Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному соединению и способы их применения
Формула / Реферат
1. Способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий
(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикаторный ген, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах; и
(в) сравнение уровня экспрессии указанного индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному препарату.
2. Способ по п.1, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как раскрыто в п.1, но в отсутствие противовирусного препарата.
3. Способ по п.1, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена является уровнем экспрессии, который определяют, как раскрыто в п.1, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного препарата.
4. Способ по п.1, в котором указанный вектор содержит ДНК геномного вирусного вектора.
5. Способ по п.1, в котором указанный вектор содержит ДНК субгеномного вирусного вектора.
6. Способ по п.1, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ретровируса.
7. Способ по п.6, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ВИЧ.
8. Способ по п.7, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую vif, vpr, tat, rev, vpu или nef, или их комбинацию.
9. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента.
10. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса содержит функциональную вирусную последовательность.
11. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса кодирует белок, являющийся мишенью указанного противовирусного лекарственного препарата.
12. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса кодирует два белка, являющихся мишенями указанного противовирусного лекарственного препарата.
13. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса содержит ретровирусный ген.
14. Способ по п.13, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген ВИЧ.
15. Способ по п.14, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген gag-pol ВИЧ.
16. Способ по п.1, в котором указанный индикаторный ген представляет собой функциональный индикаторный ген, а способ дополнительно включает стадию инфицирования указанных клеток-хозяев вирусными частицами вектора, полученными из отфильтрованных супернатантов культуры упаковывающих клеток-хозяев данного вектора, причем указанную стадию инфицирования проводят до стадии а).
17. Способ по п.1, в котором указанный индикаторный ген представляет собой нефункциональный индикаторный ген.
18. Способ по п.17, дополнительно включающий стадию инфицирования указанных клеток-хозяев вирусными частицами вектора, полученными из отфильтрованных супернатантов культуры упаковывающих клеток-хозяев данного вектора, причем указанную стадию инфицирования проводят до стадии а).
19. Способ по п.17, в котором указанную стадию инфицирования осуществляют путем совместного культивирования указанных клеток-хозяев с упаковывающими клетками-хозяевами вектора.
20. Способ по п.1, в котором указанный индикаторный ген представляет собой ген люциферазы.
21. Способ по п.1, в котором указанный индикаторный ген представляет собой ген lacZ E. coli.
22. Способ по п.18, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки человека.
23. Способ по п.18, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки почки эмбриона человека.
24. Способ по п.18, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки 293.
25. Способ по п.1, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой Т-клетки человека.
26. Способ по п.25, в котором указанные клетки-хозяева принадлежат линии Т-клеточного лейкоза человека.
27. Способ по п.26, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки Jurkat.
28. Способ по п.26, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки H9.
29. Способ по п.26, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки CEM.
30. Вектор для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, содержащий фрагмент вируса и индикаторный ген, и не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, используемый для осуществления способа по п.1.
31. Вектор по п.30, в котором указанный фрагмент вируса содержит два гена.
32. Вектор по п.30, в котором указанный фрагмент вируса содержит ретровирусный ген.
33. Вектор по п.32, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген ВИЧ.
34. Вектор по п.31, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген gag-pol ВИЧ.
35. Вектор по п.30, в котором указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента.
36. Вектор по п.30, в котором указанный индикаторный ген представляет собой функциональный индикаторный ген.
37. Вектор по п.30, в котором указанный индикаторный ген представляет собой нефункциональный индикаторный ген.
38. Вектор по п.30, в котором указанный индикаторный ген представляет собой ген люциферазы.
39. Упаковывающая клетка-хозяин, содержащая вектор по п.30.
40. Упаковывающая клетка-хозяин по п.39, представляющая собой клетку млекопитающего.
41. Упаковывающая клетка-хозяин по п.40, представляющая собой клетку человека.
42. Упаковывающая клетка-хозяин по п.41, представляющая собой клетку почки эмбриона человека.
43. Упаковывающая клетка-хозяин по п.42, представляющая собой клетку 293.
44. Упаковывающая клетка-хозяин по п.41, принадлежащая линии клеток гепатомы человека.
45. Упаковывающая клетка-хозяин по п.44, представляющая собой клетку HepG2.
46. Упаковывающая клетка-хозяин по п.44, представляющая собой клетку Huh7.
47. Способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий
(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и нефункциональный индикаторный ген, причем экспрессия указанного нефункционального индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах; и
(в) сравнение уровня экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному препарату.
48. Способ по п.47, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как раскрыто в п.47, но в отсутствие указанного противовирусного препарата.
49. Способ по п.47, в котоЁюь контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена представляет собой стандартный уровень экспрессии, который определяют, как раскрыто в п.47, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного препарата.
50. Способ по п.47, в котором указанный вектор содержит ДНК геномного вирусного вектора.
51. Способ по п.47, в котором указанный вектор содержит ДНК субгеномного вирусного вектора.
52. Способ по п.47, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ретровируса.
53. Способ по п.52, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ВИЧ.
54. Способ по п.53, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую vif, vpr, tat, rev, vpu или nef, или их комбинацию.
55. Способ по п.47, в котором указанный фрагмент вируса кодирует один белок.
56. Способ по п.47, в котором указанный фрагмент вируса кодирует два белка.
57. Способ по п.47, в котором указанный фрагмент вируса содержит ретровирусный ген.
58. Способ по п.57, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген ВИЧ.
59. Способ по п.58, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген gag-pol ВИЧ.
60. Способ по п.47, в котором указанный фрагмент вируса представляет собой фрагмент, полученный от пациента.
61. Способ по п.47, в котором указанный индикаторный ген представляет собой ген люциферазы.
62. Способ по п.47, в котором указанный нефункциональный индикаторный ген содержит пермутированный промотор.
63. Способ по п.47, в котором указанный нефункциональный индикаторный ген содержит пермутированную кодирующую область.
64. Способ по п.47, в котором указанный нефункциональный индикаторный ген содержит инвертированный интрон.
65. Способ по п.47, в котором указанная клетка-хозяин представляет собой клетку человека.
66. Способ по п.65, в котором указанная клетка-хозяин представляет собой Т-клетку человека.
67. Способ по п.47, дополнительно включающий стадию инфицирования указанных клеток-хозяев вирусными частицами вектора, полученными из отфильтрованных супернатантов культуры упаковывающих клеток-хозяев данного вектора, причем указанную стадию проводят до стадии а).
68. Способ по п.67, в котором указанную стадию инфицирования осуществляют путем совместного культивирования указанных клеток-хозяев с упаковывающими клетками-хозяевами вектора.
69. Способ по п.67, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки человека.
70. Способ по п.67, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки почки эмбриона человека.
71. Способ по п.70, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки 293.
72. Способ по п.67, в котором упаковывающие клетки-хозяева принадлежат линии клеток гепатомы человека.
73. Способ по п.72, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки HepG2.
74. Способ по п.72, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки Huh7.
75. Способ по п.67, в котором клетки-хозяева и упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки одного и того же типа.
76. Способ определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий
(а) определение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату способом по п.1, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента; и
(б) сравнение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, определенной на стадии (а), со стандартной кривой чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, причем уменьшение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату относительно указанной стандартной кривой свидетельствует о том, что указанный вирус устойчив к указанному противовирусному лекарственному препарату, и величина указанного уменьшения чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату показывает, в какой степени указанный вирус устойчив к противовирусному лекарственному препарату.
77. Способ определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий
(а) определение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату способом по п.47, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента; и
(б) сравнение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, определенной на стадии (а), со стандартной кривой чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, причем уменьшение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату относительно указанной стандартной кривой свидетельствует о том, что указанный вирус устойчив к указанному противовирусному лекарственному препарату, и величина указанного уменьшения чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату показывает, в какой степени указанный вирус устойчив к противовирусному лекарственному препарату.
78. Способ определения прогрессирования или развития устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий
(а) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в первый момент времени способом по п.1, причем указанный фрагмент вирусаявляется фрагментом, полученным от пациента;
(б) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному препарату во второй, более поздний момент времени способом по п.1, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента в этот более поздний момент времени;
(в) сравнение эффективности противовирусного лекарственного препарата, оцененной на стадиях (а) и (б), причем уменьшение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в более поздний момент времени по сравнению с более ранним свидетельствует о развитии или прогрессировании устойчивости вируса, инфицирующего указанного пациента, к противовирусному лекарственному препарату.
79. Способ определения прогрессирования или развития устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий
(а) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в первый момент времени способом по п.47, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента;
(б) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному препарату во второй, более поздний момент времени способом по п.47, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента в этот более поздний момент времени;
(в) сравнение эффективности противовирусного лекарственного препарата, оцененной на стадиях (а) и (б), причем уменьшение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в более поздний момент времени по сравнению с более ранним свидетельствует о развитии или прогрессировании устойчивости вируса, инфицирующего указанного пациента, к противовирусному лекарственному препарату.
80. Способ по п.1, в котором указанный вектор содержит ДНК гепаднавируса.
81. Способ по п.80, в котором указанный вектор содержит ДНК HBV.
82. Способ по п.81, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую белки C, P или X, или их комбинацию.
83. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса включает ген HBV.
84. Способ по п.83, в котором указанный фрагмент вируса включает ген P HBV.
85. Способ по п.83, в котором указанный фрагмент вируса включает ген RT HBV.
86. Способ по п.83, в котором указанный фрагмент вируса включает ген ДНК-полимеразы HBV.
87. Вектор по п.30, в котором указанный фрагмент вируса включает ген гепаднавируса.
88. Вектор по п.87, в котором указанный фрагмхэт вируса включает ген HBV.
89. Вектор по п.88, в котором указанный фрагмент вируса включает ген P HBV.
90. Вектор по п.88, в котором указанный фрагмент вируса включает ген ДНК-полимеразы HBV или ген RT HBV.
91. Способ определения биологической эффективности потенциального противовирусного соединения, включающий
(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного потенциального противовирусного соединения, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, включающий фрагмент вируса и индикаторный ген, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах; и
(в) сравнение указанного уровня экспрессии указанного индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, измеренным на стадии (в), и уровнем экспрессии, измеренным на стадии (б), коррелирует с эффективностью указанного потенциального противовирусного соединения, определяя тем самьм эффективность потенциального противовирусного соединения.
92. Способ по п.91, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как раскрыто в п.91, но в отсутствие указанного противовирусного соединения.
93. Способ по п.91, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена представляет собой стандартный уровень экспрессии, который определяют, как раскрыто в п.91, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного соединения.
94. Способ по п.91, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ретровируса.
95. Способ по п.94, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ВИЧ.
96. Способ по п.91, в котором указанный вектор для определения резистентности содержит ДНК гепаднавируса.
97. Способ по п.91, в котором указанный вектор содержит ДНК HBV.
98. Способ по п.95, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую gag-pol ВИЧ.
99. Способ по п.97, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую белок Р HBV.
100. Способ по п.91, в котором указанный фрагмент вируса кодирует один белок.
101. Способ по п.91, в котором указанный фрагмент вируса кодирует два белка.
102. Способ по п.91, в котором указанный фрагмент вируса включает ретровирусный ген.
103. Способ по п.102, в котором указанный фрагмент вируса включает ген ВИЧ.
104. Способ по п.91, в котором указанный фрагмент вируса включает ген гепаднавируса.
105. Способ по п.104, в котором указанный фрагмент вируса включает ген HBV.
106. Способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий
(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикатор, причем экспрессия указанного индикатора зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного индикатора в указанных клетках-хозяевах; и
(в) сравнение уровня экспрессии указанного индикатора, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикатора, причем разница между указанным уровнем экспрессии индикатора, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату.
107. Способ по п.106, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикатора определяют, как раскрыто в п.106, но в отсутствие противовирусного препарата.
108. Способ по п.106, в котором указанный индикатор включает ДНК-структуру.
109. Способ по п.106, в котором указанный индикатор включает РНК-структуру.
110. Способ определения биологической эффективности потенциального противовирусного соединения, включающий
(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного потенциального противовирусного соединения, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикатор, причем экспрессия указанного индикатора зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного индикатора в указанных клетках-хозяевах; и
(в) сравнение указанного уровня экспрессии указанного индикатора, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикатора, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикатора, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с эффективностью указанного потенциального противовирусного соединения, определяя тем самым эффективность потенциального противовирусного соединения.
111. Способ по п.110, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикатора определяют, как раскрыто в п.110, но в отсутствие указанного противовирусного соединения.
112. Способ по п.110, в котором указанный индикатор включает ДНК-структуру.
113. Способ по п.110, в котором указанный индикатор включает РНК-структуру.
Текст
005426 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к тестам на чувствительность и устойчивость к противовирусным препаратам, используемым для установления эффективных схем применения лекарств при лечении вирусных инфекций. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым векторам, хозяйским клеткам и композициям для осуществления этих новых тестов на чувствительность и устойчивость к противовирусным препаратам. Настоящее изобретение относится также к отбору кандидатов в лекарственные средства по их способности ингибировать отобранные вирусные последовательности и/или вирусные белки. В частности, настоящее изобретение относится к использованию техники рекомбинантной ДНК для получения первого конструкта резистентного тест-вектора, включающего сегмент, производимый пациентом, и индикаторный ген, с последующим введением резистентного тест-вектора в хозяйскую клетку и определением экспрессии или ингибирования продукта индикаторного гена в хозяйской клеткемишени в присутствии противовирусного лекарственного средства. Настоящее изобретение относится также к средствам и способам идентификации противовирусных лекарственных препаратов, которые обладают разными моделями (схемами) резистентности при сравнении с существующими противовирусными лекарственными препаратами. Настоящее изобретение относится также к способам и композициям для идентификации и оценки биологической эффективности потенциальных терапевтических соединений. Более точно, настоящее изобретение относится к тестам на лекарственную чувствительность и резистентность, пригодными для создания оптимального терапевтического режима для лечения разнообразных вирусных болезней, в том числе, например, HIV/AIDS и гепатитов. Уровень техники Вирусная устойчивость к лекарственному препарату Использование противовирусных соединений для химиотерапии и химиопрофилактики вирусных болезней представляет собой относительно новое направление в области инфекционных болезней, особенно в сравнении с более чем 50-летним опытом в области антибактериальных антибиотиков. История создания противовирусных соединений не была простой потому, что вирусы преподносят множество специфических проблем. Вирусы должны реплицироваться внутриклеточно и часто используют ферменты клетки хозяина, макромолекулы и органеллы для синтеза вирусных частиц. По этой причине безопасные и эффективные противовирусные соединения должны обладать способностью различать с высокой степенью эффективности клеточную и вирус-специфическую функции. Кроме того, вследствие природы вирусной репликации, оценка in vitro чувствительности вирусных изолятов к противовирусным соединениям должна осуществляться в комплексной культуральной системе, состоящей из живых клеток (например, тканевая культура). Результаты таких аналитических систем широко варьируют в соответствии с используемым типом клеток тканевой культуры и условиями анализа. Несмотря на эти сложности, для терапии AIDS одобрено девять лекарственных препаратов, пять ингибиторов обратной транскриптазыAZT, ddI, ddC, d4T, 3TC, один ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы, невирапин и три протеазных ингибитора, саквинавир, ритонавир и индиновир и недавно созданные несколько дополнительных кандидатов в противовирусные лекарственные препараты, такие как нелфинавир, делавиридин,VX-478 и 1592. Резистентный вирусный препарат представляет собой практическую задачу, связанную с высокой скоростью вирусной репликации и частотой мутирования. Лекарственная устойчивость мутантов была впервые установлена для поксвирусов в отношении тиосемикарбазона (Appleyard и Way (1966) Brit. J.Exptl. Pathol. 47, 144-51), для полиовируса в отношении гуанидина (Melnick с соавт. (1961) Science 134,557), для вируса гриппа А в отношении амантадина (Oxford с соавт. (1970) Nature 226, 82-83; Cochran с соавт. (1965) Ann. NY Acad. Sci. 130, 423-429) и для вируса простого герпеса в отношении йоддезоксиуридина (Jawetz с соавт. (1970) Ann. NY Acad. Sci. 173, 282-291). По имеющимся данным, было идентифицировано приблизительно 75 мутаций лекарственной устойчивости HIV (Mellors с соавт. (1995) Intnl.Antiviral News, приложение и Condra, J.H. с соавт. (1996) J. Virol. 70, 8270-8276). Небольшие и продуктивные геномы вирусов наиболее важных вирусных патогенов человека подверглись интенсивному молекулярно-генетическому изучению структуры и циклов репликации. В результате, более точно были охарактеризованы участки и механизмы активности и резистентности к противовирусным лекарственным препаратам, чем для каких-либо других классов лекарственных препаратов (Richman (1994) Trends Microbiol. 2, 401-407). Вероятность того, что будут возникать мутанты с устойчивостью, является функцией, как минимум, четырех факторов 1) частоты мутирования вируса; 2) присущей мишенному участку вируса мутабельности в отношении специфического противовирусного действия; 3) селективности пресса противовирусных препаратов и 4) величины и скорости вирусной репликации. Что касается первого фактора, для одноцепочечной РНК вирусов, у которых утрачен механизм проверочного считывания геномной репликации, частоты мутирования составляют приблизительно 310-5 на пару оснований на цикл репликации (Holland с соавт. (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 176, 1-20; Mansky с соавт. (1995) J. Virol. 