одну фитазу по изобретению. Термин "энзиматическая композиция" служит для обозначения композиции, включающей, по меньшей мере, одну фитазу по изобретению, причем фитаза может находиться в различных пропорциях, в зависимости от того, содержится она вместе с различными адъювантами, усиливающими ее стабильность и сохранность, или нет. В качестве примера адъювантов, которые могут применяться в энзиматической композиции по изобретению, можно отметить сорбит, маннит, бензоат, неорганические соли или растительные масла. Энзиматическая композиция может находиться в жидком виде, при этом композиция и содержащаяся в ней фитаза находится в водном растворе либо в твердом виде, при этом композиция и содержащаяся в ней фитаза лиофилизована в виде порошка. В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения энзиматическая композиция включает, наряду с фитазой по изобретению, еще, по меньшей мере, один дополнительный фермент. Этот дополнительный фермент может обладать фитазной активностью либо обладать не фитазной, а другой активностью. Если такой дополнительный фермент обладает фитазной активностью, то эта фитазная активность предпочтительно отличается от фитазной активности фитазы по изобретению и дополняет ее. Если такой дополнительный фермент обладает не фитазной, а другой активностью, то это может быть, к примеру, ксиланазная, целлюлазная, -глюканазная, ламинариназная, ферулатэстеразная, пуллуланазная,протеазная, амидазная, фосфатазная или манназная активность. Предпочтительно данные энзиматические композиции предназначаются для введения в корма для домашних животных, в особенности животных с неразделенным желудком, предпочтительно свиней или птиц. Настоящее изобретение также касается кормовой композиции, включающей, по меньшей мере, одну фитазу по изобретению. Термин "кормовая композиция", в основном, служит для обозначения корма, предназначенного для домашних животных, в особенности животных с неразделенным желудком, предпочтительно свиней или птиц. Кормовая композиция по изобретению теоретически представляет собой корм, предназначенный для домашних животных, с добавлением энзиматической композиции по изобретению. Следовательно,-9 007461 кормовая композиция по изобретению представляет собой корм для домашних животных, в который добавлена, по меньшей мере, одна энзиматическая композиция по изобретению, при этом данный корм и данную энзиматическую композицию смешивают таким образом, чтобы получить кормовую композицию. В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения данные кормовые композиции включают, по меньшей мере, один трансформированный организм хозяина по изобретению. В следующем предпочтительном воплощении изобретения данные кормовые композиции включают, по меньшей мере, один организм, содержащий полинуклеотид по изобретению, в частности, по меньшей мере, один гриб из рода Penicillium, в особенности гриб штамма Penicillium sp. CBS 109899. Предпочтительно кормовые композиции по изобретению предназначаются для кормления животных с неразделенным желудком. В предпочтительном воплощении изобретения данные кормовые композиции предназначаются для кормления свиней. В другом предпочтительном воплощении изобретения данные кормовые композиции предназначаются для кормления домашних птиц. Предметом настоящего изобретения также является способ получения кормовой композиции, описанной выше. В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения данный способ заключается в культивировании организма хозяина по изобретению или организма, содержащего полинуклеотид по изобретению, в частности гриб, точнее гриб из рода Penicillium, в особенности гриб штамма Penicillium sp. CBS 109899, в концентрировании данного организма любым методом, известным в этой области, в частности фильтрации или центрифугирования, а затем во включении данных концентрированных организмов в кормовую композицию. В соответствии с другим предпочтительным воплощением изобретения данный способ заключается в получении экстракта, обладающего фитазной активностью, или фитазы по изобретению одним из способов получения экстракта или фитазы, описанных выше, а затем во включении данного экстракта или данной фитазы в кормовую композицию. Настоящее изобретение также касается способа повышения усваивания неорганического фосфата,содержащегося в фитиновой кислоте растительных кормов, у животных с неразделенным желудком, в котором в рацион данных животных включается фитаза или энзиматическая композиция по изобретению. Предпочтительно в данном способе животным с неразделенным желудком скармливают кормовую композицию по изобретению. Изобретение также касается способа уменьшения введения фосфора животным с неразделенным желудком, в котором данным животным скармливают кормовую композицию по изобретению. Изобретение также касается способа уменьшения выброса фосфора, происходящего из рациона животных с неразделенным желудком, в котором данным животным скармливают кормовую композицию по изобретению. Настоящее изобретение также касается нитчатого гриба из рода Penicillium, имеющего депозитный номер CBS 109899. Нижеследующие примеры служат для иллюстрации осуществляемости настоящего изобретения, не ограничивая, однако, его сферу действия. Пример 1. Характеристики и культивирование штамма Penicillium sp. CBS 109899. 