Слитый белок против рака

СЛИТЫЙ БЕЛОК ПРОТИВ РАКА Слитый белок, содержащий домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент белковой последовательности hTRAIL, который начинается с аминокислоты в положении не нижеhTRAIL95, или гомолог указанного функционального фрагмента, имеющий по меньшей мере 70% идентичность последовательности; и домен (b), который представляет собой последовательность иммуностимулирующего эффекторного пептида, где последовательность домена (b) связана с С-концом или N-концом домена (а). Слитый белок можно использовать для лечения раковых заболеваний. 024452 Изобретение относится к области терапевтических слитых белков, в частности рекомбинантных слитых белков. Более конкретно изобретение относится к слитым белкам, содержащим фрагмент последовательности растворимого белка TRAIL человека в комбинации с последовательностью иммуностимулирующего пептида, к фармацевтическим композициям, содержащим их, к их применению в терапии, в частности, в качестве средств против рака, и к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим слитые белки, экспрессирующим векторам, содержащим полинуклеотидные последовательности, и клеткам-хозяевам, содержащим эти экспрессирующие векторы. Белок TRAIL, принадлежащий семейству цитокинов (родственный фактору некроза опухоли индуцирующий апоптоз лиганд), также известный как Apo2L (Аро 2-лиганд), является мощным активатором апоптоза в опухолевых клетках и в клетках, инфицированных вирусами. TRAIL представляет собой лиганд, естественным образом, встречающийся в организме. Белок TRAIL, его аминокислотная последовательность, кодирующие последовательности ДНК и системы экспрессии белков впервые были описаны в ЕР 0835305 А 1. Белок TRAIL проявляет его активность против рака путем связывания с проапоптотическими поверхностными рецепторами TRAIL 1 и 2 (TRAIL-R1/R2) и последующей активации этих рецепторов. Эти рецепторы, также известные как DR4 и DR5 (рецептор смерти 4 и рецептор смерти 5), принадлежат семейству рецепторов TNF и сверхэкспрессируются различными типами раковых клеток. Активация этих рецепторов может индуцировать внешний каскад передачи сигнала апоптоза, независимого от генасупрессора р 53, который путем активации каспазы 8 приводит к активации исполнительных каспаз и,тем самым, деградации нуклеиновых кислот. Каспаза 8, высвобождаемая при активации TRAIL, также может вызывать высвобождение белка Bid и, тем самым, непрямую активацию митоходриального каскада, причем белок Bid, транслоцированный в митохондрии, где он стимулирует высвобождение цитохрома с, таким образом, непрямо усиливает апоптотический сигнал рецепторов смерти.TRAIL действует селективно на опухолевые клетки, по существу не индуцируя апоптоз в здоровых клетках, которые устойчивы к этому белку. Таким образом, был признан огромный потенциал TRAIL в качестве средства против рака, которое действует на широкий диапазон различных типов опухолевых клеток, включая гематологические злокачественные опухоли и солидные опухоли, одновременно сохраняя нормальные клетки и вызывая потенциально относительно небольшие побочные эффекты. Белок TRAIL представляет собой мембранный белок типа II, имеющий длину 281 аминокислот, и его внеклеточная область, содержащая аминокислотные остатки 114-281, при расщеплении протеазами образует растворимую молекулу sTRAIL размером 20 кДа, которая также является биологически активной. Как форма TRAIL, так и форма sTRAIL, способны запускать апоптоз через взаимодействие с рецепторами TRAIL, присутствующими на клетках-мишенях. Высокая противоопухолевая активность и очень низкая системная токсичность растворимой части молекулы TRAIL были продемонстрированы с использованием исследований на клеточных линиях. Клинические испытания у человека с рекомбинантным растворимым TRAIL человека (rhTRAIL),имеющим аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам 114-281 hTRAIL,известным под INN "дуланермин", также показали его хорошую переносимость и отсутствие лимитирующей дозу токсичности. Также было выявлено, что фрагмент TRAIL, более короткий, чем 114-281, способен связываться с мембранными рецепторами смерти и индуцировать апоптоз через эти рецепторы, как недавно описано для рекомбинантного, полученного путем круговой пермутации мутанта 122-281 hTRAIL, например, в ЕР 1 688 498. Токсические эффекты рекомбинантного белка TRAIL на клетки печени, описанные до настоящего времени, по-видимому, ассоциированы с присутствием модификации, т.е. полигистидиновых меток, в то время как немеченый TRAIL не продемонстрировал системной токсичности. Однако в ходе дальнейшего исследования и разработки, оказалось, что многие раковые клетки также продемонстрировали первичную или приобретенную устойчивость к TRAIL (см. например,WO2007/022214). Хотя механизм устойчивости к TRAIL не полностью понятен, полагают, что он может проявлять себя на различных уровнях индуцируемого TRAIL каскада апоптоза, находящихся в диапазоне от уровня рецепторов клеточной поверхности до исполнительных каспаз в каскаде передачи сигнала. Эта устойчивость ограничивает применимость TRAIL в качестве средства против рака. Более того, в клинических испытаниях на пациентах показано, что истинная эффективность TRAIL в качестве монотерапии является низкой. Для преодоления этой низкой эффективности и устойчивости опухолей к TRAIL были разработаны различные способы комбинированной терапии с радио- и химиотерапевтическими средствами, которые обеспечивали синергический апоптотический эффектSrivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533). Использование rhTRAIL для лечения рака в комбинации с выбранными общепринятыми химиотерапевтическими средствами (паклитаксел, карбоплатин) и моноклональными антителами противVEGF описано в WO 2009/140469. Однако такая комбинация обязательно подразумевает хорошо известные недостатки общепринятой химиотерапии или лучевой терапии.-1 024452 Сконструированный слитый белок, содержащий последовательности ингибитора ангиогенеза вазостатина и TRAIL114-281, связанные с помощью линкера с участком расщепления металлопротеазой, был описан в качестве проявляющего эффект индукции апоптоза в опухолевых клетках, A.I. Guo et al, ChineseJournal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-930. Сконструированный слитый белок, содержащий последовательности тумстатина 183-230 из ингибитора ангиогенеза тумстатина иTRAIL114-281 был описан как проявляющий индукцию апоптоза клеток рака поджелудочной железы,N.Ren et al. in Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478. В US 2005/244370 и соответствующей WO 2004/035794 описана конструкция TRAIL95-281 в качестве эффекторного домена, связанного через пептидный линкер с внеклеточной частью другого представителя семейства лигандов TNF CD40 в качестве домена, связывающегося с клеточной поверхностью. Утверждается, что активация конструкции происходит через связывание ее CD40-части. Более того, было показано, что проблемой, связанной с терапией TRAIL, является его низкая стабильность и быстрое выведение из организма после введения. Преимущественный эффект цитокинов в терапии рака также известен. Представителем семейства цитокинов является интерферон - белок, который стимулирует иммунную систему. Интерфероны являются важными средствами против рака или вспомогательными средствами против рака (Borden and Williams, Interferons, Cancer Medicine, 5th edition, 815-824, 2000). Было показано, что одним из эффектов интерферонов является сильная стимуляция множества проапоптотических факторов, включая лигандTRAIL. Типичным представителем группы интерферонов типа II является интерферон-гамма (IFN-), который представляет собой димерный растворимый цитокин. IFN- секретируется NK, NKT, Th1, Тс и дендритными клетками. Лиганд IFN-Y связывается с двумя типами рецептора IFN- R И IFN- R1 и активирует каскад JAK-STAT. Одним из его эффектов является интенсивная стимуляция продуцирования моноцитами человека белка TRAIL, который значительно влияет на их способность устранять раковые клетки (Griffith et al, J. Exp. Med., 189:1343-1353, 1999). Интерферон-гамма активирует рецептор IFN-гамма, стимулирующий антитело-зависимую токсичность, и усиливает процесс взаимодействия клеток с опухолевыми клетками. Кроме того, IFN-гамма активирует каспазы, тем самым, индуцируя апоптоз в раковых клетках. Кроме того, было продемонстрировано, что во многих опухолевых линиях, демонстрирующих устойчивость к стимулируемому TRAIL апоптозу, интерферон-гамма действовал синергично, внося вклад в их чувствительность к TRAIL (Wanget al, Oncogene, 23: 928-935, 2004). Однако существующие способы терапии с использованием IFN-гамма не являются достаточно эффективными, чтобы применяться в лечении раковых заболеваний. Также были продемонстрированы благоприятные эффекты интерферона-альфа на индукцию сверхпродукции TRAIL в клетках миеломы, лимфом и рака печени (Chen и et al, Blood, 98: 2183-21192; Herzeret al, Cancer Res. 69(3): 855-862, 2009). Интерферон-альфа считается модулятором биологического ответа,который усиливает природные ответы организма на заболевания. Он влияет как на клеточный, так и на гуморальный иммунитет. Он стимулирует продукцию антител против рака, активирует цитотоксическое действие макрофагов, NK-клеток и лимфоцитов. INF-альфа также увеличивает экспрессию антигенов гистосовместимости HLA на раковых клетках, которые способствуют их распознаванию иммунными клетками. Он опосредует замедление роста и деления раковых клеток, и впоследствии их смерть. Интерферон-альфа используют для лечения различных типов рака, включая волосатоклеточный лейкоз, меланому, рак почки, миелобластический и миелоцитарный лейкоз, лимфому, саркому Капоши и другие неопластические заболевания крови (Folkman J., N. Engl. J. Med.1995, 333: 1757-1763; Sidky YA,Borden EC. Cancer Res. 1987. 47: 5155-5161; Iwagak H, Hizuta A, Yoshino T, et al., Anticancer Res. 1993, 13: 13-15; Rubinger M, Plenderleith IH, Lertzman M, et al, Chest. 1995, 108:281-282). Однако в дозе, требуемой для достижения терапевтического эффекта у пациентов, наблюдали токсические эффекты, такие как нейтропения, гриппоподобные симптомы, чувство дискомфорта, анорексия и дисфункция печени. Вследствие этих побочных эффектов терапию интерфероном-альфа часто прекращают, что делает эту терапию неэффективной. Более того, биологическое время полужизни большинства цитокинов, включая интерферон-альфа, является коротким и не более нескольких часов, вследствие чего требуются частые инъекции. По различным причинам, частое введение лекарственного средства является неудобным для пациента(особенно при длительном лечении). Это привело к необходимости разработки составов интерферонаальфа с пролонгированным высвобождением. Было предпринято несколько попыток улучшить свойства интерферона-альфа. Попытка продлить биологическое время полужизни интерферона путем предоставления гетеродимерных слитых конструкций с белками-переносчиками, содержащих линкеры, обеспечивающие надлежащее сворачивание экспрессированных слитых белков, описана, например, в US7943733. Другие попытки основаны на решенной структуре биологически активной формы интерферона, т.