Промоторные последовательности вируса желтого скручивания листьев цестровых и способы их применения

006761 Настоящее изобретение относится к новым последовательностям ДНК, которые функционируют в качестве промоторов транскрипции связанных с ними нуклеотидных последовательностей в растениях. Более конкретно, изобретение относится к новым промоторам, которые обеспечивают конститутивную экспрессию связанных с ними представляющих интерес последовательностей. В области сельского хозяйства постоянно существует необходимость в модификации растений в соответствии с определенными потребностями. Одним из путей решения этой задачи является применение современных методов генной инженерии. Например, в результате введения в растение представляющего интерес гена растение можно специфически модифицировать таким образом, чтобы оно приобрело требуемый фенотипический признак. Для этого, как правило, растения трансформируют гетерологичным геном, который включает промоторную область, кодирующую область и терминирующую область. При генетическом конструировании гетерологичного гена, предназначенного для экспрессии в растениях, решающим фактором является выбор промотора. В то время как для некоторых генов целесообразно, чтобы их экспрессия происходила только в ответ на воздействие определенных стимулов или была сосредоточена в определенных типах клеток или тканях, для других генов более предпочтительной является конститутивная экспрессия, т.е. экспрессия, которая происходит в растении постоянно и в большей части тканей и органов. Ранее для конститутивной экспрессии гетерологичных генов в растениях широко использовали промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (промотор 35S CaMV). Однако существуют ситуации, когда требуется применять альтернативные промоторы. В соответствии с этим основной задачей настоящего изобретения является создание таких альтернативных промоторов для экспрессии в растениях представляющей интерес нуклеотидной последовательности. В изобретении предложены также рекомбинантные молекулы ДНК, экспрессионные векторы и трансгенные растения, содержащие промоторы по настоящему изобретению. В соответствии с вышеизложенным в изобретении предложена последовательность ДНК, обладающая способностью осуществлять экспрессию связанной с ней нуклеотидной последовательности, где указанную последовательность ДНК можно получать из генома вируса желтого скручивания листьев цестровых (CmYLCV). Предпочтительной является последовательность ДНК, которую можно получать из промотора первичного транскрипта CmYLCV и которая включает нуклеотидную последовательность,представленную в SEQ ID NO:1. В частности, предложены следующие последовательности ДНК:ID NO:6, в частности, когда указанная выше последовательность ДНК включает нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. Изобретение относится также к последовательностям ДНК, включающим фрагмент, включающий по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов, предпочтительно включающий от примерно 400 оснований до примерно 650 оснований, более предпочтительно от примерно 200 оснований до примерно 400 оснований и наиболее предпочтительно примерно 350 оснований SEQ ID NO:1, при этом последовательности ДНК обладают способностью обеспечивать экспрессию связанных с ними нуклеотидных последовательностей. Согласно одному из конкретных вариантов осуществления последовательность фрагмента, включающего по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов, предпочтительно включающая от примерно 400 оснований до примерно 650 оснований, более предпочтительно от примерно 200 оснований до примерно 400 оснований и наиболее предпочтительно примерно 350 оснований, по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно на 95% идентична последовательности фрагмента, включающего по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов, предпочтительно включающего от примерно 400 оснований до примерно 650 оснований, более предпочтительно от примерно 200 оснований до примерно 400 оснований и наиболее предпочтительно примерно 350 оснований SEQ ID NO:1. Изобретение относится также к рекомбинантным молекулам ДНК, которые включают область промотора первичного транскрипта, выделенную из вируса желтого скручивания листьев цестровых. Кроме того, в изобретении предложены рекомбинантные молекулы ДНК и кассеты экспрессии ДНК, которые включают последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с представляющей ин-1 006761 терес нуклеотидной последовательностью. Изобретение относится также к экспрессионным векторам ДНК, которые включают рекомбинантную ДНК и кассеты экспрессии соответственно. В частности, предложены рекомбинантные молекулы ДНК и кассеты экспрессии ДНК, в которых представляющая интерес нуклеотидная последовательность включает кодирующую область, прежде всего- кодирующую последовательность, которая кодирует требуемый фенотипический признак,- кодирующую последовательность, которая кодирует ген селектируемого или пригодного для скрининга маркера,- кодирующую последовательность, которая кодирует протеин, обусловливающий устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, толерантность к гербицидам, повышенную питательную ценность, улучшенные характеристики при промышленной переработке или измененную репродуктивную способность,- кодирующую последовательность, которая кодирует протеин, придающий позитивное избирательное преимущество клеткам, трансформированным указанной кодирующей последовательностью,- кодирующую последовательность, которая кодирует протеин, придающий метаболическое преимущество клеткам, трансформированным указанной кодирующей последовательностью, которое заключается в способности осуществлять метаболизм соединения, где соединение представляет собой маннозу или ксилозу или их производное или предшественник, или субстрат протеина, или который может метаболизироваться клетками, трансформированными кодирующей последовательностью, с образованием такого субстрата,- кодирующую последовательность, которая кодирует фермент, выбранный из группы, включающей ксило-изомеразы, фосфоманно-изомеразу, маннозо-6-фосфат-изомеразу, маннозо-1-фосфатизомеразу, фосфоманно-мутазу, маннозо-эпимеразу, маннозо- или кислозо-фосфатазу, маннозо-6 фосфатазу, маннозо-1-фосфатазу и маннозо- или ксилозо-пермеазу,- кодирующую последовательность, которая кодирует фосфоманнозо-изомеразу,- кодирующую область, которая является нетранслируемой,- нетранслируемую кодирующую область из вирусного генома, в частности из TSWV (вируса пятнистого увядания томатов), более предпочтительно из NP-гена TSWV,- кодирующую последовательность, которая кодирует в растениях важные с коммерческой точки зрения ферменты или метаболиты,- кодирующую последовательность, которая находится в антисмысловой ориентации. Изобретение относится также к экспрессионным векторам ДНК, которые включают указанные выше последовательность ДНК или рекомбинантную молекулу ДНК. В конкретном варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор ДНК представляет собой pNOV2819 или pNOV2819. Кроме того, изобретение относится к экспрессионным векторам ДНК, которые включают первую последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, и вторую последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения указанные выше экспрессионные векторы ДНК обладают способностью изменять экспрессию вирусного генома. Согласно еще одному конкретному варианту осуществления указанный выше экспрессионный вектор ДНК включает первую последовательность ДНК, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию в клетке фрагмента смысловой РНК вирусного генома или его часть, и вторую последовательность ДНК, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию в клетке фрагмента антисмысловой РНК вирусного генома или его часть, причем фрагмент смысловой РНК и фрагмент антисмысловой РНК обладают способностью образовывать двухцепочечную РНК. В изобретении предложены экспрессионные векторы, отличающиеся тем, что- вирус выбирают из группы, включающей тосповирусы, потивирусы, потексвирусы, тобамовирусы, лутеовирусы, кукумовирусы, бромовирусы, клостеорвирусы, томбусвирусы и фуровирусы,- последовательности ДНК включают нуклеотидную последовательность, происходящую из гена протеина вирусной оболочки, гена вирусного нуклеокаспидного протеина, гена вирусной репликазы или гена протеина, обеспечивающего движение вируса, или их частей,- последовательность ДНК получают из вируса пятнистого увядания томатов (TSWV),- последовательность ДНК получают из гена нуклеокапсидного протеина. Изобретение относится также к клеткам-хозяевам, стабильно трансформированным последовательностью ДНК, рекомбинантной молекулой ДНК или экспрессионным вектором ДНК по изобретению. В частности, где- клетка-хозяин представляет собой бактерию,- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку,- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку, выбранную из группы, включающей клетки риса, кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи, сладкого картофеля, сахарной кукурузы, бобов, гороха,цикория, салата, капусты, цветной капусты, брокколи, турнепса, редиса, шпината, спаржи, лука, чеснока,-2 006761 перца, сельдерея, тыквы крупноплодной, тыквы пепо, конопли, цуккини, яблони, груши, айвы, дыни,сливы, вишни, персика, нектарина, абрикоса, земляники, винограда, малины, ежевики, ананаса, авокадо,папайи, манго, банана, сои, томатов, сорго, сахарного тростника, сахарной свеклы, подсолнечника, рапса,клевера, табака, моркови, хлопчатника, люцерны, картофеля, баклажана, огурца, Arabidopsis thaliana и древесных растений, таких как хвойные и лиственные деревья, но прежде всего, риса, кукурузы, пшеницы, ячменя, капусты, цветной капусты, перца, тыквы крупноплодной, дыни, сои, томатов, сахарной свеклы, подсолнечника или хлопчатника, предпочтительно риса, кукурузы, пшеницы, Sorghum bicolor, ежи сборной, сахарной свеклы и сои,- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку двудольного растения,- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку двудольного растения, выбранного из группы, включающей сою, хлопчатник, табак, сахарную свеклу и масличный рапс,- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку однодольного растения,- клетка-хозяин представляет собой растительную клетку однодольного растения, выбранного из группы, включающей кукурузу, пшеницу, сорго, рожь, овсы, газонную траву, рис и ячмень. Кроме того, изобретение относится к растениям и их потомству, включая семена, стабильно трансформированным последовательностью ДНК, рекомбинантной молекулой ДНК или экспрессионным вектором ДНК по изобретению. В частности, где- растения выбирают из группы, включающей рис, кукурузу, пшеницу, ячмень, рожь, сладкий картофель, сахарную кукурузу, бобы, горох, цикорий, салат, капусту, цветную капусту, брокколи, турнепс,редис, шпинат, спаржу, лук, чеснок, перец, сельдерей, тыкву крупноплодную, тыкву пепо, коноплю, цуккини, яблоню, грушу, айву, дыню, сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, землянику, виноград, малину, ежевику, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, томаты, сорго, сахарный тростник, сахарную свеклу, подсолнечник, рапс, клевер, табак, морковь, хлопчатник, люцерну, картофель, баклажан, огурец,Arabidopsis thaliana и древесные растения, такие как хвойные и лиственные деревья, но прежде всего рис,кукурузу, пшеницу, ячмень, капусту, цветную капусту, перец, тыкву крупноплодную, дыню, сою, томаты, сахарную свеклу, подсолнечник или хлопчатник, предпочтительно рис, кукурузу, пшеницу, Sorghum- применение последовательности ДНК по изобретению для экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности,- способ получения последовательности ДНК по изобретению, где ДНК получают с помощью полимеразной цепной реакции, причем по меньшей мере один из применяемых олигонуклеотидов включает последовательность нуклеотидов, представляющую собой фрагмент, включающий 15, 18, 20, 22, 24 или более последовательных пар оснований SEQ ID NO:1. С целью более ясного и правильного понимания описания и формулы изобретения ниже представлены следующие определения:CmYLCV: вирус желтого скручивания листьев цестровых. Перестройка ДНК: перестройка ДНК представляет собой метод, предназначенный для быстрой,простой и эффективной интродукции перераспределений, предпочтительно случайным образом, в молекулу ДНК или для получения обменов последовательностями ДНК между двумя или большим количеством молекул ДНК, предпочтительно случайным образом. Молекула ДНК, полученная в результате перестройки ДНК, является перестроенной молекулой ДНК, которая представляет собой не встречающуюся в естественных условиях молекулу ДНК, полученную на основе по меньшей мере одной молекулы ДНКматрицы. Экспрессия: обозначает транскрипцию и/или трансляцию эндогенного гена или трансгена в растениях. В случае, например, антисмысловых конструкций понятие "экспрессия" может относиться к транскрипции только антисмысловой ДНК. Функционально эквивалентная последовательность: обозначает последовательность ДНК, которая обладает промоторной активностью, практически аналогичной активности промотора первичного транскрипта CmYLCV или его части и которая гибридизуется в строгих условиях с указанными промоторными последовательностями. Ген: обозначает кодирующую последовательность и связанную с ней регуляторную последовательность, причем кодирующая последовательность транскрибируется с образованием РНК, такой как мРНК,рРНК, тРНК, snPHK (М.я.