Ген streptomyces avermitilis, контролирующий соотношение авермектинов b2:b1

1 1. Область изобретения Настоящее изобретение относится к композициям и способам получения авермектинов и, прежде всего, к области охраны здоровья животных. Более конкретно настоящее изобретение относится к полинуклеотидным молекулам,содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие генный продукт AveC, которых можно использовать для модулирования соотношения авермектинов классов 2:1, продуцируемых посредством ферментации культурStreptomyces avermitilis, и к композициям и способам скрининга таких полинуклеотидных молекул. Кроме того, настоящее изобретение относится к векторам, трансформированным клеткам-хозяевам и новым мутантным штаммамS.avermitilis, у которых ген aveC мутирован таким образом, чтобы модулировать соотношение продуцируемых авермектинов классов 2:1. 2. Предпосылки изобретения 2.1. Авермектины Виды Streptomyces продуцируют широкое разнообразие вторичных метаболитов, включая авермектины, которые составляют группу из восьми родственных шестнадцатичленных макроциклических лактонов, обладающих сильной антигельминтной и инсектицидной активностью. Эти восемь различных, но близкородственных соединений называют А 1 а, A1b, A2a,A2b, В 1 а, В 1b, В 2 а и В 2b. Ряд соединений а относится к природному авермектину, где заместитель в положении С 25 представляет собой(S)-втор-бутил, а ряд b относится к тем соединениям, где заместитель в положении С 25 представляет собой изопропил. Обозначения А и В относятся к авермектинам, где заместитель в положении С 5 представляет собой метокси и гидрокси соответственно. Цифра 1 относится к авермектинам, где в положении С 22,23 присутствует двойная связь, а цифра 2 относится к авермектинам, имеющим водород в положении С 22 и гидрокси в положении С 23. Среди родственных авермектинов тип авермектина В 1 признают обладающим наиболее эффективной противопаразитной и пестицидной активностью, и, следовательно, авермектином,наиболее желательным с коммерческой точки зрения. Авермектины и их получение с помощью аэробной ферментации штаммов S.avermitilis описаны в патентах США 4310519 и 4429042. Считают, что биосинтез природных авермектинов инициируется эндогенно с СоА (кофермент А)-тиоэфирных аналогов изомасляной кислоты и S-(+)-2-метилмасляной кислоты. Комбинация как модификации штаммов посредством неспецифического мутагенеза, так и использования добавляемых экзогенно жирных кислот привела к эффективной продукции авермектиновых аналогов. Мутанты S. avermitilis, которые являются дефектными по 2 оксокислота с разветвленной цепью 004569 2 дегидрогеназе (bkd-дефектные мутанты), могут продуцировать авермектины только тогда, когда при ферментации добавляют жирные кислоты. Скрининг и выделение мутантов, дефектных по активности дегидрогеназы разветвленной цепи(например, S.avermitilis, ATCC (Американская коллекция типовых культур) 53567), описаны в европейском патенте 276103. Ферментация таких мутантов в присутствии добавляемых экзогенно жирных кислот приводит в результате к продукции только четырех авермектинов, соответствующих используемой жирной кислоте. Так, добавление S-(+)-2-метилмасляной кислоты при ферментации S.avermitilis (ATCC 53567) приводит в результате к продукции природных авермектинов А 1 а, А 2 а, В 1 а и В 2 а; добавление при ферментации изомасляной кислоты приводит в результате к продукции природных авермектинов A1b, A2b, B1b и В 2b; и добавление при ферментации циклопентанкарбоновой кислоты приводит в результате к продукции четырех новых циклопентилавермектинов А 1, А 2,В 1 и В 2. Если добавлять другие жирные кислоты,продуцируются новые авермектины. С помощью скрининга более 800 потенциальных предшественников идентифицировали более 60 других новых авермектинов (см., например,Dutton et al., 1991, J. Antibiot. 44: 357-365 иBanks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147: 16-26). Кроме того, мутанты S.avermitilis, дефектные по активности 5-О-метилтрансферазы, продуцируют, по существу, только В-аналогичные авермектины. Следовательно, мутанты S.avermitilis,у которых отсутствуют обе активности: 2 оксокислота с разветвленной цепьюдегидрогеназы и 5-О-метилтрансферазы, продуцируют только В авермектины, соответствующие жирной кислоте, используемой для добавления при ферментации. Так, добавление S-(+)2-метилмасляной кислоты к таким двойным мутантам приводит в результате к продукции только природных авермектинов В 1 а и В 2 а, тогда как добавление изомасляной кислоты или циклопентанкарбоновой кислоты приводит в результате к продукции природных авермектинов В 1b и В 2b или новых циклопентилавермектинов В 1 и В 2 соответственно. Добавление циклогексанкарбоновой кислоты к двойному мутантному штамму является предпочтительным способом продукции важного с коммерческой точки зрения нового авермектина, циклогексилавермектина В 1 (дорамектина). Выделение и характеристики таких двойных мутантов, например S.avermitilis (ATCC 53692), описаны в ЕР 276103. 2.2. Гены, вовлеченные в биосинтез авермектинов Во многих случаях гены, вовлеченные в продукцию вторичных метаболитов, и гены,кодирующие конкретный антибиотик, обнаружены на хромосоме вместе в виде кластеров. 3 Таким случаем является, например, кластер генов поликетидсинтазы (PKS) Streptomyces (см.Hopwood and Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 37-66). Так, одной из стратегий клонирования генов в биосинтетическом пути являлось выделение гена устойчивости к лекарствам, а затем тестирование прилежащих районов хромосомы на другие гены, относящиеся к биосинтезу данного конкретного антибиотика. Другой стратегией клонирования генов, вовлеченных в биосинтез важных метаболитов, являлась комплементация мутантов. Например, части библиотеки ДНК из организма, способного к продукции конкретного метаболита, вводят в непродуцирующий мутант и проводят скрининг трансформантов на продукцию этого метаболита. Кроме того, для идентификации и клонирования генов в биосинтетических путях применяли гибридизацию библиотеки, используя зонды, имеющие происхождение от других видовStreptomyces. Гены, вовлеченные в биосинтез авермектинов (гены ave), подобно генам, необходимым для биосинтеза других вторичных метаболитовStreptomyces (например, PKS), обнаружены на хромосоме в виде кластеров. Ряд генов ave успешно клонировали, используя векторы для комплементации мутантов S.avermitilis, у которых блокирован биосинтез авермектинов. Клонирование таких генов описано в патенте США 5252474. Кроме того, Ikeda et al., 1995, J. Antibiot. 48: 532-534, описывают локализацию хромосомного района, вовлекающего стадию дегидратации С 22,23 (aveC), в фрагменте ВаmHIaveC, которые приводят в результате к получению продуцента одного компонента В 2 а. Поскольку ивермектин, сильнодействующее антигельминтное соединение, можно получить химическим путем из авермектина В 2 а, такой однокомпонентный продуцент авермектина В 2 а считают особенно полезным для коммерческого получения ивермектина. Идентификация мутаций в гене aveC, которые минимизируют сложность продукции авермектинов, таких как, например, мутации,которые снижают соотношение авермектинов В 2:В 1, должно облегчить получение и очистку важных с коммерческой точки зрения авермектинов. 3. Краткое изложение сущности изобретения Согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая полноразмерную открытую рамку считывания (ОРС) aveC S.avermitilis или ее существенную часть, причем в этой выделенной полинуклеотидной молекуле отсутствует следующая полноразмерная ОРС, которая локализована in situ на хромосоме S.avermitilis в прямом направлении от ОРС aveC. Эта выделенная полинуклеотидная молекула по настоя 004569 4 щему изобретению предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, которая является такой же, как последовательность плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующая генный продукт AveC S.avermitilis, или которая является такой же, как нуклеотидная последовательность ОРС aveC фиг. 1 (SEQ ID NO:1) либо ее существенная часть. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ IDNO:1 или ее вырожденный вариант. Далее, согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, имеющая нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной последовательности плазмиды pSE186 (ATCC 209604),кодирующей генный продукт AveC S.avermitilis,или нуклеотидной последовательности ОРСaveC, представленной на фиг. 1 (SEQ ID NO:1),либо ее существенной части. Далее, согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид,имеющий аминокислотную последовательность,которая является гомологичной аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью плазмиды pSE186 (ATCC 209604),кодирующей генный продукт AveC, или аминокислотной последовательности фиг. 1 (SEQ IDNO:2) либо ее существенной части. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт-гомолог AveC. В предпочтительном воплощении эта выделенная полинуклеотидная молекула содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продуктгомолог AveC из S.hygroscopicus, причем этот генный продукт-гомолог содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или ее существенную часть. В предпочтительном воплощении эта выделенная полинуклеотидная молекула по настоящему изобретению, которая кодирует генный продукт-гомолог AveCS.hygroscopicus, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 или ее существенную часть. Далее, согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной нуклеотидной последовательности S. hygroscopicusSEQ ID NO:3. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, который является гомологичным генному продукту-гомологуS.hygroscopicus, 5 имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. Далее, согласно настоящему изобретению предложены олигонуклеотиды, которые гибридизуются с полинуклеотидной молекулой,имеющей нуклеотидную последовательность фиг. 1 (SEQ ID NO:1) или SEQ ID NO:3, или с полинуклеотидной молекулой, имеющей нуклеотидную последовательность, которая является комплементом нуклеотидной последовательности фиг. 1 (SEQ ID NO:1) или SEQ ID NO:3. Далее, согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантные векторы для клонирования и векторы экспрессии, которые являются полезными при клонировании или экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению, включая полинуклеотидные молекулы, содержащие ОРС aveC S.avermitilis или ОРС гомолога aveC. В неограничивающем воплощении согласно настоящему изобретению предложена плазмида pSE186 (ATCC 209604), которая содержит полноразмерную ОРС гена aveCS.avermitilis. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены трансформированные клетки-хозяева, содержащие полинуклеотидную молекулу или рекомбинантный вектор по изобретению, и новые штаммы или клеточные линии, имеющие происхождение от них. Далее, согласно настоящему изобретению предложен экспрессированный рекомбинантным путем генный продукт AveC или генный продукт-гомолог AveC либо его существенная часть, который был, по существу, очищен или выделен, а также его гомологи. Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ получения рекомбинантного генного продуктаAveC, при котором культивируют клеткухозяина, трансформированную рекомбинантным вектором экспрессии, причем указанный рекомбинантный вектор экспрессии содержит полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт AveC или генный продуктгомолог AveC, причем эта полинуклеотидная молекула находится в функциональной связи с одним или более чем одним регуляторным элементом, который контролирует экспрессию этой полинуклеотидной молекулы в клетке-хозяине,в условиях, благоприятных для продукции рекомбинантного генного продукта AveC или генного продукта-гомолога AveC, и выделяют генный продукт AveC или генный продукт-гомологAveC из этой клеточной культуры. Далее, согласно настоящему изобретению предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность,которая в других отношениях является такой же, как аллель AveC S.avermitilis либо последовательность плазмиды pSE186 (ATCC 209604),кодирующая генный продукт AveC, или ее вырожденный вариант, либо нуклеотидная последовательность ОРС aveC S.avermitilis, как пред 004569 6 ставлено на фиг. 1 (SEQ ID NO:1), или ее вырожденный вариант, но которая дополнительно содержит одну или более чем одну мутацию, так что клетки штамма S.avermitilis ATCC 53692, в которых аллель aveC дикого типа инактивирован, и которые экспрессируют полинуклеотидную молекулу, содержащую мутированную нуклеотидную последовательность, продуцируют иное соотношение или количество авермектинов, чем продуцируют клетки штаммаS.avermitilis ATCC 53692, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Согласно настоящему изобретению такие полинуклеотидные молекулы можно использовать для получения новых штаммов S.avermitilis,которые проявляют обнаружимое изменение продукции авермектинов по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммов S.avermitilis, которые продуцируют авермектины в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением у того же штамма, который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. В следующем предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммовS.avermitilis, которые продуцируют повышенные уровни авермектинов по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только единственный аллель aveC дикого типа. В следующем предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммов S.avermitilis, у которых ген aveC инактивирован. Согласно настоящему изобретению предложены способы идентификации мутаций ОРСaveC S.avermitilis, способных к изменению соотношения и/или количества продуцируемых авермектинов. В предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению, предложен способ идентификации мутаций ОРСaveC, способных к изменению соотношения классов 2:1 продуцируемых авермектинов, при котором (а) определяют соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, в которых нативный для него аллель aveC инактивирован и в которые ввели и экспрессируют в них полинуклеотидную молекулу, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированный генный продукт AveC; (б) определяют соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S.avermitilis, как на стадии (а), но которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа или ОРС фиг. 1 (SEQ ID NO:1), либо нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной им; и (в) сравнивают соотношение клас 7 сов 2:1 авермектинов, продуцируемых клеткамиS.avermitilis на стадии (б), так что, если соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis на стадии (а), отличается от соотношения классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis на стадии (б), то мутация ОРС aveC, способная к изменению соотношения классов 2:1 авермектинов, идентифицирована. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 авермектинов в результате мутации является сниженным. В следующем предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ идентификации мутаций ОРСaveC или генетических конструкций, содержащих ОРС aveC, способных к изменению количества продуцируемых авермектинов, при котором (а) определяют количество авермектинов,продуцируемых клетками штамма S.avermitilis,в которых нативный для него аллель aveC инактивирован и в которые ввели и экспрессируют в них полинуклеотидную молекулу, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированный генный продукт AveC, или содержащую генетическую конструкцию, в которую включена нуклеотидная последовательность, кодирующая генный продукт AveC; (б) определяют количество авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S. avermitilis, как на стадии (а), но которые вместо этого экспрессируют только единственный аллельaveC, имеющий нуклеотидную последовательность ОРС фиг. 1 (SEQ ID NO:1) либо нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной ей; и (в) сравнивают количество авермектинов,продуцируемых клеткамиS.avermitilis на стадии (а), отличается от количества авермектинов, продуцируемых клеткамиS.avermitilis на стадии (б), то мутация ОРС aveC или генетическая конструкция, способная к изменению количества авермектинов, идентифицирована. В предпочтительном воплощении количество продуцируемых авермектинов в результате мутации является повышенным. Далее, согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантные векторы, которые являются полезными для создания новых штаммов S.avermitilis, имеющих измененную продукцию авермектинов. Например, согласно настоящему изобретению предложены векторы,которые можно использовать, чтобы направлять любую из полинуклеотидных молекул, содержащих мутированные нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению, к сайту гена aveC хромосомы S.avermitilis, чтобы она 8 либо встраивалась в этот сайт, либо заменяла аллель aveC или ОРС, либо ее участок посредством гомологичной рекомбинации. Тем не менее, согласно настоящему изобретению полинуклеотидная молекула, содержащая мутированную нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, приведенную здесь,может также функционировать, чтобы модулировать биосинтез авермектинов, когда она встроена в хромосому S.avermitilis в ином сайте,чем сайт гена aveC, или когда она поддерживается в клетках S.avermitilis в эписомном состоянии. Таким образом, согласно настоящему изобретению также предложены векторы, содержащие полинуклеотидную молекулу, в которую включена мутированная нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению, причем эти векторы можно использовать для встраивания этой полинуклеотидной молекулы в иной сайт хромосомы S.avermitilis, чем генaveC, либо для поддержания ее в эписомном состоянии. В предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложены векторы замещения гена, которые можно использовать для встраивания мутированного аллеля aveC в хромосому S.avermitilis, чтобы создать новые штаммы из клеток, которые продуцируют авермектины в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Далее, согласно настоящему изобретению предложены способы создания новых штаммовS.avermitilis, содержащих клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC и которые продуцируют измененные соотношения и/или количества авермектинов по сравнению с клетками того же штамма S.