Способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего, характеризующихся аномально высокой экспрессией лиганда, индуцирующего пролиферацию клеток (april)

005601 Область изобретения Настоящее изобретение в основном относится к способам лечения ракового заболевания. Способы включают введение некоторых антагонистов фактора некроза опухолей (TNF). Предпосылки изобретения Члены семейства фактора некроза опухолей (TNF), относящиеся к цитокинам, участвуют в постоянно увеличивающемся количестве ключевых биологических функций. Каждый член семейства TNF действует при связывании с одним или более членами соответствующего семейства рецепторных белков. В свою очередь данные рецепторы передают сигналы внутриклеточно для индукции широкого ряда физиологических или относящихся к развитию ответных реакций. Многие из рецепторных сигналов воздействуют на судьбу клеток и часто запускают конечную дифференциацию. Примеры клеточной дифференциации включают пролиферацию, созревание, миграцию и гибель. Члены семейства TNF представляют связанные с мембраной белки типа II, имеющие короткий внутриклеточный N-концевой домен, трансмембранный домен и С-концевые связывающие рецептор домены, лежащие на внешней клеточной поверхности. В некоторых случаях внеклеточный участок белка отщепляется, создавая секретируемую форму цитокина. Несмотря на то, что связанные с мембраной белки действуют локально, вероятно, через опосредуемое клетками контактное взаимодействие с их рецепторами, секретируемые формы обладают потенциальной возможностью циркулировать или диффундировать, следовательно, могут действовать на отдалении. Как связанные с мембраной, так и секретируемые формы находятся в виде тримеров, и полагают, что они передают свой сигнал рецепторам, способствуя образованию рецепторных кластеров. Семейство рецепторных белков TNF характеризуется наличием одного и более богатых цистеином доменов. Каждый богатый цистеином домен образует связанный через дисульфидную связь ядерный домен, который участвует в создании трехмерной структуры, которая образует связывающий лиганд карман. Рецепторы являются связанными с мембраной белками типа I, в которых внеклеточный домен кодируется N-концом, затем трансмембранным доменом и С-концевым внутриклеточным доменом. Внутриклеточный домен ответственен за передачу сигнала рецептором. Некоторые рецепторы включают внутриклеточный домен гибели, который может передавать клеткам сигнал об апоптозе, и они могут представлять собой эффективные индукторы гибели клеток. Другая группа рецепторов может в слабой степени индуцировать гибель; оказывается, что они теряют домен гибели. Третья группа рецепторов не индуцирует гибель клеток. Все группы рецепторов могут передавать сигналы о пролиферации или дифференциации клеток вместо гибели, в зависимости от типа клеток или наличия других сигналов. Хорошо изученным примером плюрипотентной природы активности семейства TNF является номинантный член, TNF. TNF может существовать в виде связанного с мембраной цитокина или может быть отщеплен и секретирован. Обе формы связываются с двумя TNF-рецепторами, TNF-R55 и TNFR75. Первоначально описанный по его способности непосредственно убивать опухолевые клетки TNF также регулирует большое множество иммунных процессов, включая индукцию острых воспалительных реакций, а также поддержание гомеостаза в лимфоидных тканях. В результате того, что данный цитокин может играть двойную роль в различных патологических процессах, были разработаны агонисты и антагонисты в качестве модификаторов заболевания. Например, TNF и LT (который также передает сигналы через TNF-рецепторы) использовали для лечения раковых заболеваний, особенно с периферической локализацией, таких как лимбическая саркома. При данном процессе непосредственная передача сигналов цитокинами через рецептор индуцирует гибель опухолевых клеток (Aggarwal and Natarajan, 1996. EurCytokine Netw 7:93-124). В иммунологических процессах агенты, которые блокируют передачу сигналов через TNFрецепторы (например, анти-TNF-mAb, растворимые слитые TNF-R-белки), использовали для лечения заболеваний, подобных ревматоидному артриту и воспалительному заболеванию кишечника. При этих патологиях TNF действует, индуцируя клеточную пролиферацию и эффекторную функцию, обостряя тем самым аутоиммунное заболевание, и в этом процессе блокирование связывания TNF с его рецептором(ами) имеет терапевтическую пользу (Beutler, 1999. J. Rheumatol 26 Suppl. 57:16-21). Оказалось, что открытая недавно система лиганд/рецептор поддается аналогичной регуляции. Лимфотоксин-бета (LT), член семейства TNF, который образует гетеродимеры с LT, связывается с LT-R. Некоторые опухолевые клетки аденокарциномы, которые экспрессируют LT-R, могут погибнуть или подвергнуться дифференциации при обработке агонистическими анти-LT-R-mAb (Browning et аl., 1996.J. Exp. Med. 183:867-878). Было показано в иммунологических процессах, что анти-LT-mAb или растворимый слитый LT-R-Ig-белок может блокировать развитие воспалительных заболеваний кишечника,возможно, действуя на взаимодействие дендритных клеток и Т-клеток (Mackay et al., 1998. Gastroenterology 115:1464-1475). Система TRAIL также имеет потенциальную возможность применения в качестве противоопухолевой терапии. TRAIL взаимодействует с рядом связанных с мембраной и растворимых рецепторов. Два из этих рецепторов, TRAIL-R1 и TRAIL-R2 (также называемые DR4 и DR5), передают гибель, индуцируя сигналы опухолевым клеткам, но не нормальным клеткам, которые экспрессируют дополнительныеTRAIL-рецепторы, которые не индуцируют гибель. Полагают, что эти дополнительные рецепторы функционируют в качестве ловушек. Применение растворимого TRAIL для уничтожения опухолевых клеток основано на избирательной экспрессии рецепторов-ловушек в нормальной, но не опухолевой ткани(Gura, 1997. Science 277:768). Опухолевые клетки сами по себе часто экспрессируют различные рецепторы-ловушки, которые блокируют иммунное распознавание или эффекторные функции. Действительно, некоторые опухоли гиперэкспрессируют рецепторы-ловушки TRAIL, вероятно для того, чтобы избежать опосредуемойTRAIL гибели (Sheikh et al., 1999. Oncogene 18;4153-4159). Это ограничивает применимость TRAIL в качестве противоопухолевого агента при некоторых процессах. Подобные наблюдения были сделаны в отношении рецептора-ловушки для FAS-L, который гиперэкспрессируется в опухолевых клетках легких и ободочной кишки (Pitti et al., 1998. Nature 396:699-703), и для антагониста IL-1-рецептора (Mantovani etal., 1998. Ann. N Y Acad. Sci. 840:338-351). Рецепторы-ловушки также используются вирусными геномами для защиты зараженных клеток хозяина от защитных механизмов хозяина.APRIL (лиганд, индуцирующий пролиферацию) является новым членом TNF-семейства белков. На основании исследований по экспрессии и функционированию APRIL можно предположить, что этот белок используется опухолевыми клетками для индукции быстрой пролиферации. Линии опухолевых клеток, обработанные растворимым APRIL-белком или трансфицированные кДНК APRIL быстро растут в условиях in vitro. Трансфицированные APRIL клетки, имплантированные мышам с иммунодефицитом,быстро растут в виде опухолей. Наконец, человеческие опухолевые клетки, но не нормальная ткань, экспрессируют высокие уровни мРНК APRIL. На основании этих наблюдений можно предположить, чтоAPRIL связывается с рецептором, который также экспрессируется опухолевыми клетками, приводя к аутокринной или паракринной активации опухолевых клеток. Кроме того, возможно, что APRIL действует при других болезненных состояниях так, что активирование или блокирование пути с участиемAPRIL будет иметь дополнительную применимость. Например, пониженная или повышенная экспрессияAPRIL может играть роль в аномалиях развития, поскольку развитие также часто характеризуется тщательно регулируемым балансом между пролиферацией клеток и гибелью клеток. Аналогично APRIL может действовать при заболеваниях, связанных с пролиферацией клеток, таких как возникают при некоторых аутоиммунных заболеваниях (например, волчанке) или при воспалительных заболеваниях, где происходит быстрое увеличение клеточных популяций (например, бактериальный сепсис). Основываясь на известности использования агонистов и антагонистов TNF и членов семействаTNF-рецепторов в качестве модуляторов заболевания, путь с участием APRIL сам по себе представляет важную мишень для разработки лекарственных препаратов. Это особенно верно для лечения раковых заболеваний, поскольку, как оказалось, опухолевые клетки продуцируют и используют APRIL для поддержания их собственного роста и, следовательно, мало вероятно, что они продуцируют рецепторыловушки или другие антагонисты пути с участием APRIL. Таким образом, путь с участием APRIL уникально отличается, например, от путей с участием TRAIL или FAS-L, которым можно препятствовать с помощью опухолевых рецепторов-ловушек. Имеющиеся