РНК), смысловая РНК или антисмысловая РНК. Примерами регуляторных последовательностей являются промоторные последовательности, 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности и терминирующие последовательности. Могут присутствовать другие элементы, например, интроны. Представляющий интерес ген: обозначает любой ген, который при переносе в растение придает растению требуемое свойство, такое как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, толерантность к гербицидам, повышенную питательную ценность, улучшенные характеристики при промышленной переработке или измененную репродуктивную способность. Представляющий интерес ген может также-3 006761 представлять собой ген, который переносят в растения для получения в них ценных с коммерческой точки зрения ферментов или метаболитов. Гетерологичный: в контексте настоящего описания обозначает отличный от встречающегося в естественных условиях или синтетического происхождения. Например, если клетку-хозяина трансформируют нуклеотидной последовательностью, которая не встречается в нетрансформированной клеткехозяине, то считается, что нуклеотидная последовательность является гетерологичной относительно клетки-хозяина. Применяемая для трансформации нуклеиновая кислота может содержать гетерологичный промотор,гетерологичную кодирующую последовательность или гетерологичную терминирующую последовательность. В другом варианте применяемая для трансформации нуклеиновая кислота может являться полностью гетерологичной или может включать любую возможную комбинацию гетерологичных и эндогенных нуклеотидных последовательностей. Лидерная область: область гена между сайтом инициации транскрипции и сайтом инициации трансляции. Маркерный ген: относится к гену, который кодирует селектируемый признак или признак, который можно выявлять путем скрининга. Фукционально связан/соединен с: считается, что регуляторная последовательность ДНК функционально связана с или соединена с последовательностью ДНК, кодирующей РНК или протеин, если две последовательности расположены так, что регуляторная последовательность ДНК оказывает воздействие на уровень экспрессии кодирующей последовательности ДНК. Растение: относится к любому растению, в частности к семенному материалу растений. Растительная клетка: структурная и физиологическая единица растения, включающая протопласт и клеточную оболочку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки или представлять собой часть высокоорганизованной единицы, такой, например,как ткань растения или орган растения. Растительный материал: относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, пыльцевым трубкам, семяпочкам, зародышевым мешкам, яйцеклеткам, зиготам, зародышам, семенам, отводкам, культурам клеток или тканей или любой другой части или продукту растения. Промотор: обозначает последовательность ДНК, которая инициирует транскрипцию связанной с ней последовательности ДНК. Промоторная область может также включать элементы, которые действуют в качестве регуляторов экспрессии гена, такие как активаторы, энхансеры и/или репрессоры, и может включать всю 5'-нетранслируемую лидерную последовательность или ее часть. Рекомбинантная молекула ДНК: комбинация последовательностей ДНК, которые соединены вместе с помощью метода рекомбинатной ДНК. Метод рекомбинатной ДНК: процедуры, применяемые для объединения последовательностей ДНК,описанные, например, у Sambrook и др., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. Маркерный ген, который можно выявлять путем скрининга (пригодный для скрининга маркерный ген): относится к гену, экспрессия которого не придает избирательное преимущество трансформированной клетке, но экспрессия которого приводит к фенотипическому отличию трансформированной клетки от нетрансформированных клеток. Селектируемый маркерный ген: обозначает ген, экспрессия которого в клетке растения придает клетке избирательное преимущество. Избирательное преимущество, которое имеют клетки, трансформированные селектируемым маркерным геном, по сравнению с нетрансформированными клетками может заключаться в их способности расти в присутствии отрицательного агента селекции, такого как антибиотик или гербицид. Избирательное преимущество, которое имеют трансформированные клетки по сравнению с нетрансформированными клетками, может заключаться в их усиленной или вновь приобретенной способности использовать добавленное соединение в качестве питательного вещества, фактора роста или энергетического источника. Понятие "селектируемый маркерный ген" относится также к гену или к комбинации генов, экспрессия которых в растительной клетке в присутствии селективного агента по сравнению с отсутствием селективного агента, оказывает положительное воздействие на трансформированную растительную клетку и отрицательное воздействие на нетрансформированную растительную клетку, например, в отношении роста, что придает трансформированной растительной клетке положительное избирательное преимущество. Идентичность последовательностей: процент идентичности последовательностей определяют с использованием компьютерных программ, основанных на алгоритмах динамического программирования. Компьютерные программы, которые являются предпочтительными для применения в рамках настоящего изобретения, включают комплекс поисковых программ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool),предназначенных для исследования любых доступных баз данных о последовательностях независимо от того, представляет ли собой рассматриваемая последовательность аминокислотную последовательность протеина или последовательность ДНК. Версию BLAST 2.0 (версия BLAST, в которой учитываются бреши) этого комплекса программ можно получить по Интернет (функционирующий в настоящее время-4 006761 сайт: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Этот комплекс программ основан на эвристическом алгоритме, предназначенном для локального поиска в отличие от алгоритмов глобального сравнения, и поэтому позволяет устанавливать связь между последовательностями, имеющими только изолированные области. Баллы, получаемые с использованием поисковых программ BLAST, хорошо поддаются статистической интерпретации. Для таких программ в качестве необязательных параметров предпочтительно используют задаваемые по умолчанию параметры. Трансформация: относится к интродукции нуклеиновой кислоты в клетку. В частности, понятие относится к стабильной интеграции молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма. TSWV: вирус пятнистого увядания томатов. Настоящее изобретение относится к последовательностям ДНК, получаемым из генома вируса желтого скручивания листьев цестровых (CmYLCV). Предпочтительными являются последовательности ДНК, которые получают из промотора первичного транскрипта CmYLCV, обладающего способностью обеспечивать экспрессию связанной с ним представляющей интерес нуклеотидной последовательности. Под объем изобретения подпадают также функциональные и/или структурные эквиваленты последовательностей ДНК. Таким образом, изобретение относится к последовательностям ДНК, которые функционируют в качестве промоторов транскрипции связанных с ними нуклеотидных последовательностей. Промотороная область может включать также элементы, которые действуют в качестве регуляторов экспрессии генов, такие как активаторы, энхансеры и/или репрессоры, и могут включать 5'нетранслируемую лидерную последовательность транскрибируемой мРНК. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения последовательность ДНК обеспечивает конститутивную экспрессию связанной с ней нуклеотидной последовательности. Понятие конститутивная экспрессия обозначает, что экспрессия представляющей интерес нуклеотидной последовательности происходит во все моменты времени и практически во всех тканях и органах. При анализе кратковременной экспрессии при использовании в качестве связанной последовательности репортерного гена GUS или CAT установлено, что последовательность ДНК по изобретению обеспечивает высокий уровень экспрессии репортерного гена GUS или CAT. Таким образом, последовательность ДНК по изобретению можно применять для обеспечения высокого уровня экспрессии связанной с ней представляющей интерес нуклеотидной последовательности, которая предпочтительно представляет собой кодирующую последовательность. Как очевидно специалисту в данной области, представляющую интерес связанную кодирующую последовательность можно экспрессировать в смысловой и антисмысловой ориентации. Кроме того, представляющая интерес кодирующая последовательность может быть гетерологичной или гомологичной по отношению к растению, подлежащему трансформации. В случае гомологичной кодирующей последовательности последовательность ДНК по изобретению можно применять для эктопической экспрессии указанной последовательности. Согласно одному из конкретных вариантов осуществления изобретения экспрессия представляющей интерес кодирующей последовательности под контролем последовательности ДНК по изобретению подавляет собственную экспрессию и исходную копию гена путем процесса, называемого косупрессией. Промоторы по настоящему изобретению можно получать из геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых (CmYLCV), которую можно выделять, например, из зараженных растенийCestrum parqui. Пораженные CmYLCV растения Cestrum parqui выявляют по наличию листовой мозаики и уродливых морщинистых листьев. Затем эту ДНК секвенируют и анализируют. Сравнение последовательности с последовательностями в базе данных позволило установить, что геномная организацияCmYLCV соответствует одному из других представителей семейства Caulimovirus. CmYLCV содержит 8 открытых рамок считывания. Сравнение последовательности продуктов гена CmYLCV выявило, что продукт гена I участвует в движении внутри клетки; ген А кодирует небольшой протеин неизвестной функции; ген В кодирует фактор, необходимый для переноса вируса тлями; ген С кодирует протеин, связанный с вирионом; ген IV кодирует основной капсидный протеин; ген V кодирует обратную транскриптазу и ген VI активирует в транс-ориентации трансляцию первичного транскрипта вирусных генов. Наибольший интерес представляет так называемый промотор первичного транскрипта CmYLCV. Как очевидно специалисту в данной области, согласно изобретению можно применять различные области промотора первичного транскрипта CmYLCV. Одним из конкретных вариантов осуществления изобретения является область промотора первичного транскрипта CmYLCV, представленная в SEQ IDNO:1, обозначенная как промотор CmpD. Эта область включает 350 пар оснований промотора первичного транскрипта CmYLCV и 320 пар оснований 5'-нетранслируемой лидерой последовательности первичного транскрипта CmYLCV. Эту последовательность получают секвенированием геномной ДНКCmYLCV. Проморную и лидерную последовательности соответственно идентифицируют путем сравнения с последовательностями базы данных. Вариант SEQ ID NO:1, обозначенный как СmрЕ, в котором 5'нетранслируемая лидерая последовательность первичного транскрипта CmYLCV включает 318 пар оснований вместо 320 пар оснований, приведен в SEQ ID NO:19. Одним из предпочтительных объектов изобретения является последовательность ДНК, представленная в SEQ ID NO:2, обозначенная как промотор СmрС. Промотор СmрС представляет собой фрагмент последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1, и включает 346 пар оснований промотора первичного-5 006761 транскрипта CmYLCV, соответствующих основаниям 5-350 SEQ ID NO:1. Эту последовательность ДНК получают с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых или зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений Cestrum parqui с помощью прямого праймера Cmp1 (SEQ ID NO:13) и обратного праймера CmpC2 (SEQ ID NO: 14) . Предполагаемый ТАТА-бокс промотора СmрС простирается от основания 308 до основания 315 SEQ IDNO:2. Промотор СmрС включает по меньшей мере 3 предполагаемые энхансерные области. Энхансерная область 1, имеющая нуклеотидную последовательность СААТ, простирается от основания 232 до основания 235 SEQ ID NO:2, а энхансерная область 2, которая также имеет нуклеотидную последовательность СААТ, простирается от основания 243 до основания 246 SEQ ID NO:2. Энхансерная область 3 простирается от основания 246 до основания 253 SEQ ID NO:2 и имеет нуклеотидную последовательностьTGACGTAA. Еще одним предпочтительным объектом изобретения является ДНК, приведенная в SEQ ID NO:3,обозначенная как промотор CmpS. Промотор CmpS также представляет собой фрагмент последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1, и включает 346 пар оснований SEQ ID NO:2 плюс 54 пары оснований лидерной области промотора первичного транскрипта CmYLCV. Лидерная область представляет собой нуклеотидную последовательность, расположенную перед кодирующей последовательностью,которая транскрибируется, но не транслируется с образованием протеина. Специалисту в данной области известно, что лидерная область может содержать регуляторные элементы, обладающие важными функциями при экспрессии гена. Промотор CmpS получают с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых или из зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений Cestrum parqui с помощью прямого праймера Cmp1 (SEQ ID NO:13) и обратного праймера CmpS2 (SEQ ID NO: 15). Промотор CmpS включает по меньшей мере 2 предполагаемые энхансерные области в лидерной области. Энхансерная область 4 (GAGAGA) простирается от основания 354 до основания 359 SEQ ID NO:3, а энхансерная область 5 (GAGAGAGA) простирается от основания 368 до основания 375 SEQ ID NO:3. Еще одним из предпочтительным объектом изобретения является последовательность, представленная в SEQ ID NO:4, обозначенная как промотор CmpL. Как и предыдущий промотор, промотор CmpL представляет собой фрагмент последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1, и включает 346 пар оснований SEQ ID NO:2 плюс 288 пар оснований 5'-лидерной последовательности первичного транскриптаCmYLCV. Промотор CmpL получают с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых или зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений Cestrum parqui с помощью прямого праймера Cmp1 (SEQ ID NO:13) и обратного праймера CmpL2(SEQ ID NO: 16) . Вариант SEQ ID NO:4, обозначенный как CmpF, в котором 5'-нетранслируемая лидерая последовательность первичного транскрипта CmYLCV включает 286 пар оснований вместо 288 пар оснований, приведен в SEQ ID NO:12. Как известно специалисту в данной области, нуклеотидные последовательности, представленные вSEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 19 и 20, можно удлинять на их 5' и 3'-концах с помощью гомологичных или гетерологичных нуклеотидных последовательностей. Например, 5' -конец SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 19 и 20 можно удлинять с помощью всей или части нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6. SEQ ID NO:6 в естественных условиях расположена против хода транскрипции относительно SEQ ID NO:2, 3, 4 и 20 и включает часть ОРС VI CmYLCV (основания 1-100 SEQ ID NO:6), а также часть промотора первичного транскрипта CmYLCV (основания 101-104 SEQ ID NO:6). Аналогично этому 3'-концы SEQ ID NO:2, 3, 4 и 20 можно удлинять с использованием всей или части нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5,представляющей собой нуклеотидную последовательность, которая в естественных условиях встречается на 3' SEQ ID NO:4 и 20 и включает лидерную последовательность первичного транскрипта CmYLCV. Как указано выше, последовательности ДНК по изобретению можно, например, получать с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК вируса желтого скручивания листьев цестровых или зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений Cestrum parqui. Альтернативно этому последовательности ДНК по изобретению можно получать из любого другого вируса семейства Caulimovirus, имеющего последовательности, гомологичные последовательности ДНК по изобретению, с помощью специфичных для последовательности праймеров. Как очевидно специалисту в данной области,основываясь на нуклеотидных последовательностях, представленных в SEQ ID NO:1- SEQ ID NO:6 иSEQ ID NO:19 и 20, можно выбрать любую представляющую интерес комбинацию праймеров для ПЦРамплификации фрагментов ДНК различной длины, которые можно применять согласно изобретению. Таким образом, изобретение включает фрагменты, полученные из промоторов первичного транскриптаCmYLCV, которые обладают требуемой функцией по изобретению, т.