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ создания новых штаммов S.avermitilis,содержащих клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC и которые продуцируют измененное соотношение классов 2:1 авермектинов по сравнению с клетками того же штамма S.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа,при котором клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором, который несет мутированный аллель aveC, который кодирует генный продукт, который изменяет соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, и отбирают трансформированные клетки, которые продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1, продуцируемым клетками штамма, которые вместо этого экспрессируют 9 аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 продуцируемых авермектинов в клетках нового штамма является сниженным. В следующем предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению,предложен способ создания новых штаммовS.avermitilis, содержащих клетки, которые продуцируют измененные количества авермектина,при котором клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором, который несет мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, экспрессия которого приводит в результате к измененному количеству авермектинов,продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC или эту генетическую конструкцию, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа,и отбирают трансформированные клетки, которые продуцируют авермектины в измененном количестве по сравнению с количеством авермектинов, продуцируемых клетками штамма,которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении количество продуцируемых авермектинов в клетках нового штамма является повышенным. В следующем предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ создания новых штаммовS.avermitilis, клетки которых содержат инактивированный аллель aveC, при котором клетки штамма S.avermitilis, которые экспрессируют любой аллель aveC, трансформируют вектором,который инактивирует аллель aveC, и отбирают трансформированные клетки, в которых аллельaveC инактивирован. Далее, согласно настоящему изобретению предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые трансформированы любой полинуклеотидной молекулой или любым вектором, содержащими мутированную нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению. В предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC вместо или кроме аллеля aveC дикого типа, где эти клетки нового штамма продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В более предпочтительном воплощении эти клетки нового штамма продуцируют авермектины в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Такие новые штаммы являются полезными в крупносерийном производстве 10 авермектинов, желательных с коммерческой точки зрения, таких как дорамектин. В следующем предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, вместо или кроме нативного для них аллеля aveC, что приводит в результате к продукции этими клетками измененного количества авермектинов по сравнению с количеством авермектинов, продуцируемым клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении эти новые клетки продуцируют повышенное количество авермектинов. В следующем предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, в которых ген aveC инактивирован. Такие штаммы являются полезными как для иного спектра авермектинов, который они продуцируют по сравнению со штаммом дикого типа, так и для скрининговых анализов на комплементацию, как описано здесь, чтобы определить, воздействует ли направленный или неспецифический мутагенез гена aveC на продукцию авермектинов. Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ получения авермектинов, при котором культивируют клетки штаммаS.avermitilis, которые экспрессируют мутированный аллель aveC, который кодирует генный продукт, который изменяет соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC, по сравнению с клетками того же штамма, которые не экспрессируют мутированный аллель aveC, но вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, в культуральных средах при условиях,которые дают возможность продукции из них авермектинов или индуцируют ее, и выделяют указанные авермектины из этой культуры. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемое клетками, экспрессирующими эту мутацию, является сниженным. Данный способ обеспечивает повышенную эффективность производства авермектинов, важных с коммерческой точки зрения, таких как дорамектин. Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ получения авермектинов, при котором культивируют клетки штаммаS.avermitilis, причем эти клетки экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, что приводит в результате к продукции измененного количества авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC или эту генети 11 ческую конструкцию, по сравнению с клетками того же штамма, которые не экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, но вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, в культуральных средах при условиях, которые дают возможность продукции из них авермектинов или индуцируют ее, и выделяют указанные авермектины из этой культуры. В предпочтительном воплощении количество авермектинов, продуцируемое клетками, экспрессирующими эту мутацию или генетическую конструкцию, является повышенным. Далее, согласно настоящему изобретению предложена новая композиция авермектинов,продуцируемых штаммом S.avermitilis, экспрессирующим мутированный аллель aveC по настоящему изобретению, где эти авермектины продуцируются в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S.avermitilis, которые не экспрессируют мутированный аллель aveC, но вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Эту новую композицию авермектинов можно представить в виде продуцируемой в ферментационной культуральной жидкости либо эту композицию можно собрать из этой жидкости и частично или существенно очистить от нее. 4. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 - последовательность ДНК (SEQ IDNO:1), содержащая ОРС aveC S.avermitilis, и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2); фиг. 2 - плазмидный вектор pSE186 (ATCC 209604), содержащий полноразмерную ОРС гена aveC S.avermitilis; фиг. 3 - вектор замещения гена pSE180S.avermitilis; фиг. 4 - рестрикционная карта BamHI кластера генов поликетидсинтазы авермектина изS.avermitilis с пятью идентифицированными перекрывающимися космидными клонами (то есть pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Указано также соотношение pSE118 и pSE119; фиг. 5 - анализ с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) продуктов ферментации,продуцируемых штаммами S.avermitilis. Количественное определение максимумов проводили путем сравнения со стандартными количествами циклогексил-B1. Время удержания циклогексил-В 2 составило 7,4-7,7 мин; время удержания циклогексил-В 1 составило 11,9-12,3 мин; фиг. 5 А - штамм S.avermitilis SE180-11 с инактивированной ОРС aveC; фиг. 5 Б - штамм S.avermitilis SE180-11,трансформированный pSE186 (АТСС 209604); 12 фиг. 5 В - штамм S.avermitilis SE180-11,трансформированный pSE187; фиг. 5 Г - штамм S.avermitilis SE180-11,трансформированный pSE188; фиг. 6 - сравнение выведенных аминокислотных последовательностей, кодируемых ОРСaveC S.avermitilis (SEQ ID NO:2), частичной ОРС гомолога aveC из S.griseochromogenes (SEQS.hygroscopicus (SEQ ID NO:4). Остаток валина жирным шрифтом является предполагаемым сайтом старта для белка. Консервативные остатки показаны заглавными буквами для гомологии во всех трех последовательностях и строчными буквами для гомологии в 2 из 3 последовательностей. Аминокислотные последовательности содержат примерно 50% идентичности последовательности; фиг. 7 - гибридная плазмидная конструкция, содержащая фрагмент BsaAI/KpnI длиной 564 п. н. (пары нуклеотидов) из гена-гомологаBsaAI/KpnI в ОРС aveC S.avermitilis. 5. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к идентификации и характеристике полинуклеотидных молекул, имеющих нуклеотидные последовательности, которые кодируют генный продуктAveC из Streptomyces avermitilis, к конструированию новых штаммов S.avermitilis, которые можно использовать для скрининга мутированных генных продуктов AveC на их воздействие на продукцию авермектинов, и к открытию того, что некоторые мутированные генные продукты AveC могут снижать соотношение авермектинов B1:B2, продуцируемых S.avermitilis. В качестве примера изобретение описано в приведенных ниже разделах для полинуклеотидной молекулы, имеющей либо нуклеотидную последовательность, которая является такой же, как последовательность плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующая генный продукт AveCS.avermitilis, либо нуклеотидную последовательность ОРС фиг. 1 (SEQ ID NO:1), и для полинуклеотидных молекул, имеющих мутированные нуклеотидные последовательности,имеющие происхождение от них, а также их вырожденные варианты. Однако принципы, изложенные согласно настоящему изобретению,можно аналогично применять к другим полинуклеотидным молекулам, включая геныгомологи aveC из других видов Streptomyces,включая,например,среди прочих,S.hygroscopicus и S.griseochromogenes. 5.1. Полинуклеотидные молекулы, кодирующие генный продукт AveC S.avermitilis Согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая полноразмерную ОРС aveCS.avermitilis или ее существенную часть, причем в этой выделенной полинуклеотидной молекуле отсутствует следующая полноразмерная ОРС, 13 которая локализована in situ на хромосомеS.avermitilis в прямом направлении от ОРСaveC. Эта выделенная полинуклеотидная молекула по настоящему изобретению предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, которая является такой же, как последовательность плазмиды pSE186 (ATCC 209604),кодирующая генный продукт AveC S.avermitilis,или которая является такой же, как нуклеотидная последовательность ОРС фиг. 1 (SEQ IDNO:1) либо ее существенная часть. Как использовано здесь, существенная часть выделенной полинуклеотидной молекулы, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт AveC S.avermitilis, означает выделенную полинуклеотидную молекулу, содержащую по меньшей мере примерно 70% последовательности полноразмерной ОРС aveC,показанной на фиг. 1 (SEQ ID NO:1), и кодирующую функционально эквивалентный генный продукт AveC. В этом отношении функционально эквивалентный генный продукт AveC определяют как генный продукт, который при экспрессии в штамме S.avermitilis ATCC 53692,в котором нативный аллель aveC инактивирован, приводит в результате к продукции, по существу, такого же соотношения и количества авермектинов, как продуцируется штаммом S.avermitilis ATCC 53692, который вместо этого экспрессирует только функциональный аллельS.avermitilis ATCC 53692. Кроме нуклеотидной последовательности ОРС aveC, выделенная полинуклеотидная молекула по настоящему изобретению может дополнительно содержать нуклеотидные последовательности, которые в природе фланкируют генaveC in situ у S.avermitilis, такие как фланкирующие нуклеотидные последовательности,показанные на фиг. 1 (SEQ ID NO:1). Далее, согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или ее вырожденный вариант. Используемые здесь термины полинуклеотидная молекула, полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность, открытая рамка считывания и ОРС следует относить к молекулам как ДНК,так и РНК, которые могут быть либо однонитевыми, либо двунитевыми и которые могут транскрибироваться и транслироваться (ДНК) или транслироваться (РНК) в генный продуктAveC или, как описано ниже, в генный продуктгомолог AveC, либо в полипептид, который является гомологичным генному продукту AveC или генному продукту-гомологу AveC, в подходящей системе экспрессии клетки-хозяина при помещении под контроль подходящих регуляторных элементов. Кодирующая последователь 004569 14 ность может включать в себя прокариотические последовательности, последовательности кДНК(комплементарной ДНК), последовательности геномной ДНК, а также химически синтезированные последовательности ДНК и РНК, но не ограничена ими. Нуклеотидная последовательность, показанная на фиг. 1 (SEQ ID NO:1), содержит четыре различные кодона GTG в положениях 42,174, 177 и 180 п. н. Как описано ниже в разделе 9, сконструировали множественные делеции 5 района ОРС aveC (фиг. 1; SEQ ID NO:1), чтобы помочь определить, какие из этих кодонов могут функционировать в ОРС aveC в качестве сайтов старта для экспрессии белка. Делеция первого сайта GTG в положении 42 п. н. не элиминировала активность AveC. Дополнительная делеция всех кодонов GTG в положениях 174,177 и 180 п. н. вместе элиминировала активность AveC, что указывает на то, что данный район является необходимым для экспрессии белка. Таким образом, настоящее изобретение охватывает вариабельную длину ОРС aveC. Далее, согласно настоящему изобретению предложена полинуклеотидная молекула,имеющая нуклеотидную последовательность,которая является гомологичной последовательности плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей генный продукт AveC S.avermitilis, или нуклеотидной последовательности ОРС aveC,представленной на фиг. 1 (SEQ ID NO:1), либо ее существенной части. Термин гомологичный, когда его используют по отношению к полинуклеотидной молекуле, которая является гомологичной последовательности, кодирующей генный продукт AveC S.avermitilis, означает полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность (а) которая кодирует такой же генный продукт AveC, как последовательность плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующая генный продукт AveC S.avermitilis, или которая кодирует такой же генный продукт AveC, как нуклеотидная последовательность ОРС aveC, представленная на фиг. 1(SEQ ID NO:1), но которая включает в себя одну или более чем одну молчащую замену в нуклеотидной последовательности согласно вырожденности генетического кода (т.е. вырожденный вариант); либо (б) которая гибридизуется с комплементом полинуклеотидной молекулы,имеющей нуклеотидную последовательность,которая кодирует аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей генный продукт AveC, или которая кодирует аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1 (SEQ ID NO:2), в умеренно строгих условиях, т.е. в условиях гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPO4, 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ ЭДТАJohn WileySons, Inc., New York, at p. 2.10.3), и кодирует функционально эквивалентный генный продукт AveC, как определено выше. В предпочтительном воплощении эта гомологичная полинуклеотидная молекула гибридизуется с комплементом нуклеотидной последовательности плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей генный продукт AveC, или с комплементом нуклеотидной последовательности ОРСaveC, представленной на фиг. 1 (SEQ ID NO:1),или ее существенной частью, в высоко строгих условиях, т.