Ген streptomyces avermitilis,контролирующий соотношение авермектинов в2:в1

1 1. Область изобретения Настоящее изобретение направлено на композиции и способы получения авермектинов, и прежде всего находится в области здравоохранения животных. Более конкретно настоящее изобретение относится к полинуклеотидным молекулам, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие продукт генаAveC, которые можно использовать для модулирования соотношения авермектинов классов 2:1, получаемых путем ферментации культурStreptomyces avermitilis, а также к композициям и способам скрининга таких полинуклеотидных молекул. Кроме того, настоящее изобретение относится к векторам, трансформированным клеткам-хозяевам и новым мутантным штаммамS.avermitilis, в которых ген aveC мутирован таким образом, чтобы модулировать соотношение продуцируемых авермектинов классов 2:1. 2. Предпосылки изобретения 2.1. Авермектины Виды Streptomyces продуцируют широкое разнообразие вторичных метаболитов, включая авермектины, которые содержат ряд из восьми родственных шестнадцатичленных макроциклических лактонов, обладающих сильной антигельминтной и инсектицидной активностью. Эти восемь различных, но близкородственных соединений называют А 1 а, A1b, A2a, A2b, B1a,B1b, B2a и B2b. Серия соединений а относится к природному авермектину, где заместитель в положении С 25 представляет собой (S)-втopбутил, а серия b относится к тем соединениям, где заместитель в положении С 25 представляет собой изопропил. Обозначения А и В относятся к авермектинам, где заместитель в положении С 5 представляет собой метокси или гидрокси, соответственно. Цифра 1 относится к авермектинам, где в положении С 22,23 присутствует двойная связь, а цифра 2 относится к авермектинам, имеющим водород в положении С 22 и гидрокси в положении С 23. Среди родственных авермектинов авермектин типа В 1 признают имеющим наиболее эффективное противопаразитарное и пестицидное действие, и,вследствие этого, он является наиболее коммерчески подходящим авермектином. Авермектины и их получение с помощью аэробной ферментации штаммов S.avermitilis описаны в патентах США 4310519 и 4429042. Считают, что биосинтез природных авермектинов инициируется эндогенно с СоА-тиоэфирных аналогов изомасляной кислоты и (S)-(+)-2 метилмасляной кислоты. Комбинация как усовершенствования штаммов посредством неспецифического мутагенеза, так и использования добавляемых экзогенно жирных кислот привело к эффективному производству аналогов авермектина. МутантыS.avermitilis, которые являются недостаточными по дегидрогеназе 2-оксокислот с разветвленной цепью (bkd-недостаточные мутанты), могут 2 продуцировать авермектины только тогда, когда при ферментации добавляют жирные кислоты. Скрининг и выделение мутантов, недостаточных по активности дегидрогеназы разветвленной цепи (например S.avermitilis ATCC 53567),описаны в европейском патенте (ЕР) 276103. Ферментация таких мутантов в присутствии добавляемых экзогенно жирных кислот приводит к продуцированию только четырех авермектинов, соответствующих используемой жирной кислоте. Таким образом, добавление при ферментации S.avermitilis (ATCC 53567) (S)-(+)-2 метилмасляной кислоты приводит к продуцированию природных авермектинов А 1 а, А 2 а, B1a иB2a; добавление при ферментации изомасляной кислоты приводит к продуцированию природных авермектинов А 1b, A2b, B1b и В 2b; а добавление при ферментации циклопентанкарбоновой кислоты приводит к продуцированию четырех новых циклопентилавермектинов А 1,А 2, В 1 и В 2. При добавлении других жирных кислот,продуцируются новые авермектины. С помощью скрининга более 800 потенциальных предшественников идентифицировали более 60 других новых авермектинов (см., например,Dutton et al., 1991, J. Antibiot. 44:357-365; иBanks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Кроме того, мутанты S.avermitilis, недостаточные по активности 5-O-метилтрансферазы, продуцируют, по существу, только В-аналогичные авермектины. В результате, мутанты S.avermitilis, недостаточные как по активности дегидрогеназы 2-оксокислот с разветвленной цепью, так и по активности 5-O-метилтрансферазы, продуцируют лишь В-авермектины, соответствующие жирной кислоте, которую используют для добавления при ферментации. Таким образом, добавление к таким двойным мутантам (S)-(+)-2 метилмасляной кислоты приводит к продуцированию только природных авермектинов В 1 а и В 2 а, тогда как добавление изомасляной кислоты или циклопентанкарбоновой кислоты приводит к продуцированию природных авермектиновB1b и В 2b или новых циклопентилавермектинов В 1 и В 2, соответственно. Добавление к штамму двойных мутантов циклогексанкарбоновой кислоты является предпочтительным способом получения коммерчески важного нового авермектина, циклогексилавермектина В 1 (дорамектина). Выделение и характеристика таких двойных мутантов, например S. avermitilis (ATCC 53692), описаны в ЕР 276103. 2.2. Гены, вовлеченные в биосинтез авермектинов Обнаружено, что во многих случаях гены,вовлеченные в продуцирование вторичных метаболитов, и гены, кодирующие конкретный антибиотик, ассоциированы на хромосоме вместе. Таким является, например, случай кластера генов поликетидсинтазы Streptomyces (PKS)Genet. 24: 37-66). Таким образом, одним способом клонирования генов в биосинтетическом пути было выделение гена устойчивости к лекарствам, а затем тестирование прилежащих участков хромосомы на другие гены, относящиеся к биосинтезу этого конкретного антибиотика. Другим способом клонирования генов,вовлеченных в биосинтез важных метаболитов,была комплементация мутантов. Например, части библиотеки фрагментов ДНК из организма,способного к продуцированию конкретного метаболита, вводят в непродуцирующий мутант и проводят скрининг трансформантов на продуцирование этого метаболита. Кроме того, для идентификации и клонирования генов в биосинтетических путях применяли гибридизацию библиотеки, используя зонды, имеющие происхождение от других видов Streptomyces. Обнаружено, что гены, вовлеченные в биосинтез авермектина (гены ave), подобно генам,требующимся для биосинтеза других вторичных метаболитов Streptomyces (например PKS), ассоциированы на хромосоме. Ряд генов ave успешно клонировали, используя векторы для комплементации мутантов S-avermitilis с блокированным биосинтезом авермектина. Клонирование таких генов описано в патенте США 5252474. Кроме того, Ikeda еt аl., 1995, J. Antibiot. 48: 532-534, описывает локализацию участка хромосомы, вызывающего стадию дегидратации С 22,23 (aveC) для фрагмента BamHIS.avermitilis длиной 4,82 т.п.о., а также мутации в гене aveC, которые приводят к получению однокомпонентного продуцента В 2 а. Поскольку ивермектин, сильное антигельминтное соединение, можно получить химическим путем из авермектина В 2 а, такой однокомпонентный продуцент авермектина В 2 а считают особенно полезным для промышленного производства ивермектина. Идентификация мутаций в гене aveC, которые минимизируют сложность продуцирования авермектина, таких как, например, мутации,которые снижают В 2:В 1 соотношение авермектинов, должна упростить получение и очистку коммерчески важных авермектинов. 3. Краткое изложение сущности изобретения В настоящем изобретении предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая полноразмерную открытую рамку считывания (ОРС) aveC S.avermitilis или ее существенную часть, причем в выделенной полинуклеотидной молекуле отсутствует следующая полноразмерная ОРС, которая локализована в прямом направлении от ОРС aveC in situ в хромосоме S.avermitilis. Выделенная полинуклеотидная молекула по настоящему изобретению предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, которая является такой же,как последовательность плазмиды pSE186AveC S.avermitilis, или которая является такой 4 же, как нуклеотидная последовательность ОРСaveC, представленная на фиг. 1 (SEQ ID N:1),либо ее существенная часть. Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, имеющая нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной последовательности плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей продукт гена AveC S.avermitilis, или нуклеотидной последовательности ОРС aveC, представленной на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), либо ее существенной части. Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является гомологичной аминокислотной последовательности,кодируемой последовательностью плазмидыpSE186 (ATCC 209604), кодирующей продукт гена AveC, либо аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1 (SEQ IDNО:2), или ее существенной части. Далее в настоящем изобретении предложена выделенная полинуклеотидная молекула,содержащая нуклеотидную последовательность,кодирующую продукт гомолога гена AveC. В предпочтительном воплощении выделенная полинуклеотидная молекула содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гомолога гена AveC, из S.hygroscopicus, причем этот продукт гомолога гена содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NО:4 или ее существенную часть. В предпочтительном воплощении выделенная полинуклеотидная молекула по настоящему изобретению, которая кодирует продукт гомолога гена AveCS.hygroscopicus, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NО:3 или ее существенную часть. Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной нуклеотидной последовательности S.hygroscopicus SEQ ID NО:3. Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, который является гомологичным продукту гомолога гена AveC S.hygroscopicus, имеющему аминокислотную последовательность SEQ IDNО:4. Далее в настоящем изобретении предложены олигонуклеотиды, которые гибридизуются с полинуклеотидной молекулой, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 1 (SEQ ID NО:1) или SEQ IDNО:3, либо с полинуклеотидной молекулой,имеющей нуклеотидную последовательность,которая представляет собой комплемент нуклеотидной последовательности, представленной на фиг. 1 (SEQ ID NО:1) или SEQ ID NО:3. 5 Далее в настоящем изобретении предложены рекомбинантные клонирующие векторы и векторы экспрессии, которые являются полезными при клонировании или экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению, включая полинуклеотидные молекулы, содержащиеOPC aveC S.avermitilis или ОРС гомолога aveC. В неограничивающем воплощении в настоящем изобретении предложена плазмида pSE186(ATCC 209604), которая содержит полноразмерную ОРС гена aveC S.avermitilis. Далее в настоящем изобретении предложены трансформированные клетки-хозяева, содержащие полинуклеотидную молекулу или рекомбинантный вектор по изобретению, а также новые штаммы или клеточные линии, имеющие происхождение от них. Далее в настоящем изобретении предложен рекомбинантно экспрессированный продукт гена AveC или продукт гомолога генаAveC, который, по существу, очищен или выделен, либо его существенная часть, а так же его гомологи. Далее в настоящем изобретении предложен способ получения продукта рекомбинантного гена AveC, при котором культивируют клетку-хозяина, трансформированную рекомбинантным вектором экспрессии, причем указанный рекомбинантный вектор экспрессии содержит полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена AveC или продукт гомолога гена AveC, причем эта полинуклеотидная молекула находится в оперативной связи с одним или более чем одним регуляторным элементом, который контролирует экспрессию этой полинуклеотидной молекулы в клетке-хозяине,в условиях, способствующих продуцированию продукта рекомбинантного гена AveC или продукта гомолога гена AveC, и выделяют продукт гена AveC или продукт гомолога гена AveC из клеточной культуры. Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая в других отношениях является такой же, как последовательность плазмиды рSЕ 186 (АТСС 209604), кодирующая продукт гена AveCS.avermitilis, или нуклеотидная последовательность OPC aveC S.avermitilis, как представлено на фиг. 1 (SEQ ID NO:1), но которая дополнительно содержит одну или более чем одну мутацию, так что клетки штамма S.avermitilis АТСС 53692, в которых аллель aveC дикого типа инактивирован и которые экспрессируют полинуклеотидную молекулу, содержащую мутированную нуклеотидную последовательность, продуцируют иное соотношение или количество авермектинов, чем продуцируется клетками штамма S.avermitilis АТСС 53692, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Согласно настоящему изобретению такие полинуклеотидные молекулы можно ис 003905 6 пользовать для получения новых штаммовS.avermitilis, которые проявляют обнаружимое изменение в продуцировании авермектинов по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммовS.avermitilis, которые продуцируют авермектины в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением у того же штамма,который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. В следующем предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммов S.avermitilis, которые продуцируют повышенные уровни авермектинов по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. Еще в одном предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммовS.avermitilis, в которых ген aveC инактивирован. В настоящем изобретении предложены способы идентификации мутаций ОРС aveCS.avermitilis, способных к изменению соотношения и/или количества продуцируемых авермектинов. В предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен способ идентификации мутаций ОРС aveC, способных к изменению соотношения классов 2:1 продуцируемых авермектинов, при котором: (а) определяют соотношение классов 2:1 авермектинов,продуцируемых клетками штамма S.avermitilis,в которых нативный аллель aveC инактивирован и в которые введена и экспрессируется полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт мутированного гена AveC; (б) определяют соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками того же штаммаS.avermitilis, как на стадии (а), но которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC,имеющий нуклеотидную последовательность ОРС, представленную на фиг. 1 (SEQ ID NО:1),или нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной данной; и (в) сравнивают соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (а), с соотношением классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (б); так что, если соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (а), отличается от соотношения классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клеткамиS.avermitilis стадии (б), то мутация ОРС aveC,способная к изменению соотношения классов 2:1 авермектинов, идентифицирована. В предпочтительном воплощении эта мутация снижает соотношение классов 2:1 авермектинов. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен 7 способ идентификации мутаций ОРС aveC или генетических конструкций, содержащих ОРСaveC, способных к изменению количества продуцируемых авермектинов, при котором: (а) определяют количество авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, в которых нативный аллель aveC инактивирован и в которые введена и экспрессируется полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт мутированного гена AveC, или содержащая генетическую конструкцию, включающую в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена AveC; (б) определяют количество авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S.avermitilis, как на стадии (а),но которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC, имеющий нуклеотидную последовательность ОРС, представленную на фиг. 1(SEQ ID NO:1), или нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной данной; и (в) сравнивают количество авермектинов,продуцируемых клетками S.avermitilis стадии(а), с количеством авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (б); так что,если количество авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (а), отличается от количества авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (б), то мутация ОРСaveC или генетической конструкции, способная к изменению количества авермектинов, идентифицирована. В предпочтительном воплощении эта мутация повышает количество продуцируемых авермектинов. Далее в настоящем изобретении предложены рекомбинантные векторы, которые являются полезными при создании новых штаммовS.avermitilis, имеющих измененную продукцию авермектина. Например, в настоящем изобретении предложены векторы, которые можно использовать для доставки любой из полинуклеотидных молекул, содержащих мутированные нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению, к сайту гена aveC хромосомы S.avermitilis либо для встраивания в него,либо для замещения aveC ОРС или ее части посредством гомологичной рекомбинации. Согласно настоящему изобретению, однако, полинуклеотидная молекула, содержащая мутированную нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, предложенная здесь,может также функционировать для модулирования биосинтеза авермектина при встраивании в хромосому S.avermitilis в сайте, ином чем генaveC, или при поддержании в эписомном состоянии в клетках S.avermitilis. Таким образом,в настоящем изобретении также предложены векторы, включающие в себя полинуклеотидную молекулу, содержащую мутированную нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, причем эти векторы можно использовать для встраивания этой полинуклео 003905S.avermitilis, иной чем ген aveC, или для поддержания в эписомном состоянии. В предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены векторы замещения генов, которые можно использовать для встраивания мутированного аллеля aveC в хромосому S.avermitilis с образованием новых штаммов клеток, которые продуцируют авермектины в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Далее в настоящем изобретении предложены способы создания новых штаммовS.avermitilis, содержащих клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC и которые продуцируют измененные соотношения и/или количества авермектинов по сравнению с клетками того же штамма S.