Продолжительно действующие инсулинотропные пептиды

1 Данное изобретение относится к модифицированным инсулинотропным пептидам. В частности, данное изобретение относится к модифицированным глюкагоноподобным пептидам и эксендиновым пептидам пролонгированного действия для лечения диабета и других заболеваний, опосредуемых инсулинотропными пептидами, желудочно-кишечной функции и активности, опосредуемой уровнем глюкагона. Предпосылки создания изобретения Глюкагоноподобный пептид инсулинотропного пептидного гормона (GLP-1) был привлечен в качестве возможного терапевтического агента для лечения инсулин-независимого сахарного диабета II типа, а также родственных нарушений обмена веществ, таких как ожирение. Другие пригодные инсулинотропные пептиды включают эксендин 3 и эксендин 4. Применение GLP-1, эксендина 3 и эксендина 4 страдает недостатком - ограниченной продолжительностью действия, связанной с коротким полупериодом существования в плазме in vivo,главным образом, вследствие быстрым клиренсом и протеолитическим расщеплением. Фермент, ответственный за расщепление GLP-1,дипептидилпептидаза IV, был идентифицирован. Интенсивные усилия были предприняты для того, чтобы ингибировать пептидазу или модифицировать GLP-1 таким образом, чтобы замедлить его расщепление при сохранении биологической активности. Несмотря на эти усиленные попытки, продолжительно действующий активный GLP-1 не был получен. Именно поэтому больным диабетом настоятельно требуются усовершенствованные пептиды GLP-1, эксендин 3 и эксендин 4. Следовательно, необходимо модифицировать GLP-1, эксендин 3 и эксендин 4 и другие инсулинотропные пептиды для достижения более пролонгированного действия in vivo при сохранении их низкой токсичности и терапевтической пользы. Сущность изобретения Для того, чтобы удовлетворять этим потребностям, в данном изобретении обращено внимание на модифицированные инсулинотропные пептиды (ITP). Данное изобретение относится к новым химически реакционноспособным производным инсулинотропных пептидов, которые могут реагировать с соответствующими функциональными группами на клеточных носителях, включая подвижные белки крови, образуя ковалентные связи. Конкретно, изобретение относится к новым химически реакционноспособным производным инсулинотропных пептидов, таким как глюкагоноподобный пептид (GLP), эксендин 3 и эксендин 4, которые могут реагировать с соответствующими функциональными группами в подвижных белках крови, образуя ковалентные связи. Изобретение также относится к новым химически реакционноспособным производным или аналогам инсулинотропных пептидов, которые могут реа 003922 2 гировать с соответствующими функциональными группами белков подвижной крови, образуя ковалентные связи. Настоящее изобретение относится к модифицированным инсулинотропным пептидам,содержащим реакционноспособную группу,которая реагирует с аминогруппами, гидроксильными группами или тиольными группами соединений крови, образуя устойчивые ковалентные связи. Настоящее изобретение относится к инсулинотропному гормону, содержащему модифицированный фрагмент GLP-1 и его производные, в частности GLP-1(7-36)амид. Кроме того,изобретение относится к терапевтическому применению таких соединений и, в частности, к применению модифицированного GLP-1(7-36)амида для лечения сахарного диабета зрелого возраста (диабета II типа). Помимо этого, изобретение относится к модифицированным фрагментам эксендину 3 и эксендину 4 и терапевтическому применению таких соединений. В частности, данное изобретение относится к GLP-1(1-36)-Lys37(-MPA)-NH2; GLP-1(136)-Lys37(-AAEA-AEEA-MPA)-NH2; GLP-1(7GLP-1(7-36)-Lys37(36)-Lys37(-MPA)-NH2;NH2; GLP-1(7-36)-EDA-MPA и эксендину-4(139)-EDA-MPA. Кроме того, данное изобретение относится к композициям, содержащим производные инсулинотропных пептидов, и к применению композиций для лечения диабета у человека. Далее, изобретение относится к способу усиления экспрессии инсулина, который заключается в обеспечении панкреатической островковой клетки вида бета млекопитающих эффективным количеством вышеописанных модифицированных инсулинотропных пептидов. Кроме того, изобретение относится к способу лечения диабета зрелого возраста, который заключается во введении нуждающемуся в таком лечении больному эффективного количества обсуждаемых выше инсулинотропных пептидов. Далее, изобретение относится к терапии других опосредуемых инсулинотропными пептидами заболеваний и состояний модифицированными инсулинотропными пептидами по изобретению. Подробное описание изобретения Определения Чтобы гарантировать полное понимание изобретения, включены следующие определения. 3 Инсулинотропные пептиды. Инсулинотропные пептиды (ITP) представляют собой пептиды с инсулинотропной активностью. Инсулинотропные пептиды стимулируют или вызывают стимуляцию, синтез или экспрессию гормона инсулина. Такие пептиды включают предшественники, аналоги,фрагменты пептидов, таких как глюкагоноподобный пептид, эксендин 3 и эксендин 4 и других пептидов с инсулинотропной активностью. Глюкагоноподобный пептид. Глюкагоноподобный пептид (GLP) и производные GLP являются кишечными гормонами, которые как правило стимулируют секрецию инсулина при гипергликемии, подавляют секрецию глюкагона, стимулируют биосинтез(про)инсулина, замедляют опорожнение желудка и секрецию кислоты. Некоторые GLP и GLPпроизводные промотируют поглощение глюкозы в клетках, но не стимулируют экспрессию инсулина, как описано в патенте США 5 574 008, который вводится в данное описание в качестве ссылки. Пептиды эксендин 3 и эксендин 4 Эксендин 3 и эксендин 4 и производные пептидов являются пептидами протяжeнностью 39 аминокислотных остатков, которые примерно на 53% гомологичны GLP-1 и имеют инсулинотропную активность. Реакционноспособные группы Реакционноспособные группы представляют собой химические группы, способные образовывать ковалентную связь. Реакционноспособные группы как правило стабильны в водной среде и обычно представляют собой карбокси-, фосфорилили подходящую ацильную группу либо в виде сложного эфира, либо в виде смешанного ангидрида, либо имидата, следовательно, способную образовывать ковалентную связь с функциональными группами, такими как аминогруппа, гидрокси- или тиол в сайте-мишени (в целевом сайте) подвижных (мобильных) компонентов крови. По большей части сложные эфиры содержат фенольные соединения или являются тиоэфирами, алкиловыми эфирами, фосфатами и т.п. Реакционноспособные группы включают сукцинимидил- и малеилимидогруппы. Функциональные группы Функциональными группами являются группы в компонентах крови, с которыми реагируют реакционноспособные группы модифицированных инсулинотропных пептидов, образуя ковалентные связи. Функциональные группы включают гидроксильные группы для связывания с реакционноспособными сложноэфирными фрагментами; тиольные группы для связывания с малеинимидами и малеимидными группами, имидатами и тиоэфирными группами; аминогруппы для связывания с карбокси-,фосфорил- или ацильными группами реакционноспособных частиц и карбоксильные группы 4 для связывания с аминогруппами. Такие компоненты крови включают белки крови. Связывающие группы Связывающие группы представляют собой химические фрагменты, которые связывают или соединяют реакционноспособные группы с ITP. Связывающие группы могут содержать одну или более алкильных групп, таких как метил,этил, пропил, бутил и т.п. группы, алкокси группы, алкенильные группы, алкинильные группы или замещенную аминогруппу с заместителями - алкильными группами, циклоалкильными группами, полициклическими группами, арильными группами, полиарильными группами, замещенными арильными группами,гетероциклическими группами и замещенными гетероциклическими группами. Связывающими группами могут также полиэтоксиаминокислоты, такие как АЕА 2-амино)этоксиуксусная кислота) или предпочтительная связывающая группа АЕЕА([2-(2-амино)этокси)]этоксиуксусная кислота). Компоненты крови Компоненты крови могут быть либо фиксированными, либо подвижными (мобильными). Фиксированные компоненты крови представляют собой неподвижные (немобильные) компоненты крови и включают ткани, мембранные рецепторы, интерстициальные белки, белки фибрина, коллагены, тромбоциты, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки и ассоциированные с ними мембрана и мембранные рецепторы, соматические клетки, скелетные и гладкомышечные клетки, нейронные компоненты,остеоциты и остеокласты и все ткани организма,в частности, ассоциированные с кровеносной и лимфатической системой. Мобильные (подвижные) компоненты крови представляют собой компоненты крови, которые не имеют фиксированного положения в течение какого-либо длительного периода времени, превышающего 5 мин (как правило), и более часто - превышающего 1 мин. Эти компоненты крови не являются мембраносвязанными и присутствуют в крови продолжительные периоды времени и в минимальной концентрации, по меньшей мере, 0,1 мкг/мл. Подвижные компоненты крови включают сывороточный альбумин, трансферрин,ферритин и иммуноглобулины, такие как IgM иIgG. Полупериод существования подвижных компонентов крови составляет, по меньшей мере, около 12 ч. Защитные группы Защитные группы представляют собой химические остатки (фрагменты), используемые для защиты производных пептидов от внутримолекулярных реакций (с самими собой). Различные защитные группы включены в данное описание и описаны патенте США 5 493 007,который вводится в данное описание в качестве ссылки. Такие защитные группы включают ацетил,флоренилметоксикарбонил(FMOC), 5 трет.бутилоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (CBZ) и т.п. Конкретные защищаемые аминокислоты представлены в табл. 1. Таблица 1 Природные аминокислоты и их аббревиатуры 3-буквенная 1-буквенная Защищаемые аббревиатура аббревиатура аминокислоты Аланин Аlа А Реакционные (чувствительные) функциональные группы Реакционная (чувствительная) группа представляет собой реакционный центр на ITPпептиде. Реакционная (чувствительная) функциональная группа, если таковая присутствует,может выбираться как место присоединения с целью модификации реакционноспособной в отношении линкера группы. Чувствительные(реакционные) функциональные группы включают, не ограничиваясь этим, карбоксильную,амино-, тиольную и гидроксильную группы. Модифицированные пептиды Модифицированный ITP представляет собой пептид, модифицированный путeм присоединения реакционноспособной группы, и способный образовывать стабилизированный в отношении пептидазы пептид путeм конъюгации с компонентами крови. Реакционная группа может связываться с терапевтическим пептидом через связывающую группу или, при необходимости, без использования связывающей группы. Рассматривается вариант, когда одна или более дополнительных аминокислот может вводиться в терапевтический пептид для большей лeгкости присоединения реакционноспособной группы. Модифицированные пептиды можно вводить invivo, так что конъюгация с компонентами крови происходит in vivo, или же их сначала можно конъюгировать с компонентами крови in vivo, а полученный стабилизированный в отношении пептидазы пептид (определяемый ниже) вводить in vivo. Термины модифицированный терапевтический пептид и модифицированный пептид могут в данной заявке заменять друг друга (являются взаимозаменяемыми). 6 Стабилизированный в отношении действия пептидазы ITP Стабилизированный в отношении действия пептидазы ITP представляет собой модифицированный пептид, конъюгированный с компонентом крови с помощью ковалентной связи,образованной между реакционноспособной группой модифицированного пептида и функциональными группами компонента крови, с участием или без участия связывающей группы. Стабилизированный в отношении действия пептидазы пептид является более устойчивым при действии пептидаз in vivo, чем нестабилизированный пептид. Стабилизированный в отношении действия пептидазы терапевтический пептид обычно имеет полупериод существования,по меньшей мере, на 10-50% более длительный,чем нестабилизированный пептид с идентичной последовательностью. Устойчивость к действию пептидазы определяется путм сравнения полупериода существования нестабилизированногоITP в сыворотке или в крови с полупериодом существования модифицированного аналога терапевтического пептида в сыворотке или в крови. Полупериод существования определяют взятием образцов сыворотки или крови после введения модифицированного и немодифицированного пептидов и определением активности пептида. Помимо определения активности проводят определение протяжнности (длины) ITP с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Подробное описание изобретения Пользуясь этими определениями, можно сказать, что фокусом данного изобретения является модификация инсулинотропных пептидов с целью повышения биодоступности, увеличения полупериода существования и распространения за счeт селективной конъюгации с белком-носителем, но без модификации их удивительных терапевтических свойств. Носителем, выбранным (без ограничения) по этому изобретению, является альбумин, конъюгированный да счeт своей свободной тиольной группы с инсулинотропным пептидом, дериватизированным с помощью малеинимидного фрагмента. 