е. ее образующихся в природе нековалентных гомодимерах, которые образуются с помощью антипаралельного взаимного сцепления двух мономеров в рецепторном участке с помощью иона цинка (Zn2+) (R. Radhakrishnan, Structure 1996, Vol. 4 No 12, 1453-1463). Конструкции гомодимеров интерферона-альфа, связанные через глицин-сериновый лин-2 024452 кер, упомянуты в патентной заявке LT2010012, однако данные об их активности не предоставлены. Известно, что IFN действует в качестве нековалентно асоциированного гомодимера, в котором две идентичных полипептидных цепи ориентированы антипараллельно, образуя симметричную молекулу(Ealick, S. E., Science (1991) 262, 698-702). Таким образом, существует возможность, что димерные формы IFN могут оккупировать участок связывания рецептора более эффективно, однако эта гипотеза не была клинически подтверждена. Попытки разработать производные альфа-интерферона, которые были бы свободны от упомянутых выше побочных эффектов, привели к внедрению лечения пегилированными альфа-интерферонами длительного действия. Пегилирование является одним из распространенных способов введения белков в организм млекопитающих, нацеленным на снижение или преодоление побочных эффектов активного вещества. Принципом пегилирования является создание защитного барьера вокруг модифицированных молекул, что приводит к продлению времени желаемой концентрации вещества (вследствие изменения фармакокинетических и фармакодинамических свойств). Время всасывания увеличивается, и выведение из организма является более длительным. Величины этих параметров зависят от структуры молекул полиэтиленгликоля (PEG): длины цепи,линейности, степени ветвления, типа и количества участков связывания и количества присоединенных молекул гликоля. [Delgado С, Francis GE, Fisher D., The uses и properties of PEG-linked proteins. Crit. Rev.Ther. Drug Carrier Syst. 1992; 9 (3-4): 249-304]. Пегилирование не влияет на связывание интерферона с его рецептором. Доклинические испытания продемонстрировали, что пегилированный интерферон-альфа связывается с рецептором IFN-2 а и оказывает такую же, или более высокую биологическую активность in vitro, что подтверждено в исследованиях на культуре опухолевых клеток и на мышах с имплантированными клетками карциномы почки человека [Nieforth K, Nadeau R, Patel IH, Mould D. Use of an indirect pharmacodynamic stimulation model ofPharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and preliminary efficacy data. Clin. Pharmacol. Ther. 2000; 68: 556-67]. Несмотря на перспективные данные из экспериментах с моделями на животных, коммерчески доступные, содержащие пегилированный интерферон препараты PEGIntron и PEGASYS (G. Pasut, F.M.Veronese, Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 933-961), с разветвленными цепями PEG массой 40 кДа и линейными цепями PEG массой 12 кДа, присоединенными к IFN, соответственно, продемонстрировали профиль безопасности, количественно сходный или даже худший, чем соответствующие немодифицированные молекулы интерферонов (Bukowski R. M. et al., Cancer, 95(2):389-96 (2002); Bukowski R. M. et al., JournalTong M. J. et al., Hepatology; 26(3):747-54 (1997. Наиболее часто наблюдаемые побочные эффекты терапии пегилированным IFN включают: дозозависимую тошноту, анорексию, ригидность мышц. Кроме того, более длительная терапия выявила огранчивающие дозу эффекты, такие как тяжелая усталость, нейротоксичность, нарушение функции печени и ингибирование функции костного мозга (PEG-Intron в дозах 7,5 мкг/кг и выше) (Bukowski R. M. etal., Cancer; 95(2):389-96 (2002. Таким образом, несмотря на существование клинически используемых способов терапии на основе белка TRAIL и белков семейства интерферонов (также модифицированных, в частности, пегилированием), они являются недостаточно эффективными и имеют множество хорошо известных недостатков, среди которых одними из наиболее тяжелых и ограничивающих являются ограниченная эффективность лечения, отсутствие селективности в отношении раковых клеток, побочные эффекты и первичная или приобретенная устойчивость. Все еще существует потребность в усовершенствованной терапии рака на основе активности как интерферона, так и белка TRAIL, которая была бы как эффективной, так и селективной in vivo против раковых клеток. Остается неотложная и неудовлетворенная потребность в новых средствах против рака, которые позволили бы как расширение диапазона доступных средств, так и выявление средств, которые являются более эффективными (цитотоксичными) и селективными. Также существует потребность в новых селективных средствах с увеличенной стабильностью и улучшенной фармакокинетикой. Настоящее изобретение относится к решению этой проблемы с помощью новых слитых белков, которые включают домен, происходящий из TRAIL, и короткий домен эффекторного пептида, имеющий активность стимуляции иммунной системы, причем этот эффекторный пептид не включает фрагментыTRAIL, где эффекторный пептид усиливает или дополняет действие TRAIL. Более того, оказалось, что во многих случаях слитые белки по изобретению являются более мощными, чем растворимый TRAIL и его варианты, состоящие из фрагментов его последовательности, а также более мощными, чем соответствующие эффекторные пептиды. Во многих случаях новые слитые белки также преодолевают устойчи-3 024452 вость к TRAIL. Более того, включение эффекторного пептида приводит к продлению времени полужизни и увеличению удержания белка в опухоли и повышению его эффективности. Кроме того, в определенных вариантах новые слитые белки могут быть связаны PEG, что имеет защитный эффект против неспецифических протеаз и, кроме того, изменяет фармакокинетические и фармакодинамические свойства, в частности, в отношении продления биологического времени полужизни. Описание чертежей Изобретение далее подробно описано с помощью фигур. На фиг. 1 представлена схематическая структура слитых белков по изобретению в соответствии с примером 1, примером 2, примером 3 и примером 4. На фиг. 2 представлена схематическая структура слитых белков по изобретению в соответствии с примером 5, примером 6, примером 7, примером 8, примером 9, примером 10 и примером 11. На фиг. 3 представлена схематическая структура слитых белков по изобретению в соответствии с примером 12, примером 13, примером 14 и примером 15. На фиг. 4 представлена схематическая структура слитых белков по изобретению в соответствии с примером 16 и примером 17. На фиг. 5 представлены спектры кругового дихроизма для rhTRAIL114-281, rhTRAIL95-281 и слитых белков в соответствии с примером 12, примером 5, примером 3 и примером 14, выраженные в удельной эллиптичности. На фиг. 6 представлены изменения объема опухоли (% от первоначальной стадии) у мышейCrl:CD1-Foxn1nu, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ 116, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 3, примеру 12 и примеру 14 по сравнению с rhTRAIL114-281. На фиг. 7 представлены величины ингибирования роста опухоли (%TGI) у мышей Crl:CD1-Foxn1nu,нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ 116, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 3, примеру 12 и примеру 14 по сравнению с rhTRAIL114-281. На фиг. 8 представлены изменения объема опухоли (% от первоначальной стадии) у мышейCrl:SHO-PrkdcscidHrhr, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ 116, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с rhTRAIL114-281. На фиг. 9 представлены величины ингибирования роста опухоли (%TGI) у мышей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ 116, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с rhTRAIL114-281. На фиг. 10 представлены изменения объема опухоли (% от первоначальной стадии) у мышейCrl:SHO-PrkdcscidHrhr, нагруженных клетками рака печени PLC/PRF/5, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с rhTRAIL114-281. На фиг. 11 представлены величины ингибирования роста опухоли (%TGI) у мышей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, нагруженных клетками рака печени PLC/PRF/5, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с rhTRAIL114-281. На фиг. 12 представлены изменения объема опухоли (% от первоначальной стадии) у мышейCrl:SHO-PrkdcscidHrhr, нагруженных клетками рака печени HepG2, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с rhTRAIL114-281. На фиг. 13 представлены величины ингибирования роста опухоли (%TGI) у мышей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, нагруженных клетками рака печени HepG2, которым вводили слитый белок по изобретению согласно примеру 14 по сравнению с rhTRAIL114-281. Подробное описание изобретения Изобретение относится к слитому белку, содержащему: домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент последовательности растворимого белка hTRAIL, который начинается с аминокислоты в положении не ниже hTRAIL95, или гомолог указанного функционального фрагмента, имеющий по меньшей мере 70% идентичность последовательности, и домен (b), который представляет собой последовательность иммуностимулирующего эффекторного пептида, где последовательность домена (b) присоединена к С-концу и/или N-концу домена (a). Термин "функциональный растворимый фрагмент последовательности растворимого hTRAIL" следует понимать как обозначающий любой такой фрагмент растворимого hTRAIL, который способен индуцировать апоптотический сигнал в клетках млекопитающих при связывании с его рецепторами на поверхности клеток. Также квалифицированному специалисту будет понятно, что существование по меньшей мере 70% гомологии с последовательностью TRAIL известно в данной области. Следует понимать, что домен (b) эффекторного пептида в слитом белке по изобретению не является ни белком hTRAIL, ни частью или фрагментом белка hTRAIL. Термин "пептид" в соответствии с изобретением следует понимать как молекулу, составленную из множества аминокислот, связанных друг с другом пептидной связью. Таким образом, термин "пептид" в соответствии с изобретением включает олигопептиды, полипептиды и белки. В рамках настоящего изобретения аминокислотные последовательности пептидов представлены-4 024452 общепринятым путем, признанным в данной области, т.е. в направлении от N-конца (N-концевой части) пептида к С-концу (С-концевой части). Таким образом, в любой последовательности N-конец находится слева и С-конец находится справа в ее линейном представлении. Слитый белок по изобретению может включать один домен (b) эффекторного пептида, присоединенный к С-концу или N-концу домена (а). В конкретном варианте осуществления домен (а) представляет собой фрагмент последовательностиhTRAIL, начинающийся с аминокислоты из диапазона от hTRAIL95 до hTRAIL122, включительно, и оканчивающийся аминокислотой hTRAIL281. В частности, домен (а) может быть выбран из группы, состоящей из последовательности, соответствующей hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL120-281, hTRAIL121-281 иhTRAIL122-281. Специалистам в данной области будет понятно, что hTRAIL95-281, hTRAIL114-281,hTRAIL116-281, hTRAIL120-281, hTRAIL121-281 и hTRAIL122-281 представляют собой фрагменты белка TRAIL человека, начинающиеся с аминокислоты, обозначаемой номером 95, 114, 116, 120, 121 и 122,соответственно, в известной последовательности hTRAIL, опубликованной в GenBank под номером доступаР 50591. В другом конкретном варианте осуществления домен (а) представляет собой гомолог функционального фрагмента белковой последовательности растворимого hTRAIL, начинающегося не ниже hTRAIL95 и оканчивающегося аминокислотой hTRAIL281, последовательность которого по меньшей мере на 70%,предпочтительно на 85%, идентична исходной последовательности. В конкретных вариантах этого варианта осуществления домен (а) представляет собой гомолог фрагмента, выбранного из группы, состоящей из последовательности, соответствующей hTRAIL95-281,hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL120-281, hTRAIL121-281 и hTRAIL122-281. Следует понимать что гомолог фрагмента hTRAIL представляет собой вариант/модификацию аминокислотной последовательности этого фрагмента, где изменена по меньшей мере одна аминокислота,включая 1 аминокислоту, 2 аминокислоты, 3 аминокислоты, 4 аминокислоты, 5 аминокислот, 6 аминокислот и не более 15% аминокислот, и где у фрагмента модифицированной последовательности сохранена функциональность последовательности hTRAIL, т.е. способность связываться с рецепторами смерти на клеточной поверхности и индукцию апоптоза в клетках млекопитающих. Модификация аминокислотной последовательности может включать, например, замену, делецию, укорочение и/или вставку аминокислот. Предпочтительно гомолог фрагмента hTRAIL, имеющий модифицированную последовательность,проявляет модифицированную аффинность к рецепторам смерти DR4 (TRAIL-R1) или DR5 (TRAIL-R2) по сравнению с нативным фрагментом hTRAIL. Термин "модифицированная аффинность" относится к увеличенной аффинности и/или аффинности с измененной селективностью к рецептору. Предпочтительно гомолог фрагмента hTRAIL, имеющий модифицированную последовательность,проявляет увеличенную аффинность к рецепторам смерти DR4 и DR5 по сравнению с нативным фрагментом hTRAIL. Особенно предпочтительно гомолог фрагмента hTRAIL, имеющий модифицированную последовательность, проявляет увеличенную аффинность к рецептору смерти DR5 по сравнению с рецептором смерти DR4, т.