е. в условиях гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPO4, 7% ДСН, 1 мМ ЭДТА при 65 С и отмывки в 0,1xSSC/0,1% ДСН при 68 С (Ausubel et аl.,1989, выше), и кодирует функционально эквивалентный генный продукт AveC, как определено выше. Активность генного продукта AveC и его потенциальных функциональных эквивалентов можно определить посредством анализа с помощью ВЭЖХ продуктов ферментации, как описано ниже в примерах. Полинуклеотидные молекулы, имеющие нуклеотидные последовательности, которые кодируют функциональные эквиваленты генного продуктаS.avermitilis, включают в себя встречающиеся в природе гены aveC, присутствующие в других штаммах S.avermitilis, гены-гомологи aveC, присутствующие в других видах Streptomyces, и мутированные аллели aveC, которые либо встречаются в природе или сконструированы генно-инженерным путем. Далее, согласно настоящему изобретению предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность,которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является гомологичной аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей генный продукт AveC, или аминокислотной последовательности фиг. 1 (SEQ ID NO:2) либо ее существенной части. Как использовано здесь,существенная часть аминокислотной последовательности фиг. 1 (SEQ ID NO:2) означает полипептид, содержащий по меньшей мере примерно 70% аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1 (SEQ ID NO:2), и который составляет функционально эквивалентный генный продукт AveC, как определено выше. Используемый здесь по отношению к аминокислотным последовательностям, которые являются гомологичными аминокислотной последовательности генного продукта AveC изS.avermitilis, термин гомологичный относится к полипептиду, который в других отношениях имеет аминокислотную последовательность 16 фиг. 1 (SEQ ID NO:2), но в котором один или более чем один аминокислотный остаток консервативно заменен другим аминокислотным остатком, где указанная аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере примерно 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом, кодируемым последовательностью плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей генный продукт AveC, или с аминокислотной последовательностью фиг. 1 (SEQ ID NO:2), как определено с помощью любого стандартного алгоритма идентичности аминокислотной последовательности, такого как алгоритм BLASTP(GENBANK, NCBI), и где такая консервативная замена приводит к функционально эквивалентному генному продукту, как определено выше. Консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области техники. Правила создания таких замен включают в себя те,которые описаны, среди прочего, Dayhof, M.D.,1978, Nat. Biomed. Res, Found., Washington, D. C,Vol. 5, Sup. 3. Более конкретно консервативными аминокислотными заменами являются те,которые обычно имеют место в пределах семейства аминокислот, которые являются родственными по кислотности или полярности. Генетически кодируемые аминокислоты обычно делят на четыре группы: (1) кислые = аспартат, глутамат; (2) основные = лизин, аргинин, гистидин;(3) неполярные = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные = глицин,аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин,тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин также классифицируют совместно как ароматические аминокислоты. Одна или более чем одна замена в пределах любой конкретной группы,например лейцина изолейцином или валином,либо аспартата глутаматом, либо треонина серином, либо любого другого аминокислотного остатка структурно родственным аминокислотным остатком, например, аминокислотным остатком с похожей кислотностью или полярностью, либо с подобием в некотором их сочетании, как правило, имеет незначительное воздействие на функцию полипептида. Далее, согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продуктгомолог AveC. Как использовано здесь, генный продукт-гомолог AveC определяют как генный продукт, имеющий по меньшей мере примерно 50% идентичности аминокислотной последовательности с генным продуктомS.avermitHis, содержащим аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей генный продукт AveC, или с аминокис 17 лотной последовательностью, показанной на фиг. 1 (SEQ ID NO:2), как определено с помощью любого стандартного алгоритма идентичности аминокислотной последовательности,такого как алгоритм BLASTP (GENBANK,NCBI). В неограничивающем воплощении генный продукт-гомолог AveC является продуктом из S.hygroscopicus (описан в заявке на европейский патент 0298423, депозит FERM ВР-1901) и содержит аминокислотную последовательностьSEQ ID NO:4 или ее существенную часть. Существенная часть аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4 означает полипептид,содержащий по меньшей мере примерно 70% аминокислотной последовательности SEQ IDNO:4, и который составляет функционально эквивалентный генный продукт-гомолог AveC. Функционально эквивалентный генный продукт-гомолог AveC определяют как генный продукт, который при экспрессии в штаммеS.hygroscopicus FERM ВР-1901, в котором нативный аллель гомолога aveC инактивирован,приводит к продукции, по существу, такого же соотношения и количества милбемицинов, как продуцируется штаммом S.hygroscopicus FERM ВР-1901, экспрессирующим вместо этого только функциональный аллель гомолога aveC дикого типа, нативный для штамма S.hygroscopicusFERM ВР-1901. В неограничивающем воплощении выделенная полинуклеотидная молекула по настоящему изобретению, которая кодирует генный продукт-гомолог AveC S.hygroscopicus,содержит нуклеотидную последовательностьSEQ ID NO:3 или ее существенную часть. В этом отношении существенная часть выделенной полинуклеотидной молекулы, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ IDNO:3, означает выделенную полинуклеотидную молекулу, содержащую по меньшей мере примерно 70% нуклеотидной последовательностиSEQ ID NO:3, и которая кодирует функционально эквивалентный генный продукт-гомологAveC, как определено непосредственно выше. Далее, согласно настоящему изобретению предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность,которая является гомологичной нуклеотидной последовательностиS.hygroscopicus. Термин гомологичный, когда его используют по отношению к полинуклеотидной молекуле, содержащей нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной последовательности SEQ ID NO:3, кодирующей генный продукт-гомологS.hygroscopicus, означает полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность (а) которая кодирует такой же генный продукт, как нуклеотидная последовательностьSEQ ID NO:3, но которая включает в себя одну или более чем одну молчащую замену в нуклеотидной последовательности согласно вырожденности генетического кода (т.е. вырожденный 18 вариант); либо (б) которая гибридизуется с комплементом полинуклеотидной молекулы,имеющей нуклеотидную последовательность,которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, в умеренно строгих условиях, т.е. в условиях гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPO4, 7% ДСН, 1 мМ ЭДТА при 65 С и отмывки в 0,2xSSC/0,1% ДСН при 42 С (см. Ausubel et al. выше), и кодирует функционально эквивалентный генный продукт-гомолог AveC, как определено выше. В предпочтительном воплощении эта гомологичная полинуклеотидная молекула гибридизуется с комплементом нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:3, кодирующей генный продукт-гомолог AveC, в высоко строгих условиях, т.е. в условиях гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPO4, 7% ДСН, 1 мМ ЭДТА при 65 С и отмывки в 0,1xSSC/0,1% ДСН при 68 С (Ausubel et al.,1989, выше), и кодирует функционально эквивалентный генный продукт-гомолог AveC, как определено выше. Далее, согласно настоящему изобретению предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность,которая кодирует полипептид, который является гомологичным генному продукту-гомологуAveC S.hygroscopicus. Используемый здесь по отношению к полипептидам, которые являются гомологичными генному продукту-гомологуAveC SEQ ID NO:4 из S.hygroscopicus, термин гомологичный относится к полипептиду, который в других отношениях имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, но в котором один или более чем один аминокислотный остаток консервативно заменен другим аминокислотным остатком, как определено выше, где указанная аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере примерно 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности аминокислотной последовательности с полипептидом SEQ ID NO:4, как определено с помощью любого стандартного алгоритма идентичности аминокислотной последовательности,такого как алгоритм BLASTP (GENBANK,NCBI), и где такая консервативная замена приводит к функционально эквивалентному генному продукту-гомологу AveC, как определено выше. Далее, согласно настоящему изобретению предложены олигонуклеотиды, которые гибридизуются с полинуклеотидной молекулой,имеющей нуклеотидную последовательность фиг. 1 (SEQ ID NO:1) или SEQ ID NO:3, или с полинуклеотидной молекулой, имеющей нуклеотидную последовательность, которая является комплементом нуклеотидной последовательности фиг. 1 (SEQ ID NO:1) или SEQ ID NO:3. Длина таких олигонуклеотидов составляет по 19 меньшей мере примерно 10 нуклеотидов, а предпочтительно от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов, и они гибридизуются с одной из вышеупомянутых полинуклеотидных молекул в высоко строгих условиях, т.е. в условиях отмывки в 6xSSC/0,5% пирофосфате натрия при 37 С для олигонуклеотидов длиной 14 оснований, при 48 С для олигонуклеотидов длиной 17 оснований, при 55 С для олигонуклеотидов длиной 20 оснований и при 60 С для олигонуклеотидов длиной 23 основания. В предпочтительном воплощении эти олигонуклеотиды являются комплементарными части одной из вышеупомянутых полинуклеотидных молекул. Эти олигонуклеотиды являются полезными для ряда целей, включая кодирование антисмысловых молекул или действие в качестве антисмысловых молекул, полезных при генной регуляции, либо в качестве праймеров при амплификации полинуклеотидных молекул, кодирующихaveC или гомолог aveC. Дополнительные гены-гомологи aveC можно идентифицировать у других видов или штаммов Streptomyces, используя полинуклеотидные молекулы или олигонуклеотиды, раскрываемые здесь, в сочетании с известными методиками. Например, олигонуклеотидную молекулу, содержащую часть нуклеотидной последовательности S.avermitilis фиг. 1 (SEQ IDNO:1) или часть нуклеотидной последовательности S.hygroscopicus SEQ ID NO:3, можно обнаружимо пометить и использовать для скрининга библиотеки генов, сконструированной из ДНК, имеющей происхождение от интересующего организма. Строгость условий гибридизации выбирают на основании соотношения организма сравнения, в данном примере S.avermitilis или S.hygroscopicus, к интересующему организму. Требования к различным условиям строгости хорошо известны специалистам в данной области техники, и такие условия будут предсказуемо варьировать в зависимости от конкретных организмов, от которых происходят библиотека и меченые последовательности. Длина таких олигонуклеотидов составляет предпочтительно по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, и они включают в себя, например,те, которые описаны в приведенных ниже примерах. Амплификацию гомологичных генов можно проводить, используя эти и другие олигонуклеотиды, с помощью применения стандартных методик, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), хотя можно также использовать другие методики амплификации, известные в данной области техники, например, лигазную цепную реакцию. Клоны, идентифицированные как содержащие нуклеотидные последовательности гомолога aveC, можно тестировать на их способность кодировать функциональный генный продукт-гомолог AveC. Для этой цели клоны мож 004569 20 но подвергать секвенированию, чтобы идентифицировать подходящую рамку считывания, а также сигналы инициации и терминации. Альтернативно или дополнительно клонированную последовательность ДНК можно встроить в подходящий вектор экспрессии, то есть в вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной последовательности, кодирующей белок. Можно использовать любую из ряда систем хозяин/вектор, как описано ниже, включая бактериальные системы, такие как плазмида, бактериофаг, или космидные векторы экспрессии, но не ограничиваясь ими. Затем подходящие клеткихозяева, трансформированные такими векторами, содержащими последовательности, кодирующие потенциальный гомолог aveC, можно анализировать на активность AveC-типа, используя способы, такие как анализ с помощью ВЭЖХ продуктов ферментации, как описано,например, в разделе 7 ниже. Получение полинуклеотидных молекул и манипуляция с ними, раскрытые здесь, находятся в пределах компетенции специалистов в данной области техники, и их можно осуществлять согласно рекомбинантным методикам, описанным, например, в Maniatis et al., 1989, MolecularAcademic Press, Inc., San Diego; and Erlich (ed.),1992. PCR Technology. Oxford University Press,New York, все эти публикации включены сюда путем ссылки. Полинуклеотидные клоны, кодирующие генные продукты AveC или генные продукты-гомологи AveC, можно идентифицировать, используя любой способ, известный в данной области техники, включая способы, изложенные в разделе 7 ниже, но не ограничиваясь ими. Можно проводить скрининг библиотек ДНК генов на последовательности, кодирующиеDavis, 1977, Science 196: 180 для библиотек бактериофагов и в Grunstein and Hogness, 1975,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961-3965 для библиотек плазмид. Полинуклеотидные молекулы, имеющие нуклеотидные последовательности, которые, как известно в настоящее время,включают в себя ОРС aveC, например, в плазмиде pSE186 (АТСС 209604) или в плазмидеpSE119 (описанной в разделе 7 ниже), можно использовать в качестве зондов в этих скрининговых экспериментах. Альтернативно можно синтезировать олигонуклеотидные зонды, которые соответствуют нуклеотидным последовательностям, выведенным на основании частич 21 ных или полноразмерных аминокислотных последовательностей очищенного генного продукта-гомолога AveC. 5.2. Рекомбинантные системы 5.2.1. Векторы для клонирования и экспрессии Далее, согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантные векторы для клонирования и векторы экспрессии, которые являются полезными при клонировании или экспрессии полинуклеотидных молекул по настоящему изобретению, содержащие, например,ОРС aveC S.avermitilis или ОРС любых гомологов aveC. В неограничивающем воплощении,согласно настоящему изобретению, предложена плазмида pSE186 (АТСС 209604), которая содержит полноразмерную ОРС гена aveCaveC или к генным продуктам-гомологам AveC,если не указано определенно или в контексте. Для конкретного применения в Streptomyces разработан ряд различных векторов, включая, среди прочего, фаг, мультикопийные плазмиды, низкокопийные плазмиды и челночные векторы E.coli-Streptomyces, и любой из них можно использовать для практики настоящего изобретения. Клонирован также ряд генов устойчивости к лекарствам из Streptomyces, и некоторые из этих генов включены в векторы в качестве селектируемых маркеров. Примеры современных векторов для использования вHutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190. Рекомбинантные векторы по настоящему изобретению, в частности, векторы экспрессии,предпочтительно конструируют таким образом,что кодирующая последовательность для полинуклеотидной молекулы по изобретению находится в функциональной связи с одним или более чем одним регуляторным элементом, необходимым для транскрипции и трансляции кодирующей последовательности, чтобы продуцировать полипептид. Используемый здесь термин регуляторный элемент включает в себя нуклеотидные последовательности, которые кодируют индуцибельные и неиндуцибельные промоторы, энхансеры, операторы и другие элементы, известные в данной области техники, которые служат, чтобы направлять и/или регулировать экспрессию полинуклеотидных кодирующих последовательностей, но не ограничен ими. Также используемая здесь кодирующая последовательность находится в функциональной связи с одним или более чем одним регуляторным элементом, где эти регуляторные элементы эффективно регулируют транскрипцию и дают 22 возможность для транскрипции этой кодирующей последовательности либо трансляции ее мРНК или обоих процессов. Типичные плазмидные векторы, которые можно сконструировать так, чтобы они содержали полинуклеотидную молекулу по настоящему изобретению, включают в себя pCR-Blunt,pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) и челночный вектор pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171: 5872-5881), среди многих прочих. В данной области техники хорошо известны способы конструирования рекомбинантных векторов, содержащих конкретные кодирующие последовательности в функциональной связи с подходящими регуляторными элементами, и их можно использовать для осуществления настоящего изобретения. Эти способы включают в себя рекомбинантные методики in vitro, синтетические методики и генетическую рекомбинацию in vivo. См., например, методики, описанные в Maniatis et al., 1989, выше; Ausubel et al.,1989, выше; Sambrook et al., 1989, выше; Innis etal., 1995, выше; и Erlich, 1992, выше. Регуляторные элементы этих векторов могут варьировать по своей силе и специфичности. В зависимости от используемой системы хозяин/вектор можно использовать любой из ряда подходящих элементов транскрипции и трансляции. Неограничивающие примеры транскрипционных регуляторных районов или промоторов для бактерий включают в себя промотор gal, промотор Т 7, промотор ТАС, левый и правый промоторы , промоторы trp и lac, слитые промоторы trp-lac и более конкретно для Streptomyces, промоторы ermE, meIC и tipA и так далее. В конкретном воплощении, описанном в разделе 11 ниже, был создан вектор экспрессии,который содержал клонированную ОРС aveC,прилежащую к сильному конститутивному промотору еrmЕ из Saccharopolyspora erythraea. Этим вектором трансформировали S.avermitilis,и последующий анализ с помощью ВЭЖХ продуктов ферментации показал повышенный титр авермектинов, продуцируемых по сравнению с продукцией тем же штаммом, но который вместо этого экспрессирует аллель aveC дикого типа. Векторы экспрессии слитого белка можно использовать для экспрессии белка, слитого с генным продуктом AveC. Этот очищенный слитый белок можно использовать для получения антисывороток против генного продукта AveC,чтобы изучать биохимические свойства генного продукта AveC, чтобы конструировать слитые сAveC белки с различными биохимическими активностями, либо чтобы способствовать идентификации или очистке экспрессированного генного продукта AveC. Возможные векторы экспрессии слитых белков включают в себя векторы, в которые включены последовательности,которые кодируют белки, слитые с -галакто 23 зидазой и trpE, белки, слитые с белком, связывающим мальтозу, белки, слитые с глутатион-Sтрансферазой, и белки, слитые с полигистидином (районы-носители), но не ограничены ими. В альтерантивном воплощении генный продуктAveC или его часть можно слить с генным продуктом-гомологом AveC или его частью, имеющим происхождение от другого вида или штамма Streptomyces, такого как, например,S.hygroscopicus или S.griseochromogenes. В конкретном воплощении, описанном в разделе 12 ниже и изображенном на фиг. 7, сконструировали химерную плазмиду, которая содержит район ОРС гомолога aveC S.hygroscopicus длиной 564 п. н., замещающий район ОРС aveC S.avermitilis длиной 564 п. н Такими гибридными векторами можно трансформировать клетки S.avermitilis и тестировать на определение их воздействия, например, на соотношение продуцируемых авермектинов классов 2:1. Белки, слитые с AveC, можно сконструировать таким образом, чтобы они содержали район, полезный для очистки. Например, слитые белки AveC-белок, связывающий мальтозу,можно очистить, используя амилозную смолу; слитые белки АvеС-глутатион-S-трансфераза можно очистить,используя глутатионагарозные гранулы; и слитые белки AveCполигистидин можно очистить, используя смолу с двухвалентным никелем. Альтернативно антитела против белка-носителя или пептида