в настоящее время виды лечения раковых заболеваний являются неадекватными для многих типов опухолей за счет слабой эффективности, незначительного воздействия на выживаемость,токсичности, которая вызывает тяжелые побочные эффекты, или их комбинаций. Следовательно, имеется потребность в идентификации и разработке дополнительных способов лечения развития раковых заболеваний, которые могут обеспечить эффективность, не вызывая тяжелых побочных эффектов. Следовательно, антагонисты пути с участием APRIL, включая анти-APRIL-mAbs, анти-APRIL рецепторныеmAbs, растворимые APRIL рецепторные-Ig слитые белки, естественные антагонисты, небольшие молекулы-антагонисты и химические, фармацевтические или другие антагонисты будут полезными. Для этой цели заявители идентифицировали опосредуемый В-клетками белок (ВСМ или ВСМА) в качестве рецептора APRIL. Краткое описание изобретения Заявители установили, что ВСМА является рецептором для фактора некроза опухолей, APRIL.APRIL представляет ту же молекулу, описанную ранее в WO9912965, которая включена здесь для сведения. APRIL-рецептор определен в дальнейшем как APRIL-R. Настоящее изобретение направлено на способы лечения и фармацевтические препараты для применения в целях лечения видов млекопитающих, уже имеющих раковое заболевание или при риске его развития. Данные субъекты включают субъектов, уже пораженных раковым заболеванием, или которые уже подвергались противоопухолевой терапии. Способы и композиции по данному изобретению происходят отчасти в результате открытия того,что некоторые агенты, которые представляют собой агенты для лечения раковых заболеваний, определенные здесь в качестве антагонистов APRIL-R, включая, например, анти-АРRIL-R-антитела, можно применять для лечения субъектов при риске развития ракового заболевания, как здесь определено, или при необходимости лечения ракового заболевания. Терапевтические агенты для лечения ракового заболевания можно вводить любым путем введения,который совместим с выбранным агентом, и могут быть представлены с любым фармацевтически при-2 005601 емлемым носителем, который соответствует пути введения. Предпочтительными путями введения являются парентеральные и, в частности, внутривенный, внутрибрюшинный и внутрисуставный. Лечение также предпочтительно проводить в течение длительного периода времени амбулаторно. Полагается, что суточные дозы агентов для лечения ракового заболевания будут находиться в пределах примерно 0,011000 мкг/кг массы тела, и более предпочтительно примерно 10-300 мкг/кг массы тела, хотя точные дозы будут варьировать в зависимости от используемого конкретного агента для лечения ракового заболевания и конкретного состояния субъекта и анамнеза. Лечение по настоящему изобретению пригодно для уничтожения в основном клональной популяции (колонии) трансформированных клеток в организме млекопитающего или подавления или ослабления роста колонии, которую обычно относят как к опухоли. В качестве таковых они пригодны для продления жизни и для поддержания качества жизни у субъектов при риске возникновения или уже пораженных раковым заболеванием. Краткое описание фигур На фиг. 1 показана последовательность (SEQ ID NO:1) нуклеиновой кислоты кДНК мышиногоAPRIL и на основе ее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3) в виде карты в векторе рССМ 213.10. Представленное подчеркнутым является myc-эпитопом и аминокислотами из FasL. Начало последовательности, кодирующей внеклеточный домен APRIL, указано стрелками. На фиг. 2 показана последовательность (SEQ ID NO:4) нуклеиновой кислоты и на основе ее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6) конструкции FLAG-человеческого APRIL для экспрессии в клетках млекопитающих. Карта указывает сигнальную последовательность (1-15); FLAG-эпитоп (АА 16-23) и начало последовательности, кодирующей внеклеточный домен человеческого APRIL (32-конец). На фиг. 3 А показана последовательность (SEQ ID NO:7) нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8) полной длины человеческого ВСМА. На фиг. 3 В показана последовательность (SEQ ID NO:11) нуклеиновой кислоты pJST538, плазмиды, кодирующей человеческую слитую конструкцию APRIL-R-hIgGFc, и на основе ее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12). На фиг. 4 показано связывание mус-мышиного APRIL с мышиной В-клеточной лимфомой линии А 20. В трех отдельных опытах было показано наличие специфического связывания APRIL с клетками А 20 по сравнению с А) неокрашенными клетками и клетками, окрашенными только R1532, В) клетками,окрашенными RANKL-L и R1532 и С) клетками, окрашенными APRIL, и несоответствующей кроличьей сывороткой. На фиг. 5 показано связывание myc-мышиного APRIL с человеческой В-клеточной лимфомой линии RAJI. В двух отдельных опытах было показано наличие специфического связывания APRIL с клетками RAJI по сравнению с А) неокрашенными клетками и клетками, окрашенными только R1532, и клетками, окрашенными RANK-1, и R1532 и В) клетками, окрашенными APRIL, и несоответствующей кроличьей сывороткой. На фиг. 6 показано, что связывание APRIL с клетками А 20 (А) и клетками RAJI (В) является конкурентным с использованием растворимого белка BAFF или растворимого белка BCMA-Ig. На фиг. 7 показано связывание FLAG-человеческого APRIL с клетками различных линий: А) клетками А 20, В) клетками НТ 29, С) клетками NIH3T3. Специфическое связывание показано с использованием детекции биотинилированных анти-FLAG-mAb М 2 по сравнению со связыванием, наблюдаемым с несоответствующими изотипными контрольными mAb и без добавления FLAG-APRIL. На фиг. 8 показана иммунопреципитация myc-mAPRIL с использованием слитого BCMA-Fc-белка. Верхняя левая панель показывает специфическую hBMCA-Fc/myc-mAPRIL и положительную контрольную иммунопреципитации по сравнению с верхними правыми отрицательными контролями. В нижних панелях показано, что количества нагруженного белка были эквивалентными. На фиг. 9 показаны опыты с ELISA, демонстрирующие, что FLAG-h APRIL связывается со слитымhBCMA-Fc-белком. Различные рецепторные слитые Fc-белки наносили на планшеты для ELISA и связывали с FLAG-меченными лигандами. А) Детектирование связанных лигандов выявило, что только APRIL и hBAFF специфически связываются с hBCMA-Fc, но не hCD40-Fc. В) Титрование дозы, показывающее,что сигнал ELISA, обнаруженный после связывания hAPRIL или hBAFF на покрытых hBCMA-Fc планшетах, имел линейную зависимость по отношению к количеству добавленного белка. На фиг. 10 показана иммунопреципитация FLAG-hAPRIL и FLAG-hBAFF слитым hBCMA-Fcбелком. Верхние 4 панели показывают эквивалентность белковых нагрузок при каждой реакции иммунопреципитации, в то время как нижние панели показывают, что hAPRIL и hBAFF иммунопреципитировались hBCMA-Fc, но не hTRAIN-Fc. На фиг. 11 показан анализ BiaCore связывания myc-mAPRIL, FLAG-hBAFF и FLAG-mBAFF сhBCMA, hLТбета-рецептором или hTNF-R80 или контроль, показывающий специфическое связывание только с hBCMA. На фиг. 12 показано связывание APRIL с трансфицированными ВСМА клетками. Клетки 293EBNA трансфицировали плазмидой, которая экспрессирует полную длину hBCMA. Клетки собирали через 48 ч с использованием 5 мМ ЭДТА и окрашивали myc-hAPRIL. Панель А показывает, что степень окрашива-3 005601 ния зависит от дозы. Панель В показывает, что окрашивание снижалось до фонового уровня с использованием растворимого белка BCMA-Ig. На фиг. 13 показан рост клеток NIH3T3, имплантированных подкожно мышам с иммунодефицитом(Nu/Nu), обработанных контрольными реагентами или белком BCMA-Ig. На данной модели клеткиNIH3T3 образуют фибросаркому. На фиг. 14 показан рост человеческой карциномы ободочной кишки SW480, имплантированной подкожно мышам с иммунодефицитом (Nu/Nu), обработанных контрольными реагентами или слитым белком hBCMA-Ig. На фиг. 15 А показан рост человеческой карциномы ободочной кишки НТ 29, имплантированной подкожно мышам с иммунодефицитом, обработанных контрольными реагентами или слитым белкомhBCMA-Ig. На фиг. 15 В показан рост человеческой карциномы легких А 549, имплантированной подкожно мышам с иммунодефицитом (Nu/Nu), обработанных контрольными реагентами или слитым белком hBCMA-Ig. Подробное описание Определения Для того чтобы более четко и кратко выяснить сущность заявленного изобретения, предоставляются следующие определения специальных терминов, использованных в последующем описании и прилагаемой формуле изобретения. Далее изобретение будет описано при обращении к последующему подробному описанию, в которое включены следующие определения. Термины APRIL-рецептор или APRIL-R, используемые здесь, включают естественную последовательность APRIL-R и варианты APRIL-R. APRIL-R можно выделить из различных источников, таких как типы мышиных или человеческих тканей, или из другого источника, или получить рекомбинантными или синтетическими методами. Кроме того, термин APRIL-R дополнительно относится к полипептиду, который способен связываться с членом семейства фактора некроза опухоли, APRIL, или его гомологами, или фрагментами. Примером APRIL-R является ВСМА. Термин ВСМА или ВСМ относится к новому белку для созревания В-клеток, как описано уgolgi apparatus of human mature В lymphocytes; Y. Laabi et al. (1995), EMBO J., 11, 3897-3904, A new gene ВСМ on Chromosome 16 is fused to the interleukin 2 gene by a t (4; 16) (q26:p13) translocation in a malignant Т cell lymphoma. Естественная последовательность APRIL-R включает полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как APRIL-R, выделенный из природы. Подобную естественную последовательность APRIL-R можно выделить из природных источников или можно получить рекомбинантными или синтетическими методами. Естественная последовательность APRIL-R может представлять имеющиеся в естественных условиях усеченные или секретируемые формы APRIL-R (т.