69, 5087-94; Coffin (1995) Science 267, 483-489). Так, отдельный геном из 10 тысяч пар нуклеотидов, аналогичный тому, который присущ вирусу иммунодефицита человека (HIV), предположительно содержит в среднем одну мутацию на каждые три потомка вирусного генома. Что касается второго фактора, присущая вирусному мишенному сайту мутабельность, в ответ на-1 005426 действие специфического противовирусного агента, может существенно влиять на вероятность появления устойчивых мутантов. Например, зидовудин (AZT) более легко селектирует мутации обратной транскриптазы HIV in vitro и in vivo, чем это делает другой апробированный тимидиновый аналог d4T(ставудин). Одно из вероятных неизбежных следствий действия противовирусного лекарственного препарата заключается в том, что он оказывает достаточно избирательное давление на вирусную репликацию, чтобы отобрать мутанты, резистентные к лекарственному препарату (Hermann с соавт. (1977) Ann. NY Acad.SCI. 284, 632-7). Что касается третьего фактора, с увеличением выдерживания с лекарственным препаратом, селективное давление на популяцию реплицирующегося вируса возрастает, способствуя более быстрому появлению мутантов, резистентных к лекарственному препарату. Например, наивысшие дозы(Richman с соавт. (1990) J. AIDS. 3, 743-6). Это селективное давление, оказываемое на устойчивые мутанты, повышает вероятность возникновения таких мутантов, при условии, что поддерживаются существенные уровни вирусной репликации. Что касается четвертого фактора, то величина и скорость репликации в вирусной популяции вносит основной вклад в вероятность возникновения устойчивых мутантов. Многие вирусные инфекции характеризуются высокими уровнями вирусной репликации при высоких скоростях вирусной сменяемости. Это особенно справедливо при хроническом HIV-инфицировании, а также инфицировании вирусами гепатита В и С. Вероятность возникновения AZT-резистентности повышена у HIV-инфицированных пациентов со снижением количества CD4-лимфоцитов, что связано с возрастанием уровней HIVрепликации (там же). Наивысшие уровни вируса повышают вероятность предсуществующих мутантов. Было показано,что возникновение резистентной популяции происходит из-за выживаемости и селективного размножения уже существующей субпопуляции, которая произвольно появляется в отсутствие селективного давления. Все вирусы обладают базовой скоростью мутирования. По расчетам, в течение HIV-инфекции ежедневно появляется приблизительно 1010 новых вирионов (Но с соавт. (1995) Nature 373, 123-126), мутационная скорость от 10-4 до 10-5 на нуклеотид гарантирует предсуществование почти любой мутации в любой временной точке течения HIV-инфекции. Доказательством является накопление устойчивых к лекарственному препарату мутантов, которое практически осуществляется в субпопуляциях HIVинфицированных индивидуумов (Najera с соавт. (1994) AIDS Res. Hum Retroviruses 10, 1479-88; Najera с соавт. (1995) J. Virol. 69, 23-31). Хорошо документировано также предсуществование устойчивых к лекарственному препарату мутантов пикорнавируса при скорости приблизительно 10-5 (Ahmad с соавт.(1987) Antiviral Res. 8, 27-39). Вирус иммунодефицита, человека (HIV) Синдром приобретенного иммунодефицита (AIDS) является смертельным заболеванием для человека и, в большинстве своем, считается одним из наиболее серьезных заболеваний, когда-либо поражавшего человечество. В мировом масштабе количество людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (HIV), и случаев AIDS неуклонно повышается и попытки обуздать ход этого процесса (пандемии), по некоторым предположениям, имеют ограниченную эффективность. В настоящее время различают два типа HIV: HIV-1 и HIV-2. На декабрь 1994 г. Всемирная Организация Здоровья сообщала о 1025073 случаях AIDS. Они составляют лишь часть от общего числа случаев, и ВОЗ считает, что на конец 1994 г., принимая во внимание сообщения о не диагностированных, не сообщенных и задержанных данных, и на основании установленного количества HIV-инфекций, во всем мире, в совокупности, было более 4,5 миллионов случаев AIDS (Mertens AIDS 9 (Suppl. A), S259-S272). С тех пор как HIV начал свое распространение в Северной Америке, Европе и Африке, за исключением Сахары, установлено, что инфицированными являются более чем 19,5 миллионов мужчин, женщин и детей (там же). Одной из отличительных особенностей пандемии AIDS явилось его глобальное распространение в последние 20 лет почти в 190 странах, сообщивших на сегодняшний день о случаях AIDS. Прогноз, осуществляемый ВОЗ,о распространении HIV-инфекций во всем мире, колеблется. Предполагаемая совокупная численность случаев AIDS среди взрослых к 2000 г. составит почти 10 миллионов. В 2000 г. общая численность смертей, связанных с HIV, среди взрослых возрастет по прогнозу до более чем 8 миллионов от нынешнего общего количества около 3 миллионов. HIV-1 и HIV-2 представляют собой оболочечные ретровирусы с диплоидным геномом, обладающим двумя идентичными молекулами РНК. Молекулярная организацияHIV-1 представляет собой (5') U3-R-U5-gag-pol-env-U3-R-U5 (3'), как показано на фиг. 1 а. Последовательности U3, R и U5 образуют длинные концевые повторы (LTR), которые представляют собой регуляторные элементы, которые промотируют экспрессию вирусных генов и, отчасти, соседние клеточные гены инфицированных хозяев. Внутренние области вирусной РНК кодируют структурные белки: gag(коровые белки р 55, р 17, р 24 и р 7) роl (протеаза р 10, обратные транскриптазы р 66 и р 51 и интегразу р 32) и evn (оболочечные гликопротеины gр 120 и gр 41). Gag кодирует полипротеиновый предшественник, который расщепляется вирусной протеазой на три или четыре структурных белка; роl кодирует обратную транскриптазу (RT) и вирусные протеазу и интегразу; env кодирует трансмембранный и наружный гликопротеин вируса. Гены gag и роl экспрессируются в виде геномной РНК, а ген env экспрессируется в-2 005426 виде сплайсированной субгеномной РНК. В дополнение к env-гену имеются другие HIV-гены, продуцируемые сплайсированными субгеномными РНК, которые способствуют репликации и биологической активности данного вируса. Эти гены включают: tat, который кодирует белок, который активирует экспрессию вируса и некоторые клеточные гены; rev, который кодирует белок, который промотирует экспрессию несплайсированных или одиночно-сплайсированных мРНК; nef, который кодирует, миристилированный белок, который при некоторых условиях модулирует образование вируса; vif, который кодирует белок, который влияет на способность вирусных частиц инфицировать клетки-мишени, но не оказывает влияния на вирусную экспрессию или на передачу вируса при межклеточном контакте; vpr, который кодирует вирион-ассоциированный белок; и vpu, который кодирует белок, который участвует в стимуляции внеклеточного высвобождения вирусных частиц. Нет лучшей иллюстрации проблемы вирусной резистентности к лекарственному средству, чем заболевание AIDS. Лекарственная устойчивость HIV-изолятов была установлена для ингибиторов нуклеозидной и не-нуклеозидной обратной транскриптазы и для протеазных ингибиторов. Возникновение HIVизолятов, резистентных к AZT, не удивительно, поскольку AZT и другие ингибиторы обратной транскриптазы лишь снижают вирусную репликацию примерно на 90%. Высокие скорости вирусной репликации в присутствии селективного давления лекарственного лечения создают идеальные условия для возникновения мутантов, резистентных к лекарственному препарату. На последних стадиях инфекции пациенты, которые обнаруживают самые высокие уровни вирусной репликации, создают резистентный вирус при лечении AZT более быстро, чем пациенты на ранних стадиях инфекции (Richman с соавт. (1990) J.AIDS 3, 743-6). В первоначальном описании возникновения резистентности к AZT обнаружили прогрессивное и постадийное снижение в лекарственной чувствительности (Larder с соавт. (1989) Science 243,1731-1734). Это объясняли распознаванием множественных мутаций по гену обратной транскриптазы,что содействовало снижению чувствительности (Larder с соавт. (1989) Science 246, 1155-1158). Эти мутации осуществляли аддитивный или даже синергический вклад в фенотип сниженной чувствительности(Kellam. с соавт. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 1934-1938). Кумулятивное приобретение таких мутаций приводило к прогрессивному снижению в чувствительности. Подобные эффекты наблюдали с ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы (Nunberg с соавт. (1991) J. Virol. 65, 4887-4892;Sardanna с соавт. (1992) J. Biol. Chem. 267, 17526-17530). Изучение протеазных ингибиторов обнаруживает, что селекция штаммов HIV со сниженной чувствительностью к лекарственному препарату происходит в пределах недель (Но с соавт. (1994) J. Virol. 68, 2016-2020; Kaplan с соавт. (1994) Proc. Nakl.Acad. Sci. 91, 5597-5601). Хотя в недавних исследованиях показали, что протеазные ингибиторы являются более сильными, нежели ингибиторы обратной транскриптазы, все же резистентность развивалась.(Condra с соавт., Id. and Report 3rd Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, March 1996). Субтерапевтические уровни лекарственного препарата, обусловленные снижением дозы, лекарственными взаимодействиями, малабсорбцией или снижением биологической доступности, связанной с другими факторами, или добровольно взятыми перерывами приема лекарства, все это дает возможность повысить вирусную репликацию и увеличить возможность для мутирования и резистентности (там же). Селективное давление лекарственного лечения приводит к увеличению предсуществующих мутантов. С продлением вирусной репликации, в отсутствие полностью супрессированной противовирусной лекарственной активности, кумулятивное приобретение множественных мутаций может происходить в течение длительного времени, как было описано для AZT и протеазных ингибиторов HIV. В действительности наблюдали, что вирусные мутанты множественно резистенты к разным лекарственным средствам (Larder с соавт. (1989) Science 243, 1731-1734; Larder с соавт. (1989) Science 246, 1155-1158; Condra с соавт. (1995) Nature 374, 569-71). При неизбежном появлении резистентности для многих вирусных инфекциях, как, например, для HIV, необходимо создавать способы для оптимизации лечения, преодолевая резистентность вирусных популяций. Выяснение вклада лекарственной устойчивости в лекарственную недостаточность является трудной проблемой, потому что пациенты, у которых, по всей вероятности, развилась лекарственная устойчивость, вероятнее всего обладают другими примешивающимися факторами, которые будут предрасполагать их к неблагоприятному прогнозу (Richman (1994) AIDS ResHum Rekroviruses 10, 901-905). Кроме того, пациенты содержат в себе смесь вирусов с разной чувствительностью. Гепатит В (HBV)HBV представляет собой возбудитель острого и хронического гепатита, который поражает около 200 миллионов больных во всем мире. Zuckerman A.J. Транс. R. Soc. Тrор. Med. Hygiene (1982) 76, 711718. HBV-инфекция, приобретенная во взрослой жизни, часто является клинически неочевидной, и наиболее остро инфицированные взрослые люди полностью оправляются от болезни и очищаются от вируса. Однако изредка острое заболевание печени может быть настолько серьезным, что больной погибает от скоротечного гепатита. Небольшая часть, возможно от 5 до 10% остро инфицированных взрослых,становятся постоянно инфицированными этим вирусом и заболевают болезнью печени различной тяжести. Однако новорожденные, получившие HBV-инфекцию по наследству, редко остаются чистыми, и свыше 90% таких детей становятся хронически инфицированными. Из-за того что HBV обычно передается от матери новорожденному младенцу, в густо населенных областях Африки и Азии несколько сотен-3 005426 миллионов людей этого мира из числа живущих постоянно инфицированы HBV и в разной степени страдают хроническим заболеванием печени, которое в значительной мере увеличивает их риск заболеть циррозом и гепатоцеллюлярной карциномой (НСС). Действительно, риск заболеть НСС возрастает 100 кратно у пациентов с хроническим гепатитом, а продолжительность жизни у мужчин с риском НСС, инфицированных при рождении, составляет 40%. Beasly R.Р. с соавт. Lancet (1981) 2, 1129-1133. В соответствии с этим большая часть популяции мира страдает и умирает от последующих осложнений HBVинфекции. Создания лекарственных препаратов анти-HBV ждали долго, но оно было затруднено узким кругом хозяев HBV: HBV реплицируется, в основном, в печени человека и шимпанзе и не реплицируется в печени экспериментальных животных или в культуре клеток. Tiollais, P. с соавт. Nature (London) (1985) 317, 489-495. Вирус гепатита В является ДНК вирусом с компактной геномной структурой; несмотря на свой малый размер, кольцевая, 3200 пар оснований, ДНК HBV кодирует четыре совокупности вирусных продуктов и представляет собой комплекс со структурой множественной частицы. HBV осуществляет свою геномную экономию, опираясь на эффективную стратегию кодирования белков четырех перекрывающихся генов: S, С, Р и X. HBV является одним из представителей семейства животных вирусов, гепаднавирусов и классифицируется как гепаднавирус, тип 1. Подобные вирусы инфицируют некоторые виды североамериканских лесных сурков, норовых и древесных белок и пекинских уток. Все гепаднавирусы, в том числе HBV, совмещают нижеследующие характеристики: 1) существует три различимые морфологические формы, 2) все представители обладают белками, которые функционально и структурно эквивалентны по оболочечным и нуклеокапсидным антигенам HBV, 3) они реплицируются в границах печени, но могут также существовать во внепеченочных участках, 4) они содержат эндогенную ДНК-полимеразу с РНК- и ДНК-зависимыми ДНК-полимеразными активностями, 5) их геномы представляют собой частично двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК, 6) они ассоциированы с острым и хроническим гепатитами и гепато-целлюлярной карциномой и 7) репликация их генома осуществляется через РНКинтермедиат, который обратно транскрибируем в ДНК с использованием эндогенной РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности вируса способом, аналогичным тому, который наблюдается у ретровирусов. В ядрах инфицированных печеночных клеток частично двухцепочечная ДНК преобразуется в ковалентно замкнутую кольцевую двухцепочечную ДНК (сскДНК) с помощью ДНК-зависимой ДНКполимеразы. Транскрипция вирусной ДНК осуществляется с помощью РНК-полимеразы хозяина и приводит к возникновению нескольких РНК-транскриптов, которые отличаются по своим сайтам инициации, однако, все терминированы обычным сигналом полиаденилирования. Самые длинные из этих ДНК действуют в качестве прегеномных у вируса, а также информационных для некоторых вирусных белков. Вирусные белки, транслируемые из прегеномных РНК, и белки и РНК прегенома упакованы в вирионы и выделены из гепатоцитов. Хотя культивирование HBV in vitro затруднено, некоторые клетки были успешно трансфицированы ДНК HBV, приводя к образованию in vitro частиц HBV. Существуют три формы частиц HBV: неинфекционные 22 нм частицы, которые появляются либо в виде сферических или длинных филаментозных форм, и 42 нм двухоболочечных сферических частиц,которые представляют интактный инфекционный вирион гепатита В. Оболочечный белок, НВsАg, является продуктом гена S из HBV и обнаруживается на внешней поверхности вириона и в мельчайших сферических и трубчатых структурах. Расположенная выше гена S открытая рамка считывания, представлена открытыми рамками считывания пре-S-гена, пре-S1 и пре-S2, которые кодируют продукты пре-S-гена,в том числе рецепторы на поверхности HBV для полимеризованного человеческого сывороточного альбумина и сайты присоединения для гепатоцитных рецепторов. Интактный 42 нм вирион можно разрушить с помощью мягких детергентов и выделить 27 нм нуклеокапсидную коровую частицу. Эта сердцевина состоит из двух нуклеокапсидных белков, кодируемых С-геном. С-ген обладает двумя кодонами инициации, определяющие кор, и прекоровой областью. Основной антиген, экспрессируемый на поверхности нуклеокапсидной сердцевины, кодируется данной сердцевинной областью и в качестве антигена(НВсАg) относится к кору гепатита В. Антиген е гепатита В (НВеАg) получен из того же гена С, благодаря инициации ATG на прекоре. В нуклеокапсидной сердцевине упакована также ДНК-полимераза, которая управляет репликацией и репарирует ДНК HBV. Эта ДНК-полимераза кодируется Р-геном, третьим и самым большим из геновHBV. Данный фермент обладает и ДНК-зависимой ДНК-полимеразной и РНК-зависимой обратнотранскриптазной активностями и необходим также для эффективного капсидирования прегеномной РНК. Четвертый ген, X, кодирует небольшой, не ассоциированный с макрочастицей белок, который показал способность трансактивировать транскрипцию и вирусных и клеточных генов. Хотя репликация HBV довольно хорошо понята, ранние стадии HBV-инфекции определены недостаточно. Клеточные рецепторы или сайты присоединения на вирионах не могут быть изучены без анализов соответствующих тканевых культур. В попытке постановки этой проблемы были созданы некоторые клеточные линии, человеческие гепатобластомные клетки Huh (НВ 611) (Ueda, К. с соавт. Virology (1989) 169, 213-216) и клетки HepG2 (Galle, P.R. и Theilmann, L. Arzneim-Forsh. Drug Res. (1990) 40, 1380-1382) для оценки лекарственного препарата анти-HBV.-4 005426 Недавно обратили внимание на молекулярные варианты HBV. Изменчивость происходит по всему геному HBV, и клинические изоляты HBV, которые не экспрессируют вирусные белки, приписывали мутации индивидуального или даже множественного гена. Например, были описаны варианты, у которых отсутствуют нуклеокапсидные белки, оболочечные белки или и те, и другие. Внимание привлекли два мутанта. Первый из них обнаруживается у некоторых пациентов с тяжелой хронической HBVинфекцией. Обнаружено, что эти пациенты инфицированы HBV-мутантом, который содержит изменение в прекоровой области, придающее данному вирусу неспособность кодировать НВеАg. Мутация, наиболее обычно встречаемая у таких пациентов, представляет собой одиночную замену основания, от G до А,которая происходит во втором предпоследнем кодоне пре-С-гена в нуклеотиде 1896. Эта замена приводит к замещению триптофанового кодона TTG на стоп-кодон (TAG), который предотвращает трансляцию НВеАg. Пациенты с такими прекоровыми мутантами, которые неспособны выделять НВеАg, склонны к тяжелому заболеванию печени, которое быстро прогрессирует до цирроза и которые сразу не отвечают на противовирусную терапию. Вторая категория HBV-мутантов состоит из просачивающихся мутантов, у которых одиночная аминокислотная замена, глицина на аргинин, происходит в позиции 145 иммунодоминантной детерминанты, обычной для всех субтипов HBsAg. Это изменение в HBsAg имеет результатом крайне важное конформационное изменение, которое приводит к утрате обезвреживающей активности антитела антиНВs. Доступные в настоящее время анализы вирусной резистентности Под определением чувствительности вируса к лекарственному препарату, как правило, подразумевают концентрацию противовирусного агента, при которой ингибируется заданная доля вирусной репликации (например, IC50 для противовирусного агента является концентрацией, при которой ингибируется 50% вирусной репликации). Поэтому снижение чувствительности вируса к лекарственному препарату является критерием, по которому противовирусный препарат селектирует мутантный вирус, который резистентен к этому противовирусному лекарственному препарату. Резистентность вируса к лекарственному препарату определяют, как правило, по снижению чувствительности вируса к лекарственному препарату у данного пациента в течение длительного времени, в клиническом смысле, вирусная лекарственная устойчивость, показанная с помощью противовирусного лекарственного препарата, является менее эффективной или клинически не эффективной для пациента. В настоящее время средства, доступные исследователю и клиницисту, чтобы анализировать противовирусную лекарственную чувствительность и устойчивость, не адекватны. Классический тест для определения устойчивости и чувствительности HIV к противовирусному агенту является сложным, трудоемким, дорогостоящим и опасным в том отношении, что он требует культивирования патогенного вируса из каждого и каждому пациенту (Barre-Sinoussi с соавт. (1983) Science 220, 868-871; Popovic с соавт.(1984) Science 224, 497-500). В данной методике, моноядерные клетки периферической крови (РМВС) вначале культивируют для установления вирусного штамма известной множественности заражения(moi), и тем самым получают вирусный штамм, используемый для заражения мишенной индикаторной клеточной линии. Происходящую вспышку вирусной репликации затем обычно измеряли в присутствии и в отсутствие противовирусного агента путем определения продукции вирусных антигенов в клеточной культуре. Такие тесты можно надежно осуществлять только руками квалифицированных исследователей, и проводить осуществление в течение двух-трех месяцев по цене тысячи долларов на пациента по каждому тестируемому агенту. К тому же, поскольку вирусные штаммы с достаточным moi не могут быть установлены по РМВС некоторых HIV-пациентов, классический тест на HIV-резистентность невозможно осуществить у всех HIV-инфицированных индивидуумов. Намного существенней в ходе получения вирусного штамма при прохождении культивирования вируса могут меняться собственные характеристики вирусов и поэтому могут затмевать истинную природу вируса пациента. Поэтому применение классического теста ограничено сбором информации об отклонениях в клинических опытах и не может быть пригодным для предполагаемого анализа, который можно было бы использовать для проведения индивидуальной противовирусной терапии данному пациенту. Несмотря на эти ограничения, классический тест обладает двумя важными качествами: он является специфичным для оцениваемого агента и он предоставляет информацию о фенотипе вируса, принадлежащего пациенту, т.