можно использовать для очистки слитого белка посредством аффинной хроматографии. Например, в вектор экспрессии можно включить генно-инженерным путем нуклеотидную последовательность, кодирующую эпитоп-мишень моноклонального антитела, в функциональной связи с регуляторными элементами и расположить таким образом, чтобы экспрессируемый эпитоп был слит с полипептидом AveC. Например, нуклеотидную последовательность, кодирующую эпитоп-метку FLAG (InternationalBiotechnologies Inc.), который представляет собой гидрофильный маркерный пептид, можно встроить с помощью стандартных методик в вектор экспрессии в точке, соответствующей,например, карбоксильному концу полипептидаAveC. Затем экспрессированный слитый продукт полипептид AveC - эпитоп FLAG можно обнаружить и очистить посредством аффинной хроматографии, используя имеющиеся в продаже антитела против FLAG. Вектор экспрессии, кодирующий белок,слитый с AveC, можно также сконструировать таким образом, чтобы он содержал полилинкерные последовательности, которые кодируют сайты расщепления специфической протеазы,так что экспрессированный полипептид AveC можно высвобождать от района-носителя или партнера слияния обработкой специфической протеазой. Например, в вектор слитого белка можно включать последовательности ДНК, ко 004569 24 дирующие, среди прочего, сайты расщепления тромбина или фактора Ха. Сигнальную последовательность в обратном направлении от ОРС aveC и в рамке считывания с ней можно включить генноинженерным путем в вектор экспрессии с помощью известных способов, чтобы направлять транспорт и секрецию экспрессированного генного продукта. Неограничивающие примеры сигнальных последовательностей включают в себя, среди прочего, сигнальные последовательности из -фактора, иммуноглобулинов, внешних мембранных белков, пенициллиназы и рецепторов Т-клеток. Чтобы способствовать отбору клетокхозяев, трансформированных или трансфицированных векторами для клонирования или экспрессии по настоящему изобретению, этот вектор можно сконструировать таким образом,чтобы он дополнительно содержал кодирующую последовательность для продукта генарепортера или другого селектируемого маркера. Такая кодирующая последовательность предпочтительно находится в функциональной связи с кодирующими последовательностями регуляторных элементов, как описано выше. Генырепортеры, которые являются полезными в изобретении, хорошо известны в данной области техники и включают в себя, среди прочего, гены, кодирующие зеленый флуоресцентный белок, люциферазу, xyIE и тирозиназу. Нуклеотидные последовательности, кодирующие селектируемые маркеры, хорошо известны в данной области техники и включают в себя последовательности, кодирующие генные продукты,придающие устойчивость к антибиотикам или антиметаболитам, либо которые обеспечивают ауксотрофную потребность. Примеры таких последовательностей включают в себя, среди многих прочих, те, которые кодируют устойчивость к эритромицину, тиострептону или канамицину. 5.2.2. Трансформация клеток-хозяев Далее, согласно настоящему изобретению предложены трансформированные клеткихозяева, содержащие полинуклеотидную молекулу или рекомбинантный вектор по изобретению, и новые штаммы или клеточные линии,имеющие происхождение от них. Клеткамихозяевами, полезными при осуществлении изобретения, являются предпочтительно клеткиStreptomyces, хотя можно также использовать другие прокариотические клетки или эукариотические клетки. Такие трансформированные клетки-хозяева обычно включают в себя, среди прочего, микроорганизмы, такие как бактерии,трансформированные рекомбинантными векторами ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, или дрожжи, трансформированные рекомбинантными векторами, но не ограничены ими. 25 Полинуклеотидные молекулы по настоящему изобретению предназначены для функционирования в клетках Streptomyces, но ими также можно трансформировать другие бактериальные или эукариотические клетки, например, для целей клонирования или экспрессии. Типично можно использовать штамм E.coli, такой как, например, штамм DH5, который можно получить из Американской коллекции типовых культур, Rockville, MD, США ( по каталогу 31343) и из коммерческих источников(Stratagene). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают в себя дрожжевые клетки, хотя клетки млекопитающих или клетки насекомых также можно эффективно использовать. Рекомбинантным вектором по изобретению предпочтительно трансформируют или трансфицируют одну или более чем одну клетку-хозяина, по существу, из гомогенной культуры клеток. Вектор экспрессии, как правило,вводят в клетки-хозяева в соответствии с известными методиками, такими как, например,трансформация протопластов,кальцийфосфатная преципитация, обработка хлоридом кальция,микроинъекция,электропорация,трансфекция посредством контакта с рекомбинантным вирусом, трансфекция, опосредованная липосомами, ДЭАЭ (диэтиламиноэтил) декстрановая трансфекция, трансдукция, конъюгация или бомбардировка микрочастицами. Отбор трансформантов можно проводить с помощью стандартных методик, таких как отбор по клеткам, экспрессирующим селектируемый маркер, например, устойчивость к антибиотику,связанный с рекомбинантным вектором, как описано выше. Как только вектор экспрессии введен в клетку-хозяина, интеграцию и сохранение кодирующей последовательности aveC либо в хромосоме клетки-хозяина, либо в эписомном состоянии можно подтвердить с помощью стандартных методик, например, с помощью анализа путем гибридизации по Саузерну, рестрикционного анализа, ПЦР-анализа, включая ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), либо с помощью иммунологического анализа для обнаружения ожидаемого генного продукта. Клеткихозяева, содержащие и/или экспрессирующие рекомбинантную кодирующую последовательность aveC, можно идентифицировать с помощью по меньшей мере четырех общих подходов, которые хорошо известны в данной области техники, включая (1) гибридизацию ДНК-ДНК,ДНК-РНК или РНК-антисмысловая РНК; (2) обнаружение присутствия функций маркерного гена; (3) оценку уровня транскрипции, который измеряют по экспрессии специфических для aveC транскриптов мРНК в клетке-хозяине; и (4) обнаружение присутствия зрелого полипептидного продукта, которое измеряют, например, с помощью иммунологического анали 004569 26 за, либо на основании присутствия биологической активности AveC (например, продукция специфических соотношений и количеств авермектинов, указывающее на активность AveC,например, в клетках-хозяевах S.avermitilis). 5.2.3. Экспрессия и характеристика рекомбинантного генного продуктаAveC Как только кодирующая последовательность aveC стабильно введена в подходящую клетку-хозяина, эту трансформированную клетку-хозяина клонально размножают, и полученные в результате клетки можно выращивать в условиях, способствующих максимальной продукции генного продукта AveC. Такие условия типично включают в себя выращивание клеток до высокой плотности. Если вектор экспрессии содержит индуцибельный промотор, используют подходящие условия индукции, такие как,например, температурный сдвиг, истощение питательных веществ, добавление независимых индукторов (например, аналогов углеводов, таких как изопропилD-тиогалактопиранозид(ИПТГ, накопление избытка побочных продуктов метаболизма или тому подобное, как необходимо для индукции экспрессии. Если экспрессированный генный продуктAveC сохраняется внутри клеток-хозяев, эти клетки собирают и лизируют и продукт выделяют и очищают из лизата в условиях экстракции, известных в данной области техники, для минимизации деградации белка, как, например,при 4 С, либо в присутствии ингибиторов протеазы, либо при обоих этих условиях. Если экспрессированный генный продукт AveC секретируется клетками-хозяевами, истощенную питательную среду можно просто собрать и выделить из нее этот продукт. Экспрессированный генный продукт AveC можно выделить или существенно очистить из клеточных лизатов или из культуральной среды,как подходит, используя стандартные способы,включая любое сочетание следующих способов: фракционирование сульфатом аммония, фракционирования по размеру, ионообменной хроматографии, ВЭЖХ, центрифугирования в градиенте плотности и аффинной хроматографии,но не ограничиваясь им. Если экспрессированный генный продукт AveC проявляет биологическую активность, можно контролировать возрастание чистоты препарата на каждой стадии процедуры очистки с помощью подходящего анализа. В любом случае, проявляет экспрессированный генный продукт AveC биологическую активность или нет, его можно обнаружить на основании, например, размера, либо реактивности с антителом, в другом отношении специфичским для AveC, либо присутствия слитой метки. Используемый здесь генный продуктAveC является существенно очищенным, если этот продукт составляет более чем примерно 20% мас./мас. белка в конкретном препарате. 27 Также используемый здесь генный продуктAveC является выделенным, если этот продукт составляет по меньшей мере примерно 80% белка в конкретном препарате. Таким образом, согласно настоящему изобретению, предложен рекомбинантно экспрессированный выделенный или существенно очищенный генный продукт AveC S.avermitilis, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей генный продукт AveC, или аминокислотную последовательность фиг. 1 (SEQ ID NO:2) или ее существенную часть, а также его гомологи. Далее, согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантно экспрессированный выделенный или существенно очищенный генный продукт-гомолог AveC S.hydroscopicus,содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или ее существенную часть,а также его гомологи. Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ получения генного продуктаAveC, при котором клетку-хозяина, трансформированную рекомбинантным вектором экспрессии, причем указанный вектор содержит полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт AveC, причем эта полинуклеотидная молекула находится в функциональной связи с одним или более чем одним регуляторным элементом, который контролирует экспрессию этой полинуклеотидной молекулы в клеткехозяине, культивируют в условиях, благоприятных для продукции рекомбинантного генного продукта AveC, и выделяют генный продуктAveC из этой клеточной культуры. Рекомбинантно экспрессированный генный продукт AveC S.avermitilis является полезным для ряда целей, включая скрининг соединений, которые изменяют функцию генного продукта AveC и посредством этого модулируют биосинтез авермектинов, и создание антител,направленных против генного продукта AveC. Как только получен генный продукт AveC достаточной чистоты, его можно охарактеризовать с помощью стандартных способов, включая анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСНПААГ), гель-хроматографию, анализ аминокислотной последовательности, биологическую активность в продукции соответствующих продуктов в биосинтетическом пути авермектинов и так далее. Например, аминокислотную последовательность генного продукта AveC можно определить, используя стандартные методики секвенирования пептидов. Генный продуктUSA 78: 3824) или аналогичные программнореализованные алгоритмы, чтобы идентифици 004569 28 ровать гидрофобные и гидрофильные районы генного продукта AveC. Структурный анализ можно провести, чтобы идентифицировать районы генного продукта AveC, которые принимают специфические вторичные структуры. Биофизические способы, такие как рентгеновская кристаллография (Engstrom, 1974, Biochem. Exp.Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) можно использовать для картирования и исследования сайтов взаимодействия между генным продуктом AveC и его субстратом. Информацию, полученную в результате этих исследований, можно использовать для выбора новых сайтов для мутации в ОРС aveC, чтобы способствовать определению новых штаммовS.avermitilis, имеющих более желательные характеристики продукции авермектинов. 5.3. Конструирование и использование мутантов AveC Согласно настоящему изобретению предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая в других отношениях является такой же, как аллель aveC S.avermitilis или его вырожденный вариант, либо последовательность плазмидыpSE186 (ATCC 209604), кодирующая генный продукт AveC, или ее вырожденный вариант,либо нуклеотидная последовательность ОРСaveC S.avermitilis, как представлено на фиг. 1(SEQ ID NO:1) или ее вырожденный вариант, но которая, кроме того, содержит одну или более чем одну мутацию, так что клетки штамма S.avermitilis ATCC 53692, в которых аллель aveC дикого типа инактивирован и которые экспрессируют полинуклеотидную молекулу, содержащую мутированную нуклеотидную последовательность или ее вырожденный вариант, продуцируют иное соотношение или количество авермектинов, чем продуцируют клетки штаммаS.avermitilis ATCC 53692, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Согласно настоящему изобретению такие полинуклеотидные молекулы можно использовать для получения новых штаммов S.avermitilis, которые проявляют обнаружимое изменение в продукции авермектинов по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммов S.avermitilis, которые продуцируют авермектины в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. В следующем предпочтительном воплощении такие нуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммов S.avermitilis, которые 29 продуцируют повышенные уровни авермектинов по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только единственный аллель aveC дикого типа. В следующем предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммов S.avermitilis, в которых ген aveC инактивирован. Мутации в аллеле aveC или кодирующей последовательности включают в себя любые мутации, которые вводят одну или более чем одну аминокислотную делецию, добавку или замену в генный продукт AveC, либо которые приводят к укорочению генного продукта AveC,либо любое их сочетание, и которые дают желаемый результат. В такие мутированные последовательности аллеля aveC также следует включать любые их вырожденные варианты. Например, согласно настоящему изобретению,предложены полинуклеотидные молекулы, содержащие нуклеотидную последовательность аллеля aveC или ее вырожденный вариант, либо последовательность плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей генный продукт AveC,или ее вырожденный вариант, либо нуклеотидную последовательность ОРС aveC S.avermitilis,как представлено на фиг. 1 (SEQ ID NO:1) или ее вырожденный вариант, но которые, кроме того, содержат одну или более чем одну мутацию, которая кодирует замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком в выбранных положениях генного продукта AveC. В нескольких неограничивающих воплощениях,примеры которых приведены ниже, такие замены можно осуществить в любых положениях аминокислот генного продукта AveC, которые соответствуют положениям аминокислот 38, 48,55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230,238, 266, 275, 289 или 298 SEQ ID NO:2 или какому-либо их сочетанию. Мутации в кодирующей последовательности aveC осуществляют с помощью любого из ряда известных способов, включая использование ПЦР, подверженной ошибкам, или кассетный мутагенез. Например, сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов можно применять, чтобы изменить последовательность аллеля aveC или ОРС определенным путем, например, так, чтобы ввести один или более чем один сайт рестрикции или кодон терминации в конкретные районы в пределах аллеля aveC или ОРС. Способы, такие как способы,описанные в патенте США 5605793, в патенте США 5830721 и в патенте США 5837458, в которые вовлечены случайная фрагментация, повторные циклы мутагенеза и перестановка нуклеотидов, можно также использовать для создания больших библиотек полинуклеотидов,имеющих нуклеотидные последовательности,кодирующие мутации aveC. Направленные мутации могут быть полезны, особенно там, где они служат для изменения 30 одного или более чем одного консервативного аминокислотного остатка в генном продуктеAveC. Например, сравнение выведенных аминокислотных последовательностей генных продуктов AveC и генных продуктов-гомологовS.hygroscopicus (SEQ ID NO:4), как представлено на фиг. 6, показывает сайты значительной консервативности аминокислотных остатков между этими видами. Направленный мутагенез,который приводит к замене одного или более чем одного из этих консервативных аминокислотных остатков, может быть особенно эффективным при получении новых мутантных штаммов, которые проявляют желаемые изменения в продукции авермектинов. Неспецифический мутагенез также может быть полезным, и его можно осуществлять с помощью подвергания клеток S.avermitilis ультрафиолетовому излучению или рентгеновским лучам, либо с химическими мутагенами, такими как N-метил-N'-нитрозогуанидин, этилметансульфонат, азотистая кислота или азотистый иприт. См., например, Ausubel, 1989, выше, для обзора методик мутагенеза. Как только созданы мутированные полинуклеотидные молекулы, проводят их скрининг,чтобы определить, могут ли они модулировать биосинтез авермектинов в S.avermitilis. В предпочтительном воплощении полинуклеотидную молекулу, имеющую мутированную нуклеотидную последовательность, тестируют посредством комплементации штамма S.avermitilis, в котором ген aveC инактивирован, для получения отрицательного по aveC (aveC) генетического фона. При неограничивающем способе эту мутированную полинуклеотидную молекулу сплайсируют в плазмиду экспрессии в функциональной связи с одним или более чем одним регуляторным элементом, причем эта плазмида также предпочтительно содержит один или более чем один ген устойчивости к лекарствам,чтобы дать возможность для отбора трансформированных клеток. Затем этим вектором трансформируют клетки-хозяева aveC, используя известные методики, и трансформированные клетки отбирают и культивируют в подходящих ферментационных средах в условиях, которые позволяют или индуцируют продукцию авермектинов. Затем продукты ферментации анализируют с помощью ВЭЖХ, чтобы определить способность мутированной полинуклеотидной молекулы к комплементации клетки-хозяина. Примеры нескольких векторов, несущих мутированные полинуклеотидные молекулы, способные снижать соотношение авермектинов В 2:В 1, включая pSE188, pSE199, pSE231,pSE239 и pSE290-297, приведены в разделе 8.3 ниже. Согласно настоящему изобретению предложены способы идентификации мутаций ОРСaveC S.avermitilis, способных к изменению соотношения и/или количества продуцируемых авермектинов. В предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению, предложен способ идентификации мутаций ОРСaveC, способных к изменению соотношения классов 2:1 продуцируемых авермектинов, при котором (а) определяют соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, в которых нативный для него аллель aveC инактивирован и в которые ввели и экспрессируют в них полинуклеотидную молекулу, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированный генный продукт AveC; (б) определяют соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S.avermitilis, как на стадии (а), но которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа или аллель aveC, имеющий нуклеотидную последовательность ОРС фиг. 1 (SEQ ID NO:1) либо нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной ей; и (в) сравнивают соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis на стадии (а), с соотношением классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis на стадии(б), так что, если соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis на стадии (а), отличается от соотношения классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis на стадии (б), то мутация ОРС aveC, способная к изменению соотношения классов 2:1 авермектинов, идентифицирована. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 авермектинов в результате мутации является сниженным. В следующем предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению,предложен способ идентификации мутаций ОРСaveC или генетических конструкций, содержащих ОРС aveC, способных к изменению количества продуцируемых авермектинов, при котором (а) определяют количество авермектинов,продуцируемых клетками штамма S.avermitilis,в которых нативный для него аллель aveC инактивирован и в которые ввели и экспрессируют в них полинуклеотидную молекулу, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированный генный продукт AveC, или содержащую генетическую конструкцию, в которую включена нуклеотидная последовательность, кодирующая генный продукт AveC; (б) определяют количество авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S. avermitilis, как на стадии (а), но которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа либо нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной ему; и (в) сравнивают количество авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis на стадии (а), с количеством авермектинов, продуцируемых клеткамиS.avermitilis на стадии (а), отличается от количества авермектинов, продуцируемых клеткамиS.avermitilis на стадии (б), то мутация ОРС aveC или генетическая конструкция, способная к изменению количества авермектинов, идентифицирована. В предпочтительном воплощении количество продуцируемых авермектинов в результате мутации является повышенным. Любой из вышеупомянутых способов идентификации мутаций осуществляют, используя ферментационные культуральные среды, в которые предпочтительно добавлена циклогексанкарбоновая кислота, хотя другие подходящие предшественники жирных кислот, такие как любой из предшественников жирных кислот, перечисленных в табл. 1, также можно использовать. Как только идентифицирована полинуклеотидная молекула, которая модулирует продукцию авермектинов в желаемом направлении,можно определить локализацию этой мутации в нуклеотидной последовательности. Например,полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированный генный продукт AveC, можно выделить с помощью ПЦР и подвергнуть секвенированию ДНК, используя известные способы. С помощью сравнения последовательности ДНК мутированного аллеля aveC с последовательностью аллеля aveC дикого типа можно определить мутацию (мутации), ответственную за изменение продукции авермектинов. В конкретных, хотя неограничивающих, воплощениях настоящего изобретения генные продукты AveCS.avermitilis, содержащие либо единичные замены в аминокислотной последовательности в любом из остатков 55 (S55F), 138 (S138T), 139(А 139 Т) или 230 (G230D), либо двойные замены в положениях 138 (S138T) и 139 (А 139 Т илиA139F), приводящие к изменениям функции генного продукта AveC, таким чтобы соотношение классов 2:1 продуцируемых авермектинов изменилось (см. раздел 8 ниже), где перечисленные положения аминокислот соответствуют положениям, представленным на фиг. 1 (SEQ IDNO:2). Кроме того, показано, что каждое из следующих семи сочетаний мутаций эффективно снижает соотношение классов авермектинов 2:1: (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3)A139T/K154E/Q298H. Используемые здесь вышеупомянутые обозначения, такие как А 139 Т,указывают на исходный аминокислотный остаток, обозначенный одной буквой, который в данном примере представляет собой аланин (А),в указанном положении, которое в данном примере является положением 139 (по отношению к последовательности SEQ ID NO:2) полипептида,за которым следует аминокислотный остаток, 33 который заменяет исходный аминокислотный остаток, который в данном примере представляет собой треонин (Т). Соответственно, полинуклеотидные молекулы, имеющие нуклеотидные последовательности, которые кодируют мутированные генные продукты AveC S.avermitilis,содержащие аминокислотные замены или делеции в одном или более чем одном из положений аминокислоты 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138,139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 или 298 (см. фиг. 1) или в любом их сочетании, охвачены настоящим изобретением. В предпочтительном воплощении такие мутации кодируют аминокислотные замены,выбранные из одной или более чем одной из группы, состоящей из(а) аминокислотного остатка Q в положении 38, замененного Р или аминокислотой, которая представляет собой консервативную замену для Р;(б) аминокислотного остатка D в положении 48, замененного Е или аминокислотой, которая представляет собой консервативную замену для Е;(в) аминокислотного остатка А в положении 89, замененного Т или аминокислотой, которая представляет собой консервативную замену для Т;(г) аминокислотного остатка F в положении 99, замененного S или аминокислотой, которая представляет собой консервативную замену для S;(д) аминокислотного остатка G в положении 111, замененного V или аминокислотой,которая представляет собой консервативную замену для V;(е) аминокислотного остатка L в положении 136, замененного Р или аминокислотой,которая представляет собой консервативную замену для Р;(ж) аминокислотного остатка S в положении 138, замененного Т или аминокислотой,которая представляет собой консервативную замену для Т;(з) аминокислотного остатка А в положении 139, замененного Т или F либо аминокислотой, которая представляет собой консервативную замену для Т или F;(и) аминокислотного остатка К в положении 154, замененного Е или аминокислотой,которая представляет собой консервативную замену для Е;(к) аминокислотного остатка G в положении 179, замененного S или аминокислотой,которая представляет собой консервативную замену для S;(л) аминокислотного остатка М в положении 228, замененного Т или аминокислотой,которая представляет собой консервативную замену для Т; 34 которая представляет собой консервативную замену для D;(н) аминокислотного остатка Р в положении 289, замененного L или аминокислотой,которая представляет собой консервативную замену для L; и(о) аминокислотного остатка Q в положении 298, замененного Н или аминокислотой,которая представляет собой консервативную замену для Н; где консервативные аминокислотные замены являются такими, как определены в разделе 5.1. В следующем предпочтительном воплощении такие мутации кодируют сочетание аминокислотных замен, где это сочетание замененных аминокислотных остатков выбрано из группы, состоящей изG298. В следующем предпочтительном воплощении конкретные сочетания мутаций в аллелеaveC, полезные при эффективном снижении соотношения классов 2:1 авермектинов по настоящему изобретению, выбраны из одного или более чем одного из группы, состоящей из(и) А 139 Т/К 154E/Q298H. Далее согласно настоящему изобретению предложены композиции для создания новых штаммов S.avermitilis, клетки которых содержат мутированный аллель aveC, который приводит в результате к изменению продукции авермектинов. Например, согласно настоящему изобретению, предложены рекомбинантные векторы,которые можно использовать, чтобы направлять любую из полинуклеотидных молекул, содержащих мутированные нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению, к сайту гена aveC хромосомы S.avermitilis либо для вставки, либо для замещения ОРС aveC или ее части посредством гомологичной рекомбинацией. Согласно настоящему изобретению, однако, 35 полинуклеотидная молекула, содержащая мутированную нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, предложенная согласно настоящему изобретению, может также функционировать для модулирования биосинтеза авермектинов, когда она встроена в хромосому S.avermitilis в ином сайте, чем ген aveC, либо когда она поддерживается в клетках S.avermitilis в эписомном состоянии. Таким образом, согласно настоящему изобретению, также предложены векторы, содержащие полинуклеотидную молекулу, в которую включена мутированная нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению, причем эти векторы можно использовать для вставки этой полинуклеотидной молекулы в сайт хромосомы S.avermitilis, иной,чем ген aveC, либо для поддержания в эписомном состоянии. В предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению предложены векторы замещения гена, которые можно использовать для встраивания мутированного аллеляaveC или его вырожденного варианта в клетки штамма S.avermitilis, создавая таким образом новые штаммы S. avermitilis, клетки которых продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых этими клетками, является сниженным. Такие векторы замещения гена можно сконструировать,используя мутированные полинуклеотидные молекулы, находящиеся в векторах экспрессии,предложенные согласно настоящему изобретению, такие как, например, pSE188, pSE199 иpSE231, примеры которых приведены в разделе 8 ниже. В следующем предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению предложены векторы, которые можно использовать для встраивания мутированного аллеляaveC или его вырожденного варианта в клетки штамма S.avermitilis, чтобы создать новые штаммы из клеток, которые продуцируют измененные количества авермектинов по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении количество авермектинов, продуцируемое этими клетками, является повышенным. В конкретном,хотя неограничивающем, воплощении такой вектор дополнительно содержит сильный промотор, как известно в данной области техники,такой как, например, сильный конститутивный промотор ermE из Saccharopolyspora erythraea,который расположен в обратном направлении от аллеля aveC и в функциональной связи с ним. Таким вектором может являться плазмида 36 можно сконструировать, используя мутированный аллель aveC плазмиды pSE189. В следующем предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению предложены векторы замещения гена, которые являются полезными для инактивации гена aveC в штамме S.avermitilis дикого типа. В неограничивающем воплощении такие векторы замещения гена можно сконструировать, используя мутированную полинуклеотидную молекулу,находящуюся в плазмиде pSE180 (ATCC 209605), пример которой приведен в разделе 8.1 ниже (фиг. 3). Далее, согласно настоящему изобретению предложены векторы замещения гена,которые содержат полинуклеотидную молекулу,содержащую нуклеотидные последовательности, которые в природе фланкируют ген aveC insitu на хромосоме S.avermitilis, или состоящую из них, включая, например, фланкирующие нуклеотидные последовательности, которые показаны на фиг. 1 (SEQ ID NO:1), причем эти векторы можно использовать для делеций ОРСaveC S.avermitilis. Далее, согласно настоящему изобретению предложены способы создания новых штаммовS.avermitilis, содержащих клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC и которые продуцируют измененное соотношение и/или количество авермектинов по сравнению с клетками того же штамма S.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении,согласно настоящему изобретению предложен способ создания новых штаммов S.avermitilis,содержащих клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC и которые продуцируют измененное соотношение классов 2:1 авермектинов по сравнению с клетками того же штамма S.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа,при котором клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором, который несет мутированный аллель aveC, который кодирует генный продукт, который изменяет соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими его мутированный аллель aveC, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа,и отбирают трансформированные клетки, которые продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1, продуцируемым клетками штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В более предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ создания нового штамма S.avermitilis, при котором клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором, способным к введению мутации в аллель aveC таких клеток, где мутация этого аллеля aveC приводит к замене в кодируемом 37 генном продукте AveC на другой аминокислотный остаток в одном или более чем одном положении аминокислоты, соответствующем аминокислотным остаткам 38, 48, 55, 89, 99, 111,136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275,289 или 298 SEQ ID NO:2, такой что клетки штамма S.avermitilis, в которых аллель aveC мутирован таким образом, продуцируют соотношение классов 2:1 авермектинов, которое отличается от соотношения, продуцируемого клетками того же штамма S.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении это измененное соотношение классов 2:1 авермектинов является сниженным. Как использовано здесь, где аминокислотный остаток, кодируемый аллелем aveC на хромосоме S.avermitilis, либо в векторе, либо выделенной полинуклеотидной молекуле по настоящему изобретению, называют соответствующим конкретному аминокислотному остаткуSEQ ID NO:2, или где аминокислотную замену называют встречающейся в конкретном положении, соответствующем положению аминокислотного остатка с конкретным номером SEQID NO:2, это следует относить к аминокислотному остатку в том же относительном положении в генном продукте AveC, которое специалист в данной области техники может быстро определить относительно аминокислотной последовательности, представленной здесь какSEQ ID NO:2. Далее, согласно настоящему изобретению предложены способы создания новых штаммов,где конкретные мутации в аллеле aveC, кодирующие конкретные мутации, представлены как замены оснований в конкретных положениях нуклеотидов в аллеле aveC, соответствующие конкретным положениям нуклеотидов, как показано на SEQ ID NO:1. Как указано выше в отношении соответствующих положений аминокислот, где положение нуклеотида в аллелеaveC называют соответствующим конкретному положению нуклеотида в SEQ ID NO:1, это следует относить к нуклеотиду в том же относительном положении в нуклеотидной последовательности aveC, которое специалист в данной области может быстро определить относительно нуклеотидной последовательности, представленной здесь как SEQ ID NO:1. В следующем предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению,предложен способ создания новых штаммовS.avermitilis, содержащих клетки, которые продуцируют измененные количества авермектина,при котором клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором, который несет мутированный аллель гена aveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, экспрессия которого приводит в результате к изменению количества авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими 38 этот мутированный аллель aveC или эту генетическую конструкцию, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только единственный аллель aveC дикого типа, и отбирают трансформированные клетки, которые продуцируют авермектины в измененном количестве по сравнению с количеством авермектинов, продуцируемым клетками штамма, которые вместо этого экспрессируют только единственный аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении количество продуцируемых авермектинов в этих трансформированных клетках является повышенным. В следующем предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ создания новых штаммовS.avermitilis, клетки которых содержат инактивированный аллель aveC, при котором клетки штамма S.avermitilis, которые экспрессируют любой аллель aveC, трансформируют вектором,который инактивирует этот аллель aveC, и отбирают трансформированные клетки, в которых аллель aveC инактивирован. В предпочтительном, хотя неограничивающем, воплощении клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором замещения гена, который несет аллельaveC, который инактивирован в результате мутации или замещения части аллеля aveC последовательностью гетерологичного гена, и отбирают трансформированные клетки, в которых аллель aveC, в других отношениях нативный для них, замещен инактивированным аллелемaveC. Инактивацию аллеля aveC можно определить с помощью