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен способ создания новых штаммов S.avermitilis, содержащих клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC и которые продуцируют измененное соотношение классов 2:1 авермектинов по сравнению с клетками того же штаммаS.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, при котором клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором, который несет мутированный аллель aveC, кодирующий продукт гена, который изменяет соотношение классов 2:1 авермектинов,продуцируемых клетками штаммаS.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, и отбирают трансформированные клетки, которые продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1, продуцируемых клетками штамма, которые вместо этого экспрессируют аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 продуцируемых авермектинов снижено в клетках нового штамма. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен способ создания новых штаммов S.avermitilis,содержащих клетки, которые продуцируют измененные количества авермектина, при котором клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором, который несет мутированный аллельaveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, экспрессия которого приводит к измененному количеству авермектинов,продуцируемых клетками штамма S.avermitilis,экспрессирующими этот мутированный аллельaveC или генетическую конструкцию, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, и отбирают трансформированные 9 клетки, которые продуцируют авермектины в измененном количестве по сравнению с количеством авермектинов, продуцируемых клетками штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении количество продуцируемых авермектинов повышено в клетках нового штамма. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен способ создания новых штаммов S.avermitilis,клетки которых содержат инактивированный аллель aveC, при котором клетки штаммаaveC инактивирован. Далее в настоящем изобретении предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые трансформированы любой из полинуклеотидных молекул или векторов, содержащих мутированную нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению. В предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены новые штаммыS.avermitilis, содержащие клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC вместо аллеля aveC дикого типа или в дополнение к аллелю aveC дикого типа, причем клетки нового штамма продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В более предпочтительном воплощении клетки нового штамма продуцируют авермектины в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Такие новые штаммы являются полезными при крупномасштабном производстве коммерчески подходящих авермектинов, таких как дорамектин. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, вместо аллеля aveC дикого типа или в дополнение к аллелю aveC дикого типа, что приводит к продуцированию этими клетками измененного количества авермектинов по сравнению с количеством авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении новые клетки продуцируют повышенное количество авермектинов. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, в которых ген aveC инактивирован. Такие 10 штаммы являются полезными как для различного спектра авермектинов, которые они продуцируют по сравнению со штаммом дикого типа,так и при скрининговых анализах на комплементацию, как описано здесь, чтобы определить, влияет ли направленный или неспецифический мутагенез гена aveC на продуцирование авермектина. Далее в настоящем изобретении предложен способ получения авермектинов, при котором клетки штамма S.avermitilis, которые экспрессируют мутированный аллель aveC, который кодирует продукт гена, который изменяет соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллельaveC, по сравнению с клетками того же штамма,которые не экспрессируют мутированный аллель aveC, но вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, культивируют в культуральных средах в условиях, которые дают возможность продуцирования или индуцируют продуцирование авермектинов из них, и выделяют указанные авермектины из этой культуры. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками, экспрессирующими эту мутацию,снижено. Этот способ обеспечивает повышенную эффективность при производстве коммерчески важных авермектинов, таких как дорамектин. Далее в настоящем изобретении предложен способ получения авермектинов, при котором клетки штамма S.avermitilis, которые экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, содержащую аллельaveC, что приводит к продуцированию измененного количества авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, по сравнению с клетками того же штамма, которые не экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, но вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, культивируют в культуральных средах в условиях,которые дают возможность продуцирования или индуцируют продуцирование авермектинов из них, и выделяют указанные авермектины из этой культуры. В предпочтительном воплощении количество авермектинов, продуцируемых клетками, экспрессирующими эту мутацию или генетическую конструкцию, повышено. Далее в настоящем изобретении предложена новая композиция авермектинов, продуцируемых штаммом S.avermitilis, экспрессирующим мутированный аллель aveC по настоящему изобретению, причем авермектины продуцируются в пониженном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S.avermitilis, которые не экс 11 прессируют мутированный аллель aveC, но вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Эта новая композиция авермектинов может присутствовать в качестве продуцируемой в ферментационной культуральной жидкости или ее можно собрать из этой жидкости, а также можно частично или существенно очистить от нее. 4. Краткое описание графических материалов Фиг. 1. Последовательность ДНК (SEQ IDNО:1), содержащая ОРС aveC S.avermitilis, и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2). Фиг. 2. Плазмидный вектор рSЕ 186 (АТСС 209604), содержащий полноразмерную ОРС гена aveC S.avermitilis. Фиг. 3. Вектор замещения генов рSЕ 180S.avermitilis с пятью идентифицированными перекрывающимися космидными клонами (то есть pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Отношение pSE118 и рSЕ 119 также указано. Фиг. 5. ВЭЖХ-анализ продуктов ферментации, продуцируемых штаммами S.avermitilis. Количественное определение пиков осуществляли путем сравнения со стандартными количествами циклогексила В 1. Время удерживания циклогексила В 2 составляло 7,4-7,7 мин; время удерживания циклогексила В 1 составляло 11,912,3 мин. Фиг. 5 А. Штамм S.avermitilis SE180-11 с инактивированной ОРС aveC. Фиг. 5 Б. ШтаммS.avermitilis SE180-11, трансформированный рSЕ 187. Фиг. 5 Г. Штамм S.avermitilis SE180-11,трансформированный pSE188. Фиг. 6. Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей, кодируемых ОРСaveC S.avermitilis (SEQ ID NO:2), частичной ОРС гомолога aveC из S.griseochromogenes (SEQS.hygroscopicus (SEQ ID NO:4). Валиновый остаток жирным шрифтом представляет собой предполагаемый стартовый сайт для белка. Консервативные остатки показаны заглавными буквами для гомологии во всех трех последовательностях и строчными буквами для гомологии в 2 из 3 последовательностей. Аминокислотные последовательности содержат приблизительно 50% идентичности последовательности. Фиг. 7. Гибридная плазмидная конструкция, содержащая фрагмент BsaАI/KpnI длиной 564 п.о. из гомолога гена aveC S.hygroscopicus,встроенный в сайт BsaAI/KpnI в ОРС aveCS.avermitilis. 5. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к идентификации и характеристике полинуклеотидных 12 молекул, имеющих нуклеотидные последовательности, которые кодируют продукт генаAveC из Streptomyces avermitilis, к конструированию новых штаммов S.avermitilis, которые можно использовать для скрининга продуктов мутированного гена AveC на их воздействие на продуцирование авермектинов, а также к открытию, что некоторые продукты мутированного гена AveC могут снижать соотношение В 2:В 1 авермектинов, продуцируемых S.avermitilis. В следующих ниже разделах изобретение описано посредством примера для полинуклеотидной молекулы, имеющей либо нуклеотидную последовательность, которая является такой же, как последовательность, кодирующая продукт генаAveC S.avermitilis, плазмиды рSЕ 186 (АТСС 209604), либо нуклеотидную последовательность ОРС фиг. 1 (SEQ ID NО:1), и для полинуклеотидных молекул, имеющих мутированные нуклеотидные последовательности, имеющие происхождение от них. Однако принципы,изложенные в настоящем изобретении, можно аналогично применить к другим полинуклеотидным молекулам, включая гомологи генаaveC из других видов Streptomyces, включая,например, среди прочих, S.hygroscopicus иS.griseochromogenes. 5.1. Полинуклеотидные молекулы, кодирующие продукт гена AveC S.avermitilis В настоящем изобретении предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая полноразмерную ОРС aveC S.avermitilis или ее существенную часть, причем в этой выделенной полинуклеотидной молекуле отсутствует следующая полноразмерная ОРС, которая локализована в прямом направлении от ОРСaveC in situ в хромосоме S.avermitilis. Выделенная полинуклеотидная молекула по настоящему изобретению предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность,которая является такой же, как последовательность плазмиды рSЕ 186 (АТСС 209604), кодирующая продукт гена AveC S.avermitilis, или которая является такой же, как нуклеотидная последовательность ОРС, представленная на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), или ее существенная часть. Используемая здесь "существенная часть" выделенной полинуклеотидной молекулы, содержащей нуклеотидную последовательность,кодирующую продукт гена AveC S.avermitilis,означает выделенную полинуклеотидную молекулу, содержащую, по меньшей мере, примерно 70% последовательности полноразмерной OPCaveC, показанной на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), и которая кодирует функционально эквивалентный продукт гена AveC. В этом отношенииAveC определяют как продукт гена, который при экспрессии в штамме S.avermitilis АТСС 53692, в котором нативный аллель aveC инактивирован, приводит к продуцированию, по существу, такого же соотношения и количестваS.avermitilis АТСС 53692, который вместо этого экспрессирует только функционально активный аллель aveC дикого типа, нативный для штаммаOPC aveC, выделенная полинуклеотидная молекула по настоящему изобретению может дополнительно содержать нуклеотидные последовательности, которые в природе фланкируют генaveC in situ в S.avermitilis, такие, как те фланкирующие нуклеотидные последовательности,которые показаны на фиг. 1 (SEQ ID NО:1). Используемые здесь термины "полинуклеотидная молекула", "полинуклеотидная последовательность", "кодирующая последовательность", "открытая рамка считывания" и"ОРС" предназначены для отношения к молекулам как ДНК, так и РНК, которые могут быть либо однонитевыми, либо двунитевыми и которые можно транскрибировать и транслироватьAveC или, как описано ниже, в продукт гомолога гена AveC или в полипептид, который является гомологичным продукту гена AveC или продукту гомолога гена AveC, в подходящей системе экспрессии клетки-хозяина при помещении под контроль подходящих регуляторных элементов. Кодирующая последовательность может включать в себя прокариотические последовательности, последовательности кДНК,последовательности геномной ДНК, а также химически синтезированные последовательности ДНК и РНК, но не ограничивается ими. Нуклеотидная последовательность, показанная на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), содержит четыре различных GTG кодона в положениях п.о. 42,174, 177 и 180. Как описано в разделе 9 ниже,чтобы помочь определить, какие из этих кодонов могут функционировать в OPC aveC в качестве стартовых сайтов для экспрессии белка,были сконструированы множественные делеции 5' участка OPC aveC (фиг. 1; SEQ ID NО:1). Делеция первого GTG сайта в п.о. 42 не элиминировала активность AveC. Дополнительная делеция одновременно всех GTG кодонов в положениях п.о. 174, 177 и 180 элиминировала активность AveC, что указывает на то, что данный участок необходим для экспрессии белка. Таким образом, настоящее изобретение охватываетOPC aveC переменной длины, которые инициируют трансляцию в любом из GTG сайтов, локализованных в п.о. 174, 177 или 180, как представлено на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), и соответствующие полипептиды для каждой. Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, имеющая нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной последовательности плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей продукт гена AveC S.avermitilis, или нуклеотидной последовательности OPC aveC, представ 003905 14 ленной на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), либо ее существенную часть. Когда термин "гомологичный" используется по отношению к полинуклеотидной молекуле, которая является гомологичной последовательности, кодирующей продукт генаAveC S.avermitilis, он означает полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, которая: (а) кодирует тот же продукт гена AveC, что и последовательность плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующая продукт гена AveC S.avermitilis, или кодирует тот же продукт гена AveC, что и нуклеотидная последовательность OPC aveC, представленная на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), но включает в себя одну или более чем одну молчащую замену в нуклеотидной последовательности в соответствии с вырожденностью генетического кода; или(б) гибридизуется с комплементом полинуклеотидной молекулы, имеющей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей продукт гена AveC, или которая кодирует аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1 (SEQ ID NО:2),в условиях умеренной строгости, то есть гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5 МNaHPО 4 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ ЭДТА при 65 С и отмывке в 0,2xSSC (стандартном солевом растворе - 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия, рН 7,0)/0,1% ДСН при 42 СYork, p. 2.10.3), и кодирует функционально эквивалентный продукт гена AveC, как определено выше. В предпочтительном воплощении эта гомологичная полинуклеотидная молекула гибридизуется с комплементом нуклеотидной последовательности плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей продукт гена AveC, либо с комплементом нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), или ее существенной части, в очень строгих условиях, то есть гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPО 4 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ ЭДТА при 65 С и отмывке в 0,1xSSC/0,1% ДCH при 68 С (см. Ausubel etal., 1989, вышеупомянутый), и кодирует функционально эквивалентный продукт гена AveC,как определено выше. Активность продукта гена AveC и его потенциальных функциональных эквивалентов можно определить посредством анализа с помощью ВЭЖХ продуктов ферментации, как описано в приведенных ниже примерах. Полинуклеотидные молекулы, имеющие нуклеотидные последовательности, которые кодируют функциональные эквиваленты продукта генаaveC, присутствующие в других видах Streptomyces, и мутированные аллели aveC, либо встречающиеся в природе, либо сконструированные. Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является гомологичной аминокислотной последовательности,кодируемой последовательностью плазмидыpSE186 (ATCC 209604), кодирующей продукт гена AveC S.avermitilis, либо аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(SEQ ID NО:2), или ее существенную часть. Используемая здесь "существенная часть" аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1 (SEQ ID NО:2), означает полипептид,содержащий по меньшей мере примерно 70% аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1 (SEQ ID NО:2), и который составляет функционально эквивалентный продукт гена AveC, как определено выше. Используемый здесь термин "гомологичный" по отношению к аминокислотным последовательностям, которые являются гомологичными аминокислотной последовательности продукта гена AveC из S.avermitilis, он относится к полипептиду, кодируемому последовательностью плазмиды pSE186 (ATCC 209604), кодирующей продукт гена AveC, или имеющему аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1 (SEQ ID NО:2), но в котором один или более чем один аминокислотный остаток консервативно заменен другим аминокислотным остатком, причем такая консервативная замена приводит к функционально эквивалентному продукту гена, как определено выше. Консервативные аминокислотные замены известны в данной области. Правила создания таких замен включают в себя те, которые, среди прочего, описаны Dayhof, M.D., 1987, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3. Более конкретно, консервативными аминокислотными заменами являются те, которые,как правило, имеют место в пределах семейства аминокислот, которые являются родственными по кислотности, полярности или объемности их боковых цепей. Генетически кодируемые аминокислоты, как правило, делят на четыре группы: (1) кислые = аспартат, глутамат; (2) основные = лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные= аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин,фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные = глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин также совместно классифицируют как ароматические аминокислоты. Одна или более чем одна замена в пределах любой конкретной группы, например лейцина на изолейцин или валин, либо аспартата на глутамат, либо треонина на серин, либо любого 16 другого аминокислотного остатка на структурно родственный аминокислотный остаток, например аминокислотный остаток с подобной кислотностью, полярностью, объемностью или с подобием в некотором их сочетании, будет, как правило, иметь незначительное воздействие на функцию этого полипептида. Далее в настоящем изобретении предложена выделенная полинуклеотидная молекула,содержащая нуклеотидную последовательность,кодирующую продукт гомолога гена AveC. Используемый здесь "продукт гомолога генаAveC" определяют как продукт гена, имеющий,по меньшей мере, 50% идентичности аминокислотной последовательности с продуктом генаAveC S.avermitilis, содержащим аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью плазмиды рSЕ 186 (АТСС 209604),кодирующей продукт гена AveC, или аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 1 (SEQ ID NO:2). В неограничивающем воплощении продукт гомолога гена AveC изS.hygroscopicus (описан в заявке ЕР 0298423; депонирование FERM ВР-1901) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NО:4 или ее существенную часть. "Существенная часть" аминокислотной последовательностиSEQ ID NO:4 означает полипептид, содержащий, по меньшей мере, примерно 70% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и который составляет функционально эквивалентный продукт гомолога гена AveC. "Функционально эквивалентный" продукт гомолога гена AveC определен как продукт гена, который, при экспрессии в штамме S.hygroscopicusFERM BP-1901, в котором нативный аллель гомолога aveC инактивирован, приводит к продуцированию, по существу, такого же соотношения и количества милбемицинов, как продуцируется штаммом S.hygroscopicus FERM BP1901, экспрессирующим вместо этого только функционально активный аллель гомолога aveC дикого типа,нативный для штаммаS.hygroscopicus FERM BP-1901. В неограничивающем воплощении выделенная полинуклеотидная молекула по настоящему изобретению,которая кодирует продукт гомолога гена AveCS.hygroscopicus, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NО:3 или ее существенную часть. В этом отношении "существенная часть" выделенной полинуклеотидной молекулы, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NО:3, означает выделенную полинуклеотидную молекулу, содержащую по меньшей мере 70% нуклеотидной последовательности SEQ ID NО:3, и которая кодирует функционально эквивалентный продукт гомолога гена AveC, как определено непосредственно выше. Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая яв 17 ляется гомологичной нуклеотидной последовательности S.hygroscopicus SEQ ID NО:3. Термин"гомологичный" при использовании по отношению к полинуклеотидной молекуле, содержащей нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной последовательности,кодирующей продукт гомолога гена AveCS.hygroscopicus SEQ ID NО:3, означает полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, которая: (а) кодирует тот же продукт гена, как нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:3 или ее существенная часть, но включает в себя одну или более чем одну молчащую замену в этой нуклеотидной последовательности в соответствии с вырожденностью генетического кода; или (б) гибридизуется с комплементом полинуклеотидной молекулы, имеющей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NО:4, в условиях умеренной строгости, то есть гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPО 4 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ ЭДТА при 65 С и отмывке в 0,2xSSC/0,1% ДCH при 42 С (см. Ausubel et al. вышеупомянутый), и кодирует функционально эквивалентный продукт гомолога гена AveC, как определено выше. В предпочтительном воплощении эта гомологичная полинуклеотидная молекула гибридизуется с комплементом нуклеотидной последовательности SEQ ID NО:3, кодирующей продукт гомолога гена AveC, или ее существенной части в очень строгих условиях, то есть гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPО 4 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ ЭДТА при 65 С и отмывке в 0,1xSSC/0,1% ДCH при 68 С (см. Ausubel et al. вышеупомянутый), и кодирует функционально эквивалентный продукт гомолога гена AveC, как определено выше. Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, который является гомологичным продукту гомолога гена AveCS.hygroscopicus. Термин "гомологичный", используемый здесь по отношению к полипептидам, которые являются гомологичными продукту гомолога гена AveC SEQ ID NО:4 изS.hygroscopicus, означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ IDNО:4, но в котором один или более чем один аминокислотный остаток консервативно заменен другим аминокислотным остатком, причем такая консервативная замена приводит к функционально эквивалентному продукту гомолога гена AveC, как определено выше. Далее в настоящем изобретении предложены олигонуклеотиды, которые гибридизуются с полинуклеотидной молекулой, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 1 (SEQ ID NО:1) или SEQ ID 18 имеющей нуклеотидную последовательность,которая представляет собой комплемент нуклеотидной последовательности, представленной на фиг. 1 (SEQ ID NО:1) или SEQ ID NО:3. Длина таких олигонуклеотидов составляет по меньшей мере примерно 10 нуклеотидов, а предпочтительно от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов, и они гибридизуются с одной из вышеупомянутых полинуклеотидных молекул в очень строгих условиях, то есть, отмывки в 6xSSC/0,5% пирофосфате натрия при 37 С для олигонуклеотидов из 14 оснований, при 48 С для олигонуклеотидов из 17 оснований,при 55 С для олигонуклеотидов из 20 оснований и при 60 С для олигонуклеотидов из 23 оснований. В предпочтительном воплощении эти олигонуклеотиды являются комплементарными части одной из вышеупомянутых полинуклеотидных молекул. Эти олигонуклеотиды являются полезными для разнообразных целей,включая кодирование или действие в качестве антисмысловых молекул, полезных в регуляции генов, либо в качестве праймеров в амплификации полинуклеотидных молекул, кодирующихaveC или гомолога aveC. Дополнительных гомологов генов aveC можно идентифицировать в других видах или штаммах Streptomyces с помощью использования полинуклеотидных молекул или олигонуклеотидов, описанных здесь, во взаимодействии с известными методиками. Например, в олигонуклеотидную молекулу, содержащую часть нуклеотидной последовательности S.avermitilis,представленной на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), или часть нуклеотидной последовательностиS.hygroscopicus SEQ ID NО:3, можно ввести обнаружимую радиоактивную метку и использовать ее для скрининга геномной библиотеки,сконструированной из ДНК, имеющей происхождение от интересующего организма. Строгость условий гибридизации выбирают на основании отношения рассматриваемого организма,в данном примереS.hygroscopicus, к интересующему организму. Требования к различным условиям строгости известны специалистам в данной области, и такие условия, как и ожидалось, будут варьировать в зависимости от конкретных организмов,из которых выделены библиотека и меченые последовательности. Длина таких олигонуклеотидов составляет предпочтительно по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, и они включают в себя, например, те, которые описаны в приведенных ниже примерах. Амплификацию геновгомологов можно осуществлять, используя эти и другие олигонуклеотиды, с помощью применения стандартных методик, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), хотя можно также использовать другие известные в данной области методики амплификации, например лигазную цепную реакцию. 19 Клоны, идентифицированные как содержащие нуклеотидные последовательности гомологов aveC, можно тестировать на их способность к кодированию функционально активного продукта гомолога гена AveC. Для этой цели эти клоны можно подвергать секвенированию,чтобы идентифицировать подходящую рамку считывания, а также сигналы инициации и терминации. Альтернативно или дополнительно клонированную последовательность ДНК можно встраивать в подходящий вектор экспрессии,то есть в вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной последовательности, кодирующей белок. Любую из разнообразных систем вектор/хозяин можно использовать, как описано ниже, включая бактериальные системы, такие как плазмида, бактериофаг или космидные векторы экспрессии, но не ограничиваясь ими. Подходящие клетки-хозяева, трансформированные такими векторами, содержащими потенциальные кодирующие последовательности гомолога aveC, можно затем анализировать на активность AveC-типа, используя способы, такие как анализ с помощью ВЭЖХ продуктов ферментации, как описано, например, в разделе 7 ниже. Получение и манипулирование с полинуклеотидными молекулами, описанными здесь,находятся в пределах компетенции специалистов в данной области, и могут осуществляться согласно рекомбинантным методикам, описанным, например, в Maniatis et al., 1989, MolecularTechnology. Oxford University Press, New York,причем все из этих публикаций включены здесь путем ссылки. Полинуклеотидные клоны, кодирующие продукты гена AveC и продукты гомолога гена AveC, можно идентифицировать, используя любой способ, известный в данной области, включая способы, изложенные в разделе 7 ниже, но не ограничиваясь ими. Скрининг библиотек геномных ДНК на последовательности, кодирующие aveC и гомолог aveC, можно проводить, используя методики, такие как способы, изложенные в Benton and Davis, 1977, Science 196:180, для бактериофаговых библиотек и в Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. 20 ной в разделе 7 ниже), можно использовать в качестве зондов в этих экспериментах по скринингу. Альтернативно можно синтезировать олигонуклеотидные зонды, которые соответствуют нуклеотидным последовательностям, выведенным из частичных или полных аминокислотных последовательностей очищенного продукта гомолога гена AveC. 5.2. Рекомбинантные системы 5.2.1. Клонирующие векторы и векторы экспрессии Далее в настоящем изобретении предложены рекомбинантные клонирующие векторы и векторы экспрессии, которые являются полезными при клонировании или экспрессии полинуклеотидных молекул по настоящему изобретению, содержащих, например, OPC aveCS.avermitilis или ОРС любых гомологов aveC. В неограничивающем воплощении в настоящем изобретении предложена плазмида pSE186(ATCC 209604), которая содержит полноразмерную ОРС гена aveC S.avermitilis. Все последующее описание, рассматривающее ОРС aveC из S.avermitilis или полинуклеотидную молекулу, содержащую ОРС aveC изaveC и продуктам гомологов гена AveC, если не указано иначе в подробности или в контексте. Для конкретного использования в Streptomyces разработан ряд различных векторов,включая, среди прочего, фаг, мультикопийные плазмиды, низкокопийные плазмиды и челночные векторы E.coli-Streptomyces, и любой из них можно использовать для осуществления настоящего изобретения. Из Streptomyces также был клонирован ряд генов устойчивости к лекарствам, и некоторые из этих генов были встроены в векторы в качестве селективных маркеров. Примеры используемых в настоящее время векторов для Streptomyces представлены,среди прочего, в Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190. Рекомбинантные векторы по настоящему изобретению, в частности, векторы экспрессии,предпочтительно конструируют таким образом,чтобы кодирующая последовательность для полинуклеотидной молекулы по изобретению находилась в оперативной связи с одним или более чем одним регуляторным элементом, необходимым для транскрипции и трансляции этой кодирующей последовательности для продуцирования полипептида. Используемый здесь термин "регуляторный элемент" включает в себя нуклеотидные последовательности, которые кодируют индуцибельные и неиндуцибельные промоторы, энхансеры, операторы и другие элементы, известные в данной области, которые служат для того, чтобы направлять и/или регулировать экспрессию полинуклеотидных кодирующих последовательностей, но не ограничивается ими. К тому же, используемая здесь ко 21 дирующая последовательность находится в"оперативной связи" с одним или более чем одним регуляторным элементом, где эти регуляторные элементы эффективно регулируют и обеспечивают транскрипцию кодирующей последовательности или трансляцию ее мРНК,либо и то, и другое. Типичные плазмидные векторы, которые можно сконструировать так, чтобы они содержали полинуклеотидную молекулу по настоящему изобретению, включают в себя, среди многих прочих, pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen),pGEM3Zf (Promega) и челночный векторpWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171:58725881). В данной области известны способы конструирования рекомбинантных векторов, содержащих конкретные кодирующие последовательности в оперативной связи с подходящими регуляторными элементами, и их можно использовать для осуществления настоящего изобретения. Эти способы включают в себя in vitro рекомбинантные методики, синтетические методики и генетическую рекомбинацию in vivo. См., например, методики, описанные в Maniatiset al., 1989, вышеупомянутый; Ausubel et al.,1989, вышеупомянутый; Sambrook et al., 1989,вышеупомянутый; Innis et al., 1995, вышеупомянутый; и Erlich, 1992, вышеупомянутый. Регуляторные элементы этих векторов могут варьировать по своей силе и специфичности. В зависимости от используемой системы вектор/хозяин можно применять любые из ряда подходящих транскрипционных и трансляционных элементов. Неограничивающие примеры транскрипционных регуляторных участков или промоторов для бактерий включают в себя промотор -gal, промотор Т 7, промотор ТАС, левый и правый промоторы , промоторы trp и lac,слитые промоторы trp-lac и, более конкретно для Streptomyces, промоторы ermE, meIC и tipA и так далее. В конкретном воплощении, описанном в разделе 11 ниже, был создан вектор экспрессии, который содержал ОPC aveC, клонированную под сильным конститутивным промотором ermE из Saccharopolyspora erythraea. Этим вектором трансформировали S.avermitilis, и последующий анализ с помощью ВЭЖХ продуктов ферментации показал повышенный титр продуцируемых авермектинов по сравнению с их продуцированием тем же штаммом, который вместо этого экспрессировал аллель aveC дикого типа. Векторы экспрессии слитых белков можно использовать для экспрессии белка, слитого с продуктом гена AveC. Этот очищенный слитый белок можно использовать для выработки антисывороток против продукта гена AveC, чтобы изучать биохимические свойства продукта генаAveC, чтобы конструировать AveC-слитые белки с различными биохимическими активностя 003905 22 ми, либо чтобы способствовать идентификации или очистке экспрессированного продукта генаAveC. Возможные векторы экспрессии слитых белков включают в себя векторы, в которые встроены последовательности, которые кодируют слияния с -галактозидазой и trpE, слияния с мальтозосвязывающими белками, слияния с глутатион-S-трансферазой и слияния с полигистидином (участки носителя), но не ограничиваются ими. В альтернативном воплощении продукт гена AveC или его часть можно слить с продуктом гомолога гена AveC или его частью,имеющими происхождение от другого вида или штамма Streptomyces, такого как, напримерS.hygroscopicus или S.griseochromogenes. В конкретном воплощении, описанном в разделе 12 ниже и изображенном на фиг. 7, была сконструирована химерная плазмида, которая содержит участок ОРС гомолога aveC S.hygroscopicus длиной 564 п.о., замещающий гомологичный участок ОРС aveC S.avermitilis длиной 564 п.о. Такими гибридными векторами можно трансформировать клетки S.avermitilis и тестировать их, чтобы определить их воздействие, например,на соотношение классов 2:1 продуцируемых авермектинов.AveC-слитые белки можно сконструировать таким образом, чтобы они содержали участок, полезный для очистки. Например, слиянияAveC-мальтозосвязывающий белок можно очистить, используя амилозную смолу; слитые белки АvеС-глутатион-S-трансфераза можно очистить, используя глутатион-агарозные гранулы; а слияния AveC-полигистидин можно очистить,используя смолу с двухвалентным никелем. Альтернативно можно использовать антитела против белка-носителя или пептида для очистки слитого белка с помощью аффинной хроматографии. Например, нуклеотидную последовательность, кодирующую целевой эпитоп моноклонального антитела,можно генноинженерным путем включить в вектор экспрессии в оперативной связи с регуляторными элементами и расположить таким образом, чтобы экспрессированный эпитоп был слит с AveCполипептидом. Например, нуклеотидную последовательность, кодирующую эпитоп-меткуFLAG (International Biotechnologies Inc.), который представляет собой гидрофильный маркерный белок, с помощью стандартных методик можно встроить в вектор экспрессии в точке,соответствующей, например, карбоксильному концу AveC-полипептида. Экспрессированный слитый продуктFLAG затем можно обнаружить и афинно очистить, используя имеющиеся в продаже анти-FLAG-антитела. Вектор экспрессии, кодирующий AveCслитый белок, можно также сконструировать таким образом, чтобы он содержал полилинкерные последовательности, которые кодируют сайты расщепления специфическими протеаза 23 ми, так, чтобы экспрессированный AveCполипептид можно было выделить из участка носителя или партнера слияния с помощью обработки специфической протеазой. Например,вектор слитых белков может включать в себя последовательности ДНК, кодирующие, среди прочего, сайты расщепления тромбином или фактором Ха. Сигнальную последовательность в обратном направлении и в рамке считывания с OPCaveC можно встроить в вектор экспрессии генно-инженерным путем с помощью известных способов, чтобы направлять транспортировку и секрецию экспрессированного продукта гена. Неограничивающие примеры сигнальных последовательностей включают в себя, среди прочего, сигнальные последовательности из фактора, иммуноглобулинов, белков наружной мембраны, пенициллиназы и рецепторов Тклеток. Чтобы способствовать отбору клетокхозяев, трансформированных или трансфицированных клонирующими векторами или векторами экспрессии по настоящему изобретению,этот вектор можно сконструировать таким образом, чтобы он дополнительно содержал кодирующую последовательность для продукта генарепортера или другого селективного маркера. Такая кодирующая последовательность предпочтительно находится в оперативной связи с регуляторным элементом, кодирующим последовательности, как описано выше. Генырепортеры, которые являются полезными в изобретении, известны в данной области и включают в себя те, которые кодируют, среди прочего, зеленый флуоресцентный белок, люциферазу, хуIЕ и тирозиназу. Нуклеотидные последовательности, кодирующие селективные маркеры, известны в данной области и включают в себя те, которые кодируют продукты генов,придающие устойчивость к антибиотикам или антиметаболитам, или которые удовлетворяют ауксотрофные потребности. Примеры таких последовательностей, среди многих прочих,включают в себя те, которые кодируют устойчивость к эритромицину, тиострептону или канамицину. 