1. Инсулинотропные пептидыA. GLP-1 и его производные Известно, что гормон глюкагон синтезируется в виде высокомолекулярной молекулы предшественника, которая затем протеолитически расщепляется на три пептида: глюкагон,глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) и глюкагоноподобный пептид 2 (GLP-2). GLP-1 содержит 37 аминокислот в своей непроцессированной форме, как показано в SEQ ID NO:1. Непроцессированный пептид GLP-1, однако, легко превращается в пептид протяжeнностью в 31 аминокислоту (7-37 пептид), содержащий аминокислоты 7-37 GLP-1 (GLP-1(7-37 SEQ IDNO:2. GLP-1(7-37) может также претерпевать дополнительное процессирование за счeт проте 7 олитического отщепления С-концевого глицина с образованием GLP-1(7-36), который также существует преимущественно в виде GLP-1(736)амид, в котором С-концевой остаток, аргинин, имеет алмидированную форму, то есть представляет собой аргининамид. Это процессирование происходит в кишечнике и, в меньшей степени, в поджелудочной железе, и дает полипептид с инсулинотропной активностью пептида GLP-1(7-37). О соединении говорят, что оно имеет инсулинотропную активность, в том случае, если оно способно стимулировать или быть причиной стимуляции синтеза или экспрессии гормона инсулина. Гормональная активность GLP1(7-37) и GLP-1(7-36), вероятно, является специфичной к панкреатическим бета клеткам, где он, по-видимому, индуцирует биосинтез инсулина. Глюкагоноподобный пептидный гормон по изобретению применим при изучении патогенеза сахарного диабета зрелого возраста, состояния, характеризуемого гипергликемией, при которой динамика секреции инсулина аномальна. Кроме того, глюкагоноподобный пептид применим при терапии и лечении этого заболевания, при терапии и лечении гипергликемии. Пептидные остатки (фрагменты), выбранные из определнной аминокислотной последовательности человеческого GLP-1, составляют исходный пункт разработки, развития данного изобретения. Предполагается, что взаимозаменяемые термины пептидный фрагмент или пептидный остаток охватывают как синтетические, так и природные аминокислотные последовательности, полученные из природной аминокислотной последовательности. Об аминокислотной последовательности GLP-1 сообщали несколько исследований (Lopez, L.C., et(1983); Heinrich, G., et al., Endocrinol. 115:21762181 (1985. Строение мРНК препроглюкагона и соответствующая аминокислотная последовательность хорошо известны. Было охарактеризовано протеолитическое процессирование генного продукта-предшественника, проглюкагона,в глюкагон и два инсулинотропных пептида. Употребляемое в данном описании обозначениеGLP-1(1-37) относится к GLP-1-полипептиду,содержащему все аминокислоты от 1 (N-конец) по 37 (С-конец). Аналогично, GLP-1(7-37) относится к GLP-1-полипептиду, содержащему все аминокислоты от 7 (N-конец) по 37 (С-конец). Сходным образом GLP-1(7-36) относится к полипептиду GLP-1, содержащему все аминокислоты от 7 (N-конец) по 36 (С-конец). В одном варианте изобретения GLP-1(736) и его пептидные фрагменты синтезируют обычными методами, как подробно описано ниже,такими как хорошо известный твeрдофазный синтез, описанный Merrifield,J.M. (Chem. Soc. 85:2149 (1962 и Stewart andYoung (Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman,San Francisco, 1969), стр.27-66), которые вводятся в данное описание в качестве ссылок. Однако возможно также получать фрагменты полипептида проглюкагона, или GLP-1, фрагментацией природной аминокислотной последовательности, используя, например, протеолитический фермент. Кроме того, можно получать заданные фрагменты пептида проглюкагона, или GLP-1,используя технику рекомбинантной ДНК, как описано в Maniatis, Т., et al., Molecular Biology:York (1982), вводимом в данное описание в качестве ссылки. Данное изобретение включает пептиды,получаемые из GLP-1, такие как GLP-1(1-37) иGLP-1(7-36). О пептиде говорят, что это пептид,получаемый из природной аминокислотной последовательности, если его можно получать фрагментацией природной последовательности,или если его можно синтезировать, опираясь на знание последовательности природной аминокислотной последовательности или генетического материала (ДНК или РНК), который кодирует эту последовательность. В объeм данного изобретения входят такие молекулы, которые, как указано, являются дериватами GLP-1, как GLP-1(1-37) и особенноGLP-1(7-36). Такой дериват имеет следующие характеристики: (1) он в значительной степени гомологичен GLP-1 или аналогичному по размеру фрагменту GLP-1; (2) он способен функционировать, как инсулинотропный гормон и(3) при применении, по меньшей мере, одного из приведeнных в данном описании анализов,дериват проявляет либо (i) инсулинотропную активность, которая превышает инсулинотропную активность любого GLP-1, либо, что более предпочтительно, (ii) инсулинотропную активность, которую можно обнаружить даже в том случае, когда концентрация деривата составляет 10-10 М, или, наиболее предпочтительно, (hi) инсулинотропную активность, которую можно обнаружить даже в том случае, когда концентрация деривата составляет 10-11 М. О деривате GLP-1 говорят, что он практически гомологичен GLP-1, если аминокислотные последовательности деривата, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, и наиболее более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, являются такими же, как аминокислотные последовательности GLP-1(1-37). Дериваты (производные) по данному изобретению включают фрагменты GLP-1, которые, помимо того, что содержат последовательность, практически гомологичную последовательности природного пептида GLP-1, могут содержать одну или более дополнительных аминокислот по амино и/или карбоксильному концу. Таким образом, изобретение относится к полипептидным фрагментам GLP-1, которые 9 могут содержать одну или более аминокислот,которые могут отсутствовать в природной последовательности GLP-1, при условии, что такие полипептиды обладают инсулинотропной активностью, превышающей активность GLP-1. Дополнительные аминокислоты могут быть Dаминокислотами или L-аминокислотами или их комбинацией. Изобретение также включает фрагментыGLP-1, которые, хотя имеют последовательность,практически гомологичную последовательности природного GLP-1-пептида, но в них отсутствуют одна или более дополнительных аминокислот по амино- и/или карбоксиконцу, которые обнаружены в природном GLP-1-пептиде. Таким образом,изобретение относится к полипептидным фрагментам GLP-1, в которых может отсутствовать одна или более аминокислот, которые обычно присутствуют в последовательности природногоGLP-1, при условии, что такие полипептиды имеют инсулинотропную активность, превышающую активность GLP-1. Изобретение также охватывает очевидные или тривиальные варианты вышеописанных фрагментов, которые имеют незначительные аминокислотные замены (и, следовательно,имеют аминокислотные последовательности,которые отличаются от аминокислотной последовательности природной последовательности),при условии, что такие варианты обладают инсулинотропной активностью, практически идентичной активности вышеописанных GLP-1 дериватов. Примеры очевидных и тривиальных замен включают замену одного основного остатка на другой (т.е. Arg на Lys), замену одного гидрофобного остатка на другой (т.е. Leu на Ilе),или замену одного ароматического остатка на другой (т.е. Phe на Туr) и т.д. Помимо дериватов GLP-1 с инсулинотропной активностью в объeм данного изобретения входят дериваты GLP-1, которые стимулируют поглощение глюкозы клетками, но не стимулируют экспрессию или секрецию инсулина. Такие дериваты GLP-1 описаны в патенте США 5 574 008.GLP-1-дериваты, которые стимулируют поглощение глюкозы клетками, но не стимулируют экспрессию или секрецию инсулина, которые находят применение по изобретению,включают: R1-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa-Gly-ArgR2(SEQ ID NO:3), где R1 выбирают из a) H2N; b)NH2, ОН, Gly-NH2 или Gly-OH. Эти пептиды представляют собой С-терминальные GLP-1 фрагменты, которые не обладают инсулинотропной активностью, но которые, тем не менее,применимы для лечения диабета и гипергликемических состояний, как описано в патенте США 5 574 008. В. Пептиды эксендин-3 и эксендин-4 Эксендин 3 и эксендин 4 представляют собой пептиды из 39 аминокислот (отличающиеся остатками 2 и 3) которые, примерно, на 53% гомологичны GLP-1 и находят применение в качестве инсулинотропных агентов. Последовательность эксендина-3 [SEQ ID NO:11] сутьMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS. Изобретение также охватывает инсулинотропные фрагменты эксендина-4, содержащие аминокислотные последовательности: эксендин 4(1-31) [SEQ ID NO:13] HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY. Изобретение также охватывает ингибирующий фрагмент эксендина-4, содержащий аминокислотную последовательность: эксендин-4(9-39)ID NO:16-22. Данное изобретение включает пептиды,образуемые из природных пептидов эксендина 3 и эксендина 4. О пептиде говорят, что он образуем из природной аминокислотной последовательности, если его можно получить фрагментацией природной последовательности, или если его можно синтезировать, исходя из знаний о последовательности природной аминокислотной последовательности или о генетическом материале (ДНК или РНК), который кодирует эту последовательность. В объeм данного изобретения включены те молекулы, которые, как указано, являются дериватами (производными) эксендина 3 и эксендина 4. Такой дериват имеет следующие признаки: (1) он практически гомологичен эксендину 3 или эксендину 4 или аналогичному по величине фрагменту эксендина 3 или эксендина 4; (2) он способен функционировать как инсулинотропный гормон и (3) при применении, по меньшей мере, одного из анализов, данных в настоящем описании, дериват проявляет или (i) инсулинотропную активность, которая превышает инсулинотропную активность либо эксендина 3, либо эксендина 4, или, более предпочтительно, (ii) инсулинотропную активность, которую можно обнаружить даже при концентрации деривата 10-10 М, или наиболее предпочтительно, (iii) инсулинотропную активность, которую 11 можно обнаружить даже при концентрации деривата 10-11 М. Говорят, что дериват эксендина 3 и эксендина 4 практически гомологичен эксендину 3 и эксендину 4, если аминокислотные последовательности деривата по меньшей мере на 80%,более предпочтительно по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95%, такие же, как аминокислотные последовательности либо эксендина 3 или 4,либо фрагмента эксендина 3 или 4, имеющего такое же число аминокислотных остатков, что и дериват. Дериваты по данному изобретению включают фрагменты эксендина 3 или эксендина 4,которые, помимо того, что содержат последовательность, практически гомологичную последовательности природного пептида эксендина 3 или эксендина 4, могут содержать одну или более дополнительных аминокислот по аминои/или карбокси-концу. Таким образом, изобретение относится к полипептидным фрагментам эксендина 3 и эксендина 4, которые могут содержать одну или более аминокислот, которые могут отсутствовать в природных последовательностях эксендина 3 или эксендина 4, при условии, что такие полипептиды обладают инсулинотропной активностью, которая превышает активность эксендина 3 или эксендина 4. Аналогично изобретение включает фрагменты эксендина 3 или эксендина 4, которые, хотя содержат последовательность, практически гомологичную последовательности природного пептида эксендина 3 или эксендина 4, могут не содержать одну или более дополнительных аминокислот по амино- и/или карбокси-концу, которые имеются в природных пептидах эксендина 3 или эксендина 4. Таким образом, изобретение относится к полипептидным фрагментам эксендина 3 и эксендина 4, в которых может отсутствовать одна или более аминокислот, которые обычно присутствуют в природной последовательности эксендина 3 или эксендина 4, при условии, что такие полипептиды обладают инсулинотропной активностью, превышающей активность эксендина 3 или эксендина 4. Изобретение также охватывает очевидные или тривиальные варианты вышеописанных фрагментов, которые содержат незначительные аминокислотные замены (и, следовательно,имеют аминокислотные последовательности,которые отличаются от аминокислотной последовательности природной последовательности),при условии, что такие варианты имеют инсулинотропную активность, практически идентичную активности вышеописанных дериватов эксендина 3 или эксендина 4. Примеры очевидных или тривиальных замен включают замену одного основного остатка на другой (т.е. Arg наLys), замену одного гидрофобного остатка на другой (т.е. Leu на Ilе) или замену одного ароматического остатка на другой (т.е. Phe на Туr) и т.