1.1. Характеристики. На агаризованной среде PDA (24 г/л картофельного бульона, 16 г/л агар-агара) мицелий штаммаCBS 109899 развивается при 30 С и после созревания имеет желтый цвет. Воздушный мицелий наблюдается по периферии колонки и не имеет характерных для Penicillium структур. После культивирования гриба в жидкой среде MN-Uri (P.J. Punt and C.A.M.J.J. van den Hondel (1992) Methods in Enzymology 216,447-457) при 28 С в течение 2 дней со встряхиванием мицелий собирали фильтрованием и измельчали в жидком азоте. Экстракцию геномной ДНК проводили фенол-хлороформным методом, хорошо известным в этой области, используя 1 г измельченного материала в 5 мл буфера для лизиса (1% SDS, 2% тритон Х-100, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис, рН 8,0). После выделения геномную ДНК осаждали добавлением 2 объемов этанола. Проводили ПЦР-амплификацию, используя высокоточную полимеразу и праймеры PN3 (SEQ ID NO: 5) и PN4 (SEQ ID NO: 6) для получения фрагмента в 1175 п.о., который подвергали секвенированию (SEQ ID NO: 7).PN4: 5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3' Совмещение последовательности этого транскрибируемого изнутри спейсера с имеющимися в банках данных последовательностями ITS показало тождественность на 96% с последовательностью ITS, идентифицированной как принадлежащей Penicillium aculeatum, и тождественность на 96% с последовательностьюITS штамма IMI 134756 Penicillium funiculosum. Поэтому штамм CBS 109899 поименован Penicillium sp. 1.2. Условия культивирования. Была установлена синтетическая среда для культивирования штамма CBS 109899. Она состоит из 10 г/л глюкозы, 0,1 М NH4NO3, 1,5 г/л KН 2 РO4, 0,5 г/л KCl, 0,5 г/л MgSO4, 10 мг/л МnСl2, 10 мг/л ZnSO4 и 10 мг/л FeSO4 в деминерализованной воде. Для экспрессии фитазы отбирали образец мицелия в 1 см 2 из колонии, выросшей на среде PDA, и инкубировали в 30 мл среды MSP3 (10 г/л глюкозы, 20 г/л фитата кальция,- 10007461 0,5 г/л КСl, 0,5 г/л MgSO4, 2,2 мг/л ZnSO4, 1,1 мг/л Н 3 ВO3, 0,5 мг/л МnСl2, 0,5 мг/л FeSO4, 0,17 мг/л СаСl2,0,16 мг/л CuSO4, 0,15 мг/л Na2MoO4 и 5 мг/л Na2EDTA) в течение 7 дней при 30 С со встряхиванием. Культуру центрифугировали 10 мин при 5000 об./мин и супернатант анализировали, как описано в примере 2. Пример 2. Измерение фитазной активности. Измерение фитазной активности основывается на методе Shimizu (1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56(8), 1266-1269). Принцип этого метода состоит в измерении количества неорганического фосфата, высвобожденного во время ферментативной реакции фитазы с ее субстратом (раствор фитата натрия в концентрации 10 г/л в 250 мМ ацетатном буфере, содержащем 1 мМ СаСl2, рН 5,5). Количество неорганического фосфата измеряют по реакции этого фосфата с хромогенным реагентом (свежеприготовленная смесь из 1 объема 10,8% сульфата железа и 4 объемов молибдата аммония в 0,012 М H2SO4). Эта реакция в сильнокислой среде ведет к образованию окрашенного фосфомолибдатного комплекса (в присутствииFe2+), количество которого определяется по измерению поглощения окрашенного раствора при 700 нм на спектрофотометре. Для получения энзиматической кинетики выполняются три параллельные реакции продолжительностью в 10, 20 и 30 мин при 37 С. Ферментативные реакции останавливают добавлением 2,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты. Помехи от образца определяются добавлением сначала 20%-ной трихлоруксусной кислоты, а затем фитиновой кислоты в необработанный экстракт, который может быть разбавлен или нет. Холостую пробу для ферментативной реакции готовят на 250 мМ ацетатном буфере, содержащем 1 мМ СаСl2, рН 5,5. После остановки реакций количество высвободившегося фосфата определяют добавлением такого же объема цветного реагента (1 объем FeSO47H2O + 4 объема раствора гептамолибдата аммония). Интенсивность синей окраски измеряют на спектрофотометре при 700 нм. Ее зависимость от концентрации фосфата устанавливают с помощью КН 2 РО 4 в интервале от 0 до 1 мМ. Ферментативную активность определяют по скорости появления фосфата в ходе энзиматической кинетики. Пример 3. Получение клеточного экстракта, содержащего фитазную активность. Штамм CBS 109899 культивировали в масштабе лабораторной конической колбы и в ферментерах объемом от 3 до 200 л при 30 С в течение 6-8 дней. Продукционная среда состояла из 10 г/л глюкозы, 40 г/л крахмала, 25 г/л рисовых отрубей, 20 г/л Са 2+-фитата, 15 г/л хлорида аммония, 0,5 г/л сульфата аммония и 0,9 г/л пеногасителя. Значение рН доводили до 5,5, однако, его не контролировали во время культивирования. Для запуска ферментации использовали 4%-ный инокулят. Такой инокулят соответствует культуре, выращенной за 3-4 дня при 30 С в среде, состоящей из 10 г/л глюкозы, 10 г/л пептона, 5 г/л NaCMC, 0,5 г/л сульфата магния, 0,5 г/л хлорида кальция, 0,01 г/л FeSO47H2O и 0,01 г/л MnSO44H2O. Инокулят получают при непосредственном посеве спор или кусочка агара (среда PDA, 10 дней при 30 С), на котором культивировали гриб. Для посева также можно использовать и 3-4-дневную культуру, полученную в тех же условиях. По окончании ферментации всю культуру фильтровали и фильтрат концентрировали путем ультрафильтрации через органическую или неорганическую мембрану с пределом исключения в 10 кД. Активность определяли в образце концентрированного ультрафильтрата и пересчитывали на исходный объем ферментации. Таблица 1 Активности, полученные по окончании ферментации, и их зависимость от объема ферментации Пример 4. Характеристики выделенной фитазы по изобретению. В полученном неочищенном клеточном экстракте определяли оптимум рН, температурный оптимум, стабильность в отношении рН и температуры, а также константы Михаэлиса, используя метод, описанный в примере 4. 