е. о концентрации лекарственного препарата, которая ингибирует 50% вирусной репликации (IC50). Предпринимались многочисленные попытки усовершенствовать классический тест, но у каждой из них имелись серьезные изъяны. Первый тип этих испытаний можно описать как неспецифический в том плане, что они не определяют характеристик всех вирусов, принадлежащих пациенту, а создают независимую систему измерений течения инфекции. Среди этих испытаний имеются такие, которые определяют численность СD4+-Т-клеток у пациента, критерий развития HIV-заболевания (Goedert с соавт. (1987)JAMA 257, 331-334), такие, которые определяют уровни вирусного антигена (например, антиген кора р 24(Allain с соавт. (1987) N. Engl. J. Med. 317, 1114-1121, и такие, которые определяют уровни вирусных РНК и ДНК (напр., количественная полимеразная цепная реакция и анализ разветвленной ДНК (Piatak с соавт. (1993) Science 259, 1749-1754; Uedea (1993) Clin. Chem. 39, 725-726. Исходный недостаток таких неспецифических тестов заключается в том, что они не предоставляют какой-либо информации о рези-5 005426 стентности вируса к лекарственному препарату per se, а выводят эту информацию из течения болезни данного пациента. Кроме того, многие факторы, иные, чем резистентность вируса к лекарственному препарату, могут влиять на уровень рассматриваемого параметра. Иными словами, во время течения болезни численность СО 4+-Т-клеток, уровни антигена р 24 и уровни РНК вируса HIV могут варьировать по другим причинам, чем лекарственная устойчивость. Другая модификация классического теста амплифицирует вирусный ген, который является мишенью данного противовирусного агента. В данном тесте вирусный ген от пациента амплифицировали, а затем рекомбинировали в биологически активный провирусный клон HIV. Этот провирусный клон трансфицировали в клетки человека для получения вирусного штамма с известной moi, который впоследствии может использоваться для заражения мишенной индикаторной клеточной линии. В способе классического теста, затем определяют продуцирование вирусных антигенов в присутствии или в отсутствие противовирусного агента. В одном из таких анализов, описанном Kellam и Larder (1994) Antimicrobial Agents and Chemo. 38, 23-30, осуществляли PCR-амплификацию кодирующих обратную транскриптазу последовательностей пациента, которые затем интродуцировали в провирусный ДНК-клон путем гомологичной рекомбинации для воссоздания полного вирусного генома, включающего ген обратной транскриптазы, который был делетирован. Получающийся рекомбинантный вирус, произведенный из таких клонов, культивировали затем в линиях Т-клеток, а лекарственную чувствительность тестировали в анализе восстановления бляшки Hela CD4+. Однако этот класс теста все еще требует культивирования вируса, чтобы определить лекарственную устойчивость, и является, таким образом, трудным, длительным и дорогостоящим и нуждается в лабораторном исследователе для ухода за опасными вирусными культурами. К тому же, из-за сопутствующей изменчивости самого вируса в течение процесса культивирования получаемые результаты могут оказаться соответственно неточными. Второй класс попыток тестирования создает специфическую информацию по генотипу HIVпациента с конечной целью скоррелировать эту генотипическую информацию с фенотипом вирусов, резистентных к лекарственному препарату. Действительно, было показано, что специфические аминокислотные замены в вирусных генах, таких как гены обратной транскриптазы и протеазы, корреспондируют со специфическими уровнями вирусной резистентности к ингибиторам, соответственно, обратной транскриптазы и протеазы (Larder с соавт. (1994) J. Gen. Virol. 75, 951-957). Главный недостаток, связанный с таким анализом, заключается в том, что он непрямой и может запутать вторичными мутациями, которые,как было показано, обогащают или скрывают эффекты первичной мутации. Он осложняет взаимодействие всех аминокислотных остатков в рамках данного вирусного полипептида, который строго определяет активность генных продуктов в присутствии или в отсутствие ингибитора. Поэтому понадобилась бы обширная база данных и идеальные пропорции, чтобы интерпретировать статус лекарственной устойчивости или чувствительности данного генотипа, данного числа потенциальных аминокислотных замен в геноме HIV. Третий класс теста, недавно созданный анализ, основанный на бактериях, делает возможным использование молекулярно клонированного вирусного гена (в частности, гена обратной транскриптазы),который инсерцировали в бактериальный вектор экспрессии. При трансформации специальных штаммов Е. coli, которые являются дефицитными по бактериальной ДНК-полимеразе I, клонированный ген обратной транскриптазы может деблокировать рост бактерий в селективных ростовых условиях. В создаваемой Е. coli, зависимой от обратной транскриптазы для своего роста, можно выяснить эффекты некоторых ингибиторов обратной транскриптазы на активность вирусного гена (РСТ заявкаWO 95/22622). Однако главный недостаток этого подхода заключается в том, что ингибитор может быть перемещен через клеточную мембрану и метаболизирован данной бактерией иначе, чем в человеческой клетке,и в итоге в бактерии концентрация истинного метаболического ингибитора обратной транскриптазы может сильно отличаться от таковой в инфицированной человеческой клетке-мишени, или истинный ингибитор может полностью отсутствовать. Действительно, известно, что метаболизм нуклеозидов заметно отличается между человеческими и бактериальными клетками. Другой существенный недостаток этого подхода состоит в том, что данный анализ измеряет активности ДНК-зависимой ДНК-полимеразы обратной транскриптазы, но не РНК-зависимой ДНК-полимеразы, перенос нити или РНК-Н-активности обратной транскриптазы. Поэтому противовирусное соединение, которое действует по крайней мере на часть этих других активностей, не будет проявлять в данном анализе полной ингибиторной активностью. Еще одна трудность, связанная с этим подходом, заключается в том, что он представляет собой тест, основанный на культивировании; поэтому если ингибитор (например, аналог нуклеозида) также блокирует бактериальный рост по причинам иным, чем его действие на обратную транскриптазу, он не может быть адекватно оттестирован в этой системе. Вирусные векторы Вирусные векторы и, в частности, ретровирусные векторы, использовали для модификации животных клеток по причине высокой эффективности, с которой ретровирусные векторы заражают клеткимишени и интегрируются в геном клетки-мишени. Вследствие их способности инсерцироваться в геном клеток млекопитающих значительное внимание обращено на ретровирусные векторы для использования в генной терапии. Детали ретровирусных векторов и их применение можно найти в патентах и патент-6 005426 ных публикациях, в том числе европейская патентная заявка ЕРА 0178220, патент США 4405712, РСТ заявка WO 92/07943, патент США 4980289, патент США 5439809 и РСТ заявка WO 89/11539. Указания на эти патенты и публикации включены здесь путем ссылки. Одним из следствий технологий получения указанного ретровирусного вектора было создание упаковывающих клеточных линий. Главная проблема, связанная с использованием ретровирусов, заключается в возможности вспышки репликации компетентного ретровируса. Поэтому существует необходимость получения хелперных векторов, которые не могли бы процессироваться в вирионах. В итоге были созданы упаковывающие неполные векторы и упаковывающие клеточные линии. Детали недостаточно упаковывающих векторов и упаковывающих клеточных линий можно найти в патентах и патентных публикациях, в том числе патенте США 5124263, европейской патентной заявке пуб.0386882, РСТ заявкеWO 91/19798, РСТ заявкеWO 88/08454, РСТ заявкеWO 93/03143, патенте США 4650764,патенте США 4861719 и патенте США 5278056, раскрытие которых включено здесь путем ссылки. Цель настоящего изобретения состоит в разработке теста на лекарственную чувствительность и устойчивость способного показать, действительно ли вирусная популяция пациента резистентна к данному вышеуказанному лекарственному средству. Следующая цель настоящего изобретения заключается в разработке теста, который поможет терапевту заменить один или несколько лекарственных препаратов в терапевтическом режиме пациента, который приобрел резистентность к данному лекарственному препарату или лекарственным препаратам после предварительного курса лечения. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в создании теста, который поможет отобрать эффективный режим лекарственного препарата для лечения вирусных инфекций. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в создании безопасного, стандартизованного, приемлемого, быстрого, точного, и воспроизводимого анализа лекарственной чувствительности и резистентности для клинического и исследовательского применения. Следующая цель настоящего изобретения заключается в создании теста и методов оценки биологической эффективности, кандидатов на лекарственные соединения, которые действуют на специфические вирусные гены и/или вирусные белки, в частности те, которые относятся к вирусной лекарственной устойчивости и перекрестной резистентности. Цель настоящего изобретения заключается также в создании средств и композиций оценки вирусной лекарственной устойчивости и чувствительности. Это и другие цели настоящего изобретения станут очевидными из полного настоящего описания. Сущность изобретения Первым аспектом настоящего изобретения является способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикаторный ген, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;(б) измерение уровня экспрессии указанного индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах и(в) сравнение уровня экспрессии указанного индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному препарату. В конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как описано выше, но в отсутствие противовирусного препарата. В другом конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии индикаторного гена представляет собой уровень экспрессии,который определяют, как описано выше, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного соединения. Вторым аспектом изобретения является вектор для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, используемый для осуществления способа, представляющего первый аспект изобретения. Указанный вектор содержит фрагмент вируса и индикаторный ген, и не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса. Вектор для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату,включающий фрагмент(ы) вируса, полученный(е) от пациента (например, HIV, HBV и т.п.), и индикаторный ген, может дополнительно включать один или несколько участков ДНК, полученных не от пациента. В одном из воплощений настоящего изобретения вектор для определения чувствительности конструируют из геномного вирусного вектора, который может включать делецию по одному или нескольким генам. Например, для случая ВИЧ, ген env делетирован в векторе, который в противном случае сохраняет экспрессию мРНК и характеристики процессинга полного вируса. Альтернативно, вектор конструируют из субгеномного вирусного вектора, который может включать всего один или несколько вирусных генов, которые обычно являются мишенью противовирусного лекарственного средства. Например, для случая с HBV один или несколько генов HBV, кодирующих определенные структурные и ферментатив-7 005426 ные функции, необходимые для репликации ДНК HBV и образования вирусных частиц (т.е. гены С, S иX), могут быть делетированы в векторе, который в противном случае сохраняет экспрессию мРНК и характеристики процессинга полного вируса. Кроме того, вектор включает либо природный энхансер/промотор из конкретного вируса, либо чужеродный энхансер/промотор для экспрессии геновмишеней противовирусных препаратов. Экспрессия индикаторного гена в составе вектора для определения чувствительности вируса в клетке-мишени зависит в конечном итоге от функционирования последовательностей фрагмента, полученного от пациента. Индикаторный ген может быть функциональным или нефункциональным. В случае нефункционального индикаторного гена индикаторный ген недостаточно экспрессируется в клеткехозяине, трансфицированной вектором, до тех пор, пока он не превратится в функциональный индикаторный ген в результате действия одного или нескольких продуктов фрагмента, полученного от пациента. В одном из воплощений настоящего изобретения индикаторный ген является нефункциональным за счет использования пермутированного промотора, т.е. промотора, который, хотя и находится в той же транскрипционной ориентации, что и индикаторный ген, но следует за ним вместо того, чтобы предшествовать кодирующей последовательности индикаторного гена. Кроме того, ориентация нефункционального индикаторного гена противоположна той, которую имеют вирусные промоторы или LTR. Поэтому кодирующая последовательность такого нефункционального индикаторного гена не транскрибируется ни под пермутированным промотором, ни под вирусными промоторами. В случае ВИЧ индикаторный ген претерпевает перестановку в результате обратной транскрипции, так что пермутированный промотор теперь предшествует последовательности индикаторного гена, который, в результате, может функционально экспрессироваться. В случае HBV, индикаторный ген претерпевает перестановку в результате циркуляризации генома в ходе репликации HBV. Во втором воплощении настоящего изобретения индикаторный ген приводится в нефункциональное состояние за счет использования пермутированной кодирующей области, т.е. кодирующей области индикаторного гена, в которой 5'-часть данной кодирующей области следует за, а не предшествует 3'-части данной кодирующей области. В такой конфигурации не экспрессируется никакой мРНК, которая приводила бы к появлению функционального продукта индикаторного гена. В случае ВИЧ индикаторный ген претерпевает перестройку в результате обратной транскрипции, так что 5'-кодирующая область индикаторного гена теперь предшествует 3'-кодирующей области, и, в результате, индикаторный ген может быть функционально экспрессирован. В случае HBV индикаторный ген претерпевает перестройку в результате циркуляризации генома в ходе репликацииHBV. В третьем воплощении настоящего изобретения индикаторный ген делают нефункциональным путем использования инвертированного интрона, т.е. интрон инсертируют в кодирующую последовательность индикаторного гена в транскрипционной ориентации, противоположной ориентации данного индикаторного гена. Кроме того, индикаторный ген сам по себе содержит функциональный промотор с полной транскрипционной единицей, ориентированный противоположно вирусным промоторам. Таким образом, нефункциональный индикаторный ген находится в неверной ориентации, чтобы транскрибироваться под вирусными LTR в случае ВИЧ или энхансером-промотором HBV, и он не может функционально транскрибироваться под своим собственным промотором, поскольку инвертированный интрон не может быть должным образом вырезан при сплайсинге. Однако в случае ретровирусов и гепаднавирусов,особенно ВИЧ и HBV, транскрипция под вирусными промоторами приводит к образованию мРНК, в которой при сплайсинге может происходить удаление инвертированного интрона. У ретровирусов в результате обратной транскрипции образующегося прошедшего сплайсинг транскрипта и интеграции получающегося провируса в хромосому клетки-хозяина индикаторный ген может функционально транскрибироваться под своим собственным промотором. У HBV в результате обратной транскрипции образующегося прошедшего сплайсинг транскрипта и циркуляризации геномной ДНК в клетке-хозяине индикаторный ген может функционально транскрибироваться под своим собственным промотором. Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающие нефункциональный индикаторный ген, могут использоваться для проведения тестов на лекарственную чувствительность в анализах, как основанных на (вирусных) частицах, так и не основанных на частицах. Анализ, основанный на частицах, базируется на вирусных частицах вектора для определения чувствительности, которые являются дефектными по репликации, будучи полученными с помощью клеток-хозяев для вектора для определения чувствительности. Транс-действующие факторы, необходимые для формирования вирусных частиц вектора для определения чувствительности, обеспечиваются упаковывающими экспрессионными векторами, которыми трансфицируют упаковывающие клеткихозяева. Напротив, тест на чувствительность, основанный не на частицах, осуществляют путем трансфекции одних-единственных клеток-хозяев вектором для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату в отсутствие упаковывающих экспрессионных векторов. В случае функционального индикаторного гена функциональный индикаторный ген эффективно экспрессируется в первых клетках-хозяевах, трансфицированных вектором для определения чувствительности (обозначаемых здесь как клетки-хозяева вектора для определения чувствительности). Таким образом, функция индикаторного гена в клетке-хозяине вектора для определения чувствительности не зависит от фрагмента, полученного от пациента. Однако способность индикаторного гена к экспрессии-8 005426 во второй клетке-хозяине (обозначаемой здесь как клетка-хозяин-мишень) зависит от образования функциональных вирусных частиц вектора для определения чувствительности в клетке-хозяине вектора. Таким образом, активность индикаторного гена в клетках-хозяевах-мишенях зависит от активности фрагментов, полученных от пациента. Третьим аспектом изобретения является упаковывающая клетка-хозяин, содержащая вектор для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, представляющий второй аспект изобретения, и служащая для упаковки ДНК вектора с образованием вирусных частиц вектора для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату. Четвертым, особым аспектом настоящего изобретения является способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и нефункциональный индикаторный ген, причем экспрессия указанного нефункционального индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;(б) измерение уровня экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах и(в) сравнение уровня экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена,причем разница между уровнем экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному препарату. В конкретном воплощении способа, представляющего четвертый аспект изобретения, контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как описано выше, но в отсутствие противовирусного препарата. В другом конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии индикаторного гена представляет собой стандартный уровень экспрессии, который определяют, как описано выше, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного соединения. Конкретным воплощением способов определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, представляющих первый и четвертый аспекты настоящего изобретения, является определение чувствительности вируса иммунодефицита человека к лекарственному препарату против ВИЧ. Другим конкретным воплощением указанных способов является определение чувствительности вируса гепатита Б человека к лекарственному препарату против HBV. Пятым аспектом изобретения является способ определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий(а) определение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату способом, представляющим первый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента; и(б) сравнение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, определенной на стадии (а), со стандартной кривой чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, причем уменьшение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату относительно указанной стандартной кривой свидетельствует о том, что указанный вирус устойчив к указанному противовирусному лекарственному препарату, и величина указанного уменьшения чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату показывает, в какой степени указанный вирус устойчив к противовирусному лекарственному препарату. Шестым аспектом изобретения является способ определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий(а) определение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату способом, представляющим четвертый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента; и(б) сравнение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, определенной на стадии (а), со стандартной кривой чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, причем уменьшение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату относительно указанной стандартной кривой свидетельствует о том, что указанный вирус устойчив к указанному противовирусному лекарственному препарату, и величина указанного уменьшения чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату показывает, в какой степени указанный вирус устойчив к противовирусному лекарственному препарату.