Композиции эндорибонуклеаз и способы их использования
Номер патента: 24121
Опубликовано: 31.08.2016
Авторы: Даудна Дженнифер А., Инек Мартин, Виденхефт Блейк, Хорвитц Рейчел Э.
Формула / Реферат
1. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной на фиг. 6, при этом эндорибонуклеаза включает в себя аминокислотную замену в His-29, а вариант Csy4 эндорибонуклеазы является ферментативно неактивным в отсутствие имидазола и при этом вариант Csy4 эндорибонуклеазы является активируемым в присутствии имидазола.
2. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что замена аминокислоты является заменой His29 на Аlа29.
3. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что включает в себя функциональную группу, которая обеспечивает детектируемый сигнал.
4. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что функциональная группа, которая обеспечивает детектируемый сигнал, является флуорофором, квантовой точкой, ферментом, другим, чем эндорибонуклеаза, или наночастицей.
5. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что эндорибонуклеаза является иммобилизованной на нерастворимой подложке.
6. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы по п.5, отличающийся тем, что нерастворимая подложка является шариком.
7. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что связывает субстрат РНК, содержащий нуклеотидную последовательность 5'-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3' (SEQ ID NO: 1).
8. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант Csy4 эндорибонуклеазы по п.1.
9. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую различные Csy4 эндорибонуклеазы по п.1.
10. Рекомбинантный вектор экспрессии по п.9, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая различные Csy4 эндорибонуклеазы, функционально связана с промотором.
11. Рекомбинантный вектор экспрессии по п.10, отличающийся тем, что промотор является индуцируемым промотором.
12. In vitro генетически модифицированная клетка-носитель, содержащая рекомбинантный вектор экспрессии по п.9.
13. Набор для очистки РНК-мишени, представленной в смешанной популяции нуклеиновых кислот, включающий вариант Csy4 эндорибонуклеазы по п.1.
14. Набор по п.13, отличающийся тем, что дополнительно содержит рекомбинантный вектор экспрессии, включающий в порядке от 5' к 3' и в функциональной связи:
а) нуклеотидную последовательность, кодирующую субстрат РНК, которая является специфически связанной посредством различных Csy4 эндорибонуклеаз по п.1;
б) сайт множественного клонирования, подходящий для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК-мишень.
15. Набор по п.14, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая субстрат РНК, функционально связана с промотором.
16. Набор по п.15, отличающийся тем, что промотор является индуцируемым промотором.
17. Набор по п.14, отличающийся тем, что субстрат РНК содержит нуклеотидную последовательность 5'-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3' (SEQ ID NO: 1).
18. Набор по п.14, отличающийся тем, что рекомбинантный вектор экспрессии включает в себя вставляемую в сайт множественного клонирования нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК-мишень.
19. Набор по п.13, отличающийся тем, что дополнительно включает имидазол.
20. Набор по п.13, отличающийся тем, что дополнительно включает один или более буферов отмывки.
21. Набор по п.13, отличающийся тем, что дополнительно включает положительный контрольный вектор экспрессии.
22. Набор по п.13, отличающийся тем, что вариант Csy4 эндорибонуклеазы иммобилизован на нерастворимую подложку.
23. Способ выделения РНК-мишени, присутствующей в смешанной популяции нуклеиновых кислот, включающий в себя:
а) взаимодействие смешанной популяции нуклеиновых кислот с различными Csy4 эндорибонуклеазами по п.1, при этом различные Csy4 эндорибонуклеазы иммобилизованы на нерастворимой подложке, при этом смешанная популяция нуклеиновых кислот содержит меченую целевую РНК, содержащую распознаваемую нуклеотидную последовательность, которая специфически связана посредством иммобилизованных различных Csy4 эндорибонуклеаз, образуя комплекс меченая целевая РНК-иммобилизованный вариант Csy4 эндорибонуклеазы, при этом указанное взаимодействие осуществляется в связывающем растворе в отсутствие имидазола;
б) добавление имидазола в связывающий раствор до конечной концентрации от примерно 100 до около 500 мМ, тем самым формируя реактивационный раствор, который ферментативно реактивирует иммобилизованный вариант Csy4 эндорибонуклеазы, при этом реактивированный иммобилизованный вариант Csy4 эндорибонуклеазы расщепляет РНК-мишень по метке; и
в) сбор выделенной РНК-мишени.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию отмывки, которую проводят после стадии (а) и до стадии (б).
