Нерастворимые инсулинсодержащие композиции, способы их получения, суспензионный препарат, способ лечения диабета и гипергликемии
Формула / Реферат
1. Нерастворимая композиция, содержащая
a) белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналог инсулина и проинсулин;
b) производный белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, ацилированный жирной кислотой, аналоги инсулина, ацилированного жирной кислотой, и проинсулин, ацилированный жирной кислотой;
c) комплексообразующее соединение;
d) стабилизатор гексамера; и
e) катион двухвалентного металла.
2. Композиция по п.1, которая является аморфным осадком.
3. Композиция по п.1, которая является микрокристаллом.
4. Композиция по п.3, в которой микрокристалл имеет палочкообразную морфологию.
5. Композиция по п.3, в которой микрокристалл имеет неупорядоченную морфологию.
6. Композиция по п.1, в которой комплексообразующее соединение является протамином, стабилизатор гексамера является фенольным консервантом и катион двухвалентного металла является цинком.
7. Композиция по п.1, в которой производный белок моноацилирован в положении Lys-Ne -аминогруппы.
8. Композиция по п.7, в которой комплексообразующее соединение является протамином и присутствует в количестве от около 0,15 до около 0,5 мг на 3,5 мг общего белка.
9. Композиция по п.8, в которой катион двухвалентного металла является цинком и присутствует в количестве от около 0,3 до около 0,7 моля на моль общего белка.
10. Композиция по п.9, в которой стабилизатор гексамера является фенольным консервантом, выбираемым из группы, включающей фенол, м-крезол, о-крезол, п-крезол, хлоркрезол, метилпарабен и их смеси, и присутствует в отношении, равном, по крайней мере, 3 молям фенольного консерванта на 6 молей общего белка.
11. Композиция по п.10, в которой белок выбирают из группы, включающей инсулин и аналоги инсулина.
12. Композиция по п.11, в которой белок является инсулином.
13. Композиция по п.12, в которой производный белок является инсулином, моноацилированным в положении LysB29-Ne -аминогруппы.
14. Композиция по п.13, в которой производный белок является инсулином, ацилированным насыщенной жирной кислотой с прямой цепью.
15. Композиция по п.14, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-гексановую кислоту, н-гептановую кислоту, н-октановую кислоту, н-нонановую кислоту и н-декановую кислоту.
16. Композиция по п.15, в которой молярное отношение белка к производному белку составляет от около 1:9 до около 9:1.
17. Композиция по п.16, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-гексановую кислоту, н-октановую кислоту и н-декановую кислоту.
18. Композиция по п.17, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-октановую кислоту и н-декановую кислоту.
19. Композиция по п.18, в которой насыщенная жирная кислота с прямой цепью является н-октановой кислотой.
20. Композиция по п.19, в которой молярное отношение белка к производному белку составляет от около 1:3 до около 3:1.
21. Композиция по п.17, в которой молярное отношение белка к производному белку составляет от около 1:9 до около 1:1.
22. Композиция по п.11, в которой белок является аналогом инсулина.
23. Композиция по п.22, в которой белок является аналогом LysB28,ProB29-инсулина человека.
24. Композиция по п.22, в которой белок является аналогом AspB28-инсулина человека.
25. Композиция по п.1, в которой производный белок является инсулином, моноацилированным в положении LysB29-Ne -аминогруппы насыщенной жирной кислотой с прямой цепью.
26. Композиция по п.25, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-гексановую кислоту, н-гептановую кислоту, н-октановую кислоту, н-нонановую кислоту и н-декановую кислоту.
27. Композиция по п.26, в которой производный белок выбирают из группы, включающей B29-Ne -гексаноилинсулин человека, B29-Ne -октаноилинсулин человека и B29-Ne -деканоилинсулин человека.
28. Композиция по п.25, в которой насыщенную жирную кислоту с прямой цепью выбирают из группы, включающей н-додекановую кислоту, н-тетрадекановую кислоту и н-гексадекановую кислоту.
29. Композиция по п.1, в которой производный белок диацилирован в положении Lys-Ne -аминогруппы и ацилирован в положении одной N-концевой Na -аминогруппы и в которой жирную кислоту выбирают из группы, включающей н-гексановую кислоту, н-гептановую кислоту, н-октановую кислоту, н-нонановую кислоту и н-декановую кислоту.
30. Композиция по п.1, в которой производный белок ацилирован насыщенной жирной кислотой с разветвленной цепью.
31. Композиция по п.30, в которой производный белок ацилирован насыщенной жирной кислотой с разветвленной цепью, имеющей от трех до десяти атомов углерода в наибольшей цепи.
32. Композиция по п.1, в которой производный белок является аналогом инсулина, моноацилированным в положении Lys-Ne -аминогруппы насыщенной жирной кислотой с прямой цепью.
33. Композиция по п.32, в которой жирную кислоту выбирают из группы, включающей н-гексановую кислоту, н-гептановую кислоту, н-октановую кислоту, н-нонановую кислоту и н-декановую кислоту.
34. Композиция по п.32, в которой производный белок является аналогом инсулина, моноацилированным в положении Ne -аминогруппы жирной кислотой, выбираемой из группы, включающей н-додекановую кислоту, н-тетрадекановую кислоту и н-гексадекановую кислоту.
35. Композиция по п.32, в которой производный белок выбирают из группы, включающей инсулины животных, ацилированные жирной кислотой, аналоги мономерного инсулина, ацилированного жирной кислотой, делеционные аналоги, ацилированные жирной кислотой, и аналоги инсулина со сдвигом pI, ацилированного жирной кислотой.
36. Композиция по п.35, в которой производный белок является аналогом дес(B30)инсулина человека, ацилированного жирной кислотой, аналогом LysB28,ProB29-инсулина человека, ацилированного жирной кислотой, или аналогом AspB28-инсулина человека, ацилированного жирной кислотой.
37. Композиция по п.36, в которой производный белок является аналогом дес(B30)инсулина человека, ацилированного жирной кислотой.
38. Композиция по п.37, в которой производный белок является аналогом B29-Ne -миристоил-дес(B30)инсулина человека.
39. Композиция по п.36, в которой производный белок является аналогом LysB28, ProB29-инсулина человека, ацилированного жирной кислотой.
40. Композиция по п.39, в которой производный белок является аналогом B28-Ne -миристоил-LysB28,ProB29-инсулина человека.
41. Композиция по п.36, в которой производный белок является аналогом AspB28-инсулина человека, ацилированного жирной кислотой .
42. Композиция по п.1, в которой молярное отношение белка к производному белку составляет от около 1:9 до около 9:1.
43. Композиция по п.42, в которой молярное отношение составляет от около 1:3 до около 3:1.
44. Композиция по п.42, в которой молярное отношение составляет от около 1:9 до около 1:1.
45. Композиция по п.1, в которой белок является инсулином.
46. Композиция по п.1, в которой белок является аналогом инсулина.
47. Композиция по п.46, в которой белок является аналогом мономерного инсулина.
48. Суспензионный препарат, содержащий нерастворимую фазу и фазу раствора, в котором нерастворимая фаза включает нерастворимую композицию по п.1 и фаза раствора включает водный растворитель.
49. Суспензионный препарат по п.48, в котором фаза раствора дополнительно включает фенольный консервант в концентрации от около 0,5 до около 6 мг на мл раствора, фармацевтически приемлемый буфер и изотонический агент.
50. Суспензионный препарат по п.48, в котором фаза раствора дополнительно включрхт инсулин, аналог инсулина, производный инсулин или аналог производного инсулина.
51. Суспензионный препарат по п.50, в котором фаза раствора включает инсулин.
52. Суспензионный препарат по п.50, в котором фаза раствора включает производный инсулин.
53. Суспензионный препарат по п.50, в котором фаза раствора включает аналог инсулина.
54. Суспензионный препарат по п.50, в котором аналог инсулина является аналогом мономерного инсулина.
55. Суспензионный препарат по п.50, в котором аналог инсулина является аналогом LysB28,ProB29-инсулина человека.
56. Суспензионный препарат по п.50, в котором аналог инсулина является аналогом AspB28-инсулина человека.
57. Суспензионный препарат по п.48, в котором фаза раствора включает белок, выбираемый из инсулина и аналогов инсулина, и производный белок, выбираемый из инсулина, ацилированного жирной кислотой, и аналогов инсулина, ацилированного жирной кислотой.
58. Суспензионный препарат по п.57, в котором белок в фазе раствора аналогичен белку в нерастворимой фазе и в котором производный белок в фазе раствора аналогичен производному белку в нерастворимой фазе.
59. Суспензионный препарат по п.48, в котором нерастворимая фаза состоит, в основном, из аморфного осадка.
60. Суспензионный препарат по п.48, в котором нерастворимая фаза состоит, в основном, из микрокристаллов.
61. Суспензионный препарат по п.48, в котором нерастворимая фаза состоит из смеси аморфного осадка и микрокристаллов.
62. Суспензионный препарат по п.48, в котором фаза раствора дополнительно включает цинк и протамин, отношение цинка к общему белку составляет от около 5 до около 7 молей атомов цинка на моль общего белка и отношение протамина к общему белку составляет от около 0,25 до около 0,5 мг на мг общего белка.
63. Способ лечения диабета, который заключается в том, что нуждающемуся субъекту вводят композицию по п.1 в количестве, достаточном для регулирования содержания глюкозы в крови указанного субъекта.
64. Способ лечения гипергликемии, который заключается в том, что нуждающемуся субъекту вводят препарат по п.48 в количестве, достаточном для регулирования содержания глюкозы в крови указанного субъекта.
65. Композиция на основе гибридных гексамеров, содержащая шесть мономеров и цинк, в которой, по крайней мере, один мономер выбирают из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины, и, по крайней мере, один мономер выбирают из группы, включающей инсулин, ацилированный жирной кислотой, аналоги инсулина, ацилированного жирной кислотой, и проинсулины, ацилированные жирной кислотой.
66. Композиция на основе смешанных гексамеров, содержащая гексамеры цинка и белка, гексамеры цинка и производного белка, в которой гексамеры цинка и белка состоят из цинка и белка, выбираемого из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины, и гексамеры цинка и производного белка состоят из цинка и производного белка, выбираемого из группы, включающей инсулин, ацилированный жирной кислотой, аналоги инсулина, ацилированного жирной кислотой, и проинсулины, ацилированные жирной кислотой.
67. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что
a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем pH, способствующим образованию гексамеров, и
b) добавляют комплексообразующее соединение.
68. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что
a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем pH, препятствующим образованию гексамеров, и
b) доводят показатель pH до величины от около 6,8 до около 7,8; и
c) добавляют комплексообразующее соединение.
69. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что
a) белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем pH, способствующим образованию гексамеров;
b) белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют отдельно в водном растворителе с показателем pH, способствующим образованию гексамеров;
c) растворы, полученные на стадиях a) и b), тщательно смешивают; и
d) к раствору, полученному на стадии c), добавляют комплексообразующее соединение.
70. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что
a) белок, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем pH, при котором не происходит осаждения;
b) белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют отдельно в водном растворителе, дающем раствор с показателем pH, при котором не происходит осаждения;
c) растворы, полученные на стадиях a) и b), тщательно смешивают; и
d) показатель pH раствора, полученного на стадии c), доводят до значения, при котором происходит осаждение.
71. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что
a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем pH, при котором не происходит осаждения; и
b) показатель pH раствора, полученного на стадии a), доводят до значения, при котором происходит осаждение.
72. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что
a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем pH, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;
b) добавляют комплексообразующее соединение; и
c) показатель pH раствора, полученного на стадии b), доводят до значения, при котором происходит осаждение.
73. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что
a) белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем pH, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;
b) белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют отдельно в водном растворителе, дающем раствор с показателем pH, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;
c) растворы, полученные на стадиях a) и b), тщательно смешивают;
d) к раствору, полученному на стадии c), добавляют комплексообразующее соединение; и
e) показатель pH раствора, полученного на стадии d), доводят до значения, при котором происходит осаждение.
74. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что
a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем pH, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;
b) показатель pH раствора, полученного на стадии a), доводят до значения, при котором происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения; и
c) к раствору, полученному на стадии b), добавляют комплексообразующее соединение.
75. Способ получения нерастворимой композиции по п.1, который заключается в том, что
a) белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем pH, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;
b) белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют отдельно в водном растворителе, дающхь раствор с показателем pH, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения;
c) растворы, полученные на стадиях a) и b), тщательно смешивают;
d) показатель pH раствора, полученного на стадии c), доводят до значения, при котором происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения; и
e) к раствору, полученному на стадии d), добавляют комплексообразующее соединение.
76. Способ получения гибридных гексамеров, который заключается в том, что белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем pH, способствующим образованию гексамеров.
77. Способ получения гибридных гексамеров, который заключается в том, что
a) белок, белок, ацилированный жирной кислотой, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем pH, препятствующим образованию гексамеров; и
b) показатель pH доводят до значения от около 6,8 до около 7,8.