-9 005426 Конкретным воплощением способов определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента,к противовирусному лекарственному препарату, представляющих пятый и шестой аспекты настоящего изобретения, является определение устойчивости вируса иммунодефицита человека в пациенте к лекарственному препарату против ВИЧ. Другим конкретным воплощением указанных способов является определение устойчивости вируса гепатита Б человека к лекарственному препарату против HBV. Седьмым аспектом изобретения является способ определения прогрессирования или развития устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий(а) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в первый момент времени способом, представляющим первый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента;(б) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному препарату во второй, более поздний момент времени способом, представляющим первый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента в этот более поздний момент времени;(в) сравнение эффективности противовирусного лекарственного препарата, оцененной на стадиях(а) и (б), причем уменьшение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в более поздний момент времени по сравнению с более ранним свидетельствует о развитии или прогрессировании устойчивости вируса, инфицирующего указанного пациента, к противовирусному лекарственному препарату. Восьмым аспектом изобретения является способ определения прогрессирования или развития устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий(а) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в первый момент времени способом, представляющим четвертый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента;(б) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному препарату во второй, более поздний момент времени способом, представляющим четвертый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента в этот более поздний момент времени;(в) сравнение эффективности противовирусного лекарственного препарата, оцененной на стадиях(а) и (б), причем уменьшение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в более поздний момент времени по сравнению с более ранним свидетельствует о развитии или прогрессировании устойчивости вируса, инфицирующего указанного пациента, к противовирусному лекарственному препарату. Девятым аспектом данного изобретения является способ определения биологической эффективности потенциального противовирусного соединения, включающий(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного потенциального противовирусного соединения, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, включающий фрагмент вируса и индикаторный ген, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;(б) измерение уровня экспрессии указанного индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах и(в) сравнение указанного уровня экспрессии указанного индикаторного гена, измеренного на стадии(б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, измеренным на стадии (в), и уровнем экспрессии, измеренным на стадии (б), коррелирует с эффективностью указанного потенциального противовирусного соединения, определяя тем самым эффективность потенциального противовирусного соединения. В конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как описано выше, но в отсутствие потенциального противовирусного соединения. В другом конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии индикаторного гена представляет собой стандартный уровень экспрессии, который определяют, как описано выше, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного соединения. Десятым аспектом настоящего изобретения является способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикатор, причем экспрессия указанного индикатора зависит от активности гена,кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;(б) измерение уровня экспрессии указанного индикатора в указанных клетках-хозяевах и(в) сравнение уровня экспрессии указанного индикатора, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикатора, причем разница между указанным уровнем экспрессии ин-10 005426 дикатора, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату. В конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии указанного индикатора определяют,как описано выше, но в отсутствие противовирусного препарата. Согласно десятому аспекту изобретения индикатор может быть представлен как ДНК-структурой,так и РНК-структурой. Конкретными воплощениями способа определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату согласно аспекту 10 предусмотрено определение чувствительности вируса иммунодефицита человека к препарату против ВИЧ и вируса гепатита Б человека к препарату противHBV, соответственно. Наконец, последним одиннадцатым аспектом изобретения является способ определения биологической эффективности потенциального противовирусного соединения, включающий(а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного потенциального противовирусного соединения, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикатор, причем экспрессия указанного индикатора зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;(б) измерение уровня экспрессии указанного индикатора в указанных клетках-хозяевах и(в) сравнение указанного уровня экспрессии указанного индикатора, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикатора, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикатора, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с эффективностью указанного потенциального противовирусного соединения, определяя тем самым эффективность потенциального противовирусного соединения. В конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии указанного индикатора определяют,как описано выше, но в отсутствие противовирусного соединению. Согласно одиннадцатому аспекту изобретения индикатор может быть представлен как ДНКструктурой, так и РНК-структурой. В конкретных воплощениях изобретение направлено на обеспечение способов анализа лекарственной чувствительности/устойчивости ВИЧ к противовирусным препаратам. Указаны конкретные векторы для определения чувствительности настоящего изобретения для использования в тесте на лекарственную чувствительность/устойчивость ВИЧ к противовирусному препарату, а также клетки-хозяева вектора для определения чувствительности. Следующее воплощение настоящего изобретения направлено на способы анализа лекарственной чувствительности/устойчивости HBV к противовирусным препаратам. Аналогично, для случая HBV указаны конкретные векторы для определения чувствительности настоящего изобретения для использования в тесте на лекарственную чувствительность/устойчивость HBV к противовирусному препарату (также упоминаемые в данном описании как системы векторов для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату), а также клетки-хозяева вектора для определения чувствительности. Способы анализа настоящего изобретения помогают терапевту оценить, действительно ли вирусный ген, кодирующий вирусный белок или функциональную вирусную последовательность, и который может быть мишенью противовирусного агента, мутирует, делая лекарственный препарат менее эффективным. В частности, новые способы анализа настоящего изобретения позволяют определить, действительно ли вирус становится резистентным к конкретному противовирусному лекарственному препарату. К тому же, настоящее изобретение помогает терапевту оценить лекарственную чувствительность и устойчивость в комбинированной терапии. Кроме того, способы анализа настоящего изобретения помогают внести отдельные изменения в предполагаемый терапевтический режим путем тестирования конкретного лекарственного препарата (или лекарственных препаратов) или сочетания лекарственных препаратов и определить, действительно ли эти лекарственные препараты, в отдельности или в сочетании,подавляют один или несколько вирусных генов и/или вирусных белков. Настоящее изобретение обеспечивает существенные преимущества в сравнении с ныне доступными способами анализа благодаря созданию более безопасного, более приемлемого, более воспроизводимого,более быстрого и более эффективного способа анализа лекарственной чувствительности и устойчивости вируса для проверки терапевтической эффективности конкретного противовирусного лекарственного(ых) препарата(ов) или сочетаний лекарственных препаратов, помогающего терапевту в оптимизации лечения. Способы анализа настоящего изобретения обладают существенным преимуществом, давая возможность оценить устойчивость и чувствительность вируса на всех стадиях создания лекарственного препарата 1) в ходе предварительной клинической оценки потенциальных противовирусных соединений; 2) в ходе клинической оценки новых лекарственных препаратов; 3) в ходе лечения пациента, получая возможность создать терапевтический режим для преодоления проблемы лекарственной устойчивости; и-11 005426 4) как часть эпидемиологического обследования при оценке распространенности лекарственной устойчивости вирусов в ходе использования утвержденных и экспериментальных лекарственных препаратов. Краткое описание чертежей Фиг. 1. А. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК HIV-1. В каждой из трех открытых рамок считывания находятся вирусные белки, кодируемые генами gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env и nef. РНК транскрибируется с вирусной ДНК и процессируется вирусными и клеточными ферментами, приводя к появлению и геномной вирусной РНК и мРНК. Показаны элементы вирусного длинного концевого повтора (LTR) - U3, R и U5. В. Обобщенное диаграммное изображение вирусного геномного вектора HIV, который содержит следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область U3 HIV-LTR, 2) область R HIV-LTR, 3) область U5HIV-LTR, 4) кодирующие области генов HIV gag-pol, vif, vrp, tat, rev, vpu, делетированного env, и nef, и 5) 3' HIV-LTR. С. Обобщенное диаграммное изображение вирусного геномного вектора HIV, который содержит следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) энхансер-промотор IE CMV, 2) область R HIV-LTR, 3) область U5 HIV-LTR, 4) кодирующие области генов HIV gag-pol, vif, vrp, tat, rev, vpu, делетированного env,и nef, и 5) 3' HIV-LTR.D. Обобщенное диаграммное изображение вирусного субгеномного вектора HIV, который содержит следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область U3 HIV-LTR, 2) область R HIV-LTR, 3) область U5 HIV-LTR, 4) кодирующие области гена gag-pol HIV, и 5) 3' HIV-LTR. Е. Обобщенное диаграммное изображение вирусного субгеномного вектора HIV, который содержит следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) энхансер-промотор IE CMV, 2) область R HIV-LTR, 3) область U5 HIV-LTR, 4) кодирующие области гена gag-pol HIV, и 5) 3' HIV-LTR. Фиг. 2. А. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК HIV-1. В. Диаграммное изображение резистентного тест-вектора, включающего нефункциональный индикаторный ген, включающий пермутированный промотор, обладающего следующими элементами в направлении 5' к 3': 1) область U3 HIV-LTR (pLG-lucPP-HS и pLG-lucPP-PB) или энхансер-промотор IECMV (pCG-lucPP-HS и pCG-lucPP-PB), 2) область R HIV-LTR, 3) область U5 HIV-LTR, содержащую инсерцированный промотор РНК-полимеразы фага Т 7 (указанный здесь в качестве промотора Т 7) с направлением транскрипции, противоположной направлению LTR, 4) кодирующие области генов gag-pol,vif, vpr, tat, rev, vpu делегированного env и nef, 5) сегмент(ы), получаемые от пациента, инсерцированные в сайты акцепторной последовательности пациента, 6) кассету индикаторного гена, инсерцированную в делегированный ген env, и 7) 3' HIV-LTR. С. Диаграммное изображение, показывающее преобразование не функционального индикаторного гена (пермутированный промотор) в резистентном тест-векторе, описанном в 2(А), в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскриптазы. Преобразование в функциональный индикаторный ген происходит из-за репозиции промотора Т 7 относительно кодирующей области индикаторного гена. Фиг. 3. А. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК HIV-1. В. Диаграммное изображение упаковывающего экспрессионного вектора pLTR-HIV3', который представляет гены vif, vpr, tat, rev, vpu и nef, каждый из которых экспрессируется в виде сплайсируемой субгеномной мРНК, транскрибируемой из области U3 HIV LTR. С. Диаграммное изображение упаковывающего экспрессионного вектора pCMV-HIV3', который представляет гены vif, vpr, tat, rev, vpu и nef, каждый из которых экспрессируется в виде сплайсируемой субгеномной мРНК, транскрибируемой из энхансер-промотора IE CMV.D. Диаграммное изображение упаковывающего экспрессионного вектора pVL-env4070A[pCXAS(4070A env)], который представляет продукт амфотропного гена MLV env, с помощью транскрипции из энхансер-промотора CMV IE. Фиг. 4. А. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК HIV-1. В. Обобщенное диаграммное изображение резистентных тест-векторов, включающих нефункциональный индикаторный ген, включающий пермутированную кодирующую область, содержащую следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область U3 HIV-LTR (pLG-lucPC-HS и pLG-lucPC-PB) или первый энхансер-промотор (pCG-lucPC-HS и pCG-lucPC-PB), 2) область R и U5 HIV-LTR, 3) гены кодирующих областей HIV qaq-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, делегируемый env, и nef, 4) сегмент(ы), получаемый(е) от пациента, инсерцированный в сайты акцепторной последовательности пациента, 5) кассету первого индикаторного гена, содержащую 5'-кодирующую область гена люциферазы, инсерцированную в делегируемый ген env, 6) кассету второго индикаторного гена, содержащую 3'-кодирующую область гена люциферазы, инсерцированную в делегируемую 3'-область U3 HIV-LTR, и 7) 3'-область R и U5-12 005426 С. Диаграммное изображение, показывающее преобразование не функционального индикаторного гена (пермутируемая кодирующая область) в резистентном тест-векторе, описанного в 4(A), в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскриптазы. После обратной транскрипции и переноса цепи, 3'-кодирующую область люциферазы копировали из 3'-LTR в 5'-LTR, давая возможность транскрипционной мРНК, которая может быть сплайсирована, образовать функциональную кодирующую область люциферазы. Фиг. 5. А. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК HIV-1. В. Обобщенное диаграммное изображение резистентных тест-векторов, включающих нефункциональный индикаторный ген, включающий инвертированный интрон, содержащих следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область U3 HIV-LTR (pLG-lucII-HS и pLG-lucII-PB) или первый энхансерпромотор (pCG-lucII-HS и pCG-lucII-PB), 2) области R и U5 HIV-LTR, 3) гены кодирующих областейHIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, делегируемый env и nef, 4) сегмент(ы), получаемый(е) от пациента, инсерцированные в сайт акцепторные последовательности пациента, 5) кассету индикаторного гена, инсерцированную в делегируемый ген env, и 5) 3' HIV-LTR. С. Диаграммное изображение, показывающее преобразование не функционального индикаторного гена (инвертированный интрон) в резистентный тест-вектор, описываемый в 5(А), в функциональный идикаторный ген с помощью обратной транскриптазы. Общее направление транскрипции кассеты индикаторного гена противоположно направлению первого энхансер-промотора CMV и вирусных LTR, а направление искусственного интрона остается тем же, что и у последних элементов. Транскрипция индикаторного гена под вторым энхансер-промотором CMV не приводит к образованию функциональных транскриптов, так как инвертированный интрон не может быть сплайсирован в этом направлении. Транскрипция индикаторного гена под вирусным 5'-LTR или первым энхансерпромотором IE CMV, тем не менее, приводит к удалению инвертированного интрона путем сплайсинга РНК, хотя индикаторный ген, еще не экспрессируется функционально, поскольку результирующий транскрипт обладает антисмысловой ориентацией. После обратной транскрипции этого транскрипта и интеграции полученной провирусной ДНК, индикаторный ген может быть функционально транскрибирован под вторым энхансер-промотором CMV, поскольку инвертированный интрон был удален заранее. Фиг. 6. А. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК HIV-1 показано выше (А) и (B). В. Обобщенное диаграммное изображение резистентных тест-векторов, включающих функциональный индикаторный ген, обладающий следующими элементами в направлении 5' к 3': 1) область U3HIV-LTR (pLG-luc-HS-1 и pLG-luc-PB-1) или первый энхансер-промотор IE CMV (pCG-luc-HS-1 и pCGluc-PB-1), 2) области R и U5 HIV-LTR, 3) кодирующую область генов HIV gag-pol, vif, vpr, tat, rev, vpu,делегируемого env, и nef, 4) кассету функционального индикаторного гена, инсерцированную в делегируемый ген env, с направлением транскрипции, противоположной вирусным LTR и 5) 3' HIV-LTR. С. Обобщенное диаграммное изображение резистентных тест-векторов, включающих кассету функционального индикаторного гена (pLG-luc-HS-2, pLG-luc-PB-2, pCG-luc-HS-2 и pCG-luc-PB-2), в которых направление транскрипции кассеты индикаторного гена является тем же, что и у вирусных LTR. Фиг. 7. А. Демонстрация лекарственной чувствительности с использованием резистентных тест-векторов,pCG-CXCN (F-lucP) 2-AA и pCG-CXAT(F-lucP)2-AA. Данные представлены в виде активности гена люциферазы в хозяйских клетках-мишенях в виде Относительных Световых Единиц (RLU) в отсутствиеAZT или в присутствии 5 мМ AZT. В. Лекарственная чувствительность и тест на резистентность, осуществляемый с помощью резистентного тест-вектора, pCG-CXCN(F-lucP)2-AA, содержащего преобработанные AZT и постобработанные AZT "тест"-сегменты, произведенные пациентом. Резистентные тест-векторы, получали из вирусного вектора геномного индикаторного гена, pCG-CXCN(F-lucP)2-АА. Данные представлены в виде процентного ингибирования активности гена люциферазы в хозяйских клетках-мишенях vs. концентрации AZT (1 оg10). pCG-CXCN(F-lucP)2-AA представляет собой кривую в виде зачерненных квадратов.pCG-CXCN(F-lucP)2-AA, содержащий сегменты, произведенные пациентом, перед обработкой AZT представляет собой кривую в виде зачерненных кружков, а после обработки AZT - в виде зачерненных треугольников. С. Лекарственная чувствительность и тест на резистентность, осуществляемый с помощью резистентного тест-вектора, pCG-CXCN(F-lucP)2-AA, содержащий сегмент обратной транскриптазы, полученный из биологически активного провирусного гена, pNL4-3. Данные представлены в виде процентного ингибирования активности гена люциферазы в хозяйских клетках-мишенях vs. концентрации невирапина (1 оg10) и представляют собой кривую в виде зачерненных квадратов.D. Лекарственная чувствительность и тест на резистентность, осуществляемый с помощью резистентного тест-вектора, pCG-CXCN(F-lucP)2-AA, содержащего протеазный сегмент, полученный из биологически активного провирусного клона, pNL4-3. Данные представлены в виде процентного ингибиро-13 005426 вания активности гена люциферазы в хозяйских клетках-мишенях vs. концентрации индинавира (log10) и представляют собой кривую в виде зачерненных квадратов. Фиг. 8. А. Диаграммное изображение структуры прегеномной РНК HBV. Прегеномная РНК показана в виде жирной линии. Последовательности прямого повтора показаны в виде замкнутых треугольников. Показаны позиции капсидированной сигнальной последовательности ). Гены С, Р, S и Х показаны в виде незакрашенных прямоугольников. Указаны концевой белок (TR), спейсер, ДНК-полимераза/обратная транскриптаза (pol/RT), и области Н РНК гена Р. Сайты С, Р, S и Х инициации трансляции отмечены заштрихованными треугольниками. В. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного вектора,pCG-HBV(NF-IG)II-(PSAS-), компонента резистентной тест-векторной системы, включающего кассету индикаторного гена и инвертированный интрон, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE CMV, 2) 5'-область генома HBV и DR1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован), 3) кассету не функционального индикаторного гена, в котором индикаторный ген ORF содержит инвертированный интрон, 4) область генома HBV, содержащая DR2, DR1,3' и 3'-область сигнала полиаденилирования (рА) HBV. С. Диаграммное изображение ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК), образованной из субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, pCS-HBV(F-IG)II(PSAS-), содержащей кассету индикаторного гена, собранную в результате репликации HBV-вируса.D. Диаграммное изображение, как один из примеров, упаковывающего вектора, рРК-СРХ, компонента резистентной тест-векторной системы, включающего сегмент, произведенный пациентом, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE CMV, 2) область генома HBV, простирающуюся от С-кодона инициации трансляции ORF до 3'-РА-сигнала, и включающую гены С, Р, S и X. Ген С упаковывающего вектора, рРК-СРХ, модифицировали так, чтобы он не содержал последовательности пре-С ORF и не экспрессировал S-белки (как показано в Х на сайтах инициации трансляции). Е. Диаграммное изображение дополнительного упаковывающего вектора, рРК-S, создающего белкиS-гена, который котрансфицировали с тест-векторной системой на резистентность, включающего индикаторный ген вирусного вектора, pCS-HBV(NF-IG)II-(PSAS-), и упаковывающую плазмиду, рРК-СРХ.F. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, pCS-HBV(NF-IG)II-(PSAS+),включающего не функциональный индикаторный ген с инвертированным интроном, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE CMV, 2) 5'-область геномаHBV и DR1 и 5" (кодом инициации трансляции пре-С ORF элиминирован), 3) кассету индикаторного гена (содержащую инвертированный интрон) в пределах области HBV-генома, которая содержит сегмент гена Р, производимого пациентом, 4) область HBV-генома, содержащая DR2, DR1, 3', и область РАсигнала HBV.G. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК), образованной из резистентного тест-вектора, pCS-HBV(F-IG)II-(PSAS+), содержащего кассету функционального индикаторного гена и сегмент, производимого пациентом гена Р, собранного в результате вирусной репликацииHBV. Н. Диаграммное изображение упаковывающего вектора, рРК-CSX, представляющего белки гена С,S и X, который котрансфицировали с резистентным тест-вектором, pCS-HBV(NF-IG)II-(PSAS+). Фиг. 9. А. Диаграммное изображение структуры прегеномной РНК HBV. В. Диаграммное изображение индикаторного гена вирусного вектора HBV, содержащего кассету не функционального индикаторного гена. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация прямого праймера (Pf) и обратного праймера(Рr), связывающего сайты, не определяет функциональную единицу амплификации в линеаризованной форме вектора, который используется для трансфекции упаковывающих хозяйских клеток. Обратный праймер Рr, связывающий сайты, создавали для перекрытия соединения последовательности, которое образовано при сплайсинге прегеномной РНК. С. Диаграммное изображение rc-ДНК-формы индикаторного гена вирусного вектора, описанного в 10 В. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация Pf и Рr праймеров, связывающих сайты, определяет функциональную единицу амплификации для плюс-цепи ДНК-компонента rс-ДНК-формы, а плюс- и минус-цепочечные ДНК компоненты - из сскДНК-формы вектора, который получали путем репликации ДНК HBV, находящейся внутри вирусных частиц, получаемых в упаковывающих хозяйских клетках. Данный Рr-связывающий сайт собирали путем сплайсинга прегеномной РНК.D. Диаграммное изображение индикаторного гена вирусного HBV-вектора, содержащего кассету нефункционального индикаторного гена. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация Pf и Рr праймеров, связывающих сайты оп-14 005426 ределяет функциональную единицу амплификации в линеаризованной форме вектора, который используется для трансфекции упаковывающих хозяйских клеток, но Pf связывающий сайт не примыкает к связывающему сайту экзонуклеазной детекционной пробы (зонд) в несплайсируемой линеаризованной форме вектора. Данное выстраивание Pf, Рr и зонда, связывающих сайты, не представляет эффективную экзонуклеазную детекционную единицу. Е. Диаграммное изображение rс-ДНК, образующей индикаторный ген вирусного вектора, описанного на фиг. 9D. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНКмишени. Локализация и ориентация Pf и Рr праймера, связывающих сайты, определяет функциональную единицу амплификации в rс-ДНК и сскДНК формах вектора, который получали путем репликации ДНКHBV в упаковывающих хозяйских клетках. Локализация Pf связывающего сайта прямо примыкает к связывающему сайту экзонуклеазной детекционной пробы (зонд) в rс-ДНК и сскДНК формах вектора. Данное выстраивание PF, PR и пробы, связывающих сайты, представляет эффективную экзонуклеазную детекционную единицу.F. Диаграммное изображение HBV-индикаторного гена вирусного вектора. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация прямого праймера (Pf) и обратного праймера (Рr), связывающих сайты, не определяет функциональную единицу амплификации в линеаризованной форме вектора, который используется для трансфекции упаковывающих хозяйских клеток.G. Диаграммное изображение rc-ДНК-формы индикаторного гена вирусного вектора, описанного в 10F. Показан праймер, связывающий сайт для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация Pf и Рr, связывающих сайты, определяет функциональную единицу амплификации в плюс-цепи ДНК-компонента rс-ДНК-формы и в плюс- и минус-цепи ДНК-компонентов сскДНК-формы вектора, который получали путем репликации ДНК HBV внутри вирусных частиц, получаемых в упаковывающих хозяйских клетках. Фиг. 10. А. Диаграммное изображение структуры прегеномной ДНК HBV. В. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного вектора,pCS-HBV(NF-IG)PP-(PSAS-), компонента резистентной тест-векторной системы, включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, содержащего следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE CMV, 2) 5'-область генома HBV и DR1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован), 3) кассету нефункционального индикаторного гена,собранную так, чтобы промоторная область находилась 3', то есть ниже индикаторного гена ORF, 4) 3'область генома HBV, содержащую DR2, DR1, 3', и 3'-область сигнала рА HBV (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован). Упаковывающий вектор, рРК-СРХ, компонент резистентной тест-векторной системы, включающий сегмент гена Р, производимого пациентом, показан на фиг. 8D, аS-упаковывающий вектор, pPK-S, показан на фиг. 8 Е. С. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК), образованной из субгеномного индикаторного гена pCS-HBV (F-IG)PP(PSAS-), содержащей кассету функционального индикаторного гена, собранную в результате вирусной репликации HBV.D. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, pCS-HBV (NF-IG) PP(PSAS+), включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE CMV, 2) 5'-областьHBV генома DR1 и 5'-копия (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован), 3) энхансерпромоторную область (пермутированный промотор), 4) ген Р, содержащий сегмент, производимый пациентом, 5) ORF индикаторного гена, 6) участок внутреннего входа рибосом (IRES), 7) 3'-область геномаORF элиминирован). Упаковывающий вектор, pPK-CSX, предоставляющий гены C, S и X, котрансфицировали с резистентным тест-вектором, pCS-HBV(NF-IG)PP(PSAS+) и показали на фиг. 8 Н. Е. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК) формы из резистентного тест-вектоpa, pCS-HBV(F-IG)PP(PSAS+), содержащей кассету функционального индикаторного гена и сегмент гена Р, получаемого от пациента, собранную в результате вирусной репликации HBV. Фиг. 11. А. Диаграммное изображение структуры прегеномной РНК HBV. В. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного вектора,pCS-HBV(NF-IG)PPTIS-(PSAS-), компонента резистентной тест-векторной системы, включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором и сайт инициации трансляции, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE-CMV, 2) 5'область HBV генома, включающую DR1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован),3) индикаторный ген ORF, не имеющий сайта инициации трансляции, 4) область энхансер-промотора(пермутированный промотор), 5) 3'-область HBV-генома, содержащей DR2, кодон инициации трансляции пре-С ORF, DR1, 3', и 3'-область сигнала рА HBV. Упаковывающий вектор, рРК-СРХ, компонент-15 005426 резистентной тест-векторной системы, включающий сегмент, производимый пациентом, показан на фиг. 8D, а S-упаковывающий вектору pPK-Sy показан на фиг. 8 Е. С. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой (сскДНК), ДНК-формы субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, pCS-HBV(F-IG)PPTIS(PSAS-), содержащей функциональную кассету индикаторного гена, собранную в результате вирусной репликации HBV.D. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS+), включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором,содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE CMV, 2) 5'область HBV генома, включающую DR1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован),3) индикаторный ген ORF, не имеющий сайта инициации трансляции, 4) ген Р, содержащий сегмент,производимый пациентом, 5) область энхансер-промотора (пермутированный промотор), 6) 3'-областьHBV-генома, содержащую DR2, кодон инициации трансляции пре-С ORF, DR1, 3', и 3'-область сигнала рА HBV. Упаковывающий вектор, pPK-CSX, создающий гены С, S и X, котрансфицировали с резистентным тест-вектором, pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS+), и показали на фиг. 8 Н. Е. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой (сскДНК), ДНК-формы из резистентного тест-вектора, pCS-HBV(F-IG)PPTIS(PSAS+), содержащей кассету функционального индикаторного гена и сегмент гена Р, производимого пациентом, собранной в результате вирусной репликацииHBV. Фиг. 12. А. Диаграммное изображение структуры прегеномной РНК структуры HBV. В. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного вектора,pCS-HBV(NF-IG)PCR-(PSAS-), компонента резистентной тест-векторной системы, включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированной кодирующей областью, содержащей следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE-CMV, 2) 5'-область HBV генома,включающую DR1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован), 3) кассету нефункционального индикаторного гена, собранную так, чтобы промоторная область и 5'-часть кодирующей области располагались 3', т.е. ниже остальной 3'-части кодирующей области, 4) 3'-область HBV-генома, содержащую DR2, DR1, 3' и 3'-область сигнала рА HBV (кодон инициации трансляции элиминирован). Упаковывающий вектор, рРК-СРХ, компонент резистентной тест-векторной системы, включающий сегмент, производимый пациентом, показан на фиг. 8D, a S-упаковывающий вектор, pPK-S, показан на фиг. 8 Е. С. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК) формы из субгеномного индикаторного гена вирусного вектора pCS-HBV(F-IG)PCR(PSAS-), содержащая кассету функционального индикаторного гена, собранную в результате вирусной репликации HBV.D. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, pCS-HBV(NF-IG)PCR(PSAS+), включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированной кодирующей областью, содержащую следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IECMV, 2) 5'-область HBV генома, включающую DR1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован), 3) 3'-часть ORF индикаторного гена, начинающегося со сплайсированной акцепторной последовательности в обратной ориентации, 4) ген Р, содержащий сегмент, производимый пациентом, 5) область энхансер-промотора, 6) 5'-часть ORF индикаторного гена, заканчивающегося в сплайсированной донорной последовательности в обратной ориентации, 7) 3'-область HBV-генома, содержащую DR2,DR1, 3' и 3'-область сигнала рА HBV (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован). Упаковывающий вектор, pPK-CSX, предоставляющий гены С, S и X, котрансфицировали с резистентным тествектором, pCS-HBV(NF-IG)PPTIS(PSAS+), и показали на фиг. 8 Н. Е. Диаграммное изображение ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК), образованной из резистентного тест-вектора, pCS-HBV(F-IG)PCR(PSAS+), содержащей кассету функционального индикаторного гена и сегмент гена Р, производимого пациентом, собранной в результате вирусной репликацииHBV. Фиг. 13. А. Диаграммное изображение структуры прегеномной PHK-HBV. В. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного векторного компонента, pCS-HBV(F-IG)(PSAS-), включающего кассету индикаторного гена, содержащую следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE-CMV, 2) 5'-область HBV генома,включающую DR1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован), 3) кассету функционального индикаторного гена, 4) 3'-область HBV-генома, содержащую DR2, DR1, 3' и 3'-область сигнала рА HBV (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован). Упаковывающий вектор, рРКСРХ, компонент резистентной тест-векторной системы, включающий сегмент гена Р, производимый пациентом, показан на фиг. 8D, a S-упаковывающий вектор, pPK-S, показан на фиг. 8 Е.-16 005426 С. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой (сскДНК), ДНК-формы из субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, pCS-HBV(F-IG)(PSAS-), содержащей функциональный индикаторный ген.D. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, pCS-HBV(F-IG)(PSAS+),включающего функциональный индикаторный ген, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора IE-CMV, 2) 5'-область HBV генома, включающую DR1 и 5' кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован, 3) кассету функционального индикаторного гена, 4) ген Р,содержащий сегмент, производимый пациентом, 5) 3'-область HBV-генома, содержащую DR2, DR1, 3' и 3'-область сигнала рА HBV (кодон инициации трансляции пре-С ORF элиминирован). Упаковывающий вектор, pPK-CSX, создающий гены С, S и X, котрансфицировали с резистентным тест-вектором, pCSHBV(F-IG)(PSAS+), и показали на фиг. 8 Н. Е. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой (сскДНК), ДНК-формы из резистентного тест-вектора, pCS-HBV(F-IG)(PSAS+), содержащую функциональный индикаторный ген. Подробное описание изобретения С целью лучшего понимания настоящего изобретения, ниже приводится его описание. Настоящее изобретение относится к новому анализу чувствительности и резистентности к лекарственному препарату, включающему следующие стадии: (а) введение резистентного тест-вектора, включающего сегмент, производимый пациентом, и индикаторного гена в хозяйскую клетку; (b) культивирование хозяйской клетки со стадии (а); (с) измерение экспрессии индикаторного гена в хозяйской клеткемишени; (d) сравнение экспрессии индикаторного гена со стадии (с) с экспрессией индикаторного гена,измеряемого, когда стадии (а)-(с) осуществляют в отсутствие противовирусного лекарственного препарата, и в присутствии тестируемой концентрации представлена на стадиях (а)-(с); на стадиях (b)-(с) или на стадии (с). В одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ определения чувствительности к противовирусному лекарственному препарату, включающий: (а) введение резистентного тест-вектора,включающего сегмент, производимый пациентом, и индикаторного гена в хозяйскую клетку; (b) культивирование хозяйской клетки со стадии (а); (с) измерение индикатора в клетке-мишени, причем указанный индикатор представляет собой ДНК- или РНК-структуру; и (d) сравнение измерения индикатора со стадии (с) с измерением индикатора на стадиях (а)-(с), осуществляемых в отсутствие противовирусного лекарственного препарата и в присутствии тестируемой концентрации противовирусного лекарственного препарата на стадиях (а)-(с); на стадиях (b)-(с) или на стадии (с). Настоящее изобретение относится также к способу определения у пациента противовирусной лекарственной устойчивости, включающий: (а) построение стандартной кривой лекарственной чувствительности к противовирусному лекарственному препарату; (b) определение у пациента противовирусной лекарственной чувствительности с использованием любого теста на чувствительность, описанного выше; и (с) сравнение противовирусной лекарственной чувствительности со стадии (b) со стандартной кривой,определенной на стадии (а), причем уменьшение противовирусной чувствительности свидетельствует о выработке у пациента противовирусной лекарственной устойчивости. Настоящее изобретение относится также к способу определения устойчивости пациента к противовирусному лекарственному средству, включающему: (а) определение чувствительности пациента к противовирусному лекарственному средству в первый раз в соответствии с любым из вышеупомянутых способов, причем сегмент, производимый пациентом, получают от пациента приблизительно в вышеуказанное время; (b) определение устойчивости того же пациента к противовирусному лекарственному средству в более позднее время и (с) сравнение противовирусной лекарственной чувствительности, определяемой на стадии (а) и (b), причем уменьшение противовирусной лекарственной чувствительности в более позднее время, сравненное с первым разом, свидетельствует о выработке или развитии у пациента противовирусной лекарственной резистентности. Исследование по настоящему изобретению можно использовать для любого вирусного заболевания,где затрагиваются и чувствительность, и резистентность к противовирусному лекарственному средству,в том числе, например, HIV, вирус простого герпеса, цитомегаловирус, вирус ветряной оспы, другие человеческие вирусы герпеса (HIV), вирус гриппа А, респираторно-синцитиальный вирус, вирусы гепатита А, В и С, риновирус и человеческий вирус папилломы. Эти вышеупомянутые представляют некоторые вирусы, для которых в настоящее время имеется химиотерапия, и представляют собой вирусные семейства ретровирусов, вирусов герпеса, ортомиксовируса, пневмовирусов игепаднавирусов. Анализ по настоящему изобретению будет использоваться и для других вирусных инфекций, возникающих при инфекциях, связанных с вирусами в рамках этих семейств, а также вирусных инфекций, возникающих от вирусов других вирусных семейств. Кроме того, тесты на лекарственную чувствительность и резистентность, исследованные в настоящем изобретении, полезны для скринирования соединений для лечения вирусных заболеваний, которые в настоящее время не доступны для лечения. Структура, жизненный цикл и генетические элементы вирусов, которые можно было бы протестировать на лекарственную чувствительность и резистентность в настоящем изобретении, известны рядовым специалистам в данной области. Для практики настоящего изобретения полезно, например, знать-17 005426 жизненный цикл ретровируса, а также вирусные гены, необходимые для избавления от ретровируса и инфицированности. Клетки, зараженные ретровирусом, сбрасывают оболочку с вируссодержащего диплоидного РНК-генома. Этот вирус, известный как оболочечный гликопротеин, который служит, чтобы детерминировать диапазон инфекционности хозяина, присоединяется к клеточному рецептору на плазматической мембране клетки для инфицирования. После связывания с рецептором, вирус интернализуется и раздетым проникает в цитоплазму хозяйской клетки. На своем пути к ядру или в ядро, молекулы обратной транскриптазы, присущие кору, стремятся синтезировать двухцепочечную ДНК провируса,синтез которой праймирован путем связывания молекулы tPHK с геномной вирусной РНК. Двухцепоченая провирусная ДНК последовательно интегрируется в геном хозяйской клетки, где она служит в качестве матрицы транскрипции и для мРНК, кодирующих вирусные белки, и для РНК генома вириона, которая упаковывается в вирусные частицы кора. На своем пути из инфицированной клетки коровые частицы двигаются через цитоплазму, присоединяются к внутренней плазматической мембране вновь инфицируемой клетки, а почка, создающаяся на их путях из мембраны, содержит оболочечный гликопротеин, генный продукт, кодируемый вирусом. Этот цикл заражения - обратная транскрипция, транскрипция, трансляция, сборка вириона и баддинг повторяются много раз, чтобы расширить заражение. Вирусная РНК и как результат провирусная ДНК кодирует несколько цис-действующих элементов,которые жизненно важны для успешного завершения жизненного цикла вируса. РНК вириона переносит вирусный промотор на свой 3'-конец. Репликационный пилотаж помещает вирусный промотор на 5'конец провирусного генома, поскольку геном обратно транскрибируем. Только 3'-5'-ретровирусный LTR располагает вирусный упаковывающий сайт. Ретровирусный жизненный цикл требует присутствия вирусно кодируемых трансактивирующих факторов. Вирусная РНК-зависимая ДНК-полимераза (pol) обратная транскриптаза также содержится в вирусном коре и является жизненно важной для вирусного жизненного цикла, в котором она ответственна за преобразование геномной РНК в интеграционную промежуточную провирусную ДНК. Вирусный оболочечный гликопротеин, env, необходим для присоединения вируса к неинфицированной клетке и для расселения вируса. Существуют также транскрипционные транс-активирующие факторы, так называемые трансактиваторы, которые могут служить для модуляции уровня транскрипции интегрированного родительского провируса. Обычно вирусы, компетентные по репликации (бездефектные), являются автономными в том, что они кодируют все эти трансдействующие факторы. Их дефектный двойник не автономен. В случае ДНК-вируса, такого как гепаднавирус, знание жизненного цикла и вирусных генов, требуемых для заражения, является полезным для практики настоящего изобретения. Процесс проникновения HBV не был достаточно охарактеризован. Репликация HBV использует промежуточную РНКматрицу. В зараженной клетке первая стадия в репликации представляет собой преобразование ассиметричной раскрученной кольцевой ДНК (rc-DNA) в ковалентно-замкнутую кольцевую ДНК (сскДНК). Этот процесс, который происходит в ядре инфицированных клеток печени, влечет за собой завершение синтеза положительно-цепочечной ДНК и лигирование концов ДНК. На второй стадии сскДНК транскрибируется с помощью хозяйской РНК-полимеразы с образованием 3,5 т.п.н. РНК-матрицы (прегеном). Этот прегеном комплексуется с белком в вирусный кор. Третья стадия синтеза включает синтез негативно-смысловой цепи ДНК путем репликации прегеномной РНК с использованием кодируемого вирусом белка Р обратной транскриптазы. Белок Р выступает также в качестве минус-цепи ДНК-праймера. Наконец, синтез позитивно-смысловой цепи ДНК происходит путем репликации первой цепи ДНК с использованием ДНК-полимеразной активности белка Р и олигомера вирусной РНК в качестве праймера. Прегеном также транскрибирует мРНК по главным структурным коровым белкам. Нижеследующая схема последовательностей операций иллюстрирует различные векторы и хозяйские клетки, которые могут использоваться в настоящем изобретении. Включение всех операций не предполагалось. Хозяйские клетки Упаковывающая хозяйская клетка - трансфицируемая упаковывающими экспрессионными векторами Резистентный тест-вектор хозяйской клетки - упаковывающая хозяйская клетка, трансфицируемая резистентным тест-вектором Хозяйская клетка-мишень - хозяйская клетка для заражения резистентным тест-вектором вирусной частицы, полученной с помощью резистентного тест-вектора хозяйской клетки. Резистентный тест-вектор"Резистентный тест-вектор" подразумевает несколько векторов, которые, взятые вместе, содержат ДНК или РНК, включающую сегмент, производимый пациентом, и индикаторный ген. В том случае если резистентный тест-вектор включает более чем один вектор, сегмент, производимый пациентом, может содержать в одном векторе и индикаторный ген в отличающемся векторе. Такой резистентный тествектор, включающий более чем один вектор, рассматривается здесь для ясности в качестве резистентной тест-векторной системы, но все же подразумевает резистентный тест-вектор. ДНК или РНК резистентный тест-вектор может, следовательно, содержатся в одной или нескольких молекулах ДНК или РНК. В первом варианте осуществления настоящего изобретения резистентный тест-вектор делали путем инсерции сегмента, производимого пациентом, в индикаторный ген вирусного вектора. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения резистентный тест-вектор делали путем инсерции сегмента,производимого пациентом, в упаковывающий вектор, тогда как индикаторный ген содержался во втором векторе, например, индикаторный ген вирусного вектора. Используемое здесь понятие "сегмент, производимый пациентом," относится к одному или нескольким вирусным сегментам, получаемым непосредственно от пациента с использованием различных способов, например молекулярным клонированием или полимеразной цепной реакцией (PCR), амплифицирующей сегменты, производимые пациентом с использованием вирусной ДНК или комплементарной ДНК (кДНК), получаемой из вирусной РНК, присутствующей в клетках (например, моноядерные клетки периферической крови, РМВС), в сыворотке или в других жидкостях организма инфицированных пациентов. Когда вирусный сегмент "получен непосредственно" от пациента, его получали без проведения вируса через культуру или же его культивировали с последующим минимальным количеством пассажей, чтобы существенно исключить отбор мутаций в культуре. Термин "вирусный сегмент" относится к любой функциональной вирусной последовательности или вирусному гену, кодирующему генный продукт (например, белок), который является мишенью противовирусного лекарственного препарата. Термин "функциональная вирусная последовательность",как он здесь используется, относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) с функциональной активностью, такой как энхансеры, промоторы, сайты полиаденилирования, сайты действия транс-действующих факторов, таких как tar и RRE, к упаковывающим последовательностям,интегрирующим последовательностям, или последовательностям сплайсинга. Если лекарственный препарат предназначен для мишени более чем одной функциональной вирусной последовательности или вирусного генного продукта, тогда сегменты, производимые пациентом, корреспондирующие с каждым указанным вирусным геном, будут инсерцированы в резистентный тест-вектор. В случае комбинированной терапии, где установлено, что два или несколько противовирусов мишенируют две отличающиеся функциональные вирусные последовательности или вирусные генные продукты, сегменты, производимые пациентом, корреспондирующие с каждой функциональной вирусной последовательностью или-19 005426 вирусным генным продуктом, будут инсерцированы в резистентный тест-вектор. Сегменты, производимые пациентом, инсерцированы в уникальные сайты рестрикции или специфические местоположения,называемые акцепторными сайтами последовательности пациента, в вирусном векторе, с индикаторным геном, или, например, упаковывающем векторе, зависящем от конкретной используемой конструкции,описанной здесь. Используемое здесь понятие "сегмент, производимый пациентом", охватывает сегменты, полученные от человека и различных видов животных. Такие виды включают, но не ограничиваются, шимпанзе,лошадями, крупным рогатым скотом, кошками и собаками. Сегменты, производимые человеком, могут также включаться в резистентные тест-векторы с использованием любой из нескольких альтернативных методик клонирования. Например, клонирование путем интродукции сайтов рестрикции класса II и в плазмидный остов и в сегменты, производимые человеком, или с помощью клонирования урацил-ДНК-гликозилазного праймера (ссылки). Сегмент, производимый пациентом, может быть получен любым способом молекулярного клонирования или генной амплификации, или их модификациями, путем интродуцирования акцепторных сайтов последовательности пациента, как описано ниже, на концы сегмента, производимого пациентом, интродуцируемого в резистентный тест-вектор. Например, в способе амплификации, таком как PCR, сайты рестрикции, корреспондирующие акцепторным сайтам в последовательности пациента, могут быть вставлены в концы праймеров, используемых в реакции PCR. Аналогично, в способе молекулярного клонирования, таком как кДНК-клонирование, указанные сайты рестрикции могут быть вставлены в концы праймеров, используемых для синтеза первой или второй цепи кДНК, или в способе, таком как восстановление ДНК с помощью праймера, в любой из двух, клонированной или неклонированной ДНК,указанные сайты рестрикции могут быть вставлены в праймеры, используемые для реакции репарации. Акцепторные сайты последовательности пациента и праймеры конструировали для улучшения представительства сегментов, производимых пациентом. Наборы резистентных тест-векторов, обладающие сконструированными акцепторными сайтами последовательности пациента, создают представительные сегменты, производимые пациентом, которые должны быть недостаточно представлены только в одном резистентном тест-векторе. Резистентные тест-векторы получали путем модификации индикаторного гена вирусного вектора(описываемого ниже) путем интродуцирования акцепторных сайтов последовательности пациента, амплификации или клонирования сегментов, производимых пациентом, и инсерцирования амплифицированных или клонированных последовательностей точно в вирусные векторы, с индикаторным геном, по акцепторным сайтам последовательности пациента. Резистентные тест-векторы конструировали из индикаторного гена вирусных векторов, которые, в свою очередь, произведены из геномных вирусных векторов или субгеномных вирусных векторов и кассеты индикаторного гена, каждый из которых описывается ниже. Затем резистентные тест-векторы интродуцировали в хозяйскую клетку. Альтернативно, резистентный тест-вектор (определяемый также как резистентная тест-векторноя система) получали путем введения акцепторных сайтов последовательности пациента в упаковывающий вектор, амплификации или клонирования сегментов, производимых пациентом, и инсерцирования амплифицированных или клонированных последовательностей точно в упаковывающий вектор по акцепторным сайтам последовательности пациента и котрансфицирования этого упаковывающего вектора с индикаторным геном вирусного вектора. В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, резистентный тествектор может быть интродуцирован в упаковывающие хозяйские клетки вместе с упаковывающими экспрессионными векторами, как описывается ниже, с получением резистентных тест-векторных вирусных частиц, которые используются в тестах на лекарственную устойчивость и чувствительность, рассматриваемые здесь в качестве "теста, основанного на частице". В альтернативном предпочтительном варианте,резистентный тест-вектор может быть интродуцирован в хозяйскую клетку в отсутствие упаковывающего экспрессионного вектора для осуществления теста на лекарственную устойчивость и - чувствительность, который рассматривается здесь в качестве "теста не основанного на частице". Используемый здесь"упаковывающий экспрессионный вектор" создает факторы, такие как упаковывающие белки (например,структурные белки, такие как полипептиды кора и оболочки), трансдействующие факторы, или гены,необходимые для дефектно-реплицируемого ретровируса или гепаднавируса. В такой ситуации компетентный по репликации вирусный геном ослаблен таким образом, что не может самореплицироваться. Это означает, что хотя упаковывающий вектор может давать трансдействующие или недостающие гены,необходимые для спасения дефектного вирусного генома, присутсвующего в клетке, содержащей ослабленный геном, этот ослабленный геном не может спасти самого себя. Индикатор или индикаторный ген"Индикатор или индикаторный ген" относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, ДНК или РНК структура которого либо прямо, либо посредством реагирования приводит к возникновению измеряемого или заметного внешнего проявления, например, цвета или света, измеряемого длиной волны, или в случае ДНК или РНК, используемых в качестве индикаторного изменения или образования специфической ДНК или РНК структуры. Предпочтительные примеры индикаторного гена предоставля-20 005426 ет ген lacZ E. coli, который кодирует бета-галактозидазу, ген luc, который кодирует любую форму люциферазы, например, Photonis pyralis (жук-светляк) или Renilla reniformis (морская фиалка), ген phoA E.coli, который кодирует щелочную фосфатазу, белок, флуоресцирующий зеленым, и бактериальный генCAT, который кодирует хлорамфениколацетилтрансферазу. Дополнительными предпочтительными примерами индикаторного гена являются секретируемые белки или белки клеточной оболочки, которые легко измерить в анализе, таком как радиоиммунологическом анализе (RIA), или флуоресцентноактивируемом клеточном анализе (FACS), в том числе, например, ростовые факторы, цитокины и поверхностные антигены клетки (например, гормон роста, соответственно 11-2 или CD4). Понятие "индикаторный - ген" включает также селекционный ген, рассматриваемый также как селективный маркер. Примерами подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих являются дигидрофолатредуктаза (DHFR), тимидинкиназа, гигромицин, неомицин, зеоцин или gpt E. coli. Что касается вышеупомянутых примеров индикаторных генов, данный индикаторный ген и сегмент, производимый пациентом,представляют собой обособленные элементы системы, т.е. разные и самостоятельные гены. В некоторых случаях сегмент, производимый пациентом, может также использоваться в качестве индикаторного гена. В одном таком варианте осуществления настоящего изобретения, в котором сегмент, производимый пациентом, корреспондирует с более чем одним вирусным геном, который представляет собой мишень противовируса одного из указанных вирусных генов, может также служить в качестве индикаторного гена. Например, вирусный протеазный ген может выступать в качестве индикаторного гена, благодаря своей способности расщеплять хромогенный субстрат или своей способности активировать неактивный зимоген (профермент), который в свою очередь расщепляет хромогенный субстрат, приводя к возникновению в каждом случае цветной реакции. Во всех вышеприведенных примерах индикаторных генов, индикаторный ген может быть либо "функциональным", либо "нефункциональным", но в каждом случае экспрессия индикаторного гена в клетке-мишени строго зависит от действия сегмента, производимого пациентом. Функциональный индикаторный ген Что касается "функционального индикаторного гена", индикаторный ген может быть экспрессирован в "упаковывающей хозяйской клетке/резистентном тест-векторе хозяйской клетки", указанной ниже,независимо от сегмента, производимого пациентом, однако, функциональный ген мог бы не экспрессироваться в хозяйской клетке-мишени, указанной ниже, без производства функциональных резистентных тест-векторных частиц и их эффективного заражения хозяйской клетки-мишени. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, функциональный индикаторный ген, кассету индикаторного гена, включающую контрольные элементы и ген, кодирующий индикаторный белок, инсерцировали в индикаторный ген вирусного вектора с одной и той же или противоположной транскрипционной ориентацией, в качестве своего или чужого энхансер/промотора вирусного вектора. В отдельном примере, для случая HIV или HBV, размещали индикаторный ген и его промотор (энхансер/промотор IE CMV) в одной и той же или противоположной транскрипционной ориентации, соответственно, в виде HIV-LTR илиHBV-энхансер-промотора, или энхансер-промотора IE CMV, ассоциируемых с вирусным вектором. Нефункциональный индикаторный ген Альтернативным индикаторным геном может быть "нефункциональный" в том смысле, что данный индикаторный ген не эффективно экспрессируется в упаковывающей хозяйской клетке, трансфицированной резистентным тест-вектором, который затем считают резистентным тест-вектором хозяйской клетки, до его преобразования в функциональный индикаторный ген, вследствие действия одного или нескольких продуктов сегмента, производимого пациентом. Индикаторному гену придают нефункциональность путем генетического воздействия, в соответствии с настоящим изобретением. 1. Пермутированный промотор. В одном из вариантов настоящего изобретения индикаторный ген делали нефункциональным,вследствие определенной локализации промотора, при которой, хотя данный промотор и находится в той же транскрипционной ориентации, что и индикаторный ген, он следует за, а не предшествует данному индикаторному гену, кодирующему последовательность. Этот поставленный не на место промотор рассматривается в качестве "пермутированного промотора". Кроме того, к данному пермутированному промотору нефункциональный индикаторный ген ориентируют противоположно ориентации к своему или чужому промотор/энхансеру вирусного вектора. Поэтому кодирующая последовательность нефункционального индикаторного гена не может транскрибироваться ни под пермутированным промотором, ни под вирусными промоторами. Нефункциональному индикаторному гену и его пермутированному промотору сообщают функциональность действием одного или нескольких вирусных белков. В примере нефункционального индикаторного гена с пермутированным промотором для случая HIV помещали промотор РНК-полимеразы фага Т 7 (именуемый здесь как Т 7-промотор), промотор в 5'-LTR, в той же ориентации, что и индикаторный ген. Данный индикаторный ген не может транскрибироваться под Т 7 промотором, поскольку кассета индикаторного гена расположена ниже Т 7-промотора. Нефункциональный индикаторный ген в резистентном тест-векторе преобразовывали в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскриптазы при заражении клеток-мишеней, приводящему к репозиционированию Т 7-промотора, путем репликации 5'-LTR в 3'-LTR, относительно генной кодирующей области.-21 005426 После интеграции репарированного индикаторного гена в хромосому клетки-мишени с помощью HIVинтегразы, ядерная РНК-полимераза Т 7, экспрессируемая клеткой-мишенью, транскрибирует данный индикаторный ген. В одним из примеров нефункционального индикаторного гена с пермутированным промотором для случая с HBV энхансер-промоторную область помещали ниже или в 3' данного индикаторного гена, и там, и там, обладающую одной и той же ориентацией. Индикаторный ген не может транскрибироваться под этим энхансер-промотором, поскольку кассета индикаторного гена расположена выше. Нефункциональный ген в резистентном тест-векторе преобразовывали в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскрипции и образования кольцевой молекулы из HBVиндикаторного гена вирусного вектора путем перестановки энхансер-промотора выше относительно кодирующей области индикаторного гена. Перкутированный промотор может быть любым эукариотическим или прокариотическим промотором, который может транскрибироваться в данной клетке-мишени. Предпочтительно, чтобы данный промотор был небольшим по размеру, чтобы иметь возможность инсерцироваться в вирусный геном без нарушения вирусной репликации. Более предпочтительно использовать промотор, небольшой по размеру и способный к транскрипции с помощью единственной субъединицы РНК-полимеразы, интродуцируемой в хозяйскую клетку-мишень, такой как промотор бактериофага. Примеры таких бактериофаговых промоторов и соответствующих им РНК-полимераз включают промоторы фагов Т 7, Т 3 и Sp6. Ядерная локализующая последовательность (NLS) может быть присоединена к РНК-полимеразе для локализации экспрессии РНК-полимеразы в ядре, где они могут быть необходимы для транскрибирования репарируемого индикаторного гена. Такую NLS можно получить из белка, перемещаемого в белок, такого как Тантиген SV40. При использовании фаговой РНК-полимеразы, участок внутреннего входа рибосом(IRES), такой как 5'-нетранслируемая область (UTR) ЕМС-вируса, можно добавить впереди индикаторного гена, для трансляции транскриптов, которые вообще не копированы. Для случая HIV пермутированный промотор сам по себе может быть интродуцирован в любое положение в пределах 5'-LTR, который копировали с 3'-LTR во время обратной транскрипции, при условии, что LTR-функция не нарушается предпочтительно в пределах U5 и R-частей данного LTR и более предпочтительно вне функционально важных и высоко консервативных областей U5 и R. В случае HBV пермутированный промотор можно поместить в любое положение, которое не нарушает цис-действующие элементы, которые необходимы для репликации ДНК HBV. Блокирующие последовательности, добавляемые на концы резистентного тест-вектора, должны иметь не подходящую экспрессию нефункционального индикаторного гена, обусловленную артефактами трансфекции (сцепление ДНК). В HIV-примере, приведенный выше пермутированный промотор Т 7, так блокирующий последовательность, может состоять из Т 7 транскрипционного терминатора, расположенного для блочного прочтения линейно записанной информации о транскрипции, происходящей из-за сцепления ДНК, но не транскрипции, происходящей из-за перестановки пермутированного Т 7-промотора из 5'-LTR в 3'-LTR во время обратной транскрипции. 2. Пермутированная кодирующая область. Во втором варианте осуществления настоящего изобретения, индикаторному гену придавали нефункциональность, обусловленную близким местонахождением 5'- и 3'-кодирующими областями индикаторного гена, в котором 3'-кодирующая область предшествует, а не следует за 5'-кодирующей областью. Эту неправильно расположенную кодирующую область рассматривают в качестве "пермутированной кодирующей области". Ориентация не функционального индикаторного гена может быть той же или противоположной ориентации своего или чужого промотор/энхансера вирусного вектора, поскольку мРНК, кодирующая функциональный индикаторный ген, получена, как оказалось, для любой ориентации. Нефункциональному индикаторному гену и его пермутированной кодирующей области сообщали функциональность с помощью действия одного или нескольких продуктов сегмента, производимого пациентом. Во втором примере нефункционального индикаторного гена с пермутированной кодирующей областью для случая HIV, 5'-кодирующую область индикаторного гена помещали с ассоциированным промотором в 3'-LTR ОЗ-области, а 3'-кодирующую область индикаторного гена - в верхний участокHIV-генома, с кодирующей областью каждой, обладающей той же транскрипционной ориентацией, что и вирусные LTR. В обоих примерах 5'- и 3'-кодирующие области могут также обладать ассоциированным донорными и акцепторными последовательностями сплайсинга, которые могут быть гетерологичными или синтетическими сигналами сплайсинга. Данный индикаторный ген не может быть функционально транскрибирован под ассоциированным промотором или под вирусными промоторами, так как пермутированная кодирующая область предотвращает образование функционально сплайсируемых транскриптов. Нефункциональный индикаторный ген в резистентном тест-векторе преобразовывали в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскриптазы при заражении клеток-мишеней, что происходило из-за перестановки 5'- и 3'-кодирующих областей индикаторного гена относительно друг друга, путем репликации 3'-LTR в 5'-LTR. После транскрипции с помощью промотора, ассоциированного с 5'-кодирующей областью, РНК-сплайсинг может соединить 5'- и 3'-кодирующие области с образованием продукта функционального индикаторного гена. В одном из примеров нефункциональный индикаторный ген с пермутированной кодирующей областью в случае HBV 3'-кодирующую область индикаторного гена, помещали выше 5' энхансер-промотора и 5'-кодирующей области индикаторного гена, вме-22 005426 сте или по отдельности. Направление транскрипции 5'- и 3'-кодирующих областей индикаторного гена идентично относительно друг друга и является тем же, что и у индикаторного гена вирусного вектора. Поскольку, однако, 5'- и 3'-кодирующие области индикаторного гена пермутированы в резистентном тест-векторе (т.е. 5'-кодирующая область находится ниже 3'-кодирующей области), мРНК, которая может быть сплайсирована с образованием кодирующей области функционального индикаторного гена, не транскрибируется. После обратной транскрипции и образования кольцевой молекулы индикаторного гена вирусного вектора, 3'-кодирующая область индикаторного гена располагается ниже 3'- и 5'кодирующих областей к энхансер-промотору, что позволяет осуществляться транскрипции мРНК, которая может сплайсироваться с образованием кодирующей области функционального индикаторного гена. 3. Инвертированный интрон. В третьем варианте осуществления настоящего изобретения индикаторному гену придавали функциональность, благодаря использованию "инвертированного интрона", например, интрон инсерцировали в кодирующую последовательность индикаторного гена с направлением транскрипции, противоположным направлению транскрипции индикаторного гена. Общее направление транскрипции кассеты индикаторного гена, включая свой собственный, присоединямый промотор, является противоположным направлению транскрипции вирусных контрольных элементов, тогда как ориентация искусственного интрона та же, что и у вирусных контрольных элементов. Транскрипция индикаторного гена под своим собственным присоединенным промотором не приводит к образованию функциональных транскриптов,поскольку инвертированный интрон не может быть быть сплайсирован в этой ориентации. Транскрипция индикаторного гена под вирусными контрольными элементами приводит, однако, к удалению инвертированного интрона, благодаря РНК-сплайсингу, хотя индикаторный ген все еще функционально не экспрессирован, поскольку итоговый транскрипт обладает антисмысловой ориентацией. После обратной транскрипции этого транскрипта и интеграции полученной ретровирусной ДНК или образования кольцевой молекулы ДНК гепаднавируса индикаторный ген можно функционально транскрибировать с использованием своего собственного присоединенного промотора, поскольку ранее был удален инвертированный интрон. В данном случае индикаторный ген сам может содержать свой собственный функциональный промотор с полной единицей транскрипции, противоположно ориентированной к вирусным контрольным элементам. Поэтому нефункциональный индикаторный ген находится в неверной ориентации, чтобы быть транскрибированным под вирусными контрольными элементами, и он не может быть функционально транскрибирован под своим собственным промотором, поскольку инвертированный интрон не может быть надлежащим образом вырезан путем сплайсирования. Однако, что касается ретровируса и, особенно, HIV и гепаднавируса, и, особенно, HBV, транскрипция под вирусными промоторами(LTR HIV или энхансер-промотор HBV) приводит к удалению инвертированного интрона путем сплайсинга. Вследствие обратной транскрипции результирующего сплайсируемого транскрипта и интеграции результирующего провируса в хромосому хозяйской клетки или образования кольцевой молекулы HBVвектора, теперь индикаторный ген может транскрибироваться под своим собственным промотором. Инвертированный интрон, состоящий из донорного и акцепторного сайта сплайсинга для удаления интрона,локализуются предпочтительно в кодирующей области индикаторного гена, чтобы нарушить трансляцию индикаторного гена. Донорный и акцепторный сплайсинг может представлять собой любой сплайсинг донора и акцептора. Предпочтительным донор-рецепторным сплайсингом является донорный сплайсинг IE CMV и акцепторный сплайсинг второго экзона человеческого гена альфа-глобулина ("интрон А"). Индикаторный ген вирусного вектора. Конструирование Используемый здесь "индикаторный ген вирусного вектора" относится к вектору(ам), включающему индикаторный ген и его контрольные элементы и один или несколько вирусных генов. Индикаторный ген вирусного вектора собирали из кассеты индикаторного гена и указанного выше "вирусного вектора". Индикаторный ген вирусного вектора может дополнительно включать энхансер, сигналы сплайсирования, последовательности полиаденилирования, терминаторы транскрипции или другие регуляторные последовательности. Сверх того, индикаторный ген вирусного вектора может быть функциональным или нефункциональным. Оказалось, что вирусные сегменты, которые являются мишенью противовирусного лекарственного препарата, не включены в индикаторный ген вирусного вектора, потому что они созданы во втором векторе. "Кассета индикаторного гена" включает индикаторный ген и контрольные элементы."