4.1. Константы Михаэлиса. Константу Михаэлиса-Ментен (Kmкаж) и максимальную скорость реакции (Vmкаж) определяли при варьировании концентрации субстрата и времени инкубации. Содержащаяся в клеточном экстракте фитаза характеризуется значением Kmкаж=550 мкМ и Vmкаж=1,425 мкмоль фосфата за 1 мин в 1 мг образца. 4.2. Фитазная активность в зависимости от рН. Оптимум рН измеряли при варьировании значения рН и/или природы буфера для реакции (при рН 2: буфер KСl-НСl; при рН 3: буфер глицин-HCl; при рН 4, 5, 5,5 и 6: натрий-ацетатный буфер; при рН 7: буфер трис-HCl). Приведенные на фиг. 1 результаты представляют относительную активность в пересче- 11007461 те на максимальную ферментативную активность. Оптимум рН содержащейся в клеточном экстракте фитазы, измеренный при 37 С, находится между рН 4 и рН 5. 4.3. Фитазная активность в зависимости от температуры. Температурный оптимум измеряли при варьировании температуры инкубации для ферментативных реакций. Полученные данные, приведенные на фиг. 1, представляют относительную активность в пересчете на максимальную ферментативную активность. Температурный оптимум содержащейся в клеточном экстракте фитазы, измеренный при рН 5,5, находится в районе 50 С. 4.4. Стабильность фитазы в зависимости от рН. Определяли устойчивость фитазной активности к кислым значениям рН. После обработки экстракта при значениях рН от рН 2 до рН 6,5 при 41 С в течение от 0 до 180 мин значения рН растворов стабилизировали на уровне рН 5,5 путем разбавления. Затем определяли активность методом, описанным в примере 2. Результаты показывают, что фитазная активность экстракта относительно стабильна вплоть до рН 3,5. Однако она быстро денатурирует при более кислых значениях рН, в особенности при рН 2. 4.5. Стабильность фитазы в зависимости от температуры. Определяли термостабильность фитазной активности при температурах, больших или равных 60 С. Разбавленный раствор экстракта(конечная концентрация 1 Ед/мл) выдерживали при требуемой температуре в течение определенного времени (не превышающего 30 мин). После возвращения к комнатной температуре в каждом из подвергнутых тепловой обработке растворов определяли активность в соответствии с методом,описанным в примере 2. Начиная с 5 мин при 60 С, когда фитазная активность снижалась примерно на 80%, она уменьшалась практически до нуля после 1 мин при 80 С, в условиях проведения экспериментов. Пример 5. Очистка фитазы по изобретению. Клеточный ферментный экстракт, полученный в примере 3, концентрировали при помощи ультрафильтрации, используя мембрану с пределом исключения в 10 кД. Ионную силу и рН экстракта доводили посредством нескольких промывок в 20 мМ глициновом буфере, рН 3. Проводили катионообменную хроматографию, нанося полученный концентрат на колонку SP10(PerSeptive BioSystems) при постоянном значении рН 3. Удерживаемые на колонке белки элюировали при помощи ступенчатого градиента NaCl от 0 до 1 M в глициновом буфере при скорости потока 3 мл/мин. Получали пик фитазной активности примерно при 30% 1 М NaCl. Фитазу отделяли от других компонентов пика активности путем гель-фильтрации на колонке HR2000 (Pharmacia) в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5, при скорости потока 0,7 мл/мин. Чистоту собранных фракций оценивали методом электрофореза в неденатурирующем полиакриламидном геле с окрашиванием серебром. На геле была только одна полоса белка с расчетным молекулярным весом в 130 кД. Однако после электрофореза в SDS-PAGE наблюдались 2 полипептидные полосы: одна основная полоса при относительном расстоянии миграции в 70 кД и другая второстепенная полоса при относительном расстоянии миграции в 90 кД. Пример 6. Микросеквенирование очищенной фитазы. 6.1. Определение N-концевой последовательности. Полипептиды, соответствующие полипептидным полосам в 70 и 90 кД, полученным при электрофорезе в SDS-PAGE, переносили на мембрану из PVDF (ProBlott, Applied Biosystems) в течение 15 ч при 4 С. Полипептиды выявляли по окрашиванию амидочерным 10 В (Sigma) и подвергали секвенированию(Institut Pasteur, Лаборатория микросеквенирования белков, Париж). N-концевые последовательности были одинаковы у двух полипептидных полос (SEQ ID NO: 8). Этот результат привел к заключению, что две полипептидные полосы, обнаруженные при SDSPAGE, вероятно, соответствуют одному и тому же полипептиду, а различия в скорости миграции, возможно, происходят от частичной деградации части полипептида на стадии очистки. 6.2. Определение аминокислотной последовательности внутренних фрагментов фитазы. Два полипептида в 70 и 90 кД разделяли методом электрофореза в SDS-PAGE и выявляли по окрашиванию амидочерным. Полосу полипептида в 70 кД вырезали из геля и полипептид подвергали расщеплению in situ с помощью фермента Endolysine-C в течение 18 ч при 37 С. Пептидные фрагменты разделяли методом HPLC на колонке С 18 DEAE. При микросеквенировании были получены последовательности 4 внутренних фрагментов (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12).SEQ ID NO: 12: APGLVR Пример 7. Получение молекулярного зонда, относящегося к фитазе Penicillium sp. CBS 109899. После микросеквенирования из пептидов были рассчитаны олигонуклеотиды для амплификации методом ПЦР фрагмента ДНК, относящегося к гену, кодирующему фитазу Penicillium sp. CBS 109899. 7.1. Разработка праймеров для ПЦР. Праймеры были рассчитаны из N-концевой аминокислотной последовательности и внутренней последовательности SEQ ID NO: 9. Из N-концевой последовательности были рассчитаны 4 набора смысловых вырожденных праймеров, а из внутренней последовательности SEQ ID NO: 9 был расчитан 1 набор- 12007461 обратных вырожденных праймеров. Каждый из наборов смысловых праймеров использовали по отдельности с набором обратных праймеров. 