25. Способ выделения полипептида, связывающегося с РНК-мишенью, включающий:
а) взаимодействие иммобилизованного комплекса с жидким раствором, содержащим полипептид, который связывается с РНК-мишенью, в котором иммобилизованный комплекс включает в себя вариант Csy4 эндорибонуклеазы и меченую РНК-мишень, содержащую распознаваемую нуклеотидную последовательность, которая является специфически связанной посредством различных Csy4 эндорибонуклеаз, в котором указанное взаимодействие приводит к связыванию полипептида с РНК-мишенью, в котором указанное взаимодействие осуществляется в связывающем растворе в отсутствие имидазола; и
б) элюирование связанного полипептида.
26. Способ регулирования производства РНК-мишени в эукариотической клетке, включающий взаимодействие генетически модифицированной клетки-носителя с агентом, который активирует индуцируемый промотор, в котором генетически модифицированная клетка-носитель имеет генетически модифицированный рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую ферментативно активную сайт-специфическую Csy4 эндорибонуклеазу, которая катализирует расщепление в сайт-специфическом центре расщепления в субстрате полирибонуклеотида, при этом фермент-кодирование нуклеотидной последовательности функционально связано с индуцируемым промотором, в котором при активации индуцируемого промотора фермент вырабатывается в клетке и отщепляет указанную РНК-мишень от предшественника РНК.
27. Способ по п.26, отличающийся том, что дополнительно включает разновидность РНК-мишени, являющейся регуляторной РНК.
28. Способ по п.26, отличающийся тем, что включает отщепление указанной РНК-мишени от предшественника РНК и инактивирует предшественника РНК.
29. Способ обнаружения специфической последовательности в целевом полирибонуклеотиде, включающий:
а) взаимодействие целевого полирибонуклеотида с олигонуклеотидным зондом, содержащим специфическую последовательность, и ферментативно активной сайт-специфической Csy4 эндорибонуклеазой при условиях, которые способствуют формированию дуплекса между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, в котором дуплекс расщепляется Csy4 эндорибонуклеазой; и
б) детектирование специфического связывания между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, в котором детектирование образования дуплекса между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом указывает на наличие определенной последовательности в целевом полирибонуклеотиде.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что олигонуклеотидный зонд связан с пептидом, в котором пептид высвобождается при расщеплении дуплекса Csy4 эндорибонуклеазой, и где этап детектирования включает в себя выявление выделения пептида.
31. Способ по п.29, отличающийся тем, что выделение пептида обнаруживается путем связывания с антителом, специфичным для пептида.
32. Способ по п.31, отличающийся тем, что антитело иммобилизовано.
33. Способ по п.29, отличающийся тем, что целевой полирибонуклеотид иммобилизован на твердой подложке.
34. Способ по п.29, отличающийся тем, что целевой полирибонуклеотид является полирибонуклеотидом патогена.
35. Способ по п.29 отличающийся тем, что ферментативно активная Csy4 эндорибонуклеаза содержит последовательность аминокислот Csy4 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5.