Текст
1 Предпосылки изобретения Область техники Это изобретение относится к области медицины. В частности, это изобретение относится к фармакотерапии таких болезней, как диабет и гипергликемия. Описание предшествующего уровня техники На протяжении длительного времени целью инсулинотерапии является имитация схемы секреции эндогенного инсулина у здорового человека. Дневная физиологическая потребность в инсулине колеблется и может быть разделена на две фазы: (а) фаза всасывания, требующая поступления инсулина для удаления избытка глюкозы в крови во время приема пищи, и (b) фаза после всасывания, требующая пролонгированного поступления инсулина для регулирования уровня глюкозы, секретируемой печенью, с целью сохранения оптимальной концентрации глюкозы в крови в период между приемами пищи. Из вышеизложенного следует, что эффективное лечение людей, страдающих диабетом,обычно включает комбинированное применение препаратов экзогенного инсулина двух типов: инсулин быстрого действия, вводимый во время приема пищи в виде инъекции ударной дозы вещества, и так называемый основной инсулин пролонгированного действия, вводимый в виде инъекции 1 или 2 раза в день для регулирования содержания глюкозы в крови между приемами пищи. Идеальный основной инсулин обеспечивает продолжительное и "ровное" действие в течение длительного времени, то есть он регулирует содержание глюкозы в крови в течение,по крайней мере, 12 ч и предпочтительно в течение 24 ч или более без существенного риска возникновения гипогликемии. Кроме того, идеальный основной инсулин должен смешиваться с растворимым инсулином, вводимым во время приема пищи, и не должен вызывать раздражения или реакции в месте введения. И, наконец,основной инсулин должен иметь такую структуру, чтобы его можно было легко и однородно суспендировать перед введением. Как должно быть понятно специалистам в этой области, препараты инсулина пролонгированного действия получают из обычного инсулина в виде микрокристаллических суспензий для подкожных инъекций. Примерами коммерческих препаратов основного инсулина являются инсулин NPH (с нейтральным протамином Хейгдорна), комплекс инсулина с протамином и цинком (PZI) и ультралент (UL). Первоначальные варианты современного коммерческого инсулина NPH, содержащего избыток протамина, были созданы в 1930-х годах Скоттом и др. [Scott, et al., J. Pharmacol. Exp.NPH, который, помимо усваиваемых количеств инсулина и протамина, содержал цинк. Эти исследователи обнаружили, что при смешивании инсулина и протамина в так называемых усваиваемых пропорциях при нейтральном показателе рН в присутствии цинка и фенольного соединения образуется аморфный осадок, который после выстаивания превращается в продолговатые, тетрагональные кристаллы с концами пирамидальной формы. Эти кристаллы охарактеризованы как палочкообразные кристаллы. Установлено, что усваиваемое соотношение инсулина и протамина составляет около 0,09 мг сульфата протамина на мг инсулина. Цинк необходим в количестве, по крайней мере, около 3,5 мкг на мг инсулина, и концентрация фенольного соединения превышает примерно 0,1%. Инсулин NPH является наиболее широко применяемым инсулиновым препаратом, и на его долю приходится от 50 до 70% мирового потребления инсулина. Этот препарат представляет собой суспензию микрикристаллического комплекса инсулина, цинка, протамина и одного или нескольких фенольных консервантов. Выпускаемые промышленностью препараты инсулина NPH содержат инсулин человека, свиньи,крупного рогатого скота или их смеси. Кроме того, в этой области известны NPH-подобные препараты на основе аналога мономерного инсулина и аналога LysB28, РrоВ 29-инсулина человека [определяемые здесь как "NPL": De Felippis, M.R., патент США 5461031, выданный 24 октября 1995 г.; De Felippis, M.R., патент США 5650486, выданный 22 июля 1997 г.; иDe Felippis, M.R., патент США 5747642, выданный 5 мая 1998 г.]. Общепризнанным фактом является то, что инсулин NPH обеспечивает более длительное регулирование концентрации глюкозы в крови по сравнению с обычным инсулином, так как этот инсулин должен сначала раствориться из микрокристаллов инсулинаNPH, прежде чем он поступит в кровь. Обычный инсулин не должен растворяться перед поступлением в кровь. Скорость растворения инсулина NPH является измеряемым показателем при определении его фармакодинамики и фармакокинетики. Микрокристаллы инсулина NPH имеют выраженную палочкообразную морфологию и типичные размеры, в частности длину около 5 мкм, толщину 1 мкм и ширину 1 мкм. Пролонгированное действие микрокристаллов инсулина NPH является следствием их медленного всасывания в месте подкожной инъекции. Лечение производимыми в настоящее время препаратами инсулина NPH не обеспечивает идеально "ровной" фармакокинетики, необходимой для сохранения оптимальной концентрации глюкозы в крови между приемами пищи в течение продолжительного времени. Поэтому лечение инсулином NPH может привести к не 3 желательно высоким уровням инсулина в крови,которые могут стать причиной возникновения опасной для жизни гипогликемии. Помимо того, что инсулин NPH не обеспечивает идеально ровного фармакокинетического профиля, продолжительность действия инсулина NPH также не является идеальной. В частности, основную проблему при лечении NPH вызывает "феномен пробуждения", который представляет собой гипергликемию, возникающую из-за недостаточно эффективного регулирования концентрации глюкозы во время сна субъекта. Эти недостатки, связанные с регулированием сахара, являются причиной серьезных долговременных осложнений диабета, вызывают существенные неудобства и снижают качество жизни нуждающегося субъекта. Состав препарата на основе протамина,цинка и инсулина (PZI) подобен NPH, но этот инсулин содержит большие количества протамина и цинка, чем NPH. Препараты PZI могут быть получены в виде аморфных осадков промежуточного действия или кристаллического вещества пролонгированного действия. ОднакоPZI не является идеальным фармацевтическим препаратом основного инсулина, так как он не смешивается с растворимым инсулином во время приема пищи, и высокое содержание цинка и протамина может вызывать раздражение или реакцию в месте введения. Инсулин человека "ультралент" представляет собой микрокристаллический препарат инсулина с более высоким содержанием цинка, чем у NPH, микрокристаллы которого не содержат протамин или фенольный консервант. Препараты инсулина человека "ультралент" характеризуются средней продолжительностью действия, которое не является достаточно ровным, и не образуют устойчивых смесей с инсулином. Кроме того,они плохо повторно суспендируются. Были предприняты попытки устранить недостатки известных суспензий инсулина. С этой целью была исследована способность инсулинов, ацилированных жирной кислотой, регулировать содержание глюкозы в крови [Havelund,S., et al., публикация WIPO WO 95/07931 от 23 марта 1995 г.]. Пролонгированное действие этих препаратов обусловлено тем, что ацильная часть жирной кислоты этих молекул связывается с сывороточным альбумином. Длина ацильной цепи жирной кислоты этих молекул обеспечивает связывание жирной кислоты с сывороточным альбумином. Цепи жирных кислот, используемых в инсулинах, ацилированных жирными кислотами, обычно содержат больше десяти атомов углерода, причем цепи длиной четырнадцать и шестнадцать атомов углерода являются оптимальными для связывания с сывороточным альбумином и увеличения срока действия препарата. В отличие от инсулина NPH, который является нерастворимым, вышеуказанные инсули 003394 4 ны, ацилированные жирными кислотами, растворимы при обычных терапевтических концентрациях инсулина. Однако действие этих препаратов является недостаточно продолжительным или недостаточно ровным для идеального регулирования содержания основного инсулина, и они являются менее эффективными, чем инсулин, что требует введения больших количеств лекарственного средства [Radziuk, J., et al., Diabetologia 41:116-120, 489-490 (1998)].Whittingham, J.L., et al. [Biochemistry,36:2826-2831 (1997)] кристаллизовали аналог В 29-N-тетрадеканоил-дес(В 30)-инсулина человека в виде гексамерного комплекса с цинком и фенолом для выполнения структурного исследования при помощи рентгеновской кристаллографии. Установлено, что этот гексамер имеет конформацию R6 и обладает определенными свойствами, отличающими его от гексамеров инсулина человека. Whittingham et al. не дали описания фармацевтических или фармакологических свойств полученных кристаллов и не указали, обладают ли такие кристаллы какимилибо полезными свойствами для лечения диабета или гипергликемии. В описании, представленном Whittingham и др., нет четкого определения того, можно ли получить содержащие протамин кристаллы типа NPH из производных инсулинов и аналогов инсулина и каковы фармакокинетические или фармакодинамические характеристики таких кристаллов. Таким образом, по-прежнему необходимы препараты инсулина, которые обладают более ровным и продолжительным действием, чем инсулин NPH, смешиваются с растворимыми инсулинами, вводимыми во время приема пищи,могут быть легко ресуспендированы и не вызывают раздражения или реакции в месте введения. Заявитель установил, что эти свойства присущи нерастворимым композициям, содержащим производный белок, непроизводный белок,цинк, протамин и фенольный консервант. Кроме того, такие нерастворимые композиции позволяют гибко регулировать продолжительность и форму профиля глюкодинамической реакции. Эти композиции считаются композициями с регулируемым высвобождением, в которых скорость высвобождения регулируется пропорцией и характером производного белка. Таким образом, одной целью настоящего изобретения является нерастворимая композиция, содержащая непроизводный белок, производный белок, комплексообразующее соединение, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла. Далее будут описаны другие цели этого изобретения, относящиеся к получению и применению таких композиций. Заявителю не известны примеры смесей производных и непроизводных инсулинов в том значении, которое станет очевидным из настоящего описания изобретения. Известны кристаллы, состоящие из проинсулина и инсулина [Steiner, D.F., 5Nature 243:528-530 (1973); Low, В.W., et al.,Nature 248:339-340 (1974)], и кристаллы, состоящие из инсулина или аналога инсулина,имеющего примерно такую же изоэлектрическую точку, что и инсулин, и аналога инсулина,имеющего дополнительные основные аминокислоты [Dorschug, М., et al., патент США 5028587, выданный 2 июля 1991 г.].Steiner получил кристаллы, содержащие проинсулин и инсулин в молярных отношениях,соответственно равных примерно 1:11, 1:5, 1:2 и 1:1 (то есть 0,5, 1, 2 и 3 моля проинсулина на 6 молей общего инсулина и проинсулина), в растворе 0,095 М цитрата натрия, рН 6,0, 0,03 МNaCl, 0,012 М ZnCl2 и 16% ацетона. Пропорция проинсулина сильно влияет на скорость кристаллизации. Эти кристаллы существенно отличаются от кристаллов чистого инсулина, полученных в тех же условиях, и могут быть охарактеризованы как ромбоэдральные кристаллы с закругленными ребрами. Существует большое разнообразие кристаллов как в одном препарате,так и в разных препаратах. Полезность кристаллизации проинсулина и инсулина заключается в том, что это облегчает выделение небольших количеств проинсулина и родственных структур из панкреатических экстрактов. Автор указывает, что кристаллизация может происходить между пептидами-предшественниками и зрелыми пептидами, а также между другими родственными белками.Low В.W. et al. получили очень большие кристаллы, содержащие эквимолярные количества инсулина коровы или свиньи и соответствующих проинсулинов, в которых проинсулин и инсулин образовывали гомогенные гексамеры до кристаллизации. Анализ, выполненный при помощи рентгеновской кристаллографии и количественного электрофореза, подтвердил вывод о том, что элементарная ячейка в этих кристаллах образована двенадцатью гексамерами инсулина и двенадцатью гексамерами проинсулина. Было особо отмечено, что неизвестно о выполнении исследований, которые подтвердили бы, что инсулин и проинсулин образуют в растворе смешанные димеры и гексамеры.Dorschug М. et al. описаны кристаллы, состоящие из инсулина, дес(PheB1)инсулина,дес(ТhrВ 30)инсулина человека или дес(АlаВ 30) инсулина крупного рогатого скота и, по крайней мере, одного инсулина, имеющего основную модификацию у С-конца цепи В ("модифицированный инсулин"). Такие модифицированные инсулины описаны, например, в заявке на европейский патент 132769. В этой заявке отмечено, что глобин и сульфат протамина являются дополнительными соединениями, которые можно использовать в кристаллических препаратах. В указанной заявке отсутствуют примеры использования протамина и не указано, каким образом изобретатели оценивают результат добавления таких соединений. Кроме того, модифи 003394 6 цированные инсулины, использованные Dorschug et al., отличаются от производных, используемых в настоящем изобретении. Как указывалось выше, заявитель обнаружил, что если белок, выбранный из инсулина,аналога инсулина и проинсулина, сделать менее растворимым в водном растворителе и более липофильным путем получения его производного в результате замещения одной или нескольких реакционноспособных боковых групп, то производный белок и непроизводный белок,выбираемый из инсулина, аналога инсулина и проинсулина, можно ввести в нерастворимые осадки и NPH-подобные кристаллы вместе с протамином. Когда такие белки вместе осаждают или кристаллизуют с получением нерастворимых композиций, значительно уменьшается скорость растворения белков из такой нерастворимой композиции по сравнению с физически сходными нерастворимыми композициями, содержащими непроизводный белок. Заявитель далее обнаружил, что как аморфные осадки, так и микрокристаллы, содержащие производный белок, непроизводный белок, комплексообразующее соединение, катион двухвалентного металла и стабилизатор гексамера, обеспечивают более ровное и длительное действие, чем физически схожие микрокристаллы, содержащие только непроизводный белок. Кроме того, заявитель установил, что более ровное и продолжительное действие может быть достигнуто даже при использовании аморфных осадков, содержащих один из белков и производный белок. Краткое изложение существа изобретения Целью настоящего изобретения в наиболее широком понимании являются нерастворимые композиции, содержащие производный белок,выбираемый из группы, включающей производные инсулина, производные аналога инсулина и производные проинсулина; белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины; комплексообразующее соединение; стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла. Производный белок или должен быть менее растворим в водном растворителе, чем непроизводный белок, более липофильным, чем непроизводный инсулин,или должен образовывать комплекс с цинком и протамином, который менее растворим, чем соответствующий комплекс с непроизводным белком. Нерастворимые композиции по настоящему изобретению могут иметь форму аморфных осадков или более предпочтительно форму микрокристаллов. Микрокристаллы могут иметь палочкообразную или неупорядоченную морфологию. Эти нерастворимые композиции позволяют эффективно лечить диабет и гипергликемию и характеризуются более ровным и продолжительным действием, чем инсулин NPH. Нерастворимые композиции смешивают в препарате с 7 растворимым белком или растворимым производным белком либо с обоими вместе. Кроме того, изменяя соотношение между белком и производным белком, можно очень точно регулировать продолжительность действия в очень широких пределах, от почти такого же времени действия как у инсулина NPH до гораздо более продолжительного действия, чем у инсулинаNPH. В частности, настоящее изобретение относится к нерастворимым композициям, содержащим белки и белки, ацилированные жирной кислотой, которые позволяют эффективно лечить диабет и гипергликемию. Эти композиции содержат ацилированный жирной кислотой белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, ацилированный жирной кислотой, аналог инсулина, ацилированного жирной кислотой, и проинсулин, ацилированный жирной кислотой; белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулин; протамин; фенольный консервант и цинк. Настоящее изобретение отличается от ранее известного способа получения инсулина, ацилированного жирной кислотой, тем, что продолжительность действия композиции по настоящему изобретению необязательно обусловлена связыванием альбумина, хотя связывание альбумина может еще больше увеличивать продолжительность действия некоторых композиций по настоящему изобретению. Это изобретение относится к микрокристаллам, содержащим белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналог инсулина и проинсулин; производный белок, выбираемый из группы, включающей производный инсулин,аналог производного инсулина и производный проинсулин; комплексообразующее соединение; катион двухвалентного металла и стабилизатор гексамера. Микрокристаллы по настоящему изобретению позволяют эффективно лечить диабет и регулировать содержание глюкозы в крови у нуждающихся субъектов. Это изобретение относится к аморфному осадку, содержащему белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналог инсулина и проинсулин; производный белок, выбираемый из группы, включающей производный инсулин,аналог производного инсулина и производный проинсулин; комплексообразующее соединение; катион двухвалентного металла и стабилизатор гексамера. Аморфные осадки по настоящему изобретению позволяют эффективно лечить диабет и регулировать содержание глюкозы в крови у нуждающихся субъектов. Они являются также полезными промежуточными веществами для получения микрокристаллов по настоящему изобретению. Это изобретение относится к препаратам в виде водной суспензии, содержащим нерастворимую композицию и водный растворитель. Один такой препарат в виде водной суспензии 8 содержит микрокристаллическую композицию по настоящему изобретению и водный растворитель. Другой препарат в виде водной суспензии содержит аморфный осадок по настоящему изобретению и водный растворитель. Растворимая водная фаза препаратов по настоящему изобретению может необязательно содержать белок, такой как инсулин человека, или растворимый аналог инсулина человека, такой как аналог мономерного инсулина, который регулирует содержание глюкозы в крови сразу же после приема пищи и может дополнительно или альтернативно содержать производный белок. Препараты по настоящему изобретению обладают лучшей фармакодинамикой по сравнению с инсулином NPH человека, и продолжительность их действия можно целенаправленно выбирать в широких пределах: от немного более продолжительного действия по сравнению с инсулиномNPH человека до значительно более продолжительного по сравнению с инсулином NPH человека. Это изобретение относится к способам получения гибридных гексамеров, смешанных гексамеров, аморфных осадков и сокристаллов по настоящему изобретению. Это изобретение относится к способу лечения диабета или гипергликемии, который заключается в том, что нуждающемуся субъекту вводят нерастворимую композицию по настоящему изобретению в количестве, достаточном для регулирования уровней глюкозы в крови у этого субъекта. Это изобретение относится к композициям на основе гибридных гексамеров, которые содержат белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналог инсулина и