Целлюлаза из грибов рода chrysosporium и способы ее применения
Номер патента: 3295
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Олсон Филип Т., Синицин Аркадий Пантелеймонович, Соловьева Ирина Владимировна, Окунев Олег Николаевич, Черноглазов Владимир Михайлович, Бен-Бассат Эрие, Берлингейм Ричард П.
Формула / Реферат
1. Штамм микроорганизма Chrysosporium lucknowense Garg 27K, имеющий регистрационный номер VKM F-3500D, продуцирующий целлюлазу.
2. Композиция, обладающая нейтральной и/или щелочной целлюлазной активностью, полученная способом, включающим выращивание гриба дикого типа или мутантного гриба вида Chrysosporium lucknowense, при том что указанная целлюлаза имеет пик активности при значениях pH от приблизительно 5,5 до приблизительно 11,0 и, по меньшей мере, 17 единиц CMCазной активности на грамм сухого веса.
3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что гриб представляет собой штамм Chrysosporium lucknowense Garg 27K с регистрационным номером VKM F-3500D.
4. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что гриб представляет собой мутантный штамм Chrysosporium lucknowense Garg 27K.
5. Композиция, обладающая нейтральной и/или щелочной целлюлазной активностью, имеющая пик целлюлазной активности при значениях pH от приблизительно 5,5 до приблизительно 11,0 и, по меньшей мере, 17 единиц CMCазной активности на грамм сухого веса, полученная способом, включающим выращивание мутантного гриба вида Chrysosporium lucknowense в культуре в пригодной среде.
6. Композиция по любому из пп.2-5, обладающая оптимальной целлюлазной активностью при температуре приблизительно от 40шC до приблизительно 60шC и значении pH приблизительно от 5,0 до приблизительно 12,0.
7. Композиция по любому из пп.2-5, обладающая, по крайней мере, 50% от оптимальной целлюлазной активности при значении pH приблизительно от 6,0 до приблизительно 7,0 и температуре приблизительно от 40шC до приблизительно 60шC.
8. Композиция по любому из пп.2-5, отличающаяся тем, что указанную целлюлазную активность оценивают с помощью любого из таких способов анализа, как анализ CMCазной, RBB-CMCазной активности, эндовискозиметрический способ или анализ активности с использованием фильтровальной бумаги.
9. По существу очищенная и выделенная белковая фракция, полученная из композиции по п.5, обладающая, по крайней мере, 50% максимальной целлюлазной активности при значении рН приблизительно от 6,0 до приблизительно 7,0, по данным любого из таких способов анализа, как анализ CMCазной, RBB-CMCазной активности, эндовискозиметрический способ или анализ активности с использованием фильтровальной бумаги.
10. Эндоглюканаза, полученная из фракции по п.9, имеющая молекулярную массу приблизительно 60 кДа и значение рI приблизительно 3.
11. Целлобиогидралаза, полученная из фракции по п.9, имеющая молекулярную массу приблизительно 60 кДа и значение рI приблизительно 4.
12. По существу очищенный и выделенный нейтральный и/или щелочной фермент целлюлазы, выделенный из белковой фракции по п.9 и имеющий значение рI от приблизительно 3 до приблизительно 5,5.
13. Целлюлаза по п.12, отличающаяся тем, что обладает эндоглюканазной или целлобиогидралазной активностью.
14. Целлюлаза по п.12, отличающаяся тем, что целлюлаза сохраняет, по крайней мере, 50% максимальной целлюлазной активности при значении рН от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0.
15. Эндоглюканаза, полученная из фракции по п.9 и имеющая молекулярную массу приблизительно 25 кДа.
16. Эндоглюканаза по п.15, имеющая значение рI приблизительно 4.
17. Эндоглюканаза, полученная из фракции по п.9 и имеющая молекулярную массу приблизительно 70 кДа.
18. Эндоглюканаза по п.17, имеющая значение рI приблизительно 4.
19. Эндоглюканаза, полученная из фракции по п.9 и имеющая молекулярную массу приблизительно 43 кДа.
20. Эндоглюканаза по п.19, имеющая значение рI приблизительно 3.
21. Детергентная композиция, включающая выделенную белковую фракцию по п.9 и/или один или более фермент по любому из пп.10-20 и дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество.
22. Композиция для смягчения ткани, включающая выделенную белковую фракцию по п.9 и/или один или более фермент по любому из пп.10-20.
23. Композиция для ферментативной обработки целлюлазных волокон или целлюлазной ткани, включающая целлюлазу, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium, имеющая значение pH от приблизительно 8,0 до приблизительно 12,0.
24. Композиция по п.23, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
25. Композиция по п.24, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
26. Композиция по любому из пп.23-25, отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
27. Композиция по любому из пп.23-25, дополнительно включающая один или более компонентов, выбранных из группы, включающей кусочки пемзы, абразивные материалы, смягчители, растворители, консерванты, отбеливающие средства, синьки, флуоресцентные красители, антиоксиданты, солюбилизаторы, моющие средства, поверхностно-активные вещества, ферменты, строительные добавки, агенты, препятствующие отложению, буферы, ингибиторы слеживания, маскирующие агенты для факторов, ингибирующих целюлазную активность, и активаторы целлюлазы.
28. Композиция по п.27, отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
29. Композиция по п.23, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0.
30. Композиция по п.24, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0.
31. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0.
32. Композиция по п.26, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0.
33. Композиция по п.27, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0.
34. Композиция по п.28, отличающаяся тем, что значение pH находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0.
35. Композиция для ферментативной обработки целлюлазных волокон или целлюлазных тканей, включающая целлюлазу, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium, дополнительно включающая один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из протеиназ, моющих средств и поверхностно-активных веществ.
36. Композиция по п.35, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
37. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
38. Композиция по любому из пп.35-37, отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
39. Композиция для ферментативной обработки целлюлазных волокон или целлюлазных тканей, обладающая, по крайней мере, 124 единицами эндо-1,4-b-глюканазной активности на грамм сухой композиции целлюлазы, по данным эндовискозиметрического анализа, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
40. Композиция по п.39, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
41. Композиция по п.40, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
42. Композиция по п.39, отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рюфр Chrysosporium.
43. Композиция по п.42, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
44. Композиция по п.43, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
45. Композиция для ферментативной обработки целлюлазных волокон или целлюлазных тканей, обладающая, по крайней мере, 191 единицей эндо-1,4-b-глюканазной активности на грамм сухой композиции целлюлазы, по данным эндовискозиметрического анализа, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
46. Композиция по п.45, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
47. Композиция по п.46, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
48. Композиция по п.45, отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
49. Композиция по п.48, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
50. Композиция по п.49, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
51. Композиция для ферментативной обработки целлюлазных волокон или целлюлазных тканей, обладающая, по крайней мере, 964 единицами эндо-1,4-b-глюканазной активности на грамм сухой композиции целлюлазы, по данным эндовискозиметрического анализа, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
52. Композиция по п.51, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
53. Композиция по п.52 отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
54. Композиция по п.51, отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
55. Композиция по п.54, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
56. Композиция по п.55, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
57. Моющая детергентная композиция, включающая целлюлазу, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium, дополнительно включающая одно или более поверхностно-активных веществ.
58. Композиция по п.57, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
59. Композиция по п.58, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
60. Моющая детергентная композиция по п.57, отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
61. Композиция по п.60, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей из Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum.
62. Композиция по n.61, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
63. Композиция по любому из пп.25, 37, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59 и 62, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense Garg 27K с регистрационным номером VKM F-3500D.
64. Нейтральная и/или щелочная целлюлазная композиция, обладающая пиком целлюлазной активности при значениях рН от 5,5 до 11,0, полученная из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
65. Целлюлазная композиция по п.64, отличающаяся тем, что гриб представляет собой гриб вида Chrysosporium lucknowense.
66. Целлюлазная композиция по п.65, отличающаяся тем, что гриб представляет собой штамм Chrysosporium lucknowense Garg 27K с регистрационным номером VKM F-3500D.
67. Способ получения композиции, обладающей нейтральной и/или щелочной целлюлазной активностью, включающий выращивание гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium в культуре в пригодной среде, и затем выделение целевого продукта.
68. Способ по п.67, отличающийся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum или Chrysosporium tropicum.
69. Способ по п.68, отличающийся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
70. Способ по п.69, отличающийся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense Garg 27K с регистрационным номером VKM F-3500D.
71. Способ по п.67, отличающийся тем, что гриб представляет собой мутантный штамм рода Chrysosporium.
72. Способ по п.71, отличающийся тем, что гриб представляет собой мутантный штамм Chrysosporium lucknowense Garg 27K.
73. Способ абразивной стирки грубой хлопчатобумажной ткани или джинсов из грубой хлопчатобумажной ткани, включающий обработку указанных грубой хлопчатобумажной ткани или джинсов из грубой хлопчатобумажной ткани целлюлазой, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
74. Способ биополировки, дефибрилляции, отбеливания, окрашивания или расшлихтовки текстильных изделий, включающий обработку указанных текстильных изделий целлюлазой, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
75. Способ удаления пятен или биоотбеливания бумаги или пульпы, включающий обработку указанных бумаги или пульпы целлюлазой, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
76. Способ повышения мягкости или качества на ощупь целлюлазной или содержащей хлопок ткани, включающий обработку указанной ткани целлюлазой, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
77. Способ по любому из пп.73-76, отличающийся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium.
78. Способ по любому из пп.73-76, отличающийся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
79. Способ по п.77, отличающийся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense.
80. Способ по п.78 или 79, отличающийся тем, что гриб представляет собой Chrysosporium lucknowense Garg 27K с регистрационным номером VKM F-3500D.
81. Способ получения мутантных штаммов рода Chrysosporium, продуцирующих целлюлазу с повышенной активностью при нейтральных и/или щелочных значениях pH, включающий:
(a) мутирование спор гриба рода Chrysosporium;
(b) культивирование сяюЁ, полученных на стадии (a) и
(c) скрининг культур, полученных на стадии (b) на повышенные уровни нейтральной и/или щелочной целлюлазной активности.
82. Способ по п.81, отличающийся тем, что стадия мутирования включает воздействие на споры ультрафиолетовым светом или химическим мутагеном.
83. Способ по п.82, отличающийся тем, что химический мутаген представляет собой азотистую кислоту, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или 4-нитрохинолон-N-оксид.
84. Мутантный штамм гриба рода Chrysosporium, полученный способом по любому из пп.81-83.
Текст
1 Область техники Настоящее изобретение относится к нейтральным и/или щелочным целлюлазам и к новым способам их получения. В частности изобретение относится к целлюлазам, продуцируемым грибами рода Chrysosporium, и, в частности, штаммами Chrysosporium lucknowense. Настоящее изобретение также относится к промышленному применению этих нейтральных или щелочных целлюлаз и содержащих их композиций. Предпосылки создания изобретения Одежда, изготовленная из целлюлозных тканей, таких, как полученные из хлопчатника,льна, конопли, рами (китайская крапива), а также таких, как купро, лиоцелл, ньюцелл, район,полинозик, является очень популярной. Особый интерес представляют предметы одежды, такие как джинсы, из окрашенной индиго ткани деним, изготовленной из хлопка или хлопковых смесей. Такие предметы одежды обычно шьют из отсортированных по размеру и скроенных кусков материи и стремятся сделать жесткими с помощью шлихтовочных композиций. В других случаях волокна или рулоны ткани обрабатывают ферментами перед окончательным шитьем предмета одежды. После определенного периода носки предметы одежды могут приобрести определенную степень мягкости, интенсивность оттенка в целом может снизиться, а в локальных местах может измениться цвет. Кроме того, после повторной стирки предмет одежды продолжает сохранять более удобное облегание (подгонку), ощущение мягкости и поношенный внешний вид. В последние годы такое удобство облегания, создание ощущения мягкости и внешний вид становятся все более популярными. В наиболее распространенных способах создания такого удобства облегания, ощущения мягкости и внешнего вида используется стирка предметов одежды с помощью целлюлаз в больших стиральных машинах с добавлением кусочков пемзы или других абразивов (абразивная стирка). Пемза помогает сделать ткань более мягкой и придает поверхности полинявший вид,сходный с тем, который получается после продолжительной носки ткани. Однако использование пемзы имеет определенные недостатки. Например, кусочки пемзы требуется вручную удалять из обработанных предметов одежды, поскольку они имеют тенденцию скапливаться в карманах, на внутренних сторонах, в сгибах и в складках. Кусочки пемзы также могут вызвать повреждение вследствие перегрузки электродвигателей стиральных машин, в которые добавляются кусочки камней, а также засор дренажной системы машины и сливных трасс. Эти проблемы, связанные с обработкой и оборудованием, могут существенно увеличить стоимость работы и продажную стоимость товаров. 2 Учитывая проблемы, связанные с использованием пемзы, были разработаны способы,альтернативные использованию пемзы или других абразивов в методе абразивной стирки. В одном из альтернативных способов используются обработка ферментами, которые разрушают целлюлозу в тканях (патент US 4951366 на имя Geller; патенты US 4832864 и US 4912056 на имя Olson, патенты US 5006126, US 5122159 и US 5213581 на имя Olson и др., патент US 4943530 на имя Christner и др., патент US 4788682 на имя Boegh и др.). В данной области техники известны способы обработки ткани,содержащей целлюлозу, гидролитическими ферментами, такими, как целлюлазы, причем эти способы позволяют улучшить мягкость или качество таких тканей на ощупь (Novo BrochureCellulase SP 227; Novo Brochure Celluzyme; патент US 4443355 на имя Murata; патент US 4661289 на имя Parslow; патент US 4479881 на имя Tai; патент US 4435307 на имя Barbesgaard; патент Великобритании 1368599 на имя Browning). Целлюлазы известны в данной области как ферментные системы, которые гидролизуют целлюлозу (-1,4-глюкановые связи), приводя к образованию глюкозы, целлобиозы, целлоолигосахаридов и т.п. Целлюлазные композиции содержат несколько различных ферментов,включая ферменты, идентифицированные как экзоцеллобиогидралазы, эндоглюканазы и глюкозидазы. Кроме того, эти классы ферментов могут быть дополнительно разделены на индивидуальные изоферменты. Для эффективного превращения кристаллической целлюлозы в глюкозу требуется полная целлюлазная система. Обычно, если требуется полный гидролиз целлюлозного субстрата,то целлюлазная смесь должна включать глюкозидазы и целлобиогидралазы, а также эндоглюканазы. Эндоглюканазы катализируют случайный гидролиз -1,4-глюкозидных связей между глюкозными звеньями целлюлозных полимеров. Такие компоненты гидролизуют растворимые производные целлюлозы, такие, как карбоксиметилцеллюлоза, уменьшая при этом вязкость таких растворов. Такие ферментные компоненты воздействуют на внутренние области полимера, приводя к быстрому уменьшению средней длины цепи полимера, что сопровождается медленным увеличением количества восстанавливающих концов. О быстром уменьшении средней длины цепи целлюлозного полимера свидетельствует уменьшение вязкости целлюлозного раствора. Специфичность в отношении субстрата и форма действия различных целлюлаз изменяется в зависимости от штаммов организмов, продуцирующих целлюлазы. Например, недавно установленный механизм целлюлазного действия целлюлазы, продуцируемой грибом Tricho 3derma reesei, состоит в том, что эндоглюканазная активность сначала разрушает внутренние-1,4-глюкозидные связи в областях низкой кристалличности целлюлозы (Ruohnen L. и др.,"Proceedings of the Second Tricel Symposium onFoundation for Biotechnology and Industrial Fermentation Research 8; (1993): 87-96). Целлобиогидролазная активность направлена в основном на кристаллические области восстанавливающего конца целлюлозы, приводя к высвобождению целлобиозы в качестве основного продукта. Затем -глюкозидазная или целлобиазная активности действуют на целлоолигосахариды, например, на целлобиозу, приводя к образованию глюкозы как единственного продукта. Целлюлазы продуцируются в грибах, бактериях и других микробах. Грибы, как правило,продуцируют полную целлюлазную систему,способную разлагать кристаллические формы целлюлозы. Например, Trichderma reesei продуцирует и секретирует все ферменты, обладающие активностью, необходимой для эффективного разложения кристаллической целлюлозы, а именно, эндо-1,4D-глюканазы, целлобиогидролазы (экзо-1,4D-глюканазы) и 1,4Dглюканазы или -глюкозидазы. Грибные целлюлазы обладают дополнительным преимуществом, заключающимся в том, что в грибах целлюлазы легко могут быть получены в больших количествах с помощью способов ферментации. Известно, что при существующем уровне техники целлюлазы или их компоненты применимы в различных областях текстильной промышленности, за исключением метода абразивной стирки. Например, целлюлазы применяют в композициях моющих средств для усиления моющей способности композиции, в качестве мягчителя, для увеличения яркости окраски,депилляции и других целей. При таком применении целлюлаза должна разлагать при стирке часть целлюлозного материала, например, хлопчатобумажной ткани, что облегчает чистку и/или смягчение ткани. Эндоглюканазные компоненты грибных целлюлаз также использовали для повышения моющей способности композиций моющих средств, в качестве мягчителя и для улучшения качества хлопчатобумажных тканей на ощупь и т.