е. растворимые формы, включающие,например, последовательность внеклеточного домена), имеющиеся в естественных условиях вариантные формы (например, альтернативно сплайсированные формы) и естественные аллельные варианты APRIL-R. В одном воплощении изобретения естественная последовательность APRIL-R является зрелой или естественной последовательностью полипептида APRIL-R полной длины, включающей аминокислоты 1-184 поSEQ ID NO:8, или его фрагмента. Внеклеточный домен APRIL-R или APRIL-R ECD относится к форме APRIL-R, которая в основном свободна от трансмембранного или цитоплазматического доменов APRIL-R. Обычно внеклеточный домен APRIL-R будет включать менее 1% таких трансмембранного и цитоплазматического доменов и предпочтительно будет иметь менее 0,5% таких доменов. Необязательно APRIL-R ECD будет включать аминокислотные остатки 1-51, или 1-52, или 1-53 SEQ ID NO:8. В предпочтительном воплощенииAPRIL-ECD включает аминокислотные остатки 4-51 по SEQ ID NO:8 или более предпочтительно аминокислотные остатки 8-41 по SEQ ID NO:8. Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что трансмембранный домен, установленный для полипептида APRIL-R по настоящему изобретению, идентифицирован в соответствии с критериями, обычно используемыми в данной области для идентификации данного типа гидрофобных доменов. Точные границы трансмембранного домена могут варьировать,но наиболее вероятно не более, чем примерно на 5 аминокислот с каждого конца домена, детально указанного здесь. Вариант APRIL-R означает активный APRIL-R, как определено ниже, имеющий идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере на 80% с APRIL-R, имеющего выведенную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5 для полной длины естественной последовательности APRIL-R, или с последовательностью APRIL-R ECD. Подобные варианты APRIL-R включают, например, полипептиды APRIL-R, в которых один или более аминокислотных остатков вставлены или удалены в конце или на С-конце последовательности по SEQ ID NO:8. Обычно вариант APRIL-R будет иметь идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере примерно на 80 или 85%, более предпочтительно идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере при-4 005601 мерно на 90% и еще более предпочтительно идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8. Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности по отношению к последовательностям APRIL-R, идентифицированным здесь, определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые совпадают с аминокислотными остатками в последовательностиAPRIL-R, после расположения последовательностей и введения брешей, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности и без учета любых консервативных замещений в качестве части идентичности последовательности. Расположение в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно достичь различными путями, которые известны специалистам в данной области, например с использованием широко доступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, ALIGN или Megalign(DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для определения расположения, включая любые алгоритмы, необходимые для максимального расположения по полной длине последовательностей, которые сравниваются. Термин меченый эпитоп, когда здесь используется, относится к химерному полипептиду, включающему APRIL-R, или последовательность его домена, слитые с меченым полипептидом. Меченый полипептид имеет достаточное количество остатков для обеспечения эпитопа, против которого можно получить антитела или который может быть идентифицирован каким-то другим агентом, который к тому же является достаточно коротким, чтобы не мешать активности APRIL-R. Меченый полипептид предпочтительно также является довольно уникальным в том плане, что антитела в основном не реагируют перекрестно с другими эпитопами. Подходящие меченые эпитопы обычно включают по меньшей мере 6 аминокислотных остатков и обычно примерно от 8 до примерно 50 аминокислотных остатков (предпочтительно примерно от 10 до примерно 20 остатков). Выделенный, когда используется для описания различных полипептидов, раскрытых здесь, означает полипептид, который был идентифицирован и выделен и/или извлечен из компонента его естественного окружения. Загрязняющими компонентами его естественного окружения являются вещества,которые обычно будут мешать диагностическим или терапевтическим применениям полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и не белковые растворенные вещества. В предпочтительных воплощениях полипептид должен быть очищенным (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой или (2) до гомогенности при проведении SDSPAGE в невосстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси синего или,предпочтительно, серебряной окраски. Выделенный полипептид включает полипептид in situ внутри рекомбинантных клеток, поскольку по меньшей мере один компонент из естественного окружения APRIL-R не будет присутствовать. Однако обычно выделенный полипептид будет получен по меньшей мере с одной стадией очистки. Термин антитело используется в самом широком смысле и, в частности, включает отдельные моноклональные антитела против APRIL-R (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела) и композиции на основе анти-APRIL-R-антител с полиэпитопной специфичностью. Термин моноклональное антитело в том смысле, как он здесь используется, относится к антителу, полученному из популяции в основном гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных, имеющих место в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Очищенный препарат или в основном очищенный препарат полипептида в том смысле, как этот термин здесь используется, означает полипептид, который отделен от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми он находится в естественных условиях. Предпочтительно полипептид также отделен от других веществ, например антител, матриксов и т.д., которые используются для его очистки. Термины проведение лечения, лечение и терапия в том смысле, как они здесь используются,относятся к лечебной терапии, профилактической терапии и превентивной терапии. Термины пептиды, белки и полипептиды используются здесь равнозначно. Биологически активный в том смысле, как этот термин здесь используется, означает обладающий активностью in vivo или in vitro, которая может осуществляться прямо или опосредованно. Биологически активные фрагменты могут иметь, например, 70% аминокислотную гомологию с активным сайтом рецептора, более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно 90% гомологию. Идентичность или гомология по отношению к рецептору определяется здесь в виде процента аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам APRIL-R в SEQ ID NO:8. Термин млекопитающее в том смысле, как он здесь используется, относится к любому животному, отнесенному к млекопитающему, включая людей, коров, лошадей, собак, мышей и кошек. В предпочтительном воплощении изобретения млекопитающее является человеком. В практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иначе, обычные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микро-5 005601 биологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые известны в данной области. Такие методы описаны в литературе. Далее будут подробно представлены предпочтительные воплощения настоящего изобретения. Данное изобретение относится к использованию APRIL-R и связанных с APRIL-R молекул для воздействия на рост и созревание В-клеток и клеток, не относящихся к В-клеткам, особенно, если они относятся к опухолевым клеткам. Изобретение также относится к использованию APRIL-R и связанных с APRIL-R молекул для воздействия на ответы иммунной системы, что является необходимым при нарушениях,связанных с иммунной системой. Кроме того, изобретение включает лечение ракового заболевания и иммунных нарушений посредством использования APRIL-R или связанного с APRIL-R гена посредством методов генной терапии.APRIL-R и его гомологи, продуцированные хозяевами, трансформированными последовательностями по изобретению, а также нативный APRIL-R, очищенный способами, известными в данной области, или полученный из известных аминокислотных последовательностей, пригодны в различных способах противораковых, противоопухолевых и иммунорегуляторных применений. Они также пригодны при терапии и способах, направленных на другие заболевания. Другой аспект изобретения относится к применению полипептида, кодированного выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей APRIL-R, в антисмысловой терапии. В том смысле, как этот термин здесь используется, антисмысловая терапия относится к введению или продукции in situ олигонуклеотидов или их производных, которые специфически гибридизируют в клеточных условиях с клеточной мРНК и/или ДНК, кодирующей интересующий лиганд для того, чтобы ингибировать экспрессию кодированного белка, т.