анализа посредством ВЭЖХ продуктов ферментации, как описано ниже. В конкретном, хотя неограничивающем воплощении, описанном в разделе 8.1 ниже, аллель aveC инактивируют вставкой гена ermE из Saccharopolyspora erythraea в ОРС aveC. Далее, согласно настоящему изобретению предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые трансформированы какой-либо полинуклеотидной молекулой или каким-либо вектором по настоящему изобретению. В предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению, предложены новые штаммы S.avermitHis, содержащие клетки,которые экспрессируют мутированный аллельaveC или его вырожденный вариант вместо или кроме аллеля aveC дикого типа, где эти клетки нового штамма продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1 авермектинов, продуцируемым клетками того же штамма,которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении это измененное соотношение классов 2:1, продуцируемое этими новыми клетками, является сниженным. Такие новые штаммы являются полезными в крупносерийном производстве авермектинов, желательных с коммерческой точки зрения, таких как дорамектин. ВS.avermitilis, содержащие какую-либо из вышеупомянутых мутаций или сочетаний мутаций в аллеле aveC в положениях нуклеотидов, соответствующих положениям, представленным здесь выше, или иначе которые кодируют какую-либо из вышеупомянутых аминокислотных замен в генном продукте AveC. Хотя такие мутации могут быть представлены в таких клетках во внехромосомном элементе, таком как плазмида, предпочтительно, чтобы такие мутации были представлены в аллеле aveC, локализованном на хромосоме S.avermitilis. В предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложен штамм Streptomyces avermitilis, содержащий клетки, имеющие мутацию в аллеле aveC, который кодирует генный продукт AveC, имеющий замену в одном или более чем одном положении аминокислот, соответствующем аминокислотным остаткам 38, 48, 55,89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238,266, 275, 289 или 298 SEQ ID NO:2, где эта клетка продуцирует соотношение классов 2:1 авермектинов, которое отличается от соотношения, продуцируемого клеткой того же штаммаS.avermitilis, которая экспрессирует аллель aveC дикого типа. Основной задачей описанных здесь скрининговых анализов является идентификация мутированных аллелей гена aveC, экспрессия которых в клетках S.avermitilis изменяет и, более конкретно, снижает соотношение классов 2:1 продуцируемых авермектинов. В предпочтительном воплощении соотношение авермектинов В 2:В 1, продуцируемых клетками нового штамма S. avermitilis по настоящему изобретению, экспрессирующими мутированный аллельaveC или его вырожденный вариант, по настоящему изобретению составляет примерно 1,6:1 или менее. В более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 1:1 или менее. В более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,84:1 или менее. В более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,80:1 или менее. В более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,75:1 или менее. В более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,73:1 или менее. В более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,68:1 или менее. В еще более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,67:1 или менее. В более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,57:1 или менее. В еще более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,53:1 или менее. В еще более предпочтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,42:1 или менее. В еще более пред 004569 40 почтительном воплощении это соотношение составляет примерно 0,40:1 или менее. В конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексилВ 2:циклогексил-В 1 в соотношении менее чем 1,6:1. В другом конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-В 2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,94:1. В следующем другом конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-В 2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,88:1. В следующем другом конкретном воплощении, описанном ниже,новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-B2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,84:1. В еще одном другом конкретном воплощении,описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-B2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,75:1. В еще одном другом конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,73:1. В еще одном другом конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,68:1. В еще одном другом конкретном воплощении,описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,67:1. В еще одном другом конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,57:1. В еще одном другом конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,53:1. В еще одном другом конкретном воплощении,описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,42:1. В еще одном другом конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил-2:циклогексил-В 1 в соотношении примерно 0,40:1. В следующем предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант либо генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC или его вырожденный вариант, вместо или кроме аллеля aveC дикого 41 типа, где эти клетки этого нового штамма продуцируют измененное количество авермектинов по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллельaveC дикого типа. В предпочтительном воплощении этот новый штамм продуцирует повышенное количество авермектинов. В неограничивающем воплощении эта генетическая конструкция дополнительно содержит сильный промотор, такой как сильный конститутивный промотор ermE из Saccharopolyspora erythraea в обратном направлении от ОРС aveC или в функциональной связи с ней. В следующем предпочтительном воплощении, согласно настоящему изобретению,предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, в которых ген aveC инактивирован. Такие штаммы являются полезными как для иного спектра авермектинов, которые они продуцируют по сравнению со штаммом дикого типа, так и для скрининговых анализов комплементации, как описано здесь, чтобы определить, воздействует ли направленный или неспецифический мутагенез гена aveC на продукцию авермектинов. В конкретном воплощении, описанном ниже, с помощью генной инженерии были сконструированы клетки-хозяеваS.avermitilis таким образом, что они содержат инактивированный ген aveC. Например, штаммSE180-11, описанный в приведенных ниже примерах, был создан при использовании плазмиды замещения гена pSE180 (ATCC 209605) (фиг. 3),которую сконструировали таким образом, что она инактивирует ген aveC S.avermitilis посредством вставки гена устойчивости ermE в кодирующий район aveC. Далее, согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантно экспрессированные мутированные генные продуктыS.avermitilis, кодируемые какой-либо из вышеупомянутых полинуклеотидных молекул по изобретению, и способы их получения. Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ получения авермектинов, при котором культивируют клетки штаммаS.avermitilis, причем эти клетки экспрессируют мутированный аллель aveC, который кодирует генный продукт, который изменяет соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, в культуральных средах при условиях, которые дают возможность продукции из них авермектинов или индуцируют ее, и выделяют указанные авермектины из этой культуры. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых в культуре клетками, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC, является сниженным. Данный способ обеспечивает повышенную 42 эффективность в производстве авермектинов,важных с коммерческой точки зрения, таких как дорамектин. Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ получения авермектинов, при котором культивируют клетки штаммаS.avermitilis, причем эти клетки экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, что приводит в результате к продукции измененного количества авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, по сравнению с клетками того же штамма, которые не экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, но вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, в культуральных средах при условиях, которые дают возможность продукции из них авермектинов или индуцируют ее, и выделяют указанные авермектины из этой культуры. В предпочтительном воплощении количество авермектинов, продуцируемое в культуре клетками, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC, его вырожденный вариант или генетическую конструкцию, является повышенным. Далее, согласно настоящему изобретению предложена новая композиция авермектинов,продуцируемых штаммом S.avermitilis, экспрессирующим мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, который кодирует генный продукт, который снижает соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа,причем авермектины в этой новой композиции продуцируются в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Эту новую композицию авермектинов можно представить в виде продуцируемой в истощенной ферментационной культуральной жидкости, либо эту композицию можно собрать из этой жидкости. Эту новую композицию авермектинов можно частично или существенно очистить от этой культуральной жидкости с помощью известных биохимических методик очистки, как, например, с помощью фракционирования сульфатом аммония, диализа, фракционирования по размеру, ионообменной хроматографии, ВЭЖХ и так далее. 5.4. Применение авермектинов Авермектины являются высоко активными противопаразитарными агентами, обладающими особенной пользой в качестве антигельминтных агентов, эктопаразитицидов, инсектицидов и 43 акарицидов. Авермектиновые соединения, полученные согласно способам по настоящему изобретению, являются полезными для любой из этих целей. Например, авермектиновые соединения, полученные согласно настоящему изобретению, являются полезными для лечения различных заболеваний или состояний у людей,в частности, если эти заболевания или состояния вызваны паразитными инфекциями, как известно в данной области техники. См., например, Ikeda and Omura, 1997, Chem. Rev. 97 (7): 2591-2609. Более конкретно авермектиновые соединения, полученные согласно настоящему изобретению, являются эффективными при лечении ряда заболеваний или состояний, вызванных эндопаразитами, такими как паразитические нематоды, которые могут инфицировать людей, домашних животных, свиней, овец, домашнюю птицу, лошадей или крупный рогатый скот. Более конкретно авермектиновые соединения, полученные согласно настоящему изобретению, являются эффективными против нематод, которые инфицируют людей, а также против нематод, которые инфицируют различные виды животных. Такие нематоды включают в себя паразитов желудочно-кишечного тракта,таких как Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichurus, Enterobius, Dirofilaria, и паразитов, которых обнаруживают в крови или других тканях или органах,таких как филарии и внекишечные состоянияStrongyloides и Trichinella. Авермектиновые соединения, полученные согласно настоящему изобретению, также являются полезными при лечении эктопаразитарных инфекций, включая, например, инвазии членистоногих у млекопитающих и птиц, вызванные иксодовыми клещами, клещами, вшами, блохами, падальными мухами, жалящими насекомыми или мигрирующими личинками двукрылых, которые поражают, среди прочих,крупный рогатый скот и лошадей. Авермектиновые соединения, полученные согласно настоящему изобретению, также являются полезными в качестве инсектицидов против домашних паразитов, таких как, например, среди прочего, таракан, платяная моль, антренус и комнатная муха, а также насекомыхпаразитов зерна на хранении и сельскохозяйственных растений, которые включают в себя,среди прочего, паутинных клещиков, тлей, гусениц и прямокрылых, таких как саранча. Животные, которых можно лечить авермектиновыми соединениями, продуцируемыми согласно настоящему изобретению, включают в себя овец, крупный рогатый скот, лошадей, оленей,коз, свиней, птиц, включая домашнюю птицу, а также собак и кошек. Авермектиновое соединение, полученное согласно настоящему изобретению, вводят в препарате, подходящем для конкретного пред 004569 44 назначенного применения, конкретного вида животного-хозяина, которое нужно лечить, и от вовлеченного паразита или насекомого. Для применения в качестве паразитицида авермектиновое соединение, полученное согласно настоящему изобретению, можно вводить перорально в форме капсулы, болюса, таблетки или жидкого вливания, либо альтернативно его можно вводить в виде обливания, либо путем инъекции, либо в виде имплантата. Такие препараты приготавливают общепринятым способом в соответствии со стандартной ветеринарной практикой. Так, капсулы, болюсы или таблетки можно приготовить путем смешивания активного ингредиента с подходящим тонкоизмельченным разбавителем или носителем, дополнительно содержащим разрыхляющий агент и/или связывающий агент, такой как крахмал,лактоза, тальк, стеарат магния и так далее. Препарат для жидкого вливания можно приготовить путем диспергирования активного ингредиента в водном растворе вместе с диспергирующим или увлажняющим агентом и так далее. Препараты для инъекций можно приготовить в форме стерильного раствора, который может содержать другие вещества, такие как, например, достаточные количества солей и/или глюкозы, чтобы сделать этот раствор изотоническим с кровью. Такие препараты будут варьировать относительно массы активного соединения в зависимости от пациента или от вида животногохозяина, которых нужно лечить, от тяжести и типа инфекции и от массы тела хозяина. Как правило, для перорального введения доза активного соединения от примерно 0,001 до 10 мг на кг массы тела пациента или животного, которую дают в виде разовой дозы или разделенных дозах в течение периода от 1 до 5 суток, будет достаточной. Однако могут быть случаи, когда показаны более высокие или более низкие диапазоны дозировки, как определяет, например,врач или ветеринар на основании клинических симптомов. В качестве альтернативы авермектиновое соединение, полученное согласно настоящему изобретению, можно вводить в комбинации с кормом для животного и для этой цели можно приготовить концентрированную пищевую добавку или премикс для смешивания с обычным кормом для животного. Для применения в качестве инсектицида и для обработки сельскохозяйственных паразитов авермектиновое соединение, полученное согласно настоящему изобретению, можно применять в виде распыляемого раствора, пыли,эмульсии и тому подобного в соответствии со стандартной сельскохозяйственной практикой. 6. Пример. Ферментация streptomyces avermitilis и анализ авермектинов В 2:В 1 Штаммы, у которых отсутствует как активность 2-оксокислота с разветвленной цепью 45 дегидрогеназы, так и активность 5-О-метилтрансферазы, не продуцируют авермектины,если в ферментационную среду не вводят жирные кислоты. Данный пример демонстрирует,что у таких мутантов можно получить широкий диапазон соотношений авермектинов В 2:В 1,когда биосинтез инициируется в присутствии различных жирных кислот. 6.1. Материалы и методыStreptomyces avermitilis ATCC 53692 хранили при -70 С в виде полного бульона, полученного в посевной среде, состоящей из крахмала (Nadex, Laing National) - 20 г; Pharmamedia- 1 г. Конечный объем доводили до 1 л водопроводной водой; рН доводили до 7,2 и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. 2 мл оттаявшей суспензии указанного выше препарата использовали для засева колбы,содержащей 50 мл такой же среды. После 48 ч инкубации при 28 С на роторной качалке при 180 об./мин 2 мл этого бульона использовали для засева колбы, содержащей 50 мл производственной питательной среды, состоящей из крахмала - 80 г; карбоната кальция - 7 г; Pharmamedia - 5 г; гидрофосфата калия - 1 г; сульфата магния - 1 г; глутаминовой кислоты - 0,6 г; гептагидрата сульфата железа(II) - 0,01 г; сульфата цинка - 0,001 г; тетрагидрата сульфата марганца - 0,001 г. Конечный объем доводили до 1 л водопроводной водой; рН доводили до 7,2, и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. Различные субстраты, представляющие собой карбоновые кислоты (см. табл. 1), растворяли в метаноле и добавляли в ферментационный бульон через 24 ч после засева до получения конечной концентрации 0,2 г/л. Этот ферментационный бульон инкубировали в течение 14 суток при 28 С, затем этот бульон центрифугировали (2500 об./мин в течение 2 мин) и отбрасывали супернатант. Мицелиальный осадок экстрагировали ацетоном (15 мл), затем дихлорметаном (30 мл) и органическую фазу отделяли, фильтровали, затем выпаривали досуха. Остаток растворяли в метаноле (1 мл) и анализировали с помощью ВЭЖХ жидкостным хроматографом Hewlett-Packard 1090A, оборудованным сканирующим детектором с диодной матрицей, установленным на 240 нм. Используемая колонка представляла собой колонкуBeckman Ultrasphere C-18, 5 мкм, 4,6 мм х 25 см,поддерживаемую при 40 С. 25 мкл указанного выше метанольного раствора впрыскивали на колонку. Элюцию осуществляли линейным градиентом метанол-вода от 80:20 до 95:5 в течение 40 мин при 0,85 мл/мин. Для калибровки ответа детектора использовали две стандартные концентрации циклогексил-В 1 и измеряли площадь под кривыми для авермектинов В 2 и В 1. 