п. Однако при использовании в композициях моющих средств целлюлазы,полученной из Trichoderma spp. и прежде всего из Trichoderma longibrachiatum, существуют определенные проблемы. Как правило, такие компоненты обладают наибольшей активностью при кислых значениях рН, в то время как большинство композиций моющих средств для прачечных разработаны для применения в нейтральных или щелочных условиях. Другие области применения в текстильной промышленности, в которых использовали цел 003295Textile Research Institute, 74, 3, 1983; заявка ЕРА 0220016 на имя Boegh). Целлюлазы также применяли в комбинации с полимерным агентом в способе получения локальных изменений интенсивности окраски волокон (WO 94/19528 иWO 94/1529). В легкой и текстильной промышленности целлюлазы классифицируют по их рабочему диапазону значений рН. Кислые целлюлазы, как правило, имеют пик активности при значениях рН приблизительно от 4,0 до 5,5 и менее, нейтральные целлюлазы - при значениях рН приблизительно от 5,5 до 7,5, а щелочные целлюлазы - при значениях рН приблизительно от 7,5 до 11,0. Некоторые ферментные композиции могут быть активны в более широких пределах. Например, нейтральные/щелочные целлюлазы могут работать при кислых, нейтральных и щелочных значениях рН в диапазоне температур приблизительно от 40 до 60 С. Кислые, нейтральные и щелочные целлюлазы, как правило, применяют при обработке джинсов из ткани деним способом "абразивной стирки" с добавлением или без добавления поверхностно-активных веществ, буферов, моющих средств, агентов, препятствующих повторному отложению, мягчителей, кусочков пемзы или других абразивов, отбелочных средств, таких, как оптические отбелочные средства, ферментов и других средств. Если целлюлазную композицию не изготавливают и/или не забуферивают заранее, то для кислых целлюлаз значение рН, как правило, регулируют до рН от 4,5 до 5,5, например, с помощью буфера на основе цитрата натрия и лимонной кислоты, а для нейтральных или щелочных целлюлаз - до значения рН от 5,5 до 7,5, например, с помощью буфера на основе первичного или вторичного кислого фосфата натрия. Нейтральные и щелочные целлюлазы, как правило, применяют в качестве добавок к моющим средствам для прачечных,при этом рабочий диапазон значений рН может составлять приблизительно от 7,0 до 11,5. При использовании в абразивной стирке обычные кислые целлюлазы, как правило, вызывают большее окрашивание изнанки или повторное отложение красителя индиго и большую потерю прочности ткани, в то время как обычные нейтральные и щелочные целлюлазы, как правило,вызывают меньшее истирание, меньшее окрашивание изнанки или повторное отложение и меньшую потерю прочности ткани. Нейтральные/щелочные целлюлазы являются наиболее предпочтительными типами целлюлаз для применения при промышленной абразивной стирке, поскольку они вызывают 5 меньшие уровни окрашивания изнанки или повторного отложения и меньшую потерю прочности, чем кислые целлюлазы (например, изTrichoderma spp.). Кроме того, нейтральные/щелочные целлюлазы в отличие от кислых целлюлаз проявляют активность в более широком диапазоне значений рН и способны сохранять лучшие относительные моющие характеристики в более широком диапазоне значений рН (5,0-8,0) при промышленной абразивной стирке. Вследствие этого нейтральные/щелочные целлюлазы обладают несколькими преимуществами. Во-первых, исходная вода, подваемая в машины для мокрой обработки, как правило, имеет значение рН в этом диапазоне,что уменьшает необходимость точного контроля значения рН по сравнению с кислыми целлюлазами. Это делает процесс абразивной стирки менее чувствительным к ошибкам или небрежностям оператора при выдерживании значения рН, позволяя осуществлять весь процесс в менее строгих условиях, чем процесс с применением кислых целлюлаз. Во-вторых, известно,что ткани деним являются щелочными по своей природе вследствие того, что в процессе окраски используется каустическая сода. Обыкновенная стирка ткани деним приводит к высвобождению этого каустика в промывочную воду,и значение рН промывочной воды в целом увеличивается. Щелочность может превысить щелочность, создаваемую буферами в ванне, но влияние повышенного значения рН для нейтральных/щелочных целлюлаз менее важно по сравнению с кислыми целлюлазами, поскольку нейтральные/щелочные целлюлазы обладают активностью не только при более высоких значениях рН, но и в более широком диапазоне значений рН. Широким применением в промышленности целлюлаз или компонентов целлюлаз, прежде всего щелочных и/или нейтральных целлюлаз, обусловлена ярко выраженная необходимость в получении целлюлаз, которые обладали бы активностью при нейтральных и/или щелочных значениях рН. Настоящее изобретение относится к способу получения нейтральных/щелочных целлюлаз, обладающих ферментативной активностью при нейтральных и/или щелочных значениях рН, и к содержащим их композициям. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к нейтральным и/или щелочным целлюлазам и к новым способам их получения. В частности, объектом изобретения является способ получения целлюлазных композиций из грибов рода Chrysosporium и прежде всего Chrysosporiumlucknowense, где целлюлазные композиции обладают ферментативной активностью при нейтральных и/или щелочных значениях рН. Изобретение также относится к промышленному применению целлюлазной композиции. 6 Одним из объектов изобретения являются выделенные и очищенные культуры грибов дикого типа и мутантные - рода Chrysosporium,которые обладают способностью продуцировать нейтральные и/или щелочные целлюлазные композиции, в частности штамм Chrysosporiumlucknowense GARG 27 К и его мутанты. В изобретении также предлагаются условия культивирования для получения нейтральных или щелочных целлюлаз из грибов родаChrysosporium. Другим объектом изобретения являются способы получения нейтральных и/или щелочных целлюлазных композиций с помощью метода рекомбинантной ДНК из грибов рода Chrysosporium. Еще одним объектом настоящего изобретения являются способы получения и культивирования мутантных штаммов грибов рода Chrysosporium, обладающих способностью продуцировать нейтральные и/или щелочные целлюлазы. Другим объектом изобретения являются нуклеотидные последовательности, которые кодируют ферменты целлюлазных композиций,продуцируемые Chrysosporium или генетически модифицированными штаммами Chrysosporium. Следующим объектом изобретения являются очищенные и выделенные ферменты целлюлазных композиций, продуцируемые Chrysosporium или генетически модифицированными штаммами Chrysosporium. Еще одним объектом настоящего изобретения является применение в текстильной промышленности щелочных и/или нейтральных целлюлаз, продуцируемых Chrysosporium, для таких процессов, как мягчение, отбеливание и абразивная стирка, применение для окраски предметов одежды, дефибрилляция или биополировка, увеличение яркости окраски и депилляция. Другой объект настоящего изобретения составляют композиции моющих средств, в состав которых входит целлюлаза, продуцируемаяChrysosporium. Следующим объектом изобретения является применение целлюлазных композиций при осахаривании лигноцеллюлозной биомассы,получаемой в сельском хозяйстве, в виде продуктов лесной промышленности, городских твердых отходов и из других источников. Еще одним объектом настоящего изобретения является применение целлюлазных композиций при производстве горючего и других химических веществ, при биоотбеливании древесной пульпы и при удалении типографской краски с повторно используемой бумаги для печати. Подробное описание изобретения В контексте настоящего описания понятие"нейтрально-щелочная целлюлаза" обозначает целлюлазную композицию, сохраняющую вы 7 раженную ферментативную активность при значениях рН, равных приблизительно 5,5 или выше. В предпочтительном варианте осуществления нейтральные и/или щелочные целлюлазные композиции, являющиеся объектом изобретения, имеют пик ферментативной активности в диапазоне значений рН приблизительно от 5,5 до приблизительно 7,5 при температуре от 40 С до приблизительно 60 С. В случае, если пик ферментативной активности находится при значении рН, меньшем приблизительно 5,5, то нейтрально-щелочная целлюлазная композиция должна обладать активностью, составляющей,по крайней мере, приблизительно 50% оптимальной ферментативной активности, в диапазоне значений рН приблизительно от 6,0 до приблизительно 7,5 при температуре приблизительно от 40 С до приблизительно 60 С. Эти активности могут быть измерены, например, с использованием в качестве субстрата RBBСМСазы, СМСазы, целлазима, эндовискозиметрическим путем или путем измерения активности с помощью фильтровальной бумаги (АФБ). Таким образом, целлюлазные композиции, являющиеся объектом изобретения, должны обладать пригодной ферментативной активностью при значениях рН, превышающих 5,5, чтобы композицию ферментов можно было использовать при абразивной стирке, при применении с моющими средствами, при удалении типографской краски или в других случаях, когда требуется нейтральная и/или щелочная целлюлазная активность. Изобретение относится к композициям целлюлаз, обладающим высокой активностью при нейтральных или щелочных значениях рН,и к уникальным способам получения таких нейтральных и щелочных целлюлазных композиций. Нейтральные/щелочные целлюлазные композиции по настоящему изобретению могут быть получены из любых видов Chrysosporium. В особенно предпочтительном варианте целлюлазные композиции по настоящему изобретению выделяют из штамма Chrysosporiumlucknowense GARG 27K (обозначенного как изолят Сl), помещенного в соответствии с Будапештским Договором о Международном депонировании во Всероссийскую Коллекцию Микроорганизмов Российской Академии Наук, ул. Бахрушина, 8, Москва, Россия, 113814, 29 августа 1996 г. под регистрационным номером VKMF-3500D. Целлюлазные композиции, являющиеся объектом изобретения, имеют целый ряд преимуществ, поскольку они обладают ферментативной активностью при нейтральных и/или щелочных значениях рН, что обеспечивает благоприятные рабочие характеристики при промышленном применении. По результатам анализов с использованием в качестве субстратов RBB-СМСазы, СМСазы,целлазима, эндовискозиметрическим путем или с помощью оценки активности с использовани 003295 8 ем фильтровальной бумаги (АФБ) целлюлазные композиции, полученные из штаммов грибов,являющиеся объектом изобретения, обладают активностью в диапазоне значений рН приблизительно от 5,0 до приблизительно 12,0 при температурах приблизительно от 40 до 60 С. В предпочтительном варианте при абразивной стирке целлюлазная композиция может обладать оптимальной активностью в диапазоне значений рН приблизительно от 5,5 до 7,0 при температурах приблизительно от 40 С до приблизительно 60 С. Хорошие характеристики активности нейтральных и/или щелочных целлюлаз по настоящему изобретению при нейтральных и щелочных значениях рН (т.е. при 6,0, 7,0 и 8,0) были подтверждены в ходе проведения опытов с абразивной стиркой и при значениях рН 10,0 и выше в ходе проведения опытов по применению совместно с моющими средствами. Способы ферментации при культивировании целлюлолитических (разрушающих целлюлозу) микроорганизмов для получения целлюлазы известны в данной области техники. Например, целлюлазные системы могут быть получены из твердой или погруженной культуры с использованием твердофазного, периодического,периодического с подпиткой и непрерывного методов. Сбор и очистка целлюлазных систем из бульона для ферментации также могут быть осуществлены способами, известными в данной области. Целлюлазная композиция легко может быть выделена из грибной культуры, например,с применением стадий центрифугирования или фильтрации и концентрирования фильтрата с использованием мембраны или устройства для ультрафильтрации на основе полых волокон. Штамм гриба рода Chrysosporium, используемый для получения целлюлазных композиций, являющийся объектом изобретения, может культивироваться согласно стандартным способам и в условиях, известных в данной области. В предпочтительном варианте осуществления целлюлазную композицию, являющуюся объектом изобретения, получают из штамма С 1. Штамм Chrysosporium C1 может быть выращен в среде, содержащей неорганические соли, источники органического азота, такие, как пептоны, обезжиренная мука из семян хлопчатника,экстракт из замоченных зерен кукурузы или дрожжевой экстракт, и источник углерода. Примеры источников углерода включают глюкозу, лактозу, сахарозу, целлюлозу или другие углеводы, но не ограничены ими. Более предпочтительно штамм гриба выращивают в среде,содержащей лактозу и пептон или лактозу и дрожжевой экстракт. В качестве примера среда для ферментации может содержать лактозу в количестве приблизительно от 0,3% до приблизительно 1,0%, предпочтительно приблизительно от 0,5% до приблизительно 0,6%, пептон в количестве приблизительно от 0,3% до приблизительно 1,0%, предпочтительно приблизитель 9 но от 0,5% до приблизительно 0,6%. В среду для роста гриба могут быть включены другие источники азота и источники углеводов, известные в данной области техники, в том числе (но не ограничиваясь ими) пульпа сахарной свеклы,ячменный солод, пшеничные отруби и другие источники, известные в данной области. Концентрат пульпы сахарной свеклы может применяться в диапазоне концентраций, например,приблизительно от 15 до приблизительно 30 г/л,предпочтительно приблизительно от 20 до приблизительно 25 г/л; ячменный солод может применяться в диапазоне концентраций приблизительно от 10 г/л до приблизительно 20 г/л,предпочтительно приблизительно от 14 г/л до приблизительно 16 г/л; пшеничные отруби могут применяться в диапазоне концентраций приблизительно от 3 г/л до приблизительно 8 г/л, предпочтительно приблизительно от 5 г/л до приблизительно 6 г/л. В одном из вариантов осуществления штамм Сl культивируют во вращающихся встряхиваемых колбах в среде, состоящей из физиологического раствора, содержащего пульпу сахарной свеклы, ячменный солод и пшеничные отруби. Целлюлазные композиции могут быть выделены из грибов, культивируемых в среде для роста в течение приблизительно 3-7 дней, с помощью центрифугирования и ультрафильтрационного концентрирования среды с клеточной культурой. Альтернативно этому культуры Chrysosporium можно выращивать в условиях купномасштабного производства для промышленного применения с использованием общепринятых способов ферментации. В контексте настоящего описания понятие ферментация используется в широком смысле для обозначения любых контролируемых условий культивирования гриба. Перед крупномасштабным выращиванием, как правило, культивируют инокулят целевой культуры. Среда для инокулята может содержать обычные ингредиенты, включая (но не ограничиваясь ими) источники углерода, источники органического азота и неорганические соли. Источниками углерода могут служить (но не ограничиваясь ими) глюкоза, лактоза, глицерин и/или целлюлоза в концентрациях приблизительно от 0,5 до 200 г/л, более предпочтительно приблизительно от 5 до 50 г/л. Источниками органического азота могут служить (но не ограничиваясь ими) дрожжевой экстракт, пептон или обезжиренная мука из семян хлопчатника в концентрациях приблизительно от 0,5 до 30 г/л,более предпочтительно в диапазоне приблизительно от 5 до 15 г/л. В качестве неорганических солей можно использовать (но не ограничиваясь ими) фосфат калия, например, в концентрации приблизительно от 0,01 до приблизительно 10 г/л, сульфат магния, например, в концентрации приблизительно от 0,01 до 3,0 г/л,сульфат железа, например, в концентрации приблизительно от 0,001 до 10 г/л. 10 Инокулят или заквасочная культура может применяться для инициации культуры Chrysosporium в ферментере способами, известными в данной области. Среда для ферментации может включать обычные ингредиенты для культивирования грибов, в том числе (но не ограничиваясь ими) целлюлозу, источники органического азота, хлорид магния и хлорид кальция. Примеры источников органического азота включают(но не ограничиваясь ими) пептон или обезжиренную муку из семян хлопчатника, такую какPharmamedia. Например, среда может включать приблизительно от 5 г/л до приблизительно 20 г/л пептона или обезжиренной муки из семян хлопчатника, приблизительно от 10 г/л до приблизительно 30 г/л целлюлозы, приблизительно от 0,03 г/л до приблизительно 0,06 г/л гептагидрата сульфата магния и приблизительно от 0,4 г/л до приблизительно 0,8 г/л дигидрата хлорида кальция. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что в процессе ферментации необходимо поддерживать соответствующие температуру, уровень насыщения кислородом,значение рН и концентрацию питательных веществ в смеси для ферментации. Например,уровни растворенного кислорода следует поддерживать в диапазоне приблизительно от 10 до 60% от насыщения воздухом, предпочтительно приблизительно от 20 до 40% от насыщения воздухом. Значение рН следует поддерживать в диапазоне приблизительно от 5 до 8, предпочтительно приблизительно от 6,5 до 7,5, более предпочтительно от 6,9 до 7,1, а температуру следует поддерживать в диапазоне приблизительно от 25 С до приблизительно 40 С, предпочтительно приблизительно от 28 до 35 С. Питательный раствор может включать ингредиенты, аналогичные таковым, применяемым в среде для ферментирования, но в более высоких концентрациях с целью минимизировать разбавление при добавлении в среду для ферментации. Целлюлазные композиции, получаемые согласно способам, которые являются объектом изобретения, можно использовать в иных целях,когда необходима целлюлазная активность, в частности нейтральная и/или щелочная целлюлазная активность. В одном из варинтов осуществления изобретения нейтральные и/или щелочные целлюлазные композиции могут применяться при абразивной стирке джинсов из ткани деним. Например, для применения при абразивной стирке предпочтительный диапазон значений рН составляет приблизительно от 5,5 до 7,5,наиболее предпочтительно приблизительно от 6 до приблизительно 7. Нейтральная и/или щелочная целлюлазная композиция, получаемая из изолятов Chrysosporium, преимущественно обладает выраженной ферментативной активностью при нейтральных или превышающих нейтральные или щелочных значениях рН. Способы 11 абразивной стирки, осуществляемые с применением нейтральной и/или щелочной целлюлазы,при нейтральных и/или щелочных значениях рН, обладают особыми преимуществами по сравнению с традиционными способами с применением кислых целлюлаз (т.е. получаемых изTrichoderma reesei) благодаря более низким уровням окрашивания изнанки предметов одежды, меньшей потере прочности предметов одежды и влиянию естественно присутствующей щелочности воды при таком способе. Такие способы абразивной стирки улучшают гриф джинсовой ткани и придают ей приятный внешний вид. Например, на 135 г ткани деним могут быть использованы от 0,02 до 10 г целлюлазного препарата 47.0528, представленного в данном описании. Для специалиста в данной области очевидно, каким образом можно регулировать количество или концентрацию целлюлазной композиции, получаемой согласно данному изобретению, на основе таких факторов (но не ограничиваясь ими), как активность целлюлазы и условия стирки, включая температуру и значение рН. Еще в одном варианте осуществления изобретения целлюлазные композиции по настоящему изобретению могут применяться для уменьшения или устранения грубости, присущей тканям из целлюлозы, путем добавления к композициям моющих средств. Например,предпочтительный диапазон значений рН для композиций моющих средств составляет приблизительно от 8 до приблизительно 12, наиболее предпочтительно от рН 10 до приблизительно 11. Целлюлазные композиции, являющиеся объектом изобретения, могут применяться в композициях моющих средств при нейтральных и/или щелочных значениях рН. К числу ингредиентов моющих средств, которые можно использовать вместе с целлюлазными композициями, являющимися объектом изобретения,относятся любые ингредиенты моющих средств,известные в данной области. Примеры таких ингредиентов включают (но не ограничиваясь ими) моющие средства, буферы, поверхностноактивные вещества, отбелочные средства, мягчители, растворители, средства для жесткой отделки (крахмалящие средства), абразивы, щелочи, неорганические электролиты, целлюлазные активаторы, антиоксиданты, модифицирующие добавки, силикаты, консерванты и стабилизаторы, известные в данной области. В композициях моющих средств по изобретению предпочтительно применять поверхностноактивный агент, т.е. ПАВ, включая анионогенные, неионогенные и амфолитические поверхностно-активные вещества, применение которых в композициях моющих средств хорошо известно. В дополнение к целлюлазным компонентам и поверхностно-активному веществу композиции моющих средств по изобретению могут также включать один или несколько из 12 следующих компонентов, ферменты амилазы,целлюлазы, протеиназы, липазы, оксидоредуктазы, пероксидазы и другие ферменты, катионогенные поверхностно-активные вещества и жирные кислоты с длинной цепью, модифицирующие добавки, противоосаждающие агенты,отбелочные средства, подсинивающие вещества и флуоресцентные красители, ингибиторы слеживания, маскирующие агенты для факторов,ингибирующих целлюлазную активность, активаторы целлюлазы, антиоксиданты и солюбилизаторы. Кроме того, при необходимости в композициях моющих средств по изобретению могут быть использованы отдушки, консерванты,красители и т.п. Примеры композиций моющих средств с использованием целлюлаз приведены в патентах US 4435307, US 4443355, US 4661289, US 4479881, US 5120463, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Если основа моющего средства, применяемая согласно настоящему изобретению, находится в форме порошка, он может представлять собой порошок, получаемый любым известным способом, включая распылительную сушку и/или грануляцию. Грануляция является наиболее предпочтительной вследствие того,что она позволяет получать беспылевые гранулы в отличие от продуктов, получаемых при распылительной сушке. Основа моющего средства, получаемая распылительной сушкой,представляет собой полые гранулы, образующиеся при распылении водной суспензии теплостойких ингредиентов, таких, как поверхностноактивные агенты и модифицирующие добавки, в нагретой среде. Гранулы имеют размер приблизительно от 50 до 2000 мкм. После распылительной сушки могут быть добавлены отдушки,ферменты, отбелочные средства и/или неорганические щелочные модифицирующие добавки. К гранулированной основе моющего средства,имеющей высокую плотность и получаемой распылительной сушкой/грануляцией, различные ингредиенты можно добавлять после получения основы. Если основа моющего средства является жидкой, то она может представлять собой гомогенный или негомогенный раствор. Целлюлазные композиции по изобретению предпочтительно обладают высокими уровнями активности при щелочных или нейтральных значениях рН, однако они также могут обладать ферментативной активностью при кислых значенияхрН. Поэтому композиции моющих средств, включающие целлюлазы по настоящему изобретению, могут применяться в широком диапазоне значений рН от кислых до щелочных значений рН. Другие области, в которых эти целлюлазные композиции могут использоваться в текстильной промышленности, включают применения для окраски предметов одежды, но не ограничены ими, включающие ферментативную 13 мерсеризацию вискозы, применения для биополирования, ферментативное полирование поверхности; биологическая стирка (стирка или отстирывающая обработка текстильных материалов), ферментативное микрофибриллирование, ферментативную котонизацию льна, рами и пеньки; и обработку тканей из волокон типаLyocel или Newcell (т.е., волокна "Tencel", поставляемого фирмой Courtlaud), Cupro или других целлюлозных волокон или предметов одежды из них удаление красителя из окрашенных целлюлозных субстратов, таких, как окрашенный хлопок (Leisola и Linko - Analytical Biochemistry, т. 70, стр. 592 (1976), Determination OfResearch Institute 24 (1985, в качестве отбелочного средства для придания старого вида новой ткани деним, окрашенной индиго (Fujikawa - заявка на японский патент Kokai50132269), для усиления отбеливающего действия отбелочных средств (Suzuki -патент Великобритании 2094826) и в способе с использованием композиций для расшлихтовки и отбеливания текстильных изделий с помощью ферментов(Windbichtler и др., патент US 2974001), но не ограничены ими. Другой пример ферментной расшлихтовки с использованием целлюлаз приведен у Bhatawadekar (май 1983) в Journal of theTextile Association, стр. 83-86. В других вариантах промышленных применений целлюлазные композиции могут применяться способами, известными специалисту в данной области, при осахаривании лигноцеллюлозной биомассы, получаемой в сельском хозяйстве, в виде продуктов лесной промышленности, городских твердых отходов и из других источников, при производстве различных видов горючего и других химических веществ с помощью ферментации, при биоотбеливании древесной пульпы и при удалении типографской краски с повторно используемой бумаги для печати. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения различные компоненты нейтральных и щелочных целлюлазных композиций могут быть выделены и использованы независимо друг от друга. Определенные компоненты или целлюлазная композиция с высоким содержанием определенных целлюлазных компонентов могут быть получены или выделены химическими и физическими средствами из мутантов или специально получены методами генетической инженерии. Целлюлазная система может быть разделена на отдельные компоненты известными в данной области способами разделения, включающими ионообменную хроматографию при соответствующем значении рН, аффинную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию и т.п. Например, с помо 003295 14 щью ионообменной хроматографии можно разделить целлюлазные компоненты путем элюирования с использованием градиента рН или солевого градиента, или их обоих. Такие разделения могут быть осуществлены специалистом в данной области с использованием сведений,приведенных в данном описании. После фракционирования и выделения отдельных ферментных компонентов целлюлазной композиции протеины могут быть частично секвенированы или микросеквенированы для создания синтетической ДНК или зондов, предназначенных для выделения гена, кодирующего представляющие интерес протеины ферментов. Как правило, аминоконцевую последовательность протеина определяют общепринятыми способами секвенирования протеина или автоматическим секвенированием (Ausubel и др.,(1987) в "Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons, New York, New York). Альтернативно этому другие области протеина могут быть секвенированы с использованием комбинации химического или ферментативного расщепления и способов разделения протеинов.York, New York). Специалисту в данной области должно быть очевидно, что клоны синтетической ДНК или зонды могут быть использованы в стандартных способах клонирования для выделения генов, соответствующих ферментам,присутствующим в нейтральных/щелочных целлюлазных композициях, продуцируемыхChrysosporium. Специалисту в данной области должно быть понятно, что нуклеотидные последовательности, получаемые согласно данному изобретению, могут различаться вследствие вырожденности генетического кода в последовательности ДНК, но все еще приводить к образованию последовательностей ДНК, способных кодировать ферментативные компоненты целлюлазных композиций. Следовательно, такие последовательности ДНК являются функционально эквивалентными нуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению и подразумевается, что они подпадают под объем настоящего изобретения. Также подразумевается, что под объем данного изобретения подпадают нуклеотидные последовательности, комплементарные нуклеотидным последовательностям, способным гибридизоваться с описанной нуклеотидной последовательностью в различных условиях. Кроме того, данное изобретение включает нуклеотидные последовательности, кодирующие ферменты целлюлазных композиций по данному изобретению и те протеины или пептиды, которые обладают практически той же функцией, что и ферментативные протеины или пептиды по данному изобретению. Такие протеины или полипептиды включают фрагмент 15 протеина или мутант, образованный в результате замещения, добавления или делеции, но не ограничены ими. Под объем данного изобретения также подпадают протеины или пептиды,практически гомологичные протеинам, которые являются ферментами, входящими в состав целлюлазной композиции по данному изобретению. Понятие "аналог" включает любой полипептид,имеющий аминокислотную последовательность,практически идентичную последовательности, в частности, последовательности, в которой один или несколько остатков консервативно замещены функционально сходным остатком и который обладает функциональными характеристиками описанных в данной заявке протеинов. Примеры консервативных замещений включают замену неполярного (гидрофобного) остатка,такого, как изолейцин, валин, лейцин или аланин, на другой, замену одного полярного (гидрофильного) остатка на другой, например, замену аргинина на лизин, глутамина на аспарагин,треонина на серии, замену одного щелочного остатка, такого, как лизин, аргинин или гистидин, на другой, или замену одного кислого остатка, такого, как аспартамовая кислота или глутаминовая кислота, на другой. Протеины или полипептиды по настоящему изобретению также включают любой полипептид, имеющий одно или несколько добавлений и/или делеций остатков по сравнению с последовательностью полипептида, характерной для протеина по настоящему изобретению, если сохраняется требуемая активность. Данное изобретение также относится к рекомбинантной молекуле ДНК, включающей все или часть нуклеотидных последовательностей,выделенных согласно данному изобретению, и вектор. Векторы экспрессии, пригодные для использования согласно настоящему изобретению, включают, по крайней мере, один элемент,контролирующий экспрессию, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью. Элементы, контролирующие экспрессию,встраивают в вектор для контроля и регуляции экспрессии нуклеотидной последовательности. Примеры элементов, контролирующих экспрессию, включают lac-систему, операторные и промоторные области фага лямбда, промоторы из дрожжей или других грибов, но не ограничены ими. Примеры промоторов, которые могут быть использованы, включают глюкозамилазу,но не ограничены ею. Другие предпочтительные или необходимые функциональные элементы включают лидерную последовательность, терминирующие кодоны, сигналы полиаденилирования и любые другие последовательности, необходимые или предпочтительные для соответствующей транскрипции и последующей трансляции нуклеотидной последовательности в системе хозяина, но не ограничены ими. Специалист в данной области должен понимать, что правильная комбинация требуемых или перед 003295 16 почтительных элементов, контролирующих экспрессию, должна зависеть от выбранной системы хозяина. Кроме того, следует понимать, что вектор экспрессии должен содержать дополнительные элементы, необходимые для переноса и последующей репликации вектора экспрессии,содержащего нуклеотидную последовательность, в системе хозяина. Примеры таких элементов включают сайты инициации репликации и селектируемые маркеры, но не ограничены ими. Кроме того, специалисту в данной области должно быть ясно, что такие векторы конструируют общепринятыми способами (Ausubel и др.,(1987) в "Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons, New York, New York) или они имеются в продаже. Следующий объект данного изобретения относится к организму хозяину, в который встроен рекомбинантный вектор экспрессии,содержащий всю или часть нуклеотидной последовательности. Клетки-хозяева, трансформированные нуклеотидной последовательностью по данному изобретению, включают клетки эукариотических организмов, такие как клетки животных, растений или семян, насекомых или дрожжей, клетки грибов и прокариотических организмов, такие, как клетки E.coli или других бактерий. Примеры грибных клеток-хозяев включают клетки грибов p. Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Penicillium или Neurospora, но не ограничены ими. Способы, с помощью которых вектор, несущий ген, может быть встроен в клетку, включают трансформацию, микроинъекцию, электропорацию, трансдукцию или трансфекцию с использованием DEAE-декстрана, липосом или фосфата кальция, известных специалисту в данной области, но не ограничены ими (Sambrook и др. (1989) в "MolecularCloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York). Альтернативно этому клетки Chrysosporium могут быть трансформированы нуклеотидной последовательностью по данному изобретению с последующей амплификацией ДНК и продуцированием целлюлаз грибами Chrysosporium. В предпочтительном варианте осуществления применяют векторы экспрессии, которые функционируют в грибных клетках. Примеры таких векторов включают плазмиды, описанные в патентах (патент Японии JP5095787 А 930420 на имя Ogawa; патент Японии JP7115976 А 950509 на имя Ozeki; патент Японии JP3094690 А 910419 на имя Murakami; патент ЯпонииJP3251175 А 911108 на имя Ishida; патент Японии JP5268953 А 931019 DW9346 C12N-009/34 011 рр на имя Uozumi; патент ГерманииGysler), но не ограничены ими. Предпочтительно, если рекомбинантный вектор экспрессии протеина интродуцируют в грибные клетки так, 17 чтобы гарантировать правильный процессинг и модификацию интродуцированного протеина. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный протеин, экспрессируемый клетками-хозяевами, может быть получен в виде неочищенного лизата или может быть очищен стандартными способами очистки протеина,известными в данной области, которые могут включать дифференциальное осаждение, хроматографию с использованием молекулярных сит,ионообменную хроматографию, изоэлектрическое фокусирование, гель-электрофорез, аффинную и иммуноаффинную хроматографию и т.п. (Ausubel и др., (1987) в "Current Protocols inYork, New York). В случае иммуноаффинной хроматографии рекомбинантный протеин может быть очищен путем пропускания через колонку,заполненную смолой, которая связана с антителами, специфическими для представляющего интерес протеина (Ausubel и др., (1987) в "Current Protocols in Molecular Biology", John Wileyand Sons, New York, New York). Полные нуклеотидные последовательности или части нуклеотидных последовательностей по данному изобретению также могут применяться в качестве зондов для выделения других гомологов в других родах или штаммах. В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидные последовательности используют для скрининга библиотеки Chrysosporium; отбирают и секвенируют позитивные клоны. Примеры источников, из которых может быть синтезирована генная библиотека, включают видыChrysosporium, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Cephalosporium, Trichoderma или бактерии,такие как бактерии р. Bacillus, но не ограничены данными видами. Специалист в данной области должен понимать, что для выявления гомологов должны быть использованы соответствующие условия гибридизации. Общепринятые способы гибридизации нуклеиновых кислот, конструирования библиотек и способы клонирования описаны у Sambrook и др. (ред.), (1989) в "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", ColdYork, New York. Данное изобретение также относится к мутантным штаммам Chrysosporium, в частности, к мутантным штаммам Chrysosporium lucknowense, способным продуцировать нейтральные и/ или щелочные целлюлазы. Способы мутагенеза ДНК и скрининга мутантов хорошо известны специалистам в данной области и включают целый ряд химических и ферментативных способов. Примеры таких способов включают воздействие на грибы ультрафиолетовым светом(УФ), азотистой кислотой, N-метил-N'-нитрo-Nнитрозогуанидином (НГ) и 4-нитрохинолин-Nоксидом (4 НХО), но не ограничены ими.Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor, New York). Предпочтительные способы включают использование УФ и НГ. Например, мутантные штаммы Chrysosporium, способные продуцировать повышенные уровни целлюлазных композиций, обладающих ферментативной активностью при нейтральных и/или щелочных значениях рН, могут быть получены с помощью УФ-мутагенеза. Например,мутанты могут быть получены путем воздействия на грибные споры УФ-освещением в течение промежутка времени приблизительно от 10 до приблизительно 180 с, предпочтительно от 45 до приблизительно 90 с, наиболее предпочтительно от 65 до 75 с. При мутагенезе с использованием НГ можно варьировать концентрации НГ и время экспозиции. Например, НГ в концентрации приблизительно от 13 мг/л до приблизительно 400 мг/л может применяться в течение времени экспозиции от приблизительно 15 мин до приблизительно 120 мин. Альтернативные способы получения мутантов включают способы из области молекулярной биологии. Примеры таких способов включают сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, мутации с использованием сканирования линкером или сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов с применением полимеразной цепной реакцииBiology), но не ограничены ими. Скрининг и отбор мутантных клонов Chrysosporium, проявляющих улучшенные характеристики в отношении продуцирования целлюлазы, также можно проводить согласно общепринятой методологии. Примеры критериев отбора для скрининга мутантов включают способность грибной колонии разлагать целлюлозу, что проявляется в элиминации целлюлозы в результате роста грибов на планшетах со средой, содержащей целлюлозу, и в увеличенной скорости роста на среде, содержащей целлюлозу, но не ограничены ими. Например, после мутагенеза образец грибов может выращиваться на агаровых планшетах, содержащих целлюлозу, с помощью общепринятого способа. Могут быть отобраны колонии, характеризующиеся увеличенной скоростью роста и элиминации целлюлозы (что сопровождается осветлением среды, окружающей изолят). Однако элиминация целлюлозы может быть оценена с использованием любого другого способа анализа. После выделения мутанта штамм или споры, полученные из мутанта, могут выращиваться стандартным способом. Выделенных таким способом мутантов можно культивировать или ферментировать в условиях, описанных в данном разделе и выше для штаммов Chrysosporium дикого типа. Отдельные компоненты ферментов целлюлазной композиции, продуцированной мутантами, могут 19 быть частично секвенированы или микросеквенированы для создания синтетического продукта для выделения генов, кодирующих представляющие интерес протеины, обладающие ферментативной активностью. Таким образом, данное изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующим ферменты целлюлазы, продуцируемые мутантами Chrysosporium, и к ферментам самим по себе. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения выделенные мутанты могут быть подвергнуты дельнейшему мутагенезу и скринингу способами, представленными выше в настоящем описании. Настоящее изобретение также относится к способам получения, выделения и очистки ферментов целлюлаз, обладающих требуемой эндоглюканазной и/или целлобиогидралазной активностью, из организмов любых видов и штаммов Chrysosporium и при этом способ очистки не ограничен конкретными видами организма. Такие очищенные или частично очищенные фракции протеина и полученные из них ферменты в соответствии с настоящим изобретением весьма пригодны при таких применениях, как абразивная стирка, придание яркости окраске, депилляция и мягчение ткани, а также при других применениях, хорошо известных в данной области. Такие очищенные ферментные препараты легко могут быть подготовлены к использованию в качестве добавок к моющим средствам и другим составам, которые используются при таких применениях. Специалист в данной области легко может предложить эти и другие способы применения и не нуждается в подробном описании в настоящей заявке. Однако описание типичных способов применения этих препаратов приведено ниже в примерах. Все цитированные в настоящем описании книги, патенты или статьи включены в качестве ссылки. Следующие примеры иллюстрируют различные аспекты изобретения, но никоим образом не направлены на ограничение изобретения. Все проценты представляют собой мас.%, а все соотношения в смесях растворителей представляют собой объемные соотношения, если не указано иное. Материалы и методы исследования Ферментативные анализы. Анализ СМСазной активности с использованием карбоксиметилцеллюлозы в качестве ферментативного субстрата, измерения начальной скорости гидролиза и количественной оценки количества выделившихся восстанавливающих сахаров проводили согласно способу Somogui и Nelson. Способ описан в Methods in Enzymology, т. 160 А,стр. 102-104. Эндо-1,4 глюканазную активность определяли вискозиметрическим методом на основе скорости уменьшения вязкости растворимого субстрата CMC согласно методу,описанному в Bioorganicheskaya Khimia, т. 6,стр. 1225-1242 (эндовискозиметрический ана 003295 20 лиз). В методе оценки активности с использованием фильтровальной бумаги (АФБ) или общей целлюлазной активности в качестве субстрата используется фильтровальная бумага и с его помощью определяется активность, необходимая для выделения 2 мг глюкозы из образца фильтровальной бумаги массой 50 мг. Анализ основан на рекомендациях Комиссии по биотехнологии (IUPAC) для измерения общей целлюлазной активности или истинной целлюлазы и описан в Methods in Enzymology, т. 160 А, стр. 94-97. Авицелазную активность оценивали по начальной скорости образования восстанавливающих сахаров в результате гидролиза при использовании в качестве субстрата авицелцеллюлозы (как описано в Bioresource Technology, т. 52, стр. 119-124). При анализе целлобиазной активности в качестве субстрата использовали целлобиозу и измеряли количество выделившейся глюкозы (метод описан в Methodsin Enzymology, т. 160 А, стр. 111-112). При анализе р-глюкозидазной активности в качестве субстрата использовали паранитрофенилDглюкозид (метод описан в Methods in Enzymology, т. 160 А, стр. 109-110). Количество протеина определяли по методу Лоури (Lowry, Journal ofBiological Chemistry, т. 193, стр. 165-175). Анализ RBB-СМСазной активности основан на определении количества выделившегося красителя из растворимого субстрата RBB-CMC (CMC,окрашенная Remazobrilliant Blue), метод анализа описан в Megazyme (Австралия) Ltd., ProductInformation Bulletin, апрель 1995. Эндоцеллюлазная активность также может быть измерена с помощью анализа целлазима с использованием в качестве субстрата НЕ-целлюлозы, сшитой с азурином (см. Megazyme Product Bulletin CEL,январь 1996). Пример 1. Выделение штамма Сl. Штамм выделяли из образцов лесной щелочной почвы из района Соленого Озера, Дальний Восток Российской Федерации (Тихоокеанское побережье России, приблизительно 5000 миль к востоку от Москвы). Образцы смешанной почвы брали из 10 различных мест. Один грамм каждого образца помещали в колбу, содержащую 100 мл стерильной водопроводной воды и подвергали облучению ультразвуком с помощью ультразвукового устройства в течение 1 мин (0,44 А, 22 кГц). Суспензию (разбавленную в соотношении 1:500) инокулировали в чашки Петри, содержащие среду Чапека (рН 5,5-6,0) с добавлением 100 мг/л стрептомицина. Анализ проводили в трех повторностях. Для следующей стадии выделения отбирали колонии с различной формой окраски и размером. Дальнейшее выделение оборазца проводили на планшетах, содержащих среду Чапека, солодовый агар, картофельный агар с декстрозой или физиологическую среду Гетчинсона с рН 7,5(табл. 2). Планшеты инкубировали приблизи 21 тельно при 28 С в течение нескольких дней. Отбор продуцентов целлюлазы проводили на планшетах с целлюлозным агаром, содержащим компоненты, указанные в табл. 1. Способ получения аморфной целлюлозы описан в Methods inEnzymology, т. 160 А. Таблица 1. Планшеты с целлюлозным агаром Ингредиенты г/л КН 2 РО 4 1 КСl 0,1 Планшеты инкубировали при 28 С в течение 3-7 дней. Образование светлого прозрачного венчика вокруг колоний свидетельствует о целлюлазной активности. Для дальнейшего изучения был выбран один штамм, обозначенный Сl,проявивший значительные уровни целлюлазной активности. В соответствии с Будапештским договором штамм был помещен 29 августа 1996 г. во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов Российской Академии наук (VKM) (сокращение на английском языке RCM), ул. Бахрушина, 8, Москва, Россия, 113184, под названиемChrysosporium lucknowense Garg 27K, VKM-F 3500 D). Пример 2. Характеристика штамма Сl. При выращивании штамма Сl на картофельном агаре с декстрозой через 7 дней получают колонии диаметром 55-60 мм. Колонии штамма Сl имеют светло-кремовую окраску,бархатистую поверхность и слегка возвышенную центральную часть. Края колоний плоские,тонкие и волокнистые. Обратная сторона колоний имеет светло-кремовую окраску. Мицеллий имеет гиалин и является слегка разветвленным и гладким. Гифы тонкостенные. Воздушные гифы имеют перегородки и образуют споры шириной 2,0-3,0 мкм; субстрат гиф стерильный. Конидии концевые и боковые. Не обнаружено интеркалярных конидий. Большинство конидий соединено с гифами короткими стебельками или короткими боковыми отростками. Конидии отдельные, но смежные. Конидии гиалиновые (стекловидные), тонкостенные, овальные или булавовидные и одноклеточные. Их размер варьирует от 4 до 10 мкм в диаметре. Штамм Сl можно сохранять на агаре с солодовым экстрактом (при 4 С) и пересевать каждые шесть месяцев. Их также можно сохранять в жидком азоте и с помощью лиофилизации. Штамм Сl является гаплоидным, нитеобразным, может расти на агаровых планшетах с добавлением ограничивающих рост агентов,таких, как бычья желчь (1,5%) и продуцировать споры. Пример 3. Классификация штамма Сl. 22 В соответствии с классификацией по Саттону (Van Dorschot C.A.N. [1980] "A revision ofC1, являющийся объектом изобретения, относится к отряду Hyphomycetales, семейству Moniliaceae, роду Chrysosporium, виду Chrysosporium lucknowense Garg 1966. Эта классификация основана на обнаружении следующих характеристик штамма Сl: 1. Признаки отряда Hyphomycetales. Конидии образуются непосредственно на мицелии,на отдельных спорообразующих клетках или на отдельных конидиофорах. 2. Признаки семейства Moniliaceae. Как конидии, так и конидиофоры (если они присутствуют) стекловидные или яркоокрашенные; конидиофоры одиночные или сгруппированы в редкие кластеры. 3. Признаки рода Chrysosporium Corda 1833. Колонии, как правило, плоские, белые,иногда имеющие светло-кремовую, светлокоричневую или желтую окраску, опушенные и/или припудренные. Гифы по большей части стекловидные и гладкостенные с нерегулярным,более или менее ортотопическим разветвлением. Фертильные гифы имеют слабую дифференциацию или не имеют ее вообще. Конидии концевые и боковые, слоистые, образуются целиком над гифами, бесчерешковые или расположены на коротких выростах или боковых ветвях, почти стекловидные или светло-желтые,тонко- или толстостенные, округлые, булавовидные, грушевидные, обратнояйцевидные, одноклеточные, реже двухклеточные, укороченные. Иногда присутствуют интерскалярные конидии, они являются одиночными, иногда расположенными цепочками, почти стекловидными или светло-желтыми, более широкими, чем поддерживающие гифы, как правило, одноклеточными, укороченными на обоих концах. Иногда присутствуют хламидоспоры. 4. Видовые признаки Chrysosporiumlucknowense Garg 1966. При выращивании на глюкозном агареSabouraud диаметр колоний через 14 дней становится равным 55 мм, они имеют кремовую окраску, являются опушенными и ворсистыми; плотными и имеют высоту 3-5 мм; края хорошо выражены, правильные и бахромчатые; обратная сторона имеет цвет от светло-желтого до кремового. Гифы стекловидные, гладко- и тонкостенные, слабо разветвленные. Воздушные гифы в основном фертильные и почти разделены перегородками шириной приблизительно 13,5 мм. Погруженные гифы являются бесплодными, имеют ширину приблизительно 1-4,5 мм,при этом более тонкие гифы часто искривлены. Конидии концевые и боковые, в основном бесчерешковые или расположены на коротких, часто конических выступах или коротких боковых 23 ветвях. Конидии одиночные, но расположены в тесной близости друг к другу, на одной гифальной клетке образуются 1-4 конидии, почти стекловидные, выраженно тонко- и гладкостенные, в основном округлые, а также булавовидные обратнояйцевидные, одноклеточные, размером 2,5-11x1,5-6 мм с широкими базальными рубцами (1-2 мм). Интерскалярные конидии отсутствуют. Хламидоспоры отсутствуют. 5. Описание штамма Сl. На картофельном агаре с декстрозой колонии вырастают в течение приблизительно 7 дней до размера приблизительно 55-60 мм в диаметре; они имеют беловато-кремовую окраску, опушенные, высотой 23 мм в центре; края хорошо выражены, правильные, бахромчатые; обратная сторона имеет бледную кремовую окраску. Гифы стекловидные, гладко- и тонкостенные, слабо разветвленные. Воздушные гифы фертильные, разделены перегородками, имеют ширину 2-3 мм. Погруженные гифы бесплодные. Конидии концевые и боковые; бесчерешковые или расположены на коротких боковых ветвях; рассеянные; одиночные, но расположены в тесной близости друг к другу, стекловидные, тонко- и гладкостенные,округлые, булавовидные или обратнояйцевидные, одноклеточные, размером 4-10 мм. Хламидоспоры отсутствуют. Интеркалярные конидии отсутствуют. Вывод. Сl представляет собой штамм"Сl" или "Сl-целлюлаза". Пример 4. Анализ целлюлазной активности. Штамм Сl выращивали во встряхиваемых колбах объемом 800 мл при скорости вращения 220 об./мин и инкубировали при 28 С. Штамм Сl выращивали в физиологической среде Гетчинсона (см. табл. 2) (рН 7,5), содержащей 5 г/л различных питательных веществ и в некоторых случаях 2 г/л микрокристаллической целлюлозы. В каждую колбу добавляли 100 мл среды. Таблица 2. Среда Гетчинсона для встряхиваемых колб г/л КН 2 РО 4 1 КС 1 0,1 Использование комбинаций глюкозы и микрокристаллической целлюлозы, декстрозы и микрокристаллической целлюлозы, глицерина и микрокристаллической целлюлозы, лактозы и микрокристаллической целлюлозы приводит к очень слабому росту, образованию больших скоплений мицелия и отсутствию целлюлазной активности (анализ СМСазной активности). Результаты представлены в табл. 3. Добавления источников органического азота, т.е. пептона, 003295 24 экстракта замоченной кукурузы или дрожжевого экстракта усиливали рост и производство целлюлазы и не приводили к возникновению скоплений мицелия. Лактоза и дрожжевой экстракт приводили к наибольшему производству целлюлазы штаммом Сl. Сходные результаты были получены,когда лактозу и дрожжевой экстракт заменяли на смесь, содержащую 25 г/л пульпы сахарной свеклы, 15 г/л ячменного солода и 5 г/л пшеничных отрубей. Таблица 3. Влияние источников углерода и азота на СМСазную активность штамма Сl (результаты опытов с использованием встряхиваемых колб) СМСазная активность Субстрат Пример 5. Получение целлюлазы для опытных абразивных стирок. 1. Получение во встряхиваемых колбах. Штамм Сl выращивали во встряхиваемых колбах объемом 800 мл при скорости вращения 220 об/мин и инкубировали при 28 С в течение 7 дней. Среда для роста (100 мл/колбу) представляла собой физиологическую среду Гетчинсона (см. табл. 2) (рН 7,5), содержащую 25 г/л пульпы сахарной свеклы, 15 г/л ячменного солода и 5 г/л пшеничных отрубей. Клеточную массу отделяли центрифугированием и супернатант, не содержащий клеток, лиофилизировали и хранили для дальнейших опытов. Таким способом получали препараты Сl-целлюлазы с номерами от 47.1.1 до 47.15.1. Таким же способом получали Сl-препарат 47.16.1, но супернатант, не содержащий клеток, после центрифугирования перед лиофилизацией подвергали ультрафильтрации с использованием мембраны,пропускающей частицы с предельной массой 10 кДа. Таким же способом получали Сlцеллюлазные препараты с номерами от 47.18.1 до 47.22.1 во встряхиваемых колбах со средой Гетчинсона, но содержащих вместо пульпы сахарной свеклы, ячменного солода и пшеничных отрубей лактозу (0,5 мас./об.%) и пептон (0,5 мас./об.%). Клеточную массу отделяли центрифугированием и супернатант, не содержащий клеток, лиофилизировали и хранили для дальнейших опытов. Препараты с номерами 47.1000,47.1001, 47.2000 и 47.2001 получали во встряхиваемх колбах таким же способом, что и препараты с номерами 47.1.1 - 47.15.1, за исключением того, что их получали с использованием дру 25 гих штаммов Chrysosporium. Конкретно препарат 47.2001 продуцировался Chrysosporium pannorum, препарат 47.2000 продуцировался Chrysosporium pruinosum, препарат 47.1001 продуцировался Chrysosporium keretinophilim и препарат 26 47.1000 продуцировался Chrysosporium queenslandicum (см. пример 8). Содержание протеина и активность фингерпринтов этих Сl-препаратов приведены в табл. 4. Таблица 4. Содержание протеина и активность фингерпринтов Сl-препаратов и препаратов с номерами 47.1000, 47.1001, 47.2000 и 47.2001, полученных с использованием других видов Chrysosporium sp. Глюкозидаза,Эндо (виск.),ПрепаратПротеин, % АФБ, FP, ед./г СМСаза, ед./г Авицелаза, ед./г ед./г ед./г 47.1.1 22 13 170 120 23 135 47.2.1 26 14 137 110 22 190 47.3.1 15 19 140 128 18 198 47.4.1 18 23 150 133 55 220 47.5.1 16 20 179 120 71 185 47.6.1 17 22 224 134 82 280 47.7.1 8 4 78 123 10 22 47.8.1 22 14 168 123 19 124 47.9.1 28 15 204 174 23 151 47.10.1 24 11 181 185 16 147 47.11.1 28 16 234 191 25 269 47.12.1 26 14 167 138 20 178 47.13.1 25 9 137 110 13 141 47.14.1 15 6 39 33 9 59 47.15.1 14 6 95 44 10 75 47.16.1 16 10 146 39 15 107 47.17.1 7 3 100 34 5 29 47.18.1 10 30 120 38 10 42 47.19.1 14 4 28 10 4 11 47.20.1 14 6 17 5 1 9 47.21.1 13 3 34 5 3 9 47.22.1 14 5 35 6 3 10 47.1000 18 4 31 35 6 89 47.1001 13 6 103 38 10 66 47.2000 10 3 78 31 7 67 47.2001 13 3 45 39 7 4 47.0325 50 155 4965 964 184 248 47.0528 67 111 13500 1782 232 423"ANKUM-1M" объемом 10 л, содержащих среду Гетчинсона, лактозу (0,5 мас./об.%), пептон (0,5 мас./об.%) и хлорамфеникол (50 мг/мл). Начальный объем питательной среды составлял 7,0 л, конечный объем после ферментации составлял 7,3 л. Контролировали концентрацию растворенного кислорода (DO), скорость перемешивания, уровень аэрации, температуру и значение рН. Ферментацию проводили способом периодической загрузки. Температуру ферментации выдерживали на уровне 28 С. Начальное значение рН было равно 7,5 и в дальнейшем поддерживалось на этом уровне путем добавления NH4OH (12 мас./об.