е. обладают способностью обеспечивать экспрессию связанных с ними нуклеотидных последовательностей. Это можно тестировать путем создания таких промоторных фрагментов, слияния их с селектируемым маркерным геном или пригодным для скрининга маркерным геном и анализа слитых конструкций в отношении сохранения промоторной активности. Такие анализы находятся в компетенции специалиста в данной области. Предпочтительные фрагменты ДНК по изобретению включают по меньшей мере 50 оснований, предпочтительно от примерно 400 оснований до примерно 650 оснований, более предпочти-6 006761 тельно от примерно 200 до примерно 400 оснований и наиболее предпочтительно примерно 350 оснований. Как также очевидно специалисту в данной области, последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 и 6 или их более длинные или короткие фрагменты, выведенные на основе информации о последовательности, с помощью методов, известных в данной области, можно изменять с помощью мутации, инсерции,делеции и/или замены одного или нескольких нуклеотидов или более длинных или более коротких фрагментов. Кроме того, немодифицированную или модифицированную нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению можно изменять путем перестройки последовательности по изобретению. Для оценки функциональной активности вариантов последовательностей ДНК по изобретению представляющую интерес последовательность функционально связывают с селектируемым маркерным геном или пригодным для скрининга маркерным геном и оценивают экспрессию маркерного гена путем анализов кратковременной экспрессии с использованием протопластов или стабильно трансформированных растений. Как очевидно специалисту в данной области, последовательности ДНК, обладающие способностью обеспечивать экспрессию связанных с ними нуклеотидных последовательностей, функционируют различным образом. Так, уровни экспрессии при использовании более коротких фрагментов ДНК могут отличаться от уровней экспрессии, обеспечиваемых более длинным фрагментом, и могут отличаться друг от друга. Например, делеция обладающего понижающей регуляцией расположенного против хода транскрипции элемента может приводить к повышению уровней экспрессии связанной нуклеотидной последовательности, в то время как делеция обладающего повышающей регуляцией элемента может приводить к понижению уровней экспрессии связанной нуклеотидной последовательности. Как также очевидно специалисту в данной области, делеция специфичного для определенной стадии развития или тканеспецифичного элемента может приводить к изменению временного или пространственного профиля экспрессии связанной нуклеотидной последовательности. Под объем настоящего изобретения подпадают также функциональные эквиваленты промоторов по настоящему изобретению, т.е. нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в строгих условиях с любой из последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:20. Гибридизацию в строгих условиях осуществляют при температуре 65 С, предпочтительно при 60 С и наиболее предпочтительно при 55 С, в забуференном цитратом физиологическом растворе (SSC) двойной крепости (2 Х), содержащем 0,1% ДСН, с последующей отмывкой подложки при такой же температуре, но с использованием буфера с пониженной концентрацией SSC. Такие буферы с пониженной концентрацией, как правило, представляют собой SSC 1/10 крепости (0,1XSSC), содержащий 0,1% ДСН,предпочтительно 0,2 Х SSC, содержащий 0,1% ДСН и наиболее предпочтительно SSC половинной крепости (0,5XSSC), содержащий 0,1% ДСН. Фактически функциональные эквиваленты всего промотора первичного транскрипта CmYLCV или его части из других организмов можно создавать путем гибридизации любой из последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20 с геномной ДНК, выделенной из представляющего интерес организма, прежде всего другого представителя семейства Caulimovirus. Специалисту в данной области известны методы, с помощью которых можно выявлять такие последовательности, поскольку существует много известных методик идентификации гомологичных последовательностей в других организмах. Такие вновь выявленные молекулы ДНК затем можно секвенировать и их последовательность сравнивать с любой из последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20 и оценивать промоторную активность. Под объем настоящего изобретения подпадают молекулы ДНК, последовательность которых по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно на 95% идентична любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6 длиной по меньшей мере 50 нуклеотидов. Процент идентичности последовательностей определяют с использованием компьютерных программ, основанных на алгоритмах динамического программирования. Компьютерные программы, которые являются предпочтительными для применения в рамках настоящего изобретения, включают комплекс поисковых программ BLAST (BasicLocal Alignment Search Tool), предназначенных для исследования любых доступных баз данных о последовательностях независимо от того, представляет ли собой рассматриваемая последовательность аминокислотную последовательность протеина или последовательность ДНК. Версию BLAST 2.0 (версияBLAST, в которой учитываются бреши) этого комплекса программ можно получить в Интернете (функционирующий в настоящее время сайт: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Этот комплекс программ основан на эвристическом алгоритме, предназначенном для локального поиска в отличие от алгоритмов глобального сравнения и поэтому позволяет устанавливать связь между последовательностями, имеющими только изолированные области. Баллы, получаемые с использованием поисковых программBLAST, хорошо поддаются статистической интерпретации. Для таких программ в качестве необязательных параметров предпочтительно использовать задаваемые по умолчанию параметры. Еще одним объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные молекулы ДНК, содер-7 006761 жащие последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Представляющая интерес нуклеотидная последовательность может,например, кодировать рибосомную РНК, антисмысловую РНК или любой другой тип РНК, которые не транслируются с образованием протеина. Согласно другому предпочтительному объекту изобретения представляющая интерес нуклеотидная последовательность транслируется с образованием продуктапротеина. Нуклеотидная последовательность, связанная с промоторной последовательностью, может быть гомологичной или гетерологичной относительно подлежащего трансформации растения. Последовательность может также быть полностью или частично синтетической. Независимо от происхождения,связанная последовательность ДНК должна экспрессироваться в трансформированном растении в зависимости от экспрессионных свойств промотора, с которым она связана. В случае гомологичных нуклеотидных последовательностей, связанных с промоторной последовательностью, промотор по изобретению можно применять для эктопической экспрессии указанных гомологичных последовательностей. Понятие эктопическая экспрессия обозначает, что связанная с промотором нуклеотидная последовательность экспрессируется в тканях и органах и/или в моменты времени, в которых/когда она не может экспрессироваться под контролем собственного промотора. Согласно предпочтительному варианту осуществления экспрессия связанной с промотором нуклеотидной последовательности подавляет ее собственную экспрессию и экспрессию исходной копии гена путем процесса, называемого косупрессией. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения связанная нуклеотидная последовательность может кодировать протеин, экспрессия которого в растении должна происходить в любое время и в большинстве тканей и органов. Такие нуклеотидные последовательности предпочтительно кодируют протеины, обусловливающие требуемый фенотипический признак у трансформированных растений. Примерами являются нуклеотидные последовательности, кодирующие протеины, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, толерантность к гербицидам, повышенную питательную ценность, улучшенные характеристики при промышленной переработке или измененную репродуктивную способность. Связанная нуклеотидная последовательность может также представлять собой последовательность, которую переносят в растения для получения в них ценных с коммерческой точки зрения ферментов или метаболитов. Под объем настоящего изобретения подпадают также селектируемые маркерные гены или пригодные для скрининга маркерные гены, т.е. гены, включающие последовательность ДНК по изобретению, функционально связанную с кодирующей областью, которая кодирует селектируемый признак или признак, который можно выявлять путем скрининга. Примеры селектируемых маркерных геном или пригодных для скрининга маркерных генов описаны ниже. Для определенных видов-мишеней предпочтительными могут быть различные маркеры для селекции по признаку устойчивости к антибиотику или гербициду. Обычно применяемые для трансформации маркеры для селекции включают ген nptII, который придает устойчивость к канамицину, паромомицину, генетицину и родственным антибиотикам (Vierra и Messing , Gene, 19: 259-268 (1982); Bevan и др., Nature 304: 184-187 (1983, бактериальный ген aadA, который кодирует аминогликозид-3'аденилтрансферазу и обусловливает устойчивость к стрептомицину или спектиномицину (GoldschmidtClermont M., Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089 (1991, ген hph, который придает устойчивость к антибиотику гигромицину (Blochinger и Diggelmann, Mol. Cell Biol., 4: 2929-2931, 1984, и ген dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Bourouis и др., EMBO J., 2(7): 1099-1104 (1983. Другие маркеры,которые можно использовать, включают ген фосфинотрицин-ацетилтрансферазы, обусловливающий устойчивость к гербициду фосфинотрицину (White и др., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990); Spencer и др.,Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990, мутантный ген EPSP-синтазы, кодирующий устойчивость к глифосату (Hinchee и др., Bio/Technology 6: 915-922 (1988, мутантный ген ацетолактатсинтазы (ALS), обусловливающий устойчивость к имидазолиону или сульфонилмочевине (Leeи др., EMBO J., 7: 1241-1248(1988, мутантный ген psbA, обусловливающий устойчивость к атразину (Smeda и др., Plant Physiol. 103: 911-917 (1993, или мутантный ген протопорфириногеноксидазы, описанный в ЕР 769059. Идентификацию трансформированных клеток можно осуществлять также с помощью экспрессии пригодных для скрининга маркерных генов, таких как гены, кодирующие хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT),глюкуронидазу (GUS), люциферазу и зеленый флуоресцентный протеин (GFP) или любой другой протеин, обусловливающий фенотипически различимый признак у трансформированных клеток. Можно применять также маркеры для селекции, позволяющие осуществлять позитивный отбор, такие как ген фосфоманнозо-изомеразы, описанный в заявке на патент WO 93/05163. Другие гены, которые можно применять для позитивного отбора, описаны в WO 94/20627, они кодируют ксило-изомеразы и фосфоманноизомеразы, такие как маннозо-6-фосфат-изомераза и маннозо-1-фосфат-изомераза; фосфоманномутазу; маннозо-эпимеразы, которые превращают углеводы в маннозу или маннозу в углеводы, такие как глюкоза или галактоза; фосфатазы, такие как маннозо- или ксилозо-фосфатаза, маннозо-6-фосфатаза и маннозо-1-фосфатаза, и пермеазы, которые участвуют в транспорте маннозы, или их производные или предшественники в клетке. Агент, который может снизить токсичность соединения в клетках, как правило, является производным глюкозы, таким как метил-3-О-глюкоза или флоридзин. При их применении трансформированные клетки выявляют, не повреждая или уничтожая при этом нетрансформированные клетки-8 006761 в популяции, и без одновременной интродукции генов, обусловливающих устойчивость к антибиотикам или гербицидам. Как описано в WO 93/05163, помимо того, что устраняется необходимость в генах, обусловливающих устойчивость к антибиотикам или гербицидам, было установлено, что метод позитивного отбора часто является существенно более эффективным, чем традиционный метод негативного отбора. Таким образом, промоторы по настоящему изобретению предпочтительно функционально связывают с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует протеин, включающей область, которая:(а) кодирует протеин, участвующий в метаболизме соединения, и/или (б) регулирует активность гена,кодирующего протеин, где соединение представляет собой маннозу или ксилозу или их производное или предшественник или субстрат протеина, или оно в результате метаболизма трансформированными клетками может превращаться в такой субстрат. Указанная нуклеотидная последовательность может кодировать маннозо-6-фосфат-изомеразу и соединение может представлять собой маннозу. В другом варианте нуклеотидная последовательность кодирует фосфосахароизомеразу, фосфосахаромутазу, такую как фосфоманномутаза, фосфатазу, такую как маннозо-6-фосфатаза, сахароэпимеразу, сахаропермеазу, фосфосахаропермеазу или ксилозо-изомеразу, а соединение может представлять собой маннозу, маннозо-6 фосфат, D-маннозеамин или ксилозу. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения промоторы по изобретению функционально связывают с кодирующей областью гена manA E. coli (Joersbo и Okkels, Plant Cell Reports, 16: 219-221 (1996), Negrotto и др. Plant Cell Reports, 19: 798-803 (2000, кодирующей фосфоманнозо-изомеразу (PMI), и терминатором Nos (нопалин-синтетаза), полученным из Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens (Depicker и др., J. Mol. Appl. Gener. ,1 (6), 561-573 (1982. Специалисту в данной области известно, что терминатор Nos можно заменять любым другим терминатором, функционирующим в растениях. Промотор по изобретению может представлять собой CmpD, CmpC, CmpS, CmpL, CmpB, CmpA,CmpE или CmpF, которые представлены в SEQ ID NO:1-6 и 19-20, или любой другой выведенный из них промотор. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления промотор представляет собой промотор CmpS, приведенный в SEQ ID NO:3. Промоторы по настоящему изобретению можно применять для придания устойчивости или толерантности к вирусам путем функционального связывания промоторов по изобретению с кодирующими областями генов вирусов, подлежащих уничтожению. Для борьбы с вирусами можно использовать отрицательную цепь вирусов, таких как вирус пятнистого увядания томатов (TSWV), последовательности генов вирусного нуклеокапсидного протеина (NP),протеина, обеспечивающего движение вируса (МР), а для вирусов, принадлежащих к альфа-подобной супергруппе вирусов, таких как TMV (вирус табачной мозаики) и CMV (вирус огуречной мозаики),можно применять последовательности генов РНК-зависимой РНК-полимеразы (РзРп) и гена протеина,обеспечивающего движение вируса (МР). Для вирусов, принадлежащих к Picorna-подобной супергруппе вирусов, включая потивирусы, любую последовательность вируса можно связывать с промоторами по изобретению. Наконец, для всех других вирусов, включая ДНКовые вирусы, можно применять последовательности генов РНК-зависимой РНК-полимеразы (РзРп) или связанные с репликазой последовательности генов. Примеры таких конструкций, предназначенных для борьбы с вирусами, приведены в примере 8 и примере 9 WO 00/68374. Специалисту в данной области должно быть очевидно, как заменять промоторы, описанные в WO 00/68374, на промоторы по настоящему изобретению. На основе сведений,приведенных в WO 00/68374, специалисту в данной области также должно быть ясно, как создавать конструкции, включающие промоторы по изобретению, функционально связанные с указанными выше вирусными последовательностями с целью придания устойчивости или толерантности к этим вирусам. Вместо экспрессии в трансгенных растениях двухцепочечной вирусной РНК, что описано в WO 00/68374, вирусную РНК можно также экспрессировать в виде конструкции: нетранслируемая РНК плюс молекула смысловой вирусной РНК, как это описано, например, в патенте США 558302 или в примерах 12 и 13 настоящего описания. Еще одним объектом изобретения являются рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие последовательность ДНК по изобретению, слитую со связанной с ней представляющей интерес последовательностью. В этих векторах чужеродную ДНК можно встраивать в область полилинкера таким образом, чтобы эти экзогенные последовательности можно было экспрессировать в приемлемой клеткехозяине, которая например, может иметь бактериальное или растительное происхождение. Например,плазмида рВI101, выведенная из бинарного вектора Agrobacterium tumefacience pBIN19, позволяет клонировать и тестировать промоторы с помощью сигнала экспрессии бета-глюкуронидазы (GUS) (Jefferson и др., EMBO J., и др., 6: 3901-3907 (1987. Размер вектора составляет 12,2 т.п.н. Он включает сайт инициации репликации плазмиды с малым количеством копий RK2 и обусловливает устойчивость к канамицину как у бактерий, так и у растений. Специалисту в данной области известны многочисленные другие экспрессионные векторы, которые можно применять согласно изобретению. Еще одним объектом настоящего изобретения являются трансгенные растения, содержащие рекомбинантные последовательности ДНК по изобретению. Изобретение относится также к растительным клеткам, растениям, полученным из таких клеток, растительному материалу, потомству и семенам, полученным от таких растений, и к сельскохозяйственным продуктам, отличающимся улучшенными свойст-9 006761 вами, которые получают с помощью любого из описанных ниже методов трансформации. Растения,трансформированные согласно изобретению, могут представлять собой однодольные или двудольные растения и включают (но не ограничиваясь ими) рис, кукурузу, пшеницу, ячмень, рожь, сладкий картофель, сахарную кукурузу, бобы, горох, цикорий, салат, капусту, цветную капусту, брокколи, турнепс,редис, шпинат, спаржу, лук, чеснок, перец, сельдерей, тыкву крупноплодную, тыкву пепо, коноплю, цуккини, яблоню, грушу, айву, дыню, сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, землянику, виноград, малину, ежевику, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, томаты, сорго, сахарный тростник, сахарную свеклу, подсолнечник, рапс, клевер, табак, морковь, хлопчатник, люцерну, картофель, баклажан, огурец,Arabidopsis thaliana и древесные растения, такие как хвойные и лиственные деревья. Предпочтительными подлежащими трансформации растениями являются рис, кукуруза, пшеница, ячмень, капуста, цветная капуста, перец, тыква крупноплодная, дыня, соя, томаты, сахарная свекла, подсолнечник или хлопчатник, и особенно предпочтительно рис, кукуруза, пшеница, Sorghum bicolor, ежа сборная, сахарная свекла и соя. Рекомбинантные последовательности ДНК по изобретению можно интродуцировать в растительную клетку многочисленными известными в данной области путями. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что выбор метода должен зависеть от типа подлежащего трансформации растения (т.е. однодольного или двудольного). Пригодные методы трансформации растительных клеток включают микроинъекцию (Crossway и др., BioTechniques 4: 320-334 (1986, электропорацию (Riggs и др., Рrос. Natl. Acad. Sci, USA 83:5602-5606 (1986, опосредуемую Agrobacterium трансформацию (Hinchee и др., Biotechnology 6: 915-921 (1988); ЕР 0853675), непосредственный перенос гена (Paszkowski и др., EMBO J. 3: 2717-2122 (1984, и метод баллистического ускорения частиц с использованием устройств, выпускаемых фирмами Agracetus, Inc., Мэдисон, штат Висконсин и Dupont, Inc., Вилмингтон,штат Делавар (см., например, патент США 4945050; и McCabe и др., Biotechnology 6: 923-926 (1988. Подлежащие трансформации клетки могут представлять собой дифференцированные клетки листьев,эмбриогенные клетки или любые другие типы клеток. При непосредственной трансформации протопластов поглощение экзогенного генетического материала в протопласт можно увеличить с помощью химического агента или электрического поля. Экзогенный материал затем может интегрироваться в ядерный геном. В предыдущих исследованиях использовали двудольное растение - табак, для этих растений установлено, что чужеродная ДНК включается в геном и переносится в потомство растений (Paszkowski и др., EMBO J. 3:2712-2722 (1984); Potrykus и др., Mol. Gen. Genet 199:169-177 (1985. С помощью этой процедуры можно трансформировать протопласты таких однодольных растений, например, как Triticummonococcum, Lolium multiflorum (итальянская рожь), кукуруза и черная мексиканская сахарная кукуруза. Еще одним предпочтительным вариантом является способ трансформации кукурузы, описанный в ЕР 0292435, а также в ЕР 0846771. Методы трансформации кукурузы описаны также у Koziel и др.,Bio/Technology 11:194-200 (1993). Трансформацию риса можно осуществлять с помощью методов прямого переноса генов с использованием протопластов или бомбардировки частицами. Опосредуемая протопластом трансформация описана для японских и индийских типов риса (Zhang и др., Plant Cell Rep.,7:379-384 (1988); Shimamoto и др., Nature 338:274-276 (1989); Datta и др., Bio/Technology 8:736-740(1990. Оба указанных выше типа риса, как правило, можно трансформировать бомбардировкой частицами (Christou и др., Bio/Technology 9:957-962 (1991. В ЕР 033281 описаны методы получения, трансформации и регенерации протопластов Pooideae. С помощью этих методов можно трансформировать всех представителей Pooideae, включая Dactylis и пшеницу. Методы трансформации пшеницы описаны также в ЕР 0674715; и у Weeks и др., (Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993. Сконструированные таким образом растительные экспрессионные векторы можно применять, например, для трансформации с помощью общепринятых методов каллюсов риса и тем самым индуцировать дифференциацию корней и листьев и после этого переносить в цветочные горшки, получая трансформированные растения риса. В растениях, полученных в результате трансформации с помощью последовательностей ДНК или векторов по настоящему изобретению, экспрессия представляющей интерес нуклеотидной последовательности должна происходить во всем растении и в большинстве его тканей и органов. Генетические особенности, сконструированные в описанных выше трансгенных растениях, передаются с помощью полового размножения или вегетативного роста и, таким образом, могут сохраняться и передаваться по наследству потомству растений. Обычно указанное сохранение и передачу потомству осуществляют с использованием известных сельскохозяйственных методов, разработанных для конкретных целей, таких как обработка почвы, посев или сбор урожая. Также можно применять специализированные методы, такие как гидропоника или выращивание в закрытом грунте. Кроме того, дающие преимущества генетические особенности трансгенных растений по изобретению можно использовать при селекции растений с целью выведения растений с улучшенными свойствами, такими как толерантность к вредителям, гербицидам или стрессу, с улучшенной питательной ценностью, повышенной урожайностью или улучшенным строением, способствующим уменьшению потерь от полегания или осыпания. Для различных стадий селекции характерно целенаправленное вмешательство человека, такое как отбор линий,подлежащих скрещиванию, непосредственное опыление родительских линий или отбор соответствующего потомства растений. В зависимости от требуемых свойств выбирают различные методы селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают (но не ограничиваясь ими)- 10006761 гибридизацию, инбридинг, возвратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешивание сортов,межвидовую гибридизацию, методы анэуплодии и т.д. Методы гибридизации также включают стерилизацию растений с целью получения мужских или женских стерильных растений с помощью механических, химических или биохимических способов. Перекрестное опыление мужского стерильного растения пыльцой различных линий гарантирует, что геном мужского стерильного, но фертильного женского растения будет равным образом приобретать свойства обеих родительских линий. Таким образом, трансгенные растения по настоящему изобретению можно применять для селекции улучшенных линий растений,что, например, позволяет увеличить эффективность обычных методов, таких как обработка гербицидом или пестицидом, или дает возможность обойтись без этих методов благодаря модифицированным генетическим особенностям этих растений. Кроме того, можно получать новые культурные растения с улучшенной толерантностью к стрессу благодаря оптимизации генетического "аппарата", что позволяет получать урожай продуктов лучшего качества по сравнению с продуктами, полученными от растений, которые не обладают способностью сопротивляться аналогичным вредным условиям в процессе их развития. И еще одним объектом настоящего изобретения являются последовательности ДНК, которые можно применять для экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в требуемом организме. Этот организм может представлять собой бактерию, растение или любой другой представляющий интерес организм. Кроме того, описание SEQ ID NO:1-6 дает возможность специалистам в данной области создавать олигонуклеотиды для полимеразных цепных реакций, которые могут обеспечивать амплификацию фрагментов ДНК при использовании в качестве матриц последовательности нуклеотидов, характеризующейся наличием любой из непрерывных последовательностей, включающих 15 и предпочтительно 20 - 30 или более пар оснований SEQ ID No: 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Такие нуклеотиды представляют собой последовательность нуклеотидов, состоящую из 15 и предпочтительно 20 - 30 или более пар основанийSEQ ID No:1, 2, 3, 4, 5 или 6. Полимеразные цепные реакции осуществляют с использованием по меньшей мере одного такого олигонуклеотида, полученный в результате продукт амплификации является еще одним объектом настоящего изобретения. Краткое описание последовательностей, приведенных в перечне последовательностейSEQ ID NO:21 прямой праймер терминатора NOSSEQ ID NO:22 обратный праймер терминатора NOSSEQ ID NO:23 прямой праймер гена NP TSWVSEQ ID NO:24 обратный праймер гена NP TSWVSEQ ID NO:25 прямой праймер промотора CmYLCVSEQ ID NO:26 обратный праймер промотора CmYLCVSEQ ID NO:27 сайт множественного клонирования AGLINKSEQ ID NO:28 сайт множественного клонирования BIGLINKSEQ ID NO:31 pNOV2804; бинарный вектор, содержащий лишенную промотора кассету экспрессииSEQ ID NO:32 pNOV3604; вектор для биобаллистической трансформации, содержащий лишенную промотора кассету экспрессии PMI-терминатор nosSEQ ID NO:37 synGFPI; оптимизированный для применения в растениях ген GFP с интрономSEQ ID NO:49 кассета экспрессии Ubq3(At)-GIG-nos Примеры В настоящем описании применяли стандартные методы рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, хорошо известные в данной области и изложенные, например, у Sambrook и др. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 и у Ausubel и др. "Currentprotocols in molecular biology", John Wiley and Sons, New York, 1994. Пример 1. Клонирование вирусов. 