5.2.2. Трансформация клеток-хозяев Далее в настоящем изобретении предложены трансформированные клетки-хозяева, содержащие полинуклеотидную молекулу или рекомбинантный вектор по изобретению, а также новые штаммы или клеточные линии,имеющие происхождение от них. Клеткихозяева, полезные при осуществлении изобретения, предпочтительно представляют собой клетки Streptomyces, хотя можно также использовать другие прокариотические клетки или эукариотические клетки. Такие трансформированные клетки-хозяева обычно, среди прочего,включают в себя микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинант 003905 24 ной ДНК бактериофагов, ДНК плазмидных векторов или ДНК космидных векторов, либо дрожжи, трансформированные рекомбинантными векторами, но не ограничиваются ими. Полинуклеотидные молекулы по настоящему изобретению предназначены для функционирования в клетках Streptomyces, но ими также можно трансформировать другие бактериальные или эукариотические клетки, например для целей клонирования или экспрессии. Обычно можно использовать штамм E.coli, такой, как например штамм DH5, который можно получить от American Type Culture Collection(ATCC), Rockville, MD, USA ( no каталогу 31343) и из коммерческих источников (Stratagene). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают в себя дрожжевые клетки, хотя клетки млекопитающих или клетки насекомых также можно эффективно использовать. Рекомбинантным вектором экспрессии по изобретению предпочтительно трансформируют или трансфицируют одну или более чем одну клетку-хозяина, по существу, гомогенной культуры клеток. Этот вектор экспрессии, как правило, вводят в клетки-хозяева в соответствии с известными методиками, такими как, например,трансформация протопластов,кальцийфосфатное осаждение, обработка хлоридом кальция,микроинъекция,электропорация,трансфекция путем контакта с рекомбинантным вирусом, опосредованная липосомами трансфекция, ДЕАЕ (диэтиламиноэтил)-декстрановая трансфекция, трансдукция, конъюгация или бомбардировка микроснарядами. Отбор трансформантов можно проводить с помощью стандартных методик, таких как отбор клеток, экспрессирующих селективный маркер, например устойчивость к антибиотику, связанную с рекомбинантным вектором, как описано выше. Как только вектор экспрессии введен в клетку-хозяина, интеграцию и поддержание кодирующей последовательности aveC либо в хромосоме клетки-хозяина, либо в эписомном состоянии можно подтвердить с помощью стандартных методик, например с помощью гибридизационного анализа по Саузерну, рестрикционного анализа, ПЦР-анализа, включая обратнотранскриптазную ПЦР (rt-ПЦР), либо с помощью иммунологического анализа для обнаружения ожидаемого продукта гена. Клеткихозяева, содержащие и/или экспрессирующие рекомбинантную кодирующую последовательность aveC, можно идентифицировать с помощью любого из по меньшей мере четырех обычных подходов, которые хорошо известны в данной области, включая: (1) гибридизацию ДНК-ДНК, ДНК-РНК или РНК-антисмысловая РНК; (2) обнаружение присутствия функций маркерного гена; (3) оценку уровня транскрипции, который измеряют по экспрессии транскриптов aveC-специфичных мРНК в клет 25 ке-хозяине; и (4) обнаружение присутствия зрелого полипептидного продукта, которое измеряют, например, с помощью иммунологического анализа или по присутствию биологической активности AveC (например, продуцирования специфичных соотношений и количеств авермектинов, показательных для активности AveC,например, в клетках-хозяевах S.avermitilis). 5.2.3. Экспрессия и характеристика продукта рекомбинантного гена AveC Как только кодирующая последовательность aveC стабильно введена в подходящую клетку-хозяина, эту трансформированную клетку-хозяин клонально размножают, и полученные клетки можно выращивать в условиях, приводящих к максимальному продуцированию продукта гена AveC. Такие условия обычно включают в себя выращивание клеток до высокой плотности. Там, где вектор экспрессии содержит индуцибельный промотор, используют подходящие условия индукции, такие как, например, температурный сдвиг, истощение питательных сред, добавление спонтанных индукторов (например, аналогов углеводов, таких как изопропилD-тиогалактопиранозид (ИПТГ,аккумуляция избытка метаболических побочных продуктов и тому подобные, как необходимо для индукции экспрессии. Там, где экспрессированный продукт генаAveC сохраняется внутри клетки-хозяина, эти клетки собирают и лизируют, и этот продукт выделяют и очищают из лизата в условиях экстракции, известных в данной области, минимизирующих деградацию белка, таких как, например, при 4 С или в присутствии ингибиторов протеаз, или при тех и других условиях. Там,где экспрессированный продукт гена AveC секретируется из клеток-хозяев, истощенную питательную среду можно просто собрать и выделить из нее этот продукт. Экспрессированный продукт гена AveC можно выделить или по существу очистить из клеточных лизатов или культуральной среды,как является подходящим, используя стандартные способы, включая любое сочетание следующих способов: осаждения сульфатом аммония, фракционирования по размеру, ионообменной хроматографии, ВЭЖХ, центрифугирования в градиенте плотности и аффинной хроматографии, но не ограничиваясь ими. Там, где экспрессированный продукт гена AveC проявляет биологическую активность, за повышенной чистотой препарата можно следить на каждой стадии процедуры очистки с помощью использования подходящего анализа. Проявляет экспрессированный продукт гена AveC биологическую активность или не проявляет, его можно обнаружить на основании, например, размера или реактивности с антителом, в другом отношении специфичном для AveC, либо по присутствию метки слияния. 26 Далее в настоящем изобретении предложен рекомбинантно экспрессированный продукт гена AveC S.avermitilis, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью плазмиды рSЕ 186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC, либо аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1 (SEQ ID NО:2), или ее существенную часть, а также ее гомологи. Далее в настоящем изобретении предложен рекомбинантно экспрессированный продукт гомолога гена AveC S.hygroscopicus, содержащий аминокислотную последовательностьSEQ ID NО:4 или ее существенную часть, а также ее гомологи. Далее в настоящем изобретении предложен способ получения продукта гена AveC, при котором культивируют клетку-хозяина, трансформированную рекомбинантным вектором экспрессии, причем указанный вектор содержит полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена AveC, причем эта полинуклеотидная молекула находится в оперативной связи с одним или более чем одним регуляторным элементом, который контролирует экспрессию этой полинуклеотидной молекулы в клетке-хозяине, в условиях,приводящих к продуцированию продукта рекомбинантного гена AveC, и выделяют продукт генаAveC из клеточной культуры. Рекомбинантно экспрессированный продукт гена AveC S.avermitilis является полезным для разнообразных целей, включая скрининг соединений, которые изменяют функцию продукта гена AveC и поэтому модулируют биосинтез авермектинов, а также для выработки антител, направленных против продукта генаAveC. Как только получен продукт гена AveC достаточной чистоты, его можно охарактеризовать с помощью стандартных способов, включая ДСН-ПААГ электрофорез (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), гель-хроматографию, анализ аминокислотной последовательности, биологическую активность при продуцировании соответствующих продуктов в пути биосинтеза авермектинов и так далее. Например, аминокислотную последовательность продукта гена AveC можно определить, используя стандартные методики секвенирования пептидов. Продукт генаAveC можно далее охарактеризовать, используя анализ гидрофильности (см., например, Норрand Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824) или аналогичные алгоритмы программного обеспечения для идентификации гидрофобных и гидрофильных участков в продукте гена AveC. Можно провести структурный анализ для идентификации участков продукта гена AveC, которые принимают специфические вторичные структуры. Для картирования и изучения сайтов взаимодействия между продуктом 27 гена AveC и его субстратом можно использовать биофизические способы, такие как рентгенокристаллография (Engstrom, 1974, Biochem.Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Информацию, полученную от этих исследований, можно использовать для выбора новых сайтов для мутации в ОРС aveC, чтобы способствовать разработке новых штаммовS.avermitilis, обладающих более желательными характеристиками продуцирования авермектинов. 5.3. Конструирование и использование мутантов AveC Далее в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая в других отношениях является такой же, как последовательность плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующая продукт гена AveCS.avermitilis, или нуклеотидная последовательность ОРС aveC S.avermitilis, как представлено на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), но которая дополнительно содержит одну или более чем одну мутацию, так что клетки штамма S.avermitilis АТСС 53692, в которых аллель aveC дикого типа инактивирован и которые экспрессируют полинуклеотидную молекулу, содержащую мутированную нуклеотидную последовательность, продуцируют иное соотношение или количество авермектинов, чем продуцируется клетками штамма S.avermitilis ATCC 53692, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Согласно настоящему изобретению такие полинуклеотидные молекулы можно использовать для получения новых штаммовS.avermitilis, которые проявляют обнаружимое изменение в продуцировании авермектинов по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммовS.avermitilis, которые продуцируют авермектины в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. В следующем предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммов S.avermitilis, которые продуцируют повышенные уровни авермектинов по сравнению с тем же штаммом, который вместо этого экспрессирует только аллель aveC дикого типа. В следующем предпочтительном воплощении такие полинуклеотидные молекулы являются полезными для получения новых штаммов 28 Мутации в кодирующей последовательности aveC включают в себя любые мутации, которые вводят аминокислотные делеции, добавления или замены в продукт гена AveC или которые приводят к укорочению этого продукта гена AveC, либо любое их сочетание, и которые дают желаемый результат. Например, в настоящем изобретении предложены полинуклеотидные молекулы, содержащие нуклеотидную последовательность плазмиды рSЕ 186 (ATCC 209604), кодирующую продукт гена AveC, или нуклеотидную последовательность OPC aveCS.avermitilis, как представлено на фиг. 1 (SEQ IDNО:1), но которая дополнительно содержат одну или более чем одну мутацию, которая кодирует замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком в выбранных положениях в продукте гена AveC. В некоторых неограничивающих воплощениях, примеры которых приведены ниже, такие замены можно осуществлять в любом из положений аминокислот 55, 138, 139 или 230, либо в некотором их сочетании. Мутации в кодирующей последовательности aveC осуществляют любым из ряда известных способов, включая использование склонной к ошибкам ПЦР или кассетный мутагенез. Например, направленный сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов можно использовать для изменения последовательности ОРС aveC определенным путем, таким как, например, введение одного или более чем одного сайта рестрикции или терминирующего кодона в специфические участки в пределах последовательности ОРС aveC. Для создания больших библиотек полинуклеотидов, имеющих нуклеотидные последовательности, кодирующие мутации aveC, можно также использовать способы, такие как те, которые описаны в патенте США 5605793, в которые вовлечены случайная фрагментация, повторяющиеся циклы мутагенеза и нуклеотидный сдвиг. Направленные мутации могут быть полезны, в частности, там, где они служат для изменения одного или более чем одного консервативного аминокислотного остатка в продукте гена AveC. Например, сравнение выведенных аминокислотных последовательностей продуктов генов AveC и продуктов гомологов геновS.hygroscopicus (SEQ ID NО:4), как представлено на фиг. 6, указывает на сайты значительной консервативности аминокислотных остатков между этими видами. Направленный мутагенез,который приводит к замене в одном или более чем одном из этих консервативных аминокислотных остатков, может быть особенно эффективным при получении новых мутантных штаммов, которые проявляют желаемые изменения в продуцировании авермектинов. 29 Неспецифический мутагенез также может быть полезным, и его можно осуществлять с помощью экспонирования клеток S.avermitilis при ультрафиолетовом облучении или рентгеновском излучении, либо с химическими мутагенами, такими как N-метил-N'-нитрозогуанидин, этиловый эфир метансульфокислоты,азотистая кислота или азотистые иприты. См.,например, Ausubel, 1989, выше, в качестве обзора методик мутагенеза. Как только получены мутированные полинуклеотидные молекулы, их подвергают скринингу, чтобы определить, могут ли они модулировать биосинтез авермектинов у S.avermitilis. В предпочтительном воплощении полинуклеотидную молекулу, имеющую мутированную нуклеотидную последовательность, тестируют по комплементации штамма S.avermitilis, в котором генaveC инактивирован, для получения aveCнегативного (aveC-) генетического фона. При неограничивающем способе эту мутированную полинуклеотидную молекулу встраивают по комплементарным концам в плазмиду экспрессии в оперативной связи с одним или более чем одним регуляторным элементом, причем эта плазмида предпочтительно также содержит один или более чем один ген устойчивости к лекарствам, что позволяет отбирать трансформированные клетки. Затем этим вектором трансформируют клетки-хозяева aveC-, используя известные методики, и трансформированные клетки отбирают и культивируют в подходящих ферментационных средах в условиях, которые дают возможность продуцирования авермектинов или индуцируют его. Затем продукты ферментации анализируют с помощью ВЭЖХ, чтобы определить способность мутированной полинуклеотидной молекулы к комплементации клетки-хозяина. Примеры нескольких векторов, несущих мутированные полинуклеотидные молекулы, способные снижать соотношение В 2:В 1 авермектинов,включая рSЕ 188, рSЕ 199 и рSЕ 231, приведены в разделе 8.3 ниже. В настоящем изобретении предложены способы идентификации мутаций ОРС aveCS.avermitilis, способных к изменению соотношения и/или количества продуцируемых авермектинов. В предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен способ идентификации мутаций ОРС aveC, способных к изменению соотношения классов 2:1 продуцируемых авермектинов, при котором: (а) определяют соотношение классов 2:1 авермектинов,продуцируемых клетками штамма S.avermitilis,в которых нативный аллель aveC инактивирован, и в которые введена и экспрессируется полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт мутированного гена AveC; (б) определяют соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками того же штаммаS.avermitilis, как на стадии (а), но которые вме 003905 30 сто этого экспрессируют только аллель aveC,имеющий нуклеотидную последовательность ОРС, представленную на фиг. 1 (SEQ ID NО:1),или нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной данной; и (в) сравнивают соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (а), с соотношением классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (б); так что, если соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (а), отличается от соотношения классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клеткамиS.avermitilis стадии (б), то мутация ОРС aveC,способная к изменению соотношения классов 2:1 авермектинов, идентифицирована. В предпочтительном воплощении эта мутация снижает соотношение классов 2:1 авермектинов. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен способ идентификации мутаций ОРС aveC или генетических конструкций, содержащих ОРСaveC, способных к изменению количества продуцируемых авермектинов, при котором: (а) определяют количество авермектинов, продуцируемых клетками штамма S-avermitilis, в котором нативный аллель aveC инактивирован, и в которые введена и экспрессируется полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт мутированного гена AveC, или содержащая генетическую конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена AveC; (б) определяют количество авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S.avermitilis, как на стадии (а), но которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC, имеющий нуклеотидную последовательность ОРС, представленную на фиг. 1(SEQ ID NО:1), или нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной данной; и (в) сравнивают количество авермектинов,продуцируемых клетками S.avermitilis стадии(а), с количеством авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (б); так что,если количество авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (а), отличается от количества авермектинов, продуцируемых клетками S.avermitilis стадии (б), то мутация OPCaveC или генетической конструкции, способная к изменению количества авермектинов, идентифицирована. В предпочтительном воплощении эта мутация повышает количество продуцируемых авермектинов. Любой из вышеупомянутых способов идентификации мутаций осуществляют с помощью использования ферментационных культуральных сред, в которые предпочтительно добавлена циклогексанкарбоновая кислота, хотя также можно использовать другие подходящие предшественники жирных кислот, такие как 31 любой из предшественников жирных кислот,список которых приведен в табл. 1. Как только мутированная полинуклеотидная молекула, которая модулирует продуцирование авермектинов в желаемом направлении,идентифицирована, можно определить локализацию мутации в этой нуклеотидной последовательности. Например, полинуклеотидную молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированный продукт гена AveC, можно выделить с помощью ПЦР и подвергнуть секвенированию ДНК, используя известные способы. Мутацию (мутации), ответственную (ответственные) за изменение в продуцировании авермектинов, можно определить с помощью сравнения последовательности ДНК мутированного аллеля aveC с последовательностью ДНК аллеля aveC дикого типа. В конкретных, хотя неограничивающих, воплощениях настоящего изобретения, продукты гена AveCS.avermitilis, содержащие либо одиночные аминокислотные замены в любом из остатков 55(G230D), либо двойную замену в положениях 138 (S138T) и 139 (А 139 Т), приводили к изменениям функции продукта гена AveC, так что соотношение классов 2:1 продуцируемых авермектинов, было изменено (см. раздел 8 ниже). Соответственно, полинуклеотидные молекулы,имеющие нуклеотидные последовательности,которые кодируют продукты мутированного гена AveC S.avermitilis, содержащие аминокислотные замены в одном или более чем одном из аминокислотных остатков 55, 138, 139 или 230,или любое их сочетание, включены в объем настоящего изобретения. Далее в настоящем изобретении предложены композиции для создания новых штаммовS.avermitilis, клетки которых содержат мутированный аллель aveC, который приводит к изменению продуцирования авермектинов. Например, в настоящем изобретении предложены рекомбинантные векторы, которые можно использовать для доставки любой из полинуклеотидных молекул, содержащих мутированные нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению, к сайту гена aveC хромосомыS.avermitilis либо для встраивания в него, либо для замещения ОРС aveC или ее части посредством гомологичной рекомбинации. Согласно настоящему изобретению, однако, полинуклеотидная молекула, содержащая мутированную нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, предложенная здесь, может также функционировать для модулирования биосинтеза авермектинов при встраивании в хромосому S.avermitilis в сайте, ином чем генaveC, или при поддержании в эписомном состоянии в клетках S.avermitilis. Таким образом,в настоящем изобретении также предложены векторы, содержащие полинуклеотидную молекулу, содержащую мутированную нуклеотид 003905 32 ную последовательность по настоящему изобретению, причем эги векторы можно использовать для встраивания этой полинуклеотидной молекулы в сайт на хромосоме S.avermitilis, иной чем ген aveC, или для поддержания в эписомном состоянии. В предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены векторы замещения генов, которые можно использовать для встраивания мутированного аллеля aveC в клетки штамма S.avermitilis с образованием новых штаммов S.avermitilis, клетки которых продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых этими клетками, снижено. Такие векторы замещения генов можно сконструировать, используя мутированные полинуклеотидные молекулы,присутствующие в векторах экспрессии, предложенных здесь, таких как pSE188, pSE199 и рSЕ 231, причем примеры этих векторов экспрессии приведены в разделе 8.3 ниже. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены векторы, которые можно использовать для встраивания мутированного аллеля aveC в клетки штамма S.avermitilis с образованием новых штаммов из клеток, которые продуцируют измененные количества авермектинов по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении количество авермектинов, продуцируемых этими клетками, повышено. В конкретном, хотя неограничивающем, воплощении такой вектор дополнительно содержит сильный промотор,как известно в данной области, такой как, например, сильный конститутивный промотор еrmЕ из Saccharopolyspora erythraea, который расположен в обратном направлении от ОРСaveC или находится в оперативной связи с ней. Такой вектор может представлять собой плазмиду рSЕ 189, описанную в примере 11 ниже,или его можно сконструировать с помощью использования мутированного аллеля aveC плазмиды pSE189. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены векторы замещения генов, которые являются полезными для инактивации гена aveC в штамме S.avermitilis дикого типа. В неограничивающем воплощении такие векторы замещения генов можно сконструировать, используя мутированную полинуклеотидную молекулу, присутствующую в плазмиде pSE180 (ATCC 209605),пример которой приведен в разделе 8.1 ниже(фиг. 3). Далее в настоящем изобретении предложены векторы замещения генов, которые содержат полинуклеотидную молекулу, содержа 33 щую нуклеотидные последовательности или состоящую из нуклеотидных последовательностей, которые в природе фланкируют ген aveCin situ в хромосоме S.avermitilis, включая, например, те фланкирующие нуклеотидные последовательности, которые показаны на фиг. 1(SEQ ID NО:1), причем эти векторы можно использовать для делеции ОРС aveC S.avermitilis. Далее в настоящем изобретении предложены способы создания новых штаммовS.avermitilis, содержащих клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC и которые продуцируют измененное соотношение и/или количество авермектинов по сравнению с клетками того же штамма S.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен способ создания новых штаммов S.avermitilis, содержащих клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC и которые продуцируют измененное соотношение классов 2:1 авермектинов по сравнению с клетками того же штаммаS.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, при котором клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором, который несет мутированный аллель aveC, кодирующий продукт гена, который изменяет соотношение классов 2:1 авермектинов,продуцируемых клетками штаммаS.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, и отбирают трансформированные клетки, которые продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1, продуцируемых клетками штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении измененное соотношение классов 2:1 авермектинов снижено. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен способ создания новых штаммов S.avermitilis,содержащих клетки, которые продуцируют измененные количества авермектина, при котором клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором, который несет мутированный аллельaveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, экспрессия которого приводит к изменению количества авермектинов,продуцируемых клетками штамма S.avermitilis,экспрессирующими этот мутированный аллельaveC или генетическую конструкцию, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, и отбирают трансформированные клетки, которые продуцируют авермектины в измененном количестве по сравнению с количеством авермектинов, продуцируемых клетками штамма, которые вместо этого экспрессируют 34 только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении количество авермектинов,продуцируемых в трансформированных клетках, повышено. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложен способ создания новых штаммов S.avermitilis,клетки которых содержат инактивированный аллель aveC, при котором клетки штаммаaveC инактивирован. В предпочтительном, хотя неограничивающем, воплощении клетки штамма S.avermitilis трансформируют вектором замещения генов, который несет аллель aveC, который инактивирован мутацией или замещением части этого аллеля aveC последовательностью гетерологичного гена, и отбирают трансформированные клетки, в которых нативный аллель aveC этих клеток замещен инактивированным аллелем aveC. Инактивацию аллеляaveC можно определить в помощью ВЭЖХанализа продуктов ферментации, как описано ниже. В конкретном, хотя неограничивающем,воплощении, описанном в разделе 8.1 ниже,аллель aveC инактивируют вставкой гена еrmЕ из Saccharopolyspora erythraea в ОРС aveC. Далее в настоящем изобретении предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые трансформированы любой из полинуклеотидных молекул или векторов по настоящему изобретению. В предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC вместо аллеля aveC дикого типа или дополнительно к аллелю aveC дикого типа,причем эти клетки нового штамма продуцируют авермектины в измененном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении это измененное соотношение классов 2:1, продуцируемых этими новыми клетками, снижено. Такие новые штаммы являются полезными при крупномасштабном производстве коммерчески желательных авермектинов, таких как дорамектин. Важнейшей задачей скрининговых анализов, описанных здесь, является идентификация мутированных аллелей гена aveC, экспрессия которых в клетках S.avermitilis изменяет и, более конкретно, снижает соотношение классов 2:1 продуцируемых авермектинов. В предпочтительном воплощении соотношение В 2:В 1 авермектинов, продуцируемых клетками нового штамма S.avermitilis по настоящему изобретению, экспрессирующими мутированный аллельaveC, который снижает соотношение классов 35 2:1 продуцируемых авермектинов, составляет ниже примерно от 1,6:1 до примерно 0:1; в более предпочтительном воплощении это соотношение составляет между примерно 1:1 и примерно 0:1; и в наиболее предпочтительном воплощении это соотношение составляет между примерно 0,84:1 и примерно 0:1. В конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил В 2:циклогексил В 1 в соотношении менее 1,6:1. В другом конкретном воплощении, описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил В 2:циклогексил В 1 в соотношении примерно 0,94:1. В следующем другом конкретном воплощении, описанном ниже,новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил В 2:циклогексил В 1 в соотношении примерно 0,88:1. В следующем другом конкретном воплощении,описанном ниже, новые клетки по настоящему изобретению продуцируют авермектины циклогексил В 2: циклогексил В 1 в соотношении примерно 0,84:1. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, которые экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, вместо аллеля aveC дикого типа или дополнительно к аллелю aveC дикого типа, где эти клетки этого нового штамма продуцируют измененное количество авермектинов по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. В предпочтительном воплощении этот новый штамм продуцирует повышенное количество авермектинов. В неограничивающем воплощении генетическая конструкция дополнительно содержит сильный промотор, такой как сильный конститутивный промотор еrmЕ из Saccharopolyspora erythraea,который расположен в обратном направлении от ОРС aveC или в оперативной связи с ней. В следующем предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложены новые штаммы S.avermitilis, содержащие клетки, в которых аллель aveC инактивирован. Такие штаммы являются полезными как для различного спектра авермектинов, которые они продуцируют по сравнению со штаммом дикого типа, так и в скрининговых анализах на комплементацию, как описано здесь, чтобы определить, влияет ли направленный или неспецифический мутагенез гена aveC на продуцирование авермектинов. В конкретном воплощении, описанном ниже, клетки-хозяева S.avermitilis конструировали с помощью генной инженерии так,что они содержали инактивированный ген aveC. Например, штамм SE180-11, описанный в примерах ниже, получили, используя плазмиду замещения генов рSЕ 180 (АТСС 209605) (фиг. 3), 003905 36 которую сконструировали таким образом, чтобы инактивировать ген aveC S.avermitilis вставкой гена устойчивости еrmЕ в кодирующий участокaveC. Далее в настоящем изобретении предложены рекомбинантно экспрессированные продукты мутированного гена AveC S.avermitilis,кодируемые любой из вышеупомянутых полинуклеотидных молекул по изобретению, и способы их получения. Далее в настоящем изобретении предложен способ получения авермектинов, при котором клетки штамма S.avermitilis, которые экспрессируют мутированный аллель aveC, который кодирует продукт гена, который изменяет соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрессирующими этот мутированный аллельaveC, по сравнению с клетками того же штамма,которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, культивируют в культуральных средах в условиях, которые дают возможность продуцирования или индуцируют продуцирование авермектинов из них, и выделяют указанные авермектины из этой культуры. В предпочтительном воплощении соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых в этой культуре клетками, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC, снижено. Этот способ обеспечивает повышенную эффективность при производстве коммерчески значимых авермектинов, таких как дорамектин. Далее в настоящем изобретении предложен способ продуцирования авермектинов, при котором клетки штамма S.avermitilis, которые экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, содержащую аллель aveC, который приводит к продуцированию измененного количества авермектинов,продуцируемых клетками штамма S.avermitilis,экспрессирующими этот мутированный аллельaveC или генетическую конструкцию, по сравнению с клетками того же штамма, которые не экспрессируют мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, но вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа,культивируют в культуральных средах в условиях, которые дают возможность продуцирования или индуцируют продуцирование авермектинов из них, и выделяют указанные авермектины из этой культуры. В предпочтительном воплощении количество авермектинов, продуцируемых в культуре клетками, экспрессирующими этот мутированный аллель aveC или генетическую конструкцию, повышено. Далее в настоящем изобретении предложена новая композиция авермектинов, продуцируемых штаммом S.avermitilis, экспрессирующим мутированный аллель aveC, который кодирует продукт гена, который снижает соотношение классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками штамма S.avermitilis, экспрес 37 сирующими этот мутированный аллель aveC, по сравнению с клетками того же штамма, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа, причем эти авермектины в новой композиции продуцируются в сниженном соотношении классов 2:1 по сравнению с соотношением классов 2:1 авермектинов, продуцируемых клетками того же штамма S.avermitilis, которые вместо этого экспрессируют только аллель aveC дикого типа. Эта новая композиция авермектинов либо может присутствовать как продуцируемая в истощенной ферментационной культуральной жидкости, либо ее можно собрать из этой жидкости. Эту новую композицию авермектинов можно частично или существенно очистить из этой культуральной жидкости с помощью известных биохимических методик очистки, таких как осаждение сульфатом аммония,диализ, фракционирование по размеру, ионообменная хроматография, ВЭЖХ и так далее. 5.4. Применение авермектинов Авермектины являются высокоактивными противопаразитарными агентами, имеющими конкретную пользу в качестве антигельминтных средств, эктопаразитицидов, инсектицидов и акарицидов. Авермектиновые соединения, полученные согласно способам по настоящему изобретению, являются полезными для любой из этих целей. Например, авермектиновые соединения, полученные согласно настоящему изобретению, являются полезными для лечения различных заболеваний или состояний у людей,в частности, где эти заболевания или состояния вызваны паразитарными инфекциями, как известно в данной области. См., например, Ikedaand Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609. Более конкретно, авермектиновые соединения,полученные согласно настоящему изобретению,являются эффективными при лечении ряда заболеваний или состояний, вызванных эндопаразитами, такими как паразитические нематоды,которые могут инфицировать людей, домашних животных, свиней, овец, домашнюю птицу, лошадей или крупный рогатый скот. Более конкретно, авермектиновые соединения, полученные согласно настоящему изобретению, являются эффективными против нематод, которые инфицируют людей, а также тех,которые инфицируют разнообразные виды животных. Такие нематоды включают в себя желудочно-кишечных паразитов, таких как Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Tiichinella,Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria, а также паразитов, которых обнаруживают в крови или других тканях или органах, таких как черви филярии и экстрагированные кишечные состояния Strongyloides и Trichinella. Авермектиновые соединения, полученные согласно настоящему изобретению, также являются полезными при лечении эктопаразитарных инфекций, включая, например, инвазии членистоногих у млекопитающих и птиц, вы 003905 38 званные иксодовыми клещами, клещами, вшами, блохами, падальными мухами, жалящими насекомыми или мигрирующими личинками двукрылых, которые могут поражать крупный рогатый скот и лошадей, среди прочего. Авермектиновые соединения, полученные согласно настоящему изобретению, также являются полезными в качестве инсектицидов против домашних вредителей, таких как, например, среди прочего, таракан, платяная моль,кожеед и комнатная муха, а также насекомыхвредителей убранного зерна и сельскохозяйственных растений, причем эти вредители включают в себя, среди прочего, паутинных клещиков, тлю, гусениц и прямокрылых, таких как саранча. Животные, которых можно лечить авермектиновыми соединениями, полученными согласно настоящему изобретению, включают в себя овец, крупный рогатый скот, лошадей, оленей, коз, свиней, птиц включая домашнюю птицу, а также собак и кошек. Авермектиновое соединение, полученное согласно настоящему изобретению, вводят в препарате в соответствии с конкретно назначенным применением, конкретным видом животного-хозяина, которое лечат, и вовлеченным паразитом или насекомым. Для применения в качестве паразитицида авермектиновое соединение,полученное согласно настоящему изобретению,можно вводить перорально в форме капсулы,болюса, таблетки или жидкого лекарства, либо альтернативно его можно вводить в виде вливания или путем инъекции, либо в виде имплантата. Такие препараты готовят общепринятым способом в соответствии со стандартной ветеринарной практикой. Так, капсулы, болюсы или таблетки можно готовить путем смешивания активного ингредиента с подходящим тонко измельченным разбавителем или носителем,дополнительно содержащим разрыхлитель и/или связывающее вещество, такое как крахмал, лактоза, тальк, стеарат магния и так далее. Препарат для вливания жидкого лекарства можно готовить путем диспергирования активного ингредиента в водном растворе вместе с диспергирующим или увлажняющим агентом и т.