%). Аэрация составляла 4-5 л/мин, а скорость перемешивания 400-500 об/мин. Концентрацию DO поддерживали на уровне выше 50%. Каждые 8 ч брали образцы(30 мл) для анализа. После завершения ферментации грибную биомассу отделяли центрифугированием (10000xg, комнатная температура, 20 мин) и фильтрат культуры лиофилизировали и хранили для дальнейших опытов. Результаты приведены в табл. 5. Целлюлазный препарат 47.17.1 получали таким же способом. Содержание протеина и активность фингерпринта этого Сl-препарата приведены в табл. 4. Таблица 5. Получение Сl-целлюлазы в Ферментере объемом 10 л Время (ч) DO (%) Восстанавливающие СМСаза сахара (г/л) 3. Получение Сl-препаратов 47.0325 и 47.0528. Сl-Целлюлазный препарат 47.0325 получали с использованием штамма Сl дикого типа, препарат 47.0528 получали с использованием улучшенного мутанта, полученного из штамма Сl дикого типа. Эти препараты получали путем выращивания в ферментерах в условиях, описанных в примерах 13 и 15. Препарат 47.0325 получали с использованием способа периодической ферментации, а препарат 47.0528 получали с использованием способа периодической ферментации с подпиткой. 4. Получение препаратов 14.22.1 и 14.23.1, продуцируемых грибами рода Humicola. Препарат 14.22.1, продуцируемый Humicolagrisea var. thermoidea дикого типа, получали с использованием штамма АТСС 16453, а препарат 14.23.1, продуцируемый Humicola insolens дикого типа, получали с использованием штамма АТСС 16454. Эти препараты, продуцируемые грибами рода Humicola дикого типа,получали во встряхиваемых колбах с использованием того же метода, который описан выше (в разделе "Получение во встряхиваемых колбах") для Сl-препаратов 47.1.1-47.15.1. Пример 6. Сравнение C1-целлюлазы с другими нейтральными целлюлазами АФБ,СМСазные и эндоглюканазные активности препарата 47.0528 C1-фермента сравнивали с активностями поступающих в продажу препаратов нейтральных целлюлаз, продуцируемыхHumicola insolens (Denimax XT) и АТССштаммами дикого типа Humicola (препарат 14.22.1, продуцируемый Humicola grisea var. 28 16454. Результаты приведены в таблице 6. Общие активности Сl-препарата 47.0528 существенно выше активностей препаратов нейтральных целлюлаз, продуцируемых Humicola дикого типа, и активности поступающего в продажу препарата из Humicola insolens. Удельные СМСазные и эндоглюканазные активности (выраженные в единицах на грамм сухого препарата или в единицах на грамм протеина) Сlпрепарата 47.0528 выше активностей всех тестированных препаратов, продуцируемыхHumicola, перечисленных в табл. 6. Удельная АФБ Сl-препарата 47.0528 выше удельной АФБ препаратов 14.22.1 и 14.23.1, продуцируемых Humicola дикого типа и слегка ниже удельной АФБ поступающего в продажу продукта Denimax XT, продуцируемого Humicola Таблица 6. Сравнение целлюлаз Сl и Humicola АФБ СМСаза Эндо (виск.) Протеин,% ед./1 г сухого препарата Сl (47.0528) 67 111 13500 1782 Активности измеряли при рН 5,0 и 50 С. Пример 7. Влияние рН и температуры на активность и стабильность АФБ и СМСазной активностей Сl-целлюлазы. АФБ и СМСазные активности Сl обладают оптимальной стабильностью и уровнем активности при значении рН, равном приблизительно 6-7, и температуре, равной приблизительно 5060; оптимальное значение рН для СМСазной активности составляет приблизительно 6,5, а оптимальная температура равна приблизительно 55 С (см. таблицы 8,9). При рН 8,0 (50 С) СМСазная активность составляет 80%, а АФБ 78%, при рН 9,0 (50 С) СМСазная активность составляет 65%, а АФБ - 52% от соответствующих оптимальных значений (см. табл. 7). Таблица 7. Влияние значения рН на АФБ и СМСазную активность Сl-целлюлазы ( 47.19.1) при 50 С рН (50 С) АФБ (%) СМСаза (%) 4,0 50 60 4,5 68 70 5,0 75 78 5,5 80 80 6,0 92 90 6,5 100 100 7,0 95 95 7,5 90 92 8,0 78 80 8,5 60 75 9,0 52 65 Время инкубации для АФБ-анализа составляло 60 мин, время инкубации для анализа СМСазной активности составляло 5 мин. Таблица 8. Влияние температуры на АФБ и СМСазную активность Сl-целлюлазы ( 47.19.1) при pH 7.0 Температура (С) СМСазная активАФБ (%) ность (%) 40 45 50 45 60 55 50 70 65 55 100 100 60 70 60 65 40 30 70 20 25 Время инкубации для АФБ-анализа составляло 60 мин, время инкубации для анализа СМСазной активности составляло 5 мин. Таблица 9. Стабильность СМСазной активности Сlцеллюлазы ( 47.19.1) при 50 С Время (ч) Сохранившаяся СМСазная активность (%) рН 5,1 рН 7,2 рН 7,7 рН 8,5 0 100 100 100 100 0,5 100 98 95 85 1 100 95 93 55 2 100 82 78 32 3 100 78 65 25 5 100 75 45 15 СМСазная активность Сl обладает высокой стабильностью при оптимальных рН и температуре: например, при рН 7,2 и 50 С величина СМСазной активности составляет через 1 ч 95% и через 5 ч - 75%, при рН 7,7 и 50 С величина СМСазной активности составляет через 1 ч 93(см. табл. 9). Пример 8. Нейтральная и/или щелочная целлюлазная активность/характеристики, проявляемые другими штаммами того же родаChrysosporium. Было проведено тестирование различных штаммов рода Chrysosporium в отношении продуцирования целлюлазы. Полные названия и происхождение этих штаммов приведены ниже. Штаммы, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС), Роквилл,Мэриленд, представляют собой: 1. АТСС 44006 Chrysosporium lucknowense. 2. АТСС 34151 Chrysosporium pannorum. 3. АТСС 24782 Chrysosporium pruinosum. Штаммы, полученные из Российской коллекции микроорганизмов (VKM), представляют собой: 1. VKMF-2119 Chrysosporium keratinophilum. 2. VKMF-2875 Chrysosporium keratinophilum. 3. VKMF-2120 Chrysosporium lobatum. 4. VKMF-2121 Chrysosporium merdarium. 5. VKMF-2116 Chrysosporium queenslandicum. 6. VKMF-2117 Chrysosporium queenslandicum. 7. VKMF-2877 Chrysosporium tropicum. 30 В данном исследовании использовали два типа среды для роста: среду А -среду Гетчинсона, дополненную выжимками сахарной свеклы,ячменным солодом и пшеничными отрубями; и среду Б - среду Гетчинсона, дополненную пептоном и лактозой. Составы сред приведены в табл. 11. Таблица 11. Среда для исследований в колбах Среда А г/л Среда Б К 2 НРO4 1 К 2 НРО 4 КСl 0,1 КСlNaNO3 Пульпа сахарной свеклы 25 лактоза Ячменный солод 15 пептон Пшеничные отруби 5 рН рН 7,5 Штаммы выращивали во встряхиваемых колбах при 220 об/мин и 28 С. Образцы каждого штамма, выращиваемого в среде А, брали для анализа через 6 и 7 дней культивирования. Образцы штаммов, выращиваемых в среде Б, брали через 5 дней культивирования. Все образцы анализировали в отношении СМСазной активности при значениях рН 5 и 7. Результаты анализа СМСазной активности приведены в табл. 12. Таблица 12. Продуцирование целлюлазы различными штаммами Chrysosporium Среда А (6 дней) Среда А (7 дней) Среда Б (5 дней) СМСаза СМСаза СМСазаpH5 рН 7 1. VKMF 2117 2,7 0 0,46 2,6 0,00 0,00 2,3 0,21 0,09 2. VKMF 2116 1,1 0,22 0,04 0,2 0,38 0,61 4,0 0,58 0,59 3. VKMF 2121 1,9 0 0,57 1,1 0,25 0,10 2,5 0,25 0,09 4. АТСС 24782 3,4 0,33 1,40 1,9 1,85 0,11 3,0 1,10 0,06 5. АТСС 34151 1,0 1,54 0,90 0,9 0,17 0,20 4,3 0,81 0,90 6. АТСС 44006 4,4 0,21 0,49 2,0 0,68 0,34 2,5 1,29 0,06 7. VKMF 2119 4,1 0 0,08 2,7 0,29 0,00 3,8 0,95 0,04 8. VKMF 2120 4,5 0 0,17 2,3 0,23 0,00 2,3 0,12 0,00 9. VKMF 2875 1,6 0 1,01 1,7 0,00 0,00 3,8 1,96 0,05 10. VKMF 2877 2,4 0 0,03 0,8 0,22 0,00 5,0 0,43 0,00 11. C1 (VKMF 3500D) 2,9 1,70 1,65 нт нт нт 0,1 0,89 0,80RS - концентрация восстанавливающих сахаров в среде для ферментации в конце ферментации, г/л (метод Нельсона-Сомогуи); рН 5, рН 7 - значения рН, при которых анализировали СМСазную активность бульона для ферментации; СМСазная активность в ед/мл; нт - не тестировали. Штаммы В случае штаммов АТСС 34151 Chrysosporium pannorum, АТСС 24782 Chrysosporium pruinosum, VKMF-2875 Chrysosporium keratinophilum, VKMF-2116 Chrysosporium queenslandicum клеточную массу отделяли центрифугированием и супернатант, не содержащий клеток, концентрировали от объема 5 л до объема 0,5 л с помощью ультрафильтрации с использованием мембраны, пропускающей частицы с предельной массой 10 кДа. Затем подвергнутый ультрафильтрации концентрат лиофилизировали и сохраняли для опытов. Использовали следующие номера сухих целлюлазных препаратов: 47.2001 - АТСС 34151 Chrysosporium pannorum,47.2000 - АТСС 24782 Chrysosporium pruinosum,47.1001 - VKMF-2875 Chrysosporiumqueenslandicum Содержание протеина и активность фингерпринтов этих препаратов приведены в таблице 4. 31 Пример 9. Опытные абразивные стирки. А. Тесты с использованием специальной стиральной машины с загрузкой 2 л. Эта система позволяет оценить рабочие характеристики при абразивной стирке в отношении истирания и окрашивания изнанки при использовании лишь небольших количеств фермента. Расшлихтовка. Сорок кусков (по 30 г каждый, размером 25x20 см) ткани деним (рулонной) (1,2 кг) расшлихтовывали в бытовой стиральной машине при 60 С в течение 20 мин с использованием соотношения ткань:раствор 1:6(неионогенное моющее и смачивающее средство на основе этиоксилированных жирных спиртов, содержащих в среднем 6 молей этиленоксизвеньев), 1 г/л (7,2 г) Sirrix 2UD (кислое забуференное защитное средство) и 1 г/л (7,2 г) жидкого препарата Bactosol TK (стабильная при высоких температурах -амилаза) при значении рН, равном приблизительно 5-6. Через 20 мин раствор сливали и куски ткани промывали в течение 5 мин холодной водой (14 л), соотношение ткань:жидкость 1:10. Куски ткани сушили при 40 С и использовали в качестве запаса сравниваемых образцов при оценке целлюлазной активности. Целлюлазную обработку кусков ткани проводили в стиральной машине, имеющей внутренний диаметр барабана 29 см, общий объем барабана 10,6 л (скорость вращения барабана 20 об/мин, пять оборотов против часовой стрелки, пять оборотов по часовой стрелке). Перед целлюлазной обработкой каждый кусок ткани складывали и закрепляли 4 резиновыми зажимами, получая упаковку, гарантирующую,что механическое воздействие будет происходить в основном на темной внешней стороне упаковки. В каждый барабан загружали по одной упаковке и 10 дополнительных резиновых зажимов. Общие условия стирки были следующими: кусок расшлихтованной ткани деним массой 30 г, целлюлаза в 0,02 М цитратном буфере, 50 С,60 мин, соотношение ткань:раствор 1:4. После целлюлазной обработки упаковку в течение 5 32 мин промывали горячей водой (50 С) (соотношение ткань:жидкость 1:20) и высушивали для оценки. Опыты по применению проводили с использованием различных Сl-целлюлазных препаратов наряду с использованием других целлюлазных препаратов, полученных из различных видов Chrysosporium, а также поступающих в продажу от фирмы Novo Nordisk нейтральных целлюлазных продуктов Denimax XT (патент US 4435307) и Ultra MG (WPO 91/17243). Эти опыты по применению были проведены для оценки рабочих характеристик целлюлаз Сl при абразивной стирке, а также целлюлаз, продуцируемых несколькими другими видами Chrysosporium, по сравнению с характеристиками нейтральных целлюлаз, поступающих в продажу от фирмы Novo. Опыты проводили при нейтральных и щелочных значениях рН (6,5, 6,7, 7,0 и 8,0). Результаты представлены в табл. 13. Рабочие характеристики при стирке, полученные при обработке ткани различными Сl-целлюлазными препаратами и целлюлазными препаратами,продуцируемыми другими видами Chrysosporium, оказались сходными с характеристиками поступающих в продажу нейтральных целлюлазDenimax XT и Denimax Ultra MG. Целлюлазные препараты, Сl и целлюлазные препараты, продуцируемые другими видами Chrysosporium,обладали хорошими мягчительным действием,соотношением отбеливающее действие/уменьшение общего повреждения, уровнями истирания, а также низкими уровнями окрашивания изнанки в условиях нейтральных и щелочных значений рН. Количественное измерение цвета основано на измерении степени осветления образца (коэффициента отражения). Образец освещали белым светом (2 импульсные ксеноновые лампы) и с помощью 16 диодов регистрировали отражение в диапазоне длин волн от 400 до 700 нм. Чем выше значение коэффициента отражения с лицевой стороны, тем больше истирание. Чем выше значение коэффициента отражения с изнанки, тем больше окрашивание изнанки. Таблица 13. Стирка с использованием фермента в специальной машине с загрузкой 2 л (135 г ткани деним на одну загрузку) СМСаза Эндо (вискоз.) Истирание Окрашивание МПО ед./г ед./опыт ед./г ед./опыт Соотн. Время по рез-там изнанки по Фермент Кол-во, г С рН БуферT. reesei 0,30 0,22 9190 2737 2000 600 50 1:11 4,8 60 0,02 СА 17,5 8,0 Контроль 0,00 0,00 0 0 0 0 50 1:11 6,5 60 0,02 МР 9,1 н.о. 0,02 МР - фосфатная буферная система; 0,01 СА - буферная система на основе лимонной кислоты; Т. reesei СР - поступающая в продажу кислая целлюлаза, продуцируемая Trichoderma reesei. Истирание по данным измерений системой Datacolor - коэффициент отражения с лицевой стороны, чем выше значение, тем больше истирание, контроль соответствует 9,1. Окрашивание изнанки по данным измерений системой Datacolor -коэффициент отражения с задней стороны, чем ниже значение, тем меньше окрашивание изнанки. % МПО - процент от массы предмета одежды, например, 1% МПО соответствует использованию 1 фунта фермента на 100 фунтов ткани. Б. Тесты с использованием стиральной машины с загрузкой 35 фунтов. Опыты по применению проводили в стиральной машине с загрузкой 35 фунтов (Стиральная машина с загрузкой 35 фунтов фабричной марки Milnorwasher, скорость вращения 30 об/мин). Величина загрузки составляет 2400 г (3 предмета одежды), в качестве предметов одежды используют джинсы Levi's 505. Объем воды для целлюлазной ванны составляет 15 л при соотношении раствор:ткань 6,25:1 (низкий). Объем воды для всех других ванн составляет 24 л при соотношении раствор:ткань 10:1 (средний). Забуферивающая система, используемая для поддержания значения рН на уровне 6,7 при применении целлюлазной ванны, представляет собой ПФАЗагрузка (г) Стадия 1 2 3 4 5 6 7 Машина: Операция Расшлихтовка Слив Полоскание Слив Полоскание Слив Абразивная стирка Слив Стирка Слив Полоскание Слив Полоскание Слив Полоскание Слив Отжим первичный кислый фосфат аммония и ВФА вторичный кислый фосфат аммония. В опытах 4, 5, 6 и 7 к целлюлазной ванне добавляли неионогенное моющее средство, известно, что добавление моющего средства к целлюлазной ванне помогает уменьшить окрашивание изнанки предметов одежды. Zeke представляет собой расшлихтовочный продукт. SSCE обозначает(Zeke и Superscour являются специальными текстильными химическими продуктами, поставляемыми в продажу фирмой CPN International,Ltd., Inc of Jupiter, Флорида). Одним из примеров использованных в этих опытах формул стирки является приведенная ниже формула стирки в опыте 2: Специалисту в данной области должно быть понятно, что в описанном выше примере и при промышленном применении использование кусочков пемзы в процессе абразивной стирки должно усилить общее истирающее действие в отношении предметов одежды. Результаты, приведенные в табл. 14, показывают, что С 1-целлюлазные препараты 47.0325 и 47.0528 обладают лучшими харак 35 теристиками в отношении достигаемого общего уровня истирания предметов одежды, кроме того им присущ предел уровня окрашивания 36 изнанки, характерный для других тестированных нейтральных целлюлазных продуктов, поступающих в продажу. Таблица 14. Сравнение C1-целлюлазных препаратов 47.0325 и 47.0528 с поступающими в продажу нейтральными целлюлазными препаратами Denimax XT и BTU 202-318 (который содержит Denimax XT) Опыт ЦеллюлазаSB 75 Истирание (от более сильного к менее сильному) Окрашивание изнанки (от менее сильного к более сильному) опыт 5 опыт 4 опыт 6 опыт 5 опыт 2 опыт 6 опыт 3 опыт 3 опыт 4 опыт 1 опыт 1 опыт 2 опыт 7 опыт 7 Комментарий к табл. 14. Все образцы в опытах, представленных в табл. 14, отмывали с помощью Super Scour (неионогенный детергент) при 1,0% МПО, 160F в течение 5 мин. SB означает самозабуферивающий - поступающий в продажу продукт "ROCKSOFT" BTU 202-318, содержащий Denimax XT, моющее средство и буферную систему, а также другие добавки, помогающие улучшить характеристики абразивной стирки этого поступающего в продажу продукта. В. Тесты с использованием специальной стиральной машины с загрузкой 60 л. Предметы одежды из ткани деним все целиком расшлихтовывали как описано в опытах с использованием стиральной машины с загрузкой 2 л. Каждый тест по стирке проводили с 1 парой джинсов(700 г), 2,8 л жидкости (соотношение ткань:жидкость 1:4). Все джинсы были окрашены одной партией красителя. Их подвергали предварительной стирке с использованием окислительного метода в течение 15 мин, затем сушили. Синие джинсы, подвергнутые стирке при нейтральном значении рН с использованием в составе моющего раствора С 1-целлюлазных препаратов 47.0325 (2,4 г на опыт) и 47.0528 (1,5 г в первом опыте и 1,0 г во втором опыте), непосредственно сравнивали с синими джинсами,подвергнутыми стирке при нейтральном значении рН и с использованием в составе аналогичных моющих растворов Denimax XT в количестве 12 г на опыт и двух других поступающих в продажу нейтральных целлюлаз: Bactosol JE в количестве 2,0% МПО и BTU 202-318 в количестве 2,0% МПО (Bactosol JE и BTU 202-318 содержат Denimax XT, буфер и моющее средство,а также другие добавки, усиливающие их моющие характеристики). Результаты, приведенные в табл. 15, показывают, что характеристики С 1 во всех трех опытах на голубых джинсах превосходят характеристики трех поступающих в продажу нейтральных целлюлазных продуктов в отношении достигаемого уровня истирания, а также в отношении общего обесцвечивания предметов одежды. Уровни окрашивания изнанки синих джинсов во всех шести опытах были очень хорошими, они были очень близки друг к другу и к тому, что можно было ожидать и что было обнаружено при использовании нейтральной целлюлазы Denimax XT фирмы Novo. Уровни окрашивания изнанки во всех трех этих опытах с использованием С 1 были в пределах уровней окрашивания изнанки, приведенных в табл. 13. Предметы одежды после этих опытов и опытов, результаты которых проанализированы и приведены выше в табл. 14, оценивали "вслепую" четырьмя независимыми группами, состоящими из трех и более людей. Люди, входившие в состав каждой из этих групп, считаются специалистами в области абразивной стирки. Им было предложено распределить все предметы одежды в следующем порядке: (1) от наибольшего общего истирания и обесцвечивания до наименьшего общего истирания и обесцвечивания, и (2) от наименьшего уровня окрашивания изнанки до наибольшего уровня окрашивания изнанки (см. табл. 15). Таблица 15 Истирание/умень Окрашивание изнанОпыт Фермент Доза Буфер Моющее средство шение цвета ки Опыт А С-1 47.0528 1,5 г Фосфат да 1 Комментарий к таблице 15. Истирание/обесцвечивание - + + + + + + (+6) - наилучший результат ( + + + + (4) - рассматривается как хороший результат, сравнимый с таковым для поступающих в продажу нейтральных целлюлаз (например, Denimax XT. Окрашивание изнанки - чем ниже значение, тем лучше (все джинсы оценивали в пределах диапазона уровней окрашивания,имеющего место при использовании Denimax XT фирмы Novo). Нейтральная целлюлаза существенно уменьшает уровень окрашивания изнанки по сравнению с традиционными кислыми целлюлазами, такими, как продуцируемые Trichoderma (см. пример 13).