1. Экстракция ДНК. Вирусную геномную ДНК экстрагируют из зараженных вирусом желтого скручивания листьев цестровых растений Cestrum parqui. Пять граммов зараженных листьев гомогенизируют в 30 мл буфера для измельчения (0,2 М Трис, рН 7,0, 0,02 М ЭДТК, 2 М мочевина) в течение 60 с при максимальной скорости в гомогенизаторе типа Brinkman Polytron с использованием в качестве зонда РТ 10 и осторожно встряхивают при 4 С в течение ночи в присутствии Triton Х-100 (конечная концентрация 2%). Вирус выделяют из неочищенного гомогената с помощью центрифугирования при низкой скорости вращения (10000 об/мин в течение 20 мин в роторе типа Sorvall SS-34 ), и далее из полученного супернатанта с помощью центрифугирования при высокой скорости вращения (27000 об/мин в течение 2 ч в роторе типа BeckmanSW-28 ) в градиенте сахарозы (3 мл 15%-ной сахарозы). Затем содержащий вирус дебрис ресуспендируют в 0,1 М Трис, рН 7,4, 2,5 мМ MgCl2. Добавляют ДНКазу I (фирма Sigma) и РНКазу А (фирма Sigma) до концентрации 10 мг/мл каждой. После инкубации в течение 30 мин при 37 С реакцию прекращают, добавляя ЭДТК до концентрации 10 мМ. Вирусную ДНК выделяют из содержащих CmYLCV частиц с помощью обработки протеазой К (фирма Е. Merck, конечная концентрация 0,5 мг/мл) в присутствии 1% ДСН при 65 С в течение 15 мин. Затем вирусную ДНК очищают экстракцией фенолом и осаждением этанолом. Вирусную ДНК, содержащуюся в конечном осадке, полученную путем осаждения этанолом,растворяют в воде. 2. Амплификация и клонирование ДНК. 100 нг полученной ДНК используют в качестве матрицы для ПЦР-амплификации в 50 мкл реакционной смеси, содержащей по 10 мкМ каждого праймера, 25 мМ каждого дНТФ, 5 мкл реакционного буфера Pfu (фирма Stratagene) и 2,5 ед. ДНК-полимеразы Pfu turbo (фирма Stratagene). Для ПЦР используют прямой праймер S1 (gaccacaaacatcagaag, SEQ ID NO:7) и обратный праймер S2 (caaacttattgggtaatc, SEQ IDNO:8). ПЦР осуществляют с использованием следующих циклов: 1 х (94 С в течение 1 мин); 30 х (94 С в течение 1 мин, 50 С в течение 1 мин, 72 С в течение 1 мин); 1 х (72 С в течение 10 мин). Каждый отдельный фрагмент ДНК клонируют в плазмиде pPCR-Script Amp SK(+) (фирма Stratagene) согласно инструкциям производителя. Пример 2. Секвенирование ДНК. Секвенирование ДНК вирусных клонов осуществляют с помощью автоматического секвенатора ДНК типа ABI PRISM 377 (фирма Perkin Elmer) и набора для циклического секвенирования терминатора типа ABI PRISM dRhodamine (фирма Perkin Elmer) согласно инструкциям производителя. Для реакций секвенирования используют описанные выше праймер S1 и праймер S2 (пример 1), а также универсальный праймер М 13-20 и обратные праймеры. Пример 3. Конструирование плазмид для кратковременной экспрессии. Все ПЦР осуществляют с использованием полимеразы Pfu (фирма Stratagene), согласно методу,описанному в примере 1. 1. Амплификация репортерных генов. Амплифицируют репортерные гены бета-глюкуронидазы (GUS) и хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). Для амплификации гена GUS используют прямой олигонуклеотидный GUS- 12006761 праймер (cagggtaccactaaaatcacc, SEQ ID NO:9) и обратный олигонуклеотидный GUS-праймер(aggggatccccaattcccc, SEQ ID NO:10) при температуре отжига 60 С. Прямой олигонуклеотидный САТпраймер (aggggtaccatcgatatggag, SEQ ID NO:11) и обратный олигонуклеотидный САТ-праймер (ttaggatccgccctgccac, SEQ ID NO: 12) отжигают при 62 С. Прямые праймеры создают так, чтобы они включали сайт, распознаваемый КрnI, а обратные - сайт, распознаваемый BamHI . 2. Амплификация промотора CmYLCV. Для исследования выбирают три различных промоторных фрагмента, т.е. CmpC (SEQ ID NO:2),CmpS (SEQ ID NO:3) и CmpL (SEQ ID NO:4). Прямой праймер Cmp1 (cttctagacaaagtggcagac, SEQ IDNO:13) используют во всех трех случаях для амплификации при температуре отжига 52 С. Он отличается (выделено жирным шрифтом) от исходной последовательности наличием сайта, распознаваемогоCmpC-фрагмента, а обратный праймер CmpS2 (ctacttctaggtaccttgctc, SEQ ID NO:15) применяют для амплификации CmpS-фрагмента. Оба эти праймеры модифицированы и отличаются наличием сайта, распознаваемого КрnI. Обратный праймер CmpL2 (ttggtaccttaacaatgaggg, SEQ ID NO:16) используют для амплификации CmpL-фрагмента, и он модифицирован и отличается наличием сайта рестирикции ClaI. 3. Амплификация сигнала полиаденилирования. Фрагменты сигнала полиаденилирования амплифицируют из клона, зараженного вирусом мозаики цветной капусты (CaMV) (Franck и др., Cell 21 (1), 285-294 (1980. Для ПЦР-амплификации используют прямой олигонуклеотидный праймер PA (polyadenylation signal amplification-амплификация сигнала полиаденилирования) (ggggatccccagtctctctc, SEQ ID NO:17) и обратный олигонуклеотидный праймер PA(gtgaattcgagctcggta, SEQ ID NO:18), и отжиг производят при температуре 60 С. Прямой праймер создают так, чтобы он включал сайт, распознаваемый BamHI, а обратный - сайт EcoRI. 4. Полученные конструкции.pCmpLC (промоторный фрагмент CmpL + ген CAT + poly A) Кассеты, содержащие промоторный фрагмент, репортерные гены и сигнал полиаденилирования,встраивают в вектор pUC19 (фирма Stratagene), расщепленный с помощью XbaI и EcoRI. 5. Конструкции, применяемые для сравнительного анализаpCapSG (промоторный фрагмент CapS + ген GUS + polyA) рСарС (промоторный фрагмент Сар + ген CAT + polyA). Содержащие эти конструкции промоторные фрагменты получают из CaMV (Franck и др., Cell 21(1), 285-294 (1980), см. регистрационный номер GenBank V00141). Фрагменты GUS, CAT и polyA идентичны фрагментам, применяемым для CmYLCV-конструкций. Сар соответствует фрагменту, простирающемуся от основания -227 до основания + 33 ТАТА-бокса (основания 7175-7438 генома CaMV, см. регистрационный номер GenBank V00141), a CapS соответствует фрагменту, простирающемуся от основания -227 до основания + 82 ТАТА-бокса (основания 7175-7486 генома CaMV, см. регистрационный номер GenBank V00141). Эти положения примерно соответствуют положениям, выбранным дляCmYLCV-фрагментов. Пример 4. Эксперименты по кратковременной экспрессии. 1. Получение суспензионных культур и протопластов.Orychophragmus violaceus. Суспензионные культуры поддерживают в 40 мл MS-среды (Murashige и Skoog, Physiol Plant 15,474-497 (1962, включающей 100 мг/мл инозита, 2% сахарозы и 0,1 мг/мл 2,4-Д. Протопласты выделяют из 4-5-дневных культур. Клеточные стенки расщепляют, выдерживая при 26 С в течение 1 ч в смеси,содержащей 0,1% пектолиазы Y23 (фирма Seishin Pharmaceutical Co., Япония), 1% целлюлазы OnozukaR10 (фирма Yakult Honsha Co., Япония), 0,4 М D-маннит и 0,1% MES, pH 5,5. Протопласты фильтруют через сито с размером пор 50 мкм и дважды промывают раствором для электропорации (ЭП) (10 мМNicotiana plumbaginifolia. Растения поддерживают в асептических условиях в среде RPM2 (Blonstein и др., Mol Gen Genet 211,252-259 (1988, дополненной 7 г/л бакто-агара, рН 5,6. Для получения протопластов отрезают листья и инкубируют в течение ночи при 26 С в растворе, содержащем 0,5% дризелазы (фирма Fluka), 0,25 мМ ПВП 10 (поливинилпирролидон ММ 10000), 3,85 мМ СаСl2, 6 мг/л НУК (нафталинуксусная кислота), 2 мг/л ВАР (щелочная фосфатаза бактерий) и 0,5 М сахарозу, рН 5,7. Протопласты фильтруют через сито с размером пор 100 мкм. Для осуществления первой стадии очистки к протопластам добавляют раствор сахарозы (0,6 М сахароза, 0,1% MES и 15 мМ СаСl2, рН 5,7) и суспензию дополняют W5-раствором (150 мМ NaCl, 125 мМ СаСl2, 5 мМ КСl, 6 мМ глюкоза; Menczel и др., Theor Appl Genet 59, 191-195 (1981). Затем протопласты однократно промывают W5-раствором и, наконец, ЭП-раствором.Oryza sativa. Протопласты получают из суспензионной культуры морфогенетического риса, созданной из О. sativa cv. Nipponbare согласно известному методу (Datta и др., Bio/Technology 8:736-740 (1990. 2. Эксперимент по кратковременной экспрессии. Трансфекцию с помощью электропорации 2x106 протопластов Orychophragmus violaceus в 0,66 мл ЭП-буфера осуществляют путем разряда конденсатора емкостью 960 мкФ через слой суспензии протопластов толщиной 4 мм. Конденсатор заряжают при напряжении 450 В. Электропорацию осуществляют в присутствии 5-10 мкг плазмидной ДНК, затем протопласты культивируют в течение 16-24 ч при 25 С. Трансфекцию 2x106 протопластов Nicotiana plumbaginifolia в 0,3 мл суспензии осуществляют в присутствии 0,3 мл ПЭГ (40% полиэтиленгликоль 6000) и 5-10 мкг плазмидной ДНК. Протопласты культивируют в 0,4 мл К 3-среды (Godall и др., Methods Enzymol 181, 148-161 (1990 в течение 16-24 ч при 25 С и дополняют 10 мл W5-буфера перед сбором. Протеиновые экстракты получают с помощью по меньшей мере трех циклов замораживания и оттаивания и осветляют центрифугированием. Пример 5. Анализы CAT и GUS. Для обнаружения экспрессии гена CAT используют двойной иммуносэндвич (DAS)-ELISA и наборCAT ELISA (фирма Boehringer) согласно инструкциям производителя. Активность CAT оценивают с помощью устройства типа Dynex MRXII. Для осуществления анализа активности GUS образцы растворяют в GUS-буфере (0,05 М NaPO4, рН 7, 0,01 М ЭДТК, 0,1% Triton-X-100, 0,1% саркозила). Реакцию осуществляют в присутствии равного количества реакционного GUS-буфера (100 мл/л 10 х GUS-буфера,200 мг/л БСА, 705 мг/л 4-метилумбеллиферилглюкуронида) при 37 С и прекращают, добавляя 2 М аммедиол. Для оценки активности используют устройство типа Titertek Fluoroskan II. Результаты по оценки активности CAT и GUS нормализуют по отношению к соответствующему значению для стандартного клона. Результаты, полученные в 10 различных экспериментах, свидетельствуют о том, что различные промоторные фрагменты CmYLCV обладают высокой промоторной активностью. Кратковременная экспрессия в протопластах N. plumbaginifolia Репортерный ген GUS Пример 6. Приготовление растворов и сред для регенерации и трансформации растений. Культуральные среды GM, CIM и SIM представляют собой среды, описанные у Valvekens и др.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 5536-5540 (1988. Культуральная среда GM содержит минеральные соли Мурасига и Скуга (Murashige и Skoog , Physiol. Plant. 15:473-497 (1962, 1,0 мг/л тиамина (маточный раствор, 1 мг/мл), 0,5 мг/л пиридоксин HCl (маточный раствор, 1 мг/мл), 0,5 мг/л никотиновой кислоты(маточный раствор, 1 мг/мл), 0,5 г/л 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 10 г/л сахарозы, 8 г/л агара, значение рН доводят до 5,8 с помощью 1 н. КОН. Среда CIM содержит минеральные соли и витамины В 5-среды (Gamborg и др., Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968, 0,5 г/л 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES), 20 г/л глюкозы, 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) (маточный раствор, 10 мг/мл в ДМСО), 0,05 мг/л кинетина (маточный раствор, 5 мг/мл в ДМСО), рН 5,8. Твердая CIM-среда содержит 8 г/л агара. Среда SIM содержит минеральные соли и витамины В 5-средыGM K50 представляет собой GM-среду, дополненную 50 мг/л канамицина. Все культуральные среды стерилизуют автоклавированием (20 мин, 121o С). Витамины растворяют в воде и добавляют к средам перед автоклавированием. Гормоны растворяют в диметилсульфоксиде(ДМСО). Антибиотики растворяют в воде и стерилизуют фильтрацией (0,22 мкм). Гормоны и антибиотики добавляют после автоклавирования и охлаждения сред до 65oС. Во всех случаях используют 9 сантиметровые чашки Петри (фирма Falcon, 3003) за исключением сред GM и GM K50, которые, как правило, разливают в 15-сантиметровые чашки Петри (фирма Falcon, 3025). Пластины с твердыми средами сушат перед применением в ламинарном потоке для удаления конденсата. Пример 7. Штамм Arabidopsis и условия его выращивания. Семена Arabidopsis thaliana экотипа Columbia (Col-0) дикого типа получают от фирмы Lehle Seeds,США (1102 South Industrial Blvd. Suite D, Round Rock TX 78681, США). Растения выращивают при 22o С при световом цикле 16 ч света/8 ч темноты в цветочный горшках в смеси, содержащей 4 части песка, 4 части садовой почвы и 1 часть агриллита. Пример 8. Штамм и культура Agrobacterium. Векторные плазмиды интродуцируют в реципиентный штамм Agrobacterium tumefacien LBA4404(фирма Clontech) путем трехродительского скрещивания согласно протоколу, описанному у Walkerpeach и Velten ("Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: Cointegrate and binary vector systems", in:Plant Molecular Biology Manual, B1: 1-19, 1994, ред-ры.: S.B. Gelvin, R.A., Schilperoort, Kluvers Acad. Publishers.). В качестве мобилизующего штамма используют штамм Е. coli HB101, несущий конъюгированную плазмиду pRK2013 (Ditta и др. Broad host range DNA cloning system from Gram-negative bacteria. Construction of gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351 (1980. Применяемые для трансформации корня агробактерии выращивают в LB-среде (Sambrook и др., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989) без антибиотиков при 28o С и 200 об/мин. Пример 9. Стерилизация семян. Семена помещают в смесь 70% EtOH/0,05% Tween 20 на 1 мин в пробирке Эппендорфа объемом 2 мл. Смесь 70% EtOH/0,05% Tween 20 удаляют с помощью пипетки и заменяют смесью 5% NaOCl/0,05%Tween 20, в которой семена выдерживают 15 мин. Семена регулярно встряхивают. Раствор удаляют в стерильных условиях и семена промывают стерильной дистиллированной водой трижды каждый раз по 10 мин. После последней промывки семена выдерживают в 0,5 - 1 мл воды. Семена можно использовать немедленно или хранить при 4o С в течение 2-3 недель. Стерилизованные семена (20-30 штук) переносят пинцетом на GM-среду в 15-сантиметровые чашки Петри. Ростки выращивают в вертикальном положении в планшетах в вегетационной камере (22o С; световой цикл 16 ч света/8 ч темноты). Пример 10. Трансформация эксплантатов корня Arabidopsis thaliana.