7.2. Амплификация фрагмента геномной ДНК, относящегося к фитазе. Сначала Penicillium sp. CBS 109899 культивировали в жидкой среде MN-Uri (28C, 180 об./мин, 2 дня). Мицелий собирали фильтрованием и измельчали в жидком азоте. Проводили экстракцию геномной ДНК в 5 мл буфера для лизиса (1% SDS, 2% тритон X-100, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ трис, рН 8,0) и 5 мл фенола на 1 г измельченного материала. После очистки водной фазы путем экстракции фенол/хлороформом и хлороформом геномную ДНК осаждали добавлением 2 объемов этанола. Реакции ПЦР проводили с использованием 100 нг геномной ДНК на 1 единицу полимеразы Taq (QBIOgene) на термоциклизаторе MJ Research модель РТС-200. Продукты каждой реакции ПЦР анализировали на 0,8% агарозном геле. Получили нуклеотидный фрагмент в районе 850 п.о., соответствующий паре праймеров ОТ ACS 17 Р 4.4 (SEQ ID NO: 13) и ОТ ACS 25 Р 6.1 (SEQ ID NO: 14), который субклонировали прямо в вектор pCR4-TOPO (Invitrogen) и просеквенировали (SEQ ID NO: 15). Анализ последовательности показал, что два праймера, использовавшиеся для амплификации, находятся по обе стороны от амплифицированного фрагмента и что выведенные аминокислотные последовательности, следующие за ними, соответствуют тем, что получены при микросеквенировании фитазы. Кроме того, аминокислотные последовательности внутренних пептидных фрагментов SEQ ID NO: 10 иSEQ ID NO: 11 входят в аминокислотную последовательность, выведенную из фрагмента ДНК. Эти наблюдения привели к заключению, что амплифицированный фрагмент ДНК соответствует микросеквенированной фитазе, и его назвали ОТ ACS 29.1. Затем этот фрагмент ДНК использовали в качестве гомологичного молекулярного зонда для клонирования гена, кодирующего очищенную фитазу. ОТ ACS 17 Р 4.4 (SEQ ID NO: 13): 5'-ACNGAYCCNCARGTCCC ОТ ACS 25 P6.1 (SEQ ID NO: 14): 5'-GCNGTCCAYTCRTTNAC Пример 8. Клонирование и характеристика гена, кодирующего фитазу Penicillium sp. CBS 109899. 8.1. Определение последовательности кДНК, относящейся к фитазе. Полную последовательность кДНК получали путем амплификации, субклонирования и секвенирования ее 5'- и 3'-концов в соответствии с методом 5'- и 3'-RACE-PCR. Сначала Penicillium sp. CBS 109899 культивировали в условиях индукции фитазы в среде, состоящей из 40 г/л крахмальной муки, 25 г/л рисовых отрубей, 20 г/л фитата кальция, 10 г/л глюкозы, 15 г/лNH4Cl и 0,5 г/л MgSO47H2O, pH 5,5, с добавлением 0,06 г/л глюкоамилазы AMG 300 L (Novozymes) и 0,18 г/л -амилазы Termamyl 120 L (Novozymes). Культивирование продолжали до достижения фитазной активности в 10 единиц на 1 мл культуральной среды. Мицелий собирали фильтрованием культуры через фильтровальную бумагу (Whatman), а затем измельчали в жидком азоте. Экстрагировали тотальную РНК из измельченного материала путем экстракции фенолом в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,3, содержащем 10 мМ ЭДТА. Затем мРНК подвергали обратной транскрипции с помощью набора GeneRacer(Invitrogen). Синтезированная кДНК имела заданную последовательность на 5'- и 3'-концах для последующей ПЦР-амплификации. Чтобы специфически амплифицировать концы требуемой кДНК, были составлены 2 праймера: один, направленный на 5'-конец и названный ОТ ACS 37 P1 (SEQ ID NO: 20), a другой на 3'-конец и названный ОТ ACS 37 Р 3 (SEQ ID NO: 21), исходя из молекулярного зонда в участке, относящемся к пептидной последовательности SEQ ID NO: 10. Реакции ПЦР проводили с использованием 1 мкл продукта синтеза кДНК на 1 единицу полимеразыTaq (Q-BIOgene) на термоциклизаторе MJ Research модель РТС-200. Продукты амплификации анализировали на 0,8% агарозном геле. Фрагмент в районе 0,3 т.п.о., относящийся к 5'-концу, и другой в районе 1,7 т.п.о., относящийся к 3'-концу, клонировали непосредственно в вектор pCR4-TOPO (Invitrogen), а затем секвенировали. Затем была воспроизведена последовательность всей кДНК (SEQ ID NO: 2). ОТ ACS 37 P1 (SEQ ID NO: 20): 5'-GGCGCTCCGTTCCTTGCGCAAAC-3' ОТ ACS 37 P3 (SEQ ID NO: 21): 5'-GTAGGTCGGCTGGGAATAGATCG-3' 8.2. Сублонирование содержащего ген EcoRV-фрагмента геномной ДНК. Фрагмент геномной ДНК клонировали методом продвижения по геному. Сначала лигировали адаптер по концам рестрикционного фрагмента от EcoRV. Для этого продукт расщепления геномной ДНКLaboratory, Inc.) с помощью ДНК-лигазы Т 4 в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,5, содержащем 10 мМ MgCl2,10 мМ дитиотреитола, 1 мМ АТФ и 0,25 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, в течение 15 ч при 16 С. Реакцию останавливали тепловой обработкой при 70 С и реакционную смесь разбавляли в 200 мкл ультрачистой воды. Для амплификации методом ПЦР 5'- и 3'-участков рестрикционного фрагмента от EcoRV были составлены 2 смысловых праймера, исходя из молекулярного зонда: один, направленный на 5'-конец и названный ОТ ACS 32 Р 5 (SEQ ID NO: 16), а другой на 3'-конец и названный ОТ ACS 32 Р 3 (SEQ ID NO: 17). Обратный праймер под названием Adaptor Primer (Clontech Laboratory, Inc.), использовавшийся для реакций ПЦР, соответствовал последовательности 5'-конца адаптера. Реакции ПЦР проводили с использованием 1 мкл продукта лигирования на 1 единицу смеси поли- 13007461 мераз Advantage Genomic Polymerase Mix (Clontech Laboratory, Inc.), на термоциклизаторе MJ Research модель РТС-200. Продукты каждой реакции ПЦР анализировали на 0,8% агарозном геле. Два фрагмента, один в районе 1,8 т.п.о., относящийся к 5'-концу, и другой в районе 1,3 т.