е. путем ингибирования транскрипции и/или трансляции. Связывание может происходить на основе комплементарности пар оснований или, например, в случае связывания с ДНКдуплексами посредством специфических взаимодействий в основном желобке двойной спирали. В основном антисмысловая терапия относится к ряду методов, как правило, используемых в данной области, и включает любую терапию, основанную на специфическом связывании с олигонуклеотидными последовательностями. Антисмысловую конструкцию по настоящему изобретению можно доставить, например, в виде экспрессирующей плазмиды, которая при транскрипции в клетке продуцирует РНК, которая является комплементарной по меньшей мере к части клеточной мРНК, которая кодирует Кау-лиганд. Альтернативно антисмысловая конструкция может быть олигонуклеотидным зондом, который получают ex vivo. Такие олигонуклеотидные зонды предпочтительно представляют собой модифицированные олигонуклеотиды, которые устойчивы к эндогенным нуклеазам и поэтому стабильны в условиях in vivo. Примерами молекул нуклеиновых кислот для использования в качестве антисмысловых олигонуклеотидов являются фосфорамидатные, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (см., например, патенты США 5176996, 5264564 и 5256775). Кроме того, имеется обзор по общим подходам к конструированию олигомеров, пригодных для антисмысловой терапии, например, у Van Der Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976; и Stein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668, специально включенных здесь для сведения.APRIL-R по изобретению, как обсуждалось выше, является членом семейства TNF-рецепторов. Белок, его фрагменты или гомологи могут иметь широкие терапевтические и диагностические применения. Полипептиды по изобретению специфически взаимодействуют с APRIL, полипептидом, ранее описанным в W099/12964, включенной здесь для сведения. Однако пептиды и способы, раскрытые здесь,создают возможность для идентификации молекул, которые специфически взаимодействуют с APRIL-R или его фрагментами. Заявленное изобретение в некоторых воплощениях включает способы применения пептидов, производных APRIL-R, которые обладают способностью связываться с APRIL. Фрагменты APRIL-R можно получить несколькими путями, например рекомбинацией, с помощью ПЦР, протеолитическим расщеплением или химическим синтезом. Внутренние или концевые фрагменты полипептида можно получить удалением одного или более нуклеотидов с одного конца или обоих концов нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. Экспрессия мутировавшей ДНК дает фрагменты полипептида. Фрагменты полипептида также можно синтезировать химическим путем с использованием методов,известных в данной области, таких как обычный способ Меррифилда с использованием f-moc-или t-boc в твердой фазе. Например, пептиды и последовательности ДНК по настоящему изобретению можно произвольно разделить на фрагменты желаемой длины без перекрывания фрагмента или разделить на перекрывающиеся фрагменты желаемой длины. Способы такие, как эти, описаны более подробно ниже. Получение растворимых форм APRIL-R Растворимые формы APRIL-R часто могут эффективно передавать сигналы, и, следовательно, их можно вводить в качестве лекарственного препарата, который уже имитирует естественную мембранную форму. Возможно, что заявленные здесь APRIL-R секретируются в естественных условиях в виде растворимых цитокинов, однако, если нет, то можно переконструировать ген для вынужденной секреции. Для создания растворимой секретируемой формы APRIL-R необходимо удалить на уровне ДНКN-концевые трансмембранные области и некоторый участок стволовой области и заменить их лидерной последовательностью типа I и, альтернативно, лидерной последовательностью типа II, что позволит про-6 005601 текать эффективному расщеплению в выбранной экспрессирующей системе. Специалисты в данной области могут менять размеры стволовой области, оставшейся в экспрессирующей конструкции для секреции в целях оптимизации как свойств связывания лиганда, так и эффективности секреции. Например,конструкции, включающие все возможные стволовые длины, т.е. N-концевые усечения, можно приготовить таким образом, что получатся белки, начинающиеся с аминокислот 1-52. Из данного типа анализа будут получены стволовые последовательности с оптимальной длиной. Получение антител, реагирующих с APRIL-R Изобретение также включает антитела, специфически реагирующие с заявленным APRIL-R и его корецепторами. Антибелок/антипептид-антисыворотку или моноклональные антитела можно получать стандартными методами (см., например, Anibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (ColdSpring Harbor Press: 1988. Млекопитающее, такое как мышь, хомячок и кролик, можно иммунизировать иммуногенной формой пептида. Методы для предоставления иммуногенности белку или пептиду включают конъюгацию на носителях или другие методы, хорошо известные в данной области. Иммуногенный участок APRIL-R или его корецепторов можно вводить в присутствии адъюванта. За течением иммунизации можно прослеживать по установлению титров антител в плазме или сыворотке. Можно использовать стандартные ELISA или другие иммуноанализы с иммуногеном в качестве антигена для оценки уровней антител. В предпочтительном воплощении целевые антитела являются иммуноспецифическими для антигенных детерминант APRIL-R или его корецепторов, например антигенных детерминант полипептида поSEQ ID NO:8 или тесно связанного человеческого или нечеловеческого гомолога млекопитающих (например, на 70, 80 или 90% гомологичного, более предпочтительно на 95% гомологичного). В еще одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения анти-APRIL-R или анти-АРRIL-корецепторыантитела в значительной степени не реагируют перекрестно (т.е. реагируют специфически) с белком,который, например, менее чем на 80% гомологичен по отношению к SEQ ID NO:8, предпочтительно менее чем на 90% гомологичен по отношению к SEQ ID NO:8 и наиболее предпочтительно менее чем на 95% гомологичен по отношению к SEQ ID NO:8. Выражение в значительной степени не реагируют перекрестно означает, что антитело имеет аффинность связывания для негомологичного белка, которая составляет менее 10%, более предпочтительно менее 5% и даже более предпочтительно менее 1% аффинности связывания для белка по SEQ ID NO:8. Термин антитело в том смысле как он здесь используется, предназначен для включения его фрагментов, которые также являются специфически реагирующими с APRIL-R или его рецепторами. Антитела могут быть фрагментированы с использованием обычных методов, и фрагменты подвергнуты скринингу на применимость таким же образом, как описано выше для цельных антител. Например, F(ab')2 фрагменты можно получить обработкой антитела пепсином. Полученный F(ab')2-фрагмент можно обработать для восстановления дисульфидных связей с получением Fab'-фрагментов. Антитела по настоящему изобретению дополнительно предназначены для включения биоспецифических и химерных молекул,обладающих анти-APRIL-R- или анти-APRIL-корецепторы-активностью. Таким образом, как моноклональные, так и поликлональные антитела (Аb), направленные против APRIL-R и их корецепторов, и фрагменты антител, такие как Fab' и F(ab')2, можно использовать для блокирования действия APRIL-R и его соответствующих корецепторов. Различные формы антител можно также приготовить с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК (Winter and Milstein, Nature 349:293-299 (1991), специально включенный здесь для сведения). Например, можно сконструировать химерные антитела, в которых домен связывания антигена из антитела животного связан с человеческим константным доменом (например, Cabilly et al., патент США 4816567, включенный здесь для сведения). Химерные антитела могут снизить наблюдаемые иммуногенные ответы на антитела животного происхождения, когда используются в клинике для лечения человека. Кроме того, можно синтезировать рекомбинантные гуманизированные антитела, которые распознают APRIL-R или его корецепторы. Гуманизированные антитела являются химерами, включающими в основном человеческие последовательности IgG, в которые вставлены области, ответственные за специфическое связывание с антигеном. Животных иммунизируют желаемым антителом, выделяют соответствующие антитела и удаляют участок последовательностей вариабельной области, ответственной за специфическое связывание с антигеном. Области связывания антигена от животных затем клонируют в соответствующее положение генов человеческих антител, в которых удалены области связывания антигена. Гуманизированные антитела сводят до минимума применение гетерологичных (т.