проинсулин; производный белок, выбираемый из группы, включающей производный инсулин, аналоги производного инсулина, производные проинсулины и цинк. Гибридные гексамеры по настоящему изобретению позволяют эффективно лечить диабет и регулировать содержание глюкозы в крови у нуждающегося субъекта. Они являются также полезными промежуточными веществами для получения нерастворимых композиций по настоящему изобретению, которые сами по себе полезны для лечения диабета и регулирования содержания глюкозы в крови у нуждающегося субъекта. Считается, что гибридные гексамеры образуются, во-первых, при смешивании белка и производного белка в условиях, которые в наибольшей степени способствуют растворению в более низких состояниях агрегации по сравнению с гексамерным состоянием, и, во-вторых, при изменении условий на такие, которые в наибольшей степени стимулирует гексамерное состояние агрегации. Это изобретение относится к композициям на основе смешанных гексамеров, которые содержат цинковые гексамеры белка, выбираемого из группы, включающей инсулин, аналог ин 9 сулина или проинсулин, и цинковые гексамеры производного белка, выбираемые из группы,включающей производный инсулин, аналог производного инсулина или производный проинсулин. Смешанные гексамеры по настоящему изобретению позволяют эффективно лечить диабет и регулировать содержание глюкозы в крови у нуждающегося субъекта. Они являются также полезными промежуточными веществами для получения нерастворимых композиций по настоящему изобретению, которые сами по себе полезны для лечения диабета и регулирования содержания глюкозы в крови нуждающегося субъекта. Считается, что смешанные гексамеры образуются, прежде всего, при раздельном растворении белка и производного белка в условиях, благоприятных для гексамерного состояния агрегации, и при последующем смешивании в условиях, которые в наибольшей степени стимулируют гексамерное состояние агрегации. Это изобретение относится к применению нерастворимой композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения диабета или гипергликемии. Краткое описание чертежей На фиг. 1 приведены данные растворения в течение 5 ч сокристаллов по настоящему изобретению, в которых отношения инсулина человека к В 29-N-октаноилинсулину человека составляют 3:1 , 1:1 и 1:3 по сравнению с растворением кристаллов протамина и инсулина человека . На фиг. 2 приведены данные растворения,полученные при осуществлении экспериментов,изображенных на фиг. 1, но временная ось на этой фигуре продлена, чтобы можно было показать данные для сокристаллов с отношением 1:3 в течение примерно 13,5 ч. Растворение сокристаллов по настоящему изобретению, в которых отношения инсулина человека к В 29-Nоктаноилинсулину человека составляют 3:1 ,1:1 и 1:3 , сравнивается с растворением кристаллов протамина и инсулина человека. На фиг. 3 приведены данные растворения сокристаллов по настоящему изобретению, в которых отношения инсулина человека к В 29N-октаноилинсулину человека составляют 1:1 и 1:3 по сравнению с растворением микрокристаллов, содержащих только В 29-Nоктаноилинсулин человекаили кристаллы протамина и инсулина человека . На фиг. 4 приведены данные растворения сокристаллов по настоящему изобретению, в которых отношение инсулина человека к В 29N-октаноилинсулину человека составляют 1:3 по сравнению с растворением кристаллов протамина и инсулина человека , инсулина человека "ультралент"и инсулина крупного рогатого скота "ультралент" . 10 Подробное описание изобретения Термин "смешанные гексамеры" означает смесь гексамеров белка и гексамеров производного белка, в которой гексамеры белка состоят из цинка и белка, выбираемого из группы,включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины, и гексамеры производного белка состоят из цинка и производного белка, выбираемого из группы, включающей производный инсулин, аналоги производного инсулина и производные проинсулины. Содержание цинка в гексамере составляет от около 2 до около 4 атомов цинка на один гексамер. Термин "гибридный гексамер" означает гексамер, состоящий из шести мономеров и цинка, в котором, по крайней мере, один мономер выбирают из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины, и, по крайней мере, один мономер выбирают из группы, включающей производный инсулин, аналоги производного инсулина и производные проинсулины. Содержание цинка в гексамере обычно составляет от около 2 до около 4 атомов цинка на один гексамер. В используемом здесь значении термин"сокристалл" означает микрокристалл по настоящему изобретению. Термин "нерастворимая композиция" означает вещество в микрокристаллическом состоянии или в состоянии аморфного осадка. Наличие микрокристаллов или аморфного осадка можно определить визуально и путем микроскопического исследования. Растворимость зависит от растворителя, и определенная композиция может быть нерастворимой в одном растворителе и растворимой в другом. Термин "микрокристалл" означает твердое вещество, находящееся, как правило, в кристаллическом состоянии, в котором отдельные кристаллы имеют, в основном, одну кристаллографическую композицию и микроскопический размер, причем наибольший размер обычно составляет от 1 до 100 мкм. Термин "микрокристаллический" означает состояние, в котором вещество является микрокристаллом. Термин "палочкообразный" означает выраженную микрокристаллическую морфологию,которая описывается также как тетрагональные палочки с пирамидальным концом. Морфологию микрокристаллов по настоящему изобретению можно легко определить путем микроскопического исследования. Термин "неупорядоченная морфология" характеризует микрокристаллы, морфология которых, выявленная при помощи микроскопического исследования, не может быть классифицирована в соответствии с одним из хорошо известных типов кристаллов, не относится к одному типу морфологии кристалла или не может быть сразу же определена из-за того, что размер кристаллов является слишком мелким для конкретной классификации. 11 Термин "аморфный осадок" означает нерастворимое вещество, не находящееся в кристаллическом состоянии. Специалист в этой области может легко отличить кристаллы от аморфного осадка. Аморфные осадки по настоящему изобретению сами по себе обладают предпочтительными фармакологическими свойствами и являются также промежуточными веществами для получения микрокристаллов по настоящему изобретению. Термин "белок" может иметь общепринятое значение, то есть полимер аминокислот. В этом описании изобретения термин "белок" имеет также более узкое значение, то есть белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулины. Термин"общий белок" означает общее количество белка (инсулин, аналог инсулина или проинсулин) и производного белка (производный инсулин,аналог производного инсулина или производный проинсулин). Хотя протамин и другие известные комплексообразующие соединения также являются белками в наиболее широком значении этого термина, они не входят в определение термина "общий белок". Термин "производный белок" означает белок, выбираемый из группы, включающей производный инсулин, аналоги производного инсулина и производный проинсулин, который является за счет функциональной группы таким, что производный белок становится или менее растворимым в водном растворителе, чем непроизводный белок, более липофильным, чем непроизводный инсулин, или образует комплекс с цинком и протамином, который является менее растворимым, чем соответствующий комплекс с непроизводным белком. Способы определения растворимости или липофильности белков и производных белков хорошо известны специалистам в этой области. Растворимость производных белков и белков в комплексах с цинком и протамином можно легко определить хорошо известными способами [Graham and Pomeroy, J.Pharm. Pharmacol. 36:427-430 (1983), модифицированными DeFelippis, M.R. and Frank, В., европейский патент 735048] или способом, описанным в этом описании изобретения. Многие примеры таких производных белков известны в этой области, включая бензоильные производные, карбонильные производные п-толилсульфонамида и индолильные производные инсулина и аналогов инсулина[Havelund, S., et al., заявка WO 95/07931, опубликованная 23 марта 1995 г.]; алкилоксикарбонильные производные инсулина [Geiger, R., et 123907763, выданный 23 сентября 1975 г.]; арилоксикарбонильные производные инсулина [Brandenberg, D., et al., патент США 3907763, выданный 23 сентября 1975 г.]; алкилкарбамильные производные [Smyth, D.G., патент США 3864325, выданный 4 февраля 1975 г.; Lindsay, D.G., et al., патент США 3950517, выданный 13 апреля 1976 г.]; карбамильные, O-ацетильные производные инсулина [Smyth, D.G.,патент США 3864325, выданный 4 февраля 1975 г.]; алкилдикарбоксильные производные с поперечными связями [Brandenberg, D., et al.,патент США 3907763, выданный 23 сентября 1975 г.]; N-карбамильные, O-ацетилированные производные инсулина [Smyth, D.G., патент США 3868356, выданный 25 февраля 1975 г.]; разные O-алкильные сложные эфиры [Markussen, J.,патент США 4343898, выданный 10 августа 1982 г.; Morihara, К., et al., патент США 4400465, выданный 23 августа 1983 г.; Morihara,К., et al., патент США 4401757, выданный 30 августа 1983 г.; Markussen, J., патент США 4489159, выданный 18 декабря 1984 г.; Obermeier, R., et al., патент США 4601852, выданный 22 июля 1986 г.; и Andresen, F.Н, et al., патент США 4601979, выданный 22 июля 1986 г.]; алкиламидные производные инсулина[Balschmidt, P., et al., патент США 5430016,выданный 4 июля 1995 г.]; различные другие производные инсулина [Lindsay, D.G., патент США 3869437, выданный 4 марта 1975 г.]; и белки, ацилированные жирной кислотой, рассматриваемые в этом описании изобретения. Термин "ацилированный белок" в используемом здесь значении означает производный белок, выбираемый из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулин, которые ацилированы органической кислотой, связанной с белком амидной связью, образованной между кислотной группой органической кислоты и аминогруппой белка. Аминогруппа может быть -аминогруппой N-концевой аминокислоты белка или -аминогруппой остатка Lys белка. Ацилированный белок может быть ацилирован в одной или нескольких аминогруппах из трех,присутствующих в инсулине и в большинстве аналогов инсулина. Моноацилированные белки ацилированы в одной аминогруппе. Диацилированные белки ацилированы в двух аминогруппах. Триацилированные белки ацилированы в трех аминогруппах. Органическая кислота может быть, например, жирной кислотой, ароматической кислотой или любым другим органическим соединением, имеющим группу карбоновой кислоты, которая может образовывать амидную связь с аминогруппой белка и которая уменьшает растворимость в воде, повышает липофильность или уменьшает растворимость комплексов цинка/протамина производного белка по сравнению с непроизводным белком. 13 Термин "белок, ацилированный жирной кислотой" означает ацилированный белок, выбираемый из группы, включающей инсулин,аналоги инсулина и проинсулины, которые ацилированы жирной кислотой, связанной с белком амидной связью, образованной между кислотной группой жирной кислоты и аминогруппой белка. Аминогруппа может быть -аминогруппой N-концевой аминокислоты белка или аминогруппой остатка Lys белка. Белок, ацилированный жирной кислотой, может быть ацилирован в одной или нескольких аминогруппах из трех, присутствующих в инсулине и в большинстве аналогов инсулина. Моноацилированные белки ацилированы в одной аминогруппе. Диацилированные белки ацилированы в двух аминогруппах. Триацилированные белки ацилированы в трех аминогруппах. Инсулин, ацилированный жирной кислотой, описан в заявке на патент Японии 1-254699. См. также Hashimoto,M., et al., Pharmaceutical Research, 6:171-176(1989), and Lindsay, D.G., et al., Biochemical J. 121:737-745 (1971). Дальнейшее описание инсулинов, ацилированных жирной кислотой, аналогов инсулина, ацилированных жирной кислотой,и способов их синтеза можно найти в заявке на патент США 08/342931, поданной Baker, J.С., etal. 17 ноября 1994 г., на основании которой выдан патент США 5693609 от 2 декабря 1997 г.; в заявке на патент WO 95/07931 Havelund, S.,et al., опубликованной 23 марта 1995 г., и соответствующем патенте США 5750497, выданном 12 мая 1998 г.; в заявке WO 96/29342 Jonassen, I., et al., опубликованной 26 сентября 1996 г. Все эти работы включены в это описание изобретения в качестве ссылки для описания инсулинов, ацилированных жирной кислотой, и аналогов инсулинов, ацилированных жирной кислотой, и для ознакомления со способами их получения. Термин "белок, ацилированный жирной кислотой" включает фармацевтически приемлемые соли и комплексы белков, ацилированных жирной кислотой. Термин "белок, ацилированный жирной кислотой" включает также препараты ацилированных белков, в которых совокупность молекул ацилированного белка является однородной в отношении сайта или сайтов ацилирования. Например, N-моноацилированный белок, B1-N-моноацилированный белок, A1-N-моноацилированный белок, A1,B1N-диацилированный блок, N, А 1-N-диацилированный белок, N,B1-N-диацилированный белок и N, А 1,В 1-N-триацилированный белок, которые полностью входят в объем определения термина "белок, ацилированный жирной кислотой" в соответствии с целями настоящего изобретения. Этот термин относится также к препаратам, в которых вся совокупность молекул ацилированного белка характеризуется однородным ацилированием. В последнем случае 14 термин "белок, ацилированный жирной кислотой" означает смеси моноацилированных и диацилированных белков, смеси моноацилированных и триацилированных белков, смеси диацилированных и триацилированных белков и смеси моноацилированных, диацилированных и триацилированных белков. Термин "инсулин" в используемом здесь значении означает инсулин человека, аминокислотная последовательность и особенности структуры которого хорошо известны. Инсулин человека имеет А-цепь, состоящую из 21 аминокислоты, и В-цепь, состоящую из 30 аминокислот, которые поперечно связаны дисульфидными связями. Правильно поперечно связанный инсулин содержит три дисульфидных мостика: один между положением 7 А-цепи и положением 7 В-цепи, второй между положением 20 Ацепи и положением 19 В-цепи и третий между положениями 6 и 11 А-цепи. Термин "аналог инсулина" означает белки,имеющие А-цепь и В-цепь, которые содержат практически такие же аминокислотные последовательности, что и соответственно А-цепь и В-цепь инсулина человека, но отличаются от Ацепи и В-цепи инсулина человека тем, что у них удалены, заменены и/или добавлены одна или несколько аминокислот, которые не нарушают инсулиновую активность аналога инсулина."Инсулины животных" являются аналогами инсулина человека и поэтому относятся к аналогам инсулина в соответствии с приведенным здесь определением. Четырьмя такими инсулинами животных являются инсулин кролика,свиньи, коровы и овцы. Замещения аминокислот, которые отличают инсулины этих животных от инсулина человека, приведены ниже для сведения. Положение аминокислот А 8Ala Другой тип аналога инсулина, "аналог мономерного инсулина", хорошо известен в этой области. Аналоги мономерного инсулина в структурном отношении очень схожи с инсулином человека и обладают активностью, которая схожа или эквивалентна инсулину человека, но у них удалены, заменены или добавлены одна и несколько аминокислот, нарушающие связи,относящиеся к димеризации и гексамеризации,что ведет к уменьшению связывания с достижением более высоких агрегатных состояний. Аналоги мономерного инсулина являются аналогами инсулина человека быстрого действия и описаны, например, Chance, R.E., et al., патент США 5514646, 7 мая 1996 г.; Brems, D.N., et(1991). В качестве примера аналогов мономерного инсулина приведен инсулин человека, в котором Pro в положении В 28 замещен Asp, Lys,Leu, Val или Ala и Lys в положении В 29 является Lys или замещен Pro, а также АlаВ 26 инсулин человека, des(B28-B39)инсулин человека и des(B27)инсулин человека. Аналоги мономерного инсулина, используемого в качестве производных соединений в кристаллах по настоящему изобретению или непроизводных соединений в фазе раствора суспензионных препаратов, поперечно связаны в тех же положениях, что и инсулин человека. Другую группу аналогов инсулина, пригодных для использования при осуществлении настоящего изобретения, составляют аналоги инсулина, у которых изоэлектрическая точка находится в пределах от около 7,0 до около 8,0. Эти аналоги определяются как "аналоги инсулина со сдвигом рI". Примерами таких аналогов инсулина являются АrgВ 31,АrgВ 32-инсулин человека, GlyA21, ArgB31, ArgB32-инсулин человека, АrgА 0, АrgВ 31, АrgВ 32-инсулин человека и ArgA0, GlyA21, АrgВ 31, АrgВ 32 инсулин человека. Еще одну группу аналогов инсулина составляют аналоги инсулина с делениями одной или нескольких аминокислот, существенно не нарушающими активность молекулы. Эта группа аналогов инсулина определяется здесь как"делеционные аналоги". Например, необходимой активностью обладают аналоги инсулина с делецией одной или нескольких аминокислот в положениях В 1-В 3. Аналогичным образом обладают активностью аналоги инсулина с делецией одной или нескольких аминокислот в положениях В 28-В 30. В качестве примеров "делеционных аналогов" можно указать дес(В 30)инсулин человека, дес-Рhе(В 1)инсулин человека,дес(В 27)инсулин человека, дес(В 28-В 30)инсулин человека и дес(В 1-В 3)инсулин человека. Делеционные аналоги, используемые в качестве производных соединений в кристаллах по настоящему изобретению или непроизводных соединений в фазе раствора суспензионного препарата, имеют необходимые поперечные связи в тех же положениях, что и инсулин человека. Известно, что амидированные аминокислоты, и в частности остатки аспарагина в инсулине, являются химически неустойчивыми[Jorgensen, К.Н., et al., патент США 5008241,выданный 16 апреля 1991 г.; Dorschug, M., патент США 5656722, выданный 12 августа 1997 г.]. В частности, они подвержены деамидированию и разным реакциях перегруппировки, которые хорошо известны. Поэтому аналог инсулина необязательно может быть инсулином 16 или аналогом инсулина, у которого один или несколько амидированных остатков замещены другими аминокислотами для обеспечения химической стойкости. Например, Asn или Gln может быть заменен неамидированной аминокислотой. Предпочтительными замещениями аминокислот для Asn или Gln являются Gly, Ser,Thr, Asp или Glu. Желательно заменить один или несколько остатков Asn. В частности,AsnA18, AsnA21, AsnB3 или любая комбинация этих остатков может быть заменена, например,остатками Gly, Asp или Glu. Кроме того, GlnA15 или GlnB4 либо оба вместе могут быть заменены Asp или Glu. Предпочтительными замещениями являются Asp в положении В 21 и Asp в положении В 3. Помимо этого, предпочтительны замещения, которые не изменяют заряд молекулы белка, так что замена Asn или Gln нейтральными аминокислотами также является предпочтительной. Термин "проинсулин" означает одноцепочечную молекулу пептида, которая является предшественником инсулина. Проинсулин можно превратить в инсулин или аналог инсулина при помощи химических реакций или предпочтительно реакций, катализируемых ферментом. Как указано в этом описании изобретения, в проинсулине образуются необходимые дисульфидные связи. Проинсулин включает инсулин или аналог инсулина и связь или связующий пептид. Связующий пептид имеет от 1 до около 35 аминокислот. Связь или связующий пептид присоединены к концевой аминокислоте А-цепи и к концевой аминокислоте В-цепи при помощи соответственно -амидной связи или двух амидных связей. Ни одна из аминокислот в связующем пептиде предпочтительно не является цистеином. С-концевая аминокислота связующего пептида предпочтительно является Lys или Аrg. Проинсулин может иметь формулу XB-C-A-Y или формулу X-A-C-B-Y, в которой Х обозначает водород или пептид, имеющий от 1 до около 100 аминокислот, который содержитLys или Аrg в С-концевой аминокислоте, Y обозначает гидрокси или пептид, имеющий от 1 до около 100 аминокислот, который содержит Lys или Аrg в N-концевой аминокислоте, А обозначает А-цепь инсулина и А-цепь аналога инсулина, С обозначает пептид, имеющий от 1 до около 35 аминокислот, ни одна из которых не является цистеином, в котором С-концевая аминокислота является Lys или Аrg, и В обозначает Вцепь инсулина или В-цепь аналога инсулина."