д. 12 2. Модифицированные инсулинотропные пептиды Это изобретение относится к модифицированным инсулинотропным пептидам и их дериватам. Модифицированные инсулинотропные пептиды по изобретению включают реакционноспособные группы, которые могут реагировать с соответствующими реакционноспособными функциональными группами компонентов крови с образованием ковалентных связей. Изобретение также относится к таким модификациям, таким комбинациям с компонентами крови и методам их использования. Эти методы включают увеличение эффективного терапевтического полупериода существования in vivo модифицированных инсулинотропных пептидов. Для образования ковалентных связей с функциональной группой в белке можно использовать в качестве химически реакционноспособной группы (реакционноспособной частицы) большой ряд активных карбоксильных групп, в первую очередь сложных эфиров, где гидроксильный остаток является физиологически приемлемым на уровнях, требующихся для модификации инсулинотропных пептидов. Хотя в этих связывающих агентах можно применять ряд различных гидроксильных групп, наиболее предпочтительными являются N-гидроксисукцинимид (NHS), N-гидроксисульфосукцинимид (сульфо-NHS), малеинимидбензоилсукцинимид (MBS), эфир гамма-малеинимидобутирилоксисукцинимида (GMBS) и малеинимидопропионовая кислота (МРА). Первичные амины являются основными мишенями для NHS-эфиров, как схематически показано ниже. Доступные -аминогруппы,имеющиеся на N-конце, реагируют с NHSсложными эфирами. Однако -аминогруппы белка могут быть нежелательны или недоступны для NHS-связывания. Хотя пять аминокислот содержат атом азота в боковой цепи, только-амин лизина в заметной степени реагирует сNHS-эфир по реакции конденсации реагирует с первичными аминами,выделяяNгидроксисукцинимид, как ниже показано схематически. Эти содержащие сукцинимид реакционноспособные группы называются в данном описании сукцинимидильными группами. В предпочтительных вариантах данного изобретения функциональной группой белка является тиольная группа, а химически реакционноспособной группой является малеинимидосодержащая группа, такая как GMBA или МРА.GMBA обозначает гамма-малеинимидобути 13 риламид. Такие малеинимидосодержащие группы называются в данном описании малеидогруппами. Малеинимидогруппа является наиболее селективной для сульфгидрильных групп пептидов, когда рН реакционной смеси равно 6,57,4. При рН 7,0 скорость реакции малеинимидогрупп с сульфгидрилами в 1000 раз быстрее,чем с аминами. Между малеинимидогруппой и сульфгидрилом образуется стойкая тиоэфирная связь, которую нельзя расщепить в физиологических условиях. Инсулинотропные реакции и дериваты пептидов по изобретению можно модифицировать специфичным и неспецифичным мечением компонентов крови. А. Специфичное мечение. Предпочтительно, когда модифицированные инсулинотропные пептиды (ITP) по данному изобретению создают таким образом, чтобы они реагировали с тиольными группами подвижных белков крови. Такая реакция предпочтительно идет за счет ковалентного связывания терапевтического пептида, модифицированного за счет малеинимидной связи (например, образованной с участием GMBS, МРА или других малеинимидов) с тиольной группой подвижного(мобильного) белка крови, такого как сывороточный альбумин или IgG. В определнных обстоятельствах специфичное мечение малеинимидами имеет несколько преимуществ перед неспецифическим связыванием мобильных белков с группами,такими как NHS и сульфо-NHS. Тиольные группы менее распространены in vivo, чем аминогруппы. Следовательно, малеинимидные дериваты по данному изобретению ковалентно свяжутся с меньшим количеством белков. Например, в альбумине (наиболее распространенном белке крови) только одна тиольная группа. Следовательно,в конъюгатахIP к альбумину составляет примерно 1:1. Помимо альбумина молекулы IgG (класса II) также содержат свободные тиольные группы. Так как молекулы IgG и сывороточный альбумин составляют основную часть растворимого белка в крови, они также дают основную часть свободных тиольных групп в крови, которые способны ковалентно связываться с модифицированными малеинимидами ITP. 14 Кроме того, даже среди белков крови, содержащих свободные тиольные группы, специфичные мечение малеинимидами приводит к предпочтительному образованию конъюгатовITP-малеинимидальбумин вследствие уникальных особенностей самого альбумина. Единственная свободная тиольная группа альбумина,высококонсервативного в виде, локализована в аминокислотном остатке 34(Cys34). Недавно было показано, что Cys34 альбумина имеет повышенную реакционную способность по сравнению со свободными тиольными группами других белков, содержащих свободные тиольные группы. Это вызвано частично очень низким значением рК 5,5 Cys34 альбумина. Это значительно ниже типичных значений рК для цистеиновых остатков в целом, где оно обычно составляет около 8. Вследствие такого низкого значения рK в нормальных физиологических условиях Cys34 альбумина преимущественно находится в ионизированной форме, что резко повышает его реакционную способность. Помимо низкого значения рК Cys34 другим фактором, который повышает реакционную способность Cys34, является его местоположение в расселине близко к поверхности одной петли области V альбумина. Такая локализация делаетCys34 его очень доступным для различных лигандов (всех видов) и является важным фактором для биологической роли Cys34 в качестве ловушки свободных радикалов и утилизатора со свободным тиолом. Эти свойства делаютCys34 очень реакционноспособным по отношению к ITP-малеинимидам, и скорость реакции может быть увеличена в 1000 раз по сравнению со скоростью реакций ITР-малеинимидов с другими содержащими свободные тиольные группы белками. Другим преимуществом конъюгатов ITPмалеинимидальбумин является воспроизводимость, обусловленная лодингом 1:1 пептида к альбумину, конкретно к Cys34. Другие методики, такие как методики с глутаральдегидом, ДСС, ЕДС и другие способы химической активации, например, свободных аминов, лишены такой селективности. Например, альбумин содержит 52 остатка лизина, 25-30 из которых расположены на поверхности альбумина и доступны для конъюгации. Активация этих остатков лизина, или же модификация пептидов с целью связывания с участием этих лизиновых остатков приводит к гетерогенной популяции конъюгатов. Даже если используются молярные соотношения 1:1 пептида к альбумину, в результате получают множество продуктов конъюгации, причeм некоторые содержат 0, 1, 2 или более пептидов на альбумин, и каждый содержит пептиды, произвольно связанные по любому из 25-30 доступных сайтов лизина. Так как возможны различные комбинации, то трудно охарактеризовать точно состав и свойства каждой партии, и едва ли возможна воспроизводимость от партии к партии, что делает такие конъюгаты ме 15 нее желательными в качестве терапевтических. Кроме того, хотя может показаться, что конъюгация за счeт лизиновых остатков альбумина, по меньшей мере, имеет то преимущество, что доставляется больше терапевтического агента на молекулу альбумина, но исследования показали, что предпочтительным соотношением терапевтического агента к альбумину является соотношение 1:1. В статье Stehle et al., The Loading Rate Determines Tumor Targeting Properties of MethotrexateAlbumin Conjugates in Rats (Скорость лодинга определяет противоопухолевые свойства конъюгатов метотрексат-альбумин) Anti-Cancer Drugs,Vol.8, pp 677-685 (1997), вводимой в данное описание в качестве ссылки, авторы сообщают, что соотношение 1:1 противоракового агента метотрексата к альбумину, конъюгированному с помощью глутаральдегида, дает наиболее обнадеживающие результаты. Эти конъюгаты поглощались опухолевыми клетками, тогда как конъюгаты с соотношением молекул метотрексата 5:1-20:1 изменяли ВЭЖХ-хроматограмму и быстро поглощались печенью in vivo. Было установлено, что при этих более высоких соотношениях конформационные изменения в альбумине снижают его эффективность в качестве терапевтического носителя. Контролируя введение конъюгата малеинимид-ITP in vivo, можно контролировать специфичное мечение альбумина и IgG in vivo. При типичном введении 80-90% вводимого малеинимида - ITP метит альбумин и менее 5% метит IgG. Также происходит мечение свободных тиольных групп такой меткой, как глутатион. Такое специфичное мечение предпочтительно для применения in vivo, так как оно позволяет точно рассчитывать оцениваемый полупериод существования вводимого агента. Помимо обеспечения контролируемого специфичного in vivo мечения, малеинимид-IТР могут обеспечить специфичное мечение сывороточного альбумина и IgG ex vivo. Такое ехvivo мечение включает введение малеинимидаITP в кровь, сыворотку или физиологический раствор, содержащий альбумин и/или IgG. Будучи модифицированным ех vivo конъюгатами малеинимид-IТР кровь, сыворотка или физиологический раствор могут снова вводиться в кровь для обработки in vivo. В противоположностьNHS-пептидам,малеинимид-ITP обычно совершенно стабилен в присутствии водных растворов и в присутствии свободных аминов. Так как конъюгаты малеинимид-ITP реагируют только со свободными тиолами, то защитные группы обычно не являются необходимыми для предотвращения реакции малеинимид-ITP-конъюгатов с самими собой. Кроме того, повышенная стабильность пептида позволяет использовать дополнительные стадии очистки, такой как ВЭЖХ, для получения продуктов высокой степени чистоты, пригодных для применения in vivo. Наконец, повышенная хими 003922 16 ческая стабильность позволяет получать продукт с длительным сроком хранения. В. Неспецифичное мечение.ITP по изобретению могут также быть модифицированы для неспецифичного мечения компонентов крови. Обычно используют связывание с аминогруппами, в частности, с образованием амидных групп для неспецифичного связывания. Для того, чтобы образовалась такая связь, можно использовать в качестве химически реакционноспособной группы, связываемой с ITP, большой ряд активных карбоксильных групп, в первую очередь, сложных эфиров, где гидроксильный остаток является физиологически приемлемым при требующихся уровнях. Хотя можно использовать в этих связывающих агентах различные гидроксильные группы, наиболее подходящими являются N-гидроксисукцинимид (NHS) и N-гидроксисульфосукцинимид (сульфо-NHS). Другие связывающие агенты, которые можно использовать, описаны в патенте США 5 612 034, вводимом в данное описание качестве ссылки. Различные сайты, с которыми могут in vivo реагировать химически реакционноспособные группы неспецифичных ITP, включают клетки, в частности, эритроциты и тромбоциты, и белки,такие как иммуноглобулины, включая IgG и IgM,сывороточный альбумин, ферритин, стероидсвязывающие белки, трансферрин, тироксинсвязывающий белок, -2-макроглобулин и т.п. Рецепторы, с которьми реагируют дериватизированные ITP, не являющиеся долгоживущими,обычно выделяются из организма человекахозяина в течение, примерно, 3 дней. Вышеуказанные белки (включая клеточные белки) остаются в кровотоке, по меньшей мере, 3 дня, и могут оставаться 5 дней или более (обычно не превышая 60 дней, более часто - не превышая 30 дней), конкретно, это относится к полупериоду существования на основе концентрации в крови. По большей части реакция идет с мобильными (подвижными) компонентами крови, конкретно, с белками крови и клетками, более конкретно, с белками крови и эритроцитами. Под мобильными (подвижными) подразумевается,что компонент не занимает фиксированного положения в течение любого продолжительного периода времени, обычно не превышающего 5 мин, более обычно - 1 мин, хотя некоторые из компонентов крови могут быть относительно стационарными в течение продолжительных периодов времени. Сначала имеется сравнительно гетерогенная популяция меченых белков и клеток. Однако, по большей части, популяция в течение нескольких дней после введения значительно изменяется по сравнению с первоначальной популяцией, в зависимости от полупериода существования меченых белков в кровотоке. Следовательно, обычно через 3 дня или более IgG становится преобладающим меченым белком в кровотоке. 17 Обычно на 5-ый день после введения IgG сывороточный альбумин и эритроциты составляют, по меньшей мере, около 60 мол.%, обычно, по меньшей мере, около 75 мол.% от конъюгированных компонентов крови, причем IgG,IgM (в значительно меньшей степени) и сывороточный альбумин составляют, по меньшей мере,около 50 мол.%, обычно, по меньшей мере, около 75 мол.%, более обычно, по меньшей мере,около 80 мол.% от неклеточных конъюгированных компонентов. Нужные конъюгаты неспецифичных ITP с компонентами крови могут быть получены in vivo введением ITP непосредственно больному, который может быть человеком или другим млекопитающим. Введение можно осуществлять в форме болюса или можно вводить медленно во времени с помощью инфузии, используя дозированный ток,или чего-либо подобного. Если требуется, обсуждаемые конъюгаты можно также получать ех vivo, смешивая кровь с дериватизированными ITP по данному изобретению, что делает возможным ковалентное связывание модифицированных ITP с реакционноспособными функциональными группами компонентов крови и последующим возвратом или введением конъюгированной крови хозяину. Кроме того, вышеуказанное можно также выполнить, сначала очищая индивидуальный компонент крови или ограниченное число компонентов, таких как эритроциты, иммуноглобулины, сывороточный альбумин или т.п., и смешивая компонент или компоненты ех vivo с химически реакционноспособными ITP. Меченая кровь или компонент крови могут быть затем возвращены хозяину с целью обеспечить in vivo обсуждаемые терапевтически эффективные конъюгаты. Кровь можно также обработать с целью предупреждения коагуляции в ходе манипуляций ех vivo. 3. Синтез модифицированных ITP. А. Синтез ITP. Фрагменты ITP могут быть синтезированы обычными методами твердофазной пептидной химии, известными рядовому специалисту в данной области техники. Например, фрагментыITP можно синтезировать методами тврдофазной химии по методикам, описанным StewardCompany, Rockford, III., (1984, с применением синтезатора Applied Biosystem. Аналогично,множественные фрагменты могут быть синтезированы, а затем могут быть связаны друг с другом, образуя фрагменты большего размера. Эти синтетические пептидные фрагменты могут также быть получены с аминокислотными заменами в специфичных местах. Обзор многих методов тврдофазного пептидного синтеза можно найти в J.М. Steward and(New York). Как правило, эти методы заключаются в последовательном добавлении одной или более аминокислот или соответствующим образом защищeнных аминокислот к наращиваемой пептидной цепи. Обычно либо амино-, либо карбоксильная группа первой аминокислоты защищена подходящей защитной группой. Защищнная или дериватизированная аминокислота затем либо закрепляется на инертной тврдой подложке, либо используется в виде раствора при добавлении следующей аминокислоты в последовательности, содержащей комплиментарную (амино или карбоксильную) группу,соответствующим образом защищенную, и в условиях, пригодных для образования амидной связи. Затем защитную группу удаляют из этого вновь добавленного аминокислотного остатка и добавляют следующую аминокислоту (с соответствующей защитой) и т.