Вирусный вектор" относится к вектору, включающему некоторые или все следующие: вирусные гены,кодирующие генный продукт, контрольные последовательности, вирусные упаковывающие последовательности, и, что касается ретровируса, интегрирующие последовательности. Вирусный вектор может дополнительно включать один или несколько вирусных сегментов, из которых один или несколько могут быть мишенью противовирусного лекарственного препарата. Два примера вирусного вектора, который содержит вирусные гены, относятся к рассматриваемому здесь "геномному вирусному вектору" и "субгеномному вирусному вектору". "Геномный вирусный вектор" представляет собой вектор, который может включать делецию одного или нескольких вирусных генов для придания вирусной репликации некомпетентности, но который иным образом предохраняет экспрессию мРНК и характеристики процессирования полного вируса. В первом варианте осуществления настоящего изобретения HIV-теста на лекар-23 005426 ственную чувствительность и устойчивость геномный вирусный вектор включает гены gag-pol, vif, vpr,tat, rev, vpu и nef (некоторые, большинство или все env могут быть делегированы). "Субгеномный вирусный вектор" относится к вектору, включающему кодирующую область одного или нескольких вирусных генов, которые могут кодировать белки, которые представляют собой мишень(и) противовирусного лекарственного препарата. Что касается HIV, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является субгеномный вирусный вектор, включающий ген gag-pol HIV. Что касается HBV,предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является субгеномный вирусный вектор, включающий ген Р HBV. Что касается HIV, двумя примерами провирусных клонов, используемых для конструкции вирусного вектора, являются НХВ 2 (Fischer с соавт., (1986) Nature, 320, 367-371) иNL4-3, (Adachi с соавт., (1986) J. Virol., 59, 284-291). Что касается HBV, охарактеризовано большое количество полных геномных последовательностей, которые могли бы использоваться для конструирования вирусных векторов HBV: GenBank Nos. М 54923, М 38636, J02203 и Х 59795. Вирусные кодирующие гены могут находиться под контролем своего энхансер/промотора или чужого вирусного или клеточного энхансер/промотора. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения для HIV-теста на лекарственную чувствительность и устойчивость заключается в размещении геномных и субгеномных вирусных кодирующих областей под контролем своего энхансер/промотора из U3-области HIV-LTR или быстродействующего раннего (IE) энхансер/промотора. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения для HBV-теста на чувствительность и устойчивость заключается в размещении геномных и субгеномных вирусных кодирующих областей под контролем быстродействующего раннего(IE) энхансер/промотора CMV. Что касается индикаторного гена вирусного вектора, который содержит один или несколько вирусных генов, которые являются мишенями или кодируют белки, которые являются мишенями противовирусного лекарственного препарата(ов), кроме того, указанный вектор содержит сайты акцепторной последовательности пациента. Сегменты, производимые пациентом, инсерцировали в акцепторный сайт последовательности пациента в вирусный вектор, с индикаторным геном, который затем рассматривали в качестве резистентного тест-вектора, как описано выше. "Акцепторные сайты последовательности пациента" представляют собой сайты в векторе для инсерции сегментов, производимых пациентом, и указанные сайты могут быть 1) уникальными свитами рестрикции, интродуцируемыми путем свит-направленного мутагенеза в вектор; 2) естественно встречаемыми в векторе уникальными сайтами рестрикции; или 3) отобранными сайтами, в которые можно инсерцировать сегмент, производимый пациентом, с использованием альтернативных методов клонирования (например, UDGклонирование). В одном из примеров осуществления настоящего изобретения акцепторный сайт последовательности пациента интродуцировали в индикаторный ген вирусного вектора. Акцепторные сайты последовательности пациента предпочтительно локализовали в пределах или вблизи кодирующей области вирусного белка, который представляет собой мишень противовирусного лекарственного препарата. Вирусные последовательности, используемые для интродукции акцепторных сайтов последовательности пациента, предпочтительно выбранные так, чтобы не изменять или изменять незначительно, переводили в аминокислотную кодирующую последовательность, обнаруживаемую в той же позиции. Предпочтительно акцепторные сайты последовательности пациента локализовали в пределах относительно консервативной области вирусного генома, чтобы облегчить интродукцию сегментов, производимых пациентом. Альтернативно, акцепторные сайты последовательности пациента локализовали между функционально важными генами или регуляторными последовательностями. Акцепторные сайты, производимые пациентом, могут быть локализованы в вирусном геноме или вблизи областей вирусного генома, которые являются относительно консервативными, чтобы позволить праймировать праймеру, используемому для введения корреспондирующего сайта рестрикции в сегмент, производимый пациентом. В дальнейшем, для улучшения представительства сегментов, производимых пациентом, такие праймеры можно создавать в качестве вырожденных пулов для обеспечения гетерогенности вирусной последовательности или можно вставить остатки, такие как дезоксиинозин (I), который обладает способностью к множественному спариванию. Наборы резистентных тест-векторов, обладающих акцепторными свитами последовательности пациента, которые определяют одни и те же или перекрывающиеся сайт-рестрикционные интервалы, могут использоваться вместе в тестах на лекарственную чувствительность или устойчивость для создания репрезентативных сегментов, производимых пациентом, которые содержат внутренние сайты рестрикции, идентичные данному акцепторному сайту последовательности пациента, и поэтому недостаточно представлены в любом единственном резистентном тест-векторе. Хозяйские клетки Резистентный тест-вектор интродуцировали в хозяйскую клетку. Подходящими хозяйскими клетками являются клетки млекопитающих. Предпочтительные хозяйские клетки получали из человеческих тканей и клеток, которые, в принципе, являются мишенями вирусной инфекции. Что касается HIV, они включают человеческие клетки, такие как человеческие Т-клетки, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, клетки Лангерганса, гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и другие клетки. Что касается HBV, подходящие хозяйские клетки включают клеточные линии гепатомы (HepG2,Huh 7), первичные человеческие гепатоциты, клетки млекопитающих, которые могут быть заражены псевдотипированным HBV, и другие клетки. Хозяйские клетки, производимые человеком, гарантируют,-24 005426 что противовирусный лекарственный препарат будет входить в клетку эффективно и будет преобразовываться с помощью ферментативного аппарата клетки в метаболически важную форму противовирусного ингибитора. Хозяйские клетки рассматриваются здесь в качестве "упаковывающих хозяйских клеток","хозяйских клеток с резистентным тест-вектором". "Упаковывающие хозяйские клетки" относятся к хозяйским клеткам, которые создают трансдействующие факторы и вирусные упаковывающие белки, необходимые для репликации используемых здесь дефектных вирусных векторов, таких как резистентные тест-векторы, для получения резистентных тест-векторных вирусных частиц. Упаковывающие белки могут быть созданы с помощью экспрессии вирусных генов, содержащихся в самом резистентном тествекторе, в упаковывающем экспрессионном векторе(ах) или их обоих. Упаковывающие хозяйские клетки представляют собой хозяйскую клетку, которую трансфицировали одним или несколькими упаковывающими экспрессионными векторами, или которую трансфицировали резистентным тест-вектором,которая затем рассматривается здесь в качестве "хозяйской клетки с резистентным тест-вектором" или иногда рассматривается в качестве упаковывающей хозяйской клетки/хозяйской клетки с резистентным тест-вектором. Предпочтительные хозяйские клетки для использования в качестве упаковывающих хозяйских клеток для HIV включают 293-эмбриональные почечные клетки человека (293, Graham, F.L. с соавт., J. Gen Virol. 36: 59, 1977), BOSC23 (Pear с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 8392, 1993), клеточные линии tsa54 и tsa201 (Heinzel с соавт., J. Virol. 62, 3738, 1988), HepG2 HBV (Galle и Theilmann, L."Хозяйские клетки-мишени" относятся к клетке, инфицированной тест-векторными вирусными частицами, продуцируемыми хозяйской клеткой с резистентным тест-вектором, в которой имеют место экспрессия или ингибирование индикаторного гена. Предпочтительные хозяйские клетки для использования в качестве хозяйских клеток-мишеней включают человеческие Т-клеточные лейкозные клеточные линии, в том числе Jurkat (АТСС TIB-152), H9 (АТСС НТВ-176), СЕМ (АТСС CCL-119), HUT78 (АТСС Т 1 В-161) и их производные. Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость настоящего изобретения могут быть осуществлены в одной или нескольких хозяйских клетках. Вирусную лекарственную чувствительность определяли как концентрацию противовирусного агента, при которой ингибируется данный процент экспрессии индикаторного гена (например, IC50 для противовирусного агента представляет собой концентрацию, при которой ингибируется 50% экспрессии индикаторного гена). Стандартную кривую лекарственной чувствительности данного противовирусного лекарственного препарата можно построить для вирусного сегмента, который представляет собой либо стандартный лабораторный вирусный сегмент, либо сегмент от пациента, не подвергавшийся лекарственному воздействию (т.е. пациент, который не получал противовирусного лекарственного препарата) с использованием способа настоящего изобретения. Соответственно вирусная лекарственная устойчивость ослабляется до вирусной лекарственной чувствительности для данного пациента либо при сравнении лекарственной чувствительности с таким данным стандартом, либо при осуществлении последовательного измерения у одного и того же пациента много раз, которая определяется путем увеличиваемого ингибирования экспрессии индикаторного гена(т.е. ослабления экспрессии индикаторного гена). Для первого типа теста на лекарственную чувствительность и устойчивость, вирусные частицы с резистентным тест-вектором получали с помощью первой хозяйской клетки (хозяйская клетка с тествектором), которую получали с помощью трансфицирующей упаковывающей хозяйской клетки с резистентным тест-вектором и упаковывающим экспрессионным вектором(ами). Вирусные частицы с резистентным тест-вектором использовали затем для заражения второй хозяйской клетки (хозяйская клеткамишень), в которой измеряли экспрессию индикаторного гена. Такие две клеточные системы, включающие упаковывающую хозяйскую клетку, которую трансфицировали резистентным тест-вектором, которую впоследствии рассматривали в качестве хозяйской клетки с резистентным тест-вектором, и клеткумишень использовали в отношении любого индикаторного гена, функционального или нефункционального. Функциональные индикаторные гены эффективно экспрессируются при трансфекции упаковывающей хозяйской клетки и нуждаются в инфицировании хозяйской клетки-мишени супернатантном хозяйской клетки с резистентным тест-вектором для осуществления теста настоящего изобретения. Нефункциональные индикаторные гены с пермутированным промотором, пермутированной кодирующей областью или инвертированным интроном не экспрессируются эффективно при трансфекции,упаковывающей хозяйской клетки, и поэтому заражение хозяйской клетки-мишени можно достигнуть либо путем сокультивирования с хозяйской клеткой с резистентным тест-вектором и хозяйской клеткоймишенью, либо путем заражения хозяйской клетки-мишени с использованием супернатанта хозяйской клетки с резистентным тест-вектором. Для второго типа теста на лекарственную чувствительность и устойчивость единственная хозяйская клетка (хозяйская клетка с резистентным тест-вектором) также служила в качестве хозяйской клетки-мишени. Упаковывающие хозяйские клетки трансфицировали и получали вирусные частицы с резистентным тест-вектором, а некоторые упаковывающие клетки также становились мишенью для заражения с помощью резистентных тест-векторных частиц. Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость, использующие единственный тип хозяйской клетки, возмож-25 005426 ны с вирусными резистентными тест-векторами, включающими нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, пермутированной кодирующей областью или инвертированным интроном. Такие индикаторные гены эффективно не экспрессируют при трансфекции первой клетки, но эффективно экспрессируют только при заражении второй клетки и поэтому дают благоприятную возможность для измерения эффекта оцениваемого противовирусного агента. Что касается теста на лекарственную чувствительность и устойчивость с использованием резистентного тест-вектора, включающего функциональный индикаторный ген, то ни процесс сокультивирования, ни тест на устойчивость и чувствительность, использующий единственный тип клетки, не может применяться для заражения клеток-мишеней. Резистентный тест-вектор, включающий функциональный индикаторный ген, нуждается в двухклеточной системе с использованием отфильтрованных супернатантов из хозяйских клеток с резистентным тест-вектором для заражения хозяйской клетки-мишени. В первом варианте осуществления настоящего изобретения, что касается HIV, тесты на резистентность, основанные на частице, осуществляли с резистентными тест-векторами, полученными из геномных вирусных векторов, т.е. pLG-lucPP-HS, pCG-lucPP-YS, pLG-lucPP-PB, pCG-lucPP-PB, pLG-lucPC-HS,pCG-lucPC-HS, pLG-lucPC-PB, pCG-lucPC-PB, pLG-lucII-HS, pCG-lucII-HS, pLG-lucII-PB, pCG-lucII-PB иpCG-CXCN(F-lucP)2-AA, которые контрансфицировали упаковывающим экспрессионным векторомpVL-env4070A (рассматриваемого также в качестве pCXAS-4070Aenv). Альтернативно, тест на резистентность, основанный на частице, может быть осуществлен с резистентными тест-векторами, полученными из субгеномных вирусных векторов, т.е. pLS-lucPP-HS, pCS-lucPP-HS, pLS-lucPP-PB, pCS-luc-PPPB, pLS-lucPC-HS, pCS-lucPC-HS, pLS-lucPC-PB, pCS-luc-PC-PB, pLS-lucII-HS, pCS-lucII-HS, pLS-lucIIPB и pCS-luc-II-PB), которые котрансфицировали упаковывающим экспрессионным вектором pVLenv4070A и либо pLTR-HIV3', либо pCMV-HIV3'. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, что касается HIV, тест на резистентность, основанный не на частице, осуществляли с использованием каждого из вышеописанных резистентных тест-векторов путем трансфекции селектируемых хозяйских клеток в отсутствие упаковывающих экпрессионных векторов. Что касается теста на чувствительность и устойчивость, основанного на частице вирусные частицы с резистентным тест-вектором получали с помощью первой хозяйской клетки (хозяйская клетка с резистентным тест-вектором), которую получали путем трансфицирования упаковывающей хозяйской клеткой с тест вектором на резистентность и упаковывающим экспрессионным вектором(ами). Вирусные частицы с резистентным тест-вектором использовали затем для заражения второй хозяйской клетки (хозяйская клетка-мишень), в которой измеряли экспрессию индикаторного гена. Для второго типа теста на чувствительность и устойчивость, основанного на частице, и единственный тип хозяйской клетки (хозяйская клетка с резистентным тест-вектором) служил обоим целям: трансфицировали некоторые упаковывающие хозяйские клетки в данной культуре и получали вирусные частицы с резистентным тествектором, а некоторые хозяйские клетки в одной и той же культуре являются мишенью заражения с помощью частиц с резистентным тест-вектором, полученных таким образом. Тесты на резистентность, использующие единственный тип хозяйской клетки, возможны с резистентными тест-векторами, включающими нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, с такими индикаторными генами, эффективно экспрессируемыми при инфекции пермиссивной хозяйской клетки, они эффективно не экспрессируют при трансфекции одного и того же типа хозяйской клетки и поэтому создают благоприятную возможность для измерения оценки эффекта противовирусного агента. По аналогичным причинам тесты на устойчивость, использующие два типа клеток, могут быть осуществлены путем сокультивирования двух типов клеток в качестве альтернативы заражения второго типа клетки вирусными частицами, получаемыми из супернатантов первого типа клеток. Что касается теста на чувствительность и устойчивость, не основанного на частице, тесты на устойчивость осуществляли путем трансфекции единственной хозяйской клетки с резистентным тествектором в отсутствие упаковывающих экспрессионных векторов. Тесты на устойчивость, не основанные на частице, осуществляли с использованием резистентных тест-векторов, включающих нефункциональные индикаторные гены с любыми пермутированными промоторами, пермутированными кодирующими областями или инвертированными интронами. Эти тесты на устойчивость, не основанные на частице, осуществляли путем трансфекции единственной хозяйской клетки с каждым резистентным тествектором в отсутствие упаковывающих экспрессионных векторов. Хотя нефункциональные индикаторные гены, содержащиеся в этих резистентных тест-векторах, эффективно не экспрессируются при трансфекции хозяйских клеток, отмечается детектируемая экспрессия индикаторного гена, происходящая от обратной транскрипции, не основанной на вирусной частице. Обратная транскрипция и перенос цепи заканчиваются преобразованием пермутированного, нефункционального индикаторного гена в не перкутированный функциональный индикаторный ген. Поскольку обратная транскрипция полностью зависит от экспрессии гена роl, содержащегося в каждом резистентном тест-векторе, противовирусные агенты можно тестировать на их способность ингибировать продукты гена роl, кодируемые в сегментах, производимых пациентом, содержащихся в резистентных тест-векторах. Что касается HIV, обратная транскрипция и перенос цепи заканчивается преобразованием нефункционального индикаторного гена в функциональный индикаторный ген. Поскольку обратная транскрипция полностью зависит от экспрес-26 005426 сии сегмента, производимого пациентом, содержащегося в каждом резистентном тест-векторе, противовирусные агенты можно тестировать по их способности ингибировать продукты данного гена, кодируемого в сегментах, производимых пациентом, содержащихся в резистентных тест-векторах. Упаковывающие хозяйские клетки трансфицировали резистентным тест-вектором и соответствующим упаковывающим экспрессионным вектором(ами), чтобы получить хозяйские клетки с резистентным тест-вектором. Индивидуальные противовирусные агенты, в том числе ингибиторы обратной транскриптазы AZT, ddI, ddC, d4T и 3 ТС и протеазные ингибиторы саквинавир, ритонавир и индинавир, а также их сочетания, добавляли в индивидуальные чашки с упаковывающими хозяйскими клетками во время их трансфекции в ряду соответствующих концентраций. Через 24-48 ч после трансфекции, хозяйские клетки-мишени инфицировали путем сокультивирования с хозяйскими клетками с резистентным тествектором или с вирусными частицами с резистентным тест-вектором, полученными из отфильтрованных супернатантов хозяйских клеток с резистентным тест-вектором. Каждый противовирусный агент или их сочетание добавляли к хозяйским клеткам-мишеням перед или во время заражения до получения одной и той же конечной концентрации данного агента или агентов, наличествующих в течение трансфекции. Определение экспрессии или ингибирования индикаторного гена в хозяйских клетках-мишенях,инфицированных сокультивированием или фильтрованными вирусными супернатантами, осуществляли путем анализа экспрессии индикаторного гена, например, в отношении индикаторного гена, который представляет собой ген luc жука-светляка, путем измерения активности люциферазы. Снижение активности люциферазы наблюдали для хозяйских клеток-мишеней, инфицированных данным препаратом вирусных частиц с резистентным тест-вектором в присутствии данного противовирусного агента или агентов, по сравнению с контролем, выполняемом в отсутствие противовирусного агента, в основном связанного с log-концентрацией противовирусного агента в виде сигмоидальной кривой. Эту кривую ингибирования использовали для вычисления истинной ингибирующей концентрации (IC) этого агента или сочетание агентов, действующих на продукт вируса-мишени, кодируют в сегментах, производимых пациентом, присутствующих в резистентном тест-векторе. Что касается теста на чувствительность и устойчивость для одной клетки, то хозяйские клетки трансфицировали резистентным тест-вектором и соответствующим упаковывающим экспрессионным вектором(ами), чтобы получить хозяйские клетки с резистентным тест-вектором. Индивидуальные противовирусные агенты или их сочетания вносили в чашки с трансфицируемыми клетками во время их трансфекции, в ряду соответствующих концентраций. Через 24-72 ч после трансфекции клетки собирали и анализировали на активность люциферазы жука-светляка. Поскольку трансфицированные клетки в культуре эффективно не экспрессируют индикаторный ген, трансфицированные клетки в культуре, как и суперинфицированные клетки в культуре, могут служить в качестве хозяйских клеток-мишеней для экспрессии индикаторного гена. Снижение люциферазной активности, наблюдаемое для клеток, трансфицированных в присутствии данного противовирусного агента или агентов, в сравнении с контролем, выполняемом в отсутствие противовирусного агента(ов), в основном относится к log-концентрации противовирусного агента в виде сигмоидальной кривой. Эту кривую ингибирования использовали для вычисления истинной ингибирующей концентрации (IC) агента, или сочетания агентов, для продукта вирусамишени, кодируемого в сегментах, производимых пациентом, присутствующих в резистентном тествекторе. Кандидаты в противовирусные лекарственные препараты/лекарственные препараты Противовирусные лекарственные препараты, которые вносили в тест-систему, добавляли в определенные моменты в зависимости от мишени для противовирусного препарата. Например, в отношенииHIV-протеазных ингибиторов, включающих саквинавир, ритонавир, индинавир и нелфинавир, их добавляли в индивидуальные чашки с упаковывающими хозяйскими клетками во время их трансфекции резистентным тест-вектором. HIV-протеазные ингибиторы добавляли также к хозяйским клеткам-мишеням во время инфицирования для получения той же конечной концентрации, что и при добавлении в течение трансфекции. HIV-ингибиторы обратной транскриптазы, включающие AZT, ddI, ddС, d4T, 3TC и неварипин, вносили в индивидуальные планшеты с хозяйскими клетками-мишенями во время инфицирования с помощью вирусных частиц с резистентным тест-вектором в испытуемой концентрации. Альтернативно, противовирусные лекарственные препараты могут присутствовать на протяжении анализа. Испытуемую концентрацию выбирали из ряда концентраций, которые обычно находятся между около 0,1 нМ и около 100 М и более точно для каждого из следующих лекарственных препаратов: AZT от около 1 нМ до около 5 М; ddI от около 1 нМ до около 25 М; 3 ТС от около 1 нМ до около 50 М; d4T от около 1 нМ до около 25 М и неварипина от около 1 нМ до около 100 М. В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединение тестировали в опыте настоящего изобретения на лекарственную чувствительность и устойчивость. Противовирусное соединение-кандидат добавляли к тест-системе в соответствующей концентрации в определенные моменты в зависимости от белка-мишени противовирусного кандидата. Альтернативно, можно протестировать более чем одно противовирусное соединение-кандидат или можно протестировать противовирусное соединение-кандидат в сочетании с утвержденным противовирусным лекарственным препаратом, таким какAZT, ddI, ddC, d4T, 3 ТС, саквинавир или соединение, которое подвергали клиническим испытанием, та-27 005426 кое как ритонавир или индиновир. Эффективность противовирусного кандидата оценивали путем измерения экспрессии или ингибирования индикаторного гена. В другом аспекте этого варианта осуществления настоящего изобретения тест на лекарственную чувствительность и устойчивость можно использовать для скринирования вирусных мутантов. После идентификации устойчивых мутантов к любому известному противовирусу или кандидату в противовирусы, устойчивые мутанты выделяли и анализировали их ДНК. Можно собрать, таким образом, библиотеку устойчивых мутантов, облегчающую скринирование кандидатов в противовирусы, поодиночке или в сочетании. Рядовому специалисту в данной области это поможет идентифицировать эффективные противовирусы и создать эффективные терапевтические режимы. Общие материалы и методы Большинство методик, используемых для конструирования векторов и трансфектных, и зараженных клеток, широко практикуются в данной области, и большинство практиков хорошо знакомы со стандартными материальными средствами, которые описывают специальные условия и методики. Однако для удобства нижеследующие параграфы могут служить в качестве ориентира."