д. Инъекционные препараты можно готовить в форме стерильного раствора, который может содержать другие вещества, такие как, например, достаточное количество солей и/или глюкозы, чтобы сделать этот раствор изотоничным с кровью. Такие препараты будут варьировать в отношении массы активного соединения в зависимости от пациента или вида животногохозяина, которых нужно лечить, тяжести и типа инфекции, а также массы тела хозяина. Как правило, для перорального введения доза активного соединения от примерно 0,001 до 10 мг на кг массы тела пациента или животного, которую дают в виде однократной дозы или в разделен 39 ных на курс лечения дозах в течение периода от 1 до 5 суток, будет удовлетворительной. Однако могут быть случаи, когда показаны более высокие или более низкие диапазоны дозировки, как определено, например, врачом или ветеринаром на основании клинических симптомов. В качестве альтернативы авермектиновое соединение, полученное согласно настоящему изобретению, можно вводить в сочетании с кормом животного, и для этой цели можно готовить концентрированную пищевую добавку или заранее приготовленную смесь для смешивания с обычным кормом животного. Для применения в качестве инсектицида и для обработки сельскохозяйственных вредителей авермектиновое соединение, полученное согласно настоящему изобретению, можно применять в виде распыляемого раствора, пылевидного препарата, эмульсии и тому подобного в соответствии со стандартной сельскохозяйственной практикой. 6. Пример: Ферментация StreptomycesAvermitilis и анализ авермектинов В 2:В 1 Штаммы, у которых отсутствуют обе активности, дегидрогеназы 2-оксокислот с разветвленной цепью и 5-O-метилтрансферазы, не продуцируют авермектины, если в ферментационную среду не добавлены жирные кислоты. Данный пример демонстрирует, что у таких мутантов можно получить широкий диапазон соотношений В 2:В 1 авермектинов, когда биосинтез инициируют в присутствии различных жирных кислот. 6.1. Материалы и методыStreptomyces avermitilis ATCC 53692 хранили при -70 С в виде полного бульона, приготовленного в посевной среде, состоящей из: крахмала (Nadex, Laing National) - 20 г, Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15 г, Ardamine pH (yeast Products Inc.) - 5 г, карбоната кальция - 1 г. Конечный объем доводили до 1 л водопроводной водой, pH доводили до 7,2, и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. 2 мл оттаявшей суспензии вышеуказанного препарата использовали для инокуляции колбы,содержащей 50 мл той же среды. Через 48 ч инкубации при 28 С на роторной качалке при 180 об./мин 2 мл бульона использовали для инокуляции колбы, содержащей 50 мл производственной питательной среды, состоящей из: крахмала - 80 г, карбоната кальция - 7 г, Pharmamedia - 5 г, гидрофосфата калия - 1 г, сульфата магния - 1 г, глутаминовой кислоты - 0,6 г, гептагидрата сульфата железа (II) - 0,01 г, сульфата цинка - 0,001 г, сульфат марганца (II) - 0,001 г. Конечный объем доводили до 1 л водопроводной водой, pH доводили до 7,2, и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. Различные субстраты карбоновых кислот(см. табл. 1) растворяли в метаноле и добавляли к ферментационному бульону через 24 ч после 40 инокуляции с получением конечной концентрации 0,2 г/л. Этот ферментационный бульон инкубировали в течение 14 суток при 28 С, затем этот бульон центрифугировали (2500 об./мин в течение 2 мин) и отбрасывали супернатант. Мицелиальный остаток экстрагировали ацетоном(15 мл), затем дихлорметаном (30 мл), и органическую фазу отделяли, фильтровали, затем выпаривали досуха. Этот остаток растворяли в метаноле (1 мл) и анализировали с помощью ВЭЖХ жидкостным хроматографом HewlettPackard 1090 А, оборудованном сканирующим детекторным устройством с диодной матрицей при 240 нм. Используемая колонка представляла собой колонку Beckman Ultrasphere C-18, 5 мкм, 4,6 мм х 25 см, которую поддерживали при 40 С. В колонку вносили 25 мкл вышеуказанного метанольного раствора. Элюцию проводили линейным градиентом метанол-вода от 80:20 до 95:5 в течение 40 мин при 0,85 мл/мин. Для калибровки сигнала детектора использовали две стандартные концентрации циклогексила В 1 и измеряли площадь под кривыми для авермектинов В 2 и В 1. 6.2. Результаты Время удерживания, наблюдаемое для авермектинов В 2 и В 1, и соотношения 2:1 представлены в табл. 1. Таблица 1 Субстрат 4-Тетрагидропиранкарбоновая кислота Изомасляная кислота 3-Фуранкарбоновая кислотаS-(+)-2-метилмасляная кислота Циклогексанкарбоновая кислота 3-Тиофенкарбоновая кислота Циклопентанкарбоновая кислота 3-Трифторметилмасляная кислота 2-Метилпентановая кислота Циклогептанкарбоновая кислота Время удерживаСоотнония при ВЭЖХ,шение мин В 2 В 1 В 2:В 1 8,1 Данные, представленные в табл. 1, демонстрируют чрезвычайно широкий диапазон соотношений авермектиновых продуктов В 2:В 1,указывая на значительное различие в результатах дегидративного превращения соединений класса 2 в соединения класса 1 в зависимости от природы стартовой единицы боковой цепи добавленной жирной кислоты. Это указывает на то, что изменения в соотношениях В 2:В 1 в результате изменений AveC-белка могут быть специфичными к конкретным субстратам. Следовательно, скрининг на мутанты, проявляющие изменения в соотношении В 2:В 1, полученном с конкретным субстратом, необходимо проводить в присутствии именно этого субстрата. В последующих примерах, описанных ниже, в качестве субстрата скрининга использовали циклогексанкарбоновую кислоту. Однако этот субстрат использовали единственно для того, чтобы при 41 вести пример возможного, и он не предназначен, чтобы ограничивать применимость настоящего изобретения. 7. Пример: Выделение гена aveC Данный пример описывает выделение и характеристику участка хромосомы Streptomyces avermitilis, который кодирует продукт генаAveC. Как продемонстрировано ниже, ген aveC идентифицировали как способный к модификации соотношения продуцируемых авермектинов(В 2:В 1) циклогексил-В 2 и циклогексил-В 1. 7.1. Материалы и методы 7.1.1. Выращивание Streptomyces для выделения ДНК Для выращивания Streptomyces выполняли следующий способ. Единичные колонии-5 г, бактопептон Difco - 5 г, декстрозу - 2,5 г,MOPS - 5 г, бактоагар Difco - 15 г. Конечный объем доводили до 1 л дистиллированной Н 2 О,рН доводили до 7,0, и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. Мицелии, выращенные в вышеуказанной среде, использовали для инокуляции 10 мл среды TSB (триптический соевый бульон Difco(Difco Tryptic Soy Broth) - 30 г, в 1 л дистиллированной Н 2O, автоклавировали при 121 С в течение 25 мин) в пробирке 25 мм х 150 мм,которую держали при встряхивании (300 об./мин) при 28 С в течение 48-72 ч. 7.1.2. Выделение хромосомной ДНК из Streptomyces Аликвотные пробы (0,25 мл или 0,5 мл) мицелиев, выращенных, как описано выше, помещали в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки, и клетки концентрировали центрифугированием при 12000 х g в течение 60 с. Супернатант отбрасывали, а клетки ресуспендировали в 0,25 мл буфера TSE (20 мл 1,5 М сахарозы, 2,5 мл 1 М Трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мл 1 М ЭДТА, рН 8,0 и 75 мл дистиллированной H2O), содержащего 2 мг/мл лизоцима. Образцы инкубировали при 37 С в течение 20 мин при встряхивании, загружали в автоматизированный прибор для выделения нуклеиновых кислот AutoGen 540(оборудование программным обеспечением) согласно инструкциям изготовителя. Альтернативно 5 мл мицелиев помещали в пробирку 17 мм х 100 мм, клетки концентрировали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 5 мин, и супернатант удаляли. Клетки ресуспендировали в 1 мл буфера TSE, концентрировали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 5 мин, и супернатант удаляли. Клетки ресуспендировали в 1 мл буфера TSE,содержащего 2 мг/мл лизоцима, и инкубировали при 37 С при встряхивании в течение 30-60 мин. После инкубации добавляли 0,5 мл 10% 42 додецилсульфата натрия (ДСН), и клетки инкубировали при 37 С до тех пор, пока не наблюдался полный лизис. Этот лизат инкубировали при 65 С в течение 10 мин, охлаждали до комнатной температуры, делили на две пробирки Эппендорф объемом 1,5 мл и экстрагировали 1 х 0,5 мл смеси фенол/хлороформ (50% фенол,предварительно уравновешенный 0,5 М Трис,рН 8,0; 50% хлороформ). Водную фазу отбирали и экстрагировали от 2 до 5 х смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждали с помощью добавления 1/10 объема 3 М ацетата натрия, рН 4,8, инкубации этой смеси на льду в течение 10 мин, центрифугирования этой смеси при 15000 об./мин при 5 С в течение 10 мин и удаления супернатанта в чистую пробирку, в которую добавляли 1 объем изопропанола. Смесь супернатант плюс изопропанол затем инкубировали на льду в течение 20 мин, центрифугировали при 15000 об./мин в течение 20 мин при 5 С, супернатант удаляли, и остаток ДНК промывали 1 х 70% этанолом. После того,как осадок высыхал, ДНК ресуспендировали в буфере ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). 7.1.3. Выделение плазмидной ДНК из Streptomyces Аликвотную пробу (1,0 мл) мицелиев помещали в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, и клетки концентрировали центрифугированием при 12000 х g в течение 60 с. Супернатант отбрасывали, и клетки ресуспендировали в 1,0 мл 10,3% сахарозы, концентрировали центрифугированием при 12000 х g в течение 60 с и отбрасывали супернатант. Затем клетки ресуспендировали в 0,25 мл буфера TSE, содержащего 2 мг/мл лизоцима, инкубировали при 37 С в течение 20 мин при встряхивании и загружали в автоматизированный прибор для выделения нуклеиновых кислот AutoGen 540. Плазмидную ДНК выделяли, используя цикл 106 (оборудование программным обеспечением) согласно инструкциям изготовителя. Альтернативно 1,5 мл мицелиев помещали в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, и клетки концентрировали центрифугированием при 12000 х g в течение 60 с. Супернатант отбрасывали, клетки ресуспендировали в 1,0 мл 10,3% сахарозы, концентрировали центрифугированием при 12000 х g в течение 60 с и отбрасывали супернатант. Клетки ресуспендировали в 0,5 мл буфера TSE, содержащего 2 мг/мл лизоцима, и инкубировали при 37 С в течение 1530 мин. После инкубации добавляли 0,25 мл щелочного ДСН (0,3 н NaOH, 2% ДСН), и клетки инкубировали при 55 С в течение 15-30 мин или до тех пор, пока раствор не становился прозрачным. К раствору ДНК добавляли ацетат натрия (0,1 мл, 3 М, рН 4,8), а затем его инкубировали на льду в течение 10 мин. Образцы ДНК центрифугировали при 14000 об./мин в течение 10 мин при 5 С. Супернатант удаляли в чистую пробирку, добавляли 0,2 мл смеси фе 43 нол/хлороформ (50% фенол:50% хлороформ) и мягко перемешивали. Раствор ДНК центрифугировали при 14000 об./мин в течение 10 мин при 5 С, и верхний слой удаляли в чистую пробирку Эппендорф. Добавляли изопропанол (0,75 мл), и раствор мягко перемешивали, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Раствор ДНК центрифугировали при 14000 об./мин в течение 15 мин при 5 С,супернатант удаляли, и остаток ДНК промывали 70% этанолом, высушивали и ресуспендировали в буфере ТЕ. 7.1.4. Выделение плазмидной ДНК из E.coli Единичную трансформированную колонию E.coli инокулировали в 5 мл среды ЛуриаБертани (LB) (бактотриптон -10 г, бактодрожжевой экстракт - 5 г и NaCl - 10 г в 1 л дистиллированной Н 2O, рН 7,0, автоклавировали при 121 С в течение 25 мин и добавляли 100 мкг/мл ампициллин). Эту культуру инкубировали в течение ночи и аликвотную пробу объемом 1 мл помещали в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Образцы культуры загружали в автоматизированный прибор для выделения нуклеиновых кислот AutoGen 540 и выделяли плазмидную ДНК, используя цикл 3 (оборудование программным обеспечением) согласно инструкциям изготовителя. 7.1.5. Получение и трансформация протопластовS.avermitilis Единичные колонии S.avermitilis выделяли на YPD-6 1/2 концентрации. Мицелии использовали для инокуляции 10 мл среды TSB в пробирке 25 мм х 150 мм, которую затем инкубировали при встряхивании (300 об./мин) при 28 С в течение 48 ч. Один миллилитр мицелиев использовали для инокуляции 50 мл среды YEME. Среда YEME содержит на литр: дрожжевой экстракт Difco - 3 г; бактопептон Difco - 5 г; солодовый экстракт Difco - 3 г; сахарозу - 300 г. После автоклавирования при 121 С в течение 25 мин добавляли следующее: 2,5 М MgCl2.6H2O(автоклавировали отдельно при 121 С в течение 25 мин) - 2 мл и глицин (20%) (стерилизованный фильтрованием) - 25 мл. Мицелии выращивали при 30 С в течение 48-72 ч и собирали центрифугированием в центрифужной пробирке (Falcon) объемом 50 мл при 3000 об./мин в течение 20 мин. Супернатант отбрасывали, и мицелии ресуспендировали в буфере Р, который содержит: сахарозу - 205 г;K2SO4 - 0,25 г; MgCl26H2O - 2,02 г; Н 2O - 600 мл; K2 РO4 (0,5%) - 10 мл; раствор микроэлементов - 20 мл; CaCl22H2O (3,68%) -100 мл; и буфер MES (1,0 М, рН 6,5) - 10 мл. (Раствор микроэлементов содержит на литр: ZnCl2 - 40 мг;(NH4)6 Мо 7O244 Н 2O - 10 мг). рН доводили до 6,5,конечный объем доводили до 1 л, и среду фильтровали горячей через 0,45 микронный фильтр. 44 Мицелии осаждали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 20 мин, супернатант отбрасывали, и мицелии ресуспендировали в 20 мл буфера Р, содержащего 2 мг/мл лизоцима. Мицелии инкубировали при 35 С в течение 15 мин при встряхивании и проверяли под микроскопом, чтобы определить степень образования протопластов. Когда образование протопластов было завершено, эти протопласты центрифугировали при 8000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант удаляли, а протопласты ресуспендировали в 10 мл буфера Р. Эти протопласты центрифугировали при 8000 об./мин в течение 10 мин, супернатант удаляли, протопласты ресуспендировали в 2 мл буфера Р, и примерно по 1 х 109 протопластов распределяли в криогенные пробирки объемом 2,0 мл (Nalgene). Пробирку, содержащую 1 х 109 протопластов, центрифугировали при 8000 об./мин в течение 10 мин, супернатант удаляли, а протопласты ресуспендировали в 0,1 мл буфера Р. К протопластам добавляли от 2 до 5 мкг трансформирующей ДНК с последующим немедленным добавлением 0,5 мл рабочего буфера Т. Основа буфера Т содержит: ПЭГ-1000 (Sigma) - 25 г; сахарозу - 2,5 г; Н 2O - 83 мл. рН доводили до 8,8 1 н NaOH (стерилизованный фильтрованием), и основу буфера Т стерилизовали фильтрованием и хранили при 4 С. Рабочий буфер Т, приготовленный в день употребления, составлял из основы буфера Т - 8,3 мл; K2 РO4 (4 мМ) - 1,0 мл;CaCl2.2H2O (5 М) - 0,2 мл и TES (1 М, рН 8) - 0,5 мл. Каждый компонент рабочего буфера Т индивидуально стерилизовали фильтрованием. В пределах 20 с добавления буфера Т к протопластам добавляли также 1,0 мл буфера Р и протопласты центрифугировали при 8000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали и протопласты ресуспендировали в 0,1 мл буфера Р. Затем протопласты высевали на среду RM14, которая содержит: сахарозу - 205 г;H2O - 800 мл. Этот раствор автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. После автоклавирования добавляли стерильные исходные растворы следующих веществ: K2 РО 4 (0,5%) - 10 мл;CaCl22H2O (5 М) - 5 мл; L-пролин (20%) -15 мл; буфер MES (1,0 М, рН 6,5) - 10 мл; раствор микроэлементов (такой же, как выше) - 2 мл; исходный раствор циклогексимида (25 мг/мл) - 40 мл и 1 н. NaOH - 2 мл. Среду RM14 делили на аликвоты по 25 мл на чашку, и чашки сушили в течение 24 ч перед использованием. Протопласты инкубировали при 95% влажности при 30 С в течение 20-24 ч. Для отбора трансформантов, устойчивых к тиострептону, 1 мл покровного буфера, содержащего 125 мкг на миллилитр тиострептона, равномерно распределяли по поверхности регенерационных 45 чашек RM14. Покровный буфер содержит на 100 мл: сахарозу - 10,3 г; раствор микроэлементов (такой же, как выше) - 0,2 мл и MES (1,0 М,рН 6,5) - 1 мл. Протопласты инкубировали при 95% влажности при 30 С в течение 7-14 суток,пока колонии, устойчивые к тиострептонуInstitute, Norwich, U.K.) в некоторых случаях использовали для трансформаций. Способы и композиции для выращивания, получения протопластов и трансформации S.lividans описаны вFoundation, Norwich, U.K., и их осуществляли,как описано в данной публикации. Плазмидную ДНК из трансформантов S.lividans выделяли,как описано в разделе 7.1.3 выше. 7.1.7. Ферментационный анализ штаммовYPD-6 1/2 концентрации в течение 4-7 суток,инокулировали в 2,5 х 15 см пробирки, содержащие 8 мл преферментационной среды и две 5 мм стеклянные гранулы. Преферментационная среда содержит растворимый крахмал (либо мелкий кипяченный крахмал, либо KOSO, JapanCorn Starch Co., Nagoya) - 20 г/л; Pharmamedia 15 г/л; Ardamine pH - 5 г/л (Champlain Ind.,Clifton, NJ); СаСО 3 - 2 г/л; 2x bcfa ("bcfa" относится к жирным кислотам с разветвленной цепью), содержащие конечную концентрацию в этой среде 5010-3 2-(+/-)-метилмасляной кислоты, 6010-3 изомасляной кислоты и 2010-3 изовалериановой кислоты. pH доводили до 7,2 и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. Эту пробирку встряхивали под углом 17 при 215 об./мин при 29 С в течение 3 суток. 