д. После того, как все нужные аминокислоты связаны в надлежащей последовательности, все оставшиеся защитные группы (и любая твердая подложка) удаляют последовательно или одновременно, получая конечный пептид. Простая модификация этой общей методики позволяет вводить (добавлять) более одной аминокислоты к наращиваемой цепи за раз, например, присоединением (в условиях, в которых не происходит рацемизации хиральных центров) защищенного трипептида к соответствующим образом защищенному дипептиду с образованием, после снятия защиты, пентапептида. Особенно предпочтительный способ получения соединений по данному изобретению представляет собой твердофазный пептидный синтез, отличающийся тем, что -N-концевая аминокислота защищена кислотной или основной подвижной (реакционноспособной) группой. Такие защитные группы должны обладать свойствами стабильности в условиях образования пептидной связи и в то же время легко сниматься, без разрушения растущей пептидной цепи или без рацемизации какого-либо хирального центра, содержащегося в ней. Подходящими пептидными группами являются 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), трет.бутилоксикарбонил (Вос), бензилоксикарбонил (Cbz),бифенилизопропилоксикарбонил, трет.амилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, ,-диметил-3,5-диметоксибензилоксикар-бонил, о-нитрофенилсульфенил,2-циано-трет.-бутилоксикарбонил и т.п. 9-флуоренилметилоксикарбонильная (Fmoc) защитная группа является особенно предпочтительной для синтеза ITРфрагментов. Другими предпочтительными защитными группами в боковых цепях являются для аминогрупп боковых цепей, таких как боко 19 вые цепи лизина и аргинина, - 2,2,5,7,8 пентаметилхроман-6-сульфонил (рmc), нитро, птолуолсульфонил, 4-метоксибензолсульфонил,Cbz, Вос и адамантилоксикарбонил; для тирозина - бензил, о-бром-бензилоксикарбонил, 2,6 дихлорбензил, изопропил, трет.бутил (t-Bu),циклогексил, циклопентил и ацетил (Ас); для серина - трет.бутил, бензил и тетрагидропиранил; для гистина - тритил, бензил, Cbz, птолуолсульфонил и 2,4-динитрофенил; для трипрофана - формил; для аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты - бензил и трет.бутил и для цистеина - трифенилметил (тритил). При твердофазном методе синтеза -Сконцевая аминокислота соединена с соответствующей твердой подложкой или полимером. Подходящими твердыми подложками, применимыми для вышеуказанного синтеза, являются такие материалы (вещества), которые инертны по отношению к реагентам и условиям постадийных реакций конденсации - снятия защиты,а также нерастворимы в применяемых средах. Предпочтительной твердой подложкой для синтеза -С-концевых карбоксипептидов является 4-гидроксиметилфеноксиметил-сополимер стирола-1% и дивинилбензола. Предпочтительной твердой подложкой для синтеза -С-концевых амидных пептидов является 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmос-аминометил)феноксиацетамидоэтил-полимер (смола), выпускаемый AppliedBiosystems (Foster City, Calif.). -С-концевая аминокислота связывается со смолой с помощью N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC),N,N'-диизопропилкарбодиимида (DIC) или Oбензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфата (HBTU), с 4-диметиламинопиридином (DMAP), 1-гидроксибензотриазолом (НОВТ), бензотриазол-1-илокси-трис(диметиламино)фосфонийгексафторфосфатом (ВОР) или бис(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфинхлоридом (ВОРСl) или без них, опосредующих связывание, в течение примерно 1-24 ч при температуре 10-50 С в растворителе, таком как хлористый метилен или ДМФА. Когда твeрдой подложкой (фазой) является полимер 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmос-аминометил)феноксиацетамидоэтила,Fmoc-группа отщепляется вторичным амином, предпочтительно, пиперидином, перед тем, как связываться с -С-концевой аминокислотой, как описано выше. Предпочтительным методом связывания с лишeнной защитных групп 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmос-аминометил)феноксиацетамидоэтильной смолой является применение Oбензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфата(НВТU, 1 экв.) и 1-гидроксибензотриазола (НОВТ, 1 эквив.) в ДМФА. Присоединение последовательных защищeнных аминокислот можно проводить в автоматическом полипептидном синтезаторе, что хорошо известно из уровня техники. В предпочтитель 003922 20 ном варианте изобретения -N-концевые аминокислоты растущей пептидной цепи защищены с помощью Fmoc. Удаление Fmoc-защитной группы -N-концевого участка растущего пептида осуществляют обработкой вторичным амином, предпочтительно, пиперидином. Каждую защищeнную аминокислоту затем вводят,примерно, в 3-х кратном молярном избытке, а сшивание преимущественно проводят в ДМФА. Сшивающим агентом обычно является Oбензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфат (HBTU, 1 эквив.) и 1 гидроксибензотриазол (НОВТ, 1 эквив.). По окончании твeрдофазного синтеза пептид удаляют из смолы и депротекционируют(снимают защиту) либо путем последовательных операций, либо в ходе однократной операции. Удаление полипептида и снятие защиты можно осуществлять за одну операцию, обрабатывая прикреплeнный к смоле полипептид отщепляющим реагентом, содержащим тианизол,воду, этандитиол и трифторуксусную кислоту. В тех случаях, когда -С-конец полипептида представляет собой алкиламид, смолу отщепляют аминолизом под действием алкиламина. Или же пептид можно удалять переэтерификацией, например метанолом, с последующим аминолизом или прямым переамидированием. Защищeнный пептид может очищаться в этот момент или его можно брать сразу для следующей стадии. Снятие защитных групп боковой цепи проводят, используя отщепляющий коктейль, описанный выше. Полностью депротекционированный пептид очищают с помощью нескольких последовательных хроматографических стадий, используя любые или все следующие виды хроматографии: ионообменную на слабоосновной смоле (в форме ацетата); гидрофобная адсорбционная хроматография на недериватизированном сополимере полистиролдивинилбензол (например, Амберлит ХАД); адсорбционная хроматография на силикагеле; ионообменная хроматография на карбоксиметилцеллюлозе; распределительная хроматография, например, на Sephadex G-25, LH-20 или противоточная распределительная хроматография; высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), в первую очередь, обращeннофазовая ВЭЖХ на колонке, с фазой октил- или октадецилсилил на силикагеле. Молекулярные веса этих ITP определяют, используя масс-спектрометрию FAB (BAT - бомбардировка быстрыми атомами).ITP по изобретению можно синтезировать с N- и С-концевыми защитными группами для применения в качестве пролекарств. 1. N-концевые защитные группы Как обсуждалось выше, термин Nзащитная группа относится к группам, предназначенным для защиты -N-конца аминокислоты или пептида или для того, чтобы иначе за 21 щитить аминогруппу аминокислоты или пептида от нежелательных реакций в процессе синтеза. Обычно применяемые N-защитные группы описаны в книге Greene, Protective Groups inYork (1981, вводимой в данное описание в качестве ссылки. Кроме того, защитные группы можно использовать в пролекарствах, которые легко расщепляются in vivo, например, ферментативным гидролизом, выделяя биологически активное исходное (родитель). -N-защитные группы включают низшие алканоильные группы, такие как формил, ацетил (Ас), пропионил, пивалоил, трет.бутилацетил и т.п.; другие ацильные группы включают 2-хлорацетил, 2 бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил,фталил, о-нитрофеноксиацетил, -хлорбутил,бензоил, 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, 4 нитро-бензоил и т.п.; сульфонильные группы,такие как бензолсульфонил, п-толуолсульфонил и т.п.; карбамат-образующие группы, такие как бензилоксикарбонил,п-хлорбензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, 2-нитробензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, 2,4-диметоксибензилоксикарбонил, 4-этоксибензилоксикарбонил, 2-нитро 4,5-диметоксибензилоксикарбонил,3,4,5-триметоксибензилоксикарбонил, 1-(п-бифенил)-1 метилэтоксикарбонил, ,-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил, бензгидрилоксикарбонил, трет.бутилоксикарбонил, диизопропилметоксикарбонил,изопропилоксикарбонил,этоксикарбонил, аллилоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, феноксикарбонил, 4-нитрофеноксикарбонил,флуоренил-9-метоксикарбонил, циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил,циклогексилоксикарбонил,фенилтиокарбонил и т.п.; арилалкильные группы, такие как бензил, трифенилметил, бензилоксиметил,9-флуоренилметилоксикарбонил(Fmoc) и т.п.; и силильные группы, такие как триметилсилил и т.п. 2. Карбоксизащитные группы Как обсуждалось выше, термин карбоксизащитная группа относится к защищающей карбоновую кислоту сложноэфирной или амидной группе, применяемой для блокирования или для защиты функции карбоновой кислоты на то время, пока идут реакции с участием других функциональных центров соединения. Карбокси-защитные группы описаны в книге Greene,Protective Groups in Organic Synthesis, pp 152186, (1981), вводимой в данное описание в качестве ссылки. Кроме того, карбокси-защитная группа может применяться в пролекарствах, при этом карбокси-защитная группа может легко расщепляться in vivo, например, ферментативным гидролизом, выделяя биологически активное исходное (родитель). Такие карбокси 003922 22 защитные группы хорошо известны специалистам в данной области, они широко применяются для защиты карбоксильных групп в области пенициллина и цефалоспорина, как описано в патентах США 3 840 556 и 3 719 667, раскрытие которых вводится в данное описание в качестве ссылки. Репрезентативные карбокси-защитные группы представляют собой C1-C8-низший алкил (например, метил, этил или трет.бутил и т.п.); арилалкил, такой как фенетил или бензил и их замещенные производные, такие как алкоксибензильная или нитробензильная группы и т.п.; арилалкенил, такой как фенилэтенил и т.п.; арил и его замещенные производные, такие как 5-инданил и т.п.; диалкиламиноалкил, такой как диметиламиноэтил и т.п.; алканоилоксиалкильные группы, такие как ацетоксиметил, бутирилоксиметил, валерилоксиметил, изобутирилоксиметил, изовалерилоксиметил, 1-(пропионилокси)-1-этил, 1-(пивалоил)-1-этил, 1-метил 1-(пропионилокси)-1-этил, пивалоилоксиметил,пропионилоксиметил и т.п.; циклоалканоилоксиалкильные группы, такие как циклопропилкарбонилоксиметил,циклобутилкарбонилоксиметил, циклопентилкарбонилоксиметил,циклогексилкарбонилоксиметил и т.п.; ароилоксиалкил, такой как бензоилоксиметил, бензоилоксиэтил и т.п.; арилалкилкарбонилоксиалкил,такой как бензилкарбонилоксиметил, 2-бензилкарбонилоксиэтил и т.п.; алкоксикарбонилалкил или циклоалкилоксикарбонилалкил, такой как метоксикарбонилметил, циклогексилоксикарбонилметил, 1-метоксикарбонил-1-этил и т.п.; алкоксикарбонилоксиалкил или циклоалкилоксикарбонилоксиалкил, такой как метоксикарбонилоксиметил, трет.бутилоксикарбонилоксиметил, 1-этоксикарбонилокси-1-этил, 1-циклогексилоксикарбонилокси-1-этил и т.п.; арилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(феноксикарбонилокси)этил, 2-(5-инданилоксикарбонилокси)этил и т.п.; алкоксиалкилкарбонилоксиалкил, такой как 2-(1-метокси-2-метилпропан-2-оилокси) и т.п.; арилалкилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(бензилоксикарбонилокси)этил и т.п.; арилалкенилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(3-фенилпропен-2 илоксикарбонилокси)этил и т.п.; алкоксикарбониламиноалкил, такой как трет.бутилоксикарбониламинометил и т.п.; алкиламинокарбониламиноалкил, такой как метиламинокарбониламинометил и т.п.; алканоиламиноалкил, такой как ацетиламинометил и т.п.; гетероциклилкарбонилоксиалкил, такой как 4-метилпиперазинилкарбонилоксиметил и т.п.; диалкиламинокарбонилалкил, такой как диметиламинокарбонилметил, диэтиламинокарбонилметил и т.п.; 23 Представителями амидных карбоксизащитных групп являются аминокарбонильная и(низший алкил)аминокарбонильная группы. Предпочтительными карбоксизащищенными соединениями по изобретению являются соединения, в которых защитной карбоксигруппой является (низший алкил)овый, циклоалкиловый или арилалкиловый сложный эфир,например, метиловый эфир, этиловый эфир,пропиловый эфир, изопропиловый эфир, бутиловый эфир, вт.бутиловый эфир, изобутиловый эфир, амиловый эфир, изоамиловый эфир, октиловый эфир, циклогексиловый эфир, фенилэтиловый эфир и т.п. или алканоилоксиалканоиловый, циклоалканоилоксиалкиловый, ароилоксиалкиловый или арилалкилкарбонилоксиалкиловый эфир. Предпочтительными амидными карбокси-защитными группами являются (низший алкил)аминокарбонильные группы. Например,аспарагиновая кислота может быть защищена по -С-концу неустойчивой при действии кислоты группой (например, трет.