п.о., относящийся к 3'-концу, субклонировали и анализировали путем секвенирования. После получения 5'- и 3'нуклеотидных последовательностей EcoRV-фрагмента были составлены праймеры, специфичные к концам, названные ОТ ACS 38 P1 (SEQ ID NO: 18) и ОТ ACS 38 P2 (SEQ ID NO: 19). Фрагмент амплифицировали во всей полноте с помощью высокоточной полимеразы. Реакцию ПЦР проводили с использованием 100 нг геномной ДНК Penicillium sp. CBS 109899 на 1 единицу ДНК-полимеразы Platinum Pfx (LifeTechnologies, Inc.) на термоциклизаторе MJ Research модель РТС-200. Продукт амплификации анализировали на 0,8% агарозном геле. Фрагмент в 3,8 т.п.о. субклонировали непосредственно в вектор pCR4TOPO (Invitrogen), секвенировали (SEQ ID NO: 1) и назвали ОТ ACS 38.1. 8.3. Анализ последовательности кДНК и гена. Исходя из кДНК, выводили аминокислотную последовательность и анализировали (SEQ ID NO: 3). Все последовательности внутренних пептидов фитазы, полученные при микросеквенировании, обнаруживались в этой аминокислотной последовательности, подтверждая, что просеквенированная кДНК соответствует требуемой фитазе. Кроме того, выведенная аминокислотная последовательность содержит специфические сайты для связывания (RHGXRXP, где X - любая аминокислота; SEQ ID NO: 24) и нуклеофильной атаки (HD) фосфатов, которые характеризуют фитазу как принадлежащую к группе гистидиновых кислых фосфатаз. Совмещение последовательности кДНК с последовательностью фрагмента геномной ДНК ОТ ACS 38.1 дает возможность определить точные границы данного гена и локализовать содержащиеся в нем интроны. Пример 9. Поиск гомологичных последовательностей. 9.1. Получение космидной библиотеки из штамма IMI 134756 Penicillium funiculosum.P. funiculosum IMI 134756 культивировали в жидкой среде MN-Uri (28C, 180 об./мин, 2 дня). Мицелий собирали фильтрованием и измельчали в жидком азоте. Проводили экстракцию геномной ДНК в 5 мл буфера для лизиса (1% SDS, 2% тритон X-100, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ трис, рН 8,0) и 5 мл фенола на 1 г измельченного материала. После очистки водной фазы фенол/хлороформом и хлороформом геномную ДНК осаждали добавлением 2 объемов этанола. Продукт частичного расщепления 20 мкг геномной ДНК рестрикционным ферментом SalI наносили на агарозный (с низкой температурой плавления) гель, чтобы подвергнуть его импульсному электрофорезу (18 ч, 5 В/см) в буфере 0,5 хТВЕ. После окрашивания бромистым этидием фрагменты ДНК длиной от 30 до 40 т.п.о. извлекали из геля путем расщепления -агаразой (Gibco-BRL) и осаждали этанолом. Порцию этой геномной ДНК лигировали в вектор pMOCosX [Orbach (1994), Gene 150, pp. 159-162],предварительно обработанный XhoI и дефосфорилированный фосфатазой из кишечника теленка. Продукт лигирования, после реакции с элементами фага(Packaging Protocol - Stratagene; Gigapack Gold-11),можно трансфецировать в штамм Q358 Е. coli (Maniatis et al., 1982). После посева на агаризованную среду Луриа и Бертани (LB) с добавлением 50 мкг/мл ампициллина выросшие колонии пересевали в 50 микропланшетов на 96 лунок и культивировали в течение ночи в 150 мкл LB с добавлением 50 мкг/мл ампициллина. Культуры реплицировали на мембраны N+ (Amersham), а затем добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и хранили при -80 С. 9.2. Скринирование космидной библиотеки зондом ОТ ACS 29.1. Анализ геномной ДНК штамма IMI 134756 P. funiculosum методом Саузерн-гибридизации проводили с помощью зонда ОТ ACS 29.1. Мембрану, на которую переносили геномную ДНК, предварительно расщепленную несколькими рестрикционными эндонуклеазами и разделенную методом электрофореза,преинкубировали в буфере для гибридизации (7% SDS, 0,5 М фосфат натрия, рН 7,0) в течение 10 мин при 65 С. Зонд метили [-32P]-dCTP с помощью набора для мечения ДНК (Amersham). Меченый зонд вносили в буфер для гибридизации и эту смесь нагревали 5 мин при 100 С перед употреблением. Гибридизацию проводили в течение 6 ч при 65 С. После гибридизации мембрану промывали 3 раза по 15 мин при 65 С в промывочном буфере (1% SDS, 0,1 М фосфат натрия, рН 7,0), а затем подвергали экспозиции. Этот анализ выявил только один сигнал. Следовательно, в геноме P. funiculosum IMI 134756 содержится только одна копия данного гена. После этого космидную библиотеку скринировали в таких же строгих условиях с помощью зонда ОТ ACS 29.1, который выявил несколько сигналов на мембранах 15, 19 и 48. При этом космида 15F10, относящаяся к мембране 15, была идентифицирована как содержащая последовательность ДНК, гибридизирующейся с зондом ОТ ACS 29.1. Проводили рестрикционный анализ ДНК из этой космиды для того, чтобы определить положение соответствующего гена. Этот ген назвали phyF. Клонирование и секвенирование NcoI-фрагмента в 1,3 т.п.о. из космиды 15F10 показало сильную гомологию с последовательностью ОТ ACS 29.1. Полный ген phyF был локализован на фрагменте EcoRV-EcoRI в 2,7 т.п.о., который клонировали и секвенировали (SEQ ID NO: 4). При анализе последовательности выявлен промоторный участок в 790 п.о. и начало кодирующей- 14007461 Пример 10. Рекомбинантная экспрессия гена, содержащегося в ОТ ACS 38.1 (SEQ ID NO: 1). 