е. увеличенную селективность DR5/DR4. Также предпочтительно гомолог фрагмента hTRAIL, имеющий модифицированную последовательность, проявляет увеличенную селективность в отношении рецепторов смерти DR4 и/или DR5 по сравнению с аффинностью в отношении рецепторов DR1 (TRAIL-R3) и/или DR2 (TRAIL-R4). Модификации hTRAIL, приводящие к увеличенной аффинности и/или селективности в отношении рецепторов смерти DR4 и DR5, известны специалистам в данной области, например из публикации TurChem. 2008 Jul 18; 283(29):20560-8, в которой описана мутация D218H, имеющая увеличенную селективность в отношении DR4, или Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B withD269H, имеющая сниженную аффинность к DR4. Мутанты hTRAIL, приводящие к увеличенной аффинности в отношении одного рецептора, выбранного из DR4 и DR5, по сравнению с рецепторами DR1 иWO2009077857 и WO2009066174. Подходящие мутации представляют собой одну или несколько мутаций в положениях нативногоhTRAIL, выбранных из группы, состоящей из 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 и 251, в частности, мутации, вовлеченные в замену аминокислоты основной аминокислотой, такой как лизин,гистидин или аргинин, или аминокислотой, такой как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота. В частности, могут быть указаны одна или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей изK251Q, как описано в WO 2009066174. Подходящие мутации также представляют собой одну или несколько мутаций в положениях нативного hTRAIL, выбранных из группы, состоящей из 195, 269 и 214, в частности мутации, вовлекающие замену аминокислоты основной аминокислотой, такой как лизин, гистидин или аргинин. В частности,могут быть указаны одна или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из D269H, E195R иT214R, как описано в WO 2009077857. В конкретном варианте осуществления домен (а), который является гомологом фрагмента hTRAIL,выбран из мутанта D218H нативной последовательности TRAIL, как описано в WO2009066174, или мутанта Y189N-R191K-Q193R-H264R-I266R-D269H нативной последовательности TRAIL, как описано вGasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Apoptosis. 2009 Jun; 14(6):778-87. Иммуностимулирующий эффекторный пептид домена (b) может представлять собой пептид цитокина, который, помимо прочего, интенсивно стимулирует продуцирование моноцитами человека белкаTRAIL, таким образом, значительно влияя на способность устранять раковые клетки. В одном варианте осуществления слитого белка по изобретению эффекторный пептид представляет собой пептид, обладающий иммуностимулирующей активностью, выбранный из группы, состоящей из(псевдодимер INF-гамма), SEQ. No. 46 (псевдодимер интерферона альфа 2b) и SEQ. No. 47 (консенсусная последовательность интерферона альфа). Эффекторный пептид описанной выше группы представляет собой пептид, который стимулирует сверхэкспрессию TRAIL, и, в частности фрагмент из 165-аминокислот субъединицы бета интерферона альфа, представленный в SEQ. No. 17. Полагают, что пептид, содержащий последовательность бета-субъединицы интерферона-альфа,включенный в слитый белок по изобретению, может эффективно устранять раковые клетки. Другим эффекторным пептидом является фрагмент интерферона-гамма из 124 аминокислот, представленный в SEQ. No. 18. Полагают, что пептид, содержащий последовательность интерферона-гамма, включенный в слитый белок по изобретению, может эффективно устранять раковые клетки. Эффекторный пептид описанной выше группы представляет собой пептид из 263 аминокислот,представляющий собой слитую конструкцию двух субъединиц интерферона-гамма человека, образующих одноцепочечный псевдодимер INF-гамма, описанный Landar'a et al. (J.Mol.Biol. 299: 169-179, 2000). Полученный одноцепочечный вариант белка сохраняет способность связываться с подходящим рецептором и биологическую активность, предполагаемую для интерферона-гамма. Этот эффекторный пептид представлен в SEQ. No. 19. Другим эффекторным пептидом указанной выше группы является пептид из 351 аминокислот,представляющий собой слитую конструкцию двух субъединиц интерферона-альфа 2b человека, образующих одноцепочечный псевдодимер INF-альфа 2b, где вторая цепь последовательности субъединицыIFN-альфа 2b является обратной по сравнению с нативной последовательностью (т.е. от С-конца к Nконцу). Полученный эффекторный пептид характеризуется двумя "нативными" С-концами интерферонаальфа 2b, связанными друг с другом. Мономеры в природных условиях образующихся димерах IFNальфа связаны их С-концами. N-концы, в свою очередь, ответственны за взаимодействие с рецептором и обеспечивают надлежащую среду для координации процесса димеризации ионов цинка (остатки глутаминовой кислоты 41 и 42). Полученный одноцепочечный вариант белка сохраняет способность связываться с подходящим рецептором и биологическую активность, предполагаемую для интерферона-альфа. Этот эффекторный пептид представлен в SEQ. No. 46. Другим эффекторным пептидом является консенсусная последовательность интерферона-альфа из 166 аминокислот, представленная в SEQ. No. 47. Эта консенсусная последовательность описана в US 4695623. Полагают, что пептид, содержащий консенсусную последовательность интерферона-альфа, включенную в слитый белок по изобретению, может эффективно устранять раковые клетки. При связывании с рецепторами TRAIL, присутствующими на поверхности раковых клеток, слитый белок проявляет двойной эффект. Домен (а), который представляет собой функциональный фрагментTRAIL или его гомолог с сохраненной функциональностью, проявляет его известную агонистичскую активность - т.е. связывание с рецепторами смерти на клеточной поверхности и активацию внешнего каскада апоптоза. После интернализации слитого белка, содержащего иммумностимулирующий пептид,домен (b) потенциально способен оказывать его действие внутриклеточно параллельно активности домена TRAIL. Таким образом, активность TRAIL против рака может усиливаться активацией других элементов и механизмов, таких как стимуляция продуцированием В-клетками антител, стимуляция экспрессии каспазы 7 и 8, или стимуляция сверхэкспрессии TRAIL. В одном из вариантов осуществления изобретения домен (а) и домен (b) связаны по меньшей мере одним доменом (с), содержащим последовательность участка расщепления протеазами, распознаваемую-6 024452 протеазами, присутствующими в клеточном окружении, особенно в окружении опухолевых клеток. Связывание домена (а) с доменом (b) через по меньшей мере один домен (с) означает, что между доменами(а) и (b) может присутствовать более одного домена (с), в частности один или два домена (c). Участок расщепления протеазами может быть выбран из: последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, в частности Pro Leu Gly Leu Ala Gly(PLGLAG в однобуквенном представлении), обозначаемой как SEQ. No. 20,последовательности, распознаваемой урокиназой uPA, в частности, Arg Val Val Arg (RVVR в однобуквенном представлении), обозначаемой как SEQ. No. 21,и их комбинаций. В одном из вариантов осуществления изобретения участок расщепления протеазой представляет собой комбинацию последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, и последовательности,распознаваемой урокиназой uPA, расположенных рядом друг с другом в любом порядке. В одном варианте осуществления домен (с) представляет собой комбинацию MMP/uPA (SEQ. No 20/SEQ. No. 21), которая представляет собой последовательность Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val ValNo. 20), которая представляет собой последовательность Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly(RVVRPLGLAG в однобуквенном обозначении). Такие комбинации могут повторяться, предпочтительно два раза. Протеазы металлопротеазы ММР и урокиназа uPA сверхэкспрессируются в опухолевом окружении. Присутствие последовательности, распознаваемой протеазами, обеспечивает отщепление домена (а) от домена (b) при интернализации конструкции, т.е. высвобождение функционального домена (b) и, таким образом, его активацию. Присутствие участка расщепления протеазой, позволяя быстрое высвобождение эффекторного пептида, увеличивает вероятность переноса пептида в область его действия до того, как произойдет случайная деградация слитого белка протеазами, присутствующими в клетке. В другом варианте осуществления между доменами (а) и (b) дополнительно включен домен (d) из последовательности, подходящий для присоединения молекулы PEG (линкер PEG) к слитому белку по изобретению. Такой линкер PEG, представляет собой, например, известную последовательность Ala Ser Gly CysGly Pro Glu (ASGCGPE в однобуквенном представлении), обозначаемую как SEQ. No. 22. Линкер PEG также может быть выбран из Ala Ala Cys Ala Ala (AACAA в однобуквенном представлении), Ser Gly GlyCys Gly Gly Ser (SGGCGGS в однобуквенном представлении) и Ser Gly Cys Gly Ser (SGCGS в однобуквенном представлении), обозначаемые как, соответственно, SEQ. No. 23, SEQ. No. 24 и SEQ. No. 25. В одном из вариантов осуществления белок по изобретению содержит как домен (с), так и домен(d). В предпочтительном варианте осуществления домен (d) расположен между двумя доменами (с), в частности, между двумя доменами (с), которые выбраны из участка расщепления протеазой и комбинации участков расщепления протеазами, в частности, последовательности, распознаваемой металлопротеазами ММР (SEQ. No. 20), последовательности, распознаваемой урокиназой uPA (SEQ. No. 21) и комбинации MMP/uPA (SEQ. No. 20/SEQ. No. 21) или uPA/MMP (SEQ. No. 21/SEQ. No. 20). Таким образом, в одном варианте осуществления слитого белка по изобретению участок расщепления протеазой представляет собой комбинацию последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, и последовательности, распознаваемой урокиназой uPA, в любом порядке, разделенных последовательностью линкера PEG, описанной выше. Следует понимать, что в случае, когда слитый белок имеет как домен (d) из линкера PEG, так и домены (с) из участка расщепления, между доменами (а) и (b), тогда домены (с) расположены так, чтобы после расщепления конструкции домен (d) отсоединялся от доменов (а) и (b). Эти два домена (с) могут содержать как один участок расщепления протеазой, так и их комбинацию, как определено выше. Иными словами, если слитый белок содержит как домен (d), содержащий линкер PEG, так и домены участков расщепления (с), тогда домен (d) расположен между доменами (с). Изобретение не включает такой вариант, в котором домен (d) расположен между доменом (с) и доменом (а) или между доменом (с) и доменом (b), т.