бутильной), а по-С-концу - защищена неустойчивой при гидрировании группой (например, бензильной), которые затем селективно удаляются в процессе синтеза. В. Модификация ITP Метод получения модифицированных ITP по данному изобретению очень широко варьируется в зависимости от природы различных элементов, составляющих ITP. Методики синтеза выбираются так, чтобы быть простыми, обеспечивать высокие выходы и продукт высокой степени чистоты. Обычно химически реакционноспособную группу получают на последней стадии синтеза, например, с карбоксильной группой, этерификацией с образованием активного сложного эфира. Конкретные способы получения модифицированных ITP по данному изобретению описаны ниже. Каждый ITP, выбранный для модификации линкером, и реакционноспособный агент модифицируют в соответствии со следующими критериями: если карбоксильная группа, не важная для сохранения фармакологической активности,имеется в первоначальном ITP, а никаких других реакционноспособных функциональных групп в ITP нет, тогда выбирают карбоновую кислоту в качестве места связывания для модификации линкер-реактивная частица. Если карбоновые кислоты отсутствуют, тогда в качестве места связывания для модификации линкер-реактивная частица выбирают другие функциональные группы, не являющиеся важными для сохранения фармакологической активности. Если в ITP имеется несколько пригодных функциональных групп, используют сочетание защитных групп таким образом, чтобы после присоединения линкер-реактивная частица и снятия защиты (депротекции) у всех защищeнных функциональных групп по 003922 24 прежнему сохранялась фармакологическая активность. Если в ITP нет подходящих реакционноспособных функциональных групп, то синтетические методы могут сделать возможной такую модификацию начального ITP, что достигается сохранение биологической активности и сохранение рецепторной или намеченной (целевой) специфичности. Химически реакционноспособную частицу помещают в сайт так, что когда ITP связывается с компонентом крови, ITP сохраняет значительную часть активности немодифицированного ITP. Даже более конкретно, каждыйITP, выбранный для дериватизации линкером и реактивной частицей, модифицируют в соответствии со следующими критериями: если в терапевтическом пептиде имеется подходящая концевая карбоксильная группа и она не является важной для сохранения фармакологической активности, а никакой другой реакционноспособной функциональной группы в ITP нет, то в качестве места связывания для модификации линкер-реактивная частица выбирают карбоновую кислоту. Если концевая карбоксильная группа влияет на фармакологическую активность или если нет подходящей карбоксильной группы, тогда выбирают в качестве места связывания для модификации линкер-реактивная частица любую другую реакционноспособную функциональную группу, не являющуюся важной для сохранения фармакологической активности. Если в ITP имеется несколько реакционноспособных (чувствительных) функциональных групп, используют комбинацию защитных групп таким образом, чтобы после присоединения линкер/реактивная частица и депротекции защищнных чувствительных функциональных групп сохранялась фармакологическая активность. Если в терапевтическом пептиде нет в наличии никаких чувствительных функциональных групп, синтетические приемы сделают возможной такую модификацию оригинального пептида, что достигается сохранение биологической активности т рецепторной или намеченной (целевой, относительно мишени) специфичности. В этом случае модификация происходит на противоположном конце пептида.NHS-дериват можно синтезировать из карбоновой кислоты в отсутствие других чувствительных функциональных групп в терапевтическом пептиде. Конкретно, такой терапевтический пептид реагирует с N-гидроксисукцинимидом в безводном CH2Cl2 и EDC, и продукт очищают хроматографией или перекристаллизацией из подходящей системы растворителей, получая NHS-дериват. Или же NHS-дериват можно синтезировать из ITP, который содержит амино и/или тиольную группу и карбоновую кислоту. Когда в молекуле присутствует свободная амино и/или 25 тиольная группа, предпочтительно, защитить эти чувствительные функциональные группы перед присоединением NHS-деривата. Например, если молекула содержит свободную аминогруппу, то перед проведением вышеописанных химических реакций следует превратить амин вFmoc- или, предпочтительно, в t.Bocзащищeнный амин. Функциональная аминогруппа не депротекционируется после получения NHS-деривата. Следовательно, этот метод применяется только к соединению, в котором не требуется снятия защиты у аминогруппы для стимулирования заданного фармакологического эффекта. Кроме того, NHS-дериват можно синтезировать из терапевтического пептида, содержащего амино или тиольную группу, но не содержащего карбоновой кислоты. Если выбранная молекула не содержит карбоновой кислоты,то для превращения молекулы в реакционноспособное NHS-производное можно использовать набор (структурный мотив) бифункциональных линкеров. Например, этиленгликольбис(сукцинимидилсукцинат) (EGH) и триэтиламин, растворенные в ДМФА и прибавленные к содержащему свободный амин соединению (в соотношении 10:1, при избытке EGS), дают моно-NHS-производное (дериват). Для получения NHS-деривата из тиолдеривати-зированной молекулы можно использовать(GMBS) и триэтиламин в ДМФА. Малеинимидогруппа реагирует со свободным тиолом, aNHS-дериват очищают от реакционной смеси хроматографией на силикагеле или с помощью ВЭЖХ.NHS-производное можно также синтезировать из ITP, содержащего несколько чувствительных функциональных групп. Каждый случай следует анализировать и решать различным способом. Однако благодаря большому набору защитных групп и бифункциональных линкеров, которые выпускаются промышленностью, это изобретение применимо к любому терапевтическому пептиду с применением,предпочтительно, одной химической стадии дериватизации ITP или двух стадий, на первой из которых защищается чувствительная группа, или трeх стадий (защита, активация, снятие защиты). Только в исключительных обстоятельствах требуется применение многостадийного(более трeх стадий) синтеза для превращения терапевтического пептида в активный NHS- или малеинимидодериват. Малеинимидодериват можно также получать из ITP, содержащего свободную аминогруппу, и свободной карбоновой кислоты. Для получения малеинимидо-производного из аминодериватизированной молекулы можно использовать N-[-малеинимидобутирилокси]сукцинимидоэфир (GMBS) и триэтиламин в ДМФА. Сукцинимидоэфирная группа реагирует со свободной аминогруппой, а малеинимидо 003922 26 производное очищают от реакционной смеси кристаллизацией или хроматографией на силикагеле или методом ВЭЖХ. Наконец, малеинимидо-производное можно синтезировать из терапевтического пептида,содержащего множество других чувствительных функциональных групп и ни одной свободной карбоновой кислоты. Когда выбранная молекула не содержит карбоновой кислоты, набор реагентов для бифункционального связывания можно применить для превращения молекулы в реакционноспособный NHS-дериват. Например, малеинимидопропионовую кислоту(МРА) можно связать со свободной аминогруппой с целью получения малеинимид-деривата по реакции амина с карбоксильной группой МРА, используя HBTU/HOBt/DIEA-активацию в ДМФА. Или же при необходимости можно применять многие другие выпускаемые промышленностью гетеробифункциональные сшивающие реагенты. Выпускается большой ряд бифункциональных соединений для связывания с частицами. Эти реагенты включают азидобензоил гидразид, N-[4-(п-азидосалициламино)бутил]-3'[2'-пиридилдитио]пропионамид,бис-сульфосукцинимидил суберат, диметиладипимидат,дисукцинимил тартрат,N-y-малеинимидобутирилоксискуцинимидоэфир,N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат, N-сукцинимидил[4-азидофенил]-1,3'-дитиопропионат,N-cyкцинимидил[4-иoдaцeтил]aминoбeнзoaт,глутаральдегид и сукцинимидил-4-[N-малеинимидометил]циклогексан-1-карбоксилат. 4. Применение модифицированных ITP Модифицированные ITP по изобретению находят множество применений, включая применение для лечения диабета, в качестве седативных веществ, лечения расстройства нервной системы, применение для стимулирования анксиолитического действия на ЦНС, для постхирургического лечения и как средство терапии с целью инсулинорезистентности. А. Лечение диабета Модифицированные ITP по изобретению,как правило, нормализуют гипергликемию по глюкоза-зависимому, инсулин-зависимому и инсулин-независимому механизмам. В этом случае модифицированные ITP применимы в качестве первичных агентов для лечения сахарного диабета типа II и в качестве вспомогательного средства для лечения сахарного диабета типа I. Применение эффективного количества модифицированных ITP для лечения сахарного диабета имеет то преимущество, что они являются более сильнодействующими, чем немодифицированные ITP. Так как модифицированныеITP стабильны in vivo, для эффективного лечения можно вводить меньшее количество молекул. Данное изобретение особенно подходит для лечения больных диабетом как типа I, так и ти 27 па II, тем, что действие пептида зависит от концентрации глюкозы в крови, и следовательно,риск гипергликемических побочных эффектов резко падает по сравнению с применяемыми в настоящее время методами лечения. Настоящее изобретение также охватывает способ лечения больных сахарным диабетом,причeм указанный способ заключается в обеспечении количества модифицированного ITP,достаточного для лечения диабета; при этом композиция содержит модифицированный ITP. В. Лечение расстройств нервной системы Модифицированные ITP по изобретению также находят применение в качестве седативных веществ. В одном аспекте изобретения предлагается способ седативного воздействия на млекопитающее с расстройством, вызванным повышенной активностью центральной или периферической нервной системы, с помощью модифицированных ITP по изобретению. Способ заключается во введении модифицированного ITP субъекту в количестве, достаточном для оказания седативного или анксиолитического действия на субъект. МодифицированныйITP можно вводить интерацеребровентрикулярно, перорально, подкожно, внутримышечно или внутривенно. Такие методы применимы для лечения или улучшения состояния нервной системы, такого как страх, двигательные расстройства, агрессия, психоз, эпилептические припадки, приступы паники, истерия и нарушение сна. В родственном аспекте изобретение охватывает способ повышения активности млекопитающего, заключающийся во введении модифицированного ITP субъекту в количестве, достаточном для оказания активирующего действия на субъект. Предпочтительно, больной находится в состоянии, возникшем в результате пониженной активации центральной или периферической нервной системы. МодифицированныеITP находят, в частности, применение для лечения или облегчения депрессии, шизоаффективных нарушений, приступов апноэ во сне, потери памяти, забывчивости и нарколепсии, которые представляют малую часть состояний, при которых возбуждение центральной нервной системы может быть благоприятным. Модифицированные ITP по изобретению можно использовать, чтобы стимулировать возбуждение с целью лечения или облегчения депрессии, шизоаффективных нарушений, апноэ во сне, синдромов недостатка внимания со слабой концентрацией, потери памяти, забывчивости и нарколепсии. Терапевтическую эффективность лечения модифицированными ITP можно наблюдать в ходе собеседований с пациентом для оценки их состояния, с помощью психологического/неврологического тестирования или по ослаблению симптомов, обусловленных этими состояниями. Например, лечение нарколепсии можно оценивать мониторингом частоты нарколептических приступов. Другой пример, 003922 28 действие модифицированных ITP на способность субъекта концентрироваться или на объeм памяти можно анализировать, используя любой из диагностических тестов, хорошо известных специалистам в данной области техники. С. Послеоперационное лечение Модифицированные ITP по изобретению можно применять для послеоперационного лечения. Больному необходимы модифицированные ITP по данному изобретению примерно за 1-16 ч до операции, в ходе операции и после операции не более, примерно, 5 дней. Модифицированные ITP по данному изобретению вводят, примерно, за 16-1 ч до начала операции. Продолжительность времени перед операцией, в течение которого надо вводить соединения по данному изобретению для того,чтобы уменьшить катаболический эффект и устойчивость к инсулину, зависит от ряда факторов. Эти факторы, как правило, известны рядовому врачу и включают, прежде всего, (наиболее важный), находится ли больной в состоянии натощак или же даeтся больному глюкоза в виде вливания или питья, или в какой-либо другой форме питания при подготовке к операции. Другие важные факторы включают пол больного, вес и возраст, опасность какой-либо невозможности контролировать глюкозу в крови,скрытые причины какой-либо невозможности контролировать глюкозу в крови, ожидаемую серьeзность травмы, вызванной операцией, способ введения и биодоступность, стойкость в организме, рецептуру и эффективность вводимого соединения. Предпочтительный временной интервал начала введения модифицированныхITP, применяемых по данному изобретению,составляет от около 1 примерно до 10 ч до начала операции. Наиболее предпочтительный интервал начала введения составляет примерно от 2 до 8 ч перед операцией. Стойкость к инсулину после конкретной операции, рекомендуемой операции брюшной полости, наиболее сильна в первый послеоперационный день, длится, по меньшей мере, 5 дней,и может нормализоваться за период до 3 недель. Так, больному после операции может потребоваться введение модифицированных ITP по данному изобретению за время послеоперационной травмы, которое зависит от факторов,которые понимает и определяет рядовой врач. Среди этих факторов такие, как: не дают или дают больному после операции глюкозу в виде вливаний или питья или в какой-либо другой питательной форме после операции, и также,без ограничения, пол больного, вес и возраст,серьeзность любой невозможности регулировать уровень глюкозы в крови, скрытые причины любой невозможности регулировать уровень глюкозы в крови, действительную серьeзность послеоперационной травмы, способ введения и биосовместимость, устойчивость в организме,рецептуру и эффективность вводимого соедине 29 ния. Предпочтительная продолжительность введения соединения по изобретению составляет более 5 дней после операции.D. Лечение стойкости к инсулину Модифицированные ITP по изобретению можно применять для лечения инсулиновой устойчивости независимо от их применения при послеоперационном лечении. Инсулиновая устойчивость может быть вызвана снижением связывания инсулина с рецепторами клеточной поверхности или изменениями внутриклеточного метаболизма. Первый тип, характеризуемый как снижение чувствительности к инсулину,может быть преодолен повышенной концентрацией инсулина. Второй тип, характеризуемый как снижение инсулиновой отвечаемости, нельзя обойти большими количествами инсулина. Инсулиновая резистентность после травмы может быть преодолена дозами инсулина, которые пропорциональны степени инсулиновой резистентности и, таким образом, вызвана, повидимому, снижением инсулиновой чувствительности. Доза модифицированных ITP, эффективная для нормализации уровней глюкозы в крови больного, зависит от ряда факторов, среди которых, без ограничения, пол больного, вес и возраст, серьзность невозможности регулировать уровень глюкозы в крови, скрытые факторы(причины) невозможности регулировать уровень глюкозы в крови, вне зависимости от того,вводится глюкоза или одновременно с ней вводится источник другого углевода, способ введения и биосовместимость, устойчивость в организме, рецептура, эффективность. 