е. межвидовых) последовательностей в человеческих антителах и, таким образом, маловероятно, что они будут вызывать иммунные ответы у обработанного субъекта. Конструкцию различных групп рекомбинантных антител также можно проводить приготовлением химерных или гуманизированных антител, включающих вариабельные домены и человеческие константные домены (СН 1, СН 2, СН 3), выделенные из различных классов иммуноглобулинов. Например,антитела с повышенными валентностями сайта связывания антигена можно получить рекомбинантным-7 005601 методом при клонировании сайта связывания антигена в векторы, несущие человеческие константные области цепей (Arulanandam et al., J. Exp. Med. 177:1439-1450 (1993), включенный здесь для сведения). Кроме того, обычные методы рекомбинантной ДНК можно использовать для изменения аффинности связывания рекомбинантных антител с их антигенами изменением аминокислотных остатков в окружении сайтов связывания антигена. Аффинность связывания антигена гуманизированного антитела может быть повышена мутагенезом, основанным на молекулярном моделировании (Queen et al., Proc.Natl. Acad. Sci. 86:10029-33 (1989, включенный здесь для сведения. Получение аналогов: продукция измененных ДНК и пептидных последовательностей Аналоги APRIL-R могут отличаться от имеющегося в естественных условиях APRIL-R по аминокислотной последовательности или другим свойствам, не связанным с последовательностью, или по обоим. Не связанные с последовательностью модификации включают химическую дериватизациюAPRIL-R in vivo или in vitro. He связанные с последовательностью модификации включают, но не ограничиваются изменениями в результате ацетилирования, метилирования, фосфорилирования, карбоксилирования или гликозилирования. Предпочтительные аналоги включают биологически активные фрагменты APRIL-R, чьи последовательности отличаются от последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, одной или более консервативной заменой аминокислот или одной или более неконсервативной заменой аминокислот, делениями или вставками, которые не приводят к потере активности APRIL-лиганда. Консервативные замены обычно включают замену одной аминокислоты на другую с одинаковыми свойствами, например замены внутри следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. Применения Полную длину гена APRIL-R (SEQ ID NO:8) или его участки можно использовать в качестве зондов гибридизации для библиотеки кДНК для выделения, например, еще других генов, которые обладают желаемой идентичностью последовательности по отношению к последовательности APRIL-R, раскрытой вSEQ ID NO:6. Нуклеотидные последовательности, кодирующие APRIL-R, также можно использовать для конструирования зондов гибридизации в целях картирования гена, который кодирует APRIL-R, и для генетического анализа индивидуумов с генетическими нарушениями. Скрининг может быть построен таким образом, чтобы найти основные соединения, которые подражают биологической активностиAPRIL-R. Подобный скрининг будет включать тесты, предназначенные для скрининга с высокой пропускной способностью химических библиотек, делая их особенно пригодными для идентификации небольших молекул, кандидатов для лекарственных препаратов. Предполагаемые небольшие молекулы включают синтетические органические или неорганические соединения. Нуклеиновые кислоты, которые кодируют APRIL-R или его модифицированные формы, можно также использовать для получения или трансгенных животных, или сконструированных животных, которые, в свою очередь, пригодны при разработке и скрининге терапевтических полезных реагентов, включая, например, реагенты против ракового заболевания.APRIL-R и гомологи, полученные от хозяев, трансформированных последовательностями по изобретению, а также нативный APRIL-R, очищенный способами, известными в данной области, или полученный по известным аминокислотным последовательностям, являются пригодными в различных способах противораковых применений. В одном воплощении изобретения обеспечивается способ лечения млекопитающего от состояния,связанного с нежелаемой пролиферацией клеток, назначением млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей антагонист APRIL-R, где антагонист APRIL-R содержит полипептид, который противодействует взаимодействию между APRIL-R и его родственным рецептором или рецепторами, с фармакологически приемлемым наполнителем. В предпочтительном воплощении родственным рецептором APRIL на поверхности клетки является ВСМА. Способ можно использовать с любым антагонистом APRIL-R, который имеет полипептид, который противодействует взаимодействию между APRIL и его родственным рецептором или рецепторами. Примеры антагонистов APRIL-R включают, но не ограничиваются растворимым полипептидом APRIL-R,включая, но не ограничиваясь растворимым ВСМА; растворимыми химерными молекулами APRIL-R,включая, но не ограничиваясь BCMA-IgG-Fc, и гомологами анти-APRIL-R-антитела, включая, но не ограничиваясь анти-ВСМА моноклональным антителом. Способ по изобретению можно использовать при любом состоянии, связанном с нежелаемой пролиферацией клеток. В частности, способы по настоящему изобретению можно использовать для обработки опухолевых клеток, которые экспрессируют APRIL и/или APRIL-R (т.е. ВСМА). Примеры раковых заболеваний, где пролиферация клеток модулируется под действием APRIL,можно тестировать при определении в условиях in vitro уровня мРНК, APRIL и/или APRIL-R (т.е. ВСМА), экспрессированной в библиотеках опухолевых тканей. Библиотеки опухолевых тканей, в которых имеется высокая экспрессия мРНК APRIL и/или APRIL-R (т.е. ВСМА), будут кандидатами. Альтернативно, можно провести скрининг кандидатов при поиске в общедоступных или частных базах данных(т.е. база данных Incyte) с помощью, например, полной длины последовательности кДНК APRIL. С ис-8 005601 пользованием этих методов было установлено, например, что экспрессия мРНК APRIL обнаружена в большом ряде типов опухолей, включая, но не ограничиваясь таковыми, найденными в табл. 1 ниже. Таблица 1 Описание библиотеки СА - карцинома; SAR - саркома Антагонисты APRIL-R как объект изобретения используются при лечении состояний, связанных с нежелаемой пролиферацией клеток, в частности при лечении опухолей, преимущественно ингибируют рост опухолевых клеток более, чем на 10, 20, 30 или 40% и наиболее преимущественно более чем на 50%. Антагонисты APRIL-R получают в результате скрининга (см., например, обсуждение в примере 6). Например, антагонисты APRIL-R можно отобрать на основе активности ингибировать рост (т.е. более чем на 10, 20, 30, 40 или 50%) карциномы ободочной кишки НТ 29 человека или карциномы легких А 549 человека (см., например, обсуждение на фиг. 15), которые происходят соответственно из опухоли ободочной кишки и легкого. Другое воплощение изобретения обеспечивает способы ингибирования роста В-клеток и клеток, не относящихся к В-клеткам, индуцированного дендритными клетками роста В-клеток и созревания или продукции иммуноглобулинов у животного с использованием полипептида APRIL-R. В другом воплощении изобретение обеспечивает способы применения APRIL-R при лечении аутоиммунных заболеваний, гипертензии, сердечно-сосудистых нарушений, почечных нарушений, Вклеточных лимфо-пролиферативных нарушений, иммуносупрессорных заболеваний, при трансплантации органов, воспаления и заболевания, связанного с вирусом иммунодефицита человека. Также включены способы применения агентов для лечения, подавления или изменения иммунного ответа, включающего пути передачи сигналов между APRIL-R и его лигандом. Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, включающие полипептид APRIL-R и фармацевтически приемлемый наполнитель. Подходящие носители для полипептидаAPRIL-R, например, и их композиции описаны в Remington' Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, MackPublishing Co., edited by Oslo et al. Как правило, в композиции используется соответствующее количество фармацевтической приемлемой соли для того, чтобы сделать композицию изотонической. Примеры носителя включают буферы, такие как физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Значение рН раствора предпочтительно равняется от примерно 5 до примерно 8 и более предпочтительно от примерно 7,4 до примерно 7,8. Дополнительные носители включают препараты для непрерывного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, когда матрицы находятся в виде имеющих определенную форму частиц, например липосом, пленок или микрочастиц. Специалистам в данной области, очевидно, будет понятно, что некоторые носители будут более предпочтительными в зависимости, например, от пути введения и концентрации полипептида APRIL-R,который вводится.