%МПО означает % от массы предмета одежды, например, 1% МПО означает, что на 100 фунтов сухого веса джинсов используют 1 фунт фермента. Г. Коэффициент отражения света. Другой тест по оценке окрашивания изнанки заключается в измерении коэффициента отражения света обработанной ткани. После завершения обработки путем стирки образцы джинсов анализировали с использованием рефлектометра при двух длинах волн: (1) чем интенсивнее сигнал,обнаруживаемый при 680 нм (измеренный на лицевой стороне джинсов), тем меньше окрашивание изнанки; и (2) чем интенсивнее сигнал,обнаруживаемый при 420 нм (измеренный с изнанки джинсов), тем ниже окрашивание изнанки. В табл. 16 приведено сравнение коэффициентов отражения для джинсов из ткани деним после обработки целлюлазами, поступающими в продажу от фирм Novo Nordisk и Genencor International, пo сравнению с С 1-препаратом 47.6.1. Фермент Величины коэффициентов отражения света при использовании С 1-целлюлазы сходны с таковыми, полученными при использовании поступающего в продажу от фирмы Novo Nordisk продукта Denimax L, нейтральной целлюлазы, как при 680, так и при 420 нм, и коэффициенты отражения света, как при 680, так и при 420 нм, при использовании С 1-целлюлазы значительно лучше таковых, полученных при использовании поступающего в продажу от фирмы Genecor продукта Primаfast 100, кислой целлюлазы. Д. Тесты с использованием полупромышленной стиральной машины. Тест 1. 2 пары джинсов весом 1343 г соотношение вода:ткань 6:1 рН 5,5 температура 54 С фермент: С 1 (препарат 47.6.1) 12 г(0,9%) время абразивной стирки 90 мин слив воды промывка 5 мин 1%-ным неионогенным моющим средством при 66 С слив воды промывка холодной водой слив воды мягчение в течение 5 мин катионогенным мягчителем при 49 С отжим и сушка Тест 2. Применялась та же схема, что и приведенная выше в тесте 1, за исключением того, что использовался фермент Denimax 700 Т(2% МПО, 28,9 г) и стирка проводилась в условиях: рН 7,0, 54 С. С 1-целлюлазу сравнивали с Denimax 700 Т, поступающим в продажу нейтральным целлюлазным продуктом, производимым фирмойNovo. Все джинсы были окрашены красителем из одной партии. Их подвергали предварительной стирке в течение 15 мин с использованием окислительного способа, затем сушили. Джинсы, обработанные С 1-целлюлазным препаратом 47.6.1, имели слегка меньшее истирание и меньшее окрашивание изнанки, чем джинсы, обработанные целлюлазой Denimax 700 Т. Пример 10. Использование С 1-целлюлазы в качестве добавки к моющему средству для стирки. А. Удаление пятен с хлопчатобумажной ткани Моющую способность С 1-целлюлазного препарата 47.9.1 тестировали с использованием способа оценки моющей способности PW 9406 (Solvay). Эффективность удаления пятен(чернила) с хлопчатобумажной ткани оценивали с помощью устройства Delta Reflectance (%). В опытной стирке сравнивали С 1-целлюлазный препарат ( 47.9.1) с препаратом Celluzyme 0,7 Т, поставляемым фирмой Novo Nordisk, в присутствии щелочной протеазы Opticlean L500 и без нее. Результаты этого теста приведены в табл. 17. С 1-целлюлаза обладает такой же способностью выведения пятен с испачканной чернилами хлопчатобумажной ткани при нейтральных значениях рН в присутствии моющего средства, оказывающего влияние на цвет, что и целлюлазный фермент, продуцируемый Humicola insolens. Таблица 17. Опытная стирка с использованием моющего средства с добавлением С 1-целлюлазы Тестируемый ферДоза СМСазы Коэффициент мент (рН 7,0)Celluzyme 0,7 Т 500 2,68 4,07 Тестируемый ферДоза СМСазы Коэффициент мент (рН 7,0) Б. Стабильность С 1-целлюлазы в присутствии сериновых протеаз. В качестве сериновых протеаз использовали трипсин (3,2 мкМ, из панкреатической железы быка, с активностью, соответствующей 10000-13000 ед. этилового эфира N-бензил-Lаргинина (ВАЕЕ)/мг, Sigma T-8253) и химотрипсин (8 мкМ, из панкреатической железы быка, 40-60 ед/мг, Sigma C-4129). Протеазы инкубировали с С 1-целлюлазой при 20 С и рН 7,0. Химотрипсин не приводил к снижению активности С 1-целлюлазы в течение 12 ч, а трипсин приводил к небольшому снижению (приблизительно на 20%) активности С 1 целлюлазы, см. табл. 18. Трипсин и химотрипсин не вызывали существенного изменения стабильности СМСазной активности С 1 при значениях рН 4,5 и 7,0 при температуре 50 и 57 С, см. табл. 18. Таблица 18. Влияние протеаз на СМСазную активность С 1-целлюлазы ( 47.9.1) Время СохранившаяТемперН инку- ся СМСазная Протеаза ратура бации активность (%) В. Влияние цитратного буфера, ЭДТК,Твин-80 и персульфата на СМСазную активность. Замена ацетатного буфера на цитратный(хелатирующий агент) не оказывает влияния на СМСазную активность С 1 (молярность буферов- 0,1 М, рН 4,5, температура 50 и 57 С), см. табл. 19. ЭДТК (этилендиамитетрауксусная кислота) (5 мМ), используемая в качестве хелатирующего агента, при рН 4,5 и температуре 50 С не приводила к изменению СМСазной активности. При рН 4,5 (57 С) и при рН 7,0 (50 С) ЭДТК приводила к небольшому снижению СМСазной активности. При рН 7,0 и 57 С ЭДТК вызывала небольшое повышение СМСазной активности,см. табл. 19. 40 Неионогенное поверхностно-активное вещество Твин-80 (3 г/л, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана) не приводило к изменению СМСазной активности С 1 (при значениях рН 4,5 и 7,0 и при температурах 50 и 57 С), см. табл. 19. Окислитель персульфат (3 г/л) не приводил к изменению СМСазной активности С 1 (при значениях рН 4,5 и 7,0 и при температурах 50 и 57 С), см. табл. 19. СМСазная активность С 1 обладает устойчивостью к действию сериновых протеаз (трипсина и химотрипсина), хелатирующих агентов(ЭДТК, цитратного буфера), неионогенного поверхностно-активного вещества (Твин-80) и окислителя (персульфата). Таблица 19. Влияние цитратного буфера, ЭДТК, Твин-80 и персульфата на активность С 1-целлюлазы ( 47.9.1),время инкубации - 3 ч СохранившаяКонцен- ТемпераЭффектор рН ся СМСазная трация тура (С) активность (%) Нет (контроль) 50 4,5 100 Цитрат 0,1 М 50 4,5 100 ЭДТК 5 мМ 50 4,5 100 Твин-80 3 г/л 50 4,5 100 Персульфат 3 г/л 50 4,5 97 Нет (контроль) 57 4,5 62 Цитрат 0,1 М 57 4,5 65 ЭДТК 5 мМ 57 4,5 60 Твин-80 3 г/л 57 4,5 68 Персульфат 3 г/л 57 4,5 65 Нет (контроль 50 7,0 78 ЭДТК 5 мМ 50 7,0 50 Твин-80 3 г/л 50 7,0 52 Персульфат 3 г/л 50 7,0 50 Нет (контроль) 57 7,0 30 ЭДТК 5 мМ 57 7,0 38 Твин-80 3 г/л 57 7,0 25 Персульфат 3 г/л 57 7,0 30 Пример 11. Опытные абразивные стирки с использованием образцов целлюлаз, продуцируемых различными штаммами Chrysosporium. Препараты 47.1000, 47.1001, 47.2000 и 47.2001, продуцируемые различными штаммами Chrysosporium, применяли для опытной стирки с использованием специальной стиральной машины с загрузкой 2 л при значении рН 6,5, температуре 50 С в течение 60 мин с использованием 135 г расшлихтованной джинсовой ткани деним. Общий уровень СМСазной активности в опыте оставался постоянным и составлял 336 ед./опыт. После сушки оценивали истирание и окрашивание изнанки предмета одежды с использованием системы Datacolor. Результаты представлены в таблице 20. Результаты показывают, что целлюлазы, продуцируемые различными штаммами Chrysosporium, обладают при нейтральных значениях рН моющими способностями в отношении уровней истирания и окрашивания изнанки, сходными с таковыми, характерными для целлюлаз, продуцируемых С 1-штаммами вида Chrysosporium 41 Таблица 20. Активность целлюлазных препаратов, продуцируемых различными штаммами Chrysosporium при абразивной стирке ПрепаратИстираниеОкрашивание изнанки 47.1000 12,3 1,6 47.1001 12,1 1,6 47.2000 14,2 1,7 47.2001 14,6 1,6- коэффициент отражения с лицевой стороны, чем выше значение, тем больше истирание, отсутствие истирания соответствует значению 9,1;- коэффициент отражения с изнанки, чем выше значение, тем больше окрашивание изнанки. Пример 12. Очистка целлюлазных компонентов. 1. Отбор образцов С 1 для очистки. Для дальнейшей очистки был выбран С 1 целлюлазный препарат 47.11.1 с учетом того,что 47.11.1 обладает (1) высоким содержанием протеина; (2) высокой АФБ и СМСазной активностью (см. таблицу 4). 2. Выделение и очистка компонентов комплекса С 1. Первая стадия очистки включала ионообменную хроматографию на колонке типаAcrylex P-2. Затем обессоленный образец вносили в колонку типа DEAE-Toyopearl (1,5x30 см) в 0,03 М фосфатном буфере, рН 4,7, и адсорбированные протеины элюировали в 0-0,2 М градиенте NaCl при скорости потока 1 мл/мин. Получали три объединенные фракции - несвязывающуюся (НС) фракцию элюировали в исходном буфере, фракции I и II элюировали в 00,2 М градиенте NaCl. Все фракции обладали целлюлолитическими активностями. 3. ДСН-ПААГ протеиновые фракции. После проведения электрофореза в полиакриламдном геле с додецилсульфатом натрия (ДСНПААГ) НС-фракция содержала протеины с молекулярными массами от 30 до 70 кДа. ФракцияI содержала протеины с молекулярными массами от 25 до 100 кДа и фракция II содержала протеины с молекулярными массами от 35 до 100 кДа. ДСН-ПААГ проводили с использованием 10%-го разделяющего геля (100x80x0,75 мм) в денатурирующих условиях. Реагенты и наборы для электрофореза получали от фирмыBio-Rad (US). Для окрашивания протеина применяли кумасин бриллиантово-синий R-250 в 25%-ной трихлоруксусной кислоте. 4. ИЭФ фракции протеина. После проведения изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) НС-фракция содержала протеины с изоэлектрическими точками (рI) от 4,6 до 8,0. Фракция I содержала протеины со значениями рI от 3,2 до 5,5, а фракция II содержала протеины со значениями рI от 3,0 до 5,5. Изоэлектрическое фокусирование проводили с использованием 7%-го ПААГ с помощью устройства типа мини-ИЭФ 42 модель 111 (фирма Bio-Rad). Реагенты и наборы для изоэлектрического фокусирования получали от фирмы Bio-Rad (US). Для окрашивания протеина применяли кумасин бриллиантово-синийR-250 в 25%-ной трихлоруксусной кислоте. 5. Зависимости СМСазной активности протеиновых фракций от значения рН. В таблице 21 представлены зависимости СМСазной иRBB-СМСазной активностей фракций НС, I и II С 1-целлюлазы от значения рН. Использовали следующую буферные системы: ацетатный буфер (рН 4-5), фосфатный буфер (рН 6-8) и карбонатный буфер (рН 8,5-10). Кроме того, использовали универсальную буферную систему,включающую ацетат, борат и фосфат (рН 4-10). Таблица 21. Влияние значения рН на СМСазную и RBBСМСазную активности протеиновых фракций С 1-целлюлазы СМСазная активность (%), 50 С рН Фракция НС Фракция I Фракция II 4,0 85 70 95 4,5 95 85 100 5,0 100 90 95 5,5 90 100 90 6,0 80 90 80 6,5 70 85 80 7,0 65 85 80 7,5 60 65 75 8,0 50 60 60 8,5 45 50 50 9,0 30 45 40 9,5 10 40 32 рН 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5RBB- СМСазная активность, (%), 50 С Фракция НС Фракция I Фракция II 65 95 100 100 100 95 95 100 90 95 95 90 80 87 90 80 85 87 60 65 85 50 60 70 45 60 60 30 50 40 10 40 32 СМСазная и RBB-СМСазная активности фракций НС, I и II после ионообменной хроматографии с помощью DEAE-Toyopearl характеризовались несимметричным колоколообразным профилем зависимости от рН. Зависимость СМСазной активности фракции НС имела максимум при рН 4,5-5,5 и достигала 50% от максимальной активности при рН 8,0. ЗависимостьRBB-СМСазной активности фракции НС имела максимум при рН 5,0-6,0 и достигала 50% от максимальной активности при рН 8,0. Зависимость СМСазной активности фракции I имела максимум при рН 5,0-6,0 и достигала 50% от максимальной активности при рН 8,5. Зависимость RBB-СМСазной активности фракции НС имела максимум при рН 4,5-7,0 и достигала 50% от максимальной активности при рН 8,5. Зависимость СМСазной активности фракции II имела максимум при рН 4,5-5,5 и достигала 50% от максимальной активности при рН 8,5. Зависи 43 мость RBB-СМСазной активности фракции II имела максимум при рН 4,5-7,5 и достигала 50% от максимальной активности приблизительно при рН 8,5. 6. Стабильность СМСазной активности протеина фракции I (после хроматографии с помощью DEAE-Toyopearl). В таблице 22 приведены зависимости от времени СМСазной активности фракции I после ионообменной хроматографии с помощью DEAE-Toyopearl при различных значениях рН (5,2-8,7) и температуре 50 С. СМСазная активность фракции I наиболее стабильна при рН 5,2-7,2 (через 3 ч было потеряно приблизительно 30-45% активности). При рН 7,7 приблизительно через 1 ч было потеряно 60% активности, а при рН 8,3 и 8,7 приблизительно через 0,5 ч было потеряно 50% активности. При рН 8,3 100% СМСазной активности было потеряно через 3 ч, а при рН 8,7 100% активности было потеряно через 2 ч. Таблица 22. Стабильность СМСазной активности протеиновой фракции I после хроматографии с помощьюDEAE-Toyopearl при 50 С Сохранившаяся СМСазная активность (%) Время (ч) рН 5,2 рН 7,2 рН 7,7 рН 8,3 рН 8,7 0 100 100 100 100 100 0,5 97 75 65 50 50 1 90 55 40 25 15 2 40 50 35 10 0 3 30 45 25 0 0 7. Свойства фракций после ионообменной хроматографии с помощью DEAE-Toyopearl. Эксперименты по адсорбции с использованием авицела (микрокристаллическая целлюлоза) в качестве субстрата показали, что фракции I и II не связываются с кристаллическим субстратом,а фракция НС связывается с авицелом с коэффициентом распределения 0,2 л/г. Удельные активности фракций НС, I и II по отношению к различным субстратам приведены в табл. 23. Все три фракции обладают СМСазной, эндоглюканазной, авицелазной, -глюканазной и ксиланазной активностями, но фракция НС в отличие от фракций I и II не обладаетглюкозидазной активностью. Опытная микростирка ткани деним с использованием фракций НС, I и II показала, что фракции I и II обладали приблизительно одинаковой активностью в отношении ткани деним при рН 7, в то время как фракция НС проявила более низкую активность(по результатам опытной микростирки для ткани деним). Таблица 23. Удельные активности фракций после ионообменной хроматографии с помощью DEAE-Toyopearl Удельные активности, ед./мг протеина Опытная-ГлюЭндог-Глю- КсиАвимикроФра СМ- люкакозицелаканаза лана- стирка для кции Саза наза даза за за ткани деним НС 9,9 6,2 0,18 0,0 11,0 5,3 44 8. Опытная микростирка для ткани деним. Этот тест проводили с использованием 20 мл забуференного ферментного раствора, имеющего заданный уровень СМСазной активности. Маленькие кусочки настоящей ткани деним,окрашенной индиго, обрабатывали при 50 С в течение 60 мин в условиях интенсивной механической нагрузки (истирание). Уровень целлюлазной активности оценивали по балльной системе по уменьшению яркости цвета после высушивания образцов. Также можно использовать приборы для количественного измерения цвета, а также математическое обеспечение. Большее количество "+" оценок означает лучшие характеристики в отношении истирания. 9. Дополнительная очистка протеинов из фракции I после ионообменной хроматографии с помощью DEAE-Toyopearl. Обессоленную фракцию I (25 мл, 0,8 г/л протеина) подвергали ионообменной хроматографии с помощью колонки типа Macro Prep Q. Колонку Macro Prep Q(1,5x10 см) уравновешивали 0,03 М ацетатным буфером, рН 4,7, и адсорбированные протеины элюировали в 0-0,1 М градиенте концентрацииNaCl. Собирали три фракции I.1, I.2 и I.3. Фракция I.2 проявила наибольшую активность при микростирке ткани деним при рН 7,0, а фракцияI.3 - наименьшую. По результатам ДСН-ПААГ установили, что фракции I.1 и I.2 различались присутствием во фракции I.2 протеина с низкой молекулярной массой (25 кДа), который мог вносить вклад в активность при абразивной стирке. Фракция I.1 по данным ИЭФ имела значение pI, равное 4,2. Фракции I.1 и I.3 имели слишком малое содержание протеина, для того,чтобы проводить дальнейшее исследование. Поэтому для дальнейшей очистки использовали фракцию I.2. На следующей стадии очистки использовали хроматофокусирование на колонке типаMono Р. Фракцию I.2 уравновешивали 0,03 М имидазольным буфером, рН 6,8, и вносили в колонку. Адсорбированные протеины элюировали с помощью Polybuffer 74 (1:8), рН 4,0, после чего было обнаружено 2 основных пика в профилях уровней протеина и активности. Первый пик, обозначенный пиком А, проявил более низкую СМСазную активность (2,5 ед./мг) по сравнению с пиком Б (3,6 ед./мг). Электрофорез в нативном полиакриламидном геле показал наличие 2 протеиновых полос в пике А, при этом полоса, соответствующая протеину с более высокой молекулярной массой, обладала активностью по отношению к CMC, окрашенной красителем Congo Red. Одна полоса активного протеина в нативных условиях наблюдалась в пике Б. Данные ДСН-ПААГ показали, что пик А включал два основных протеина (60 кДа и 70 кДа), а пик Б включал один основной протеин(25 кДа) и один минорный протеин (27 кДа). Фракцию, обнаруженную в пике Б, обозначили 25 кДа-эндоС 1 и использовали для дальнейших 45 исследований. В табл. 24 приведены удельные активности 25 кДа-эндоС 1 по отношению к различным субстратам. Протеин 25 кДа-эндоС 1 обладал СМСазной, RBB-СМСазной, эндоглюканазной активностью, АФБ, авицелазной, глюканазной и ксиланазной активностями, но не проявил -глюкозидазной активности. Комбинация этих различных активностей показывает,что 25 кДа-эндоС 1 представляет собой эндоглюканазу. Оптимальное значение рН для СМСазной и RBB-СМСазной активностей составляет приблизительно 6,0 (табл. 24). 