5. Введение модифицированных ITP Модифицированные ITP вводят в физиологически приемлемой среде, например, в деионизированной воде, забуференном фосфатном растворе (PBS), физиологическом растворе,водном этаноле или другом спирте, плазме, белковых растворах, манните, водной глюкозе, растительном масле и т.п. Другие добавки, которые могут входить в состав, включают буферы, в которых среда, как правило, забуферена до рН в интервале около 5-10, и буфер обычно имеет концентрацию около 50-250 мМ; соль, причем концентрация соли, обычно, составляет 5-500 мМ, физиологически приемлемые стабилизаторы и т.п. Композиции могут быть модифицированы для удобства хранения и транспортировки. Модифицированные ITP, по большей части, вводят перорально, парентерально, например, интраваскулярно (IV), внутриартериально(IA), внутримышечно (IM, ВМ), подкожно (SC) и т.п. В некоторых случаях введение может быть осуществлено путем внутривенного вливания. В некоторых примерах, когда реакция функциональной группы идт сравнительно медленно, введение может быть пероральным,назальным, ректальным, трансдермальным или в виде аэрозоля, где природа конъюгата позво 003922 30 ляет переносить его в сосудистую систему. Обычно применяют однократную инъекцию,хотя, если требуется, можно использовать более одной инъекции. Модифицированные ITP можно вводить любым обычным способом, включая шприц, троакар, катетер и т.п. Конкретный способ введения меняется в зависимости от вводимого количества, вводится ли однократный болюс или осуществляют непрерывное введение и т.п. Предпочтительно, чтобы осуществлялось интраваскулярное (внутрисосудистое) введение там, где участок для введения не столь важен для данного изобретения, предпочтительно, где быстрый ток крови, например, внутривенно, в периферическую или центральную вену. Другие способы могут находить применение там, где введение сопряжено с аппаратурой для медленного выделения или с защитной матрицей. Целью является, чтобы ITP эффективно распределялись в крови, так чтобы они могли реагировать с компонентами крови. Концентрация конъюгата меняется в широких пределах. Как правило, от около 1 пг/мл до 50 мг/мл. Общее количество, вводимое интраваскулярно, обычно составляет около 0,1-10 мг/мл, более обычно,около 1-5 мг/мл. Связывая долгоживущие компоненты крови, такие как иммуноглобулин, сывороточный альбумин, эритроциты и тромбоциты, достигают ряда преимуществ. Активность соединения с модифицированными ITP длится от дней до недель. В течение этого времени требуется только одно введение. Можно достичь более высокой специфичности, так как активное соединение сначала связывается с большими молекулами,что уменьшает вероятность внутриклеточного поглощения, мешающего другим физиологическим процессам. Образование ковалентной связи с компонентом крови может происходить in vivo и exvivo. Для образования ковалентной связи ех vivo модифицированный ITP добавляют в кровь, сыворотку или физиологический раствор, содержащий человеческий сывороточный альбумин или IgG, с целью сделать возможным образование ковалентной связи между модифицированным ITP и компонентом крови. В предпочтительном варианте ITP модифицируют малеимидом, и он реагирует с человеческим сывороточным альбумином в физиологическом растворе. Модифицированный ITP реагирует с компонентом крови, образуя конъюгат ITP-белок, конъюгат можно вводить больному. Или же модифицированный ITP можно вводить больному непосредственно, так что ковалентная связь образуется между модифицированным ITP и компонентом крови in vivo. 6. Мониторинг присутствия модифицированных ITP Кровь млекопитающего-хозяина можно контролировать на активность ITP и/или присутствие модифицированных ITP. Отбирая 31 часть (порцию) или образец крови хозяина в различные временные точки, можно определить,связан ли ITP с долгоживущими компонентами крови в количестве, достаточном, чтобы быть терапевтически активным, и следовательно,уровень ITP-соединения в крови. При необходимости можно также определить, с какими компонентами крови связана молекула ITP. Это особенно важно при использовании неспецифичных ITP. Для специфичных малеинимид-ITP намного проще рассчитать полупериод существования сывороточного альбумина и IgG. Модифицированные ITP можно контролировать, используя анализы на инсулинотропную активность, ВЭЖХ-масс-спектрометрию или антитела к ITP. А. Анализы на инсулинотропную активность Данное изобретение относится к модифицированным ITP-дериватам (производным), которые проявляют инсулинотропную активность,превышающую или равную инсулинотропной активности немодифицированных ITP. Инсулинотропные свойства соединения можно определить, вводя это соединение в животные клетки или инъецируя это соединение животным и контролируя выделение иммунореактивного инсулина (IRI) в среды или кровеносную систему животного соответственно. Присутствие IRI обнаруживают радиоиммуноанализом, которые могут специфично обнаруживать инсулин. Хотя можно использовать любой радиоиммуноанализ, способный обнаруживать наличие IRI,предпочтительно использовать модификацию аналитического метода Альбано (Albano,J.D.M.) et al., (Acta Endocrinol. 70:487-509(1972. В этой модификации используют буфер фосфат/альбумин с рН 7,4. Инкубацию проводят последовательным кондиционированием 500 мкл фосфатного буфера, 50 мкл перфузата образца или стандарта инсулина крыс в перфузате,100 мкл противоинсулиновой сыворотки (Wellcome Laboratories; 1:40000 разведение) и 100 мкл [125I] инсулина, получая общий объeм 750 мкл в стеклянной пробирке одноразового пользования 10 х 75 мм. После инкубации в течение 2-3 дней при 4 С свободный инсулин на угле отделяют от связанного с антителом инсулина. Чувствительность метода обычно равна 1-2 мкл ед./мл. Для измерения выделения IRI в клеточную культуральную среду клеток, выращенных в культуре тканей, предпочтительно в проинсулин вводят радиоактивную метку. Хотя можно использовать любую радиоактивную метку,способную метить полипептид, предпочтительно использовать 3 Н лейцин, чтобы получить меченый проинсулин. Мечение можно производить в течение любого периода времени, достаточного для образования детектируемого меченого количества молекул проинсулина; однако,предпочтительно инкубировать клетки в присутствии радиоактивной метки в течение 60 32 мин. Хотя любая клеточная линия, способная экспрессировать инсулин, может быть использована для определения того, обладает ли соединение инсулинотропным действием, предпочтительно использовать клетки инсулиномы крыс, и в частности клетки инсулиномы крысRIN-38. Такие клетки можно выращивать в любой подходящей среде; однако, предпочтительно использовать DME-среду, содержащую 0,1%BSA и 2,5 мМ глюкозы. Инсулинотропные свойства модифицированного ITP можно также определить панкреатической инфузией. Приготовление выделеннойin situ поджелудочной железы крысы для перфузии есть модификация метода Penhos, J.С., et al.,(Diabetes 18:733-738 (1969. По этому методу крыс натощак (предпочтительно самцов белых крыс линии Charles River), весящиx 350-600 г,анестезируют с помощью внутрибрюшинной инъекции Амитала натрия (Eli Lilly and Co., 160 нг/кг). Кровеносные сосуды почек, надпочечников, желудка и нижней части ободочной кишки лигируют. Проводят резекцию всего кишечника,за исключением 4 см двенадцатиперстной и нисходящей ободочной и прямой кишки. Следовательно, проводят перфузию только малой части кишечника, что сводит к минимуму вмешательство веществ из кишечника с инсулинотропной иммунореактивностью. Перфузат предпочтительно представляет собой модифицированный бикарбонатный буфер Krebs-Ringer с 4% декстрана Т 70 и 0,2% альбумина бычьей сыворотки (фракция V) и, предпочтительно,продутый 95% О 2 и 5% СО 2. Предпочтительно применяют четырехканальный перистальтический насос в непульсовом режиме (Bucherpolystatic, Bucher Instruments Division, NuclearChicago Corp.), а переключение с одного источника перфузата на другой, предпочтительно,осуществляют с помощью трхходового крана. Осуществляют перфузию, модифицируют и анализируют, предпочтительно, по методу Wier,G.С., et al., (J. Clin. Investigat. 54:1403-1412(1974, вводимому в данное описание в качестве ссылки. В. ВЭЖХ-масс-спектрометрия ВЭЖХ,сопряженная с массспектрометрией (МС), может быть использована для анализа на присутствие пептидов и модифицированных пептидов, что хорошо известно специалистам в данной области техники. Как правило, используют две подвижные фазы: 0,1%TFA/вода и 0,1% TFA/ацетонитрил. Температура в колонке может изменяться в градиенте. Конкретные детали излагаются ниже в разделе Примеры. С. Антитела Другой аспект данного изобретения относится к способам определения концентрацииITP или их конъюгатов в биологических образцах (таких как кровь) с использованием антител,специфичных к ITP, и к использованию таких 33 антител для лечения токсичности, возможно,обусловленной такими ITP или конъюгатами. Это является полезным, так как повышенная стабильность и более продолжительное существование ITP в организме больного in vivo может привести к новым проблемам в ходе лечения,включая повышенную возможность токсичности. Применение антител против ITP, либо моноклональных, либо поликлональных специфичных к конкретным ITP, может способствовать опосредованию любой такой проблемы. Антитела можно синтезировать или взять у хозяина, иммунизированного конкретным модифицированным ITP или иммуногенным фрагментом агента или синтезированным иммуногеном, соответствующим антигенной детерминанте агента. Предпочтительные антитела имеют высокую специфичность и сродство к нативным, дериватизированным и конъюгированным формам модифицированного ITP. Такие антитела могут также быть мечены с помощью ферментов, флуорохромов или радиоизотопной меткой. Антитела, специфичные к модифицированным ITP, могут быть получены с использованием очищенных ITP для индукции дериватизированных ITР-специфичных антител. С помощью индукции антител предполагается не только стимулировать иммунный ответ инъекцией животным, но аналогичные стадии получения синтетических антител или других специфично связывающих молекул, таких как библиотеки для скрининга рекомбинантного иммуноглобулина. Как моноклональные, так и поликлональные антитела можно получать хорошо известными из уровня техники методами. Антитела можно использовать для контроля присутствия ITP-пептидов в крови. Образцы крови и/или сыворотки можно анализировать методами SDS-PAGE и вестерн-блоттингом. Такие методы позволяют анализировать кровь и сыворотку с целью определения связывания модифицированных ITP с компонентами крови. Антитела против терапевтических агентов можно также использовать для лечения токсичности, вызванной введением модифицированного ITP, и могут применяться ex vivo или in vivo. Методы ех vivo включают иммуно-диализное лечение токсичности с применением антител против терапевтических агентов, прикреплнных к тврдой подложке. In vivo методы включают введение антител против терапевтических агентов в количествах, эффективных для стимулирования клиринга комплексов антитело агент. Антитела можно использовать для удаления модифицированных ITP и их конъюгатов из крови больного ех vivo приведением в контакт в антителами в стерильных условиях. Например,антитела могут быть закреплены или иным образом иммобилизованы на матриксной колонке,а у больного можно взять кровь и пропустить 34 через матрицу. Модифицированные ITP связываются с антителами, и кровь, содержащая низкую концентрацию ITP, затем может быть возвращена в кровеносную систему больного. Количество взятого модифицированного ITP можно контролировать корректировкой давления и скорости тока. Предпочтительное удаление модифицированных ITP из компонента плазмы крови можно проводить, например, используя полупроницаемую мембрану, или иначе, сначала отделяя компонент плазмы от клеточного компонента известными из уровня техники способами перед тем, как пропускать компонент плазмы через матрицу, содержащую антитерапевтические антитела. Или же предпочтительное выделение ITР-конъюгированных клеток крови, включая эритроциты, можно осуществлять, собирая и концентрируя клетки крови в крови больного и приводя в контакт эти клетки с прикреплнными антителами против ITP с целью исключения компонента сыворотки из крови больного. Антитела против ITP можно вводить invivo, парентерально больному, который получал модифицированные ITP или конъюгаты в качестве лечения. Антитела связывают ITPсоединения и конъюгаты. В результате связывания активность ITP затруднена, если не полностью блокирована, тем самым снижается биологически эффективная концентрация ITPсоединения в кровотоке больного и сводятся к минимуму вредные побочные эффекты. Кроме того, связанный комплекс антитело-ITР облегчает клиренс ITP-соединений и конъюгатов в кровотоке больного. Подробно описанное изобретение иллюстрируется нижеследующими не ограничивающими примерами. Примеры Общие замечания Твeрдофазный пептидный синтез инсулинотропных пептидов в масштабе 100 мкмол осуществляют методом мануального твeрдофазного синтеза на синтезаторе пептидов Symphony, применяя Fmoc-защищeнную амидно-МВНА смолу Ринка, Fmoc-защищeнные аминокислоты, Oбензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфат (HBTU) в N,N-диметилформамиде (ДМФА) и активацию с помощью N-метилморфолина (NMM), и пиперидиновую депротекцию Fmoc-групп (cтадия 1). При необходимости вручную осуществляют селективную депротекцию (снятие защиты) Lys (Aloc) группы и выполняют это, обрабатывая смолу раствором 3 экв. Рd(РРh3)4 в 5 мл CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5) в течение 2 ч (cтадия 2). Затем смолу промывают СНСl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ(6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). В некоторых примерах синтез снова автоматизируют для добавления одной АЕЕА (аминоэтоксиэтоксиуксусная кислота) группы, добавления уксусной кислоты или добавления 3-малеинимидопропионовой кислотыTFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующей преципитацией Et2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукты очищают препаративной обращeнно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ, используя Varian (Rainin) препаративную бинарную ВЭЖХ-систему: градиентная элюция 30-55% В(В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин с использованием колонки 21 мм х 25 см с 10 мк фенил-гексила (Phenomenex Luna) и УФдетектора (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм. Частоту определяют ОФ-ВЭЖХ-массспектрометрией с помощью спектрометра Hewlett Твeрдофазный пептидный синтез аналога в масштабе 100 мкмол осуществляют методом мануального твeрдофазного синтеза на синтезаторе пептидов Symphony, применяя Fmocзащищeнную амидно-МВНА смолу Ринка,Fmoc-защищeнные аминокислоты, раствор Oбензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфата (HBTU) в N,N-диметилформамиде (ДМФА) и активацию N-метилморфолином (NMM), и снятие (депротекцию)Fmoc-групп пиперидином (cтадия 1). Отщепление смолы и выделение продукта осуществляют с помощью 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола после преципитации Et2O,охлаждeнным сухим льдом (cтадия 2). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой ВЭЖХ, используя Varian (Rainin) препаративную бинарную ВЭЖХ-систему: градиентная элюция 30-55% В (0,045% TFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в CH3CN (В за 180 мин при скорости 9,5 мл/мин; Phenomenex Luna колонка 21 мм х 25 см с 10 мк фенил-гексила и УФдетектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм, получая заданный пептид с 95%-ой чистотой, как определено методом ОФ-ВЭЖХ. Твeрдофазный пептидный синтез аналога в масштабе 100 мкмол осуществляют методом мануального твeрдофазного синтеза на синтезаторе пептидов Symphony, применяя Fmocзащищeнную амидно-МВНА смолу Ринка,Fmoc-защищeнные аминокислоты, раствор Oбензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфата (HBTU) в N,N-диметилформамиде (ДМФА) и активацию N-метилморфолином (NMM), и снятие (депротекцию) Fmocгрупп пиперидином (cтадия 1). Отщепление смолы и выделение продукта осуществляют с помощью 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола после преципитации Et2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 2). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой ВЭЖХ, используя Varian (Rainin) препаративную бинарную ВЭЖХ-систему: градиентная элюция 30-55% В(В за 180 мин при скорости 9,5 мл/мин; Phenomenex Luna колонки 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила и УФ-детектор (Varian DynamaxUVD II) при 214 и 254 нм, получая заданный пептид с 95%-ой чистотой, как определено методом ОФ-ВЭЖХ. Пример 3. Получение эксендин 4(9-39)NH2. Твeрдофазный пептидный синтез аналога в масштабе 100 мкмол осуществляют методом мануального твeрдофазного синтеза на синтезаторе пептидов Symphony, применяя Fmocзащищeнную амидно-МВНА смолу Ринка, 37Fmoc-групп пиперидином (cтадия 1). Отщепление смолы и выделение продукта осуществляют с помощью 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола после преципитации Et2O,охлаждeнным сухим льдом (cтадия 2). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой ВЭЖХ, используя Varian (Rainin) препаративную бинарную ВЭЖХ-систему: градиентная элюция 30-55% В (0,045% TFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в СН 3 СN (В за 180 мин при скорости 9,5 мл/мин; Phenomenex Luna колонки 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила и УФ-детекторHis-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-GlyThr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-LeuVal-Lys-Gly-Arg-Lys(-MPA)-NH25TFA Модифицированный GLP-1-пептид синтезируют связывая аминогруппу добавляемого остаткаLys (лизина), как показано ниже на схеме. С помощью автоматического пептидного синтеза к смоле Rink Amide MBHA последовательно добавляют следующие замещенные аминокислоты: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, FmocVal-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-AlaOH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Phe-OH,FmocGlu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-AlaOH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, FmocGly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Tyr(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, FmocSer(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu) 003922(cтадия 1). Селективную депротекцию Lys(Аlос)-группы осуществляют вручную и выполняют, обрабатывая смолу раствором 3 экв. Рd(РРh3)4 в 5 млCHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5) в течение 2 ч (cтадия 2). Затем смолу отмывают СНСl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА(6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления 3-малеинимидопропионовой кислоты(cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта проводят, используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждением Et2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeннофазовой (ОФ) ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему фирмы Varian (Rainin): элюция в градиенте 30-55% В (0,045% TFA в Н 2 О(А) и 0045% TFA в CH3CN (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (Phenomenex Luna),используя УФ-детектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%,еe определяют ОФ-ВЭЖХ-масс-спектрометрией на спектрометре Hewlett Packard серии LCMS-1100,снабжeнном детектором с диодной матрицей, используя электро-спрей-ионизацию. Пример 5. Получение GLP-1(1-36)-Lys37(AEEA-AEEA-MPA)-NH25TFA;His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-GlyThr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GluGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-LeuVal-Lys-Gly-Arg-Lys(-AEEA-AEEA-MPA)NH25TFA Модифицированный GLP-1-пептид синтезируют, присоединяя аминогруппу добавляемого остатка Lys (лизина), как ниже показано на схеме. 39 Автоматическим пептидным синтезом следующие защищeнные аминокислоты последовательно присоединяют к амидно-МВНА смоле Ринка: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-ValOH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Тrp-ОН, Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, Fmoc-Ala-OH, PmocAla-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Leu-OH,FmocTyr(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, FmocSer(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,FmocGlu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(N-Trt)OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,FmocAsp(OtBu)-OH, Boc-His(N-Trt)-OH (cтадия 1). Селективную депротекцию Lys (Аlос)группы осуществляют вручную и выполняют,обрабатывая смолу раствором 3 экв. Рd(РРh3)4 в 5 мл СНСl3:NММ:НОАс (18:1:0,5) в течение 2 ч(cтадия 2). Затем смолу отмывают CHCl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления двух АЕЕА (аминоэтоксиэтоксиуксусная кислота) групп и 3 малеинимидопропионовой кислоты (cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта проводят, используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждениемEt2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeннофазовой (ОФ) ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему фирмы VarianTFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в CH3CN (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (Phenomenex Luna), используя УФдетектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%, еe определяют ОФ-ВЭЖХ-масс-спектрометрией на спектрометре Hewlett Packard серии LCMS1100, снабжeнном детектором с диодной матрицей, используя электро-спрей-ионизацию, ESIMS m/z для С 174 Н 265N44 О 56 (MН+), вычислено 3868, найдено [М+H2]2+ 1934, [М+Н 3]3+ 1290,[M+H4]4+ 967. Пример 6. Получение GLP-1(7-36)-Lys37(MPA)-NH24TFA;Lys (лизинового) остатка, как описано ниже. Используя автоматический синтез пептидов к амидно-МВНА смоле Ринка последовательно присоединяют следующие защищeнные(cтадия 2). Затем смолу отмывают СНСl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления 3-малеинимидопропионовой кислоты (cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта проводят, используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждением Et2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему фирмы Varian (Rainin): элюция в градиенте 30-55% В (0,045% TFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в CH3CN (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (PhenomenexUVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%, е определяют ОФ-ВЭЖХ-массспектрометрией на спектрометре Hewlett Packard серии LCMS-1100, снабжeнном детектором с диодной матрицей, используя электро-спрейионизацию. Пример 7. Получение GLP-1(7-36)-Lys37(AEEA-AEEA-MPA)-NH24TFA;His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-ValSer-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-GluPhe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(AEEA-AEEA-MPA)-NH24TFA Модифицированный GLP-1-пептид синтезируют, присоединяя -N-конец добавляемого остатка Lys (лизина), как описано ниже. Используя автоматический пептидный синтез, к амидно-МВНА смоле Ринка последовательно добавляют Fmoc-Lys(Aloc)-OH, FmocArg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(tBoc)OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH,Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(tBoc)-OH, FmocAla-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-LeuOH, Fmoc-Tyr(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,FmocAsp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc 41(cтадия 2). Затем смолу отмывают СНСl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления двух АЕЕА (аминоэтоксиэтоксиуксусная кислота) групп и 3 малеинимидопропионовой кислоты (cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта проводят, используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждениемEt2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeннофазовой (ОФ) ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему фирмы VarianTFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в CH3CN (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (Phenomenex Luna), используя УФдетектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%, еe определяют ОФ-ВЭЖХ-масс-спектрометрией на спектрометре Hewlett Packard серии LCMS1100, снабжeнном детектором с диодной матрицей, используя электро-спрей-ионизацию. Пример 8. Получение D-Ala8 GLP-1(7-36)37D-Ala8 GLP-1(7-36)амид синтезируют, как показано ниже на схеме. А. Получение D-Ala8 GLP-1(7-36)амида. Твердофазный пептидный синтез GLP-1 аналога в масштабе 100 мкмол осуществляют методом мануального твердофазного синтеза на синтезаторе пептидов Symphony, применяяFmoc-групп пиперидином (cтадия 1). Отщепление смолы и выделение продукта осуществляют с помощью 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола после преципитации Et2O,охлаждeнным сухим льдом (cтадия 2). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой ВЭЖХ, используя Varian (Rainin) препаративную бинарную ВЭЖХ-систему: градиентная элюция 30-55% В (0,045% TFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в СH3 СN (В за 180 мин при скорости 9,5 мл/мин; Phenomenex Luna колонки 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила и УФ-детектор(Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм,получая заданный пептид с 95%-ой чистотой,как определено методом ОФ-ВЭЖХ. Модифицированный пептид GLP-1 синтезируют, присоединяя -N-конец добавляемого остатка Lys (лизина), как схематически показано ниже. В. Получение D-Ala8 GLP-1 (7-36)-Lуs37(МРА)амида. Используя автоматический пептидный синтез, к амидно-МВНА смоле Ринка последовательно добавляют следующие аминокислоты: 43 Селективную депротекцию Lys (Аlос)-группы осуществляют вручную и выполняют, обрабатывая смолу раствором 3 экв. Pd(PPh3)4 в 5 млCHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5) в течение 2 ч (cтадия 2). Затем смолу отмывают CHCl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА(6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления 3-малеинимидо-пропионовой кислоты(cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта проводят, используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждением Et2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeннофазовой (ОФ) ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему фирмы Varian (Rainin): элюция в градиенте 30-55% В (0,045% TFA в Н 2 О(А) и 0,045% TFA в CH3CN (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (Phenomenex Luna),используя УФ-детектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%,е определяют ОФ-ВЭЖХ-масс-спектрометрией на спектрометре Hewlett Packard серии LCMS-1100,снабжeнном детектором с диодной матрицей, используя электро-спрей-ионизацию. Пример 9. Получение D-Ala8 GLP-1(7-36)Lys37(-AEEA-AEEA-MPA)-NH24TFA;His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-AspVal-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-LysGlu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(AEEA-AEEA-MPA)-NH24TFA Модифицированный пептид GLP-1 синтезируют, присоединяя -N-конец добавляемого остатка Lys (лизина), как схематически изображено ниже. Используя автоматический пептидный синтез, к амидно-МВНА смоле Ринка добавляют последовательно Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc 003922(cтадия 2). Затем смолу отмывают СНСl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления двух АЕЕА (аминоэтоксиэтоксиуксусная кислота) групп и 3 малеинимидопропионовой кислоты (cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта проводят, используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждениемEt2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeннофазовой (ОФ) ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему фирмы VarianTFA в H2O (А) и 0,045% TFA в СН 3 СN (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (Phenomenex Luna), используя УФдетектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%, еe определяют ОФ-ВЭЖХ-масс-спектрометрией на спектрометре Hewlett Packard серии LCMS1100, снабжeнном детектором с диодной матрицей, используя электро-спрей-ионизацию. Пример 10. Получение эксендин-4(1-39)Lys40(-MPA)-NH2;His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-LeuSer-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-LeuPhe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-SerSer-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(-MPA)NH25TFA Эксендин-4 синтезируют, как схематически показано ниже. А. Получение эксендина-4. 