46 6.2. Результаты Время удерживания при ВЭЖХ, наблюдаемое для авермектинов В 2 и В 1, и соотношения 2:1 представлены в табл. 1. Таблица 1 Данные, представленные в табл. 1, демонстрируют чрезвычайно широкий диапазон соотношений авермектиновых продуктов В 2:В 1,указывая на значительное различие в результатах дегидратационного превращения соединений класса 2 в соединения класса 1 в зависимости от природы стартовой единицы боковой цепи добавленной жирной кислоты. Это указывает на то, что изменения в соотношениях В 2:В 1, являющиеся результатом изменений белка AveC, могут быть специфическими для конкретных субстратов. Следовательно, скрининг мутантов, проявляющих изменения в соотношении В 2:В 1, полученном при конкретном субстрате, необходимо проводить в присутствии данного субстрата. В последующих примерах,описанных ниже, в качестве субстрата для скрининга используют циклогексанкарбоновую кислоту. Однако этот субстрат используют исключительно для того, чтобы привести пример потенциала, и он не предназначен для ограничения применимости настоящего изобретения. 7. Пример. Выделение гена aveC В данном примере описано выделение и характеристика района хромосомы Streptomycesavermitilis, который кодирует генный продуктAveC. Как продемонстрировано ниже, ген aveC был идентифицирован как ген, способный к модификации соотношения продуцируемых авермектинов циклогексил-В 2: циклогексил-В 1. 7.1. Материалы и методы 7.1.1. Культивирование Streptomyces для выделения ДНК Для культивирования Streptomyces использовали следующий способ. Единичные колонииS.avermitilis ATCC 31272 (изолят единичной колонии 2) выделяли на среде YPD-6 1/2 концентрации, содержащей дрожжевой экстракт 47 Конечный объем доводили до 1 л дистиллированной Н 2 О; рН доводили до 7,0 и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. Мицелии, выращенные на вышеуказанной среде, использовали для засева 10 мл среды TSB(трипсинизированный соевый бульон Difco - 30 г в 1 л дистиллированной Н 2 О автоклавировали при 121 С в течение 25 мин) в пробирке 25 мм х 150 мм, которую поддерживали при встряхивании (300 об./мин) при 28 С в течение 48-72 ч. 7.1.2. Выделение хромосомной ДНК из Streptomyces Аликвоты (0,25 мл или 0,5 мл) мицелиев,выращенных, как описано выше, помещали в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и клетки концентрировали центрифугированием при 12000xg в течение 60 с. Супернатант отбрасывали, и клетки ресуспендировали в 0,25 мл буфера TSE (20 мл 1,5 М сахарозы, 2,5 мл 1 М Трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мл 1 М ЭДТА, рН 8,0 и 75 мл дистиллированной Н 2 О), содержащего 2 мг/мл лизоцима. Образцы инкубировали при 37 С в течение 20 мин при встряхивании, загружали в автоматизированный аппарат для выделения нуклеиновых кислот AutoGen 540(Integrated Separation Systems, Natick, MA) и выделяли геномную ДНК, используя цикл 159 программного обеспечения согласно инструкциям изготовителя. Альтернативно 5 мл мицелиев помещали в пробирку 17 мм х 100 мм, клетки концентрировали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 5 мин и удаляли супернатант. Клетки ресуспендировали в 1 мл буфера TSE, концентрировали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 5 мин и удаляли супернатант. Клетки ресуспендировали в 1 мл буфера TSE,содержащего 2 мг/мл лизоцима, и инкубировали при 37 С при встряхивании в течение 30-60 мин. После инкубации добавляли 0,5 мл 10% додецилсульфата натрия (ДСН), и клетки инкубировали при 37 С до тех пор, пока лизис не был полным. Лизат инкубировали при 65 С в течение 10 мин, охлаждали до комнатной температуры, делили на две 1,5 мл пробирки Эппендорфа и экстрагировали 1 х 0,5 мл смеси фенол/хлороформ (50% фенола, предварительно уравновешенного 0,5 М Трис, рН 8,0; 50% хлороформа). Водную фазу отбирали и экстрагировали от 2 до 5 х хлороформом: изоамиловым спиртом (24:1). ДНК осаждали добавлением 1/10 об. 3 М ацетата натрия, рН 4,8, инкубацией этой смеси на льду в течение 10 мин, центрифугированием этой смеси при 15000 об./мин при 5 С в течение 10 мин и отбором супернатанта в чистую пробирку, в которую добавляли 1 объем изопропанола. Смесь супернатанта и изопропанола затем инкубировали на льду в течение 20 мин, центрифугировали при 15000 об./мин в течение 20 мин при 5 С, удаляли супернатант, и осадок ДНК промывали 1 х 70% этанолом. После того, как осадок высыхал, ДНК ресуспенди 004569 48 ровали в буфере ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА,рН 8,0). 7.1.3. Выделение плазмидной ДНК из Streptomyces Аликвоту (1,0 мл) мицелиев помещали в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и клетки концентрировали центрифугированием при 12000xg в течение 60 с. Супернатант отбрасывали, клетки ресуспендировали в 1,0 мл 10,3% сахарозы и концентрировали центрифугированием при 12000xg в течение 60 с и супернатант отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в 0,25 мл буфера TSE, содержащего 2 мг/мл лизоцима, и инкубировали при 37 С в течение 20 мин при встряхивании и загружали в автоматизированный аппарат для выделения нуклеиновых кислот AutoGen 540. Плазмидную ДНК выделяли, используя цикл 106 программного обеспечения согласно инструкциям изготовителя. Альтернативно 1,5 мл мицелиев помещали в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и клетки концентрировали центрифугированием при 12000xg в течение 60 с. Супернатант отбрасывали, клетки ресуспендировали в 1,0 мл 10,3% сахарозы и концентрировали центрифугированием при 12000xg в течение 60 с и супернатант отбрасывали. Клетки ресуспендировали в 0,5 мл буфера TSE, содержащего 2 мг/мл лизоцима, и инкубировали при 37 С в течение 15-30 мин. После инкубации добавляли 0,25 мл щелочного ДСН (0,3 н. NaOH, 2% ДСН), и клетки инкубировали при 55 С в течение 15-30 мин или пока раствор не становился прозрачным. К этому раствору ДНК добавляли ацетат натрия (0,1 мл,3 М, рН 4,8), который затем инкубировали на льду в течение 10 мин. Образцы ДНК центрифугировали при 14000 об./мин в течение 10 мин при 5 С. Супернатант отбирали в чистую пробирку, добавляли 0,2 мл смеси фенол: хлороформ (50% фенола : 50% хлороформа) и осторожно перемешивали. Этот раствор ДНК центрифугировали при 14000 об./мин в течение 10 мин при 5 С и верхний слой отбирали в чистую пробирку Эппендорфа. Добавляли изопропанол(0,75 мл), и этот раствор осторожно перемешивали, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Этот раствор ДНК центрифугировали при 14000 об./мин в течение 15 мин при 5 С, удаляли супернатант и осадок ДНК промывали 70% этанолом, сушили и ресуспендировали в буфере ТЕ. 7.1.4. Выделение плазмидной ДНК из E.coli Единичную трансформированную колонию E.coli инокулировали в 5 мл среды ЛуриаБертани (LB) (бакто-триптон - 10 г, бактодрожжевой экстракт - 5 г, и NaCl - 10 г в 1 л дистиллированной Н 2 О, рН 7,0, автоклавировапи при 121 С в течение 25 мин и добавляли 100 мкг/мл ампициллина). Культуру инкубировали в течение ночи и аликвоту 1 мл помещали в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Эти образцы 49 культур загружали в автоматизированный аппарат для выделения нуклеиновых кислот AutoGen 540 и плазмидную ДНК выделяли, используя цикл 3 программного обеспечения согласно инструкциям изготовителя. 7.1.5. Получение и трансформация протопластов S.avermitilis Единичные колонии S.avermitilis выделяли на среде YPD-6 1/2 концентрации. Мицелии использовали для инокуляции 10 мл среды TSB в пробирке 25 х 150 мм, которую затем инкубировали при встряхивании (300 об./мин) при 28 С в течение 48 ч. Один мл этих мицелиев использовали для инокуляции 50 мл средыYEME. Среда YEME содержит на литр дрожжевого экстракта Difco - 3 г; бакто-пептона Difco 5 г; солодового экстракта Difco - 3 г; сахарозы 300 г. После автоклавирования при 121 С в течение 25 мин добавляли следующее: 2,5 М(стерилизованный фильтрованием) - 25 мл. Мицелии выращивали при 30 С в течение 48-72 ч и собирали центрифугированием в 50 мл центрифужной пробирке (Falcon) при 3000 об./мин в течение 20 мин. Супернатант отбрасывали и мицелии ресуспендировали в буфере Р, который содержит сахарозу - 205 г; K2SO4 0,25 г; MgCl26H2O - 2,02 г; Н 2 О - 600 мл; К 2 РО 4CaCl22H2O (3,68%) - 100 мл и буфер MES (2-(Nморфолино)этансульфоновая кислота) (1,0 М,рН 6,5) - 10 мл. (Раствор микроэлементов содержит на литр ZnCl2 - 40 мг; FeCl36H2O - 200 мг; CuCl22H2O - 10 мг; MnCl24H2O - 10 мг;Na2B4C710H2O - 10 мг; (NH4)6Mo7O244H2O - 10 мг). рН доводили до 6,5, конечный объем доводили до 1 л и среду фильтровали горячей через фильтр 0,45 мкм. Мицелии осаждали при 3000 об./мин в течение 20 мин, супернатант отбрасывали и мицелии ресуспендировали в 20 мл буфера Р, содержащего 2 мг/мл лизоцима. Мицелии инкубировали при 35 С в течение 15 мин при встряхивании и проверяли под микроскопом, чтобы определить степень образования протопластов. Когда образование протопластов было полным, эти протопласты центрифугировали при 8000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант удаляли и протопласты ресуспендировали в 10 мл буфера Р. Протопласты центрифугировали при 8000 об./мин в течение 10 мин, супернатант удаляли,протопласты ресуспендировали в 2 мл буфера Р,и примерно по 1 x 109 протопластов распределяли по 2,0 мл криогенным флаконам (Nalgene). Флакон, содержащий 1 x 109 протопластов,центрифугировали при 8000 об./мин в течение 10 мин, супернатант удаляли и протопласты ресуспендировали в 0,1 мл буфера Р. От двух до 5 мкг трансформирующей ДНК добавляли к протопластам с немедленным последующим 50 добавлением 0,5 мл рабочего буфера Т. Основа буфера Т содержит ПЭГ-1000 (Sigma) - 25 г; сахарозы - 2,5 г; Н 2 О - 83 мл. рН доводили до 8,8 1 н. NaOH (стерилизованного фильтрованием) и основу буфера Т стерилизовали фильтрованием и хранили при 4 С. Рабочий буфер Т,изготовленный в сутки использования, составлял: основа буфера Т - 8,3 мл; К 2 РО 4 (4 мМ) - 1,0 мл; CaCl22H2O (5 М) - 0,2 мл и TES (Nтрисгидроксиметил)метил)-2-аминоэтансульфоновая кислота) (1 М, рН 8) - 0,5 мл. Каждый компонент рабочего буфера Т индивидуально стерилизовали фильтрованием. В течение 20 с добавления к протопластам буфера Т добавляли также 1,0 мл буфера Р и протопласты центрифугировали при 8000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали и протопласты ресуспендировали в 0,1 мл буфера Р. Затем протопласты высевали на среду RM14, которая содержит сахарозы - 205 г;K2SO4 - 0,25 г; MgCl26H2O - 10,12 г; глюкозы 10 г; казаминовых кислот Difco - 0,1 г; дрожжевого экстракта Difco - 5 г; агара из овсяной мукиDifco - 3 г; бакто-агара Difco - 22 г; дистиллированной Н 2 О - 800 мл. Этот раствор автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. После автоклавирования добавляли следующие стерильные исходные растворы: К 2 РО 4 (0,5%) - 10 мл;CaCl22H2O (5 М) - 5 мл; L-пролин (20%) - 15 мл; буфер MES (1,0 М, рН 6,5) -10 мл; раствор микроэлементов (такой, как выше) - 2 мл; исходный раствор циклогексимида (25 мг/мл) - 40 мл и 1 н. NaOH - 2 мл. Аликвоту 25 мл средыRM14 наливали на чашку и чашки сушили в течение 24 ч перед использованием. Протопласты инкубировали при влажности 95% при 30 С в течение 20-24 ч. Чтобы отобрать трансформанты, устойчивые к тиострептону, 1 мл буфера верхнего слоя, содержащего 125 мкг на мл тиострептона, равномерно распределяли по регенерационным чашкам RM14. Буфер верхнего слоя содержит на 100 мл сахарозы - 10,3 г; раствора микроэлементов (такой,как выше) - 0,2 мл и MES (1 М, рН 6,5) - 1 мл. Протопласты инкубировали при 95% влажности при 30 С в течение 7-14 суток, пока устойчивые к тиострептону колонии (Thio) не становились видимыми. 7.1.6. Трансформация протопластовS.lividans ТК 64 (предоставленный John Innes Institute, Norwich, UK) в некоторых случаях использовали для трансформаций. Способы и композиции для культивирования, получения протопластов и трансформации S.lividans описаны в Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. JohnInnes Foundation, Norwich, UK, и их осуществляли, как описано там. Плазмидную ДНК выделяли из трансформантов S.lividans, как описано выше в разделе 7.1.3.YPD-6 1/2 концентрации в течение 4-7 суток инокулировали в пробирки 1 x 6 дюймов (2,5 x 15 см), содержащие 8 мл преформированной среды и две 5 мм стеклянные гранулы. Преформированная среда содержит растворимый крахмал (либо разбавленный кипяченый крахмал,либо KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 г/л; Pharmamedia - 15 г/л; Ardamine pH - 5 г/лbcfa (bcfa относится к жирным кислотам с разветвленной цепью), содержащие конечную концентрацию в среде 50 x 10-3 2-(+/-)метилмасляной кислоты, 60 x 10-3 изомасляной кислоты и 20 x 10-3 изовалериановой кислоты. рН доводили до 7,2, и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. Пробирку встряхивали под углом 17 при 215 об./мин при 29 С в течение 3 суток. 2 мл аликвоту посевной культуры использовали для инокуляции 300 мл колбы Эрленмейера, содержащей 25 мл продукционной среды, которая содержит крахмал (либо тонко измельченный кипяченый крахмал, либо KOSO) - 160 г/л; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) - 10 г/л; Ardamine pH - 10 г/л; K2HPO4 - 2 г/л;- 14 г/л; 2 х bcfa (как выше) и циклогексанкарбоновая кислота (ЦКК) (приготовленная в виде 20% раствора при рН 7,0) - 800x10-3. рН доводили до 6,9, и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. После инокуляции колбу инкубировали при 29 С в течение 12 суток при встряхивании при 200 об./мин. После инкубации 2 мл образец отбирали из колбы, разбавляли 8 мл метанола,перемешивали и эту смесь центрифугировали при 1250xg в течение 10 мин, чтобы осадить дебрис. Затем супернатант анализировали с помощью ВЭЖХ, используя колонку BeckmanUltrasphere ODS (25 см х 4,6 мм внутренний диаметр) при скорости тока 0,75 мл/мин и обнаружении по поглощению при 240 нм. Подвижную фазу составляли 86/8,9/5,1 метанол/ вода/ацетонитрил. 7.1.8. Выделение генов PKS S. avermitilis Космидную библиотеку хромосомной ДНКS.avermitilis (ATCC 31272, SC-2) получали и гибридизовали с зондом кетосинтазы (KS), полученным из фрагмента гена поликетидсинтазы(PKS) Saccharopolyspora erythraea. Подробное описание получения космидных библиотек можно найти в Sambrook et al., 1989, см. выше. Подробное описание получения библиотек хромосомной ДНК Streptomyces представлено вDr. P. Leadlay, Cambridge, UK). Примерно 5 нг рЕХ 26 подвергали ферментативному гидролизу,используя Ndel и Есо 47IIII. Реакционную смесь наносили на 0,8% агарозный гель SeaPlaqueGTG (FMC BioProducts, Rockland, ME). Фрагмент 2,7 т. п. н. Ndel/Eco47III после электрофореза вырезали из геля и выделяли ДНК из геля,используя GELase от Epicentre Technologies,используя быстрый протокол. Фрагмент 2,7 т. п. н. Ndel/Eco47III метили [-32P]dCTP (дезоксицитидин-5'-трифосфат, соль тетра(триэтиламмония), [-32P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA),используя систему ник-трансляции BRL (BRLLife Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), выполняя инструкции поставщика. Типичную реакцию проводили в объеме 0,05 мл. После добавления 5 мкл остановочного буфера меченую ДНК отделяли от невключенных нуклеотидов,используя колонку G-25 Sephadex Quick Slin(Boehringer Mannheim), следуя инструкциям поставщика. Примерно 1800 космидных клонов подвергали скринингу на гибридизацию колоний. Идентифицировали десять клонов, которые проявляли сильную гибридизацию с зондом KSLB и выделяли космидную ДНК из каждой культуры в автоматизированном инструменте для выделения нуклеиновых кислот AutoGen 540, используя цикл 3 программного обеспечения, согласно инструкциям изготовителя. Анализы с помощью картирования рестрикционными эндонуклеазами и Саузерн-блотгибридизации выявили, что пять из десяти клонов содержат перекрывающиеся хромосомные районы. Геномную карту рестрикции S. avermitilis no BamHI пяти космид (т. е. pSE65, pSE66,pSE67, pSE68, pSE69) сконструировали с помощью анализа перекрывающихся космид и гибридизации (фиг. 4). 7.1.9. Идентификация ДНК, которая модулирует соотношения авермектинов В 2:В 1 и идентификация ОРС aveC Следующие способы использовали для тестирования субклонированных фрагментов,выделенных из космидного клона pSE66, на их способность модулировать соотношения авермектинов В 2:В 1 у мутантов AveC. pSE66 (5 мкг) подвергали ферментативному гидролизу SacI иBamHI. Реакционную смесь наносили на 0,8% агарозный гель SeaPlaque GTG (FMC BioProducts), фрагмент 2,9 т. п. н. SacI/BamHI после электрофореза вырезали из геля и выделяли ДНК из геля, используя GELase (EpicentreTechnologies), используя быстрый протокол. Примерно 5 мкг челночного вектора pWHM3(Vara et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 5872-5881) подвергали ферментативному гидролизу SacI иBamHI. Примерно 0,5 мкг вставки 2,9 т. п. н. и 0,5 мкг подвергнутого ферментативному гидролизу pWHM3 смешивали вместе и инкубировали в течение ночи с 1 ед. лигазы (New EnglandBiolabs, Inc., Beverly, MA) при 15 С в суммарном объеме 20 мкл согласно инструкциям поставщика. После инкубации 5 мкл этой лигазной смеси инкубировали при 70 С в течение 10 мин,охлаждали до комнатной температуры и использовали для трансформации компетентных клеток Е.coli DH5 (BRL) согласно инструкциям изготовителя. Плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов и подтверждали наличие вставки 2,9 т. п. н.SacI/BamHI с помощью рестрикционного анализа. Эту плазмиду обозначили как pSE119. Протопласты штамма S.avermitilis 1100SC38 (фирменный штамм Pfizer) получали и трансформировали pSE119, как описано в разделе 7.1.5 выше. Штамм 1100-SC38 представляет собой мутант, который продуцирует значительно больше формы авермектина циклогексил-В 2 по сравнению с формой циклогексил-В 1 при снабжении циклогексанкарбоновой кислотой (В 2:В 1 примерно 30:1). pSE119, использованную для трансформации протопластовS.avermitilis, выделили либо из штамма Е. coliGM2163 (полученного от Dr. В. J. Bachmann,Curator, Е. coli Genetic Stock Center, Yale University), штамма E. coli DM1 (BRL), либо из штамма S.lividans TK64. Устойчивые к тиострептону трансформанты штамма 1100-SC38 выделяли и анализировали с помощью ВЭЖХ анализа продуктов ферментации. Трансформанты штаммаS.avermitilis 1100-SC38, содержащие pSE119,продуцировали измененное соотношение авермектинов циклогексил-В 2:циклогексил-В 1 примерно 3,7:1 (табл. 2). Как только установили, что pSE119 способна модулировать соотношения авермектинов В 2:В 1, ДНК вставки секвенировали. Примерно 10 мкг pSE119 выделяли, используя набор для выделения плазмидной ДНК (Qiagen, Valencia,СА), следуя инструкциям изготовителя, и секвенировали, используя автоматизированный секвенатор ДНК ABI 373A (Perkin Elmer, FosterCity, CA). Данные секвенирования собирали и редактировали, используя программы Генетической компьютерной группы (GCG, genetic Computer Group, Madison, Wl). Последовательность ДНК и ОРС aveC представлены на фиг. 1 (SEQpSE118, конструировали следующим образом. Примерно 5 мкг pSE66 подвергали ферментативному гидролизу SphI и BamHI. Реакционную смесь наносили на 0,8% агарозный гель SeaPlaque GTG (FMC BioProducts), фрагмент 2,8 т. п. н. SphI/BamHI после электрофореза вырезали из геля и выделяли ДНК из геля, используя GELase (Epicentre Technologies), используя быстрый протокол. Примерно 5 мкг челночного век 004569 54 тора pWHM3 подвергали ферментативному гидролизу SphI и BamHI. Примерно 0,5 мкг вставки 2,8 т. п. н. и 0,5 мкг подвергнутого ферментативному гидролизу pWHM3 смешивали вместе и инкубировали в течение ночи с 1 ед. лигазы (New England Biolabs) при 15 С в суммарном объеме 20 мкл согласно инструкциям поставщика. После инкубации 5 мкл этой лигазной смеси инкубировали при 70 С в течение 10 мин, охлаждали до комнатной температуры и использовали для трансформации компетентных клеток Е. coli DH5 согласно инструкциям изготовителя. Плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов и подтверждали наличие вставки 2,8 т. п. н.SphI/BamHI с помощью рестрикционного анализа. Эту плазмиду обозначили как pSE118. ДНК вставки в pSE118 и pSE119 перекрываются примерно на 838 нуклеотидов (фиг. 4). Протопласты штамма S.avermitilis 1100SC38 трансформировали pSE118, как описано выше. Устойчивые к тиострептону трансформанты штамма 1100-SC38 выделяли и анализировали с помощью ВЭЖХ анализа продуктов ферментации. Трансформанты штаммаS.avermitilis 1100-SC38, содержащие pSE118, не были изменены по соотношению авермектина циклогексил-В 2:авермектина циклогексил-В 1 по сравнению со штаммом 1100-SC38 (табл. 2). 