10.1. Введение множественных копий гена в P. funiculosum IMI 134756. Для проверки клонированного гена (ОТ ACS 38.1) было решено ввести множественные копии в геном штамма IMI 134756 P. funiculosum, вырабатывающего мало фитазы, и посмотреть, будут ли трансформированные клоны проявлять увеличение продуктивности. Для этого P. funiculosum IMI 134756 котрансформировали в соответствии с методом, описанным в патенте WO 00/68401, плазмидой, содержащей фрагмент ОТ ACS 38.1, и плазмидой pAN7-1 (Punt et al.,1987, Gene, 56: 117-24), позволяющей селекцию на гигромицине. После трансформации проверяли встраивание множественных копий данного гена методом Southern-гибридизации с помощью молекулярного зонда ОТ ACS 29.1. Southern-гибридизацию проводили в соответствии с условиями, описанными в примере 9, используя геномную ДНК кандидатов, расщепленную рестрикционной эндонуклеазой EcoRI. Положительных кандидатов культивировали в условиях индукции фитазы в 50 мл среды, состоящей из 20 г/л фитата кальция, 10 г/л глюкозы, 8 г/л NH4NO3, 5 г/л КСl и 5 г/л MgSO47H2O, с добавлением 1 мл/л раствора микроэлементов (2,2% ZnSO47H2O, 1,1% Н 3 ВО 3, 0,5% МnСl24 Н 2O, 0,5% FeSO47H2O,0,17% СоСl26 Н 2O, 0,16% CuSO45H2O, 0,15% Na2MoO42H2O и 5,0% Na2EDTA, pH 6,5). Фитазную активность в среде измеряли по времени. Результаты, полученные при анализе 2 кандидатов с использованием нетрансформированного P. funiculosum IMI 134756 в качестве контроля, представлены в табл. 2. Таблица 2 Измерения фитазной активности (ед./мл) в культурах 2 кандидатов, состоящих из P. FuniculosumIMI 134756, трансформированного фрагментом ОТ ACS 38.1, и P. funiculosum IMI 134756 дикого типа Измерения фитазной активности в среде показывают, что у двух исследованных кандидатов, у которых в геном встроились множественные копии ОТ ACS 38.1, продукция фитазы возросла в 2-2,5 раза. Этот результат как будто подтвержает, что данный ген, содержащийся во фрагменте ОТ ACS 38.1, кодирует фитазу и что продукция фитазы штаммом Penicillium может быть повышена при увеличении числа копий гена в геноме. 10.2. Экспрессия гена под контролем гетерологичного промотора. Использовали экспрессионную кассету, содержащую промотор и терминатор гена csl31, описанного в патенте WO 00/68401, для экспрессии участка фрагмента геномной ДНК ОТ ACS 38.1, кодирующего данную фитазу. Для этого после введения сайта SwaI в конец промотора экспрессионную кассету расщепляли рестрикционными эндонуклеазами SwaI/SpeI. Кодирующий фитазу участок, содержащийся во фрагменте геномной ДНК ОТ ACS 38.1, амплифицировали с помощью следующих праймеров:phyGoamp5: 5'-ATACTAGTTTAGGACGTAGCATTCTTCGGAATAG-3' (SEQ ID NO: 23) Реакцию ПЦР проводили на термоциклизаторе MJ Research модель РТС-200 с использованием 10 пмоль каждого из праймеров на 1 единицу ДНК-полимеразы Platinum Pfx (Life Technologies, Inc.) в 50 мкл буфера для этой полимеразы (Life Technologies, Inc.). Продукт ПЦР расщепляли рестрикционными эндонуклеазами EcoRV и SpeI и лигировали с вектором рВСМТ. Полученную при этом плазмиду назвали рСР.WO 00/68401, плазмидой, содержащей фрагмент ОТ ACS 38.1, и плазмидой pAN7-1 (Punt et al., 1987,Gene, 56: 117-24), позволяющей селекцию на гигромицине. Встраивание кассеты рСР проверяли методомSouthern-гибридизации с помощью молекулярного зонда ОТ ACS 29.1, используя геномную ДНК 8 кандидатов, расщепленную рестрикционной эндонуклеазой EcoRI. После анализа были отобраны 4 котрансформанта и культивированы в условиях индукции промотора csl31. Проводили анализ на экспрессию гена и измеряли фитазную активность. Отобранные 4 кандидата культивировали в конических колбах на 125 мл в 50 мл минимальной среды с добавлением 1% кукурузного экстракта. Собирали мицелий после культивирования в течение 48 ч и 72 ч при 28 С, 180 об./мин, и проводили анализ каждого образца методом Northern-гибридизации с помощью зонда ОТ ACS 29.1, используя 20 мкг тотальной РНК (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A LaboratoryManual). После отмывки мембраны сигналы проявляли на фосфорадиографе (Molecular Dynamics). Результаты показывают наличие сигнала исключительно у кандидатов, трансформированных рСР,и отсутствие сигнала у нетрансформированного контроля, свидетельствуя, что ген экспрессируется под- 15007461 контролем промотора csl31. Параллельно этому измеряли фитазную активность в супернатантах каждой из культур. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Измерения фитазной активности (ед./мл) в супернатантах культур 4 кандидатов, трансформированных рСР и культивированных в условиях индукции промотора csl31 в течение 48 ч и 72 ч В качестве контроля использовали P. funiculosum IMI 134756. Анализ результатов показывает, что фитазная активность имеется только в супернатантах, соответствующих кандидатам, трансформированным рСР. Такой результат согласуется с экспрессией гена и свидетельствует, что этот фрагмент геномной ДНК содержит ген, кодирующий фитазу. Пример 11. Оптимизация условий культивирования штамма CBS 109899 Penicillium sp. 11.1. Влияние перемешивания на продукцию фитазы. Ферментацию проводили в условиях из примера 3, при этом скорость перемешивания варьировали от 400 до 450 об./мин (табл. 4). Таблица 4 Активности, полученные по окончании ферментации, в зависимости от перемешивания Эти результаты показывают, что усиление перемешивания оказывает отрицательное влияние на продукцию фитазы исходным штаммом CBS 109899 Penicillium sp. 11.2. Влияние источника азота на продукцию фитазы. Ферментацию проводили в условиях из примера 3. Единственным варьируемым параметром был источник азота (рисовые отруби), который заменяли другим источником азота - соевыми отрубями (табл. 5). Таблица 5 Активности, полученные по окончании ферментации, в зависимости от источника азота Эти результаты показывают, что источник азота оказывает влияние на продукцию фитазы исходным штаммом CBS 109899 Penicillium sp.; в частности, соевые отруби как источник азота усиливают продукцию фитазы. 