25 кДаэндоС 1 обладает высокой активностью при абразивной стирке (по данным опытной микростирки для ткани деним с использованием небольших кусочков хлопчатобумажной ткани)(см. табл. 24). При элюировании пика А из колонки типаMono P были выделены несколько фракций,различающихся соотношением протеинов с молекулярными массами 60 и 70 кДа, в частности,фракция, обозначенная 70(60) кДа-С 1, содержащая в основном протеин с молекулярной массой 60 кДа, и фракция, обозначенная 70 кДаэндоС 1, содержащая в основном протеин с молекулярной массой 70 кДа. Удельные активности этих фракций по отношению к различным субстратам приведены в табл. 24. Как видно,фракция 70(60) кДа-С 1 обладает низкой удельной эндоглюканазной (0,5 ед./мг) и высокой удельной авицелазной (0,31 ед./мг) активностями по сравнению с фракцией 70 кДа-эндоС 1 (2,8 ед./мг эндоглюканазной и 0,18 ед./мг авицелазной активности) и очень низкой -глюкозидазной активностью. Удельные активности фракции 70(60) кДа-С 1 при использовании в качестве субстата фильтровальной бумаги (FP),-глюкана и ксилана оказались очень низкими(см. табл. 24) и в качестве продукта гидролиза авицела образовывалась только целлобиоза. Активность фракции 70(60) кДа-С 1 при абразивной стирке (по данным опытной микростирки для ткани деним с использованием небольших кусочков хлопчатобумажной ткани) была низкой (см. табл. 24). Эти данные показывают, что протеин с молекулярной массой 60 кДа из фракции I после ионообменной хроматографии с помощью DEAE-Toyopearl может быть клас рН 5,0 6,0 7,0 5,0 6,0 7,0 5,0 5,0 46 сифицирован как целлобиогидралаза. Оптимальное значение рН для 70(60) кДа-С 1 (по отношению к CMC и RBB-CMC) составляло приблизительно 5,0 (см. табл. 24). Протеин 70 кДа-эндоС 1 обладал высокой удельной СМСазной, RBB-СМСазной, эндоглюканазной активностями, АФБ, -глюканазной и ксиланазной активностями и обладал определенной авицелазной и -глюкозидазной активностью (табл. 24). Протеин 70 кДа-эндоС 1 также обладал относительно высокой активностью при абразивной стирке (по данным опытной микростирки для ткани деним с использованием небольших кусочков хлопчатобумажной ткани)(см. табл. 24). Протеин 70 кДа-эндоС 1, выделенный из фракции I с помощью ионообменной хроматографии с использованием DEAEToyopearl, по-видимому, представляет собой эндоглюканазу. Как видно из табл. 24, оптимальное в отношении СМСазной и RBBСМСазной активностей значение рН для 70 кДаэндоС 1 составляло приблизительно 6,0. 10. Дополнительная очистка протеинов из фракции II после ионообменной хроматографии с помощью DEAE-Toyopearl. Фракцию II, полученную с помощью DEAE-хроматографии, разделяли на 3 фракции (фракции II.1, II.2 и II.3 соответственно) с использованием продолжительного элюирования в 0-0,2 М градиенте NaCl(в течение промежутка времени 8 ч) на колонке типа DEAE-Toyopearl. Результаты ДСН-ПААГ показали, что фракция II.1 включала 2 основных протеина с молекулярными массами 60 и 100 кДа, фракция II.2 включала 3 основных протеина с молекулярными массами 35, 60 и 100 кДа, и фракция II.3 включала 2 основных протеина с молекулярными массами 43 и 60 кДа. ФракцияII.3 обладала наибольшей СМСазной активностью (10 ед./мг протеина), но имела низкую моющую способность (по данным опытной субмикростирки для ткани деним) и удельную СМСазную активность, равную 1 ед./мг. Фракция II.2 не обладала никакой моющей способностью (но СМСазная активность была равна 0,7 ед./мг). Поэтому фракции II.1 и II.3 подвергали дальнейшей очистке.-Глюканазная активность (ед./мг) 0,07 2,4 1,3 0 Ксиланазная активность (ед./мг) 0,16 0,50 0,06 0,01 Активность в отношении микростирки ткани деним н.о. н.о. Активность в отношении субмикростирки ткани деним н.о. н.о. 11. Опытная субмикростирка для ткани деним. Этот тест проводили с использованием кусочков настоящей ткани деним, окрашенной индиго, в 2 мл забуференного ферментного раствора (2 единицы СМСазной активности) при 50 С в течение 2 ч в условиях интенсивной механической нагрузки. Уровень целлюлазной активности оценивали по балльной системе по уменьшению яркости цвета после высушивания образцов. 12. Очистка фракции II.1. Фракцию II.1 вносили в колонку типа Macro prep Q, уравновешенную 0,03 М ацетатным буфером, рН 4,75,и адсорбированные протеины элюировали в градиенте NaCl (0-0,3 М). Получали два протеиновых пика, но только один обладал СМСазной активностью. ДСН-ПААГ вещества из первого пика показал, что протеины с молекулярной массой 60 и 100 кДа выделялись в гомогенном состоянии. По данным ИЭФ-анализа протеины с молекулярной массой 60 и 100 кДа имели кислое значение pI, составляющее приблизительно 3. Активности протеинов с молекулярной массой 60 и 100 кДа в отношении различных субстратов приведены в табл. 24. Было обнаружено,что протеин с молекулярной массой 60 кДа, обозначенный как 60 кДа(II.1)-эндоС 1, обладал эндоглюканазной, СМСазной, RBB-СМСазной активностями, АФБ, -глюканазной активностями при рН 5 (0,2, 0,7, 0,9, 0,3 и 1,3 ед./мг протеина соответственно, как показано в табл. 24). Авицелазная, -глюкозидазная и ксиланазная активности были довольно низкими. Такая комбинация активностей свидетельствует о том,что протеин 60 кДа(II.1)-эндоС 1 представляет собой эндоглюканазу. Протеин 60 кДа(II.1)эндоС 1 также обладает высокой моющей способностью (по данным опытной субмикростирки для ткани деним) как при рН 5, так и при рН 7 (см. табл. 24). Зависимости от рН СМСазной иRBB-СМСазной активностей этого протеина имели максимум при рН 4,0-4,5, при этом при рН 6 сохранялись 50% СМСазной активности и 85% RBB-СМСазной активности от соответствующих максимальных значений, а при значениях рН 9 и 10 сохранялись 15-20% обеих активностей (см. табл. 25). Протеин с молекулярной массой 100 кДА из фракции ИЛ был обо 0,01 значен как 100 кДа (ИЛ)-протеин и он почти не обладал целлюлазной активностью (табл. 24). Этот протеин обладал лишь очень низкой СМСазной (0,03 ед./мг) и ксиланазной (0,008 ед./мг) активностями и не мог быть классифицирован как целлюлолитический фермент. По результатам опытной субмикростирки для ткани деним 100 кДа (II.1)-протеин не обладал какойлибо активностью при абразивной стирке (табл. 24) и также не проявлял какой-либо протеазной активности ни при рН 5, ни при рН 7. 13. Очистка фракции II.3. Фракцию II.3 также очищали с помощью хроматографии на колонке типа Macro prep Q. Адсорбированные протеины элюировали в градиенте 0,2-0,6 М градиенте NaCl (исходный буфер представлял собой 0,03 М ацетатный буфер, рН 4,75). ДСНПААГ фракций, полученных после хроматографии на колонке типа Macro Prep Q, показал, что протеины с молекулярными массами 43 и 60 кДа получены в гомогенной форме. Изоэлектрическое фокусирование этих фракций показало, что оба протеина с молекулярными массами 43 и 60 кДа имели значения pI, равные приблизительно 3. Протеины с молекулярными массами 43 и 60 кДа были обозначены как 43 кДа(II.3)-эндоС 1 и 60 кДа(II.3)-эндоС 1 соответственно. Результаты исследования активностей этих ферментов по отношению к различным субстратам (см. табл. 24) показали, что они обладали сходными удельными СМСазной активностью, АФБ, авицелазной и ксиланазной активностями. Протеин 60 кДа(II.3)-эндоС 1 обладал более высокой RBB-СМСазной, эндоглюканазной активностями и АФБ (табл. 24). В то же время необходимо подчеркнуть, что протеины 43 кДа(II.3)-эндоС 1 и 60 кДа(II.3)-эндоС 1 обладали очень небольшими активностями при абразивной стирке при рН 5 (по данным опытной субмикростирки для ткани деним). Однако оба протеина 43 кДа(II.3)-эндоС 1 и 60 кДа(II.3)эндоС 1 проявили значительную активность при абразивной стирке при рН 7, при этом протеин 43 кДа(II.3)-эндоС 1 обладал более высокой активностью при абразивной стирке по сравнению с протеином 60 кДа(II.3)-эндоС 1. Как видно из зависимостей от значения рН, приведенных в таблице 25, протеин 43 кДа(II.3)-эндоС 1 обла 49 дал широким диапазоном оптимальных значений рН (от рН 4,5 до 8) как в отношении СМСазной, так и RBB-СМСазной активностей. При рН 9 протеин 43 кДа(II.3)-эндоС 1 обладал 50% СМСазной активности и 70% RBBСМСазной активности от соответствующих максимальных значений, а при рН 10-20% как СМСазной активности, так и RBB-СМСазной активности от соответствующих максимальных значений. В противоположность этому протеин 60 кДа(II.3)-эндоС 1 обладал узким диапазоном оптимальных значений рН (рН 4-4,5) в отношении СМСазной активности, и широким диапазоном (от рН 4 до 8) в отношении RBBСМСазной активности, при рН 9 сохранялось 30% RBB-СМСазной активности от ее максимального значения. Следует отметить, что во всех случаях молекулярные массы очищенных протеинов, представленных в данном описании, определяли на основе гель-электрофореза (в частности, СДНПААГ) с использованием в качестве стандартов контрольных протеинов с известными молекулярными массами. Как и во всех анализах, основанных на таких методах, результаты являются лишь приблизительными и могут наблюдаться некоторые вариации величины молекулярной массы при использовании различных гелей различными специалистами, применяющими в качестве контролей различные стандарты молекулярной массы. Такие очищенные и частично очищенные ферментные препараты весьма пригодны в качестве компонентов композиций моющих средств, композиций, предназначенных для мягчения ткани, депилляции, увеличения яркости окраски и абразивной стирки. Поэтому описанные выше выделенные и очищенные ферментные препараты в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться для таких применений. Таким образом, в изложенных в настоящем описании способах абразивной стирки, мягчения ткани, депилляции, увеличения яркости окраски и очистки, а также в стандартных способах их осуществления, уже описанных в литературе, для успешного осуществления этих способов могут быть применены такие очищенные или частично очищенные ферментные препараты и содержащие их композиции в качестве основных ингредиентов или добавок. Из литературы известно использование для таких целей других и различным образом очищенных или частично очищенных ферментных препаратов на основе многих поступающих в продажу ферментов. 50 Таблица 25. Влияние значения рН на СМСазную и RBBСМСазную активности С 1-целлюлазных ферментов СМСазная активность (%), 50 С рН 60 кДа (II.1)43 кДа (II.3)60 кДа (II.3)эндо эндо эндо 3,5 85 80 85 4,0 100 100 100 5,0 65 100 85 6,0 50 100 70 7,0 45 90 65 8,0 25 70 45 9,0 17 30 30 10,0 15 20 10 11,0 15 5 5 Следует иметь в виду, что нейтральные и/или щелочные целлюлазы, приведенные в данном описании, могут обладать различными ферментативными активностями в зависимости от химического строения субстрата, применяемого для измерения активности, и конкретного метода анализа для измерения активности. Поэтому очищенные или частично очищенные нейтральные и/или щелочные целлюлазы могут иметь различные профили рН/активность в зависимости от применяемых метода анализа и субстратов. Для устранения недоразумений в отношении природы активностей и свойств практически очищенных целлюлазных ферментов, полученных согласно способам этого примера, ниже представлено описание измеренных активностей и свойств целлюлаз очищенных фракций. Очищенные или частично очищенные целлюлазы, полученные согласно настоящему описанию, обладают как эндоглюканазной, так и/или целлобиогидралазной активностью при использовании соответствующего субстрата. Так, например, все целлюлазные препараты,проявляющие эндоглюканазные активности,характеризуются значениями рI приблизительно от 3 до приблизительно 4,5. Более конкретно эти фракции включают целлюлазы (эндоглюканазы), имеющие следующие молекулярные массы и значения pI: MM приблизительно 25 кДа (рI приблизительно 4,0), ММ приблизительно 70 кДа (рI приблизительно 4,2), ММ приблизительно 60 кДа (рI приблизительно 3,0) и ММ приблизительно 43 кДа (рI приблизительно 3,1). Эти целлюлазные фракции также содержали протеины, обладающие целлобиогидралазной активностью. Более конкретно последние имели ММ приблизительно 60 кДа и рI приблизительно 4,2. 51 Способы применения композиций и очищенных ферментов по настоящему изобретению подробно описаны в литературе, в том числе во многих патентах, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Они включают патент US 5290474 на имя Clarkson, в котором описано применение ферментов целлюлаз и композиций, содержащих фермент целлюлазу,включающих поверхностно-активные вещества и другие добавки, предназначенные для применения в водных моющих средах, композиции моющих средств, среды, созданные для усиления сохранения и/или восстановления цвета, а также для придания улучшенных свойств мягкости и качества ткани на ощупь, особенно тканей, содержащих хлопок. Ферменты целлюлазы и содержащие целлюлазу композиции по настоящему изобретению также предназначены для использования в тех же областях применения, конкретные описания которых приведены во многих, если не во всех, цитированных ссылках. Кроме того, использование ферментов целлюлаз и композиций для таких применений, как уменьшение жесткости или мягчение ткани,также описано в патенте US 4435307 на имяBarbesgaard и др., в котором конкретно раскрыто применение целлюлаз из грибов, но не относящихся к роду Chrysosporium, в щелочном диапазоне значений рН с использованием различных вспомогательных веществ, таких, как вещества, применяемые в сочетании с новой целлюлазой и композициями, включающими целлюлазу, по настоящему изобретению, для уменьшения жесткости, мягчения ткани или стирки в виде отдельной операции. В этом случае также применимы целлюлазы и композиции,включающие целлюлазу, по настоящему изобретению и сведения, касающиеся этого, содержащиеся в патенте на имя Barbesgaard и др.,специально включены в настоящее описание. Кроме того, использование ферментов целлюлаз и композиций, включающих целлюлазу, отличных от ферментов целлюлаз и композиций,включающих целлюлазу, по настоящему изобретению, для увеличения яркости окраски конкретно описано в европейском патенте ЕР 0220016 на имя Boegh, эти сведения специально включены в настоящее описание. Конечно, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что новые ферменты целлюлазы и композиции, включающие целлюлазу, по настоящему изобретению могут быть весьма пригодны в применениях согласно цитированным выше ссылкам, что позволяет избежать описания дополнительных подробностей таких способов применения. Кроме того,такие очищенные или частично очищенные ферменты или содержащие ферменты композиции также пригодны для таких применений, как удаление пятен и отбеливание таких материалов, как бумага или пульпа, и способ осуществления этого может быть легко предложен спе 003295 52 циалистом в данной области техники, особенно с учетом указаний, приведенных в данном описании. Пример 13. Получение С 1-целлюлазы в ферментере с загрузкой 60 л. 1. Получение инокулята. Препараты инокулята или исходные культуры для ферментации с использованием периодической загрузки получали следующим образом. Для инокулирования среды в каждой из двух колб использовали по одному миллилитру (1 мл) культуры спор, в результате чего получали в целом 2,0 л инокулята. Исходную культуру инкубировали при 150 об/мин и 30 С в течение 56 ч. Среда для получения инокулята К 2 НРО 4 0,5 г/л 0,15 г/лFeSO47H2O 1,0 г/л Дрожжевой экстракт (только КАТ) 10,0 г/л Пептон (Hormel PSR 5) 10,0 г/л Лактоза 10,0 г/л Глюкозазначение рН среды инокулята доводили до рН 7,0 с использованием NaCl, затем среду автоклавировали в течение 35 мин при 121 С в двух 6-литровых колбах с перегородками, каждая из которых содержала по одному литру среды. 2. Получение целлюлазы в ферментере объемом 60 л с периодической загрузкой (препарат 47.0325). Посевную культуру, полученную согласно указанному выше способу, во встряхиваемой колбе объемом 2 л использовали для инокуляции 40 л среды, находящейся в ферментере объемом 60 л. Среда для ферментации имела следующий состав: Среда для ферментации К 2 НРО 4 0,22 г/л КН 2 РO4 0,08 г/л 4,0 г/л(только КАТ) 0,05 г/л Обезжиренная мука из семян хлопчатника 5,0 г/л Целлюлоза (Sigmacell 50) 20,0 г/лpH 7,040 л среды представляли собой указанные вещества, растворенные в деионизированной воде и стерилизованные при 121 С в течение 45 мин. 53 После инокуляции среды для ферментации значение рН поддерживали выше 6,9 путем добавления NH3 и ниже 7,1 путем добавленияH2SO4. Смесь в ферментере инкубировали в течение 64 ч при перемешивании и аэрации, необходимой для поддержания уровня растворенного кислорода выше 30% от уровня насыщения. 3. Восстановление целлюлазной активности. Суспендированные твердые продукты из культуры после ферментации удаляли фильтрацией через большую воронку Бюхнера с использованием фильтровальной бумаги типа Whatman 54 и 10 г/л Celite 503 в качестве фильтра. Фильтрат собирали и целлюлазу концентрировали ультрафильтрацией с использованием пористого волоконного фильтра, пропускающего вещество с предельным значением молекулярной массы 10000. Концентрат сушили замораживанием. Высушенный концентрат обозначили как целлюлазный препарат 47.0325. Активность этого препарата приведена в табл. 4. Пример 14. Способ получения мутантного штамма С-1. Суспензию спор получали с использованием агаровых планшетов со средой Придхама (4 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л солодового экстракта, 10 г/л глюкозы, 15 г/л агара), содержащей спорулирующую культуру штамма С 1. Планшеты подпитывали 10 мл 0,05%-ного Твин 80. Суспензию переносили в стерильную пробирку с завинчивающейся крышкой и интенсивно перемешивали в течение 1 мин. Затем суспензию фильтровали через колонку для удаления мицелия. Подсчитывали споры и разбавляли до концентрации 7 х 105 спор в миллилитре воды. 10 мл суспензии спор переносили в стандартную стеклянную чашку Петри. Споры подвергали облучению в течение 75 с интенсивностью 720 мкВт/см 2 с использованием ультрафиолетовой лампы типа Pen-Ray. Суспензию спор осторожно перемешивали в процессе облучения с помощью стерильного зажима для бумаги в качестве магнитного стержня для перемешивания. После облучения суспензию спор переносили в обернутую фольгой пробирку,разбавляли водой и высевали при слабом освещении в NH4- минимальную среду как описано ниже. После инкубации в течение 20 дней при 30 С выявляли колонию, имеющую большую зону элиминации целлюлозы вокруг нее.(добавленной в виде 1,25%-ного маточного раствора после автоклавирования); 0,5 г/л дезоксихолата натрия (добавленного после автоклавирования). Пример 15. Получение мутантной С 1 целлюлазы в колбах объемом 60 л для ферментации с периодической загрузкой (препарат 47.0528). 1. Получение инокулята. Препараты исходных культур для периодического способа ферментации с подпиткой готовили как описано в примере 13 (раздел 1). 2. Получение целлюлазы в ферментере объемом 60 л с периодической загрузкой. Для инокулирования 40 л описанной ниже среды для ферментации использовали два литра инокулята. Среда для ферментации К 2 РO4 0,44 г/л 0,16 г/л КН 2 РO4 3,0 г/лCoSO46H2O 0,048 мг/л Лактоза 5,0 г/л Дрожжевой экстракт (только КАТ) 0,1 г/л Обезжиренная мука из семян хлопчатника (Pharmamedia) 10,0 г/л Целлюлоза (Sigmacell 50) 20,0 г/л 40 л среды представляли собой указанные вещества, растворенные в деионизированной воде и стерилизованные при 121 С в течение 45 мин посредством автоклавирования. 