Плазмиды" и "векторы" обозначили с помощью строчной буквы р с последующими буквами и/или числами. Исходные плазмиды представляют собой здесь любые коммерчески доступные, доступные всем без ограничений или могут быть сконструированы из доступных плазмид в соответствии с опубликованными методиками. Кроме того, плазмиды, эквивалентные описанным, известны в данной области и знакомы рядовым младшим специалистам. Для конструкции векторов настоящего изобретения использовали методики стандартного лигирования и рестрикции, хорошо известные в данной области (см. Ausubel с соавт., (1987) Current Protocols inMolecular Biology, Wiley - Interscience or Maniatis с соавт., (1992) в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.). Выделяемые плазмиды, последовательности ДНК или синтезированные олигонуклеотиды очищали, метили и классифицировали в желаемой форме. Последовательности из всех ДНК-конструктов, включающих синтетическую ДНК, подтверждали анализом секвенирования ДНК (Sanger с соавт., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467)."Гидролитическое расщепление" ДНК относится к каталитическому расщеплению ДНК ферментом рестрикции, который действует только на некоторые последовательности, сайты рестрикции в ДНК. Различные ферменты рестрикции, используемые здесь, коммерчески доступны, и условия их реакции, кофакторы и другие требования известны рядовым младшим специалистам. Для аналитических целей,обычно, использовали 1 г плазмиды или ДНК-фрагмента с около 2 единицами фермента в около 20 л буферного раствора. Альтернативно, использовали избыток рестрикционного фермента, чтобы гарантировать полное гидролитическое расщепление ДНК-субстрата. Подходящее для обработки время инкубации составляет от около 1 до 2 ч при около 37 С, хотя допустимы вариации. После каждой инкубации белок удаляли путем экстракции смесью фенол/хлороформ, и возможной последующей эфирной экстракцией, а полученную нуклеиновую кислоту извлекали из водных фракций путем осаждения этанолом. При необходимости разделение по размеру расщепленных фрагментов можно осуществлять электрофорезом в полиакриламидном геле или агарозном геле с использованием стандартных методик. Общее описание разделения по размеру находится в Methods of Enzymology 65:499-560 (1980). Рестрикционно расщепленные фрагменты могут быть затуплены по концам путем обработки большим фрагментом ДНК-полимеразы I (Клнов) E.Coli в присутствии четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) в периоды инкубации от около 15 до 25 мин при 20 С в 50 мМ Трис (рН 7,6) 50 мМ NaCl, 6 мМ MgCl2, 6 мМ DTT и 5-10 мМ dNTP. Фрагмент Кленова достраивает 5'-липкие концы, но уничтожает выступающие 3'-одиночные цепи, даже в присутствии четырех dNTP. При желании можно осуществить селективную репарацию путем снабжения лишь одного из dNTP или с выбранными dNTP в ограниченных рамках, диктуемых природой липких концов. После обработки фрагментом Кленова, полученную смесь экстрагировали смесью фенол/хлороформ и осаждали этанолом. В соответствующих условиях обрабатывали нуклеазой S1 или Bal-31, подвергая гидролизу любую одноцепочечную часть. Лигирования осуществляли в объемах 15-50 л при следующих стандартных условиях и температурах: 20 мМ Трис-НСl рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 33 мг/мл BSA, 10 мМ-50 мМ NaCl и либо 40 мМ АТР, 0,01-0,02 (Weiss) единиц ДНК-лигазы Т 4 при 0 С (для лигирования "липкого конца"), либо 1 мМ АТР, 0,3-0,6 (Weiss) единиц ДНК-лигазы Т 4 при 14 С (для лигирования "тупого конца"). Межмолекулярные лигирования "липкого конца" обычно осуществляют при концентрациях 33-100 г/мл общей ДНК(5-100 мМ общая конечная концентрация). Межмолекулярные лигирования тупого конца (обычно использующие 10-30-кратный молярный избыток линкеров) осуществляют при 1 мМ общей конечной концентрации."Временная экспрессия" относится к неамплифицируемой экспрессии в пределах от одного дня до двух недель трансфекции. Оптимальное время для временной экспрессии отдельного требуемого гетерологичного белка может варьировать в зависимости от нескольких факторов, включающих, например,любые трансдействующие факторы, которые можно использовать, трансляционные контрольные механизмы и хозяйскую клетку. Временная экспрессия случается, когда отдельная плазмида, которая осуществляла трансфекционные функции, т.е. транскрибируется и транслируется. В течение этого времени-28 005426 плазмидная ДНК, которая проникла в клетку, перемещается в ядро. Данная ДНК, находящаяся в неинтегрированном состоянии, свободна в рамках данного ядра. Транскрипция данной плазмиды, поглощенной данной клеткой, происходит в течение этого периода. После трансфекции плазмидная ДНК может становится деградированной или разбавленной вследствие клеточного деления. В клеточном хроматине происходит и случайная интеграция. Обычно, векторы, содержащие промоторы и контрольные последовательности, которые получены от видов совместимых с хозяйской клеткой, использовали в отдельной хозяйской клетке. Промоторы,подходящие для использования с прокариотическими хозяевами, иллюстративно включают беталактамазную и лактозную промоторные системы, промоторную систему щелочной фосфатазы, триптофана (trp) и гибридные промоторы, такой как tac-промотор. Однако подходят и другие функциональные бактериальные промоторы. Кроме прокариот, могут использоваться микробы-эукариоты, такие как дрожжевые культуры. Saccharomyces cerevisiae или обычные хлебопекарные дрожжи представляют собой наиболее обычный эукариотический микроорганизм, хотя всегда доступен и ряд других штаммов. Промоторы, контролирующие транскрипцию из векторов в хозяйских клетках млекопитающих, могут быть получены из разных источников, например из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, обезьяний вирус 40 (SV40), аденовирус, вирус гепатита В и предпочтительно цитомегаловирус, или из гетерологичных промоторов млекопитающих, например b-актинового промотора. Удобны ранний и поздний промоторы вируса SV40, получаемые в виде SV40-рестрикционного фрагмента, который также содержит вирусный SV40-ориджин репликации. Предранний промотор цитомегаловируса человека удобно получать в виде Е-рестрикционного фрагмента HindIII. Разумеется, промоторы хозяйской клетки или близких видов также используются здесь. Используемые здесь векторы могут содержать селективный ген, именуемый также селективный маркер. Селективный ген кодирует белок, необходимый для выживаемости или роста хозяйской клетки,трансформируемой вектором. Примеры подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих включают ген дигидрофолатредуктазы, ген орнитиндекарбоксилазы, множественный ген лекарственной устойчивости (mdr),ген аденозиндезаминазы и ген глутаминсинтазы. Когда такие селективные маркеры успешно переносят в хозяйскую клетку млекопитающего, трансформируемая хозяйская клетка млекопитающего может выживать при помещении под селективный пресс. Существуют две широко используемые отличающиеся категории селективных режимов. Первая категория основывается на метаболизме клетки и использует мутантную клеточную линию, которая утратила способность к росту независимо от дополнительной среды. Вторая категория отнесена к доминантной селекции, которая относится к схеме селекции, используемой для любого типа клетки и не требует применения мутантной клеточной линии. В этих схемах обычно используется лекарственное средство для задержки роста хозяйской клетки. Те клетки, которые обладают новым геном, будут экспрессировать белок, сообщающий лекарственную устойчивость, и будут выживать при селекции. Примерами такой доминантной селекции является использование лекарственного препарата неомицина (Southern and Berg (1982) J. Volec. Appi. Genet. 1, 327), микофеноловой кислоты(Mulligan and Berg (1980) Science 209, 1422), или гигромицина (Sugden с соавт., (1985) Mol. Cell. Biol. 5,410-413). В трех примерах, приведенных выше, используют бактериальные гены под эукариотическим контролем для сообщения устойчивости, присущей, соответственно, лекарственному средству неомицину (G418 или гентицин), xgpt (микофеноловая кислота) или гигромицину."Трансфекция" означает введение ДНК в хозяйскую клетку таким образом, чтобы данная ДНК экспрессировалась независимо от того, экспрессируется ли она функционально или иначе; данная ДНК может также реплицироваться либо в качестве внехромосомного элемента, либо путем хромосомного слияния. Если не оговорено особо, метод, используемый здесь для трансформации хозяйской клетки, представляет собой кальций-фосфатный метод Graham и van der Eb (1973) Virology 52, 456-457. Альтернативными методами трансфекции являются электропорация, DEAE-декстрановый метод, липофекция и биологическая бомбардировка (Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, StocktonPress). Хозяйские клетки могут быть трансфицированы экспрессионными векторами настоящего изобретения и культивированы в традиционной питательной среде, модифицированной, чтобы подходила для индуцирующихся промоторов, селектирующихся трансформантов или амплифицирующихся генов. Хозяйские клетки культивировали в F12:DMEM (Gibco) 50:50 с добавлением глутамина и без антибиотиков. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобное, представляют собой условия,ранее использовавшиеся для хозяйской клетки, селектируемой по экспрессии, и являются очевидными для рядовых младших специалистов. Нижеследующие примеры лишь иллюстрируют лучший ныне известный способ для применения на практике настоящего изобретения, и не должны создавать ограничение настоящему изобретению. Все литературные ссылки точно включены путем ссылки.-29 005426 Пример 1. Тест на лекарственную чувствительность и устойчивость HIV с использованием резистентных тест-векторов, включающих сегмент(ы), производимый пациентом, и нефункциональный индикаторный ген А с А-пермутированным промотором. Индикаторный ген вирусного вектора. Конструирование. Вирусные векторы с индикаторным геном, содержащие нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, создавали с использованием геномного и субгеномного вирусных векторов HIV, включающих вирусные гены, которые представляют собой мишень(и) для противовирусных лекарственных препаратов. Вирусные векторы с индикаторным геном pLG-lucPP и pCG-lucPP основываются на геномных вирусных векторах pLG и PCG; каждый несет делению в гене env HIV. Резистентные тест-векторы получали из геномного индикаторного гена вирусных векторов, pLG-lucPP и pCGlucPP, содержащие акцепторный сайт последовательности пациента для инсерции сегмента, производимого пациентом, и использовали во взаимодействии с упаковывающим экспрессионным вектором, кодирующим продукт гена env амфотропного MLV 4070A. Вирусные векторы, с индикаторным геном, pLSlucPP и pCS-lucPP основаны на субгеномных векторах pLS и pCS; каждый кодирует только ген gag-polHIV. Резистентные тест-векторы получали из субгеномного индикаторного гена вирусных векторов,pLCS-lucPP и pCS-lucPP, содержащих акцепторный сайт последовательности для инсерции сегмента,производимого пациентом, и использовали во взаимодействии с первым упаковывающим экспрессионным вектором, кодирующим гены vif, vpr, tat, rev, vpu, nef, и вторым упаковывающим вектором, кодирующим продукт гена env амфотропного MLV 4070A. Вирусные векторы HIV - геномный и субгеномный. Вирусные векторы HIV конструировали с использованием последовательностей из биологически активного провирусного клона НХВ 2 (Fisher с соавт. (1986) Nature 320, 367-371). Сконструировали два типа вирусного вектора: геномные вирусные векторы с делениями по единственному гену, такому какenv, но который иначе предохраняет экспрессию мРНК и характеристики процессирования полного вируса, и субгеномные вирусные векторы, которые могут включать один или несколько генов, которые представляют собой типичные специфические мишени, тестирующиеся на чувствительность и устойчивость, такой как gag-pol, или которые могут утрачивать вирусные гены в совокупности. Оба типа векторов обладают уникальным сайтом рестрикции в рамках вирусного генома для инсерции кассеты индикаторного гена, а также акцепторными сайтами последовательности пациента, т.е. дополнительными уникальными сайтами рестрикции вблизи или в противовирусном мишенном гене (например, роl), чтобы дать возможность инсерцировать последовательности, производимые пациентом. Кроме того, оба типа вектора конструировали, чтобы вставить любой свой энхансер-промотор из U3-области HIV-LTR или чужой энхансер-промотор из предранней (IE) области CMV. Для конструирования плазмидных ДНК использовали стандартные методы (Ausubel с соавт. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, WileyInterscience). Последовательности всех ДНК-конструктов, включающих синтетическую ДНК, подтверждали анализом секвенирования ДНК (Sanger с соавт. (1977) Proc. Natl, Acad, Sci. 74, 5463-5467). Последовательности HIV получали из плазмиды pBS-HIV (Page с соавт. (1990) J. Virol. 64, 52705276), которая содержит провирусную ДНК-последовательность НХВ 2 в рестрикционном фрагменте(Stratagene, San Diego, CA). Поскольку этот провирусный клон содержит неохарактеризованную, фланкирующую человеческую ДНК из сайта провирусной интеграции, использовали две стадии сайтнаправленного мутагенеза для удаления таких последовательностей с использованием плазмиды pBSHIV в качестве матрицы. На первой стадии человеческие последовательности, примыкающие к 5'-LTR,удаляли с использованием олигонуклеотида 1, который содержит нижеследующие последовательности в направлении 5' к 3': 1) последовательность, комплементарную первым 18 нуклеотидам интегрированного провируса, в левой U3-области, 2) 6-нуклеотидный SmaI-сайт, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную области в pBluescript KS(+) сразу за полилинкером и промотором фага Т 3. На второй стадии человеческие последовательности, примыкающие к 5'-LTR, удаляли с использованием олигонуклеотида 2, который содержит следующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную области в pBluescript KS(+) сразу за PvuI-сайтом, в гене LacZ, 2) шестинуклеотидный XbaI-сайт, и 3) последовательность, комплементарную последним 18 нуклеотидам интегрированного провируса, в правой U5-области. Результирующую плазмиду назвали pBS-HXB2. Геномный и субгеномный вирусные векторы, использующие U3-область HIV-LTR в качестве энхансер-промотора для экспрессии противовирусных мишенных генов (фиг. 1), каждый, получали из плазмиды pBS-HXB2 с помощью единственной стадии сайт-направленного мутагенеза. Геномный вирусный вектор pLG, который делегировали по гену env, готовили с использованием олигонуклеотида 3,который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям 7626-7463 НХВ 2 в гене env (все координаты для НХВ 2 приведены по ссылке GenBank, инвентарный номер К 03455), 2) 8-нуклеотидный NotI-сайт, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям 6384-6401 НХВ 2 в гене env. Субгеномный вирусный вектор pLS, который делегировали по генам env, tat, rev, vif, vpr и vpu, готовили с использованием олигонуклеотида 4, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную по-30
МПК / Метки
МПК: C12Q 1/02, C12N 15/49
Метки: соединению, чувствительности, применения, способы, противовирусному, лекарственному, вируса, определения, векторы
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-5426-vektory-dlya-opredeleniya-chuvstvitelnosti-virusa-k-protivovirusnomu-lekarstvennomu-soedineniyu-i-sposoby-ih-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному соединению и способы их применения</a>
Мутантный il-6 человека и его внутренний фрагмент, кодирующие их последовательности днк, способы их получения, содержащие их фармацевтические композиции, содержащие их векторы, линии клеток- хозяев испособ лечения il-6 опосредованных заболеваний
Номер патента: 852
Опубликовано: 26.06.2000
Авторы: Гротзингер Йоахим, Розе-Йон Штефан, Элерс Марк
МПК: A61P 19/10, A61K 38/20, A61P 35/00...
Метки: заболеваний, человека, фрагмент, испособ, векторы, днк, хозяев, способы, содержащие, фармацевтические, последовательности, внутренний, клеток, опосредованных, линии, кодирующие, лечения, композиции, мутантный, получения
Формула / Реферат:
1. Мутантный интерлейкин-6 (IL-6) человека, имеющий аминокислотную последовательность содержащую следующие точечные мутации по сравнению с природным IL-6 человека: Pro 54, Glu 159, Pro 162, Leu 170 и Аrg 176. 2. Внутренний фрагмент мутантного IL-6 человека по п.1 формулы, обладающий аналогичной биологической активностью. 3. Последовательность ДНК, кодирующая мутантный IL-6 человека по п.1 формулы. 4. Последовательность ДНК, кодирующая...
Протеинкиназа candida albicans, обладающая активностью фосфорилирования циклинзависимых протеинкиназ, и способы ее применения
Номер патента: 4710
Опубликовано: 24.06.2004
Авторы: Манн Карл, Фай Жерар, Тюре Жан-Ив, Валей Жан Габриель
МПК: C12N 9/12
Метки: candida, обладающая, протеинкиназ, albicans, фосфорилирования, циклинзависимых, активностью, способы, применения, протеинкиназа
Формула / Реферат:
1. Протеинкиназа, полученная из Candida albicans, выбранная из протеинкиназы, имеющей последовательность SEQ ID NO:2, и ее аллельные варианты, и определяемая следующими характеристиками: в ней отсутствует звено GxGx(Y/F)GxV, в котором G обозначает глицин, x обозначает какую-либо аминокислоту, Y/F обозначает либо тирозин, либо фенилаланин, V обозначает валин; она обладает активностью фосфорилирования циклинзависимых протеинкиназ (Цзк). 2....
Устройства для доставки лекарств с пролонгированным высвобождением, способы применения и способы их изготовления
Номер патента: 4980
Опубликовано: 28.10.2004
МПК: A61K 9/00
Метки: способы, лекарств, высвобождением, применения, устройства, доставки, изготовления, пролонгированным
Формула / Реферат:
1. Система доставки лекарства с пролонгированным высвобождением, включающая в себя внутреннее лекарственное ядро, содержащее терапевтически эффективное количество агента, эффективного для получения желаемого местного или системного физиологического или фармакологического эффекта; внутреннюю трубку, не проницаемую для прохождения указанного агента, где указанная внутренняя трубка имеет первый и второй концы и покрывает по меньшей мере часть...
Аморфные бензотиофены, способы получения и способы применения
Номер патента: 2022
Опубликовано: 24.12.2001
Авторы: Кафф Джордж В., Таккар Арвинд Л.
МПК: C07D 333/52, A61K 31/381, A61P 19/08...
Метки: применения, аморфные, способы, получения, бензотиофены
Формула / Реферат:
1. Аморфная форма гидрохлорида 6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-3-[4-(2-пиперидинилэтокси)бензоил]бензо[b]тиофена формулы или его фармацевтически приемлемого сольвата. 2. Способ получения аморфной формы гидрохлорида 6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-3-[4-(2-пиперидинилэтокси)бензоил]бензо[b]тиофена формулы или его фармацевтически приемлемого сольвата, который включает получение раствора кристаллической формы гидрохлорида соединения формулы I в...
Легкие экструдированные композиции, содержащие легкий экструдируемый керамический носитель, способы их применения и способы их приготовления
Номер патента: 3033
Опубликовано: 26.12.2002
Авторы: Кимпара Масаоми, Сузуки Мунехиро, Такаянаги Нориказу
МПК: A01N 25/08
Метки: композиции, экструдированные, керамический, экструдируемый, приготовления, применения, способы, содержащие, легкие, носитель, легкий
Формула / Реферат:
1. Легкая экструдированная композиция, которая включает, по меньшей мере, одно соединение сельскохозяйственного назначения, легкий экструдируемый керамический носитель и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество. 2. Композиция по п.1, которая далее включает минеральный носитель и связующее вещество. 3. Композиция по п.2, которая включает в пересчете на массу от примерно 0,5 до 75% одного или нескольких соединений...
Предыдущий патент: Способы получения мембранных везикул
Следующий патент: Способ и устройство для выращивания растений
Случайный патент: Способ получения вируса или вирусного белка для получения вакцины