7.1.10. ПЦР амплификация гена aveC из хромосомной ДНК S.avermitilis Фрагмент 1,2 т. п. н., содержащий ОРСaveC выделяли из хромосомной ДНКS.avermitilis с помощью ПЦР амплификации,используя праймеры, сконструированные на основании нуклеотидной последовательностиaveC, полученной выше. Праймеры ПЦР были предоставлены Genosys Biotechnologies, Inc.(Texas). Правый праймер представлял собой: 5'TCACGCCGGACACAC-3' (SEQ ID NO:6),а левый праймер представлял собой: 5'CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO:7). Реакцию ПЦР проводили с полимеразой DeepVent (New England Biolabs) в буфере, поставляемом изготовителем, и в присутствии 300 мкМ дНТФ, 10% глицерина, 200 пмоль каждого праймера, 0,1 мкг матрицы и 2,5 ед. фермента в конечном объеме 100 мкл, используя термоциклер Perkin-Elmer Cetus. Температурный профиль первого цикла составлял 95 С в течение 5 мин(стадия отжига) и 72 С в течение 2 мин (стадия элонгации). Следующие 24 цикла имели подобный температурный профиль за исключением того, что стадию денатурации сокращали до 45 с, а стадию отжига сокращали до 1 мин. Продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и обнаружили единственную полосу ДНК 1,2 т. п. н. Эту ДНК очищали из геля и лигировали с 25 нг линеаризованного вектора с тупыми концами pCR-Blunt (Invitro 55gen) в молярном соотношении вектор-вставка 1:10, следуя инструкциям изготовителя. Эту лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток Е. coli One Shot(Invitrogen), следуя инструкциям изготовителя. Плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов, и наличие вставки 1,2 т. п. н. подтверждали с помощью рестрикционного анализа. Эту плазмиду обозначили как pSE179. Вставку ДНК из pSE179 выделяли с помощью ферментативного гидролиза BamHI/XbaI,выделяли с помощью электрофореза, очищали из геля и лигировали с челночным векторомpWHM3, который также был подвергнут ферментативному гидролизу BamHI/XbaI, при суммарной концентрации ДНК 1 мкг в молярном соотношении вектор-вставка 1:5. Эту лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток Е. coli DH5 согласно инструкциям изготовителя. Плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов,и наличие вставки 1,2 т. п. н. подтверждали с помощью рестрикционного анализа. Этой плазмидой, которую обозначили как pSE186 (фиг. 2,АТСС 209604), трансформировали Е. coli DM1,и плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов. 7.2. Результаты Идентифицировали 2,9 т. п. н. фрагментSacI/BamHI из pSE119, который при трансформации в штамм S. avermitilis 1100-SC38 значительно изменял соотношение продуцирования авермектинов В 2:В 1. Штамм S.avermitilis 1100SC38 в норме имеет соотношение В 2:В 1 примерно 30:1, но при трансформации вектором,содержащим 2,9 т. п. н. фрагмент SacI/BamHI соотношение авермектинов В 2:В 1 снижалось до примерно 3,7:1. Постферментационный анализ культур трансформантов подтвердил наличие трансформирующей ДНК. 2,9 т. п. н. фрагмент pSE119 секвенировали и идентифицировали ОРС 0,9 т. п. н. (фиг. 1)(SEQ ID NO:1), которая включает в себя фрагмент PstI/SphI, который был ранее мутирован где-нибудь в другом месте таким образом, что продуцирует только продукты В 2 (Ikeda et al.,1995, выше). Сравнение этой ОРС или соответствующего ей выведенного полипептида с известными базами данных (GenEMBL, SWISSPROT) не показало какой-либо сильной гомологии с известными ДНК или белковыми последовательностями. В табл. 2 представлен ферментационный анализ штамма S. avermitilis 1100-SC38, трансформированного различными плазмидами.S.avermitilis В данном примере описано конструирование нескольких различных мутантов AveC S.avermitilis при использовании композиций и способов, описанных выше. Общее описание методик введения мутаций в ген в Streptomyces описано Kieser and Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204: 430-458. Более подробное описание приведено Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI(2): 226-233 и Stutzman-Engwall et al., 1992, J. Bacteriol. 174 (1): 144-154. Эти ссылки включены здесь путем ссылки в полном объеме. 8.1. Инактивация гена aveC S. avermitilis Мутанты AveC, содержащие инактивированные гены aveC, конструировали, используя несколько способов, как подробно описано ниже. При первом способе 640 п. н. фрагментSphI/PstI, внутренний по отношению к генуBibb et al., 1985, Gene 41: 357-368) с помощью ферментативного гидролиза ферментами рестрикции BgIII и EcoRI с последующим электрофорезом, и очищали из геля. Этот 1,7 т. п. н. фрагмент лигировали в pGEM7Zf (Promega),который был подвергнут ферментативному гидролизу BgIII и EcoRI, и лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.coliDH5, следуя инструкциям изготовителя. Плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов, и наличие вставки 1,7 т. п. н. подтверждали с помощью рестрикционного анализа. Эту плазмиду обозначили какpSE118 (описанную в разделе 7.1.9 выше) подвергали ферментативному гидролизу SphI иBamHI, гидролизат подвергали электрофорезу, и вставку 2,8 т. п. н. SphI/BamHI очищали из геля. pSE119 подвергали ферментативному гидролизу PstI и EcoRI, гидролизат подвергали электрофорезу, и вставку 1,5 т. п. н. PstI/EcoRI очищали из геля. Челночный вектор pWHM3 подвергали ферментативному гидролизу BamHI и EcoRI. pSE27 подвергали ферментативному гидролизу PstI и SphI, гидролизат подвергали электрофорезу, и вставку 1,7 т. п. н. PstI/SphI очищали из геля. Все четыре фрагмента (т.е. -2,8 57 т. п. н., 1,5 т. п. н., 7,2 т. п. н., 1,7 т. п. н.) лигировали вместе при 4 вариантах лигирования. Этой лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli DH5, следуя инструкциям изготовителя. Плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов, и наличие правильной вставки подтверждали с помощью рестрикционного анализа. Эту плазмиду обозначили как pSE180 (фиг. 3, АТСС 209605).pSE180 трансформировали S. lividans TK64 и идентифицировали трансформированные колонии по устойчивости к тиострептону и к эритромицину. pSE180 выделяли из S. lividans и использовали для трансформации протопластовS. avermitilis. Идентифицировали четыре устойчивых к тиострептону трансформанта S. avermitilis и протопласты получали и высевали в неселективных условиях на среду RM14. После того,как протопласты регенерировали, отдельные колонии подвергали скринингу на наличие устойчивости к эритромицину и на отсутствие устойчивости к тиострептону, что указывает на хромосомную интеграцию инактивированного гена aveC и потерю свободного репликона. Идентифицировали один трансформант ErmThios и обозначили как штамм SE180-11. Суммарную хромосомную ДНК выделяли из штамма SE180-11, подвергали ферментативному гидролизу ферментами рестрикции BamHI, HindIII,PstI или SphI, разделяли с помощью электрофореза на 0,8% агарозном геле, переносили на нейлоновые мембраны и гибридизовали с зондом ermE. Эти анализы показали, что хромосомная интеграция гена устойчивости ermE и сопутствующая делеция 640 т. п. н. фрагментаPstI/SphI произошли посредством двойного кроссоверного события. ВЭЖХ анализ продуктов ферментации штамма SE180-11 показал, что нормальные авермектины больше не продуцировались (фиг. 5 А). При втором способе инактивации генаaveC 1,7 т. п. н. ген ermE удаляли из хромосомы штамма S. avermitilis SE180-11, оставляя 640 п. н. делецию PstI/SphI в гене aveC. Плазмиду замещения гена конструировали следующим образом: pSE180 подвергали частичному ферментативному гидролизу XbaI и 11,4 т. п. н. фрагмент очищали из геля. В полосе 11,4 т. п. н. отсутствует 1,7 т. п. н. ген устойчивости ermE. Затем эту ДНК лигировали и трансформировали ею клетки Е. coli DH5. Плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов, и наличие правильной вставки подтверждали с помощью рестрикционного анализа. Этой плазмидой, которую обозначили какpSE184, трансформировали Е. coli DM1 и плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов. Эту плазмиду использовали для трансформации протопластов штамма S. avermitilis SE180-11. Протопласты 58 получали из устойчивых к тиострептону трансформантов штамма SE180-11 и высевали в виде отдельных колоний на RM14. После того, как протопласты регенерировали, отдельные колонии подвергали скринингу на отсутствие обеих устойчивостей, к эритромицину и к тиострептону, что указывает на хромосомную интеграцию инактивированного гена aveC и потерю свободного репликона, содержащего ген ermE. Идентифицировали один трансформант ErmsThios и обозначили его как SE184-1-13. Ферментационный анализ SE184-1-13 показал, что нормальные авермектины не продуцировались, и что SE1841-13 имел такой же профиль ферментации, какSE180-11. При третьем способе инактивации генаaveC в хромосомный ген aveC вводили сдвиг рамки считывания добавлением двух G после С в положении нуклеотида 471, используя ПЦР,создавая посредством этого сайт BspE1. Наличие сконструированного генно-инженерным путем сайта BspE1 было полезным при обнаружении события замещения гена. Для введения мутации сдвига рамки считывания в ген aveC сконструировали праймеры для ПЦР и их получили от Genosys Biotechnologies, Inc. Правый праймер представлял собой: 5'GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3'NO:8), а левый праймер представлял собой: 5'AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ IDNO:9). Условия ПЦР были такими, как описаны в разделе 7.1.10 выше. Продукт ПЦР 666 п. н. подвергали ферментативному гидролизу SphI с получением двух фрагментов 278 п. н. и 388 п. н., соответственно. Фрагмент 388 п. н. очищали из геля. Плазмиду замещения гена конструировали следующим образом. Челночный векторpWHM3 подвергали ферментативному гидролизу EcoRI и BamHI. pSE119 подвергали ферментативному гидролизу BamHI и SphI, гидролизат подвергали электрофорезу и 840 п. н. фрагмент очищали из геля. pSE119 подвергали ферментативному гидролизу EcoRI и XmnI, гидролизат разделяли с помощью электрофореза, и 1,7 т. п. н. фрагмент очищали из геля. Все четыре фрагмента (т.е. 7,2 т. п. н., 840 п. н., 1,7 т. п. н. и 388 т. п. н.) лигировали вместе при 4 вариантах лигирования. Этой лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coliDH5. Плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов и наличие правильной вставки подтверждали с помощью рестрикционного анализа и анализа последовательности ДНК (сиквенс-анализа). Этой плазмидой, которую обозначили как pSE185, трансформировали Е. coli DM1, и плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов. Эту плазмиду использовали для трансформации протопластов штаммаS.avermitilis 1100-SC38. Устойчивые к тиостреп 59 тону трансформанты штамма 1100-SC38 выделяли и анализировали с помощью ВЭЖХ анализа продуктов ферментации. pSE185 значительно не изменяла соотношения авермектинов В 2.В 1 при трансформации штамма S.avermitilis 1100SC38 (табл. 2).pSE185 использовали для трансформации протопластов S.avermitilis, чтобы создать мутацию сдвига рамки считывания в хромосомном гене aveC. Протопласты получали из устойчивых к тиострептону трансформантов и высевали в виде отдельных колоний на RM14. После того,как протопласты регенерировали, отдельные колонии подвергали скринингу на отсутствие устойчивости к тиострептону. Хромосомную ДНК из чувствительных к тиострептону колоний выделяли и подвергали скринингу с помощью ПЦР на наличие мутации сдвига рамки считывания, интегрированной в хромосому. Праймеры ПЦР сконструировали на основании нуклеотидной последовательности aveC и получили от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Правый праймер представлял собой: 5'GCAAGGATACGGGGACTAC-3'NO:10), а левый праймер представлял собой: 5'GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO:11),и условия ПЦР были такими, как описаны в разделе 7.1.10 выше. Полученный продукт ПЦР составлял 543 п. н. и при ферментативном гидролизе BspE1 наблюдали три фрагмента 368 п. н., 96 п. н. и 79 п. н., что указывало на хромосомную интеграцию инактивированного генаaveC и потерю свободного репликона. Ферментационный анализ мутантов S.avermitilis, содержащих мутацию сдвига рамки считывания в гене aveC, показал, что нормальные авермектины более не продуцировались, и что эти мутанты имели такой же профиль ферментации по ВЭЖХ, как штаммы SE180-11 иSE184-1-13. Идентифицирован один трансформант Thios и обозначен как штамм SE185-5a. Кроме того, получили мутацию в генеaveC, которая изменяет положение нуклеотида 520 с G на А, что приводит к замене кодона,кодирующего триптофан (W) в положении 116,на кодон терминации. Штамм S.avermitilis с этой мутацией не продуцировал нормальные авермектины и имел такой же профиль ферментации, как штаммы SE180-11, SE184-1-13 иSE185-5a. Кроме того, получили мутации, которые изменяют оба положения нуклеотидов: (i) положение нуклеотида 970 с G на А, что заменяет аминокислоту в положении 266 с глицина (G) на аспартат (D) и (ii) положение нуклеотида 996 с Т на С. что заменяет аминокислоту в положении 275 с тирозина (Y) на гистидин (Н). Штамм S.avermitilis с этими мутациями (G256D/Y275H) не продуцировал нормальные авермектины и имел такой же профиль ферментации, как штаммы SE180-11, SE184-1-13 и SE185-5a. 60 Мутантные штаммы S.avermitilis по инактивации гена aveC SE180-11, SE184-1-13 иSE185-5a и другие, предложенные настоящим,обеспечивают инструменты скрининга для оценки воздействия других мутаций в генеaveC. pSE186, которая содержит копию генаDM1, и плазмидную ДНК выделяли из устойчивых к ампициллину трансформантов. Эту ДНКpSE186 использовали для трансформации протопластов штамма S.avermitilis SE180-11. Устойчивые к тиострептону трансформанты штамма SE180-11 выделяли, определяли наличие устойчивости к эритромицину, и трансформанты ThiorErmr анализировали с помощью ВЭЖХ анализа продуктов ферментации. Наличие функционального аллеля aveC в трансположении было способно восстановить нормальное продуцирование авермектинов у штамма SE180-11 (фиг. 5 Б). 8.2. Анализ мутаций в гене aveC. которые изменяют соотношения классов В 2:В 1 Как описано выше, штамм S.avermitilisSE180-11, содержащий неактивный аллель генаaveC, претерпевал комплементацию в результате трансформации плазмидой, содержащей функциональный аллель гена aveC (pSE186). Штамм SE180-11 также использовали в качестве штамма-хозяина для характеристики других мутаций в гене aveC, как описано ниже. Хромосомную ДНК выделяли из штамма 1100-SC38 и использовали в качестве матрицы для ПЦР амплификации гена aveC. OPC 1,2 т. п. н. выделяли с помощью ПЦР амплификации,используя праймеры, сконструированные на основании нуклеотидной последовательностиaveC. Правый праймер представлял собой SEQID NO:6, а левый праймер представлял собойSEQ ID NO:7 (см. раздел 7.1.10 выше). Условия ПЦР и субклонирования были такими, как описаны в разделе 7.1.10. Анализ последовательности ДНК 1,2 т. п. н. ОРС показывает мутацию в гене aveC, которая изменяет положение нуклеотида 337 с С на Т, что заменяет аминокислоту в положении 55 с серина (S) на фенилаланин (F). Ген aveC, содержащий мутацию S55F, субклонировали в pWHM3 с получением плазмиды,которую обозначили как pSE187, и которую использовали для трансофрмации протопластов штамма S.avermitilis SE180-11. Выделяли устойчивые к тиострептону трансформанты штаммаSE180-11, определяли наличие устойчивости к эритромицину, и трансформанты ThiorErmr анализировали с помощью ВЭЖХ анализа продуктов ферментации. Наличие гена aveC, кодирующего замену в аминокислотном остатке 55(S55F), было способно восстановить нормальное продуцирование авермектинов в штамме SE18011 (фиг. 5 В), однако, соотношение циклогексилВ 2:циклогексил-В 1 составляло примерно 26:1 по сравнению со штаммом SE180-11, трансформированным pSE186, который имел соотноше