3. Условия ферментации. Значение рН поддерживали на уровне приблизительно 7,0 и контролировали путем добавления NH3 при рН свыше 6,9 и путем добавления H2SO4 при рН ниже 7,1. Время инкубации составляло 87 ч, интенсивность перемешивания и аэрация находились на уровне, необходимом для того, чтобы концентрация растворенного кислорода превышала 30% от насыщающей. В течение 40 ч добавляли 3,0 л описанного выше подпитывающего раствора со скоростью 5,0 л каждые 5 мин. Подпитывающий раствор для ферментера 0,88 г/л К 2 РO4 0,32 г/л КН 2 РO4Pharmamedia 20,0 г/л Целлюлоза (Sigmacell 50) 20,0 г/л 4. Восстановление целлюлазной активности. Суспендированные твердые частицы удаляли фильтрацией с помощью большой воронки Бюхнера с использованием в качестве фильтра фильтровальной бумаги типа Whatman 54 и 10 г/л Celite 503. Фильтрат собирали и целлюлазу концентрировали с помощью ультрафильтрации, используя пористоволоконный фильтр,пропускающий вещество с предельным значением молекулярной массы 10000. Концентрат сушили замораживанием. Концентрат обозначили как целлюлазный препарат 47.0528 (активность приведена в табл. 4). Пример 16. Анализ целлюлазной активности с использованием целлазима. Этот анализ осуществляли с использованием целлазима С в виде таблеток и набора для анализа, поставляемых фирмой Megazime (Австралия) Pty. Ltd., Сидней, NSW 2101, Австралия. В качестве субстрата использовали НЕцеллюлозу, сшитую азурином (AZCL-целлюлоза), поступающую в продажу в виде таблеток целлазима С, готовых к употреблению. Вкратце,аликвоты по 0,5 мл препарата фермента (при необходимости разбавленного) в 0,025 М ацетатном буфере (рН 4,5) выдерживали при 40 С в течение 5 мин в стеклянных опытных пробирках(16x122 мм). После этого инициировали исследуемую реакцию путем добавления таблетки целлазима С (без перемешивания). После выдерживания точно в течение 10 мин при 40 С реакцию прекращали путем добавления раствора Trizma Base (10,0 мл, 2 мас./об.%, фирмаSigma Chemical Co., St Lois, МО) и затем раствор перемешивали. Пробиркам давали выстояться в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре, после чего суспензию снова перемешивали, фильтровали через круговой фильтр типа Whatman1 и измеряли абсорбцию фильтрата при 590 нм. Измерения абсорбционной способности осуществляли по отношению к контролю, содержащему как субстрат, так и фермент, но полученному при добавленииTrizma Base к ферментному раствору перед добавлением таблетки целлазима С. Эту суспензию выдерживали при комнатной температуре, а не при 40 С. Для каждой серии измерений применяли один контроль и его использовали в качестве нулевой отметки для спектрофотометрии. В этом анализе одна единица ферментативной активности определяется как количество фермента, необходимое для выделения одного микромоля глюкозных эквивалентов восстанавливающего сахара в определенных условиях анализа. После этого эндонуклеазную активность определяли путем сопоставления со стан 003295 56 дартной кривой (образец кривой прилагался к набору, но он не мог быть легко воспроизведен в лабораторных условиях, если для конкретной серии экспериментов использовались различные конкретные ферменты, разбавления ферментов и условия эксперимента). Используя этот анализ для оценки нейтральной/щелочной ферментативной активности композиций по настоящему изобретению, авторы установили, что эндоцеллюлазная активность (если принимать активность при рН 7 за 100%) составляет 92,4% (при рН 6), 75,6 (при рН 5,0) и 69,7 (при рН 4,0). Пример 17. Опытная стирка с применением моющих средств для определения характеристик депилляции и придания яркости окраски(антиобесцвечиваюшее действие). Тесты проводили согласно ААТСССмонографии "Standartization of Home LaundryTechnical Manual, 1997 (пересмотренное и исправленное издание 1995 г), с использованием обычной бытовой стиральной машины типаKenmore с верхней загрузкой и с использованием бытовой циркуляционной сушилки типаKenmore. В качестве предметов одежды использовали три различных типа носков, которые имеют размер, характерный для взрослого человека, красного цвета (88% хлопка, 10% синтетического винилового волокна, 2% лайкры) (гладкий репсовый трикотаж, сильно переплетенный трикотаж и вафельное переплетение). Носки разделяли на три группы с одинаковым количеством носков каждого типа в каждой группе,при этом в качестве контроля использовали нестираный предмет одежды каждого типа. Приблизительная масса каждой группы была равна 1 кг. Перед каждой стиркой готовили следующие образцы моющего средства: а) моющее средство типа Cheer Triple Guard (поступающий в продажу в США и обычно имеющий щелочные значения рН) как таковой (для демонстрации способности целлюлаз, изначально присутствующих в препарате Cheer, в отношении депилляции и сохранения цвета), б) образец препарата Cheer, подвергнутый тепловой обработке для инактивации всех ферментов, присутствующих в моющем средстве (для того, чтобы ограничить действие Cheer компонентами, отличными от ферментов). Для тепловой инактивации 40 г образца препарата Cheer суспендировали в 200 мл воды и сильно нагревали (1000 Вт) в бытовой микроволновой печи в течение 5 мин, при этом конечная температура достигала 95 С. После этого повторяли описанные выше стадии (а) и (б), но при этом к препарату добавляли 5 г С 1-целлюлазы. Для каждой группы циклы стирка/сушка повторяли по 25 раз. Для каждой группы стирку проводили 25 раз с использованием соотношения: 1 кг предметов одежды на 20 л водного раствора (уровень воды в стиральной машине был небольшим) и 40 г только одного из вышеуказанных моющих препаратов. Температура устанавливалась на положение hot-hot, продолжительность стирки составляла 30 мин, после чего осуществлялся обычный высокоскоростной отжим. Температура сушки устанавливалась в положение high и цикл сушки продолжался 45 мин. Тестирование завершалось после 25 стирок, после чего предметы одежды оценивались в отношении депилляции и усиления яркости окраски несколькими различными группами/комиссиями специалистов в данной области. Результаты исследования состоят в следующем: Инактивация исходных ферментов CheerAARL нет нет да (5 г С 1) Результаты оценки каждой группы предметов одежды, подвергнутых стирке, следующие (все три типа носков оценивались одинаковым образом). Следует понимать, что примеры и варианты осуществления, приведенные в настоящем описании, даны только с целью иллюстрации и что специалисты в данной области легко могут предложить их различные модификации и изменения в рамках этого описания, которые подпадают под объем и сферу действия настоящего описания и объем прилагаемых пунктов формулы изобретения.(полный) Депилляция Усиление яркости окраскиlucknowense Garg 27K, имеющий регистрационный номер VKM F-3500D, продуцирующий целлюлазу. 2. Композиция, обладающая нейтральной и/или щелочной целлюлазной активностью, полученная способом, включающим выращивание гриба дикого типа или мутантного гриба видаChrysosporium lucknowense, при том что указанная целлюлаза имеет пик активности при значениях рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 11,0 и, по меньшей мере, 17 единиц СМСазной активности на грамм сухого веса. 3. Композиция по п.2, отличающаяся тем,что гриб представляет собой штамм Chrysosporium lucknowense Garg 27K с регистрационным номером VKM F-3500D. 4. Композиция по п.2, отличающаяся тем,что гриб представляет собой мутантный штамм 58 5. Композиция, обладающая нейтральной и/или щелочной целлюлазной активностью,имеющая пик целлюлазной активности при значениях рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 11,0 и, по меньшей мере, 17 единиц СМСазной активности на грамм сухого веса,полученная способом, включающим выращивание мутантного гриба вида Chrysosporiumlucknowense в культуре в пригодной среде. 6. Композиция по любому из пп.2-5, обладающая оптимальной целлюлазной активностью при температуре приблизительно от 40 С до приблизительно 60 С и значении рН приблизительно от 5,0 до приблизительно 12,0. 7. Композиция по любому из пп.2-5, обладающая, по крайней мере, 50% от оптимальной целлюлазной активности при значении рН приблизительно от 6,0 до приблизительно 7,0 и температуре приблизительно от 40 С до приблизительно 60 С. 8. Композиция по любому из пп.2-5, отличающаяся тем, что указанную целлюлазную активность оценивают с помощью любого из таких способов анализа, как анализ СМСазной,RBB-СМСазной активности, эндовискозиметрический способ или анализ активности с использованием фильтровальной бумаги. 9. По существу очищенная и выделенная белковая фракция, полученная из композиции по п.5, обладающая, по крайней мере, 50% максимальной целлюлазной активности при значении рН приблизительно от 6,0 до приблизительно 7,0, по данным любого из таких способов анализа, как анализ СМСазной, RBB-СМСазной активности, эндовискозиметрический способ или анализ активности с использованием фильтровальной бумаги. 10. Эндоглюканаза, полученная из фракции по п.9, имеющая молекулярную массу приблизительно 60 кДа и значение рI приблизительно 3. 11. Целлобиогидралаза, полученная из фракции по п.9, имеющая молекулярную массу приблизительно 60 кДа и значение рI приблизительно 4. 12. По существу очищенный и выделенный нейтральный и/или щелочной фермент целлюлазы, выделенный из белковой фракции по п.9 и имеющий значение рI от приблизительно 3 до приблизительно 5,5. 13. Целлюлаза по п.12, отличающаяся тем,что обладает эндоглюканазной или целлобиогидралазной активностью. 14. Целлюлаза по п.12, отличающаяся тем,что целлюлаза сохраняет, по крайней мере, 50% максимальной целлюлазной активности при значении рН от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0. 15. Эндоглюканаза, полученная из фракции по п.9 и имеющая молекулярную массу приблизительно 25 кДа. 16. Эндоглюканаза по п.15, имеющая значение рI приблизительно 4. 59 17. Эндоглюканаза, полученная из фракции по п.9 и имеющая молекулярную массу приблизительно 70 кДа. 18. Эндоглюканаза по п.17, имеющая значение рI приблизительно 4. 19. Эндоглюканаза, полученная из фракции по п.9 и имеющая молекулярную массу приблизительно 43 кДа. 20. Эндоглюканаза по п.19, имеющая значение рI приблизительно 3. 21. Детергентная композиция, включающая выделенную белковую фракцию по п.9 и/или один или более фермент по любому из пп.10-20 и дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество. 22. Композиция для смягчения ткани, включающая выделенную белковую фракцию по п.9 и/или один или более фермент по любому из пп.10-20. 23. Композиция для ферментативной обработки целлюлазных волокон или целлюлазной ткани, включающая целлюлазу, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium, имеющая значение рН от приблизительно 8,0 до приблизительно 12,0. 24. Композиция по п.23, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей изqueenslandicum и Chrysosporium tropicum. 25. Композиция по п.24, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporiumlucknowense. 26. Композиция по любому из пп.23-25,отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium. 27. Композиция по любому из пп.23-25,дополнительно включающая один или более компонентов, выбранных из группы, включающей кусочки пемзы, абразивные материалы,смягчители, растворители, консерванты, отбеливающие средства, синьки, флуоресцентные красители, антиоксиданты, солюбилизаторы,моющие средства, поверхностно-активные вещества, ферменты, строительные добавки, агенты, препятствующие отложению, буферы, ингибиторы слеживания, маскирующие агенты для факторов, ингибирующих целюлазную активность, и активаторы целлюлазы. 28. Композиция по п.27, отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба родаChrysosporium. 29. Композиция по п.23, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0. 60 30. Композиция по п.24, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0. 31. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0. 32. Композиция по п.26, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0. 33. Композиция по п.27, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0. 34. Композиция по п.28, отличающаяся тем, что значение рН находится в диапазоне от 10,0 до приблизительно 11,0. 35. Композиция для ферментативной обработки целлюлазных волокон или целлюлазных тканей, включающая целлюлазу, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба родаChrysosporium, дополнительно включающая один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из протеиназ, моющих средств и поверхностно-активных веществ. 36. Композиция по п.35, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей изpannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum,Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum и Chrysosporium tropicum. 37. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporiumlucknowense. 38. Композиция по любому из пп.35-37,отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из гриба дикого типа или мутантного гриба рода Chrysosporium. 39. Композиция для ферментативной обработки целлюлазных волокон или целлюлазных тканей, обладающая, по крайней мере, 124 единицами эндо-1,4 глюканазной активности на грамм сухой композиции целлюлазы, по данным эндовискозиметрического анализа, аминокислотная последовательность которой кодируется нуклеотидной последовательностью из гриба дикого типа или мутантного гриба родаChrysosporium. 40. Композиция по п.39, отличающаяся тем, что гриб выбран из группы, состоящей изqueenslandicum и Chrysosporium tropicum. 41. Композиция по п.40, отличающаяся тем, что гриб представляет собой Chrysosporiumlucknowense. 42. Композиция по п.39, отличающаяся тем, что целлюлазу выделяют или получают из
МПК / Метки
МПК: D06P 1/00, D06M 16/00, C12N 1/14, C12S 11/00, C11D 3/386
Метки: грибов, применения, chrysosporium, способы, рода, целлюлаза
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-3295-cellyulaza-iz-gribov-roda-chrysosporium-i-sposoby-ee-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Целлюлаза из грибов рода chrysosporium и способы ее применения</a>
Легкие экструдированные композиции, содержащие легкий экструдируемый керамический носитель, способы их применения и способы их приготовления
Номер патента: 3033
Опубликовано: 26.12.2002
Авторы: Кимпара Масаоми, Такаянаги Нориказу, Сузуки Мунехиро
МПК: A01N 25/08
Метки: легкий, носитель, керамический, применения, способы, приготовления, легкие, экструдированные, содержащие, экструдируемый, композиции
Формула / Реферат:
1. Легкая экструдированная композиция, которая включает, по меньшей мере, одно соединение сельскохозяйственного назначения, легкий экструдируемый керамический носитель и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество. 2. Композиция по п.1, которая далее включает минеральный носитель и связующее вещество. 3. Композиция по п.2, которая включает в пересчете на массу от примерно 0,5 до 75% одного или нескольких соединений...
Аморфные бензотиофены, способы получения и способы применения
Номер патента: 2022
Опубликовано: 24.12.2001
Авторы: Кафф Джордж В., Таккар Арвинд Л.
МПК: C07D 333/52, A61P 19/08, A61K 31/381...
Метки: бензотиофены, способы, аморфные, получения, применения
Формула / Реферат:
1. Аморфная форма гидрохлорида 6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-3-[4-(2-пиперидинилэтокси)бензоил]бензо[b]тиофена формулы или его фармацевтически приемлемого сольвата. 2. Способ получения аморфной формы гидрохлорида 6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-3-[4-(2-пиперидинилэтокси)бензоил]бензо[b]тиофена формулы или его фармацевтически приемлемого сольвата, который включает получение раствора кристаллической формы гидрохлорида соединения формулы I в...
Композиция, включающая ингибитор il-1 и гидрогелевый эфир, и способы ее применения
Номер патента: 1792
Опубликовано: 27.08.2001
Авторы: Коллинс Дэвид С., Бевилаква Майкл П.
МПК: A61P 29/00, A61K 47/36
Метки: композиция, гидрогелевый, эфир, ингибитор, способы, применения, включающая
Формула / Реферат:
1. Фармацевтическая композиция, включающая гидрогелевый эфир, контролирующий высвобождение, и белковый ингибитор интерлейкина-1 (IL-1). 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что гидрогелевый эфир является гиалуронаном или его солью. 3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что гиалуронан является гиалуроновой кислотой. 4. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что гиалуронан является гиланом. 5. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что гиалуронан...
Фармацевтическая композиция, содержащая витамин d и кальций, способы ее приготовления и терапевтического применения
Номер патента: 2492
Опубликовано: 27.06.2002
Авторы: Тозетти Алессандро, Валлери Маурицио
МПК: A61P 19/10, A61K 31/59
Метки: композиция, фармацевтическая, терапевтического, применения, содержащая, способы, кальций, приготовления, витамин
Формула / Реферат:
1. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активных действующих веществ витамин D в сочетании с солью кальция, отличающаяся тем, что она содержит связующее вещество, выбранное из пропиленгликоля или полиэтиленгликоля, имеющих молекулярный вес от 300 до 1500, жидкого парафина или силиконового масла, при этом витамин D присутствует в количестве 500-1000 ME на 1-2 г кальция. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой соль кальция...
Устройства для диспергирования сухого порошка и способы их применения
Номер патента: 2869
Опубликовано: 31.10.2002
Авторы: Шулер Карлос, Шнайдер Герм, Аксфорд Джордж С., Бурр Джон Д., Рэй Чарлз, Смит Адриан Е., Хол Рэнди К.
МПК: A61M 15/00
Метки: устройства, диспергирования, применения, порошка, способы, сухого
Формула / Реферат:
1. Устройство для аэрозолизации порошкообразного лекарственного средства, содержащее цилиндр под давлением; поршень, установленный в цилиндре с возможностью скольжения, для поддержания давления газа в цилиндре; рукоятку, связанную с цилиндром, которая может перемещаться из выдвинутого положения в исходное положение с целью поддержания давления газа в цилиндре; аэрозолизирующий механизм, рассчитанный на аэрозолизацию порошкообразного...
Предыдущий патент: Ингибиторы металлопротеиназы, фармацевтические композиции, их содержащие, и их фармацевтические применения
Случайный патент: Система для выработки электроэнергии из плазмы