е. вариант, где после расщепления конструкции последовательность, подходящая для присоединения к слитому белку по изобретению молекулы PEG (d), будет оставаться связанной с доменом (а) или доменом (b). Молекулы PEG, пригодные для присоединения к слитому белку, могут быть выбраны из линейных и разветвленных молекул PEG. Особенно пригодными являются линейным молекулы PEG, имеющие молекулярную массу от 4000 до 20000. Помимо основных функциональных элементов слитого белка -домена(ов) участка расщепления и последовательности линкера PEG, слитые белки по изобретению могут содержать нейтральную последовательность/последовательности гибкого пространственного глицин-серинового линкера (спейсер). Такие линкеры/спейсеры хорошо известны и описаны в литературе. Подразумевают, что их включение в последовательность слитого белка обеспечивает правильное сворачивание белков, продуцированных в-7 024452 процессе их сверхэкспрессии в клетках-хозяевах. Гибкий пространственный линкер может быть выбран из любой комбинации остатков глицина и серина. В частности, гибкий линкер может быть выбран из группы, состоящей из Gly Ser Gly Gly Gly(GSGGG в однобуквенном представлении), Gly Gly Gly Ser (GGGS в однобуквенном представлении),Xaa Gly Gly Ser (XGGS в однобуквенном представлении), где Xaa обозначает любую аминокислоту или отсутствует, и Gly Gly Ser Gly (GGSG в однобуквенном представлении), обозначаемые как, соответственно SEQ. No. 26, SEQ. No. 27 и SEQ. No. 28) и SEQ. No. 50. Конкретные варианты осуществления слитого белка по изобретению представляют собой слитые белки, содержащие иммуностимулирующий пептид, выбранный из группы, состоящей из белков, соответствующих SEQ. No. 1, SEQ. No. 2, SEQ. No. 3, SEQ. No. 4 и SEQ. No. 45. Другим конкретным вариантом осуществления слитого белка по изобретению является слитый белок, содержащий иммуностимулирующий пептид, соответствующий SEQ. No. 44. Другими конкретными вариантами осуществления слитого белка по изобретению являются слитые белки, содержащие иммуностимулирующий пептид, выбранный из группы, состоящей из белков, соответствующих SEQ. No. 5, SEQ. No. 6, SEQ. No. 7, SEQ. No. 8, SEQ. No. 9, SEQ. No. 10 и SEQ. No. 11. Другими конкретными вариантами осуществления слитого белка по изобретению являются слитые белки, содержащие иммуностимулирующий пептид, выбранный из группы, состоящей из белков, соответствующих SEQ. No. 12, SEQ. No. 13, SEQ. No. 14 и SEQ. No. 15. Подробное описание структуры типичных слитых белков, упомянутых выше, представлено на фиг. 1-3 и на фиг. 4, и в примерах, представленных в настоящем описании ниже. В соответствии с настоящим изобретением "слитый белок" означает одну белковую молекулу, содержащую два или более белков или их фрагментов, ковалентно связанных через пептидную связь в их соответствующих пептидных цепях без дополнительных химических линкеров. Слитый белок также может быть альтернативно описан как белковая конструкция или химерный белок. В соответствии с настоящим изобретением, термины "конструкция" или "химерный белок", при их использовании, следует понимать как относящиеся к слитому белку, как определено выше. Для специалиста в данной области будет очевидно, что слитый белок, определенный таким образом, можно синтезировать известными способами химического синтеза пептидов и белков. Слитый белок можно синтезировать способами химического синтеза пептидов, особенно с использованием технологий пептидного синтеза на твердой фазе с использованием подходящих смол в качестве носителей. Такие технологии являются общепринятыми и известны в данной области, и описаны, среди прочих, в монографиях, таких как, например, Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis,1984, Springer-Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, PierceChemical Company. Слитый белок можно синтезировать способами химического синтеза пептидов в качестве непрерывного белка. Альтернативно индивидуальные фрагменты (домены) белка можно синтезировать по отдельности, а затем объединять вместе в один непрерывный пептид через пептидную связь, путем конденсации (амино-) N-конца одного пептидного фрагмента с (карбоксил-) С-концом второго пептида. Такие способы являются общепринятыми и хорошо известны. Для подтверждения структуры полученного пептида можно использовать известные способы анализа аминокислотного состава пептидов, такие как способ масс-спектрометрии высокого разрешения для определения молекулярной массы пептида. Для подтверждения пептидной последовательности также можно использовать секвенаторы белков, которые последовательно разрушают пептид и идентифицируют последовательность аминокислот. Однако предпочтительно слитый белок по изобретению представляет собой рекомбинантный белок, полученный способами генной экспрессии полинуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок, в клетках-хозяевах. Следующим аспектом изобретения является полинуклеотидная последовательность, в частности,последовательность ДНК, кодирующая слитый белок, как определено выше. Предпочтительно, полинуклеотидная последовательность, в частности, ДНК, в соответствии с изобретением, кодирующая слитый белок, как определено выше, представляет собой последовательность,оптимизированную для экспрессии в Е. coli. Другим аспектом изобретения также является экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, в частности, последовательность ДНК по изобретению, как определено выше. Другой аспект изобретения также представляет собой клетку-хозяина, содержащую экспрессирующий вектор, как определено выше. Предпочтительной клеткой-хозяином для экспрессии слитых белков по изобретению является клетка Е. coli. Способы получения рекомбинантных белков, включая слитые белки, хорошо известны. В кратком изложении, этот способ состоит в получении полинуклеотидной молекулы, например молекулы ДНК,кодирующей аминокислотную последовательность заданного белка и обеспечивающей экспрессию за-8 024452 данного белка в хозяине. Затем полинуклеотидную молекулу, кодирующую заданный белок, включают в соответствующий экспрессирующий вектор, который обеспечивает эффективную экспрессию полипептида. Затем рекомбинантный экспрессирующий вектор вводят в клетки-хозяева для трансфекции/трансформации, и в результате получают трансформированную клетку-хозяина. После этого проводят культивирование трансформированных клеток для сверхэкспрессии заданного белка, очистку полученных белков и необязательно разрезание путем отщепления последовательностей меток, использованных для экспрессии и очистки белка. Подходящие способы для экспрессии и очистки описаны, например, в монографии Goeddel, Geneal., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995. В качестве экспрессирующих векторов для введения и репликации последовательностей ДНК в клетках-хозяевах можно использовать космиды, плазмиды или модифицированные вирусы. Как правило,в качестве экспрессирующих векторов используют плазмиды. Подходящие плазмиды являются хорошо известными и коммерчески доступными. Экспрессирующий вектор по изобретению содержит полинуклеотидную молекулу, кодирующую слитый белок по изобретению и необходимые регуляторные последовательности для транскрипции и трансляции кодирующей последовательности, включенной в подходящую клетку-хозяина. Выбор регуляторных последовательностей зависит от типа клеток-хозяев, и он может быть без труда осуществлен специалистом в данной области. Примерами таких регуляторных последовательностей являются промотор и энхансер транскрипции или последовательность связывания РНК-полимеразы, последовательность связывания рибосом, содержащая сигнал инициации транскрипции, встроенная перед кодирующей последовательностью, и последовательность терминации транскрипции, встроенная после кодирующей последовательности. Более того, в зависимости от используемой клетки-хозяина и вектора, в экспрессирующий вектор можно вводить другие последовательности, такие как ориджин репликации, дополнительные участки рестрикции ДНК, энхансеры и последовательности, обеспечивающие индукцию транскрипции. Экспрессирующий вектор также может содержать последовательность маркерного гена, которая придает определенный фенотип трансформированной клетке и обеспечивает специфическую селекцию трансформированных клеток. Более того, вектор также может содержать вторую маркерную последовательность, которая позволяет отличить клетки, трансформированные рекомбинантной плазмидой, содержащей встроенные кодирующие последовательности заданного белка, от клеток, которые захватили плазмиду без вставки. Наиболее часто используют типичные маркеры устойчивости к антибиотикам,однако можно использовать любые другие репортерные гены, известные в данной области, присутствие которых в клетке (in vivo) можно легко определить с использованием технологии радиоавтографии,спектрофотометрии или био- и хемилюминесценции. Например, в зависимости от клетки-хозяина, можно использовать репортерные гены, такие как 6-галактозидаза, -глюкуронидаза, люцифераза, хлорамфениколацетилтрансфераза или зеленый флуоресцентный белок. Более того, экспрессирующий вектор может содержать сигнальную последовательность, транспортирующую белки в соответствующий клеточный компартмент, например периплазму, где обеспечивается сворачивание. Кроме того, может присутствовать последовательность, кодирующая метку/маркер,такой как HisTag, связанный с N-концом, или GST, связанный с С-концом, которая облегчает последующую очистку продуцированного белка с использованием принципа аффинности, через аффинную хроматографию на никелевой колонке. Также могут присутствовать дополнительные последовательности, которые защищают белок от протеолитической деградации в клетках-хозяевах, а также последовательности, которые повышают ее растворимость. Предпочтительно, вследствие простоты культивирования и генетического манипулирования, и большого количества полученного продукта используют экспрессирующую систему Е. coli. Таким образом, полинуклеотидную последовательность, содержащую заданную последовательность, кодирующую слитый белок по изобретению, оптимизируют для экспрессии Е. coli, т.е. она содержит кодоны кодирующей последовательности, оптимальные для экспрессии в Е. coli, выбранные из возможных вариантов последовательностей, известных на уровне техники. Более того, экспрессирующий вектор содержит описанные выше элементы, подходящие для Е. coli, связанные с кодирующей последовательностью. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок по изобретению, оптимизированную для экспрессию в Е. coli, выбрана из группы полинуклеотидных последовательностей,состоящей из: SEQ. No. 29; SEQ. No. 30; SEQ. No. 31; SEQ. No. 32; SEQ. No. 33, SEQ. No. 34; SEQ. No. 35; SEQ. No. 36; SEQ. No. 37; SEQ. No. 38; SEQ. No. 39; SEQ. No. 40; SEQ. No. 41, SEQ. No. 42; SEQ. No. 43; SEQ. No. 48 и SEQ. No. 49; которые кодируют слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, соответственно: SEQ. No. 1; SEQ. No. 2; SEQ. No. 3; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 7; SEQ. No. 8; SEQ. No. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11, SEQ. No. 12,SEQ. No. 13; SEQ. No. 14 и SEQ. No. 15; SEQ. No. 44 и SEQ. No. 45. В предпочтительном варианте осу-9 024452 ществления изобретение также относится к экспрессирующему вектору, подходящему для трансформации Е. coli, содержащему полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы полинуклеотидных последовательностей с SEQ. No. 29 по SEQ. No. 43, SEQ. No. 48 и SEQ. No. 49, указанных выше,а также к клетке Е. coli, трансформированной таким экспрессирующим вектором. Трансформацию, т.е. введение последовательности ДНК в бактериальные клетки-хозяева, в частности, Е. coli, обычно проводят на компетентных клетках, подготовленных к захвату ДНК, например, путем обработки ионами кальция при низкой температуре (4 С), а затем воздействия теплового шока (при 3742 С) или электропорации. Такие способы хорошо известны и обычно определяются изготовителем экспрессирующей системы или описаны в литературе или лабораторных практикумах, таких как Maniatis et al.,Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982). Методика сверхэкспрессии слитых белков по изобретению в экспрессирующей системе Е. coli дополнительно описана ниже. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, как определено выше, в качестве активного ингредиента и подходящий фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и общепринятые вспомогательные компоненты. Фармацевтическая композиция содержит эффективное количество слитого белка по изобретению и фармацевтически приемлемые вспомогательные компоненты, растворенные или диспергированные в носителе или разбавителе, и предпочтительно она находится в форме фармацевтической композиции, составленной в единичной дозированной форме, или состава, содержащего множество доз. Фармацевтические формы и способы их составления, а также другие компоненты, носители и разбавители, известны специалисту в данной области и описаны в литературе. Например, они описаны в монографии Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA. Термины "фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и вспомогательный ингредиент" включают любые растворители, дисперсионные среды, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, стабилизаторы, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства),обеспечивающие изотоничность средства, известные в данной области. Фармацевтическая композиция по изобретению может содержать различные типы носителей, разбавителей и эксципиентов, в зависимости от выбранного пути введения и выбранной дозированной формы, такой как жидкие, твердые и аэрозольные формы для перорального, парентерального, ингаляционного, местного введения, и от того,должна ли выбранная форма быть стерильной для данного пути введения, такого как инъекция. Предпочтительным путем введения фармацевтической композиции в соответствии с изобретением является парентеральный, в том числе инъекционный, путь, такой как внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, внутриопухолевый, или с помощью однократных или непрерывных внутривенных инфузий. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить путем инъекции непосредственно в опухоль. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить внутривенно. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить подкожно или внутрибрюшинно. Фармацевтическая композиция для парентерального введения может представлять собой раствор или дисперсию в фармацевтически приемлемой водной или неводной среде, забуференной до соответствующего значения рН и изоосмотической с жидкостями организма, если необходимо, и она может содержать антиоксиданты,буферы, бактериостатические средства и растворимые вещества, которые делают композицию совместимой с тканями или кровью реципиента. Другими компонентами, которые могут быть включены в композицию, являются, например, вода, спирты, такие как этанол, полиолы, такие как глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль, липиды, такие как триглицериды, растительные масла, липосомы. Надлежащая текучесть и размер частиц вещества могут быть обеспечены с помощью покровных веществ, таких как лецитин, и поверхностно-активные вещества, такие как гидроксипропилцеллюлоза, полисорбаты и т.п. Подходящие обеспечивающие изотоничность средства для жидких парентеральных композиций представляют собой, например, сахара, такие как глюкоза и хлорид натрия, и их комбинации. Альтернативно фармацевтическая композиция для введения путем инъекции или инфузий может быть в форме порошка, такого как лиофилизированный порошок для восстановления непосредственно перед применением в подходящем носителе, например, таком как стерильная свободная от пирогенов вода. Фармацевтическая композиция по изобретению для парентерального введения также может иметь форму для назального введения, включая растворы, спреи или аэрозоли. Предпочтительно, форма для интраназального введения представляет собой водный раствор и является изотонической или забуференной для поддержания рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5, так чтобы поддерживать свойства, сходные с носовыми секретами. Более того, она содержит консерванты или стабилизаторы, такие как в хорошо известных интраназальных препаратах. Композиция может содержать различные антиоксиданты, которые замедляют окисление одного или- 10024452 нескольких компонентов. Более того, для предупреждения действия микроорганизмов, композиция может содержать различные антибактериальные и противогрибковые средства, включая, например и не ограничиваясь ими, парабены, хлорбутанол, тимеросал, сорбиновую кислоту, и сходные известные вещества этого типа. Как правило, фармацевтическая композиция по изобретению может включать, например, по меньшей мере приблизительно 0,01 мас.% активного ингредиента. Более конкретно, композиция может содержать активный ингредиент в количестве от 1 до 75% по массе единицы композиции,или например, от 25 до 60% по массе, но она не ограничивается этими указанными величинами. Истинную величину дозы композиции в соответствии с настоящим изобретением, вводимой пациентам, в том числе человеку, могут определять физические и физиологические факторы, такие как масса тела, тяжесть состояния, тип подвергаемого лечению заболевания, предшествующее или сопутствующее терапевтическое вмешательство, пациент и путь введения. Подходящую единичную дозу, общую дозу и концентрацию активного ингредиента в композиции должен определять лечащий врач. Композицию, например, можно вводить в дозе от приблизительно 1 мкг/кг массы тела до приблизительно 1000 мг/кг массы тела пациента, например в диапазоне от 5 мг/кг массы тела до 100 мг/кг массы тела или в диапазоне от 5 мг/кг массы тела до 500 мг/кг массы тела. Слитый белок и композиции, содержащие его, являются противораковыми или противоопухолевыми, и их можно использовать для лечения раковых заболеваний. Также изобретение относится к применению слитого белка по изобретению, как определено выше, для лечения онкологических заболеваний у млекопитающих, в том числе у человека. Также изобретение относится к способу лечения раковых заболеваний у млекопитающих, в том числе человека, включающему введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, эффективное против рака количество слитого белка по изобретению, как определено выше, необязательно в форме соответствующей фармацевтической композиции. Слитый белок по изобретению можно использовать для лечения гематологических рака, таких как лейкоз, гранулематоз, миелома, и других гематологических рака. Слитый белок также можно использовать для лечения солидных опухолей, таких как рак молочной железы, рак легкого, в том числе немелкоклеточный рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак почки, рак головного мозга и т.п. Подходящим путем введения слитого белка при лечении рака, в частности, является парентеральный путь, который состоит во введении слитого белка по изобретению в форме инъекций или инфузий, в композиции и форме, подходящих для этого пути введения. Изобретение описано более подробно с помощью следующих общих методик и примеров конкретных слитых белков. Общая методика для сверхэкспрессии слитого белка Получение плазмиды Аминокислотную последовательность заданного слитого белка использовали в качестве матрицы для получения кодирующей его последовательности ДНК, содержащей кодоны, оптимизированные для экспрессии в Escherichia coli. Такая методика позволяет увеличить эффективность следующей стадии синтеза заданного белка в Escherichia coli. Затем полученную нуклеотидную последовательность синтезировали автоматически. Кроме того, к полученному гену, кодирующему заданный белок, добавляли участки расщепления ферментов рестрикции NdeI (на 5'-конце ведущей цепи) и XhoI (на 3'-конце ведущей цепи). Их использовали для клонирования гена в вектор рЕТ 28 а (Novagen). Также их можно использовать для клонирования белка в другие векторы. Заданный белок, экспрессированный с этой конструкции, необязательно может иметь на N-конце полигистидиновую метку(шесть остатков гистидина), которой предшествует участок, распознаваемый тромбином, который впоследствии служит для очистки аффинной хроматографией. Правильность полученной конструкции подтверждали сначала рестрикционным анализом выделенных плазмид с использованием ферментов NdeLI и XhoI, a затем автоматическим секвенированием всей рамки считывания белка-мишени. Праймеры, использованные для секвенирования, были комплементарны последовательностям промотора Т 7 (5'TAATACGACTCACTATAGG-3') и терминатора Т 7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'), присутствующим в векторе. Полученную плазмиду использовали для сверхэкспрессии заданного слитого белка в коммерческом штамме Е. coli, который трансформировали в соответствии с рекомендациями изготовителя. Колонии, полученные на селективной среде (агар LB, канамицин 50 мкг/мл, 1% глюкоза), использовали для получения ночной культуры в жидкой среде LB, дополненной канамицином (50 мкг/мл) и 1% глюкозой. После выращивания в течение приблизительно 15 ч во вращающемся инкубаторе, культуры использовали для инокуляции соответствующей культуры. Сверхэкспрессия и очистка слитых белков - общая методика А Среду LB с канамицином (30 мкг/мл) и 100 мкМ. сульфатом цинка инокулировали ночной культурой. Культуру инкубировали при 37 С до тех пор, пока оптическая плотность (OD) при 600 нм не достигала 0,60-0,80. Затем добавлялиIPTG до конечной концентрации в диапазоне 0,25-1 мМ. После инкубации (3,5-20 ч) с вращением при 25 С культуру центрифугировали в течение 25 мин при 6000 g. Бактериальные осадки ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 10 мМ имидазол, рН 7,4. Суспензию обрабатывали ультразвуковым облучением на льду в течение 8 мин (амплитуда 40%, 15-секундный импульс, интервал- 11024452 10 с). Полученный экстракт очищали центрифугированием в течение 40 мин при 20000 g, 4 С. Смолу NiSepharose (GE Healthcare) предварительно обрабатывали буфером для уравновешивания, который использовали для получения экстракта бактериальных клеток. Затем смолу инкубировали в течение ночи при 4 С с супернатантом, полученным после центрифугирования экстракта. Затем ее помещали в хроматографическую колонку и промывали от 15 до 50 объемами буфера из 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазола, рН 7,4. Полученный белок элюировали с колонки с использованием градиента имидазола в 50 мМ буфере KH2PO4 с 0,5 М NaCl, рН 7,4. Полученные фракции анализировали с помощью SDS-PAGE. Соответствующие фракции объединяли и подвергали диализу в течение ночи при 4 С против 20 мМ Trisбуфера, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 500 мМ L-аргинина, 0,1 мМ ZnSO4, 0,01% Tween 20, и в то же время 10Histag отщепляли тромбином (1:50). После отщепления тромбин отделяли от заданного слитого белка с использованием смолы Benzamidine Sepharose. Чистоту продукта анализировали с помощью SDSPAGE электрофореза (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982). Сверхэкспрессия и очистка слитых белков - общая методика В Среду LB с канамицином (30 мкг/мл) и 100 мкМ сульфатом цинка инокулировали ночной культурой. Культуру инкубировали при 37 С до тех пор, пока оптическая плотность (OD) при 600 нм не достигала 0,60-0,80. Затем добавлялиIPTG до конечной концентрации в диапазоне 0,5-1 мМ. После инкубации в течение 20 ч с вращением при 25 С культуру центрифугировали в течение 25 мин при 6000 g. Бактериальные клетки после сверхэкспрессии разрушали в French Press в буфере, содержавшем 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 10 мМ имидазол, 5 мМ бета-меркаптоэтанол, 0,5 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид), рН 7,8. Полученный экстракт очищали центрифугированием в течение 50 минут при 8000 g. Полученный супернатант инкубировали в течение ночи со смолой Ni-Sepharose. Затем смолу со связанным белком помещали в хроматографическую колонку. Для смыва фракций, содержавших не связывающиеся белки, колонку промывали от 15 до 50 объемами буфера из 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 10 мМ имидазола, 5 мМ бета-меркаптоэтанола, 0,5 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид), рН 7,8. Затем, для смыва большинства белков, специфично связывающихся с подложкой, колонку промывали буфером, содержащим 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl,500 мМ имидазол, 10% глицерин, 0,5 мМ PMSF, рН 7,5. Полученные фракции анализировали с помощьюSDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982). Фракции, содержавшие заданный белок, объединяли и расщепляли тромбином (1 Е на 4 мг белка, 8 ч при 16 С) для удаления полигистидиновой метки. Затем фракции подвергали диализу против буфера для составления (500 мМ Lаргинин, 50 мМ Tris, 2,5 мМ ZnSO4, рН 7,40). Пример 1. Слитый белок SEQ. No. 1. Белок SEQ. No. 1 представляет собой слитый белок, имеющий длину 345 аминокислот и массу 39,8 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL122-281 присоединена субъединица 2b интерферона-альфа человека из 165-аминокислот (SEQ. No. 17) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL последовательно включены рядом друг с другом участки расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA(SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 1 и SEQ. No. 29, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 1 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 29. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штаммов Е. coli BL21 (DE3) и Tuner(DE3)pLysS отNovagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой,описанной выше. Пример 2. Слитый белок SEQ. No. 2. Белок SEQ. No. 2 представляет собой слитый белок, имеющий длину 347 аминокислот и массу 40 кДа, в котором к С-концу последовательности TRAIL120-281 присоединена субъединица 2b интерферона-альфа человека из 165 аминокислот (SEQ. No. 17) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL последовательно включены рядом друг с другом последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 2 и SEQ. No. 30, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 2 со структурой, описанной выше, использовали в- 12024452 качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 30. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. coli BL21 (DE3) от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 3. Слитый белок SEQ. No. 3. Белок SEQ. No. 3 представляет собой слитый белок, имеющий длину 352 аминокислоты и массу 40,4 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL122-281 присоединена субъединица 2b интерферона-альфа человека из 165 аминокислот (SEQ. No. 17) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL включены две комбинации последовательностей участков расщепления протеазами, распознаваемыми металлопротеазой MMP (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между этим двумя комбинациями SEQ. No. 20 иSEQ. No. 21 слитый белок, кроме того, включает линкер для пегилирования (SEQ. No. 22). Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 3 и SEQ. No. 31, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 3, представленную выше использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No 31, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. coli BL21 (DE3) от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 4. Слитый белок SEQ. No. 4. Белок SEQ. No. 4 представляет собой слитый белок, имеющий длину 353 аминокислоты и массу 40,5 кДа, в котором к С-концу последовательности TRAIL121-281 присоединена субъединица 2b интерферона-альфа человека из 165 аминокислот (SEQ. No. 17) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL включены две комбинации последовательностей участков расщепления протеазами, распознаваемых металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназойuPA (SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между этими двумя комбинациями SEQ. No. 20 иSEQ. No. 21 слитый белок дополнительно включает линкер для пегилирования (SEQ. No. 22). Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 4 и SEQ. No. 32, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 4, представленную выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No 32, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. coli BL21DE3pLysSRIL отStratagene и Е. coli Tuner (DE3) от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 5. Слитый белок SEQ. No. 5. Белок SEQ. No. 5 представляет собой слитый белок, имеющий длину 300 аминокислот и массу 34,7 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (SEQ. No. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21). Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 5 и SEQ. No. 33, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 5 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 33. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. coli Tuner (DE3) от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше.- 13024452 Пример 6. Слитый белок SEQ. No. 6. Белок SEQ. No. 6 представляет собой слитый белок, имеющий длину 307 аминокислот и массу 35,1 кДа, в котором к С-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (SEQ. No. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21). Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер (SEQ. No. 27) между последовательностью TRAIL и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицинсериновый (SEQ. No. 28) между участком расщепления урокиназой uPa и эффекторной последовательностью. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 6 и SEQ. No. 34, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 6 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 34. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. coli Tuner(DE3) от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 7. Слитый белок SEQ. No. 7. Белок SEQ. No. 7 представляет собой слитый белок, имеющий длину 310 аминокислот и массу 35,5 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (SEQ. No. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21). Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер SEQ. No. 26 между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицин-сериновый линкер SEQ. No. 26 между участком расщепления урокиназой uPa и последовательностью TRAIL. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 7 и SEQ. No. 35, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 7 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 35. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. coli Tuner(DE3) от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 8. Слитый белок SEQ. No. 8. Белок SEQ. No. 8 представляет собой слитый белок, имеющий длину 310 аминокислот и массу 35,3 кДа, в котором к С-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (SEQ. No. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No, 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21). Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР/ и гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между участком расщепления урокиназой uPa и последовательностью TRAIL. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 8 и SEQ. No. 36, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 8 со структурой, описанной выше использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 36. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. coli Tuner(DE3) от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 9. Слитый белок SEQ. No. 9. Белок SEQ. No. 9 представляет собой слитый белок, имеющий длину 317 аминокислот и массу 35,9- 14024452 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен фрагмент интерферона-гамма человека (SEQ. No. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL включена комбинация участков расщепления протеазами, распознаваемых металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. МеждуSEQ. No. 20 и SEQ. No. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (SEQ. No. 22). Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между участком расщепления урокиназой uPa и последовательностью TRAIL. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 9 и SEQ. No. 37, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 9 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 37. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штамма Е. coli Rosetta (DE3) от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 10. Слитый белок SEQ. No. 10. Белок SEQ. No. 10 представляет собой слитый белок, имеющий длину 338 аминокислот и массу 38,3 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL95-281 присоединен фрагмент интерферонагамма человека (SEQ. No. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL слитый белок содержит последовательности участков расщепления протеазами,распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Рядом с SEQ. No. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (SEQ. No. 22). Белок также содержит гибкие линкеры: между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26); и между линкером для пегилирования и последовательностью TRAIL гибкий глицин-сериновый линкерGSGGG (SEQ. No. 26). Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 10 и SEQ. No. 38, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 10 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 38. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штаммов Е. coli BL21 (DE3) и Tuner(DE3)pLysS отNovagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой,описанной выше. Пример 11. Слитый белок SEQ. No. 11. Белок SEQ. No. 11 представляет собой слитый белок, имеющий длину 317 аминокислот и массу 35,9 кДа, в котором к С-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен фрагмент интерферонагамма человека (SEQ. No. 18) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между SEQ. No. 20 и SEQ. No. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (SEQ. No. 22). Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между участком расщепления урокиназой uPa и последовательностью TRAIL. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 2 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 11 и SEQ. No. 39, как показано в прилагаемом списке последовательностей.- 15024452 Аминокислотную последовательность SEQ. No. 11 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 39. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штаммов Е. coli BL21 (DE3) и Е. coli Tuner(DE3)pLysS от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой,описанной выше. Пример 12. Слитый белок SEQ. No. 12. Белок SEQ. No. 12 представляет собой слитый белок, имеющий длину 449 аминокислот и массу 51,8 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-гамма человека (SEQ. No. 19) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21),благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР; и гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между участком расщепления урокиназой uPa и последовательностью TRAIL. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 3 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 12 и SEQ. No. 40, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 12 со структурой, описанной выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 40. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой А, с использованием штаммов Е. coli BL21 (DE3) и Е. coli Tuner(DE3)pLysS от Novagen. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой,описанной выше. Пример 13. Слитый белок SEQ. No. 13. Белок SEQ. No. 13 представляет собой слитый белок, имеющий длину 44 9 аминокислот и массу 51,8 кДа, в котором к С-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-гамма человека (SEQ. No. 19) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL последовательно встроены последовательности участков распознавания протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA(SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления урокиназой uPa; и гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между участком расщепления металлопротеазой ММР и последовательностью TRAIL. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 3 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 13 и SEQ. No. 41, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 13, представленную выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No 41, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. coli В.21 (DE3) от Novagen и Е.coli L21DE3pLysSRIL от Stratagene. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 14. Слитый белок SEQ. No. 14 Белок SEQ. No. 14 представляет собой слитый белок, имеющий длину 456 аминокислот и массу 52,4 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-гамма человека (SEQ. No. 19) в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью TRAIL встроены последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между последовательностями SEQ. No. 20 и SEQ. No. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (SEQ. No. 22).- 16024452 Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления урокиназой uPa; и гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между участком расщепления металлопротеазой ММР и последовательностью TRAIL. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 3 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 14 и SEQ. No. 42, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 14, представленную выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No 42, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. coli В.21 (DE3) от Novagen и штамма Е. coli BL21DE3pLysSRIL от Stratagene. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 15. Слитый белок SEQ. No. 15. Белок SEQ. No. 15 представляет собой слитый белок, имеющий длину 456 аминокислот и массу 52,4 кДа, в котором к С-концу последовательности TRAIL116-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-гамма человека (SEQ. No. 19) в качестве эффекторного пептида. Между последовательностью TRAIL и эффекторным пептидом слитый белок содержит последовательности участков расщепления протеазами, распознаваемые металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ.No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между последовательностями SEQ. No. 20 и SEQ. No. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (SEQ. No. 22). Белок также содержит гибкие линкеры: гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления урокиназой uPa; и гибкий глицин-сериновый линкер GSGGG (SEQ. No. 26) между участком расщепления металлопротеазой ММР и последовательностью TRAIL. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 3 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 15 и SEQ. No. 43, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 15, представленную выше, использовали в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 43, представленной выше. Получали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли свехэкспрессию слитого белка в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. coli В.21 (DE3) от Novagen и штамма Е. coli L21DE3pLysSRIL от Stratagene. Разделение белка проводили с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 16. Слитый белок SEQ. No. 44. Белок SEQ. No. 44 представляет собой слитый белок, имеющий длину 538 аминокислот и массу 62,4 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL122-281 присоединен одноцепочечный псевдодимер интерферона-альфа 2b человека (SEQ. No. 46) в качестве эффекторного пептида. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью TRAIL встроены две комбинации последовательностей участков расщепления протеазами, распознаваемых металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между двумя комбинациями последовательностей SEQ. No. 20 и SEQ. No. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования (SEQ. No. 22). Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 4 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 44 и SEQ. No. 48, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 44, представленную выше, используют в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No. 48, представленной выше. Можно получать плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и сверхэкспрессию слитого белка можно осуществлять в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию можно осуществлять в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. coli В.21 (DE3) от Novagen и штамма Е. coli L21DE3pLysSRIL от Stratagene. Разделение белка можно проводить с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 17. Слитый белок SEQ. No. 45. Белок SEQ. No. 45 представляет собой слитый белок, имеющий длину 384 аминокислоты и массу 44- 17024452 кДа, в котором к N-концу последовательности TRAIL95-281 присоединена консенсусная последовательность интерферона-альфа человека (SEQ. No. 47) в качестве эффекторного пептида. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью TRAIL встроены две комбинации последовательностей участков расщепления протеазами, распознаваемых металлопротеазой ММР (SEQ. No. 20) и урокиназой uPA (SEQ. No. 21), благодаря которым эффекторный пептид будет подвергаться расщеплению в опухолевом окружении при интернализации слитого белка. Между комбинациями последовательностей SEQ. No. 20 и SEQ. No. 21 слитый белок дополнительно содержит линкер для пегилирования(SEQ. No. 22). Белок также содержит гибкий глицин-сериновый линкер GGSG (SEQ. No. 50) между последовательностью эффекторного пептида и участком расщепления металлопротеазой ММР. Структура слитого белка схематично представлена на фиг. 4 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. coli, представляют собой, соответственно, SEQ. No. 45 и SEQ. No. 49, как показано в прилагаемом списке последовательностей. Аминокислотную последовательность SEQ. No. 45, представленную выше, используют в качестве матрицы для получения ее кодирующей последовательности ДНК SEQ. No 49, представленной выше. Можно получать плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и сверхэкспрессию слитого белка можно осуществлять в соответствии с общими методиками, описанными выше. Сверхэкспрессию можно осуществлять в соответствии с общей методикой В, с использованием штамма Е. coli В.21 (DE3) от Novagen и штамма Е. coli L21 DE3pLysSRIL от Stratagene. Разделение белка можно проводить с помощью электрофореза в соответствии с общей методикой, описанной выше. Пример 18. Исследование противоопухолевой активности слитых белков. Исследование противоопухолевой активности слитых белков проводили in vitro в анализе цитотоксичности на опухолевых клеточных линиях и in vivo у мышей. Для целей сравнения использовали белокrhTRAIL114-281 и плацебо. 1. Измерение кругового дихроизма. Качество препаратов слитых белков с точки зрения их структуры определяли с помощью кругового дихроизма (CD) для соединений примера 3, примера 5, примера 12 и примера 14. Круговой дихроизм используют для определения вторичных структур и конформации белка. В способе CD используется оптическая активность белковых структур, проявляющаяся во вращении плоскости поляризации света и появлении эллиптической поляризации. Спектр CD белков в дальней ультрафиолетовой области (УФ) обеспечивает точные данные о конформации главной полипептидной цепи. Образцы белка, подлежащие анализу после составления в буфере, состоящем из 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 100 мМ NaCl, 10% глицерина, 0,1 мМ ZnCl2, 80 мМ сахарозы, 5 мМ DTT подвергали диализу в мешках для диализа (Sigma-Aldrich) с пределом 12 кДа. Диализ проводили против 100-кратного избытка(об./об.) буфера по сравнению с белковыми препаратами при перемешивании в течение нескольких часов при 4 С. После завершения диализа каждый препарат центрифугировали (25000 об./мин, 10 мин, 4 С) и соответствующие супернатанты собирали. Концентрацию белка в образцах, полученных таким образом,определяли способом Брэдфорд. Измерение кругового дихроизма для белков в диапазоне концентраций 0,1-2,7 мг/мл проводили на спектрополяриметре Jasco J-710 в кварцевой кювете с оптическим путем 0,2 мм или 1 мм. Измерение проводили в потоке азота со скоростью 7 л/мин, который позволял проводить измерение в диапазоне длин волн от 195 до 250 нм. Параметры измерения: спектральное разрешение - 1 нм; половина ширины пучка света 1 нм; чувствительность 20 мград, среднее время для одной длины волны - 8 с, скорость сканирования 10 нм/мин. Результаты представлены в качестве среднего значения для трех измерений. Спектры кругового дихроизма для rhTRAIL114-281, rhTRAIL95-281 и белков примера 12, примера 5, примера 3 и примера 14 представлены на фиг. 5. Полученные спектры анализировали в численном виде в диапазоне 193-250 нм с использованием программного обеспечения CDPro. Точки, для которых напряжение на фотоумножителе превышало 700 В, пропускали, вследствие слишком низкого соотношения сигнала к шуму при этом диапазоне длин волн. Полученные данные служили для вычисления содержания конкретных вторичных структур с использованием программного обеспечения CDPro (табл. 1).- 18024452 Таблица 1 Содержание вторичных структур в анализируемых белках величина, полученная, исходя из кристаллической структуры 1D4V Контроли (rhTRAIL114-281 и rhTRAIL95-281) демонстрируют спектр CD, характерный для белков с преобладанием структур типа -слоя (резко очерченный минимум эллиптичности при длине волны 220 нм). Это подтверждает вычисление компонентов вторичной структуры, которое указывает на минимальное количество элементов -спирали. Полученный результат также согласуется с данными о кристаллической структуре белка TRAIL,где бета-элементы составляют более половины его состава. В случае слитых белков согласно примеру 3, примеру 5, примеру 12 и примеру 14, спектры кругового дихроизма характеризуются двумя минимумами при длинах волн 208 и 220 нм, что характерно для белков со смешанной вторичной структурой типа альфа/бета. Молекулы интерферона, присоединенные кTRAIL в слитых белках, образуют, главным образом, альфа-спиральные структуры, таким образом, смешанный характер вторичных структур в анализируемых химерных белках может подтвердить присутствие надлежащим образом свернутых элементов как TRAIL, так и интерферона. В случае препаратов согласно примеру 3 и примеру 14, было выявлено практически 100% структур альфа-типа. Такое содержание структур альфа-типа является следствием узкого диапазона длин волн,используемых в анализе, что является следствием выбора составов, оптимальных для способов и материалов (высокое количество шума в дальней УФ-области). Отсутствие остро очерченного диапазона 180200 нм в анализируемой области спектра может привести к тому, что содержание структур -спирали будет переоцененным. 2. Исследования на клеточных линиях in vitro. Клеточные линии Таблица 2. Прикрепляющиеся клетки МТТ-тест цитотоксичности Анализ с МТТ представляет собой колориметрический анализ, используемый для измерения пролиферации, жизнеспособности и цитотоксичности клеток. Он состоит в разложении желтой соли тетразолия МТТ (4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) до нерастворимого в воде фиолетового красителя формазана под действием митохондриального фермента сукцинат-тетразолий редуктазы 1. Восстановление МТТ происходит только в живых клетках. Анализ данных состоит в определении концентрации IC50 белка (в нг/мл), при которой происходит 50% снижение количества клеток в обработанной популяции по сравнению с контрольными клетками. Результаты анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0. Тест проводили в соответствии с описанием в литературеOncol, 34(4), 176-183). Клеточную культуральную среду разбавляли до определенной плотности (104-105 клеток на 100 мкл). Затем 100 мкл соответствующим образом разбавленной суспензии клеток наносили в 96-луночный планшет в трех экземплярах. Полученные таким образом клетки инкубировали в течение 24 ч при 37 С в 5 или 10% СО 2, в зависимости от использованной среды, а затем к клеткам (в 100 мкл среды) добавляли дополнительные 100 мкл среды, содержащей различные концентрации исследуемых белков. После инкубации клеток с исследуемыми белками в течение следующих 72 ч, что эквивалентно делению клеток 3-4 раза, в среду с исследуемым белком добавляли 20 мл рабочего раствора МТТ [5 мг/мл],и инкубацию продолжали в течение 3 ч при 37 С в 5% СО 2. Затем среду с раствором МТТ удаляли, и кристаллы формазана растворяли добавлением 100 мкл DMSO. После перемешивания измеряли поглощение при 570 нм (эталонный фильтр 690 нм). Тест цитотоксичности с EZ4U Тест EZ4U (Biomedica) использовали для исследования цитотоксической активности белков в не прикрепляющихся клеточных линиях. Этот тест является модификацией МТТ, где формазан, образующийся при восстановлении соли тетразолия, является растворимым в воде. Исследование жизнеспособности клеток проводили после непрерывной инкубации клеток в течение 72 часов с белком (семь концентраций белка, каждый в трех экземплярах). Исходя из этого, определяли величины IC50 (в качестве среднего значения для двух независимых экспериментов) с использованием программного обеспеченияGraphPad Prism 5. Результаты тестов цитотоксичности in vitro обобщенно представлены в табл. 4 и в табл. 5 в качестве величин IC50 (нг/мл), которые соответствуют концентрации белка, при которой наблюдают цитотоксический эффект слитых белков на уровне 50% относительно контрольных клеток, обработанных только растворителем. Каждый эксперимент соответствует средней величине по меньшей мере двух независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах. В качестве критерия отсутствия активности препаратов белков, был принят предел IC50 2000 нг/мл. Слитые белки с величиной IC50 выше 2000 считали неактивными. Клетки для этого теста отбирали так, чтобы они включали опухолевые клеточные линии, естественным образом устойчивые к белку TRAIL (критерий естественной устойчивости к TRAIL: IC50 для белка TRAIL2000), опухолевые клеточные линии, чувствительные к белку TRAIL, и устойчивую к доксорубицину линию MES-SA/DX5 в качестве линии раковых клеток, устойчивой к общепринятым средствам для лечения рака. Недифференцированную клеточную линию HUVEC использовали в качестве клеточной линии здорового контроля для оценки эффекта/токсичности слитых белков в нераковых клетках. Полученные результаты подтверждают возможность преодоления устойчивости клеточных линий к TRAIL путем введения определенных слитых белков по изобретению в клетки, естественным образом устойчивые кTRAIL. Когда слитые белки по изобретению вводили в клетки, чувствительные к TRAIL, в некоторых случаях наблюдали явное и существенное усиление мощности действия, проявляющееся в сниженных величинах IC50 слитого белка по сравнению с IC50 для TRAIL отдельно. Более того, была достигнута цитотоксическая активность слитого белка по изобретению в клетках, устойчивых к классическому средству против рака доксорубицину, и в некоторых случаях она была сильнее активности TRAIL отдельно.