Фармацевтически приемлемая соль" означает соль, образованную между одной или несколькими заряженными группами в белке и одним или несколькими фармацевтически приемлемыми нетоксичными катионами или анионами. Органическими и неорганическими солями являются, например, соли, полученные из таких кислот, как хлористо-водородная, серная, 17 сульфоновая, винная, фумаровая, бромистоводородная, гликолевая, лимонная, малеиновая,фосфорная, янтарная, уксусная, азотная, бензойная, аскорбиновая, п-толуолсульфоновая,бензолсульфоновая, нафталинсульфоновая, пропионовая, угольная и тому подобные кислоты,или, например, соли аммония, натрия, калия,кальция или магния. Глагол "ацилировать" означает образование амидной связи между жирной кислотой и аминогруппой белка. Белок "ацилирован" в том случае, когда одна или несколько его аминогрупп связаны амидной связью с кислотной группой жирной кислоты. Термин "жирная кислота" означает насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту с прямой или разветвленной цепью, имеющую от одного до восемнадцати атомов углерода. Термин "С 1-С 18 жирная кислота" означает насыщенную жирную кислоту с прямой или разветвленной цепью, имеющую от одного до восемнадцати атомов углерода. Термин "катион двухвалентного металла" означает ион или ионы, участвующие в образовании комплекса с несколькими молекулами белка. В качестве примеров металлов, образующих комплексы с инсулином, можно привести переходные металлы, щелочные металлы и щелочно-земельные металлы. Переходные металлы являются предпочтительными. Цинк является особенно предпочтительным. Другими переходными металлами, которые могут был фармацевтически приемлемыми для образования комплекса с белками инсулина, являются медь, кобальт и железо. Термин "комплекс" имеет два значения в настоящем описании изобретения. Первым значением этого термина является комплекс, образуемый между одним или несколькими атомами комплексообразующих белков и одним или несколькими катионами двухвалентного металла. Атомы белков служат в качестве электронодонорных лигандов. Белки обычно образуют гексамерный комплекс с катионами двухвалентных переходных металлов. Вторым значением термина "комплекс" в настоящем описании изобретения является ассоциация между комплексообразующим соединением и гексамерами. "Комплексообразующее соединение" является органической молекулой, которая обычно имеет множество положительных зарядов, которые связываются или образуют комплекс с гексамерами в нерастворимой композиции, стабилизируя их против растворения. Примерами комплексообразующих соединений, пригодных для осуществления настоящего изобретения, являются протамин, сурфен, различные глобиновые белки [Brange, J., Galenics of Insulin, SpringerVerlag, Berlin Heidelberg (1987)] и разные поликатионные полимеры, образующие комплекc с инсулином. 18 Термин "протамин" означает смесь сильно основных белков, полученных из спермы рыбы. Средняя молекулярная масса белков в протамине равна примерно 4200 [Hoffmann, J.A., et al.,Protein Expression and Purification, 1:127-133(1990)]. "Протамин" может означать относительно бессолевой препарат белков, часто именуемый "основанием протамина". Протамин также означает препараты, содержащие соли белков. В коммерческих препаратах содержание соли изменяется в широких пределах. Протамины хорошо известны специалистам в области получения инсулина, и в настоящее время их вводят в препараты инсулинаNPH. В настоящем изобретении использована чистая фракция протамина, а также смеси протаминов. Однако коммерческие препараты протамина обычно не бывают однородными в отношении присутствующих белков. Тем не менее, они пригодны для осуществления настоящего изобретения. Протамин в форме основания протамина пригоден для осуществления настоящего изобретения точно так же, как препараты протамина, включающие соли протамина, и препараты, представляющие собой смеси основания и солей протамина. Часто используемой солью протамина является сульфат протамина. Все массовые отношения для протамина указаны с учетом свободного основания протамина. Специалист в этой области может определить целый ряд других препаратов протамина,имеющих требуемое массовое отношение для протамина. Термин "суспензия" означает смесь жидкой и твердой фаз, которая состоит из нерастворимых или умеренно растворимых частиц, размер которых больше коллоидных частиц. Смеси микрокристаллов NPH и водного растворителя образуют суспензии. Смеси аморфного осадка и водного растворителя также образуют суспензию. Термин "суспензионный препарат" означает фармацевтическую композицию, в которой активное вещество присутствует в твердой фазе,например такой, как микрокристаллическое твердое вещество, аморфный осадок или оба вместе, и тонко диспергировано в водном растворителе. Тонко диспергированное твердое вещество имеет такую структуру, которая позволяет его суспендировать в достаточно однородном состоянии в водном растворителе при слабом перемешивании смеси, в результате чего получают однородную суспензию, из которой можно экстрагировать дозу требуемого объема. Примерами промышленно выпускаемых суспензионных препаратов инсулина являются,например, NPH, PZI и ультралент. Небольшая пропорция твердого вещества в микрокристаллической суспензии может находиться в аморфном состоянии. Пропорция аморфного вещества предпочтительно составляет менее 10% и наиболее предпочтительно менее 1% твердого вещества в микрокристаллической суспензии. 19 Аналогичным образом небольшая пропорция твердого вещества в суспензии аморфного осадка может иметь микрокристаллическую структуру. Термин "инсулин NPH" означает препарат инсулина с "нейтральным протамином Хейгдорна". Синонимами этого термина наряду с другими определениями являются инсулин NPH человека и инсулин NPH. Промышленно выпускаемым препаратом инсулина NPH является гумулин N. Родственным термином является"NPL", который служит для определения NPHподобного препарата аналога LysB28,РrоВ 29 инсулина человека. Значения этих терминов и способы получения этих препаратов должны быть известны специалистам в области получения инсулина. Термин "водный растворитель" означает жидкий растворитель, содержащий воду. Водный растворитель может состоять только из воды, может включать воду и один или несколько смешивающихся растворителей и может содержать растворенные вещества. Наиболее широко используемыми смешивающимися растворителями являются органические спирты с короткой цепью, такие как метанол, этанол, пропанол; кетоны с короткой цепью, такие как ацетон; и многоатомные спирты, такие как глицерин. Термин "изотонический агент" означает соединение, которое является физиологически толерантным и сообщает необходимую тоничность композиции, предотвращающую движение воды через клеточные мембраны, контактирующие с введенным препаратом. В качестве изотонического агента обычно используют глицерол, известный также как глицерин. Другими изотоническими агентами являются соли, например хлорид натрия, и моносахариды, например декстроза и лактоза. Нерастворимые композиции по настоящему изобретению содержат стабилизатор гексамера. Термин "стабилизатор гексамера" означает небелковое низкомолекулярное соединение,которое стабилизирует белок или производный белок в гексамерном агрегатном состоянии. Наиболее известными стабилизаторами для инсулина и производных инсулина являются фенольные соединения, в частности фенольные консерванты. Стабилизаторы гексамера оказывают стабилизирующее действие в результате связывания с гексамером через специфические межмолекулярные связи. Примерами стабилизаторов гексамера являются разные фенольные соединения, фенольные консерванты, резорцинол, 4'-гидроксиацетанилид, 4-гидроксибензамид и 2,7-дигидроксинафталин. Многоцелевые препараты, содержащие нерастворимые композиции по настоящему изобретению, помимо стабилизатора гексамера, включают консервант. Консервант, используемый в препаратах по настоящему изобретению, может быть фенольным консервантом, при этом он может 20 быть аналогичен стабилизатору гексамера или отличаться от него. Термин "консервант" означает соединение,добавляемое к фармацевтическому препарату в качестве антимикробного средства. Препараты для парентерального введения должны удовлетворять требованиям, предъявляемым к эффективности консерванта, в соответствии с которыми он должен быть коммерчески жизнеспособным многоцелевым продуктом. Среди консервантов, которые считаются в этой области эффективными и приемлемыми для использования в препаратах для парентерального введения,можно указать хлорид бензалкония, бензетоний,хлоргексидин, фенол, м-крезол, бензиловый спирт, метилпарабен, хлорбутанол, о-крезол, пкрезол, хлоркрезол, нитрат фенилртути, тимерозал, бензойную кислоту и их разные смеси. См.,например, Wallhausser, K.-H., Develop. Biol.Standard, 24:9-28 (1974) (S. Krager, Basel). Термин "фенольный консервант" означает такие соединения, как фенол, м-крезол, окрезол, п-крезол, хлоркрезол, метилпарабен и их смеси. Известно, что некоторые фенольные консерванты, такие как фенол и м-крезол, связываются с инсулиноподобными молекулами и, таким образом, вызывают конформационные изменения, усиливающие физическую или химическую стойкость либо оба эти показателя вместе [Birnbaum, D.Т., et al., Pharmaceutical. Res. 14:25-36 (1997); Rahuel-Clermont, S., et al., Biochemistry, 36:5837-5845 (1997)]. Термин "буфер" или "фармацевтически приемлемый буфер" означает соединение, которое является безопасным для использования в инсулиновых препаратах и позволяет регулировать рН препарата до достижения требуемого значения. Показатель рН препаратов по настоящему изобретению находится в пределах от около 6,0 до около 8,0. Препараты по настоящему изобретению предпочтительно имеют значение рН от около 6,8 до около 7,8. Фармацевтически приемлемыми буферами, позволяющими регулировать рН от умеренно кислого значения рН до умеренно основного значения рН, являются такие соединения, как фосфат, ацетат,цитрат, аргинин, TRIS и гистидин. "TRIS" означает 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол и его любую фармацевтически приемлемую соль. TRIS обычно используют в форме свободного основания и гидрохлорида. TRIS известен в этой области также как триметилоламинометан, трометамин и трис(гидроксиметил)аминометан. Специалистам в этой области должны быть известны другие буферы, которые являются фармацевтически приемлемыми и позволяют регулировать рН в требуемых пределах. Термин "вводить" означает введение препарата по настоящему изобретению в тело нуждающегося субъекта для лечения болезни или нарушения. 21 Термин "лечение" означает оказание помощи и уход за больным, страдающим диабетом или гипергликемией, а также другим заболеванием, для лечения которого показано введение инсулина с целью устранения или облегчения симптомов и осложнений этих болезней. Лечение включает введение препарата по настоящему изобретению для предотвращения возникновения симптомов или осложнений, облегчения симптомов или осложнений или излечивания болезни, поражения или нарушения. Как указывалось выше, настоящее изобретение относится к нерастворимым композициям, обладающим свойствами, подобными в некоторых отношениях инсулину NPH и превосходящими инсулин NPH в других отношениях. Они имеют такие же описываемые ниже физические свойства, что и инсулин NPH. Микрокристаллы, содержащие В 29-N-октаноилинсулин человека, инсулин, цинк, протамин и фенол,которые были получены по настоящему изобретению, исследовали при помощи светового микроскопа, оснащенного объективом с масляной иммерсией и перекрестным поляризатором. Исследование при 1000-кратном увеличении показало, что эти микрокристаллы являются палочкообразными одиночными кристаллами и имеют однородную кристаллическую структуру. Длина этих микрокристаллов обычно составляет от около 2 до 8 мкм. Прямое сравнение, выполненное при помощи этого микроскопа, показало, что морфология указанных микрокристаллов, по-видимому, подобна морфологии производимых промышленностью микрокристалловNPH свиньи, которые в научной литературе описаны как палочкообразные микрокристаллы. Размер этих микрокристаллов также подобен производимым промышленностью микрокристаллам NPH, средняя длина которых обычно равна примерно 5 мкм. Средняя длина промышленно производимых микрокристаллов NPH составляет от 1 до 40 мкм. Однако микрокристаллы по настоящему изобретению совершенно неожиданно отличаются от кристаллов инсулина NPH растворимостью и продолжительностью действия. В частности, микрокристаллы по настоящему изобретению растворяются гораздо медленнее в имитированных физиологических условиях, чем кристаллы инсулина NPH, и характеризуются более продолжительным и ровным профилем регулирования содержания глюкозы в крови по сравнению с инсулином NPH. Это продемонстрировано нижеследующими экспериментами. Установлено, что продолжительность действия некоторых производных белков в растворимой форме существленно не отличается от обычного инсулина человека. В экспериментах использовали три группы животных. Всем животным в первой группе вводили дозу (0,75 нмоль/кг) гумулина R (Humulin R) (растворимый инсулин человека), всем животным во вто 003394 22 рой группе вводили дозу (0,75 нмоль/кг) растворимого В 29-N-октаноилинсулина человека("С 8-hI") и всем животным в третьей группе вводили дозу (0,75 нмоль/кг) растворимого В 29N-деканоилинсулина человека ("С 10-hI") . Эти эксперименты выполняли, в основном, так же,как это описано в примере 5, причем в каждой группе было по пять собак. Белки вводили подкожно. Полученные концентрации глюкозы в крови приведены в нижеследующей таблице. Таблица 1. Концентрации глюкозы в крови до и после введения гумулина R, растворимого В 29-N-октаноилинсулина человека ("C8-hI") или растворимого В 29-N-деканоилинсулина человека ("С 10-hI") здоровым собакам, которым одновременно вводили соматостатин, чтобы вызвать временное диабетическое состояние. Приведенные величины представляют собой среднее значениестандартную ошибку. Время, ч Концентрация глюкозы в крови, мг/дл Растворимый Растворимый Гумулин R Эти данные ясно показывают, что растворимый B29-N-октаноилинсулин человека и В 29-N-деканоилинсулин человека, вводимые подкожно здоровым собакам, у которых было вызвано временное диабетическое состояние,обеспечивают резкое снижение содержания глюкозы по сравнению с результатами, полученными при использовании растворимого инсулина человека. Наиболее интересным является то, что растворимый В 29-N-октаноилинсулин человека действует гораздо быстрее и менее продолжительно, чем инсулин человека. Во втором эксперименте было установлено, что скорость растворения сокристаллов инсулина и В 29-N-октаноилинсулина человека,полученных по настоящему изобретению, является значительно более длительной, чем у промышленно производимого инсулина NPH свиньи. Этот результат явился особенно неожиданным в свете приведенных выше данных. Скорость растворения можно измерить хорошо известными способами [Graham and Pomeroy, J. 23 Скорость растворения микрокристаллов инсулина NPH свиньи измеряют, помещая 5 мклU100 инсулина NPH свиньи в 100 мл физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция или магния), находящегося в квадратной кварцевой кювете с длиной пути 1 см при температуре 22 С. Этот раствор перемешивают с постоянной скоростью при помощи магнитной мешалки кюветы. Измерения оптической плотности производят при 320 нм через промежутки времени, равные 1 мин. Оптическая плотность при 320 нм соответствует свету, рассеиваемому нерастворимыми частицами, присутствующими в водной суспензии. Затем по мере растворения микрокристаллов оптическая плотность приближается к нулю. Микрокристаллы инсулина NPH свиньи полностью растворяются примерно через 20 мин. При помощи вышеописанного способа установлено, что скорость растворения кристаллов, состоящих из протамина, цинка и инсулина человека и не содержащих сокристаллизованного ацилированного инсулина человека, также равна примерно 20 мин. Эти кристаллы инсулина NPH человека получены в соответствии с описываемым ниже способом получения 1, за исключением того, что при его осуществлении вместо ацилированного белка использовано 7 частей инсулина человека. Данные, полученные в результате выполнения этого эксперимента,показаны на фиг. 1 пунктирной линией. Сокристаллы по настоящему изобретению,состоящие из инсулина человека и В 29-Nоктаноил-LysВ 29-инсулина человека, получены в соответствии с описанными ниже способами получения 2, 4 и 5. При осуществлении этих способов инсулин человека и ацилированный инсулин используют в массовых отношениях перед кристаллизацией, равных соответственно 3:1, 1:1 и 1:3. Скорость растворения этих сокристаллов измеряли вышеописанным способом. Для этого 12 мкл суспензии сокристаллов, состоящих из протамина, цинка, В 29-N-октаноил-LysВ 29 инсулина человека и инсулина человека, (содержащей не более чем 50 u/мл) вводят в 3 мл физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция или магния), находящегося в квадратной кварцевой кювете с длиной пути 1 см. Этот раствор перемешивают с вышеуказанной постоянной скоростью и при температуре 22 С. Данные, полученные в результате осуществления этого эксперимента,представлены на фиг. 1; эти данные показывают, что сокристаллы с отношением 3:1 растворяются в течение более 100 мин, сокристаллы с отношением 1:1 растворяются в течение более 150 мин и сокристаллы с отношением 1:3 не растворяются полностью даже через 400 мин. Время, необходимое для изменения оптической плотности наполовину от исходного до 24 конечного значения оптической плотности, определяется как t1/2. Значения t1/2 для этих препаратов приведены ниже в табл. 2. Таблица 2. Значения t1/2 для растворения инсулина Эти эксперименты показывают, что в физиологическом растворе с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция и магния), который в некоторых отношениях имитирует тканевую жидкость, скорость растворения сокристаллов с отношениями компонентов 3:1, 1:1 и 1:3 значительно ниже аналогичного показателя для микрокристаллов NPH свиньи. Эти эксперименты также показывают, что скорость растворения микрокристаллов, состоящих из протамина,цинка и инсулина человека, весьма схожа с аналогичным показателем для инсулина NPH свиньи (илетин NPH). Эти результаты далее показывают, что скорость растворения сокристаллов, состоящих из протамина, цинка, В 29-Nоктаноил-LysD29-инсулина человека и обычного инсулина человека, зависит от отношения