- 15006761 Для трансформации используют корни трехнедельных проростков. Корни не должны быть ни зелеными, ни коричневыми. Зеленые части проростков удаляют с помощью скальпеля и пинцета. Отбирают оставшиеся корни и приблизительно по 5 полных корневых систем помещают на планшет с твердойCIM-средой. Корни осторожно прижимают к поверхности планшета для того, чтобы обеспечить полный контакт со средой, однако они не должны быть погружены в агар. Корни инкубируют в течение трех дней в вегетационной камере (22o С; световой цикл 16 света/8 ч темноты). Затем корни переносят в стерильную чашку Петри с фильтровальной бумагой, смоченной жидкой CIM-средой, и разрезают скальпелем на кусочки длиной 0,5-1 см. После этого эксплантаты корня переносят в стерильную пробирку Фалкона объемом 50 мл, содержащую 10 мл жидкой CIM-среды. В нее добавляют 0,5 мл культуры Agrobacterium, выращенной в течение ночи (оптическая плотность ОП 0,6-1) и инкубируют в течение 1-2 мин при осторожном встряхивании. Жидкость сливают из пробирки через стерильные металлические сита(размер ячеек 50 меш, фирма Sigma, сита типа S-0895), которые удерживают с помощью пинцета. Корни обычно остаются на стенке пробирки вблизи ее края. Затем эксплантаты корня переносят в стерильную чашку Петри с фильтровальной бумагой и быстро промокают для удаления избытка жидкости. Эксплантаты корня помещают на планшеты с твердой CIM-средой и инкубируют в вегетационной камере в течение 2 дней при слабом освещении (1,5-2 клк). После периода совместного культивирования можно наблюдать небольшие проявления разрастания Agrobacterium. Затем эксплантаты корня переносят в стерильную пробирку Фалкона объемом 50 мл, содержащую 20 мл жидкой CIM-среды, дополненной 1000 мг/л ванкомицина. После этого пробирки Фалькона осторожно встряхивают для удаления Agrobacteria. Жидкость сливают из пробирки как описано выше и эксплантаты быстро промокают с помощью фильтровальной бумаги. Затем эксплантаты переносят на планшеты, содержащие среду SIM V750 К 100. Корни должны находиться в плотном контакте со средой. Эксплантаты инкубируют в вегетационной камере в стандартных условиях в течение одной недели и затем переносят в среду SIM V750 К 100 и инкубируют в течение еще одной недели. После этого концентрацию ванкомицина уменьшают до 250 мг/л. Появление первых проростков следует ожидать в конце третьей недели культивирования на SIM-среде. Проростки вырезают после того, как они достигают размера 0,3-0,5 см, удаляют весь оставшийся каллюс и проростки переносят на 15-сантиметровые планшеты, содержащие среду GM K50. На один планшет помещают максимум 3 проростка. Для получения большего количества проростков можно переносить оставшиеся эксплантаты еще на две недели на планшеты со свежей SIM-средой, дополненной 125 мг/л ванкомицина и 100 мг/л канамицина. Проростки, имеющие корни, можно переносить в почву с целью получения семян. Проростки, не имеющие корней, переносят в контейнеры типа Magenta (по одному на контейнер),содержащие GM-среду, для получения семян in vitro. Семена отдельных трансгенных растений проращивают на среде GM K50 в вегетационной камере в течение 2 недель. Для дальнейшего анализа отбирают устойчивые к канамицину проростки с нормальным фенотипом, которые имеют зеленые настоящие листья и разветвленную корневую систему. Пример 11. Гистохимический анализ -глюкуронидазы (GUS). Для анализов GUS применяют выращенные in vitro проростки или растения, выращенные в почве. Целые проростки или разрезанные на части органы погружают в раствор для окрашивания GUS. Раствор для окрашивания GUS содержит 1 мМ 5-бром-4-хлор-3-индолилглюкуронид (X-Gluc, фирма Duchefa, 20 мМ маточный раствор в DMSO), 100 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,0, 10 мМ ЭДТК, рН 8,0, и 0,1% Triton X100. Образцы ткани инкубируют при 37 С в течение 1-16 ч. При необходимости образцы можно очищать путем нескольких промывок с использованием 70% EtOH для удаления хлорофилла. Пример 12. Конструирование трансформирующего вектора pZU627 для табака. Все ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы Platinum Pfx (фирма Life Technologies),согласно инструкциям производителя. 1. Амплификация терминатора NOS и клонирование полученного продукта. Терминатор NOS амплифицируют из pBIN19 (Bevan и др. 1984) с использованием прямого праймера для терминатора NOS (SEQ ID NO:21) и обратного праймера для терминатора NOS (SEQ ID NO:22). Прямой праймер модифицируют таким образом, чтобы он содержал сайт PstI, а обратный праймер модифицируют таким образом, чтобы он содержал сайт HindIII. Продукт амплификации терминатора NOS клонируют в виде PstI/HindIII-фрагмента в тех же сайтах вектора pBluescript (фирма Stratagene), получая плазмиду pZU400A. 2. Амплификация и клонирование гена нуклеокапсидного протеина вируса пятнистого увядания томата (NP TSWV). При получении с помощью амплификации нетранслируемого гена NP TSWV используют модифицированные праймеры для гена NP TSWV. В прямой праймер для гена NP TSWV встраивают сайтыBamHI, SphI, инициирующий и терминирующий кодоны (SEQ ID NO:23). Обратный праймер модифицируют таким образом, чтобы он содержал сайт PstI (SEQ ID NO:24). Амплифицированный продукт клонируют в виде BamHI/PstI-фрагмента в сайте BamHI/PstI плазмиды pZU400A против хода транскрипции и том же направлении, что и терминатор NOS. В полученном клоне pZU400b сайт PstI, расположенный между геном NP TSWV и терминатором NOS, удаляют путем обработки ДНК-полимеразой фага Т 4SphI/HindIII челночного вектора pZO1560, получая плазмиду pZU400. pZO1560 является производным вектора pBluescript, в котором исходный сайт множественного клонирования заменен сайтом множественного клонирования AGLINK (SEQ ID NO:27). 3. Амплификация и клонирование промотора вируса CmYLCV. Промотор вируса CmYLCV амплифицируют с использованием прямого праймера для промотора вируса CmYLCV (SEQ ID NO:25) и обратного праймера для промотора вируса CmYLCV (SEQ IDNO:26). Прямой праймер модифицируют таким образом, чтобы он содержал сайт SstI, а обратный праймер таким образом, чтобы он содержал сайт PstI. Амплифицированный промотор вируса CmYLCV клонируют в виде SstI/PstI-фрагмента в сайте SstI/PstI плазмиды pZU400 в том же направлении и против хода транскрипции относительно гена NP TSWV. В результате получают клон pZU625, который содержит кассету вирусного гена, позволяющую получать нетранслируемую РНК гена NP TSWV. 4. Клонирование кассеты вирусного гена в pVictorHiNK. Кассету вирусного гена клонируют в виде AscI/PacI-фрагмента плазмиды pZU625 в сайте AscI/PacI вектора pZU494 в плазмиде pVictorHiNK. В результате получают растительный трансформирующий вектор pZU627. pVictorHiNK представляет собой бинарный вектор, который содержит сайт инициации репликации (ORI), выделенный из плазмиды pVSl Pseudomonas aeruginosa, в отношении которого известно,что он обладает высокой стабильностью в А. tumefaciens (Itoh и др., Plasmid 11:206-220 (1984); Itoh иHaas, Gene 36;27-36 (1985. ORI pVS1 функционирует только в Agrobacterium и его можно мобилизировать в A. tumefaciens с помощью плазмиды-хелпера pRK2013, происходящей из Е. coli, с использованием процедуры трехродительского скрещивания (Ditta и др., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347-7351 (1980. Этот бинарный вектор содержит также сайт инициации репликации ColEI, выделенный из pUC19(Yannisch-Perron и др., Gene 33:103-119 (1985, который функционирует в Е. coli. Для сохранения в E.coli и A. tumefaciens этот вектор содержит бактериальный ген устойчивости к спектомицину и стрептомицину, который кодируется геном транспозона Тn7, имеющим длину 0,93 т.п.н.(Fling и др., Nucl. Acid Res. 13:7095 (1985, который функционирует в качестве маркера для селекции по признаку наличия вектора в Е. coli и A. tumefaciens. Для повышения эффективности бактериальной экспрессии ген сливают с промотором tac (Amman и др., Gene 25: 167-178 (1983. Правый и левый пограничные фрагменты Т-ДНК длиной 1,9 т.п.н. и 0,9 т.п.н. соответственно, содержащие пограничные повторы длиной 24 пары оснований, получают из Ti-плазмиды штаммов A. tumefaciens нопалинового типа pTiI37 (Yadev и др., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA. 79:6322-6326 (1982. Затем область Т-ДНК, расположенную между пограничными последовательностями, модифицируют путем удаления последовательностей, происходящих из M13, и для увеличения вариантов его клонирования встраивают сайт множественного клонирования BIGLINK (SEQ ID NO:28), получая pVictorHiNK.PVictorHiNK содержит генную кассету NPTII для отбора трансформантов в процессе трансформации растений. Эта генная кассета содержит промотор NOS, ген NPTII и терминатор NOS, полученный изA. tumefaciens. Пример 13. Трансформация растений и скрининг по признаку устойчивости. 1. Трансформация растительного материала с помощью бинарных векторов. Методы переноса бинарных векторов в растительный материал хорошо разработаны и известны специалисту в данной области. Имеются различия в процедурах, обусловленные, например, тем, что применяют различные штаммы Agrobacterium, различные источники получения эксплантатов, различные системы регенерации, которые зависят как от сорта, так и от вида используемого растения. Бинарный вектор pZU627 в экспериментах по трансформации растений применяют согласно описанной ниже процедуре. PZU627 переносят путем трехродительского скрещивания в штамм-акцептор Agrobacterium tumefaciens, после чего методом саузерн-блоттинга осуществляют анализ экс-конъюгантов для проверки правильного переноса конструкции в штамм-акцептор, инокуляцию и совместное культивирование стерильного эксплантата с рекомбинантным штаммом Agrobacterium tumefaciens, селективное уничтожение штамма Agrobacterium tumefaciens с использованием соответствующих антибиотиков, селекцию трансформированных клеток путем выращивания на средах для селекции, содержащих канамицин, перенос проростков в почву, оценку методом саузерн-блотинга степени интактности интегрированной Т-ДНК с помощью анализа выделенной хромосомной ДНК растения. 2. Устойчивость растений к инфекциям, вызываемым TSWV. Трансформированные растения выращивают в теплице в стандартных карантинных условиях для того, чтобы не допустить никакой инфекции, вызываемой патогенами. На стадии четырех листьев растения заражают TSWV путем механической инокуляции. Ткань растений, системно инфицированныхTSWV, измельчают в 5 объемах охлажденного на льду буфера для инокуляции (10 мМ фосфатный буфер,дополненный 1% Na2SO3) и натирают ею в присутствии карборундового порошка два первые полностью распустившиеся новые листа. В течение трех недель после инокуляции осуществляют наблюдение развития симптомов заболевания у инокулированных растений. У растений, которые содержат последовательности pZU627, не выявлено симптомов заболевания, вызываемого TSWV, в то время как у нетрансформированных контрольных растений в течение 7 дней после инокуляции проявляются серьезные сим- 17006761 птомы системного заболевания, вызываемого TSWV. Устойчивые растения подвергают самоопылению и собирают семена. Потомство растений анализируют в отношении сегрегации встроенного гена и затем подвергают повторному скринингу по признаку устойчивости к TSWV-инфекции согласно описанной выше процедуре. Пример 14. Создание конструкций СmрS-фосфоманнозо-изомераза-nos для трансформации растений. Промотор CmpS амплифицируют с помощью ПЦР с использованием праймеров Cmpf-B (cgc gga tcctgg cag аса aag tgg cag a; SEQ ID NO:29) и CmpS-B (cgc gga tcc tac ttc tag gct act tg, SEQ ID NO:30), имеющих фланкирующие сайты BamHI. Образовавшийся PCR-фрагмент клонируют в сайте BamHI pBluescriptKS (+), получая pNOV4211. Для создания бинарного вектора, предназначенного для трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens, промотор CmpS выделяют из pNOV4211 путем отщепления с помощью BamHI и встраивают в расщепленный с помощью BamHI вектор pNOV2804 (SEQ ID NO:31) против хода транскрипции относительно гена PMI, образовавшийся вектор обозначают как pNOV2819. pNOV2804 (SEQ IDNO:31) представляет собой бинарный вектор, содержащий сайт инициации репликации VS1, копию генаvirG Agrobacterium в каркасной области и лишенную промотора кассету экспрессии PMI-терминатор nos между левой и правой пограничными последовательностями Т-ДНК. PMI (фосфоманнозо-изомераза) представляет собой кодирующую область гена manA E.coli (Joersbo и Okkels, Plant Cell Reports 16:219221 (1996), Negrotto и др., Plant Cell Reports 19:798-803 (2000. Терминатор nos (нопалинсинтазы) выделяют из Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens (Depicker и др., J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982. Кодирующая область фосфоманнозо-изомеразы и терминатор nos простираются от нуклеотида 290 до нуклеотида 1465 и от нуклеотида 1516 до нуклеотида 1789 соответственно pNOV2804 (SEQ ID NO:31). Для создания вектора, предназначенного для биобаллистической трансформации, промотор CmpS отщепляют от pNOV4211 с помощью BamHI и встраивают в расщепленный с помощью BamHI векторpNOV3604 (SEQ ID NO:32) получая pNOV2820, в результате чего создается кассета экспрессии PMI, находящаяся под контролем промотора CmpS. pNOV3604 представляет собой вектор для получения предназначенных для биобаллистической доставки фрагментов, созданный на основе pUC19, содержащий сайт инициации репликации ColEI и ген бета-лактамазы, обусловливающий устойчивость к ампициллину. Так же как и pNOV2804, pNOV3604 содержит лишенную промотора кассету экспрессии PMIтерминатор nos (см. выше). Кодирующая область фосфоманнозо-изомеразы и терминатор nos простираются от нуклеотида 42 до нуклеотида 1217 и от нуклеотида 1268 до нуклеотида 1541 соответственноpNOV3604 (SEQ ID NO:32). Бинарный вектор pNOV2819 применяют для трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens, а вектор pNOV2820 применяют для биобаллистической трансформации. Пример 15. Конструирование CmpC-GUS-плазмид для стабильной экспрессии in planta. 1. Конструирование бинарного вектора. Для экспериментов был выбран вектор pCambia 1302 (Cambia, Canberra, Australia; Roberts, C.S., Rajagopal, S., Smith, L., Nguyen, Т., Yang, W., Nugroho, S., Ravi, K.S. Cao, M.L., Vijayachandra, K., и др. Acomprehensive set of modular vectors for advanced manipulation and efficient transformation of plants. Presented at the Rockefeller Foundation Meeting of the International Program on Rice Biotechnology, Malacca,Malaysia, September 15-19 (1997 и его модифицируют следующим образом: промотор 35S CaMV, расположенный перед геном GFP, удаляют путем расщепления в положении 9788 с помощью эндонуклеазыHindIII и в положении 1 с помощью эндонуклеазы NcoI, и вектор повторно сшивают путем лигирования по двум совместимым концам. Путем расщепления с помощью эндонуклеазы XhoI в положении 7613 и с помощью BstXI в положении 9494 удаляют ген устойчивости к гигромицину и находящийся перед ним промотор 35S CaMV. Последовательности промотора 35S удаляют из вектора для того, чтобы исключить любой возможный риск того, что вследствие гомологии ген окажется молчащим. Ген bar, находящийся под контролем промотора 1' (Mengiste и др., Plant J, 12(4): 945-948 (1997,встраивают в сайт ЕсоRI в положении 9737 в качестве селектируемого маркера. Полученный вектор обозначают как pCamBar. 