2 мл аликвотную пробу этой посевной культуры использовали для инокуляции 300 мл колбы Эрленмейера, содержащей 25 мл производственной питательной среды, которая содержит крахмал (либо мелкий кипяченый крахмал, либоpH доводили до 6,9 и среду автоклавировали при 121 С в течение 25 мин. После инокуляции эту колбу инкубировали при 29 С в течение 12 суток при встряхивании при 200 об./мин. После инкубации из этой колбы отбирали образец 2 мл, разбавляли 8 мл метанола, перемешивали, и эту смесь центрифугировали при 1250 х g в течение 10 мин, чтобы осадить дебрис. Затем супернатант анализиро 003905Beckman Ultrasphere ODS (25 см х 4,6 мм внутренний диаметр), при скорости тока 0,75 мл/мин и обнаружении по поглощению при 240 нм. Подвижная фаза представляла собой 86/8,9/5,1 метанол/вода/ацетонитрил. 7.1.8. Выделение PKS генов S.avermitilis Получали космидную библиотеку хромосомной ДНК S.avermitilis (ATCC 31272, SC-2) и гибридизовали ее с зондом кетосинтазы (KS),полученным из фрагмента гена поликетидсинтазы (PKS) Saccharopolyspora erythraea. Подробное описание получения космидных библиотек можно найти в Sambrook et al., 1989, см. выше. Подробное описание получения библиотек хромосомной ДНК Streptomyces представлено вHopwood et аl., 1985, см. выше. Космидные клоны, содержащие гибридизующиеся с кетосинтазой участки, идентифицировали по гибридизации с фрагментом NdeI/Eco47III длиной 2,7 т.п.о. из рЕХ 26 (любезно предоставленной Dr. P.Leadlay, Cambridge, UK). Примерно 5 нг рЕХ 26 подвергали ферментативному гидролизу, используя NdeI и Есо 47III. Эту реакционную смесь наносили на 0,8% агарозный гель SeaPlaque GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME). Фрагмент / NdeI /Eco47III длиной 2,7 т.п.о. вырезали из геля после электрофореза и ДНК выделяли из геля, используя GELase от Epicentre(NEN-Dupont, Boston, МА), используя систему ник-трансляции от BRL (BRL Life Technologies,Inc., Gaithersburg, MD), следуя инструкциям поставщика. Типичную реакцию проводили в объеме 0,05 мл. После добавления 5 мкл буфераStop меченую ДНК отделяли от невключившихся нуклеотидов, используя колонку с сефадексом G-25 Quick Spin (Boehringer Mannheim),следуя инструкциям поставщика. Провели скрининг на гибридизацию колоний примерно 1800 космидных клонов. Идентифицировали десять клонов, которые проявляли строгую гибридизацию с KS-зондомSacc.erythraea. Колонии E.coli, содержащие космидную ДНК, выращивали в жидкой среде LB и выделяли космидную ДНК из каждой культуры в автоматизированном приборе для выделения нуклеиновых кислот AutoGen 540, используя цикл 3 (оборудование программным обеспечением) согласно инструкциям изготовителя. Картирование рестрикционными эндонуклеазами и анализы блот-гибридизацией по Саузерну выявили, что пять из этих клонов содержат перекрывающиеся хромосомные участки. Геномную карту рестрикции S.avermitilis BamHI из этих пяти космид (то есть рSЕ 65, pSE66, pSE67,pSE68, pSE69) конструировали с помощью анализа перекрывающихся космид и гибридизаций 47 7.1.9. Идентификация ДНК, которая модулирует соотношения авермектинов В 2:В 1,и идентификация ОРС aveC Для тестирования субклонированных фрагментов, имеющих происхождение от космидного клона pSE66, на их способность к модулированию соотношений авермектинов В 2:В 1 у мутантов AveC использовали следующие способы. pSE66 (5 мкг) подвергали ферментативному гидролизу SaсI и BamHI. Эту реакционную смесь наносили на 0,8% агарозный гельSeaPlaque GTG (FMC BioProducts, Rockland,ME), фрагмент SacI/BamHI длиной 2,9 т.п.о. вырезали из геля после электрофореза, и ДНК выделяли из геля, используя GELase от Epicentre Technologies, используя быстрый протокол. Примерно 5 мкг челночного вектораSacI и SamHI. Примерно 0,5 мкг вставки длиной 2,9 т.п.о. и 0,5 мкг гидролизованного pWHM3 смешивали вместе и инкубировали в течение ночи с 1 ед. лигазы (New England Biolabs, Inc.,Beverly, MA) при 15 С в общем объеме 20 мкл согласно инструкциям поставщика. После инкубации 5 мкл этой лигазной смеси инкубировали при 70 С в течение 10 мин, охлаждали до комнатной температуры и использовали для трансформации компетентных клеток E.coli DH5SacI/SamHI длиной 2,9 т.п.о. подтверждали рестрикционным анализом. Эту плазмиду обозначили как рSЕ 119. Протопласты штамма S.avermitilis 1100SC38 (штамм фирмы Pfizer) получали и трансформировали pSE119, как описано в разделе 7.1.5 выше. Штамм 1100-SC38 представляет собой мутант, который продуцирует значительно больше авермектина формы циклогексил-В 2 по сравнению с авермектином формы циклогексил-В 1 при добавлении циклогексанкарбоновой кислоты (В 2:В 1 примерно 30:1). pSE119, используемую для трансформации протопластовS.avermitilis, выделяли либо из штамма E.coliGM2163 (полученного от Dr. В.J. Bachmann,Curator, E.coli Genetic Stock Center, Yale University), из штамма E.coli DM1 (BRL), либо из штамма S.lividans TK64. Выделяли устойчивые к тиострептону трансформанты штамма 1100SC38 и анализировали с помощью ВЭЖХанализа продуктов ферментации. Трансформанты штамма 1100-SC38 S.avermititis, содержащиеpSE119, продуцировали измененное соотношение авермектинов циклогексил-В 2:циклогексилВ 1 примерно 3,7:1 (табл. 2). Установив, что pSE119 способна к модулированию соотношений авермектинов В 2:В 1 у мутанта AveC, ДНК вставки секвенировали. Примерно 10 мкг pSE119 выделяли, используя набор для выделения плазмидной ДНК (Qiagen, 003905Valencia, CA), следуя инструкциям изготовителя, и секвенировали, используя автоматизированный секвенатор ДНК ABI 373A (PerkinaveC представлены на фиг. 1 (SEQ ID NО:1). Новую плазмиду, обозначенную pSE118,конструировали следующим образом. Примерно 5 мкг pSE66 подвергали ферментативному гидролизу SphI и BamHI. Эту реакционную смесь наносили на 0,8% агарозный гель SeaPlaqueGTG (FMC BioProducts), фрагмент SphI/BamHI длиной 2,8 т.п.о. вырезали из геля после электрофореза, и ДНК выделяли из геля, используяGELase (Epicentre Technologies), используя быстрый протокол. Примерно 5 мкг челночного вектора pWHM3 подвергали ферментативному гидролизу SphI и BamHI. Примерно 0,5 мкг вставки длиной 2,8 т.п.о. и 0,5 мкг гидролизованного pWHM3 смешивали вместе и инкубировали в течение ночи с 1 ед. лигазы (New England Biolabs) при 15 С в общем объеме 20 мкл согласно инструкциям поставщика. После инкубации 5 мкл этой лигазной смеси инкубировали при 70 С в течение 10 мин, охлаждали до комнатной температуры и использовали для трансформации компетентных клеток E.coli DH5 согласно инструкциям изготовителя. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК, и наличие вставки длиной 2,8 т.п.о. SphI/BamHI подтверждали рестрикционным анализом. Эту плазмиду обозначили как рSЕ 118. ДНК вставок в рSЕ 118 и рSЕ 119 перекрывается примерно на 838 нуклеотидов(фиг. 4). Протопласты штамма S.avermitilis 1100SC38 трансформировали рSЕ 118, как описано выше. Выделяли устойчивые к тиострептону трансформанты штамма 1100-SC38 и анализировали с помощью ВЭЖХ-анализа продуктов ферментации. Трансформанты штамма 1100SC38 S.avermitilis, содержащие pSE118, не изменяли соотношения авермектина циклогексилВ 2:авермектина циклогексил-В 1 по сравнению со штаммом 1100-SC38 (табл. 2). 7.1.10. ПЦР-амплификация гена aveC из хромосомной ДНК S.avermitilis Фрагмент длиной 1,2 т.п.о., содержащийOPC aveC, выделяли из хромосомной ДНКS.avermitilis с помощью ПЦР-амплификации,используя праймеры, сконструированные на основании нуклеотидной последовательности(Texas). Правонаправленный праймер представлял собой 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3'(SEQ ID NО:6), a левонаправленный праймер представлял собой 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NО:7). Реакцию ПЦР осуществляли с полимеразой Deep Vent (NewEngland Biolabs) в буфере, поставляемом производителем, и в присутствии 300 мкМ дНТФ,10% глицерина, 200 пмоль каждого праймера,0,1 мкг матрицы и 2,5 ед. фермента в конечном объеме 100 мкл, используя термоциклер PerkinElmer Cetus. Температурный профиль первого цикла составлял 95 С в течение 5 мин (стадия денатурации), 60 С в течение 2 мин (стадия отжига) и 72 С в течение 2 мин (стадия элонгации). Последующие 24 цикла имели сходный температурный профиль за исключением того,что стадию денатурации сокращали до 45 с, а стадию отжига сокращали до 1 мин. Продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и обнаруживали единственную полосу ДНК 1,2 т.п.о. Эту ДНК очищали из геля и лигировали с 25 нг линеаризованного вектора pCR-Blunt (Invitrogen) с тупыми концами в 1:10 молярном отношении вектора к вставке, следуя инструкциям изготовителя. Эту лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli One Shot (Invitrogen), следуя инструкциям изготовителя. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину,выделяли плазмидную ДНК и наличие вставки длиной 1,2 т.п.о. подтверждали рестрикционным анализом. Эту плазмиду обозначили какpSE179. ДНК вставки из pSE179 выделяли с помощью ферментативного гидролиза BamHI/XbaI,разделяли с помощью электрофореза, очищали из геля и лигировали с челночным векторомpWHM3, который был также подвергнут ферментативному гидролизу BamHI/XbaI, при суммарной концентрации ДНК 1 мкг в 1:5 молярном отношении вектора к вставке. Эту лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli DH5 согласно инструкциям изготовителя. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК, и наличие вставки длиной 1,2 т.п.о. подтверждали рестрикционным анализом. Этой плазмидой, которую обозначили как pSE186E.coli DM1 и выделяли плазмидную ДНК из трансформантов, устойчивых к ампициллину. 7.2. Результаты Было идентифицировано, что фрагментSacI/BamHI длиной 2,9 т.п.о. из pSE119 при трансформации им штамма S.avermitilis 1100SC38 значительно изменяет соотношение продуцирования авермектинов В 2:В 1. В норме штамм S.avermitilis 1100-SC38 имеет В 2:В 1 соотношение примерно 30:1, но при трансформации вектором,содержащим фрагментSacI/BamHI длиной 2,9 т.п.о., соотношение авермектинов В 2:В 1 снижалось до примерно 3,7:1. Постферментационный анализ культур трансформантов подтвердил наличие трансформирующей ДНК. Этот фрагмент длиной 2,9 т.п.о. pSE119 секвенировали и идентифицировали ОРС дли 003905 50 ной 1,2 т.п.о. (фиг. 1) (SEQ ID NО:1), который включает в себя фрагмент PstI/SphI, который ранее был мутирован в другом месте для продуцирования только продуктов В 2 (Ikeda et al.,1995, выше). Сравнение этой ОРС или ее соответствующего выделенного полипептида с известными базами данных (GenEMBL, SWISSPROT) не показало какой-либо сильной гомологии с известными последовательностями ДНК или белка. В табл. 2 представлен ферментационный анализ штамма S.avermitilis 1100-SC38, трансформированного различными плазмидами. Таблица 2 Штамм S.avermitilis Число протес- СреднееAveC S.avermitilis Данный пример описывает конструирование нескольких различных мутантов AveCS.avermitilis при использовании композиций и способов, описанных выше. Общее описание методик для введения мутаций в ген в Streptomyces приведено Kieser and Hopwood, 1991,Meth. Enzym. 204: 430-458. Более подробное описание представлено Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI(2):226-233, и Stutzman-Engwall et al.,1992, J. Bacteriol. 174(1): 144-154. Эти ссылки включены здесь полностью путем ссылки. 8.1. Инактивация гена aveC S.avermitilis Мутанты AveC, содержащие инактивированные гены aveC, конструировали, используя несколько способов, как подробно описано ниже. При первом способе фрагмент SphI/PstI длиной 640 п.о., внутренний по отношению к гену aveC в рSЕ 119 (плазмида, описанная в разделе 7.1.9 выше), замещали геном еrmЕ (устойчивости к эритромицину) из Sacc.erythraea. Этот ген еrmЕ выделяли из pIJ4026 (предоставленаBibb et al., 1985, Gene 41:357-368) с помощью гидролиза ферментами рестрикции Bg/II иEcoRI с последующим электрофорезом и очищали из геля. Этот фрагмент длиной 1,7 т.п.о. лигировали в pGEM7Zf (Promega), который был подвергнут ферментативному гидролизу BamHI и EcoRI, и этой лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli DH5, следуя инструкциям изготовителя. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК, и наличие вставки длиной 1,7 т.п.о. подтверждали рестрикционным анализом. Эту плазмиду обозначили как рSЕ 27. 51 рSЕ 118 (описана в разделе 7.1.9 выше) подвергали ферментативному гидролизу SphI и ВаmHI, гидролизат подвергали электрофорезу, и вставку SphI/SamHI длиной 2,8 т.п.о. очищали из геля. рSЕ 119 подвергали ферментативному гидролизу PstI и EcoRI, гидролизат подвергали электрофорезу, и вставку PstI/EcoRI длиной -1,5 т.п.о. очищали из геля. Челночный векторpWHM3 подвергали ферментативному гидролизу ВаmHI и EcoRI. рSЕ 27 подвергали ферментативному гидролизу PstI и SphI, гидролизат подвергали электрофорезу, и вставку PstI/SphI длиной 1,7 т.п.о. очищали из геля. Все четыре фрагмента (то есть 2,8 т.п.о., 1,5 т.п.о., 7,2 т.п.о., 1,7 т.п.о.) лигировали вместе при лигировании в 4-х направлениях. Этой лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli DH5, следуя инструкциям изготовителя. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом. Эту плазмиду обозначили как рSЕ 180 (фиг. 3; АТСС 209605). рSЕ 180 трансформировали S.lividans TK64 и идентифицировали трансформированные колонии по устойчивости к тиострептону и эритромицину. рSЕ 180 выделяли из S.lividans и использовали для трансформации протопластовS.avermitilis. Идентифицировали четыре устойчивых к тиострептону трансформантаS.avermitilis, и протопласты получали и высевали в неселективных условиях на среду RM14. После того, как эти протопласты регенерировали, единичные колонии подвергали скринингу на наличие устойчивости к эритромицину и отсутствие устойчивости к тиострептону, указывающие на хромосомную интеграцию инактивированного гена aveC и потерю свободного репликона. Идентифицировали один трансформант ЕrmrТhios и обозначили его как штамм SE 180-11. Из штамма SE180-11 выделяли суммарную хромосомную ДНК, подвергали гидролизу ферментами рестрикции SamHI, HindIII, PstI или SphI, разделяли с помощью электрофореза на 0,8% агарозном геле, переносили на найлоновые мембраны и гибридизовали с зондом еrmЕ. Эти анализы показали, что хромосомная интеграция гена устойчивости еrmЕ и сопутствующая делеция фрагмента PstI/SphI длиной 640 п.о. произошла вследствие двойного кроссоверного события. ВЭЖХ-анализ продуктов ферментации штамма SE180-11 показал, что нормальные авермектины больше не продуцировались (фиг. 5 А). При втором способе для инактивации генаaveC ген еrmЕ длиной 1,7 т.п.о. удаляли из хромосомы штамма SE180-11 S.avermitilis, оставляя 640 п.о. делецию PstI/SphI в гене aveC. Плазмиду замещения генов конструировали следующим образом: pSE180 подвергали частичному ферментативному гидролизу ХbаI, и фрагмент длиной 11,4 т.п.о. очищали из геля. В этой по 003905 52 лосе 11,4 т.п.о. отсутствует ген устойчивости еrmЕ длиной 1,7 т.п.о. Затем эту ДНК лигировали и трансформировали клетки E.coli DH5. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину,выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом. Этой плазмидой, которую обозначили как pSE184, трансформировали E.coliDM1 и выделяли плазмидную ДНК из трансформантов, устойчивых к ампициллину. Эту плазмиду использовали для трансформации протопластов штамма SE180-11 S.avermitilis. Протопласты получали из устойчивых к тиострептону трансформантов штамма SE180-11 и высевали единичными колониями на RM14. После того, как эти протопласты регенерировали, единичные колонии подвергали скринингу на отсутствие обеих устойчивостей, к эритромицину и к тиострептону, указывающее на хромосомную интеграцию инактивированного генаaveC и потерю свободного репликона, содержащего ген еrmЕ. Идентифицировали один трансформант ErmsThios и обозначили его как штамм SE184-1-13. Ферментационный анализSE184-1-13 показал, что нормальные авермектины не продуцировались и что SE184-1-13 имел такой же профиль ферментации, какSE180-11. При третьем способе для инактивации генаaveC в хромосомный ген aveC вводили сдвиг рамки считывания путем добавления двух G(гуанин) после С (цитозин) в положении нуклеотида 471, используя ПЦР, посредством чего создавали сайт BspE1. Наличие этого сконструированного генной инженерией сайта BspE1 было полезным при обнаружении события замещения гена. ПЦР-праймеры были сконструированы таким образом, чтобы ввести мутацию со сдвигом рамки в ген aveC, и предоставленыGenosys Biotechnologies, Inc. Правонаправленный праймер представлял собой 5'GGTTCCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ IDNO:8), а левонаправленный праймер представлял собой 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3'(SEQ ID NO:9). Условия ПЦР были такими, как описаны в разделе 7.1.10 выше. Продукт ПЦР 666 п.о. подвергали ферментативному гидролизу SphI с получением двух фрагментов 278 п.о. и 388 п.о. соответственно. Фрагмент длиной 388 п.о. очищали из геля. Плазмиду замещения генов конструировали следующим образом: челночный векторpWHM3 подвергали ферментативному гидролизу EcoRI и SamHI. pSE119 подвергали ферментативному гидролизу BamHI и SphI, гидролизат подвергали электрофорезу, и фрагмент длиной 840 п.о. очищали из геля. рSЕ 119 подвергали ферментативному гидролизу EcoRI и ХmnI,гидролизат разделяли электрофорезом, и фрагмент длиной 1,7 т.п.о. очищали из геля. Все четыре фрагмента (то есть 7,2 т.п.о., 840 п.о.,1,7 т.п.о. и 388 п.о.) лигировали вместе при 53 лигировании в 4-х направлениях. Этой лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli DH5. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием ДНК. Этой плазмидой, которую обозначили как рSЕ 185, трансформировали E.coli DM1 и выделяли плазмидную ДНК из трансформантов, устойчивых к ампициллину. Эту плазмиду использовали для трансформации протопластов штамма 1100-SC38 S.avermitilis. Выделяли устойчивые к тиострептону трансформанты штамма 1100-SC38 и анализировали с помощью ВЭЖХ-анализа продуктов ферментации. pSE185 при трансформации штамма 1100-SC38S.avermitilis значительно не изменяла соотношения авермектинов В 2:В 1 (табл. 2). рSЕ 185 использовали для трансформации протопластов S.avermitilis, чтобы создать мутацию со сдвигом рамки в хромосомном генеaveC. Протопласты получали из устойчивых к тиострептону трансформантов и высевали единичными колониями на RM14. После того, как эти протопласты регенерировали, единичные колонии подвергали скринингу на отсутствие устойчивости к тиострептону. Из чувствительных к тиострептону колоний выделяли хромосомную ДНК и подвергали скринингу с помощью ПЦР на наличие мутации со сдвигом рамки, интегрированную в хромосому. ПЦРпраймеры были сконструированы на основании нуклеотидной последовательности гена aveC и предоставлены Genosys Biotechnologies, Inc.GACTAC-3' (SEQ ID NO:10), а левонаправленный ПЦР-праймер представлял собой: 5'GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO:11),и условия ПЦР были такими, как описаны в разделе 7.1.10 выше. Полученный продукт ПЦР составлял 543 п.о., и при ферментативном гидролизе BspE1 наблюдали три фрагмента 368 п.о., 96 п.о. и 79 п.о., что указывало на хромосомную интеграцию инактивированного генаS.avermitilis, содержащих мутацию со сдвигом рамки в гене aveC, показал, что нормальные авермектины больше не продуцировались и что эти мутанты имели такой же ВЭЖХ-профиль ферментации, как SE180-11 и SE184-1-13. Идентифицировали один трансформант Thios и обозначили его как штамм SE185-5a. Кроме того, получили мутацию в генеS.avermitilis с этой мутацией не продуцирует нормальные авермектины и имеет такой жеaveC, которые заменяют как (1) G на А в положении нуклеотида 970, что заменяет аминокислоту в положении 275 с глицина (G) на аспартат(D), так и (2) Т (тимидин) на С в положении нуклеотида 996, что заменяет аминокислоту в положении 275 с тирозина (Y) на гистидин (Н). Штамм S.avermitilis с этими мутациями(G256D/Y275H) не продуцирует нормальные авермектины и имеет такой же профиль ферментации, как штаммы SE180-11, SE184-1-13 иSЕ 185-5 а. Штаммы S.avermitilis, мутантные по инактивации гена aveC, SE180-11, SE184-1-13,SE185-5a и другие предложенные здесь, обеспечивают инструменты скрининга для оценки воздействия других мутаций в гене aveC. pSE186,которая содержит копию гена aveC дикого типа,трансформировали E.coli DM1 и выделяли плазмидную ДНК из трансформантов, устойчивых к ампициллину. Эту ДНК pSE186 использовали для трансформации протопластов штаммаSE180-11 S.avermitilis. Выделяли трансформанты штамма SE180-11, устойчивые к тиострептону, определяли наличие устойчивости к эритромицину, и трансформанты ThiorErmr анализировали с помощью ВЭЖХ-анализа продуктов ферментации. Присутствие функционально активного гена aveC в транс-положении было способно восстановить нормальное продуцирование авермектинов у штамма SE180-11 (фиг. 5 Б). 8.2. Анализ мутаций в гене aveC,которые изменяют соотношения классов В 2:В 1 Как описано выше, штамм SE180-11S.avermitilis, содержащий неактивный ген aveC,комплементировали с помощью трансформации плазмидой, содержащей функционально активный ген aveC (pSE186). Штамм SE180-11 также использовали в качестве штамма-хозяина, чтобы охарактеризовать другие мутации в гене aveC,как описано ниже. Из штамма 1100-SC38 выделили хромосомную ДНК и использовали в качестве матрицы для ПЦР амплификации гена aveC. OPC длиной 1,2 т.п.о. выделяли с помощью ПЦРамплификации, используя праймеры, сконструированные на основании нуклеотидной последовательности aveC. Правонаправленный праймер представлял собой SEQ ID NО:6, a левонаправленный праймер представлял собойSEQ ID NО:7 (см. раздел 7.1.10 выше). ПЦР и условия субклонирования были такими, как описаны в разделе 7.1.10. Секвенирование ДНК ОРС длиной 1,2 т.п.о. показывает мутацию в гене aveC, которая заменяет С на Т в положении нуклеотида 337, которая заменяет аминокислоту в положении 55 с серина (S) на фенилаланин(F). Ген aveC, содержащий мутацию S55F, субклонировали в pWHM3 с получением плазмиды,которую обозначили как рSЕ 187 и которую ис 55 пользовали для трансформации протопластов штамма SE180-11 S.avermitilis. Выделяли устойчивые к тиострептону трансформанты штаммаSE180-11, определяли наличие устойчивости к эритромицину и трансформанты ThiorErmr анализировали с помощью ВЭЖХ-анализа продуктов ферментации. Присутствие гена aveC, кодирующего замену в аминокислотном остатке 55(S55F), было способно к восстановлению нормального продуцирования авермектинов в штамме SE180-11 (фиг. 5 В); однако, соотношение циклогексил-В 2:циклогексил-В 1 составляло примерно 26:1 по сравнению со штаммомSE180-11, трансформированным pSE186, который имел соотношение В 2:В 1 примерно 1,6:1(табл. 3), что указывало на то, что одиночная мутация (S55F) модулирует количество циклогексила-В 2, продуцируемого относительно циклогексила-В 1. Идентифицировали другую мутацию в гене aveC, которая заменяет G на А в положении нуклеотида 862, которая заменяет аминокислоту в положении 230 с глицина (G) на аспартат (D). Штамм S.avermitilis, имеющий эту мутацию(G230D), продуцирует авермектины в соотношении В 2:В 1 примерно 30:1. 8.3. Мутации, которые снижают соотношение В 2:В 1 Несколько мутаций, которые снижают количество циклогексила-В 2, продуцируемого относительно циклогексила-В 1, сконструировали следующим образом. Идентифицировали мутацию в гене aveC,которая заменяет G на А в положении нуклеотида 588, которая заменяет аминокислоту в положении 139 с аланина (А) на треонин (Т). ГенaveC, содержащий мутацию А 139 Т, субклонировали в pWHM3 с получением плазмиды, которую обозначили как рSЕ 188 и которую использовали для трансформации протопластов штамма SE180-11 S.avermitilis. Выделяли устойчивые к тиострептону трансформанты штаммаSE180-11, определяли наличие устойчивости к эритромицину, и трансформанты ThiorErmr анализировали с помощью ВЭЖХ-анализа продуктов ферментации. Присутствие мутированного гена aveC, кодирующего замену в аминокислотном остатке 139 (А 139 Т), было способно к восстановлению продуцирования авермектинов в штамме SE180-11 (фиг. 5 Г); однако, соотношение В 2:В 1 составляло примерно 0,94:1, указывая на то, что эта мутация снижает количество циклогексила-В 2, продуцируемого относительно циклогексила-В 1. Этот результат оказался неожиданным, поскольку опубликованные результаты, а также результаты о мутациях, описанных выше, продемонстрировали только либо инактивацию гена aveC, либо повышенное продуцирование авермектина формы В 2 относительно В 1 формы (табл. 3). Поскольку мутация А 139 Т изменяла соотношения В 2:В 1 в более благоприятном для В 1 56 направлении, сконструировали мутацию, которая кодирует треонин вместо серина в положении аминокислоты 138. Так, pSE186 подвергали ферментативному гидролизу EcoRI и клонировали в pGEM3Zf (Promega), который был гидролизован EcoRI. Эту плазмиду, которую обозначили как pSE186a, подвергали ферментативному гидролизу АраI и KрnI, фрагменты ДНК разделяли в агарозном геле, и два фрагмента 3,8 т.п.о. и 0,4 т.п.о. очищали из этого геля. Вставку ДНК длиной 1,2 т.п.о. из pSE186 использовали в качестве ПЦР-матрицы для введения одной замены основания в положение нуклеотида 585. ПЦР-праймеры были сконструированы таким образом, чтобы ввести мутацию в положение нуклеотида 585, и были предоставлены Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Правонаправленный праймер представлял собой 5'GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID NO:12); а левонаправленный праймер представлял собой 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ IDNO:13). Реакцию ПЦР проводили, используя набор для геномной ПЦР Advantage GC(Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) в буфере,поставляемом изготовителем, в присутствии 200 мкМ дНТФ, 200 пмоль каждого праймера, 50 нг матричной ДНК, 1,0 М GC-Melt и 1 ед. KlenTaq полимеразной смеси в конечном объеме 50 мкл. Температурный профиль первого цикла составлял 94 С в течение 1 мин с последующими 25 циклами 94 С в течение 30 с и 68 С в течение 2 мин, и 1 цикл при 68 С в течение 3 мин. Продукт ПЦР 295 п.о. подвергали ферментативному гидролизу АраI и KрnI с выделением фрагмента длиной 254 п.о., который разделяли электрофорезом и очищали из геля. Все три фрагмента(3,8 т.п.о., 0,4 т.п.о. и 254 п.о.) лигировали вместе при лигировании в 3-х направлениях. Этой лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli DH5. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом. Эту плазмиду обозначили как рSЕ 198.pSE198 подвергали ферментативному гидролизу EcoRI и клонировали в pWHM3, который был ферментативно гидролизован EcoRI, и трансформировали клетки E.coli DH5. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину,выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием ДНК. Этой плазмидной ДНК трансформировали клеткиE.coli DM1, из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом. Эту плазмиду, которую обозначили как рSЕ 199, использовали для трансформации протопластов штамма SE180-11S.avermitilis. Выделяли устойчивые к тиостреп 57 тону трансформанты штамма SE180-11, определяли наличие устойчивости к эритромицину, и трансформанты ThiorErmr анализировали с помощью ВЭЖХ-анализа продуктов ферментации. Присутствие мутированного гена aveC, кодирующего замену в аминокислотном остатке 138(S138T), было способно к восстановлению нормального продуцирования авермектинов в штамме SE180-11; однако, соотношение В 2:В 1 составляло 0,88:1, указывая на то, что эта мутация снижает количество циклогексила-В 2, продуцируемого относительно циклогексила-В 1(табл. 3). Это соотношение В 2:В 1 даже ниже,чем соотношение 0,94:1, наблюдаемое при мутации А 139 Т, продуцируемое с помощью трансформации штамма SE180-11 рSЕ 188, как описано выше. Другую мутацию сконструировали, чтобы ввести треонин в оба положения аминокислот 138 и 139. Вставку ДНК длиной 1,2 т.п.о. изpSE186 использовали в качестве ПЦР-матрицы. ПЦР-праймеры были сконструированы таким образом, чтобы ввести мутации в положения нуклеотидов 585 и 588, и были предоставленыGenosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Правонаправленный праймер представлял собой 5'GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3'(SEQ ID NO:14),а левонаправленный праймер представлял собой 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ IDNO:15). Реакцию ПЦР проводили, используя условия, описанные непосредственно выше в данном разделе. Продукт ПЦР 449 п.о. подвергали ферментативному гидролизу ApaI и KрnI с выделением фрагмента длиной 254 п.о., который разделяли электрофорезом и очищали из геля. PSE186a подвергали ферментативному гидролизу АраI и KрnI, фрагменты ДНК разделяли в агарозном геле, и два фрагмента 3,8 т.п.о. и 0,4 т.п.о. очищали из этого геля. Все три фрагмента (3,8 т.п.о., 0,4 т.п.о. и 254 п.о.) лигировали вместе при лигировании в 3-х направлениях, и этой лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli DH5. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину,выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом. Эту плазмиду обозначили как рSЕ 230. рSЕ 230 подвергали ферментативному гидролизу EcoRI, клонировали в pWHM3, который был ферментативно гидролизован EcoRI, и трансформировали клетки E.coli DH5. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину,выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием ДНК. Этой плазмидной ДНК трансформировали E.coliDM1, из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрик 003905 58 ционным анализом. Эту плазмиду, которую обозначили как рSЕ 231, использовали для трансформации протопластов штамма SE180-11S.avermitilis. Выделяли устойчивые к тиострептону трансформанты SE180-11, определяли наличие устойчивости к эритромицину, и трансформанты ThiorErmr анализировали с помощью ферментации. Присутствие дважды мутированного гена aveC, кодирующего S138T/A139T,было способно к восстановлению нормального продуцирования авермектинов в штамме SE18011; однако, соотношение В 2:В 1 составляло 0,84:1, указывая на то, что эта мутация еще больше снижает количество циклогексила-B2,продуцируемого относительно циклогексила-В 1(табл. 3), по сравнению со снижениями, полученными в результате трансформации штаммаSE180-11 рSЕ 188 или pSE199, как описано выше. Таблица 3 Число Среднее Штамм S.avermitilis Относи- Относипротестир. соотно(трансформирующая тельная тельная трансфоршение плазмида) конц. В 2 конц.В 1 мантов В 2:В 1 Эти результаты оказались первыми, продемонстрировавшими специфические мутации в гене aveC, которые приводят к продуцированию повышенных уровней более коммерчески желательных авермектинов класса 1 относительно авермектинов класса 2. 9. Пример: Конструирование 5' делеционных мутантов Как объяснено в разделе 5.1 выше, нуклеотидная последовательность Streptomyces avermitilis, показанная на фиг. 1 (SEQ ID NО:1), содержит четыре различных GTG кодона в положениях п.о. 42, 174, 177 и 180, которые являются потенциальными стартовыми сайтами. В этом разделе описано конструирование множественных делеций 5' участка OPC aveC (фиг. 1;SEQ ID NO:1), чтобы помочь определить, какие из этих кодонов могут функционировать в качестве стартовых сайтов в OPC aveC для экспрессии белка. Фрагменты гена aveC, различным образом делегированные на 5' конце, выделяли из хромосомной ДНК S.avermitilis с помощью ПЦРамплификации. ПЦР-праймеры были сконструированы на основании последовательности ДНК aveC и предоставлены Genosys Biotechnologies, Inc. Правонаправленные праймеры представляли собой 5'-AACCCATCCGAGCCG(SEQ ID NO:19) (9D2F2). Левонаправленные праймеры представляли собой 5'CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEQ ID NО:20); 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID(SEQ ID NО:22). Реакцию ПЦР проводили, как описано в разделе 8.3 выше. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле и обнаруживали отдельные полосы 1,0 т.п.о. и 1,1 т.п.о. Эти продукты ПЦР очищали из геля и лигировали с 25 нг линеаризованного вектора pCR2.1 (Invitrogen) в 1:10 молярном отношении вектор-вставка, следуя инструкциям изготовителя. Эти лигазные смеси использовали для трансформации компетентных клеток E.coli One Shot (Invitrogen),следуя инструкциям изготовителя. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК и наличие вставки подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием ДНК. Эти плазмиды обозначили как pSE190 (получена с праймером D1F1),pSE191 (получена с праймером D1F2), pSE192(получена с праймером D1F3) и pSE193 (получена с праймером D2F2). Каждую из ДНК вставок подвергали ферментативному гидролизу BamHI/XbaI, разделяли электрофорезом, очищали из геля и лигировали по отдельности с челночным векторомpWHM3, который был ферментативно гидролизован BamHI/XbaI, в суммарной концентрации ДНК 1 мкг в 1:5 молярном отношении векторвставка. Эти лигазные смеси использовали для трансформации компетентных клеток E.coliDH5. Из трансформантов, устойчивых к ампициллину, выделяли плазмидную ДНК, и наличие вставки подтверждали рестрикционным анализом. Этими плазмидами, которые обозначили как pSE194 (D1F1), р 8 Е 195 (D1F2), pSE196(D1F3) и pSE197 (D2F2), каждой по отдельности трансформировали штамм E.coli DM1, из трансформантов, устойчивых к ампициллину,выделяли плазмидную ДНК, и наличие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом. Эту ДНК использовали для трансформации протопластов штамма SE180-11S.avermitilis. Выделяли устойчивые к тиострептону трансформанты штамма SE180-11, определяли наличие устойчивости к эритромицину, и трансформанты ThiorErmr анализировали с помощью ВЭЖХ-анализа продуктов ферментации,чтобы определить, какие GTG сайты необходимы для экспрессии aveC. Результаты указывают на то, что GTG кодон в положении 42 можно удалить без воздействия на экспрессию aveC,тогда как каждая из pSE194, pSE195 и pSE196, в каждой из которых отсутствует GTG сайт в положении 42, но каждая из которых содержит все три GTG сайта в положениях 174, 177 и 180,была способна к восстановлению нормального продуцирования авермектинов при трансфор 003905 60 мации SE180-11. Нормальное продуцирование авермектинов не восстанавливалось, когда штамм SE180-11 трансформировали pSE197, в которой отсутствуют все четыре GTG сайта(табл. 4). Таблица 4 Число Среднее Штамм S.avermitilis Относи- Относипротестир. соотно(трансформирующая тельная тельная трансфоршение плазмида) конц. В 2 конц.В 1 мантов В 2:В 1 10. Пример: Клонирование гомологов aveC из S.hygroscopicus и S.griseochromogenes Настоящее изобретение дает возможность идентифицировать и клонировать гомологи геновS.hygroscopicus (FERM ВР-1901) гибридизовали с зондом aveC длиной 1,2 т.п.о. из S.avermitilis, описанным выше. Идентифицировали несколько космидных клонов, которые проявляли строгую гибридизацию. Из этих космид выделяли хромосомную ДНК и идентифицировали фрагмент KрnI длиной 4,9 т.п.о., который гибридизовался с зондом aveC. Эту ДНК секвенировали и идентифицировали OPC (SEQ ID NO:3), имеющую значительную гомологию с OPC aveC S.avermitilis. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4),выведенная изS.hygroscopicus, представлена на фиг. 6. Кроме того, космидную библиотеку геномной ДНК S.griseochromogenes гибридизовали с зондом aveC длиной 1,2 т.п.о. изS.avermitilis, описанным выше. Идентифицировали несколько космидных клонов, которые проявляли строгую гибридизацию. Из этих космид выделяли хромосомную ДНК и идентифицировали фрагмент PstI длиной 5,4 т.п.о., который гибридизовался с зондом aveC. Эту ДНК секвенировали и идентифицировали частичнуюOPC гомолога aveC, имеющую значительную гомологию с OPC aveC S.avermitilis. Выведенная частичная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:5) представлена на фиг. 6. Анализ последовательности ДНК и аминокислотной последовательности гомологов aveC из S.hygroscopicus и S.griseochromogenes указывает на то, что эти участки разделяют значительную гомологию (50% идентичности последовательности на аминокислотном уровне) как друг с другом, так и с ОРС aveC S.avermitilis и продуктом гена AveC (фиг. 6).