- 10005601 Введение можно осуществлять инъекцией (например, внутривенной, внутрибрюшинной, подкожной, внутримышечной) или другими способами, такими как инфузия, для обеспечения доставки в кровяное русло в эффективной форме. В практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иначе, обычные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белков и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Эти методы описаны в литературе. См., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook,Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning: Volumes I and II (D.N.Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Следующие примеры предоставлены для иллюстрации настоящего изобретения, и их не следует рассматривать, как ограничивающие его. Примеры В примерах, раскрытых ниже, использовали следующие методы. Методы Клонирование и экспрессия mус-меченного мышиного APRIL (CCM776) в Pichia pastoris Экспрессирующий вектор рССМ 213.10 конструировали, взяв PDR004 (Н 98 muAPRIL с включающим высший FAS-лиганд стволом, соединенным с N-концом вместе с FLAG-эпитоп-меткой) и вырезав кодирующую последовательность mu APRIL из Sac I в Not1. Синтетические олигонуклеотиды LTB-559 и 560 образуют линкер Xho-1-Sac1, который включает лидерную последовательность с альфа-фактором скрещивания, mус-эпитоп-метку, а также мотив KEL из FAS-лиганда. Фрагмент muAPRIL и линкер лигировали в сайтах Xho-1-Not1 в рссm211, экспрессирующей плазмиды Pichia pastoris. РССМ 213.10 линеаризовали Stu1, подвергали электропорации в штамм GS115 (his4-) и высевали в минимальной среде, содержащей декстрозу. HIS4-трансформанты анализировали на экспрессию белка посевом единичной представительной колонии в обогащенную среду (BMGY: забуференную, содержащую глицерин, сложную среду) и давали возможность расти до плотности в течение 48 ч при 30 С. Культуры центрифугировали и клеточные осадки ресуспендировали (1:5) в обогащенной индукционной среде, содержащей 1,5% метанола (BMMY: забуференная, содержащая метанол, сложная среда). Через двое суток индукции при 30 С, супернатанты подвергали SDS-PAGE и оценивали на присутствиеmuAPRIL. Окрашивание Кумасси и вестерн-блоттинг (с анти-mус-mАb9 Е 10) показывали, что один штамм, CCM776, продуцировал адекватные количества гликозилированной формы белка mус-меченного Н 98 muAPRIL. Очистка myc-mAPRILMyc-mAPRIL, белок из 149 аминокислот, экспрессировали в pichia. Данный белок имеет изоэлектрическую точку 7,45. 175 мл супернатанта pichia диализовали против 10 мМ Трис буфера, рН 6,8 в течение ночи и затем пропускали через колонку SP емкостью 20 мл. Колонку тщательно промывали 10 мМ Трис-НСl буфером, рН 6,8 и элюировали 250 мМ NaCl в PBS. Вторую стадию очистки проводили с использованием колоночной гель-фильтрации (S300). Фракции, содержащие myc-APRIL, с колонки SP емкостью 20 мл концентрировали центрифугированием до объема 7 мл. После гель-фильтрации заявители получали 8 мг myc-APRIL, который детектировали по оптической плотности и окрашенному Кумасси гелю. Заявители также провели вестерн-блоттинг с использованием мышиных моноклональных антител 9 Е 10 (анти-mус), в котором было показано, что mус-метка была интактной после стадий очистки.N-концевая последовательность подтверждала, что очищенный белок соответствует myc-mAPRIL. Очистка FLAG-человеческого APRIL Плазмиду рs429 (в последующем названную р 1448) использовали для временной трансфекции клеток 293 Т с использованием липофектамина (Gibco-BrI) и несодержащей сыворотку среды. Плазмиду,конструировали в экспрессирующем векторе млекопитающих PCR3 (Invitrogen), кодирует домен связывания рецептора человеческого APRIL с N-концевым белком в клеточной культуральной среде. БелокFLAG-APRIL выделяли из несодержащей сыворотку среды с использованием колонки с анти-FLAG-mAb М 2 и избытка пептида FLAG, следуя рекомендациям производителя (Kodak). Очистка НСВСА-РсHBCMA-Fc временно трансфицировали в клетки 293. Кондиционированную среду от клеток 293 с гиперэкспрессией hBCM-Fc наносили на колонку с белком А. Белок элюировали с использованием 25 мМ фосфатного 100 нМ NaCI, pH 2,8 с последующей нейтрализацией 1/20 объема 0,5 М NaPO4, pH 8,6. Отобранные по оптической плотности при 280 нм фракции подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих- 11005601 и невосстанавливающих условиях и вестерн-блоттингу для идентификации очищенного белка. Из 500 мл кондиционированной среды было получено 3 мг белка.Myc-mAPRIL связывается с различными клеточными линиями в анализе FACS 450 нг/мл очищенного myc-mAPRIL связывали с клеточными линиями в 100 мкл РВS/2%FВС+Fсблокирующие реагенты (FcBlock20 мкг/мл (Pharmingen и очищенного человеческого IgG10 мкг/мл (Sandoz) на льду в течение 1 ч. Положительное связывание выявляли с использованием специфической кроличьей анти-мышиной к APRIL антисыворотки (1:500) и ослиного антикроличьего IgG-FITC(Jackson). Клеточные линии А 20, Raji, NIH3T3 и НТ 29 поддерживали в среде, как предложено поставщиком (АТСС Bethesda, MD). Клетки BJAB культивировали в HEPES-забуференной среде RPMI с добавление 10% FBS и L-глутамина. В конкурентных тестах добавляли 450 нг/мл mус-мышиного APRIL с 1 мкг/мл конкурентного белка. Пример 1. Детектирование связывания APRIL с APRIL-R с использованием теста чашек. В данном примере анализировали связь ВСМА с APRIL. Для того, чтобы тестировать, насколько ВСМА связывается с APRIL, заявители провели опыт по коиммунопреципитации. В данном примере использовали растворимые белки hBCMA-Fc и mycmAPRIL.myc-mAPRIL; myc-CD40L и myc-RANKL в среду, содержащую 10% FBC, на 1/2 ч при комнатной температуре. Fc-белки связывали с гранулами, нагруженными белком А, в течение 1-2 ч, промывали три раза 1 мл PBS, анализировали иммуноблоттингом с мышиными моноклональными 9 Е 10 (анти-mус) антителами и выявляли с использованием усиленной хемилюминесценции. Заявители обнаруживали myc-APRIL в иммунопреципитатах hBCMA-Fc, что указывает на то, что ВСМА взаимодействует с APRIL специфическим образом, поскольку другие TNF-лиганды, myc-CD40L и myc-RANKL не обладали способностью связываться с ВСМА. Myc-APRIL не связывается с LTbR-Fc. Ту же мембрану очищали и повторно ставили блоттинг с анти-hIG-HRP для того, чтобы показать,что то же количество LTbR-Fc с BCMA-Fc использовали в иммунопреципитатах. Пример 2. В данном примере описывается, что hBCMA-Fc взаимодействует с FLAG-hAPRIL. Анализ ELISA: покрытые рецепторными слитыми Fc-белками планшеты (hBCMA-Fc-739 илиhTNFR2-Fc-492) с концентрацией 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6 в течение ночи, при 4 С. Блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре с использованием PBS/5% обезжиренного сухого молока/0,5% Твина-20. Готовили двукратные последовательные разведения лигандов в 100 мкл блокирующего буфера (TNFa-197 из 1000 нг/мл, muBAFF-657 из 1000 нг/мл, hAPRIL-507 из 2000 нг/мл (неактивный), hAPRIL-429 из пятикратно концентрированной среды). После инкубирования с лигандами планшет промывали PBS/5% Твин-20 и зондировали 0,5 мкг/мл анти-FLAG-mAb М 2 в буфере для разведения. Антитела детектировали с использованием анти-мышиных-РО 1/2000 с энзиматическим выявлением (OPD). Опыты по иммунопреципитации: клетки 293 Т трансфицировали указанной экспрессирующей плазмидой (Rec-Fc или FLAG-лиганд) в чашке диаметром 9 см. Трансфицированные клетки оставляли на 5 суток в 8 мл среды Optimem (Gibco-BRL). Иммунопреципитацию проводили при смешивании 200 мкл содержащей каждый рецептор кондиционированной среды с 200 мкл содержащей каждый лиганд кондиционированной средой+400 мкл PBS+10 мкл ProtG-сефарозы. Все это вращали в течение 1 ч на роторе, 4 раза промывали 1 мл PBS, затем кипятили в 50 мкл буфера для образца (+DTT). 20 мкл из каждой реакции иммунопреципитации наносили дорожку. Оценку результатов блоттинга проводили с помощью 1 мкг/мл анти-FLAG-mAb М 2 (Sigma, St Louis МО) и анти-мышиными-РО (1/2000). Также блоттинг проверяли с античеловеческими-РО: 100 мкл кондиционированной среды осаждали смесью МеОН/СНСl3/лизоцим. Эту смесь кипятили в 50 мкл буфера для образца (+DTT) и 20 мкл нагружали. Оценку блоттинга проводили с анти-FLAG-mAb М 2 (1 мкг/мл) и анти-мышиными-РО (1/2000). Пример 3. В данном примере описывается связывание myc-mAPRIL; hKayL-440 (hBAFF) и FLAG-mBAFF сhBCMA-Ig, hLT-R-Ig или hp80 TNFR-Ig. Все опыты проводили при 25 С со скоростью потока 10 мкл/мин. Каждый опыт проводили с использованием HBS буфера (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCI, 0,005% поверхностно-активного вещества Р 20 при рН 7,4). Этот же раствор использовали в качестве элюирующего буфера и в качестве разбавителя для проб. Вначале поверхность чипов СМ 5 активировали N-гидрокси-сукцинимид/N-этил-N'-(3 диэтиламинопропил)карбодиимидом гидрохлоридом (BIAcore). 