- 20024452 Величины IC50 выше 2000, полученные для нераковых клеточных линий, демонстрируют отсутствие токсических эффектов, ассоциированных с использованием белков по изобретению, для здоровых клеток, что указывает на потенциальную низкую системную токсичность белка. Определение цитотоксической активности выбранных препаратов белков против расширенной панели опухолевых клеточных линий В табл. 5 представлены результаты исследований цитотоксической активности in vitro для выбранных слитых белков по изобретению против широкой панели опухолевых клеток из различных органов,соответствующих широкому диапазону большинства распространенных типов рака. Полученные величины IC50 подтверждают высокую цитотоксическую активность слитых белков и,таким образом, их потенциальную применимость при лечении рака. Таблица 4. Цитотоксическая активность слитых белков по изобретению Таблица 5. Анализ цитотоксической активности выбранных препаратов белков против широкой панели опухолевых клеточных линий 2. Противоопухолевая эффективность слитых белков in vivo на ксенотрансплантатах. Противоопухолевую активность препаратов белков исследовали в модели на мышах с клетками рака толстого кишечника человека НСТ 116. Клетки Клетки НСТ 116 поддерживали в среде RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, США), смешанными в соотношении 1:1 с Opti-MEM (Invitrogen, каталожный номер 22600-134), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамина. В день трансплантации мышам клетки открепляли от подложки путем промывания клеток трипсином (Invitrogen), затем клетки центрифугировали при 1300 об./мин., 4 С, 8 мин., суспендировали в буфере HBSS (среда Хенкса), подсчитывали и разбавляли до концентрации 25106 клеток/мл. Клетки PLC/PRF/5 (CLS) поддерживали в DMEM (HyClone, Logan, UT, США), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамина. В день трансплантации мышам клетки открепляли от подложки путем промывания трипсином (Invitrogen), затем клетки центрифугировали при 1300 об./мин., 4 С, 8 мин., суспендировали у буфере HBSS (среда Хенкса), подсчитывали и разбавляли до концентрации 25106 клеток/мл. Клетки HepG2 поддерживали в MEM (HyClone, Logan, UT, США), дополненной 10% эмбриональ- 21024452 ной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамина. В день трансплантации мышам клетки открепляли от подложки путем промывания трипсином (Invitrogen), затем клетки центрифугировали при 1300 об./мин.,4 С, 8 мин., суспендировали у буфере HBSS (среда Хенкса), подсчитывали и разбавляли до концентрации 25106 клеток/мл. Мыши Исследование противоопухолевой активности белков по изобретению проводили у мышей CD-nude в возрасте 7-9 недель (Crl:CDl-Foxn1nu 1) или у мышей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr в возрасте 4-5 недель, полученных от Charles River Germany. Мышей содержали в специализированных свободных от патогенов условиях со свободным доступом к пище и деминерализованной воде (без ограничений). Все эксперименты на животных проводили в соответствии с руководством: "Interdisciplinary Principles and GuidelinesAd Hoc Committee on Animal Research и они были добраны approved IV Local Ethics Committee on AnimalExperimentation in Warsaw (No. 71/2009). Ход экспериментов и оценка Модель рака толстого кишечника человека мыши Crl:CD1-Foxn1nu 1. На 0 сутки мышам Crl:CD1-Foxn1nu 1 подкожно (п/к) трансплантировали в правый бок 5106 клеток НСТ 116, суспендированных в 0,2 мл буфера HBSS с помощью шприца с иглой 0,525 мм (Bogmark). Когда опухоли достигали размера 50-140 мм 3 (14 сутки), мышей случайным образом, распределяли с получением среднего размера опухолей в группе 70 мм 3 и приписывали к группам введения. В группах введения вводили препараты слитых белков по изобретению согласно примеру 3, примеру 12 и примеру 14 (10 мг/кг), и rhTRAIL114-281 (10 мг/кг) в качестве сравнения и буфер для составления (5 мМNaH2PO4, 95 мМ Na2HPO4, 200 мМ NaCl, 5 мМ глутатион, 0,1 мМ ZnCl2, 10% глицерин, 80 мМ сахароза,рН 8,0) в качестве контроля. Препараты вводили внутривенно (в/в) каждые сутки в течение десяти суток на 8-12 сутки и 15-19 сутки. Когда группа введения достигала среднего размера опухоли 1000 мм 3, мышей умерщвляли путем разрушения спинного мозга. В контрольной группе вводили rhTRAIL114-281. Мыши Crl:SHO-PrkdcscidHrhr На 0 сутки мышам Crl:SHO-PrkdcscidHrhr подкожно (п/к) трансплантировали в правый бок 5106 клеток НСТ 116, суспендированных в 0,1 мл буфера HBSS с помощью шприца с иглой 0,525 мм (Bogmark). Когда опухоли достигали размера 200-700 мм 3 (18 сутки), мышей случайным образом, распределяли с получением среднего размера опухолей в группе 400 мм 3 и приписывали к группам введения. В группах введения вводили препараты слитых белков по изобретению согласно примеру 14 (50 мг/кг), иrhTRAIL114-281 (20 мг/кг) в качестве сравнения и буфер для составления (5 мМ NaH2PO4, 95 мМNa2HPO4, 200 мМ NaCl, 5 мМ глутатион, 0,1 мМ ZnCl2, 10% глицерин, 80 мМ сахароза, рН 8,0) в качестве контроля. Препараты вводили внутривенно (в/в) 6 введений один раз в двое суток. На 32 сутки эксперимента мышей умерщвляли путем разрушения спинного мозга. Модель рака печени человека Клетки PLC/PRF/5 На 0 сутки мышам Crl:SHO-PrkdcscidHrhr подкожно (п/к) трансплантировали в правый бок 7106 клеток PLC/PRF/5, суспендированных в смеси буфер НВSS:матригель (3:1) объемом 0,1 мл с помощью шприца с иглой 0,525 мм (Bogmark). Когда опухоли достигали размера 140-300 мм 3 (31 сутки), мышей случайным образом распределяли с получением среднего размера опухолей в группе 200 мм 3 и приписывали к группам введения. В группах введения вводили препараты слитых белков по изобретению согласно примеру 14 (20 мг/кг) и rhTRAIL114-281 (30 мг/кг) в качестве сравнения и буфера для составления (5 мМ NaH2PO4, 95 мМ Na2HPO4, 200 мМ NaCl, 5 мМ глутатион, 0,1 мМ ZnCl2, 10% глицерин, 80 мМ сахароза, рН 8,0) в качестве контроля. Препараты вводили внутривенно (в/в) по следующей схеме: 4 введения раз в трое суток, а затем 2 введения раз в двое суток (q3d4 и q2d2). На 32 сутки эксперимента мышей умерщвляли путем разрушения спинного мозга. Клетки HepG2 На 0 сутки мышам Crl:SHO-PrkdcscidHrhr подкожно (п/к) трансплантировали в правый бок 7106 клеток HepG2, суспендированных в смеси буфер HBSS:матригель (3:1) объемом 0,1 мл с помощью шприца с иглой 0,525 мм (Bogmark). Когда опухоли достигали размера 250-390 мм 3 (19 сутки), мышей случайным образом, распределяли с получением среднего размера опухолей в группе 330 мм 3 и приписывали к группам введения. В группах введения вводили препараты слитых белков по изобретению согласно примеру 14 (50 мг/кг) и rhTRAIL114-281 (30 мг/кг) в качестве сравнения и буфера для составления (5 мМNaH2PO4, 95 мМ Na2HPO4, 200 мМ NaCl, 5 мМ глутатион, 0,1 мМ ZnCl2, 10% глицерин, 80 мМ сахароза,рН 8,0) в качестве контроля. Препараты вводили внутривенно (в/в) 6 введений один раз в двое суток. На 31 сутки эксперимента мышей умерщвляли путем разрушения спинного мозга. Размер опухоли измеряли с использованием электронного толщиномера, объем опухоли вычисляли с использованием формулы: (а 2b)/2, где a = более короткая диагональ из 25 опухоли (мм) и b = более длинная диагональ опухоли (мм). Ингибирование роста опухоли вычисляли с использованием формулы:TGI [%] (ингибирование роста опухоли)=(WT/WC)100-100%,- 22024452 где WT относится к среднему объему опухоли в группе введения, WC относится к среднему объему опухоли в контрольной группе. Экспериментальные результаты представлены в качестве среднего значениястандартное отклонение (SD). Все вычисления и графики подготавливали с использованием программного обеспеченияGraphPad Prism 5.0. Экспериментальные результаты, полученные у мышей Crl:CD1-Foxn1nu, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ 116, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 3,примеру 12 и примеру 14, и в сравнении с rhTRAIL114-281 представлены на фиг. 6 в качестве диаграммы изменений объема опухоли и на фиг. 7, на которой показано ингибирование роста опухоли (%TGI) в качестве процента от контроля. Результаты экспериментов, представленные на графиках на фиг. 6 и 7, показывают, что введение слитых белков по изобретению согласно примеру 3, примеру 12 и примеру 14 вызывало ингибирование роста опухоли НСТ 116, с TGI, соответственно, 71%; 67% и 75% относительно контроля на 28 сутки эксперимента. Для rhTRAIL114-281, использованного в качестве эталона для сравнения, был получен небольшой ингибиторный эффект на рост опухолевых клеток относительно контроля, с TGI на уровне 44%. Таким образом, слитые белки по изобретению проявляют значительно более сильный эффект по сравнению с TRAIL отдельно. Экспериментальные результаты, полученные у мышей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, нагруженных клетками рака толстого кишечника НСТ 116, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 14(20 мг/кг), и в сравнении с rhTRAIL114-281 представлены на фиг. 8 в качестве диаграммы изменений объема опухоли и на фиг. 9, на которой показано ингибирование роста опухоли (%TGI) в качестве процента от контроля. Результаты экспериментов, представленные на графиках на фиг. 8 и 9, показывают, что введение слитых белков по изобретению согласно примеру 14 вызывало ингибирование роста опухоли НСТ 116 сTGI 22,5% относительно контроля на 32 сутки эксперимента. Для rhTRAIL114-281, использованного в качестве эталона для сравнения, был получен небольшой ингибиторный эффект на рост опухолевых клеток относительно контроля, с TGI на уровне 5,6%. Таким образом, слитые белки по изобретению проявляют значительно более сильный эффект по сравнению с TRAIL. Экспериментальные результаты, полученные у мышей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, нагруженных клетками рака печени PLC/PRF/5, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 14 и в сравнении с rhTRAIL114-281, представлены на фиг. 10 в качестве диаграммы изменений объема опухоли и на фиг. 11, на которой показано ингибирование роста опухоли (%TGI) в качестве процента от контроля. Результаты экспериментов, представленные на графиках на фиг. 10 и 11, показывают, что введение слитых белков по изобретению согласно примеру 14, вызывало ингибирование роста опухоли PLC/PRF/5 с TGI 34% относительно контроля на 49 сутки эксперимента. Для rhTRAIL114-281, использованного в качестве эталона для сравнения, был получен небольшой ингибиторный эффект на рост опухолевых клеток относительно контроля, с TGI на уровне 18%. Таким образом, слитые белки по изобретению проявляют значительно более сильный эффект по сравнению с TRAIL. Экспериментальные результаты, полученные у мышей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, нагруженных клетками рака печени HepG2, которым вводили слитые белки по изобретению согласно примеру 14 и в сравнении с rhTRAIL114-281, представлены на фиг. 12 в качестве диаграммы изменений объема опухоли и на фиг. 13, на которой показано ингибирование роста опухоли (%TGI) в качестве процента от контроля. Результаты экспериментов, представленные на графиках на фиг. 12 и 13, показывают, что введение слитых белков по изобретению согласно примеру 14, вызывало ингибирование роста опухоли HepG2 сTGI 33,6% относительно контроля на 31 сутки эксперимента. Для rhTRAIL114-281, использованного в качестве эталона для сравнения, был получен небольшой ингибиторный эффект на рост опухолевых клеток относительно контроля, с TGI на уровне 7%. Таким образом, слитые белки по изобретению проявляют значительно более сильный эффект по сравнению с TRAIL. Исследованные слитые белки не вызывали существенных побочных эффектов, проявляющихся в снижении массы тела мышей (т.е. менее 10% от исходной массы тела). Это показывает низкую системную токсичность белка.