инсулина человека к В 29-N-октаноил-LysВ 29 инсулину человека, присутствующему в сокристаллах, в частности скорость растворения сокристаллов, состоящих из протамина, цинка,В 29-N-октаноил-LysВ 29-инсулина человека и инсулина человека, снижается при уменьшении пропорции инсулина человека. Другой способ измерения растворенного белка и производного белка использовали для сравнения скорости растворения вышеописанных микрокристаллов с отношением компонентов 1:3 с коммерческими препаратами инсулинаNPH человека, инсулина человека "ультралент" и инсулина крупного рогатого скота "ультралент", а также для исследования влияния на скорость растворения изменения отношения белка к производному белку. Препарат U100 (0,5 мл) суспендируют в 200 мл физиологического раствора с фосфатным буфером Дульбекко, имеющего рН 7,4, в аппарате для растворения с водяной рубашкой при 25 С. Буфер для растворения содержит также 1 мг/мл сывороточного альбумина человека, с тем чтобы предотвратить адсорбционные потери растворенных инсулинов. Среду растворения перемешивают при постоянной скорости, равной 180 об./мин. Через одинаковые промежутки времени отбирают 3,5 мл этого раствора и фильтруют его через фильтр 0,22 мкм с низким связыванием белка. Первые 0,5 мл фильтрата 25 выбрасывают и следующие 1,5 мл фильтрата подкисляют 4 мл 5 н. раствора НСl и анализируют при помощи ВЭЖХ. Концентрации растворенных инсулинов определяют на основании площадей пиков ВЭЖХ и выражают в процентах растворения в зависимости от времени, при этом 100% соответствуют общей площади инсулинов в нефильтрованных образцах. Если общая площадь нефильтрованных образцов незначительно уменьшается в зависимости от времени, то для вычисления процентного значения растворенного вещества в каждый период времени за 100% принимают значение с линейной поправкой. Результаты этих исследований представлены на фиг. 3 и 4. Данные, приведенные на фиг. 3, показывают, что, чем больше доля производного белка в микрокристалле, тем медленнее скорость растворения. Данные, приведенные на фиг. 4, показывают, что микрокристалл с соотношением инсулина человека и В 29-октаноилинсулина человека 1:3 растворяется значительно медленнее по сравнению с инсулином NPH человека и инсулином человека "ультралент". Важное значение имеет то, что микрокристаллы с отношением 1:3 имеют скорость растворения, схожую с аналогичным показателем инсулина крупного рогатого скота "ультралент". Инсулин крупного рогатого скота "ультралент" в течение длительного времени считался почти идеальным инсулиновым препаратом пролонгированного действия благодаря длительному сохранению биологической активности и ровной фармакодинамической реакции после его введения. Таким образом, можно предположить, что эти микрокристаллы могут обладать такой же или более высокой активностью, чем инсулин крупного рогатого скота "ультралент", при регулировании выделения основной глюкозы в течение продолжительных периодов времени. Так как профиль продолжительности действия препаратов NPH тесно связан со скоростью растворения микрокристаллов в подкожной тканевой жидкости, на основании этих экспериментов можно сделать вывод о том, что микрокристаллические композиции по настоящему изобретению обладают более продолжительным действием при подкожном введении субъектам, страдающим диабетом, чем существующие коммерческие препараты инсулинаNPH. Важно отметить, что эти результаты также показывают, что настоящее изобретение позволяет регулировать и даже оптимизировать продолжительность действия препарата у субъектов, изменяя отношение белка к производному белку. Возможность изменять продолжительность действия путем изменения соотношений белка и производного белка имеет особо важное значение, если рассматривать эту проблему в историческом аспекте. Основным препятствием к созданию инсулиновых препаратов для регулиро 003394 26 вания секреции основной глюкозы было то, что продолжительность их действия неразрывно связана с молекулярными свойствами белка,такими как сродство к связыванию альбумина,изоэлектрическая точка или растворимость. Следствием этого явилось то, что только одна продолжительность действия была возможна для каждой молекулы или препарата, и единственным способом улучшения фармакокинетики была дальнейшая модификация молекулы. Долговременной целью является создание систем доставки лекарственного средства с регулируемым высвобождением, в которых фармакокинетика может быть точно и удобно отрегулирована путем изменения матрицы препарата. На протяжении последних 15 лет многие научные и промышленные исследования в этой области были посвящены инсулину, однако,достижение регулируемого высвобождения оказалось нереальным из-за чрезвычайно узкого терапевтического индекса инсулина, необходимости его постоянного применения, а также экономических соображений, которые не позволяли создавать сложные и дорогостоящие способы и препараты. Основным преимуществом настоящего изобретения является то, что оно позволяет создать систему с регулируемым высвобождением,в которой фармакокинетику высвобождения инсулина можно регулировать гораздо проще,чем в других предлагаемых методах регулируемого высвобождения. То есть нерастворимая композиция, содержащая белок инсулина и производный белок, предоставляет удобный способ регулировать скорость растворения и, как следствие этого, делает возможным регулируемое высвобождение инсулина. Не ограничиваясь какими-либо рамками, можно предположить,что в основе фармакологической эффективности нерастворимых композиций по настоящему изобретению лежит медленное высвобождение из композиции необходимого количества обычного белка и производного белка. Далее можно предположить, не ограничивая объем изобретения, что важной отличительной особенностью этого изобретения является полная или почти полная однородность нерастворимой композиции. Что касается микрокристаллов, то можно отметить, что все отдельные микрокристаллы в суспензии имеют практически одинаковое соотношение белка и производного белка. Это соотношение очень близко отражает отношение белка к производному белку, соединенных в растворе перед кристаллизацией. Кроме того,считается, что по мере растворения микрокристаллов высвобождается требуемое и заранее определенное количество белка и производного белка на протяжении всего времени растворения. Это явление имеет важное значение, так как оно ведет к постоянной, но более низкой скорости поступления в кровоток двух активных молекул с места инъекции. Для достижения 27 этой цели особое внимание должно быть уделено способу получения композиций. Настоящее открытие, состоящее в том, что можно кристаллизовать белок с производным белком и, таким образом, получить однородные сокристаллы, имеет важное значение с учетом сложности параметров, влияющих на кристаллизацию белка: специфические и неспецифические межмолекулярные взаимодействия, такие как связывание водорода, электростатические взаимодействия, гидрофобные взаимодействия,силы межмолекулярного взаимодействия, взаимоисключающие влияния объемов, растворимость и пространственный объем. Хотя научное понимание кристаллизации маленьких молекул является достаточно глубоким, в отношении макромолекул комплексов эта наука все еще носит, в основном, качественный характер, и современная практика строится на эмпирическом применении многочисленных способов кристаллизации. Гидрофобный эффект предложен в качестве основной движущей силы для связывания белков [Chothia, С. et al., Nature 256:705-708(1975)]. Кроме того, отмечена сильная корреляция между поверхностной гидрофобностью и белок-белковыми связями [Young, L., et al., Protein Science 3:717-729 (1994)]. И все же с учетом сложности кристаллизации белков открытие того, что производные инсулины можно сокристаллизовывать с непроизводным белком в изоморфной или почти изоморфной форме в отношении нормального инсулина, является совершенно удивительным. Сокристаллизация двух родственных терапевтических белков с целью модификации терапевтического поведения является новой концепцией. В значительной степени это происходит потому, что большая часть работы по кристаллизации белков направлена на создание больших, однородных монокристаллов, пригодных для исследования при помощи рентгеноструктурного анализа. Хотя сокристаллы белка известны в этой области, такие системы сокристаллов определяются как комплексы хозяин-субстрат, например белок и его рецептор,комплексы белка и ДНК и комплексы рецептора белка и лекарственного средства. Сокристаллы комплекса хозяин-субстрат существенно отличаются от сокристаллов по настоящему изобретению, так как здесь отсутствует комплекс, образованный между белком и производным белком. Возможность прогнозирования пропорций белка и производного белка и однородности нерастворимых композиций по настоящему изобретению была продемонстрирована путем измерения (ВЭЖХ) концентраций белка и производного белка во время исследований по растворению двух препаратов микрокристаллов,которые были получены с использованием известных количеств инсулина человека (белка) и 28 В 29-октаноилинсулина человека (производный белок). В первом препарате массовое отношение белка, добавляемого к производному белку,равно 1:3. Во втором препарате эта пропорция равна 55:45. В микрокристаллах с отношением 1:3 В 29-октаноилинсулин человека составляет от около 73 до 76% общего белка для 14 измерений, выполняемых в течение 10 ч в условиях растворения, описанных выше для испытания на растворение. В этом случае также не наблюдалось отклонения данных. В микрокристаллах с отношением 55:45 В 29-октаноилинсулин человека составлял от около 43 до 47% общего белка для 9 измерений,выполняемых в течение примерно 3,75 ч в условиях растворения, описанных выше для испытания на растворение. Здесь также не наблюдалось отклонения данных. Нерастворимые композиции по настоящему изобретению могут быть кристаллами с палочкообразной или неупорядоченной морфологией либо они могут быть аморфными осадками. Предпочтительные нерастворимые композиции содержат ацилированный инсулин или аналог ацилированного инсулина, ионы цинка,присутствующие в количестве от около 0,3 до около 0,7 моля на моль общего белка, фенольный консервант, выбираемый из группы, включающей фенол, м-крезол, о-крезол, п-крезол,хлоркрезол, метилпарабен или их смеси, количество которого относительно общего белка должно быть достаточным для стабилизации конформации гексамера T2R3 или R6, и протамин, присутствующий в количестве от около 0,15 до около 0,7 моля на моль общего белка. Предпочтительную группу аналогов инсулина, предназначенных для получения аналогов производного инсулина, используемых для создания нерастворимых композиций по настоящему изобретению, составляют инсулины животных, делеционные аналоги и аналоги со сдвигом pI. В более предпочтительную группу входят инсулины животных и делеционные аналоги. Делеционные аналоги являются еще более предпочтительными. Другую предпочтительную группу аналогов инсулина, предназначенных для использования в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют аналоги мономерного инсулина. Особенно предпочтительными являются аналоги мономерного инсулина, в которых аминокислотный остаток в положении В 28 является Asp, Lys, Leu, Val или Ala, аминокислотный остаток в положении В 29 является Lys илиPro, аминокислотный остаток в положении В 10 является His или Asp, аминокислотный остаток в положении В 1 является Phe, Asp либо он удален один или вместе с остатком в положении В 2, аминокислотный остаток в положении В 30 является Thr, Ala, Ser или удален, и аминокислотный остаток в положении В 9 является Ser 29 или Asp; при условии, что остаток в положении В 28 или В 29 является Lys. Другую предпочтительную группу аналогов инсулина, предназначенных для использования в настоящем изобретении, составляют аналоги, в которых изоэлектрическая точка аналога инсулина находится в пределах от около 7,0 до около 8,0. Эти аналоги определяются как аналоги инсулина со сдвигом рI. Примерами аналогов инсулина со сдвигом рI являются, например, АrgВ 31, АrgВ 32-инсулин человека,GlyA21,АrgВ 31 АrgВ 32-инсулин человека,АrgА 0, АrgВ 31, АrgВ 32-инсулин человека и АrgА 0, GlyA21, АrgВ 31, АrgВ 32-инсулин человека. Другую предпочтительную группу аналогов инсулина составляют LysB28,РrоВ 29 инсулин человека (В 28 означает Lys; B29 означает Pro); AspB28-инсулин человека (В 28 означает Asp), AspB1-инсулин человека, АrgВ 31,АrgВ 32-инсулин человека, АrgА 0-инсулин человека, AspB1, СluВ 13-инсулин человека,АlаВ 26-инсулин человека, GlyA21-инсулин человека, дес(ТhrВ 30)инсулин человека и GlyA21,АrgВ 31,АrgВ 32-инсулин человека. Особенно предпочтительными аналогами инсулина являются LysB28, РrоВ 29-инсулин человека,дес(ТhrВ 30)инсулин человека,AspB28-инсулин человека и АlаВ 26-инсулин человека. Еще одним особенно предпочтительным аналогом инсулина является GlyA21,АrgВ 31, АrgВ 32-инсулин человека [Dorschug,M., патент США 5656722, 12 августа 1997 г.]. Наиболее предпочтительным аналогом инсулина является LysB28, ProB29-инсулин человека. Предпочтительными производными белками являются ацилированные белки, и предпочтительными ацилированными белками для получения микрокристаллов и препаратов по настоящему изобретению являются инсулин,ацилированный жирной кислотой, и аналоги инсулина, ацилированного жирной кислотой. Ацилированный жирной кислотой инсулин человека является особенно предпочтительным. Аналоги инсулина, ацилированного жирной кислотой, предпочтительны в равной степени. Конкретная группа, используемая для получения производного инсулина, аналога инсулина и проинсулина (общее название "белок"),может быть любой химической частью молекулы, которая существенно не уменьшает биологическую активность белка, не является токсичной при связывании с белком и, что наиболее важно, уменьшает растворимость в воде, повышает липофильность или уменьшает растворимость комплексов цинка/протамина производного белка. Одну предпочтительную группу ацилирующих частей составляют жирные кислоты,которые имеют прямую цепь и являются насыщенными. В эту группу входят метановая кислота (С 1), этановая кислота (С 2), пропановая(С 14), н-пентадекановая кислота (С 15), н-гексадекановая кислота (С 16), н-гептадекановая кислота (С 17) и н-октадекановая кислота (С 18). Производными формами являются формил (С 1),ацетил (С 2), пропионил (С 3), бутирил (С 4), пентаноил (С 5), гексаноил (С 6), гептаноил (С 7),октаноил (С 8), нонаноил (С 9), деканоил (С 10),ундеканоил (С 11), додеканоил (С 12), тридеканоил (С 13), тетрадеканоил (С 14) или миристоил,пентадеканоил (С 15), гексадеканоил (С 16) или пальмитиновая кислота, гептадеканоил (С 17) и октадеканоил (С 18) или стеариновая кислота. Предпочтительную группу жирных кислот,предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению,составляют жирные кислоты, имеющие четное число атомов углерода, то есть С 2, С 4, С 6, С 8,С 10, С 12, С 14, С 16 и С 18 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие нечетное число атомов углерода, то есть С 1, С 3,С 5, С 7, С 9, С 11, С 13, С 15 и С 17 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие более 5 атомов углерода, то есть С 6, С 7, С 8, С 9,С 10, С 11, С 12, С 13, С 14, C15, C16, С 17 и С 18 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие менее 9 атомов углерода, то есть С 1, С 2, С 3, С 4,С 5, С 6, С 7 и С 8 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие от 6 до 8 атомов углерода, то есть С 6, С 7 и С 8 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие 31 от 4 до 6 атомов углерода, то есть С 4, С 5 и С 6 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие от 2 до 4 атомов углерода, то есть С 2, С 3 и С 4 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие менее 6 атомов углерода, то есть С 1, С 2, С 3, С 4 и С 5 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие менее 4 атомов углерода, то есть C1, C2 и С 3 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие более 9 атомов углерода, то есть С 10, С 11, С 12,С 13, С 14, C15, C16, С 17 и С 18 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие четное число и более 9 атомов углерода, то есть С 10, С 12, С 14, C16 и С 18 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие 12, 14 или 16 атомов углерода, то есть С 12, С 14 и C16 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие 14 или 16 атомов углерода, то есть С 14 и С 16 насыщенные жирные кислоты. Жирные кислоты с 14 атомами углерода являются особенно предпочтительными. Жирные кислоты с 16 атомами углерода также предпочтительны. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие 32 от 4 до 10 атомов углерода, то есть С 4, С 5, С 6,С 7, С 8, С 9 и С 10 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие четное число и от 4 до 10 атомов углерода, то есть С 4, С 6, С 8 и С 10 насыщенные жирные кислоты. Другую предпочтительную группу жирных кислот, предназначенных для получения ацилированных жирной кислотой белков, используемых в микрокристаллах по настоящему изобретению, составляют жирные кислоты, имеющие 6, 8 или 10 атомов углерода. Жирные кислоты с 6 атомами углерода являются предпочтительными. Жирные кислоты с 8 атомами углерода являются особенно предпочтительными. Жирные кислоты с 10 атомами углерода также являются особенно предпочтительными. Специалисту в этой области должно быть понятно, что более узкие предпочтительные группы можно получить, объединяя вышеописанные предпочтительные группы жирных кислот. Другую предпочтительную группу ацилирующих частей молекулы составляют насыщенные жирные кислоты с разветвленной цепью. Жирная кислота с разветвленной цепью имеет,по крайней мере, две цепи. Длина "цепи" жирной кислоты с разветвленной цепью может быть определена по числу атомов углерода в цепи,начинающемся с атома углерода кислоты. Например, жирная кислота с разветвленной цепью,а именно 3-этил-5-метилгексановая кислота имеет три цепи длиной 5, 6 и 6 атомов углерода. В этом случае "наибольшая" цепь равна 6 атомам углерода. В качестве другого примера можно привести 2,3,4,5-тетраэтилоктановую кислоту, которая имеет пять цепей длиной 4, 5, 6, 7 и 8 атомов углерода. "Наибольшая" цепь равна 8 атомам углерода. Предпочтительную группу жирных кислот с разветвленной цепью составляют кислоты, имеющие от 3 до 10 атомов углерода в наибольшей цепи. Ниже приведены типичные примеры насыщенных жирных кислот с разветвленной цепью, дающие представление о диапазоне жирных кислот, которые можно использовать в качестве ацилирующих частей белков при осуществлении настоящего изобретения: 2-метилпропионовая кислота, 2-метилмасляная кислота, 3 метилмасляная кислота, 2,2-диметилпропионовая кислота, 2-метилпентановая кислота, 3-метилпентановая кислота, 4-метилпентановая кислота, 2,2-диметилмасляная кислота, 2,3-диметилмасляная кислота, 3,3-диметилмасляная кислота, 2-этилмасляная кислота, 2-метилгексановая кислота, 5-метилгексановая кислота, 2,2 диметилпентановая кислота, 2,4-диметилпентановая кислота, 2-этил-3-метилмасляная кислота, 33 2-этилпентановая кислота, 3-этилпентановая кислота, 2,2-диметил-3-метилмасляная кислота, 2 метилгептановая кислота, 3-метилгептановая кислота, 4-метилгептановая кислота, 5-метилгептановая кислота, 6-метилгептановая кислота,2,2-диметилгексановая кислота, 2,3-диметилгексановая кислота, 2,4-диметилгексановая кислота, 2,5-диметилгексановая кислота, 3,3-диметилгексановая кислота, 3,4-диметилгексановая кислота, 3,5-диметилгексановая кислота, 4,4-диметилгексановая кислота, 2-этилгексановая кислота, 3-этилгексановая кислота, 4-этилгексановая кислота, 2-пропилпентановая кислота, 2 этилгексановая кислота, 3-этилгексановая кислота, 4-этилгексановая кислота, 2-(1-пропил)пентановая кислота, 2-(2-пропил)пентановая кислота, 2,2-диэтилмасляная кислота, 2,3,4-триметилпентановая кислота, 2-метилоктановая кислота, 4-метилоктановая кислота, 7-метилоктановая кислота, 2,2-диметилгептановая кислота,2,6-диметилгептановая кислота, 2-этил-2-метилгексановая кислота, 3-этил-5-метилгексановая кислота, 3-(1-пропил)гексановая кислота, 2-(2 бутил)пентановая кислота, 2-(2-(2-метилпропилпентановая кислота, 2-метилнонановая кислота, 8-метилнонановая кислота, 6-этилоктановая кислота, 4-(1-пропил)гептановая кислота, 5(2-пропил)гептановая кислота, 3-метилундекановая кислота, 2-пентилгептановая кислота,2,3,4,5,6-пентаметилгептановая кислота, 2,6-диэтилоктановая кислота, 2-гексилоктановая кислота, 2,3,4,5,6,7-гексаметилоктановая кислота,3,3-диэтил-4,4-диэтилгексановая кислота, 2 гептилнонановая кислота, 2,3,4,5-тетра-этилоктановая кислота, 2-октилдекановая кислота и 2(1-пропил)-3-(1-пропил)-4,5-диэтил-6-метилгептановая кислота. Другую предпочтительную группу ацилирующих частей составляют циклические алкильные кислоты, имеющие от 5 до 24 атомов углерода, в которых одна или несколько циклических алкильных частей имеют 5-7 атомов углерода. Ниже приведены типичные примеры таких циклических алкильных кислот, дающие представление о диапазоне кислот, которые можно использовать в качестве ацилирующих частей белков при осуществлении настоящего изобретения: циклопентилмуравьиная кислота,циклогексилмуравьиная кислота, 1-циклопентилуксусная кислота, 2-циклогексилуксусная кислота, 1,2-дициклопентилуксусная кислота и тому подобные. Предпочтительную группу производных белков, предназначенных для использования в нерастворимых композициях по настоящему изобретению, составляют моноацилированные белки. Наиболее предпочтительным является моноацилирование в положении -аминогруппы. Для инсулина предпочтительным является моноацилирование в положении LysB29. Подобным образом, для определенных аналогов инсулина, таких как аналог LysB28,РrоВ 29 003394 34 инсулина человека, наиболее предпочтительным является моноацилирование в положении-аминогруппы LysB28. Моноацилирование в положении -аминогруппы В-цепи (В 1) также является предпочтительным. Не менее предпочтительным является моноацилирование в положении -аминогруппы А-цепи (А 1). Другую предпочтительную группу ацилированных белков, предназначенных для использования в нерастворимых композициях по настоящему изобретению, составляют диацилированные белки. Диацилирование может быть произведено, например, в положении -аминогруппы Lys и в положении -аминогруппы Вцепи, в положении -аминогруппы Lys и в положении -аминогруппы А-цепи или в положении -аминогруппы А-цепи и в положении аминогруппы В-цепи. Другую предпочтительную группу ацилированных белков, предназначенных для использования в нерастворимых композициях по настоящему изобретению, составляют триацилированные белки. Триацилированными белками являются белки, ацилированные в положении аминогруппы Lys, в положении -аминогруппы В-цепи и в положении -аминогруппы А-цепи. Кроме того, можно использовать ацилированные белки, представляющие собой смесь моноацилированных и диацилированных белков. Аналогичным образом можно использовать ацилированные белки, представляющие собой смесь моноацилированных и триацилированных белков. Другую предпочтительную группу ацилированных белков составляет смесь диацилированных и триацилированных белков. Кроме того, можно использовать ацилированные белки, представляющие собой смесь моноацилированных, диацилированных и триацилированных белков. Ниже приведены некоторые ацилированные жирной кислотой белки, используемые в микрокристаллах по настоящему изобретению,которые дают представление об объеме настоящего изобретения. Этот список является иллюстративным, и тот факт, что в нем не указан какой-либо конкретный белок, ацилированный жирной кислотой, не означает, что содержащий его микрокристалл не входит в объем настоящего изобретения. В 29-N-формилинсулин человека;A1-N-бутирил-,B1-N-бутирилдес(ThrB30)инсулин человека; В 29-N-бутирил-, A1-N-бутирил-, B1-Nбутирил-дес(ThrB30)инсулин человека. Предпочтительными являются водные композиции, содержащие воду в качестве главного растворителя. Особенно предпочтительными являются водные суспензии, в которых растворителем является вода. Композиции по настоящему изобретению предназначены для лечения пациентов, страдающих диабетом или гипергликемией. Препараты по настоящему изобретению обычно содержат производный белок в концентрациях от около 1 до около 10 мг/мл. Препараты по настоящему изобретению, содержащие продукты инсулина, обычно оценивают по числу единиц активности инсулина (ед/мл), например U40,U50, U100 и так далее, что соответствует примерно 1,4, 1,75 и 3,5 мг/мл препарата. Дозу, способ введения и число введений в день определяет лечащий врач с учетом таких факторов, как лечебные цели, характер и причина заболевания, пол и масса тела пациента, уровень физической подготовки, пищевые привычки, способ введения, и других факторов, хорошо известных квалифицированному врачу. Дневная доза в широких пределах составляет от около 1 до около 6 нмоль/кг массы тела (считается, что 6 нмоль эквивалентны примерно 1 единице активности инсулина). В современной инсулинотерапии обычно применяется доза от около 2 до около 3 нмоль/кг. Врач, обладающий необходимой квалификацией в области лечения диабета, может выбрать терапевтически наиболее приемлемый способ введения препаратов по настоящему изобретению. Парентеральные способы введения являются предпочтительными. Типичными способами парентерального введения суспензионных препаратов инсулина являются подкожные и внутримышечные инъекции. Композиции и препараты по настоящему изобретению можно также вводить назальным, трансбуккальным,легочным или глазным способами. В качестве изотонического агента предпочтителен глицерин в концентрации от 12 до 25 мг/мл. Для регулирования изотоничности 42 еще предпочтительнее использовать глицерин в концентрации от около 15 до около 17 мг/мл. М-крезол и фенол или их смеси являются предпочтительными консервантами в препаратах по настоящему изобретению. Инсулин, аналоги инсулина или проинсулины, используемые для получения производных белков, можно получить любым известным методом синтеза пептида, включая классические методы (растворение, твердофазные методы,полусинтетические методы и недавно получившие признание методы рекомбинантных ДНК.) См., например. Chance, R.E., et al., патент США 5514646, 7 мая 1996 г.; публикация ЕРО 383472, 7 февраля 1996 г.; Brange, J.J.V., et al.,публикация ЕРО 214826, 18 марта 1987 г.; иBelagaje, P.M., et al., патент США 5304473, 19 апреля 1994 г., в которых описаны способы получения разных проинсулинов и аналогов инсулина. Эти работы включены в это описание изобретения в качестве ссылки. Производные белки обычно получают методами, известными в этой области. В вышеуказанных публикациях, посвященных производным белкам, описаны приемлемые методы получения производных белков. Эти публикации включены в это описание изобретения в качестве ссылки на методы получения производных белков. Чтобы получить ацилированный белок,исходный белок подвергают взаимодействию с активированной органической кислотой, такой как активированная жирная кислота. Активированные жирные кислоты являются производными обычно используемых ацилирующих агентов и включают активированные сложные эфиры жирных кислот, галогенангидриды жирных кислот, активированные амиды жирных кислот,например производные активированного азолида [Hansen, L.В., публикация WIPO98/02460,22 января 1998 г.] и ангидриды жирных кислот. Использование активированных сложных эфиров, в частности N-гидроксисукцинимидоэфиров жирных кислот, является особенно предпочтительным способом ацилирования свободной аминокислоты жирной кислотой. Lapidot, etal., описывают способ получения N-гидроксисукцинимидоэфиров и их применение для получения N-лауроилглицина, N-лауроил-Lсерина и N-лауроил-L-глутаминовой кислоты. Термин "активированный сложный эфир жирной кислоты" означает жирную кислоту, которая была активирована обычными методами,известными в этой области [Riordan, J.F. andVallee, В.L., Methods in Enzymology, XXV:494499 (1972); Lapidot, Y., et al., J. Lipid Res. 8:142145 (1967)]. Гидроксибензотриазид (НОВТ), Nгидроксисукцинимид и их производные широко используются для получения активированных кислот, применяемых для синтеза пептидов. Для избирательного ацилирования -аминогруппы можно использовать разные защит 43 ные группы, блокирующие -аминогруппы во время осуществления реакции сочетания. У специалиста в этой области не вызовет затруднений выбор приемлемой защитной группы, в частности, такой группой может быть пметоксибензоксикарбонил (pmZ). -Аминогруппу предпочтительно ацилируют в соответствии с одностадийным синтезом без использования защитных групп для аминогруппы. Способ избирательного ацилирования в положении Nаминогруппы остатка Lys описан в заявке на патент Baker, J.С., et al., патент США 5646242,выданный 8 июля 1997 г., который полностью включен в это описание изобретения в качестве ссылки. Способ получения сухого порошка ацилированного белка рассмотрен в заявке на патент Baker, J.С. et а 1., патент США 5700904,выданный 23 декабря 1997 г., который полностью включен в это описание изобретения в качестве ссылки. Цинк, используемый в препаратах по настоящему изобретению, прежде всего, служит для облегчения процесса получения гексамеровZn(II) белка и производного белка, отдельно в виде смешанных гексамеров или вместе в виде гибридных гексамеров. Цинк облегчает получение гексамеров инсулина и аналогов инсулина. Цинк стимулирует образование гексамеров производного инсулина и аналогов инсулина. Чтобы получить гексамер, показатель рН раствора,содержащего белок или производный белок либо оба белка вместе, доводят до нейтрального значения в присутствии ионов Zn(II) или добавляют Zn(II) после того, как показатель рН будет доведен до нейтрального значения. Для достижения эффективного выхода микрокристаллов или аморфного осадка молярное отношение цинка к общему белку в микрокристалле и аморфном осадке по настоящему изобретению доводят до нижнего предела, равного примерно 0,33, то есть вводят примерно два атома цинка на гексамер, необходимые для эффективной гексамеризации. Композиция, состоящая из микрокристаллов и аморфного осадка, предпочтительно имеет от около 2 до около 4-6 атомов цинка при отсутствии соединения,конкурирующего с инсулином за связывание цинка. В присутствии соединения, конкурирующего с белком за связывание цинка, такого как цитрат или фосфат, можно использовать даже большее количество цинка. Для усиления гексамеризации может потребоваться избыток цинка, превышающий минимальное количество,необходимое для эффективной гексамеризации. Кроме того, избыток цинка, превышающий минимальное количество, может присутствовать в препарате по настоящему изобретению для улучшения химической и физической стойкости, для улучшения суспендируемости и, возможно, для дальнейшего увеличения времени действия. Поэтому существует достаточно ши 003394 44 рокий диапазон отношений цинк:белок, используемых в нерастворимых композициях, способах и препаратах по настоящему изобретению. В соответствии с настоящим изобретением цинк присутствует в препарате в количестве от около 0,3 до около 7 молей на моль общего белка и более предпочтительно от 0,3 до около 1,0 моля общего белка. Отношение цинка к производному белку предпочтительнее всего составляет от около 0,3 до около 0,7 моля атомов цинка на моль общего белка. Еще более предпочтительным является отношение цинка к общему белку от около 0,30 до около 0,55 моля атомов цинка на моль общего белка. В случае более сильных препаратов на основе цинка, которые подобны препаратам PZI, отношение цинка составляет от около 5 до около 7 молей цинка на моль общего белка. Соединение цинка, дающее цинк для настоящего изобретения, может быть любым фармацевтически приемлемым соединением цинка. В этой области хорошо известны способы введения цинка в инсулиновые препараты и фармацевтически приемлемые источники цинка. Предпочтительными соединениями цинка,дающими цинк для осуществления настоящего изобретения, являются хлорид цинка, ацетат цинка, цитрат цинка, оксид цинка и нитрат цинка. Для получения микрокристаллов и осадков по настоящему изобретению необходимо комплексообразующее соединение. Комплексообразующее соединение должно присутствовать в достаточных количествах, чтобы вызвать значительное осаждение и кристаллизацию гексамеров. Такие количества можно определить для конкретного препарата с определенным комплексообразующим соединением при помощи простых экспериментов по титрованию. Концентрацию комплексообразующих соединений нужно довести до требуемого значения, чтобы в фазе раствора после окончания осаждения и кристаллизации оставалось незначительное количество комплексообразующего соединения. Для этого комплексообразующее соединение нужно вводить на основании отношения "усвоения", установленного экспериментальным путем. Считается, что это отношение аналогично отношениям NPH и NPL. Однако оно может незначительно отличаться, так как получение производного соединения может повлиять на характер взаимосвязи между белком и протамином. Когда комплексообразующим соединением является протамин, он присутствует в микрокристаллах в количестве от около 0,15 до около 0,5 мг на 3,5 мг общего белка. Отношение протамина к общему белку предпочтительно составляет от около 0,25 до около 0,40 (мг/мг). Это отношение более предпочтительно составляет от около 0,25 до около 0,38 (мг/мг). Протамин предпочтительно используют в количестве 45 от 0,05 до около 0,2 мг/мг общего белка и более предпочтительно в количестве от около 0,05 до около 0,15 мг протамина на миллиграмм общего белка. Сульфат протамина является предпочтительной солью протамина, предназначенной для использования в настоящем изобретении. Масса сульфата протамина или другой соли протамина должна быть отрегулирована в соответствии с массой свободного основания протамина, которое может быть использовано для той же цели, с учетом коэффициента, равного отношению молекулярных масс соли и протамина. Чтобы еще больше увеличить время действия композиций по настоящему изобретению или улучшить их суспендируемость, после кристаллизации в них можно добавить дополнительный протамин и цинк. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят препараты, содержащие протамин в более высоком количестве, чем отношение усвоения. Содержание протамина в этих препаратах составляет от 0,25 до около 0,5 мг протамина на мг общего белка. Необходимым компонентом микрокристаллов и осадков по настоящему изобретению является стабилизатор гексамера. В научной литературе описаны структуры трех гексамерных конформаций, которые обозначены Т 6,T3R3 и R6. В присутствии стабилизатора гексамера, например разных фенольных соединений,происходит стабилизация конформаций R6. Поэтому весьма вероятно, что гексамеры имеют конформацию R6 или T3R3, полученную в кристаллах или осадках в присутствии стабилизатора гексамера, такого как фенол или м-крезол. При осуществлении этого изобретения можно использовать целый ряд стабилизаторов гексамера. Они должны присутствовать в достаточных пропорциях относительно общего белка,чтобы стабилизировать конформацию гексамераR6. Для эффективной стабилизации гексамера необходимо использовать, по крайней мере, 2 или 3 моля стабилизатора гексамера на гексамер. Желательно, чтобы в микрокристаллах и осадках по настоящему изобретению присутствовало, по крайней мере, 3 моля стабилизатора гексамера на гексамер. Присутствие в растворе,из которого получают микрокристаллы и осадки, стабилизатора гексамера в более высоких концентрациях, например в 25-50 раз больше, не оказывает вредного влияния на стабилизацию гексамера. В препаратах по настоящему изобретению может присутствовать консервант, особенно в тех случаях, когда препарат предназначен для многократного использования. Как указывалось выше, известен целый ряд приемлемых консервантов. Консервант предпочтительно присутствует в растворе в количестве, приемлемом для обеспечения антимикробного действия в соответствии с требованиями фармакопеи. Предпочтительными консервантами являются вышеуказанные фенольные консерванты. 46 Предпочтительные концентрации для фенольного консерванта составляют от около 2 до около 5 мг на миллилитр препарата в виде водной суспензии. Эти концентрации относятся к общей массе фенольных консервантов, так как предполагается, что могут быть использованы смеси отдельных фенольных консервантов. Приемлемыми фенольными консервантами являются,например, фенол, м-крезол и метилпарабен. Предпочтительными фенольными соединениями являются фенол и м-крезол. Смеси фенольных соединений, таких как фенол и м-крезол,также являются весьма предпочтительными. Типичные смеси фенольных соединений включают 0,6 мг/мл фенола и 1,6 мг/мл м-крезола и 0,7 мг/мл фенола и 1,8 мг/мл м-крезола. Микрокристаллы по настоящему изобретению предпочтительно имеют продолговатую форму и известны как "палочкообразные" одиночные кристаллы, содержащие белок, производный белок, катион двухвалентного металла,комплексообразующее соединение и стабилизатор гексамера. Средняя длина микрокристаллов по настоящему изобретению предпочтительно равна 1-40 мкм и более предпочтительно 3-15 мкм. Предпочтительная композиция содержит от около 3 до около 6 мг сульфата протамина на 35 мг общего белка и от около 0,1 до около 0,4 мг цинка на 35 мг общего белка. Другая предпочтительная композиция содержит от около 10 до около 17 мг сульфата протамина на 35 мг общего белка и от около 2,0 до около 2,5 мг цинка на 35 мг общего белка. Другая предпочтительная композиция содержит в 1 мл раствора 0,34-0,38 мг сульфата протамина, 0,01-0,04 мг цинка и 3,2-3,8 мг общего белка. В сокристаллах и аморфных осадках по настоящему изобретению должен присутствовать как непроизводный белок, так и производный белок. Соотношение между массами этих белков определяет время действия препаратов. Предпочтительное отношение количества молей белка к количеству молей производного белка составляет от около 1:100 до около 100:1. Другое предпочтительное отношение количества молей белка к количеству молей производного белка составляет от около 1:1 до около 100:1. Еще одно предпочтительное отношение количества молей белка к количеству молей производного белка составляет от около 1:1 до около 20:1. Другие предпочтительные отношения количества молей белка к количеству молей производного белка составляют от около 2:1 до около 20:1; от около 2:1 до 10:1; от около 2:1 до 5:1; от около 3:1 до 5:1; от 1:1 до 1:20; от 1:1 до 1:10; от около 1:2 до около 1:20; от около 1:2 до 1:10; от около 1:2 до 1:5; от около 1:3 до 1:5; от около 10:1 до около 1:10; от около 9:1 до около 1:9; от около 5:1 до около 1:5 и от около 3:1 до около 1:3. 