20 мкл hBCMA-Ig, 15 мкл hLT-R05-Ig и 10 мкл hp80-TNFR, разбавленные до 30 мкг/мл 10 мМ уксусной кислотой, затем блокировали один раз 30 мкл и повторно 15 мкл этанол-амина-НСl (рН 8,5). Это приводило к поверхностной плотности 16003700 резонансных единиц (RU). Чипы регенерировали 20 мкл 1 мМ муравьиной кислоты. Эти удаления повторяли пять раз для установления воспроизводимого и стабильного фона.- 12005601 Для опыта 100 мкл myc-mAPRIL, hKayL-400 и FLAG-mBAFF, каждого, разбавляли до 30 мкл/мл буфером для разбавления и наносили по поверхности чипов. Сразу же после каждого нанесения чипы промывали 500 мкл буфера для разбавления. Поверхность регенерировали между опытами нанесением 20 мкл 1 мМ муравьиной кислоты, затем еще нанесением 15 мкл муравьиной кислоты. После регенерации чипы уравновешивали буфером для разведения. Пример 4. Получение растворимых форм рецептора. Для приготовления ингибитора рецептора для применения у людей необходима последовательность кДНК внеклеточного домена человеческого рецептора. Если мышиная форма известна, библиотеки человеческой кДНК можно легко подвергнуть скринингу с использованием последовательности мышиной кДНК и подобные манипуляции обычно проводят в данной области. С последовательностью человеческой кДНК можно приготовить олигонуклеотидные праймеры для амплификации в ПЦР внеклеточного домена рецептора при отсутствии трансмембранного и внутриклеточного доменов. Как правило, он включает большую часть аминокислот между последним связанным дисульфидной связью TNFдоменом и трансмембранным доменом. Можно изменять количество включенной стволовой области для оптимизации активности полученного растворимого рецептора. Данный амплифицированный участок следует перестроить для включения подходящих сайтов рестрикции для предоставления возможности клонирования в различные С-концевые Ig-слитые химерные векторы. Альтернативно можно вставить стоп-сигнал в 3'-конце и приготовить растворимую форму рецептора без повторного сортинга для использования Ig-слитой химеры. Полученные векторы можно экспрессировать в большинстве систем, используемых в биотехнологии, включая дрожжи, клетки насекомых, клетки бактерий и млекопитающих, и существуют примеры для всех типов экспрессии. Можно присоединить различные человеческиеFc-домены для оптимизации или элиминации FcR и комплементарных взаимодействий по желанию. Альтернативно можно использовать мутировавшие формы данных Fc-доменов для избирательного удаления FcR, или комплементарных взаимодействий, или присоединения N-связанных сахаров к Fcдомену, который имеет некоторые преимущества. Пример 5. Получение агонистических или антагонистических антител. Вышеописанные растворимые формы рецепторов можно использовать для иммунизации мышей и приготовления моноклональных антител обычными методами. Полученные mAbs, которые идентифицируются ELISA, можно затем подвергнуть скринингу на агонистическую активность либо в виде растворимых антител, либо иммобилизованных на пластмассе в различных клеточных тестах in vitro. Часто гибель клеточной линии НТ 29 представляет подходящую систему, которая чувствительна к передаче сигналов через многие TNF-рецепторы. Если данная линия не имеет интересующий рецептор, полную длину данного рецептора можно стабильно трансфицировать в линию НТ 29 для того, чтобы предоставить возможность протекать тесту на цитотоксичность. Альтернативно, эти клетки можно использовать в аппарате Cytosensor для оценки того, насколько активация рецептора может вызывать изменение рН, что свидетельствует о передаче сигнала. Семейство TNF-рецепторов передает сигналы в таком формате, и для данного метода не требуется знать, какие действительные биологические события запускаются рецептором. Агонистические mAbs следует гуманизировать перед использованием в клинике. Этот метод можно также использовать для определения антагонистических mAbs. Подобные mAbs будут определяться по отсутствию агонистической активности и способности ингибировать взаимодействия рецептор-лиганд, что прослеживается ELISA, классическими методами связывания или BIAcore. Наконец,индукция секреции хемокинов различными клетками в ответ на агонистическое антитело может быть тестом для скрининга. Пример 6. Скрининг ингибиторов взаимодействия рецептор-лиганд. Используя рецепторный-Ig-слитый белок, можно тестировать комбинаторные библиотеки на молекулы, которые могут непосредственно связываться с рецептором. Затем данные молекулы можно тестировать в ELISA с использованием рецепторного-Ig-слитого белка и растворимой формы лиганда на способность ингибировать взаимодействие рецептор-лиганд. ELISA можно непосредственно использовать для скрининга библиотек различных естественных продуктов и т.д. на ингибирующие соединения. Рецептор можно трансфицировать в клеточную линию, такую как линия НТ 29, для постановки биологического теста (в данном случае по цитотоксичности), который затем может дать тест для скрининга. Пример 7. Ингибирование роста опухолей in vivo. Эффективность BCMA-Ig в качестве антагониста роста опухолей тестировали с использованием ряда различных линий опухолевых клеток в условиях in vivo. Для этих исследований использовали бестимусных мышей (Nu/Nu) с иммунодефицитом и опухолевые клетки имплантировали подкожно. Для опухолевой линии SW480, которая обладает агрессивным ростом, заявители имплантировали 8105 клеток в 100 мкл не содержащего пирогенов, стерильного PBS. Одну контрольную группу оставили необработанной (n=5), в то время как другим группам ввели 100 мкг контрольного-Ig (n=6) и 100 мкг BCMA-Ig (n=6). Введение начали непосредственно перед имплантацией с последующим введением каждые 7 суток. Диаметр опухолей определяли микрометром и вычисляли объем с использованием формулы объем=4/3 Пr3. Карцинома ободочной кишки SW480 растет очень быстро на модели мышей Nu/Nu, и пальпируемые опухоли обнаруживали через 10 суток. Через 24 суток средний объем опухолей в контроле составлял 0,3 см 3,- 13005601 в то время средний объем опухолей у мышей, обработанных BCMA-Ig, равнялся 0,19 см 3, снижение опухолевой нагрузки на 46%. Карцинома ободочной кишки НТ 29 также растет агрессивно на модели мышей Nu/Nu. Для этих опытов 1106 клеток в 100 мкл не содержащего пирогенов, стерильного PBS имплантировали подкожно, и схема введения была аналогичной, описанной для SW480. Пальпируемые опухоли обнаруживали через 7 суток, и в контрольных группах большая часть опухолей росла очень быстро. Через 42 суток средний объем опухолей в контрольных группах (необработанные и обработанные контрольным-Ig, n=12) равнялся 0,485 см 3, в то время как средний размер опухолей в обработанной BCMA-Ig группе (n=5) составлял 0,095 см 3,снижение опухолевой нагрузки на 80%. Через 50 суток 30% мышей в контрольной группе были оценены, как находящиеся на терминальной стадии за счет размера опухолей более 1,5 см 3, и опыт был остановлен. В противоположность контрольной группе 0% мышей в группе, обработанной BCMA-Ig, было оценено, как находящиеся на терминальной стадии. Эти результаты представлены в табл. 2. Таблица 2 Объемы опухолей и летальность на модели НТ 29 через 50 суток лечения Она показывает 70% снижение объема опухоли и достоверное воздействие на смертность на модели роста опухоли НТ 29 с использованием обработки BCMA-Ig. Линия карциномы легкого А 549 растет медленнее, чем линии карциномы ободочной кишки, описанные выше. Для этой клеточной линии заявители имплантировали 1106 клеток в 100 мкл не содержащего пирогенов, стерильного PBS и обрабатывали с использованием схемы, описанной выше. Пальпируемые опухоли обнаруживали примерно через 20 суток после имплантации. Через 50 суток после имплантации опухолей средний объем опухолей в контрольных группах (необработанные и обработанные контрольным Ig; n=16) составлял 0,2 см 3, в то время как средний объем в группе, обработанной BCMAIg (=7), равнялся 0,1 см 3, снижение объема опухолей на 50%. В группе, обработанной BCMA-Ig, у 57% мышей объем опухолей был менее 0,1 см 3 через 50 суток, в то время как только 6% контрольных обработанных мышей сохраняли такую небольшую опухолевую нагрузку. Через 60 суток после имплантации опухолей средний объем опухолей в контрольной группе увеличивался до 0,3 см 3. В противоположность средний объем опухолей в группе, обработанной BCMA-Ig, составлял по-прежнему менее 0,2 см 3 (0,188). Для мышиной линии NIH3T3, которая также растет медленнее, чем линии карциномы ободочной кишки, заявители имплантировали 5106 клеток в 100 мкл не содержащего пирогенов, стерильного PBS и обрабатывали, как описано выше. Клетки NIH3T3 образовывали фибросаркому при