2. Полученные конструкции. Кассеты CmpCG и CapG, описанные в примере 3, встраивают в вектор pCamBar между сайтом ХbаI в положении 9764 и сайтом EcoRI в положении 9737, получая плазмиды pCamBarCmpCG и pCamBarCapG соответственно. Обе конструкции используют для трансформации клеток Agrobacterium tumefaciens. Пример 16. Стабильная экспрессия в Arabidopsis thaliana. 1. Получение и трансфекция растений. Высевают семена Arabidopsis thaliana (Columbia 0) дикого типа, которые выдерживали в течение 3 дней в холодных условиях при at 4C в темноте для синхронизации прорастания, и переносят в вегетационную камеру (22 С/освещение в течение 24 ч). Проросшие растения подвергают инфильтрации, когда у них образуется максимальное количество нераскрытых почек. Инфильтрацию осуществляют согласно протоколу, описанному у Clough и Bent, Plant J. 16: 735-743 (1987).- 18006761 2. Отбор трансгенных растений. Осуществляют отбор проростков из семян поколения Т 1, опрыскивая их гербицидом BASTA (фирма Pluss-Staufer AG/SA) (150 мг/л) три раза через каждые пять дней. Путем отбора получают двадцать устойчивых к pCamBarCmpCG и девять устойчивых к pCamBarCapG растений. Их выращивают в описанных условиях, получая семена поколения Т 2. Эти семена подвергают процедуре, описанной выше для растений дикого типа, отбирают проростки поколения Т 2 с использованием опрыскивания гербицидомBASTA и осуществляют анализ устойчивых мутантов в отношении экспрессии гена GUS. 3. Гистохимическое исследование экспрессии гена GUS в стабильно трансформированных растениях Arabidopsis. Гистохимическое окрашивание для выявления GUS осуществляют согласно методу, описанному в примере 11. Анализ проводят в пробирках с культурой объемом 15 мл путем погружения трансформированных проростков в раствор X-Gluc, выдерживания в течение 10 мин при давлении 130 мбар и инкубации в течение ночи при 37 С. Результаты, полученные для растений Arabidopsis, трансформированных с помощью pCamBarCmpCG, свидетельствуют о наличии во всех вегетативных органах конститутивной экспрессии репортерного гена GUS, которая осуществляется под контролем промотора СmрС. 4. Количественный ферментативный анализ GUS в стабильно трансформированных растенияхArabidopsis. А. Получение образцов. Для исследования отбирают по четыре растения для каждой трансгенной линии и с каждого из этих растений берут по одному листу. Четыре листа вносят в одну пробирку Эппендорфа, замораживают с помощью жидкого азота и размалывают с помощью соответствующих мельниц до получения тонкоизмельченного порошка. Порошок разбавляют 150 мкл GUS-буфера (0,05 М NaPO4, рН 7, 0,01 М ЭДТК,0,1% Triton-X-100, 0,1% саркозила), инкубируют в течение 5 мин при 37 С и продукт вращают в микроцентрифуге в течение 5 мин при максимальной скорости. Супернатант переносят в новую пробирку Эппендорфа и полученные образцы используют для ферментативного анализа. Содержание протеина в указанных растительных экстрактах оценивают по методу Бредфорда(Bradford M.M., Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976, используя в качестве стандарта БСА (бычий сывороточный альбумин). Присутствие промотора и гена GUS в мутантных линиях подтверждают с помощью ПЦР-анализа, используя экстрагированные образцы в качестве матрицы. Б. Флуорометрический анализ GUS. Флуорометрический анализ GUS проводят согласно методу, описанному в примере 5. Для обнаружения экспрессии гена GUS образцы разбавляют GUS-буфером. Реакцию проводят при 37 С в присутствии одинаковых количеств GUS-буфера для реакции и прекращают путем добавления 2 М аммедиола. Активность измеряют с помощью устройства типа Titertek Fluoroskan II. У пятнадцати из двадцати отобранных линий, трансформированных с помощью pCamBarCmpCG, и у восьми из девяти линий, трансформированных с помощью pCamBarCapG, выявлена ферментативная активность GUS в листьях. Уровень активности для некоторых линий, трансформированных с помощьюCmpCG, оказался сопоставимым с уровнем активности линий, трансформированных с помощью CapG. Однако результаты варьируются для различных трансгенных линий вследствие различий их генотипов(количество локусов и количество трансгенных вставок в каждый локус). Пример 17. Конструирование вариантов промотора СmрС. Все ПЦР осуществляют с использованием полимеразы Pfu (фирма Stratagene) согласно методу,описанному в примере 1. 1. Амплификация и клонирование ДНК. Получают два варианта плазмиды pCmpCG (пример 3), а именно pCmpMG и pCmpMsG. У первой в промоторе pCmpCG отсутствует последовательность "GTGGTCCC", а у последней указанная последовательность в результате мутации превращена в последовательность "GTGCTCGC". Для получения pCmpMG амплифицируют три ПЦР-продукта:CmpM1 - с использованием прямого парймера Cmp1 (см. пример 3, SEQ ID NO:13), обратного праймера CmpMr (CCATCGTGGTATTTGGTATTG, SEQ ID NO:33) и плазмиды pCmpCG в качестве матрицы. СmрМ 2 - с использованием прямого праймера CmpMf (CAATACCAAATACCACGATGG; SEQ IDNO:34), обратного праймера CmpC2 (см. пример 3; SEQ ID NO:14) и плазмиды pCmpCG в качестве матрицы. СmрМ - с использованием прямого праймера Cmp1, обратного праймера СmрС 2 и эквимолярной смеси ПЦР-продуктов CmpM1 и СmрМ 2 в качестве матрицы. Для получения pCmpMsG амплифицируют три ПЦР-продукта:CmpMs1 - с использованием прямого праймера Cmp1, обратного праймера CmpMrs (CGTGGTAGCGAGCACTTTGGT, SEQ ID NO:35) и плазмиды pCmpCG в качестве матрицы.CmpMs2 - с использованием прямого праймера CmpMfs (AAGTGCTCGCTACCACGATGG, SEQ IDCmpsM - с использованием прямого праймера Cmp1, обратного праймера Сmр 2 и эквимолярной- 19006761 смеси ПЦР-продуктов CmpMs1 и CmpMs2 в качестве матрицы. Для получения плазмид pCmpMG и pCmpMsG исходную плазмиду pCmpCG расщепляют с помощью эндонуклеаз ХbaI и BamHI для того, чтобы исключить фрагмент СmрС и вместо него встроить ПЦР-продукты СmрМ и CmpMs. Пример 18. Эксперименты по осуществлению кратковременной экспрессии с использованием конструкций рСmрМ и pCmpMs. 1.Получение суспензионных культур и протопластов. Суспензионные культуры и протопласты получают согласно процедуре, описанной в примере 4. 2. Анализ GUS. Трансфекцию и получение протеиновых экстрактов осуществляют согласно процедуре, описанной в примере 4, а анализ GUS проводят согласно процедуре, описанной в примере 5. Результаты анализа GUS представляют собой средние значения результатов десяти различных экспериментов и их нормализуют по отношению к значению для стандартного клона. Делеция последовательности "GTGGTCCC" в конструкции CmpCG приводит к снижению экспрессии репортерного генаGUS под контролем СmрС приблизительно на 50% во всех типах протопласта (см. ниже). Эффект, вызываемый мутацией "GTGCTCGC" зависит от вида растения. В протопластах О. violaceus и О. sativa уровень экспрессии гена GUS понижается на 65,2% и 73,6% соответственно. В протопластах N. plumbaginifolia активность промотора CmpMs близка к активности промотора СmрМ. Пример 19. Конструирование растительных трансформирующих векторов, содержащих 5'- промоторные фрагменты, функционально связанные с репортерными генами GFP или GUS. 1. Амплификация и клонирование промотора. Конструируют химерный ген, который содержит последовательность ДНК промотора первичного транскрипта CmYLCV (SEQ ID NO:1), слитую с оптимизированной для растения последовательностьюGFP, содержащей интрон (synGFPI, SEQ ID NO:37), или с последовательностью репортерного гена GUS,содержащей интрон (GIG; SEQ ID NO:38). Ген GIG содержит интрон ST-LS1 из Solarium tuberosum, простирающийся от нуклеотида 385 до нуклеотида 576 SEQ ID NO: 38 (получен от д-ра Stanton Gelvin, Purdue University, описан Narasimhulu и др., Plant Cell, 8: 873-886 (1996. SynGFPI представляет собой оптимизированный для растения ген GFP, в который встроен интрон ST-LS1 (от нуклеотида 278 до нуклеотида 465 SEQ ID NO:37). Для амплификации промоторов в качестве матрицы при осуществлении полимеразной цепной реакции (ПЦР) используют геномную ДНК CmYLCV. Для амплификации последовательности ДНК конструируют специфичные для гена праймеры. Фрагмент гена, соответствующий CmpC(SEQ ID NO:2) выделяют с использованием прямого праймера Cmpf-B (SEQ ID NO:29) в сочетании с 5' 3' праймером CGCGGATTGCTCCCTTAACAATGAGG (SEQ ID NO:39) в качестве обратного праймера. Фрагмент гена, соответствующий CmpS (SEQ ID NO:3) выделяют с использованием прямого праймераCmpf-B (SEQ ID NO:29) в сочетании с обратным праймером CmpS-B (SEQ ID NO:30). Все три праймера содержат на своих 5'-концах сайт CGCGGA, распознаваемый рестриктазой BamHI. Все ПЦР осуществ- 20006761 ляют с использованием полимеразы Pfu согласно рекомендациям производителя (фирма Stratagene). Для амплификации промоторных фрагментов применяют термоячейку (типа DNA Engine, фирма MJResearch,Inc., Уолтем, штат Массачусетс, США) и используют следующие условия для ПЦР: [(94 С:10 с):(94 С:10 с/56 С:30 с/72 оС:1 мин)х 20]:(72 С:1,5 мин)]. После расщепления рестриктазой BamHI промоторные фрагменты сшивают путем лигирования в векторах, созданных на основе pUC, с геном GIG или геном synGFPI, в результате чего получают слияния промотор-репортерный ген, функционально связанные с терминатором nos. 2. Полученные кассеты промотор-репортерный ген промоторный фрагмент CmpS + ген synGFPI + nos (SEQ ID NO:40) промоторный фрагмент CmpS + ген GIG + nos (SEQ ID NO:41) промоторный фрагмент CmpC + ген synGFPI + nos (SEQ ID NO:42) промоторный фрагмент CmpC + ген GIG + nos (SEQ ID NO:43) 3. Субклонирование в бинарном векторе Agrobacterium Кассеты промотор-репортерный ген (SEQ ID NO:40 - 43), содержащие промоторный фрагмент, репортерный ген и терминатор nos, встраивают в бинарный вектор pNOV2117, предназначенный для трансформации кукурузы, и в бинарный вектор pNOV4200, предназначенный для трансформации томатов. pNOV2117 (SEQ ID NO:44) представляет собой бинарный вектор, содержащий в каркасной области сайт инициации репликации VS1, копию гена virG Agrobacterium, а также кассету экспрессии промотор убикитина кукурузы-ген PMI-терминатор nos, расположенную между левой и правой пограничными последовательностями Т-ДНК. PMI (фосфоманнозо-изомераза) представляет собой кодирующую область гена manA E.coli (Joersbo и Okkels, Plant Cell Reports 16:219-221 (1996), Negrotto и др., Plant Cell Reports 19:798-803 (2000. Терминатор nos (нопалинсинтазы) выделяют из Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens(Depicker и др., J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982. Промотор убикитина кукурузы, кодирующая область фосфоманнозо-изомеразы и терминатор nos простираются от нуклеотида 31 до нуклеотида 2012,от нуклеотида 2109 до нуклеотида 3212 и от нуклеотида 3273 до нуклеотида 3521 соответственноpNOV2117 (SEQ ID NO:44). Кассеты репортерный ген-промотор встраивают максимально близко к правой пограничной последовательности. Кассету экспрессии, содержащую селектируемый маркер, встраивают в бинарные векторы максимально близко к левой пограничной последовательности. Для трансформации томатов в качестве бинарного вектора используют pNOV4200 (SEQ ID NO:45),который содержит в каркасной области сайт инициации репликации VS1, копию гена virG Agrobacterium и кассету, содержащую селектируемый маркер по признаку устойчивости к гигромицину, расположенную между левой и правой пограничными последовательностями. Кассета с селектируемым маркером по признаку устойчивости к гигромицину содержит промотор убикитина 3 Arabidopsis (Ubq3(At), Callis и др., J. Biol. Chem. 265:12486-12493 (1990, функционально связанный с геном, кодирующим устойчивость к гигромицину (в настоящем описании обозначен как "HYG", синтетический ген гигромицин Вфосфотрансферазы из E.coli, патент: JP 1986085192-А 1 30-APR-1986) и терминатор nos (Depicker и др.,J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982. Промотор убикитина Arabidopsis, ген HYG и терминатор nos простираются от нуклеотида 162 до нуклеотида 11494, от нуклеотида 1897 до нуклеотида 2939 и от нуклеотида 2939 до нуклеотида 3236 соответственно pNOV4200 (SEQ ID NO:45). Кассеты репортерный генпромотор (SEQ ID NO:40 - 43) встраивают максимально близко к правой пограничной последовательности. Кассеты экспрессии, содержащие селектируемый маркер, встраивают в бинарные векторы максимально близко к левой пограничной последовательности. Ниже приведены ориентации селектируемого маркера и кассет промотор-репортерный ген в конструкциях бинарных векторов. 4. Конструкции бинарных векторов:NOV4215 (примыкающий к правой пограничной последовательности промоторный фрагмент (RBфрагмент) CmpS + ген synGFPI + nos - ZmUbi + ген PMI + nos, примыкающий к левой пограничной последовательности (LB-nos NOV4216 (RB-nos + ген synGFPI + промоторный фрагмент CmpS - ZmUbi + ген PMI + LB-nos)NOV4226 (RB-промоторный фрагмент CmpC + ген synGFPI + nos - ZmUbi + ген PMI + LB-nos) С целью сравнения конструируют дополнительные кассеты с использованием известных промоторов. Для этого создают также содержащую промотор кассету ZmUbi-GFP-35S term (SEQ ID NO:46), содержащую промотор убикитина кукурузы (Christensen и др. Plant Molec. Biol.12: 619-632 (1989, функционально связанный с synGFP, и терминатором 35S (35S term), и промоторную касету, содержащую промотор убикитина, функционально связанный с геном GIG, и терминатором nos (NOV 3612, SEQ IDNO:47). Промотор ZmUbi, ген GFP и терминатор 35S простираются от нуклеотида 1 до нуклеотида 2019,от нуклеотида 2020 до нуклеотида 2751 и от нуклеотида 2876 до нуклеотида 2949 соответственно SEQ IDNO:46. Промотор ZmUbi, ген GIG и терминатор nos простираются от нуклеотида 1 до нуклеотида 1982,от нуклеотида 2015 до нуклеотида 4015 и от нуклеотида 4069 до нуклеотида 4341 соответственно SEQ IDNO:47. Кассету ZmUbi-GIG-nos (SEQ ID NO: 47) клонируют в векторе, созданном на основе pUC. Кассету ZmUbi-GFP-nos (SEQ ID NO:46 ) клонируют в бинарном векторе pNOV2117, предназначенном для трансформации кукурузы, согласно описанному выше методу. Конструируют промоторные кассеты, содержащие промотор убикитина 3 Arabidopsis (Ubq3(At, функционально связанный с synGFPI, и терминатор nos (SEQ ID NO:48), промотор убикитина 3 Arabidopsis, функционально связанный с геном GIG, и терминатор nos (SEQ ID NO:49). Промотор убикитина 3, synGFPI и терминатор nos простираются от нуклеотида 1 до нуклеотида 1332, от нуклеотида 1738 до нуклеотида 2658 и от нуклеотида 2670 до нуклеотида 2943 соответственно SEQ ID NO: 48. Промотор убикитина 3, ген GIG и терминатор nos простираются от нуклеотида 1 до нуклеотида 1335, от нуклеотида 1746 до нуклеотида 3746 и от нуклеотида 3800 до нуклеотида 4072 соответственно SEQ ID NO: 49. Как описано выше, включающией промотор кассеты клонируют в бинарном векторе pNOV4200, включающем кассету, которая включает селектируемый по признаку устойчивости к гигромицину маркер, предназначенную для трансформации томатов. Ниже приведены ориентации селектируемого маркера и кассет промотор-репортерный ген в конструкциях бинарных векторов. 