47 Настоящее изобретение относится к способам получения указанных композиций. Кроме того, в объем настоящего изобретения входит применение нерастворимых композиций для получения лекарственных средств, предназначенных для регулирования содержания глюкозы в крови и лечения диабета или гипергликемии. Аморфные осадки и микрокристаллы по настоящему изобретению, предназначенные для использования в лекарственных средствах или для других применений, можно получить разными способами. Приемлемые способы обычно включают стадии в одной из нижеследующих последовательностей: солюбилизация (если исходное вещество находится в сухом состоянии), гексамеризация,гомогенизация, комплексообразование, осаждение, кристаллизация и необязательно получение композиции; или солюбилизация (если исходное вещество находится в сухом состоянии), гомогенизация,гексамеризация, комплексообразование, осаждение, кристаллизация и необязательно получение композиции. Солюбилизация означает растворение производного белка и белка в достаточной степени для образования гексамеров. Гексамеризация означает процесс связывания молекул белка и производного белка с цинком(II) для образования гексамеров. Комплексообразование означает образование нерастворимых комплексов между гексамерами и протамином. Осаждение обычно происходит в результате образования нерастворимых комплексов. Кристаллизация означает превращения осажденных комплексов гексамера/протамина в кристаллы,обычно в палочкообразные кристаллы. Солюбилизацию осуществляют, растворяя производный белок и белок в водном растворителе. Водный растворитель может быть, например, кислым, нейтральным или основным раствором. Водный растворитель может частично включать смешиваемый органический растворитель, такой как этанол, ацетонитрил, диметилсульфоксид и тому подобные. Кислые растворы могут быть, например, растворами НСl,содержащими предпочтительно от около 0,01 н. НСl до около 1,0 н. НСl. Можно использовать другие фармацевтически приемлемые кислоты. Основные растворы могут быть, например, растворами NaOH, содержащими предпочтительно от около 0,01 н. NaOH до около 1,0 н. NaOH или больше. Можно использовать другие фармацевтически приемлемые основания. Для сохранения стабильности белка концентрация кислоты или основания должна быть как можно меньше,но при этом она должна быть достаточной для эффективного растворения белка и производного белка. Большинство белков (инсулин, аналоги инсулина и проинсулины) и многие производ 003394 48 ные белки можно растворить до приемлемых концентраций при нейтральном значении рН. Растворы, предназначенные для растворения производных белков при нейтральном значении рН, могут содержать буфер и необязательно одно или несколько дополнительных растворенных веществ, таких как соли, фенольные соединения, цинк и изотонические агенты. Если гексамеризацию осуществляют до гомогенизации, сначала образуются две совокупности однородных гексамеров, после чего эти совокупности смешивают с получением смешанных гексамеров. Если сначала производят гомогенизацию, то в результате последующей гексамеризации получают гибридные гексамеры. Как указывалось выше, чтобы получить нерастворимые композиции, состоящие из гибрадных гексамеров, белок и производный белок гомогенизируют в условиях, способствующих диссоциации на мономерное или димерное агрегатные состояния, до гексамеризации с катионом двухвалентного металла. Для достижения необходимой диссоциации белок и производный белок можно смешивать в сильно кислотных или сильно основных условиях. На степень диссоциации и последующей гомогенизации влияют условия растворения, выбранные на этой стадии. Инсулин и родственные белки легко самоассоциируются в результате осуществления последовательности реакций с образованием димеров, гексамеров и других ассоциированных форм. Равновесное распределение этих ассоциированных форм зависит от многих параметров, включая показатель рН. Обычно считается, что эти реакции ассоциации позволяют получить, главным образом, совокупность мономеров, димеров и гексамеров. Поэтому в зависимости от выбранных условий растворения во время гомогенизации должно производиться смешивание мономеров, димеров или их смесей. Гомогенизация в 1 н. растворе HCl, например,ведет к смешиванию большего количества мономеров, чем гомогенизация в 0,1 н. растворе НСl, что увеличивает вероятность смешивания большего количества димеров. При получении композиций, содержащих гибридные гексамеры, процесс гомогенизации будет эффективным только тогда, когда в применяемых условиях гомогенизации имеется очень небольшая или пренебрежимая фракция однородных гексамеров белка или производного белка. Композиции, содержащие смешанные гексамеры, включают, главным образом, два типа гексамеров, а именно гексамеры белка и гексамеры производного белка. В этом случае стадию гомогенизации осуществляют после стадии гексамеризации и производят гомогенизацию гексамеров до комплексообразования с использованием комплексообразующего соединения. Стадию гомогенизации осуществляют в условиях растворения, которые стабилизируют гексамер Zn(II)инсулина. Условия растворения, ста 49 билизирующие гексамеры инсулина, хорошо известны в научной литературе. Для гексамеризации необходимы такие условия растворения, которые позволяют получить в растворе гибридные или смешанные гексамеры. Эти условия идентичны или подобны условиям, в которых производят гексамеризацию инсулина или аналогов инсулина. Обычно для гексамеризации необходим цинк и нейтральный или слегка основный показатель рН,который находится в пределах от около 6,8 до около 8,4. Присутствие стабилизатора гексамера благоприятно влияет на гексамеризацию, стимулируя образование конформаций R6 илиT3R3 производного белка и в некоторых случаях также белка. При использовании некоторых аналогов мономерного инсулина для образования гексамеров необходим стабилизатор гексамера. В случае композиций, содержащих гибридные гексамеры, можно получить семь гексамерных видов: Р 6, P5D1, Р 4D2, Р 3D3, P2D4, P1D5 иD6, где Р обозначает мономер белка и D обозначает мономер производного белка. Предполагается, что статистическое распределение гексамеров соответствует распределению Пуассона,причем на этот показатель влияет относительная пропорция белка и производного белка и степень диссоциации до гексамеризации. Например, из гомогенизированного раствора, состоящего, в основном, из димеров, можно получить четыре основных гибридных гексамера: P6,Р 4D2, P2D4 и D6. В случае композиций, содержащих смешанные гексамеры, можно получить только два гексамерных вида: Р 6 и D6. Стадия комплексообразования включает смешивание комплексообразующего соединения с гексамером в условиях растворения, при которых каждое вещество первоначально растворяется. Этот процесс осуществляют, смешивая отдельные растворы гексамеров и протамина или получая сначала раствор белка, производного белка и протамина при кислотном или основном показателе рН с последующим сдвигом рН к нейтральному значению. Во время кристаллизации условия растворения должны стабилизировать кристаллизующиеся виды и способствовать превращению осадка в растворенное вещество и затем в кристаллы. Таким образом, условия растворения должны определять скорость и выход кристаллизации. Кристаллизация, по-видимому, вызывает уравновешивание комплекса, включая некристаллический осадок, растворенные комплексы гексамера с протамином и кристаллы. Чтобы получить микрокристаллы, условия, выбранные для кристаллизации, должны вызывать смещение равновесное состояние в сторону образования кристаллов. Кроме того, с учетом гипотетического равновесия ожидается, что растворимость производного белка сильно влияет на скорость кристаллизации и размер 50 кристаллов, так как более низкая растворимость, по-видимому, замедляет превращение осадка в раствор и затем в кристаллы. Из этого следует, что замедление скорости кристаллизации часто ведет к образованию более крупных кристаллов. Таким образом, считается, что скорость кристаллизации и размер кристаллов зависят от размера и характера части производного белка, образующей производное соединение. Параметрами кристаллизации, влияющими на скорость кристаллизации и размер кристаллов по настоящему изобретению, являются размер и характер ацильной группы; температура; наличие и концентрация соединений, конкурирующих с белком и производным белком за связывание с цинком, таких как цитрат, фосфат и тому подобные; характер и концентрация одного или нескольких фенольных соединений; концентрация цинка; присутствие и концентрация смешивающегося органического растворителя; время, необходимое для кристаллизации; значение рН и ионная сила; характер и концентрация буфера; концентрация осадителей; присутствие затравочных веществ: форма и материал емкости; скорость перемешивания и концентрация общего белка. Считается, что особое значение имеют температура и концентрация конкурирующих соединений. Конкурирующие соединения, такие как цитрат, могут влиять на скорость образования кристаллов и косвенно на размер и качество кристаллов. Эти соединения могут действовать путем образования координационных комплексов с цинком в растворе, конкурируя таким образом с относительно слабыми сайтами связывания цинка на поверхности гексамера. Занятость этих слабых поверхностных сайтов связывания, вероятно, препятствует кристаллизации. Кроме того, многие производные белки частично нерастворимы в присутствии цинка в количестве более 0,333 на моль производного белка и присутствие конкурирующих соединений восстанавливает растворимость и способствует кристаллизации. Оптимальную концентрацию конкурирующего соединения можно определить обычными методами, предназначенными для любой комбинации белка и производного белка. Верхним пределом, несомненно, является концентрация, при которой цинк осаждается конкурирующим соединением, или концентрация, при которой остаточное конкурирующее соединение является фармацевтически неприемлемым, например когда оно вызывает боль или раздражение в месте введения. Ниже приведен пример способа получения осадков и кристаллов по настоящему изобретению. Измеренные количества производного белка и белка растворяют или смешивают с получением раствора в водном растворителе, содержащем стабилизатор гексамера, такой как фенольное соединение. К этому раствору добавляют раствор цинка в виде одной из его раство 51 римых солей, например Zn(II)Cl2, до концентрации от около 0,3 моля цинка на моль производного инсулина до около 0,7 моля или 1,0 моля цинка на моль общего белка (белок 4- производный белок). К этому раствору необязательно добавляют абсолютный этанол или другой смешивающийся органический растворитель в количестве, необходимом для получения раствора,содержащего от примерно 5 до примерно 10 об.% органического растворителя. Этот раствор затем фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя измеренное количество протамина в водном растворителе. Этот раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Раствор белка и производного белка смешивают с раствором протамина, в результате чего сначала образуется осадок. Полученную суспензию медленно перемешивают при комнатной температуре (обычно около 20-25 С), в результате чего в течение периода времени от около 4 ч до около 10 дней образуются микрокристаллы. Микрокристаллы затем отделяют от маточного раствора и вводят в другой растворитель для хранения и введения пациенту. Примерами соответствующих водных растворителей являются вода для инъекций, содержащая 25 мМ TRIS,5 мг/мл фенола и 16 мг/мл глицерина; вода для инъекций, содержащая 2 мг/мл двухосновного фосфата натрия, 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола и 16 мг/мл глицерина; и вода для инъекций, содержащая 25 мМ TRIS, 5 мг/мл фенола,0,1 М тринатрийцитрата и 16 мг/мл глицерина. В соответствии с другим способом получения нерастворимых композиций по настоящему изобретению измеренную массу сухого производного белка и измереннyю массу сухого белка растворяют вместе в кислотном водном растворителе, таком как 0,1-1,0 н. раствор НСl. Этот раствор перемешивают до полного смешивания производного белка и белка. Отношение порошка производного белка к порошку белка в этой смеси определяют с таким расчетом, чтобы получить такое же отношение производного белка к белку в нерастворимой композиции. Отдельно полученный водный раствор, содержащий фенольный консервант и необязательно фармацевтически приемлемый буфер, смешивают с кислым раствором белков. Показатель рН полученного раствора доводят до величины от около 6,8 до около 8,4, предпочтительно от около 6,8 до около 8,0 или предпочтительно до рН от около 7,2 до около 7,8 и наиболее предпочтительно от около 7,4 до около 7,8. К этому раствору добавляют раствор цинка в виде одной из его растворимых солей, например Zn(II)Cl2, до концентрации от около 0,3 моля цинка на моль общего инсулина до около 4 молей цинка на моль общего инсулина. Этот раствор доводят до указанного выше значения рН, предпочтительно до около 7,4-7,6, и фильтруют через 0,22 микронный 52 фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя измеренную массу протамина в водном растворителе. Раствор протамина можно профильтровать через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Раствор белка и производного белка смешивают с раствором протамина, в результате чего сначала образуется осадок. Полученную суспензию медленно перемешивают при комнатной температуре (обычно около 20-25 С), в результате чего в течение периода времени от около 4 ч до около 10 дней образуются микрокристаллы. В соответствии с еще одним способом получения нерастворимых композиций по настоящему изобретению измеренное количество производного белка сначала растворяют в водном растворителе, содержащем фенольный консервант. К этому раствору добавляют раствор цинка в виде одной из его растворимых солей,например Zn(II)Cl2, до концентрации от около 0,3 моля цинка на моль производного белка. Показатель рН полученного раствора доводят до величины от около 6,8 до около 8,4, предпочтительно от около 6,8 до около 8,0, более предпочтительно от около 7,2 до около 7,8 и особенно предпочтительно от около 7,4 до около 7,8. Отдельно получают второй раствор, в котором измеренное количество белка, выбираемого из группы, включающей инсулин, аналоги инсулина и проинсулин, растворяют в водной растворителе, содержащем фенольный консервант. К этому раствору добавляют раствор цинка в виде одной из его растворимых солей, напримерZn(II)Cl2, до концентрации от около 0,3 моля цинка на моль белка до около 4 молей цинка на моль белка. Показатель рН полученного раствора доводят до величины от около 6,8 до около 8,4, предпочтительно от около 6,8 до около 8,0,более предпочтительно до рН от около 7,2 до около 7,8 и особенно предпочтительно от около 7,4 до около 7,8 или 7,4-7,6. Порции раствора производного белка и раствора белка перемешивают в заранее определенном отношении,чтобы получить такое же отношение производного белка к белку в нерастворимой композиции. Этот раствор перемешивают до полного смешивания производного белка и белка. Показатель рН этого раствора доводят до около 7,6,после чего раствор может быть профильтрован через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Отдельно получают раствор протамина, растворяя измеренное количество протамина в водном растворителе. Раствор протамина можно профильтровать через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Раствор белка и производного белка смешивают с раствором протамина, в результате чего сначала образуется осадок. Полученную суспензию медленно перемешивают при комнатной температуре (обычно около 20-25 С), в результате чего в течение периода времени от около 4 ч до около 10 дней образуются микрокристаллы. 53 Хотя в этом описании изобретения не рассмотрены все многочисленные способы, позволяющие получить нерастворимые композиции по настоящему изобретению, тем не менее, далее представлено еще несколько способов по настоящему изобретению, которые заключаются в том, что белок, производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров, и добавляют комплексообразующее соединение; белок, производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, препятствующим образованию гексамеров, доводят рН до значения между около 6,8 и около 7,8 и добавляют комплексообразующее соединение; белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров, отдельно растворяют производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла в водном растворителе с показателем рН, способствующим образованию гексамеров, тщательно смешивают эти два раствора и добавляют комплексообразующее соединение; белок, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения, отдельно растворяют производный белок, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения,тщательно смешивают эти два раствора и доводят рН раствора до значения, при котором происходит осаждение; белок, производный белок, стабилизатор гексамера, катион двухвалентного металла и комплексообразующее соединение растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения, и доводят рН раствора до значения, при котором происходит осаждение; белок, производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего вещества, добавляют комплексообразующее соединение и доводят показатель рН раствора, полученного на стадии b), до значения, при котором происходит осаждение; белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем 54 рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения, отдельно растворяют производный белок,стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения, тщательно перемешивают эти два раствора, добавляют к раствору комплексообразующее соединение и доводят показатель рН до значения, при котором происходит осаждение; белок, производный белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения, доводят показатель рН раствора до значения, при котором происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения, и добавляют к раствору комплексообразующее соединение; белок, стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла растворяют в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения, отдельно растворяют производный белок,стабилизатор гексамера и катион двухвалентного металла в водном растворителе, дающем раствор с показателем рН, при котором не происходит осаждения при добавлении комплексообразующего соединения, тщательно смешивают эти два раствора, доводят рН раствора, полученного на стадии с), до значения, при котором происходит осаждение при добавлении комплексообразующего соединения, и добавляют к раствору комплексообразующее соединение. В предпочтительном варианте осуществления изобретения микрокристаллы получают так, чтобы устранить необходимость отделения микрокристаллов от маточного раствора. Таким образом, желательно, чтобы маточный раствор сам по себе был пригоден для введения пациенту или чтобы маточный раствор можно было сделать пригодным для введения путем разведения его приемлемым разбавителем. Термин"разбавитель" означает раствор, содержащий водный растворитель, в котором растворены разные фармацевтически приемлемые наполнители, которые включают, но не ограничиваются ими, буфер, изотонический агент, цинк, консервант, протамин и тому подобные. Помимо белка, производного белка, катиона двухвалентного металла, комплексообразующего соединения и стабилизатора гексамера, фармацевтические композиции, предназначенные для парентерального введения в соответствии с настоящим изобретением, могут содержать дополнительные наполнители и носители, в частности смешивающиеся с водой органические растворители, такие как глицерин, 55 кунжутное масло, водный раствор пропиленгликоля и тому подобные. Такие вещества обычно используют в количестве менее 2 вес.