подкожной имплантации у мышей Nu/Nu. Через 4 недели обнаруживали пальпируемые опухоли, и в контрольных группах (n=11) эти опухоли вырастали в течение последующих 10 суток до объема, достигающего среднего значения 0,136 см 3. В противоположность объем опухолей в группе, обработанной BCMA-Ig (n=5), достигал значения только 0,03 см 3, 78% снижение опухолевой нагрузки. На 48 сутки после имплантации средний объем опухолей в контрольных группах достигал 1,6 см 3, в то время как средний объем опухолей в группе, обработанной BCMA-Ig,равнялся только 0,8 см 3, 50% снижение объема опухолей. К 52 суткам 82% (9/11) животных в контрольных группах было оценено, как находящиеся на терминальной стадии, основываясь на объеме опухолей, который составлял более 1,5 см 3, только 18% животных оставалось живыми. В противоположность 40% (2/5) животных в группе, обработанной BCMA-Ig, имело опухоли такого объема, что их необходимо было убить, в живых оставалось еще 60% животных. Эти результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Данные по выживаемости на модели NIH3T3 Данные, показывающие рост опухолей NIH3T3 в течение времени, представлены на фиг. 13. Данные, показывающие рост опухолей SW480 в течение времени, представлены на фиг. 14. Данные, показы- 14005601 вающие рост опухолей НТ 29 в течение времени, и диаграмма рассеяния, показывающая отдельных животных на 42 сутки после имплантации опухоли, представлены на фиг. 15 А. Данные, показывающие рост опухолей А 549 у отдельных животных на 50 и 60 сутки после имплантации, представлены на фиг. 15 В. Данные по ингибированию роста опухолей для линии опухолевых клеток NIH3T3 представлены на фиг. 13. Данные по ингибированию роста опухолей для линии опухолевых клеток SW480 представлены на фиг. 14. Данные по ингибированию роста опухолей для линии опухолевых клеток НТ 29 и А 549 представлены на фиг. 15. Пример 8. BCMA-Ig вызывает снижение количества В-клеток у нормальных мышей. Мышей BALB/c самок в возрасте восьми недель получали из Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Мыши (3 группы) получали внутрибрюшинно либо PBS из 400 мкг человеческого слитого белкаBCMA-huIgCl (hBCMA-Ig) (от Teresa Cachero, Biogen), или 400 мкг очищенного человеческого IgG(HulgG) (Sandoz, Basel, Швейцария) на дни -8, -5, -1 и +2. Мыши получали 100 мкл 10% суспензии овечьих эритроцитов (SRBC) (Colorado Serum Company, Denver, CO) на 0 день. При вскрытии при пункции сердца собирали кровь в пробирки, содержащие ЭДТА, и эритроциты лизировали в гипотоническом буфере. Кровь также собирали без ЭДТА для приготовления сыворотки. Готовили отдельные клеточные суспензии из селезенки и брыжеечных лимфатических узлов (MLN) и эритроциты лизировали в гипотоническом буфере. Проводили проточную цитометрию с использованием РЕ-конъюгированных анти-СD45R/В 220, анти-синдекан/СD138 и анти-В 7.2 и ФИТЦ-конъюгированного анти-IgM и анти-СD45R/В 220-антител. Все mAbs получали от Pharmingen (San Diego, CA). Кратко,Fc-рецепторы блокировали 10 мкг/мл Fc-блока (Pharmingen) в течение 15 мин на льду с последующим добавлением РЕ- и ФИТЦ-конъюгированных mAbs и инкубировали на льду в течение 20-30 мин. Клетки промывали 1 раз и суспендировали в 0,5% параформальдегиде. Данные по флуоресценции клеток получали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) и анализировали с использованием программного обеспечения CELLQuest (Becton Dickinson). После обработки hBCMA-Ig было отмечено примерно 50% снижение количества В-клеток в периферической крови и в исследованных периферических лимфоидных органах. B220 высокие и IgMнизкие В-клетки составляли соответственно 23,4 и 21,5% клеток у мышей, обработанных PBS и HulgG, в то время как данная популяция составляла только 9,9% клеток у мышей, обработанных hBCMA-Ig. Оказалось,что число плазматических клеток (cиндeкaн/CD138+) было несколько снижено при соответственно 5,7 и 4,8% в крови мышей, обработанных PBS и HulgG, по сравнению с 3,9% у мышей, обработанныхhBCMA-Ig. Молекула В 7.2 положительно регулировалась соответственно при 3,1 и 4,5% В 220+ клеток у мышей, обработанных PBS и HulgG, по сравнению с 1,9% у мышей, получивших обработку hBCMA-Ig. В селезенке количество B220 выcoкиx B-клeтoк было заметно ниже у мышей, обработанных hBCMAIg, и равнялось 18,8% по сравнению с соответственно 36,7 и 40% у мышей, обработанных PBS и HulgG. Данное снижение наблюдали в обеих IgMвысоких и IgMнизких субпопуляциях (смотри табл. 1). Не было изменений в количестве только что образовавшихся В-клеток в селезенке, B220 высоких IgMнизких (данные не представлены). Оказалось, что количество плазматических клеток (синдекан/СD138+) было несколько снижено при соответственно 3,3 и 3,4% в селезенке мышей, обработанных PBS и HulgG, по сравнению с 2,4% у мышей, получивших hBCMA-Ig. В MLN было установлено снижение В 220+ В-клеток при 14,1% у мышей, обработанных hBCMA-Ig, по сравнению с соответственно 26,7 и 35,8% у мышей с обработкой PBS и HulgG. Данные представлены в табл. 4. Таблица 4 Популяции В-клеток у мышей 1, обработанных hBCMA-Ig, PBS и HuIgG- 15005601 Мышей обрабатывали, как описано в разделе Материалы и методы, и данные представлены в виде процентастандартное отклонение. На основании пониженного уровня В 7.2+ В-клеток в крови и плазматических клеток в крови и селезенке мышей, обработанных hBCMA-Ig, после иммунизации SRBC можно предположить, что имеется ингибирование активации и/или созревания В-клеток и потенциально повышенная элиминация активированных В-клеток. Очень небольшой процент антиген-специфических В-клеток будет активироваться и давать ответ на любой антиген, и в данном случае на SRBC. Вследствие того, что обработка hBCMA-Ig приводит к такому заметному снижению процента В-клеток во всех исследованных тканях, на 50%,оказалось, что активность hBCMA-Ig распространяется также на находящиеся в покое зрелые В-клетки. Следовательно, ожидается, что слитый ВСМА-белок можно использовать в качестве лечебного препарата с клиническим применением при опосредуемых В-клетками заболеваниях. Заболевания будут включать таковые, которые являются аутоиммунными по своей природе, такими как системная красная волчанка, тяжелая, псевдопаралитическая миастения, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, антифосфолипидный синдром, болезнь Чагаса, болезнь Грейвса, грануломатоз Вегенера,полиартериит нодозный и быстро прогрессирующий гломерулонефрит. Терапевтический агент будет также иметь применение при нарушениях, связанных с плазматическими клетками, таких, как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, заболевание, связанное с тяжелой цепью иммуноглобулинов, первичный или связанный с иммуноцитами амилоидоз, моноклональная гаммапатия неопределенного значения(MGUS). Онкологические мишени будут включать В-клеточную карциному, лейкемию и лимфому. Специалистам в данной области, очевидно, будет понятно, что можно сделать различные модификации и вариации в полипептидах, композициях и способах по изобретению, не изменяя сущности или объема изобретения. Таким образом, подразумевается, что настоящее изобретение включает модификации и вариации данного изобретения при условии, что они совпадают с объемом прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентами. Список последовательностей ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего, характеризующихся аномально высокой экспрессией лиганда, индуцирующего пролиферацию клеток (APRIL), предусматривающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антагонист рецептора APRIL, выбранный из группы, включающей:a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 1-184 SEQ ID NO:8, или полипептид, по меньшей мере на 80% идентичный указанному;b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 1-52 SEQ ID NO:8, или полипептид, по меньшей мере на 80% идентичный указанному;SEQ ID NO:8,а также фармацевтически приемлемый наполнитель. 2. Способ по п.1, в котором полипептид дополнительно содержит гетерологичную аминокислотную последовательность. 3. Способ по п.2, в котором гетерологичная аминокислотная последовательность представлена сигнальной последовательностью секретируемого белка. 4. Способ по п.2, в котором гетерологичная аминокислотная последовательность представляет собой Fc-домен иммуноглобулина. 5. Способ по п.4, в котором иммуноглобулин представляет собой IgG. 6. Способ по п.5, в котором иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин человека. 7. Способ по п.6, в котором полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12. 8. Способ по любому из пп.1-7, согласно которому злокачественная опухоль представляет собой карциному. 9. Способ по п.8, согласно которому карцинома выбрана из группы, включающей карциному легкого, карциному ободочной кишки, карциному простаты и карциному молочной железы. 10. Способ по любому из пп.1-9, согласно которому млекопитающее представляет собой человека.