11.3. Влияние источника фитата на продукцию фитазы. Ферментацию проводили в условиях из примера 3. Единственным варьируемым параметром был Са-фитат, который заменяли двойной солью Са и Mg (табл. 6). Таблица 6 Активности, полученные по окончании ферментации, в зависимости от источника фитата Эти результаты показывают, что источник фитата оказывает влияние на продукцию фитазы исходным штаммом CBS 109899 Penicillium sp.; в частности, двойная соль кальция и магния как источник фи- 16007461 тата дает возможность усилить продукцию фитазы по сравнению с солью кальция. 11.4. Влияние содержания фитата на продукцию фитазы. Ферментацию проводили в условиях из примера 3. Единственным варьируемым параметром было содержание фитата в среде ферментации (табл. 7). Таблица 7 Активности, полученные по окончании ферментации, в зависимости от содержания фитата Эти результаты показывают, что продукция фитазы исходным штаммом CBS 109899 Penicillium sp. значительно повышается с увеличением содержания фитата в среде ферментации. Пример 12. Зоотехническая эффективность фитазы, вырабатываемой штаммом CBS 109899 Penicillium sp. 12.1. Влияние дополненного фитазой рациона на усваиваемость фосфора у петухов. Эксперимент проводился на 20 петухах. Животных разделили на 2 группы по 10 петухов: 1 группа подопытных животных и 1 группа контрольных животных, а затем содержали в клетках по одному. Им давали корм на основе кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), с добавлением 702 Ед(международная единица = количество фитазы, способное к образованию 1 мкмоль фосфата за 1 мин при 37 С, рН 5,5, раствор фитата натрия 10 г/л) фитазы на 1 кг корма в группе подопытных животных. Собирали экскременты животных через 2 и 3 дня после начала эксперимента для анализа выделения фосфата. Усваиваемость фосфора соответствует проценту фосфора, усвоенного животными, по сравнению с потребленным количеством. Этот процент вычисляли, исходя из количества, выделенного с экскрементами (табл. 8). Таблица 8 Потребление, выделение и усваиваемость фосфора Результаты в табл. 8 четко показывают, что добавление в основной корм с дефицитом усваиваемого фосфора фитазы по изобретению значительно уменьшает (р 0,05) выделение фосфора. Этот эффект отражает повышение усваиваемости фосфора у животных, получавших корм с добавкой. Он свидетельствует об эффективности фитазы по изобретению в высвобождении неусваиваемого фосфора из потребляемого корма. 12.2. Влияние дополненного фитазой рациона на рост цыплят. Эксперимент проводился на 210 цыплятах породы Ross 308. Животных разделили на 6 групп по 35 цыплят: 4 группы животных, получавших различные дозы фитазы, 1 группа не получавших фитазу животных - отрицательный контроль, и 1 группа животных, получавших неорганический фосфат - положительный контроль. Животных содержали в клетках по 5 цыплят и давали корм в течение 13 дней (с 9 дневного возраста до 22 дней). В основной корм, состоящий из кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), добавляли фитазу в 4 различных концентрациях: 243, 433, 738 и 1234 Ед/кг корма для 4 групп подопытных животных, а также 0,1% неорганического фосфата в виде однозамещенного или двузамещенного фосфата кальция для положительного контроля. Рост оценивали по измерению веса тела животных в начале и в конце эксперимента. Эти измерения дают возможность определить прирост веса и показатель расхода корма (ПРК). Показатель расхода корма соответствует количеству потребленного корма относительно прироста веса. При заданном количестве корма снижение показателя означает увеличение прироста веса животного, то есть лучшее усваивание корма животным. Результаты представлены в табл. 9.- 17007461 Таблица 9 Влияние фитазы на рост цыплят Результаты показывают, что добавление в основной корм с дефицитом усваиваемого фосфора 243,433, 738 и 1234 Ед/кг корма фитазы по изобретению ведет к приросту веса, который повышается в 1,7,2,0, 2,1 и 2,3 раза, соответственно. Самые высокие дозы даже позволяют получить больший прирост веса,чем при добавлении в корм неорганического фосфата. Добавление фитазы в корм также позволяет улучшить показатель расхода корма, в среднем, на 33%. 12.3. Влияние дополненного фитазой рациона на минерализацию костной ткани у цыплят. Эксперимент проводился на 210 цыплятах породы Ross 308. Животных разделили на 6 групп по 35 цыплят: 4 группы животных, получавших различные дозы фитазы, 1 группа не получавших фитазу животных - отрицательный контроль, и 1 группа животных, получавших неорганический фосфат - положительный контроль. Животных содержали в клетках по 5 цыплят и давали корм в течение 13 дней (с 9 дневного возраста до 22 дней). В основной корм, состоящий из кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), добавляли фитазу в 4 различных концентрациях: 243, 433, 738 и 1234 Ед/кг корма для 4 групп подопытных животных, а также 0,1% неорганического фосфата в виде однозамещенного или двузамещенного фосфата кальция для положительного контроля. На 14-ый день у каждого животного извлекали большую берцовую кость. Каждую кость взвешивали,прокаливали и определяли зольность и содержание кальция и фосфора. Результаты представлены в табл. 10. Таблица 10 Влияние фитазы на минерализацию костной ткани у цыплят Эти результаты четко показывают, при всех исследованных концентрациях, положительный эффект добавления в корм фитазы по изобретению на минерализацию костной ткани у цыплят. В частности, фитаза по изобретению усиливает минерализацию кальция и фосфора в костной ткани, а также зольность. Кроме того, наблюдается дозовая зависимость по каждому из исследованных параметров. 