5. Конструкции бинарных векторов:NOV4208 (RB-промотор Ubq3(At) + интрон GUS - ген GUS + nos - Ubq3(At) + ген HYG + LB-nos) Пример 20. Трансформация растений кукурузы, опосредуемая Agrobacterium. Трансформацию незрелых зародышей кукурузы осуществляют в основном согласно методу, описанному у Negrotto и др., Plant Cell Reports 19: 798-803 (2000). В рассматриваемом примере в качестве всех компонентов, входящих в состав сред, использовали компоненты, описанные у Negrotto и др., см. выше. Следует иметь ввиду, что различные компоненты сред, указанные в литературе, можно заменять другими. 1. Трансформирующие плазмиды и селектируемый маркер. Гены, которые используют для трансформации, клонируют в векторе, пригодном для трансформации кукурузы, согласно методу, описанному в примере 19. Применяемые векторы содержат ген фосфоманнозо-изомеразы (PMI) (Negrotto и др. Plant Cell Reports 19: 798-803 (2000. 2. Получение штамма Agrobacterium tumefaciens. Штамм Agrobacterium LBA4404 (pSB1), содержащий плазмиду для трансформации растений, выращивают в течение 2-4 дней при 28 С в твердой среде YEP (дрожжевой экстракт (5 г/л), пептон (10 г/л),NaCl (5 г/л), агар (15 г/л), рН 6,8). Приблизительно 0,8 х 109 агробактерий суспендируют в среде LS-inf,дополненной 100 мкМ ацетосирингоном (As) (Negrotto и др., Plant Cell Rep 19: 798-803 (2000. Бактерии подвергают предварительной индукции в этой среде в течение 30-60 мин. 3. Инокуляция. Незрелые зародыши линии А 188 или другого пригодного генотипа кукурузы вырезают из 8 - 12 дневных початков и помещают в жидкую среду LS-inf + 100 мкМ As. Зародыши промывают один раз свежей инфицирующей средой. Затем добавляют раствор, содержащий Agrobacterium, зародыши перемешивают в течение 30 с, после чего дают осадиться на них бактериям в течение 5 мин. Затем зародыши помещают в LSAs-среду так, чтобы щиток располагался сверху, и культивируют в темноте в течение 2-3 дней. Затем зародыши переносят (по 20-25 зародышей на чашку Петри) в LSDc-среду, дополненную цефотаксимом (250 мг/л) и нитратом серебра (1,6 мг/л) и культивируют в темноте при 28 С в течение 10 дней. 4. Отбор трансформированных клеток и регенерация трансформированных растений. Незрелые зародыши, продуцирующие эмбриогенный каллюс, переносят в среду LSD1M0.5S. Культуры подвергают селекции в этой среде в течение 6 недель, осуществляя стадии пересева через 3 недели. Выжившие каллюсы переносят либо в среду LSD1M0.5S для увеличения их объема, либо в среду Reg1. После культивирования на свету (световой режим: 16 ч света/8 ч темноты), зеленые ткани переносят в среду Reg2, не содержащую регуляторов роста, и инкубируют в течение 1-2 недель. Проростки переносят в коробки типа Magenta GA-7 (фирма Magenta Corp, Чикаго, штат Иллинойс), содержащие средуReg3, и выращивают на свету. Растения, у которых выявлен позитивный ответ при проведении ПЦР на наличие кассеты промотор-репортерный ген, переносят в почву и выращивают в теплице.- 22006761 Пример 21. Стабильная трансформация томатов. Трансформацию томатов осуществляют, практически следуя методу, описанному у Meissner и др.,The Plant Journal 12: 1465-1472 (1997). 1. Трансформирующие плазмиды и селектируемый маркер. Гены, которые используют для трансформации, клонируют в бинарном векторе, пригодном для трансформации томатов, согласно методу, описанному в примере 19. Векторы содержат ген устойчивости к гигромицину, предназначенный для селекции. 2. Получение штамма Agrobacterium tumefaciens. Штамм Agrobacterium GV3101, содержащий плазмиду для трансформации растений, культивируют в течение 2 дней при 22 С в жидкой среде LB (дрожжевой экстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), NaCl (5 г/л),агар (15 г/л), рН 6,8). Приблизительно 0,8 х 109 агробактерий суспендируют в среде KCMS для инокуляции (MS-соли (4,3 г/л), Муо-инозит, тиамин (1,3 мкг/мл), 2,4-Д (0,2 мкг/мл), кинетин (0,1 мкг/мл) и 3% сахарозы, рН 5,5), дополненной 100 мкМ ацетосирингоном. Бактерии подвергают предварительной индукции в этой среде в течение 30-60 мин. 3. Стерилизация и проращивание семян. Семена томатов сорта Micro-Tom (Meissner и др., The Plant Journal 12: 1465-1472 (1997 и сортовZTV-840 пропитывают в течение 20 мин 20%-ным раствором хлорной извести, содержащим Tween. Затем семена трижды промывают стерильной водой и высевают для проращивания на среду TSG (MS-соли половинной крепости, 1% сахарозы, 1% фитоагара, рН 5,8) в коробки типа Magenta (фирма Magenta Corp,Чикаго, штат Иллинойс). Через 7-10 дней после прорастания вырезают семядоли и черешки семядолей разрезают на сегменты длиной 5 мм. 4. Инокуляция. 7-10-дневные семядоли и сегменты черешков семядолей перед осуществлением инокуляции с использованием Agrobacterium инкубируют в течение 24 ч на планшетах, содержащих в качестве питающих клеток клетки табака линии BY-2 (MS-соли, Муо-инизит (0,1 мг/мл), гидролизат казеина (0,2 мг/мл),тиамин-НСl (1,3 мкг/мл), 3% сахарозы, рН 5,5). Семядоли погружают на 5 мин в жидкую суспензию KCMS, содержащую Agrobacterium. Затем 2025 семядолей помещают абаксиальной стороной вверх на те же самые планшеты, содержащие питательные клетки, и культивируют в темноте в течение 2-3 дней. 5. Отбор трансформированных семядолей и черешков и регенерация трансформированных растений. Семядоли и фрагменты черешков переносят на среду для селекции TSM-1 (4,3 г/л MS-солей, витамины В 5 (1 х), 2% сахарозы, 1% глюкозы, 1 мкг/мл зеатина, 0,05 мкг/мл ИУК, 5 мкг/мл гигромицина и 250 мкг/мл карбенициллина, рН 5,8) через 2-3 дня после инокуляции с использованием Agrobacterium и выращивают на свету. Семядоли и сегменты черешков, продуцирующие эмбриогенный каллюс, переносят на среду TSM-2 (MS-соли (4,3 г/л), MS-витамины (1 х), 2% сахарозы, 1 мкг/мл зеатина, 5 мкг/мл гигромицина и 250 мкг/мл карбенициллина, рН 5,8). Выжившие проростки, образующие каллюс, переносят в коробки типа GA-7 (фирма Magenta Corp, Чикаго, штат Иллинойс) со средой TRM (4,3 г/л MS-соли,MS-витамины (1 х), 2% сахарозы, рН 5,8) и выращивают на свету. После формирования корней первичные трансформанты переносят в почву. Пример 22. Флуорометрический анализ зеленого флуоресцентного протеина (GFP). Для обнаружения экспрессии гена synGFP осуществляют флуорометрический анализ. Диски листьев стабильно трансформированных растений кукурузы и томатов замораживают с помощью сухого льда. Замороженную ткань тщательно измельчают и смешивают с 300 мкл буфера для экстракции GFP (10 мМ Трис-НСl (рН 7,5), 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ (дитиотреитол) и 0,1% саркозила). Экстракты отделяют от дебриса листьев путем центрифугирования, после чего переносят в 96-луночный планшет черного цвета с прозрачным дном (типа Costar 3615). Относительные единицы флуоресценции (RFU) измеряют с помощью планшет-ридера типа Spectra Fluor Plus при длине волны возбуждения 465 нм и длине волны испускания 512 нм. Активность GFP нормализуют по отношению к активности общего протеина, измеренной на основе анализа с использованием ВСА (согласно методу Пирса (Pierce. Пример 23. Анализ экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы и томатов. 1. Трансгенные растения Zea mays линии То. Экспрессия GFP, осуществляемая под контролем промотора CmpS (NOV4215, NOV4216), в 10-20 раз превышает экспрессию, осуществляемую под контролем промотора ZmUbi (NOV2110). Эти результаты были получены с использованием образцов листьев 42 независимых линий То, взятых от 93 растений линий То. 2. Анализ GFP с помощью метода ELISA. Для обнаружения зеленого флуоресцентного протеина (GFP) осуществляют количественный сэндвич-иммуноанализ. Используют два поступающих в продажу поликлональных антитела. С помощью иммунноаффинной хроматографии очищают козлиное антитело к GFP IAP (фирма Rockland, 600-1-1215), а кроличье антитело к GFP (фирма Torrey Pines Biolabs, TP401) очищают с использованием про- 23006761 теина А. Протеин GFP в растительных экстрактах захватывают кроличьим антителом, иммобилизованным на твердой подложке в титрационном микропланшете. Затем образуется сэндвич, состоящий из кроличьего антитела, иммобилизованного на твердой подложке, протеина GFP и второго козлиного антитела, присутствующего в лунке. После стадии промывки, во время которой удаляют несвязанное второе антитело, проводят обнаружение связанного антитела с использованием антитела, меченого с помощью щелочной фосфатазы. Добавляют субстрат для фермента и в каждой лунке оценивают изменение окраски путем измерения уровня поглощения. Затем данные аппроксимируют стандартной кривой и строят график зависимости концентрации GFP от уровня поглощения. Репортерный ген syn GFP 2. Растения Lycopersicon esculentum линии То. Присутствие промоторного фрагмента CmpS CmYLCV (NOV 4217) приводит к уровню экспрессииsynGFP, существенно превышающему уровень экспрессии в присутствии промотора Ubq3 Arabidopsis(NOV 4209). Репортерный ген synGFP. Результаты были получены путем оценки с помощью микроскопа интенсивности флуоресценцииsynGFP в каллюсе и первичных проростках для 5 независимых стабильно трансформированных линий каллюса, для трансформации которых использовали кассету NOV4217, и 2 независимых стабильно трансформированных линий каллюса, для трансформации которых использовали кассету NOV4209. Кассета Gus-интрон-репортерный ген GUS. Результаты получают путем оценки интенсивности окрашивания GUS для 11 независимых стабильно трансформированных линий каллюса, содержащих кассеты промотор CmpS-репортерный ген(линии NOV4220-1 - NOV4220-11). Исследуют две стабильно трансформированные линии, содержащие промоторный фрагмент СmрС промотора CmYLCV (NOV4224-1, NOV4224-2). Для сравнения используют две стабильно трансформированные линии каллюса, содержащие промотор убикитина 3 (Ubq3) Пример 24. Эксперименты по кратковременной экспрессии в растениях кукурузы. 1. Получение зародышей. Незрелые зародыши вырезают из 8-12-дневных початков растений кукурузы, имеющих генотип А 188 или другой пригодный генотип, и помещают в жидкую среду 2DG4 + 0,5d (модифицированная среда Дункана D, содержащая 20 мг/л глюкозы и дополненная 10 г/л маннозы) и культивируют в течение 1-2- 24006761 дней. 2. Плазмолиз. Незрелые зародыши инкубируют в 12%-ном растворе сахарозы в течение 3-4 ч до начала бомбардировки. Зародыши располагают на пластине по окружностям диаметром 8-10 мм. 3. Бомбардировка. Трансфекцию зародышей кукурузы путем бомбардировки частицами осуществляют в присутствии 5 мкг плазмидной ДНК при давлении 650 фунтов/кв. дюйм согласно методу, описанному у Wright и др,2001, Plant Cell Reports, в печати. Поскольку работу, находящуюся в печати, нельзя использовать в качестве ссылки, ниже приводятся некоторые сведения, почерпнутые из статьи. Фрагмент ДНК осаждают на золотые микроносители (1 мкм) согласно инструкциям, изложенным в руководстве DuPont Biolistics Manual. Гены вводят в клетки ткани-мишени с помощью биобаллистического устройства типа PDS-1000 Не Biolistics. Устанавливают следующие регулировочные параметры: расстояние 8 мм между разрушаемым диском и макроносителем, расстояние 10 мм между макроносителем и задерживающим экраном и расстояние 7 мм между задерживающим экраном и мишенью. Пластины обстреливают дважды частицами, покрытыми ДНК, используя диски, разрушающиеся при давлении 650 фунтов/кв. дюйм. Для уменьшения повреждения ткани от ударной волны при выбросе гелия между задерживающим экраном и тканью-мишенью помещают сетку из нержавеющей стали, имеющей по вертикали и по горизонтали по 200 отверстий на дюйм (фирма McMaster-Carr, Нью Брунсвик, штат Нью Джерси). Зародыши выращивают на планшетах в течение 48 ч в темноте при 25 С. Протеиновые экстракты получают путем лизиса клеток в лизирующем GUS-буфере и осветляют путем центрифугирования. Пример 25. Анализ GUS. Для обнаружения экспрессии гена GUS осуществляют гистохимический и хемилюминисцентный анализы. 1. Гистохимический анализ -глюкуронидазы (GUS). При проведении анализа GUS используют зародыши кукурузы и линии каллюса томатов, выращенные в условиях in vitro. В раствор для окрашивания GUS погружают либо зародыши целиком, либо небольшие кусочки каллюса. Раствор для окрашивания GUS содержит 1 мМ 5-бром-4-хлор-3 индолилглюкуронид (X-Gluc, фирма Duchefa, 20 мМ маточный раствор в ДМСО), 100 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,0, 10 мМ ЭДТК, рН 8,0, и 0,1% Triton X100. Образцы ткани инкубируют при 37o С в течение 1-16 ч. При необходимости образцы осветляют путем нескольких промывок 70% EtOH для удаления хлорофилла. 2. Хемилюминисцентный анализ -глюкуронидазы (GUS). Для количественного анализа экспрессии GUS осуществляют хемилюминисцентный анализ GUS с использованием набора типа GUS-Light (фирма Tropix. Inc.) согласно инструкциям производителя. Активность измеряют с помощью люминометра. Результаты измерений экспрессии GUS для образцов, в которых присутствуют конструкции pCmpS и pCmpMG (пример 17) нормализуют по отношению к соответствующему значению, полученному для клона, с которым проводится сравнение (pNOV3612, пример 19). Результаты, полученные в двух различных экспериментах, свидетельствуют о том, что делеция длиной 8 пар оснований в промоторе CmYLCV(pCmpMG, пример 17) не оказывает существенного влияния на уровни экспрессии репортерного гена