% в расчете на конечный вес препарата. Для более подробного ознакомления с разными методами использования известных наполнителей или носителей в продуктах, предназначенных для парентерального введения, см. справочник(1985), который включен в это описание изобретения в качестве ссылки. Препарат, полученный в соответствии с широкой практикой осуществления настоящего изобретения, может также содержать смесь микрокристаллов и растворимой фракции белка,выбираемого из инсулина, производного инсулина, аналогов инсулина и аналогов производного инсулина. Примерами таких фармацевтических композиций являются стерильные, изотонические водные физиологические растворы инсулина, аналога инсулина, производного инсулина или аналога производного инсулина,содержащие физиологически приемлемый буфер и не содержащие пирогена. Для растворимой фазы предпочтителен инсулин или быстродействующий аналог инсулина, такой какLysB28,РrоВ 29-инсулин человека или AspB28 инсулин человека. Такие смеси позволяют регулировать концентрацию глюкозы во время приема пищи, что обеспечивается растворимым инсулином, и концентрацию глюкозы в промежутках между приемами пищи, что обеспечивается нерастворимым инсулином. Отношение общего белка (белок плюс производный белок) в нерастворимой фазе к общему белку в растворимой фазe находится в пределах от около 9:1 до около 1:9. Это отношение предпочтительно находится в пределах от около 9:1 до около 1:1 и более предпочтительно около 7:3. Другие отношения равны 1:1 и 3:7. Это изобретение проиллюстрировано и объяснено с использованием следующих способов получения и примеров. Объем изобретения не ограничивается этими способами получения и примерами. Ссылка на "части" для твердых веществ означает весовые части. Ссылка на"части" для жидкостей означает объемные части. Проценты, используемые для выражения концентрации, означают массу, деленую на объем (x100). Все температуры выражены в градусах по шкале Цельсия (С). "TRIS" означает 2 амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол. Раствор, содержащий 1000 частей на миллион цинка, получают, разбавляя 1,00 мл стандартного раствора с атомным поглощением 10000 частей на миллион цинка [Ricca Chemical Company,цинк в разбавленной азотной кислоте] водой до конечного объема 10,00 мл. Во многих нижеописанных способах получения указан выход осадков и кристаллов. Значение выхода определено на основании количе 003394 56 ства общего белка в осадке или кристаллах и на оценке количества того же вещества, первоначально находившегося в растворе. Чтобы определить количество общего белка, образцы повторно растворенного осадка или кристаллов и супернатанта над осадком или кристаллами анализировали градиентной ВЭЖХ с обращенной фазой, как это описано ниже. В аналитической системе использована колонка С 8 с обращенной фазой при 23 С. Скорость потока равна 1,0 мл/мин, и ультрафиолетовое детектирование произведено при 214 нм. Растворитель А содержит 0,1% (в объемном отношении) трифторуксусной кислоты в ацетонитрил:вода с отношением 10:90 (в объемном отношении). Растворитель В содержит 0,1% (в объемном отношении) трифторуксусной кислоты в ацетонитрил:вода с отношением 90:10 (в объемном отношении). Использована программа проявления (минуты, %В): (0,1, 0); (45,1, 75);(50,1, 100); (55, 100); (57, 0); (72, 0). Все изменения являются линейными. Специалист в этой области может использовать другие аналитические системы для достижения той же цели. Чтобы получить образцы для анализа ВЭЖХ, аликвоты хорошо смешанных суспензий растворяли, разбавляя их 0,01 или 0,03 н. раствором НСl. Результаты анализа ВЭЖХ этих растворов позволяют высчитать общий белок. Аликвоты этих суспензий центрифугировали в течение примерно 5 мин в микроцентрифуреEppendorf 5415C со скоростью 14000 об./мин. Слитый супернатант разводили 0,01 или 0,1 н. раствором НСl и анализировали ВЭЖХ. Осадок промывали, для чего его повторно суспендировали в физиологическом растворе с фосфатным буфером Дульбекко (без кальция или магния) и повторно осаждали центрифугированием. Буфер сливали и твердое вещество повторно растворяли в 0,01 н. растворе НСl. Повторно растворенный осадок анализировали ВЭЖХ. ВЭЖХ использовали для подтверждения наличия требуемых белков в подкисленной суспензии, повторно растворенном осадке и супернатанте, а также для определения концентраций белков. Время удерживания пиков в хроматограммах повторно растворенных осадков сравнивали с временем удерживания для протамина и активных соединений, используемых для получения указанных препаратов. Соответствие между значениями времени удерживания было всегда хорошим, свидетельствуя о том, что микрокристаллы действительно содержат протамин,белок и производные белки. Концентрации белка и производного белка определяли путем сравнения площадей соответствующих пиков с площадями эталона. В качестве эталона использовали 0,22 мг/мл раствора производного инсулина. Эталон, содержащий протамин, исследовали только с целью определения времени удерживания. Количественное определение концентрации протамина не производили. 57 Во многих нижеописанных способах получения использовали стандартный спектрофотометрический анализ для определения скорости растворения кристаллов в физиологическом растворе с фосфатным буфером Дульбекко (рН 7,4) при комнатной температуре. Там, где это необходимо, в способах получения указаны существенные отклонения от нижеописанной процедуры. Для всех анализов растворения использовали спектрофотометр, пригодный для измерения в ультрафиолетовом диапазоне и оснащенный 1 см кюветой и магнитной мешалкой для кюветы. Кювету с маленькой мешалкой,содержащую 3,00 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS), помещали в ячейку спектрофотометра. Прибор был установлен на 320 нм и на нуль в отношении того же буфера. Затем в кювету добавляли 4,0 мкл хорошо суспендированного препарата, общая концентрация которого обычно была эквивалентна препарату U50 или составляла от около 1,6 до 1,8 мг/мл. Препарат перемешивали в течение 1,0 мин и определяли оптическую плотность при 320 нм. Поскольку белки, используемые в этом исследовании, не поглощают свет при 320 нм,уменьшение оптической плотности связано с уменьшением рассеяния света по мере растворения кристаллов. Обычно регистрировали время (t1/2), необходимое для уменьшения оптической плотности на половину первоначальной величины. Для выполнения контрольного эксперимента 2,0 мкл гумулина N U100 (то есть инсулин NPH человека) добавляли к 3,00 мл буфера PBS и измеряли оптическую плотность при 320 нм, как описано выше. Полупериод растворения (t1/2) для гумулина N равен примерно 6 мин. Способ получения 1. Сокристаллы инсулина человека и В 29-N-октаноилинсулина человека с отношением 9:1. Сухой порошок В 29-N-октаноил-LysВ 29 инсулина человека (0,7 мас.ч.) и сухой порошок инсулина человека (6,3 мас.ч.) растворяют в 1000 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМ TRIS, 0,1 М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 75 частей 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Показатель рН доводят до 7,6, добавляя 1 н. раствор НСl и/или 1 н. раствор NaOH. Этот раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают второй раствор, растворяя 7 мас.ч. сульфата протамина в 10000 об.ч. воды и фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина. Сначала образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22 С). 58 Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества. Способ получения 2. Сокристаллы инсулина человека и В 29-N-октаноилинсулина человека с отношением 3:1. Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 1,75 мас.ч. сухого порошка В 29-Nоктаноил-LysВ 29-инсулина человека и 5,25 мас.ч. сухого порошка инсулина человека. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22 С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества. Способ получения 3. Композиция, содержащая сокристаллы инсулина человека и В 29N-октаноилинсулина человека с отношением 3:1. Сокристаллы микрокристаллического твердого вещества, полученные в соответствии со способом получения 1, отделяют от супернатанта и получают обычными способами разделения твердого вещества и жидкости, такими как фильтрование, центрифугирование или декантация. Полученные сокристаллы микрокристаллического твердого вещества суспендируют в растворе, содержащем 25 мМ TRIS, 5 мг/мл фенола и 16 мг/мл глицерина, рН 7,8, до достижения конечной концентрации, при которой активность инсулина составляет примерно 100 ед./мл. Способ получения 4. Сокристаллы инсулина человека и В 29-N-октаноилинсулина человека с отношением 1:1. Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 3,5 мас.ч. сухого порошка В 29-Nоктаноил-LysВ 29-инсулина человека и 3,5 мас.ч. сухого порошка инсулина человека. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22 С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества. Способ получения 5. Сокристаллы инсулина человека и В 29-N-октаноилинсулина человека с отношением 1:3. Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 5,25 мас.ч. сухого порошка В 29-Nоктаноил-LysВ 29-инсулина человека и 1,75 мас.ч. сухого порошка инсулина человека. Смешивают равные объемы раствора, содержа 59 щего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22 С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества. Способ получения 6. Сокристаллы инсулина человека и В 29-Nгексаноилинсулина человека с отношением 3:1. Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 1,75 мас.ч. сухого порошка В 29-Nгексаноил-LysВ 29-инсулина человека и 5,25 мас.ч. сухого порошка инсулина человека. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22 С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества. Способ получения 7. Сокристаллы инсулина человека и В 29-N-бутирилинсулина человека с отношением 3:1. Выполняют процедуру, описанную в способе получения 1, за исключением того, что используют 1,75 мас.ч. сухого порошка В 29-Nбутирил-LysВ 29-инсулина человека и 5,25 мас.ч. сухого порошка инсулина человека. Смешивают равные объемы раствора, содержащего инсулин и ацилированный инсулин, и раствора сульфата протамина, в результате чего образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22 С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества. Способ получения 8. Сокристаллы микрокристаллического вещества, состоящие из протамина, цинка, В 29-N-октаноилинсулина человека и инсулина человека. В 29-N-октаноил-LysВ 29-инсулин человека (20,1 мг) растворяют в 1 мл растворителя,содержащего 0,1 н. раствор НСl. Инсулин человека (19,3 мг) растворяют в 1 мл растворителя,содержащего 0,1 н. раствор НСl. Получают пять растворов,содержащих В 29-N-октаноилLysВ 29-инсулин человека и инсулин человека в разных отношениях, для чего эти растворы смешивают в нижеуказанных объемах. 60 Таблица 3. Объемы растворов инсулина человека и В 29-Nоктаноилинсулина человека, используемые для получения осадков и микрокристаллов Отношение инсулина человека к ацилированному инсулину Объем, мкл человека 1:0 3:1 1:1 1:3 0:1 Раствор инсулина человека 400 300 200 100 0 Раствор В 29-N-октано 0 100 200 300 400 инсулина человека К каждому из этих пяти растворов добавляют 1,6 мл растворителя, содержащего 50 мМ буфера TRIS, 0,1 М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К каждому из пяти растворов добавляют 0,15 мл 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Показатель рН всех пяти растворов доводят до 7,6, добавляя 1 н. растворNaOH. Все пять растворов фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают дополнительный раствор, растворяя 3,50 мг сульфата протамина в 10 мл воды, и фильтруют его через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. По 1,9 мл каждого из пяти растворов соответственно смешивают с 1,9 мл раствора сульфата протамина, в результате чего сразу же образуется аморфный осадок. Эти пять растворов оставляют выстаиваться в течение 24 ч при комнатной температуре (примерно 22 С). Затем в каждом из пяти растворов образуется белое и не совсем белое микрокристаллическое вещество. Способ получения 9. Сокристаллы инсулина человека и В 29-N-октаноилинсулина человека с отношением 9:1. Сухой порошок В 29-N-октаноил-LysВ 29 инсулина человека (0,7 мас.ч.) растворяют в 100 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМTRIS, 0,1 М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 7,5 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Получают второй раствор, в котором сухой порошок инсулина человека (6,3 мас.ч.) растворен в 900 об.ч. водного растворителя, содержащего 50 мМTRIS, 0,1 М тринатрийцитрата и 10 мг/мл фенола при рН 7,6. К этому раствору добавляют 67,5 части 15,3 мМ раствора хлорида цинка. Раствор ацилированного инсулина объединяют с раствором инсулина и перемешивают до однородного смешивания двух растворов. Полученный раствор фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Получают раствор протамина, растворяя 7 мас.ч. сульфата протамина в 10000 об.ч. воды, и фильтруют через 0,22 микронный фильтр со слабым связыванием белка. Смешивают равные объемы раствора ацилированного инсулина и раствора сульфата протамина. Образуется аморфный осадок. Эту суспензию оставляют выстаиваться в течение примерно 24 ч при комнатной температуре (обычно около 22 С). Аморфный осадок превращается в сокристаллы микрокристаллического твердого вещества.
МПК / Метки
МПК: A61K 38/28, C07K 14/62, A61P 5/50
Метки: гипергликемии, препарат, суспензионный, диабета, получения, способы, нерастворимые, композиции, лечения, инсулинсодержащие, способ
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-3394-nerastvorimye-insulinsoderzhashhie-kompozicii-sposoby-ih-polucheniya-suspenzionnyjj-preparat-sposob-lecheniya-diabeta-i-giperglikemii.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Нерастворимые инсулинсодержащие композиции, способы их получения, суспензионный препарат, способ лечения диабета и гипергликемии</a>
Изолируемые смеси из семян eugenia jambolana lamarck, способы их получения, способ получения оксамата натрия, лекарственные средства для профилактики и лечения диабета и применение указанных смесей, их компонентов и оксамата натрия для получения этих лекарственных средств
Номер патента: 1463
Опубликовано: 23.04.2001
Авторы: Расоанаиво Филипп, Лебуль Жан, Ракото Ратсимаманга Альберт, Рейсдорф Даниель, Прово Жан, Ракото Ратсимаманга Сюзанн
МПК: A61P 5/50, A61K 35/78
Метки: получения, средств, смеси, jambolana, оксамата, лекарственные, семян, лекарственных, применение, диабета, средства, компонентов, натрия, способы, смесей, лечения, этих, способ, указанных, lamarck, изолируемые, eugenia, профилактики
Формула / Реферат:
1. Смесь, не содержащая полифенольных и стерольных производных и изолируемая посредством измельчения семян EUGENIA JAMBOLANA LAMARCK, мацерации полученного порошка низшим алифатическим спиртом в горячем состоянии, фильтрации, выделения нерастворимой фракции, не содержащей более полифенольных и стерольных соединений, мацерации нерастворимой фракции с помощью низшего алифатического спирта, фильтрации и выделения нерастворимой фракции, не...
Производные индолилпирролиденметилпиррола, способ их получения, фармацевтическая композиция и комбинированный препарат на их основе, способ лечения с их использованием и промежуточный продукт для их получения
Номер патента: 1055
Опубликовано: 28.08.2000
Авторы: Изетта Анна Мария, Колотта Франческо, Феррари Марио, Тиболла Марчеллино, Барджотти Альберто, Д`алессио Роберто
МПК: C07F 5/02, C07D 403/14
Метки: композиция, использованием, продукт, лечения, комбинированный, фармацевтическая, получения, препарат, способ, промежуточный, производные, основе, индолилпирролиденметилпиррола
Формула / Реферат:
1. Производные (1Н-индол-2-ил)-5-[(2Н-пиррол-2-илиден)метил]-1H-пиррола формулы (I) где каждый из R1, R2, R3 и R4, которые являются одинаковыми или разными, представляет независимо водород, (C1-C6)-алкил, галоген, циано, нитро, гидрокси, (C1-C6)-алкокси, незамещенный или замещенный фенилом, (C1-C6)-алкилкарбонилокси, -NRaRb, в котором каждый из Ra и Rb независимо представляет водород или (C1-C6)-алкил, (C1-С6)-алкилкарбониламино, карбокси,...
Мутантный il-6 человека и его внутренний фрагмент, кодирующие их последовательности днк, способы их получения, содержащие их фармацевтические композиции, содержащие их векторы, линии клеток- хозяев испособ лечения il-6 опосредованных заболеваний
Номер патента: 852
Опубликовано: 26.06.2000
Авторы: Розе-Йон Штефан, Элерс Марк, Гротзингер Йоахим
МПК: A61K 38/20, A61P 35/00, A61P 19/10...
Метки: лечения, содержащие, способы, внутренний, мутантный, фрагмент, днк, получения, испособ, клеток, кодирующие, линии, векторы, человека, опосредованных, фармацевтические, последовательности, заболеваний, композиции, хозяев
Формула / Реферат:
1. Мутантный интерлейкин-6 (IL-6) человека, имеющий аминокислотную последовательность содержащую следующие точечные мутации по сравнению с природным IL-6 человека: Pro 54, Glu 159, Pro 162, Leu 170 и Аrg 176. 2. Внутренний фрагмент мутантного IL-6 человека по п.1 формулы, обладающий аналогичной биологической активностью. 3. Последовательность ДНК, кодирующая мутантный IL-6 человека по п.1 формулы. 4. Последовательность ДНК, кодирующая...
Фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного начала жизнеспособные лактобациллы, способы их применения и препарат из микроинкапсулированных лактобацилл
Номер патента: 412
Опубликовано: 24.06.1999
Автор: Форд Лэрри С.
МПК: A61K 35/74
Метки: применения, качестве, микроинкапсулированных, препарат, фармацевтические, композиции, лактобацилл, начала, активного, жизнеспособные, способы, лактобациллы, содержащие
Формула / Реферат:
1. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала жизнеспособные лактобациллы и фармацевтически приемлемый носитель для целенаправленной доставки лактобацилл, отличающаяся тем, что единичная доза указанной композиции содержит, по крайней мере, 103 лактобацилл, причем указанные лактобациллы микроинкапсулированы и в результате этого сохраняют жизнеспособность в течение всего срока хранения композиции, а вещество, составляющее...
Способ лечения диабета тиазолидиндионом и сульфонилмочевиной
Номер патента: 3303
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Смит Стефен Элистэр, Бакингэм Робин Эдвин
МПК: A61K 31/64, A61P 3/10
Метки: способ, лечения, сульфонилмочевиной, диабета, тиазолидиндионом
Формула / Реферат:
1. Способ лечения сахарного диабета и состояний, связанных с сахарным диабетом, у млекопитающих, включающий введение эффективного нетоксичного и фармацевтически приемлемого количества от 2 до 12 мг в день 5-[4-[2-(N-метил-N-(2-пиридил)амино)этокси]бензил]тиазолидин-2,4-диона (соединение I) или его таутомерной формы, и/или его фармацевтически приемлемого производного и субмаксимального количества сульфонилмочевины (средства, усиливающего секрецию...
Предыдущий патент: Композиции пароксетина
Следующий патент: Фунгицидная смесь на базе амидных соединений и производных морфолина, способ борьбы с фитопатогенными грибами
Случайный патент: Устройство для затягивания/ослабления резьбовой крепежной детали