12.4. Влияние дополненного фитазой рациона на усваиваемость фосфора и кальция у свиней. Эксперимент проводился на 7 свиньях средним весом примерно 70 кг. У животных хирургическим путем осуществляли илеоректальный анастомоз для того, чтобы можно было количественно собирать содержимое подвздошной кишки. Их содержали по одному в целях эксперимента. Животным давали 3 вида корма на основе кукурузы и сои. Добавление фитазы осуществляли по 300 и 600 Ед/кг корма. Каждое животное адаптировали к корму на протяжении 6 дней. Содержимое подвздошной кишки собирали на 7-oй день, после чего животному меняли корм. Определяли содержание кальция и фосфора в содержимом подвздошной кишки, а затем измеряли усваиваемость этих двух элементов. Результаты представлены в табл. 11. Таблица 11 Влияние фитазы на усваиваемость кальция и фосфора у свиней- 18007461 Добавление в корм фитазы по изобретению значительно повышает усваиваемость кальция и фосфора. Усваиваемость кальция возрастала на 5,6 и 9,3%, соответственно, при добавлении 300 и 600 Ед/кг корма,а усваиваемость фосфора возрастала на 8,4 и 17%, соответственно, при добавлении 300 и 600 Ед/кг корма. 12.5. Влияние дополненного фитазой рациона на усваиваемость фосфора у поросят. Эксперимент проводился на 12 поросятах средним весом примерно 11 кг. Животных разделили на 2 группы по 6 поросят: 1 группа подопытных животных и 1 группа контрольных животных, а затем содержали в клетках по одному. Затем на протяжении 26 дней им давали корм на основе кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), в который добавляли фитазу по 481 Ед/кг корма. Собирали экскременты животных на протяжении 5 дней, начиная с 21-го дня эксперимента, для анализа на содержание фосфора и кальция. Усваиваемость фосфора соответствует проценту фосфора и кальция, усвоенного животными, по сравнению с потребленным количеством. Этот процент вычисляли,исходя из количества, выделенного с экскрементами (табл. 12). Таблица 12 Влияние фитазы на усваиваемость фосфора у поросят Эти результаты показывают, что добавление в корм фитазы по изобретению повышает усваиваемость фосфора на 250% и усваиваемость кальция на 42%. 12.6. Влияние дополненного фитазой рациона на рост поросят. Эксперимент проводился на 12 поросятах средним весом примерно 11 кг. Животных разделили на 2 группы по 6 поросят: 1 группа подопытных животных и 1 группа контрольных животных, а затем содержали в клетках по одному. Затем на протяжении 26 дней им давали корм на основе кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), в который добавляли фитазу по 481 Ед/кг корма. Рост оценивали по измерению веса тела животных в начале и в конце эксперимента. Эти измерения дают возможность определить прирост веса и показатель расхода корма (ПРК). Результаты представлены в табл. 13. Таблица 13 Влияние фитазы на рост поросят Результаты показывают, что добавление в основной корм с дефицитом усваиваемого фосфора 481 Ед/кг фитазы по изобретению ведет к увеличению прироста веса на 24%. Добавление фитазы также значительно уменьшает показатель расхода корма. 12.7. Влияние дополненного фитазой рациона на минерализацию костной ткани у поросят. Эксперимент проводился на 12 поросятах средним весом примерно 11 кг. Животных разделили на 2 группы по 6 поросят: 1 группа подопытных животных и 1 группа контрольных животных, а затем содержали в клетках по одному. Затем на протяжении 26 дней им давали корм на основе кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), в который добавляли фитазу по 481 Ед/кг корма. На 27-ый день эксперимента у каждого животного извлекали большую берцовую кость. Каждую кость взвешивали, прокаливали и определяли зольность и содержание кальция и фосфора. Результаты представлены в табл. 14.- 19007461 Таблица 14 Влияние фитазы на минерализацию костной ткани у поросят Результаты показывают, что добавление в основной корм с дефицитом усваиваемого фосфора 481 Ед/кг фитазы по изобретению ведет к значительному увеличению минерализации костной ткани у поросят. В частности, фитаза по изобретению усиливает минерализацию кальция и фосфора в костной ткани, а также содержание минералов. Перечень последовательностей(b) гомологичного выделенного полинуклеотида, тождественного по меньшей мере на 50% полинуклеотиду по п.(а);(c) выделенного полинуклеотида, комплементарного полинуклеотиду по п.(а) или (b);(d) фрагмента, состоящего по меньшей мере из 100 нуклеотидов полинуклеотида по пп.(а), (b) или(с), кодирующего активный фрагмент фитазы. 2. Полинуклеотид по п.1, представленный последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. 3. Полинуклеотид по п.1, представленный последовательностью SEQ ID NO: 4. 4. Полинуклеотид по одному из пп.1-3, происходящий из гриба рода Penicillium, например Penicillium sp. с депозитным номером CBS 109899. 5. Выделенный полинуклеотид, включающий полинуклеотид по одному из пп.1-4. 6. Фитаза, кодируемая полинуклеотидом по одному из пп.1-5. 7. Фитаза, выбранная из группы, состоящей из:(b) гомологичной фитазы, тождественной по меньшей мере на 35% фитазе по п.(а);(c) активного фрагмента фитазы по п.(а) или (b), обладающего фитазной активностью, эквивалентной активности указанной фитазы. 8. Фитаза по любому из пп.6 или 7, происходящая из гриба рода Penicillium. 9. Фитаза по п.8, происходящая из штамма CBS 109899 Penicillium sp. 10. Химерный ген, включающий функционально связанные друг с другом, по меньшей мере:(b) полинуклеотид по одному из пп.1-5;