45 Твердофазный пептидный синтез эксендина-4 в масштабе 100 мкмол осуществляют методом мануального твердофазного синтеза на пептидном синтезаторе Symphony, используя Fmocзащищенную амидно-МВНА смолу Ринка. К смоле последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:(ДМФА) и, согласно данной последовательности активируют, используя O-бензотриазол-1 ил-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфат (HBTU) и диизопропилэтиламин (DIEA).Fmoc-защитную группу удаляют раствором 20%(cтадия 1). Отщепление смолы и выделение продукта осуществляют с помощью 85%TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола после преципитации Et2O, охлаждeнным сухим льдом(cтадия 2). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой ВЭЖХ, используя VarianTFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в CH3CN (В за 180 мин при скорости 9,5 мл/мин; PhenomenexLuna колонки 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила и УФ-детектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм, получая заданный пептид с 95%-ой чистотой, как определено методом ОФ-ВЭЖХ. В. Получение модифицированного эксендина-4(SEQ ID NО:18). Модифицированный эксендин-4-пептид синтезируют, присоединяя -N-конец добавляемого Lys (лизина) остатка, как схематически показано ниже. Используя автоматический пептидный синтез, к амидно-МВНА смоле Ринка последовательно добавляют Fmoc-Lys(Aloc)-OH, FmocSer(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, FmocPro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-SerOH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, FmocGly-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-TrpOH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, FmocPhe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Bpf)-OH,Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,FmocLys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, FmocThr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-GlyOH, Boc-His(Trt)-OH (cтадия 1). Селективную депротекцию Lys (Аlос)группы осуществляют вручную и выполняют,обрабатывая смолу раствором 3 экв. Рd(РРh3)4 в 5 мл CHCl3:NMM:HOAc (18:1:0,5) в течение 2 ч(cтадия 2). Затем смолу отмывают CHCl, (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления 3-малеинимидопропионовой кислоты (cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта проводят, используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждением Et2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ,используя препаративную бинарную ВЭЖХсистему фирмы Varian (Rainin): элюция в градиенте 30-55% В (0,045% TFA в H2O (А) и 0,045%TFA в СН 3 СН (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (Phenomenex Luna), используя УФ-детектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%,еe определяют ОФ-ВЭЖХ-масс 47 спектрометрией на спектрометре Hewlett Packard серии LCMS-1100, снабжeнном детектором с диодной матрицей, используя электро-спрейионизацию. Пример 11. Получение модифицированного эксендина-4(1-39)-Lуs40(-АЕЕА-АЕЕАМРА)-NH25TFA;His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-LeuSer-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-LeuPhe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-SerSer-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(-AEEA-AEEAMPA)-NH25TFA Модифицированный эксендин-4-пептид синтезируют, присоединяя -N-конец добавляемого остатка Lys (лизина), как схематически показано ниже. С помощью автоматического пептидного синтеза к амидно-МВНА смоле Ринка добавляют последовательно следующие защищенные аминокислоты:(cтадия 2). Затем смолу отмывают СНСl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления двух АЕЕА (аминоэтоксиэтоксиуксусная кислота) групп и 3 малеинимидопропионовой кислоты (cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта проводят, используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждениемEt2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeннофазовой (ОФ) ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему фирмы VarianTFA в Н 2O (А) и 0,045% TFA в СН 3 СN (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (Phenomenex Luna), используя УФдетектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%, еe определяют ОФ-ВЭЖХ-масс-спектрометрией на спектрометре Hewlett Packard серии LCMS1100, снабжeнном детектором с диодной матрицей, используя электро-спрей-ионизацию. Пример 12. Получение эксендина-3(1-39)Lys40(-MPA)-NH25TFA; Твердофазный пептидный синтез эксендина-3 в масштабе 100 мкмол осуществляют, применяя мануальный твердофазный синтез и синтезатор пептидов Symphony на Fmocзащищенной амидно-МВНА смоле Ринка. К смоле последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:(стадия 1). Отщепление смолы и выделение продукта осуществляют с помощью 85%TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола после преципитации Et2O, охлажденным сухим льдом(стадия 2). Продукт очищают препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ, используя VarianTFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в CH3CN (В за 180 мин при скорости 9,5 мл/мин; PhenomenexLuna колонки 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила и УФ-детектор (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм, получая заданный пептид с 95%-ой чистотой, как определено методом ОФ-ВЭЖХ. В. Получение модифицированного эксендина-3. Используя автоматический пептидный синтез, к амидно-МВНА смоле Ринка последовательно добавляют защищенные аминокислоты(cтадия 2). Затем смолу отмывают СНСl3 (6 х 5 50 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления 3-малеинимидопропионовой кислоты (cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта проводят, используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждением Et2O, охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему фирмы Varian (Rainin): элюция в градиенте 30-55% В (0,045% TFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в CH3CN (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (PhenomenexUVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%, е определяют ОФ-ВЭЖХ-массспектрометрией на спектрометре Hewlett Packard серии LCMS-1100, снабжeнном детектором с диодной матрицей, используя электро-спрейионизацию. Пример 13. Получение эксендина-3(1-39)Lys40(-AEEA-AEEA-MPA)-NH25TFA;His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-LeuSer-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-LeuPhe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-SerSer-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(-AEEA-AEEAMPA)-NH25TFA Модифицированный пептид эксендин-3 синтезируют, присоединяя -N-конец добавляемого остатка Lys (лизина), как описано ниже. Используя автоматический пептидный синтез, к амидно-МВНА смоле Ринка последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:(cтадия 2). Затем смолу отмывают СНСl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). Затем синтез снова автоматизируют для добавления двух АЕЕА (аминоэтоксиэтоксиуксусная кислота) групп и 3-малеинимидопропионовой кислоты (cтадия 3). Отщеп 51 ление смолы и выделение продукта проводят,используя 85% TFA/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола с последующим осаждением Et2O,охлаждeнным сухим льдом (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой(ОФ) ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему фирмы Varian (Rainin): элюция в градиенте 30-55% В (0,045% TFA в Н 2 О (А) и 0,045% TFA в CH3CN (В в течение 180 мин при скорости потока 9,5 мл/мин, на колонке 21 мм х 25 см с 10 мк фенилгексила (Phenomenex Luna), используя УФ-детектор (VarianDynamax UVD II) при 214 и 254 нм. Продукт имеет чистоту 95%, еe определяют ОФ-ВЭЖХмасс-спектрометрией на спектрометре Hewlett Твeрдофазный пептидный синтез ДАС:GLР-1-аналога в масштабе 100 мкмол осуществляют вручную и на синтезаторе пептидов Symphony, применяя Fmoc-защищeнную амидно-МВНА смолу Ринка. Следующие защищeнные аминокислоты последовательно добавляют к смоле:(cтадия 2). Смолу затем отмывают СНСl3 (6 х 5 мл), 20% НОАс в ДСМ (6 х 5 мл), ДСМ (6 х 5 мл) и ДМФА (6 х 5 мл). Синтез затем снова автоматизируют для добавления 3 малеинимидопропионовой кислоты (cтадия 3). Отщепление смолы и выделение продукта осуществляют с помощью 86% TFA/5% TIS/5% Н 2 О/2% тиоанизола и 2% фенола с последующей преципитацией охлаждeнным сухим льдомEt2O (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой ВЭЖХ, используя препаративную бинарную ВЭЖХ-систему Varian(Rainin) на колонке Dynamax C18, 60A, 8 мкм 21 мм х 25 см, снабжeнной Dynamax C18, 60A, защитным модулем 8 мкм, 21 мм х 25 см колонкой и УФ-детектором (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм, получая заданный ДАС с чистотой 95%, что показано ОФ-ВЭЖХ. 53 Пример 15. Получение GLP-1(7-36)-EDAMPA. Твeрдофазный пептидный синтез модифицированного GLP-1-аналога в масштабе 100 мкмол осуществляют вручную и на синтезаторе пептидов Symphony SASRIN (сверхчувствительная к кислоте смола). Следующие защищeнные аминокислоты последовательно добавляют к смоле: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-LeuOH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-IleOH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, FmocLys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,FmcoGlu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(tBu)-OH,FmocSer(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,FmocGlu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(Trt)-OH. Их растворяют в N,N-диметилформамиде(cтадия 1). Полностью защищeнный пептид отщепляют от смолы обработкой 1% TFA/DCM(cтадия 2). Затем к свободному С-концу последовательно добавляют этилендиамин и 3 малеинимидопропионовую кислоту (cтадия 3). Затем защитные группы отщепляют и продукт выделяют используя 86% TFA/5% TIS/5%H2O/2% тиоанизола и 2% фенола с последующей преципитацией охлажднным сухим льдомEt2O (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой ВЭЖХ, используя Varian (Rainin) препаративную бинарную ВЭЖХсистему с помощью Dynamax С 18, 60A, 8 мкм,21 мм х 25 см колонки, снабжeнной DynamaxC18, 60 А, с 8 мкм защитным модулем, 21 мм х 25 см колонкой и УФ-детектором (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм, получая заданный ДАС 95% чистоты, по данным ОФВЭЖХ. Пример 16. Получение эксендин-4(1-39)ЕDА-МРА. Ниже схематически иллюстрируется синтез эксендин-4(1-39)-ЕDА-МРА. Твeрдофазный пептидный синтез модифицированного аналога эксендина-4 в масштабе 100 мкмол осуществляют вручную и на Symphony синтезаторе пептидов SASRIN (сверхкислоточувствительная смола). Следующие защищeнные аминокислоты последовательно добавляют к смоле: Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,FmocSer(tBu)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,FmocLys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-PheOH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, FmocVal-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,FmocLys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, FmocThr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-GlyOH, Boc-His(Trt)-OH. Их растворяют в N,N-диметилформамиде(cтадия 1). Полностью защищeнный пептид отщепляют от смолы обработкой 1% TFA/DCM(cтадия 2). Затем к свободному С-концу последовательно добавляют этилендиамин и 3 малеинимидопропионовую кислоту (cтадия 3). Затем защитные группы отщепляют и продукт выделяют используя 86% TFA/5% TIS/5% 55 Н 2 О/2% тиоанизола и 2% фенола с последующей преципитацией охлажднным сухим льдомEt2O (cтадия 4). Продукт очищают препаративной обращeнно-фазовой ВЭЖХ, используя Varian (Rainin) препаративную бинарную ВЭЖХсистему с помощью Dynamax С 18, 60 А, 8 мкм,21 мм х 25 см колонки, снабжeнной Dynamax С 18, 60 А, с 8 мкм защитным модулем, 21 мм х 25 см колонкой и УФ-детектором (Varian Dynamax UVD II) при 214 и 254 нм, получая заданный ДАС 95% чистоты, по данным ОФВЭЖХ. Перечень последовательностей ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Модифицированный инсулинотропный пептид или его дериват, содержащий малеинимидную группу, которая реагирует с тиольными группами компонентов крови, образуя устойчивую ковалентную связь. 2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что дериват является реакционноспособным в отношении тиольной группы альбумина человеческой сыворотки. 3. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:15. 4. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQID NO:21 и SEQ ID NO:22. 5. Композиция для лечения диабета у человека, содержащая дериват инсулинотропного