Текст
Настоящее изобретение описывает вариант Csy4 эндорибонуклеазы, нуклеиновые кислоты,кодирующие вариант Csy4 эндорибонуклеазы, и клетки-носители, генетически модифицированные нуклеиновыми кислотами. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы находит разные применения, которые также описаны. Настоящее изобретение также описывает способы детекции специфической последовательности в целевом полирибонуклеотиде и способы регуляции производства РНКмишени в эукариотической клетке.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДЗЕ РЕДЖЕНТС ОВ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОВ КАЛИФОРНИЯ Эта заявка извлекает пользу из Предварительной патентной заявки США 61/333163, от 10 мая 2010 г., Предварительной патентной заявки США 61/365627, от 19 июля 2010 г., Предварительной патентной заявки США 61/413287, от 12 ноября 2010 г., каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Положение о государственном финансировании исследования Это изобретение было сделано при поддержке правительственного финансирования, грантТ 32National Science Foundation. Правительство обладает некоторыми правами на изобретение. Уровень техники ДНК-рестриктазы преобразовали молекулярную биологию в 1970-х гг., т.к. способны расщеплять определенные ДНК последовательности по своему усмотрению. Секвенсинг молекул РНК одновременно способствует синтезированию из РНК ДНК-нити, после чего секвенция происходит традиционными способами. Этот принцип, также известный как RNASeq, трудоемок, и считывание происходит с миллионов последовательностей. Тем не менее, синтез комплементарной ДНК представлен отклонениями от нормы,ввиду того, что результативность каждого считывания зависит от последовательности. Литература Carteet al. (2008) Genes Dev. 22:3489; U.S. Patent Publication No. 2010/0093026. Настоящее изобретение обеспечивает различные Csy4 эндорибонуклеазы; нуклеиновые кислоты,кодирующие вариант Csy4 эндорибонуклеазы; клетки-носители, генетически модифицированные нуклеиновыми кислотами. Вариант Csy4 эндонуклеазы находит разные применения, которые также обеспечены. Настоящее изобретение также обеспечивает способы определения специфической последовательности в искомом полирибонуклеотиде и способы регуляции производства целевой РНК в эукариотической клетке. Краткое описание фигур Фиг. 1 А-С изображают специфическое распознавание субстрата пре-трансактивирующей РНК (precrRNA) Pa14Csy4. Изображенная нуклеотидная последовательность - 5'-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3' (SEQ ID NO:1). Фиг. 2 А-С изображают кристаллические структуры Csy4, связанные с РНК субстратом. Фиг. 3 А и 3 В изображают детальный обзор каталитического центра Csy4 (фиг. 3 А) и разделение активности Csy4 дикого типа и мутантных (фиг. 3 В). Фиг. 4 изображает инвариантные аминокислоты среди 12 последовательностей Csy4. Pa (SEQ IDNO:10). Фиг. 5A-5BD представляют ряд аминокислотной последовательности различных Csy4 полипептидов, также как и нуклеотидные последовательности РНК распознаются каждым Csy4 полипептидом. Фиг. 6 изображает примеры аминокислотных последовательностей ферментативно неактивных сайт-специфических эндорибонуклеаз. Фиг. 7 изображает пример способа для определения специфической последовательности в целевом полирибонуклеотиде. Фиг. 8 изображает активирующий эффект имидазола на различные варианты ферментативно неактивных Csy4. Фиг. 9 изображает примерный способ изоляции искомой РНК. Показана целевая Csy4 стволовая петля (SEQ ID NO:103). Фиг. 10 изображает примерный способ регуляции экспрессии целевой РНК в эукариотической клетке. Показана последовательность (SEQ ID NO:103) РНК субстрата Csy4. Определения Используемый здесь термин "полирибонуклеотид" означает полимерную форму рибонуклеотидов и включает РНК, РНК-содержащие дезоксирибунуклеотид(ы) и ДНК-содержащие рибонуклеотид(ы). Полирибонуклеотид в некоторых случаях может включать один или более модифицированных нуклеотидов(например, дезоксиинозин, дезоксиуридин или гидроксиметилдезоксиуридин). В некоторых случаях полирибонуклеотид состоит только из рибонуклеотидов (т.е., не включает какие-либо дезоксирибонуклеотиды). В некоторых случаях полирибонуклеотид содержит рибонуклеотиды, и один или более модифицированных рибонуклеотидов, и не содержит дезоксирибонуклеотидов. В других случаях, полирибонуклеотид содержит рибонуклеотиды, и может содержать один или более модифицированных рибонуклеотидов, и один или более дезоксирибонуклеотидов (включая модифицированные дезоксирибонуклеотиды). В некоторых случаях, когда полирибонуклеотид содержит один или более дезоксирибонуклеотидов,дезоксирибонуклеотиды содержат от около 50 до примерно 40%, от около 40 до примерно 30%, от около 30 до примерно 20%, от около 20 до примерно 10%, от около 10 до примерно 1% или менее 1% от общего количества нуклеотидов в полирибонуклеотиде. Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" взаимозаменяемы и означают полимерную форму нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов, или же их аналогов. Неограниченные варианты полинуклеотидов включают линейные и кольцевые нуклеиновые ки-1 024121"Биологический образец" охватывает разнообразие типов образцов, полученных из клетки, внеклеточного матрикса, ткани или многоклеточного организма. Определение охватывает кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, твердые тканевые образцы, такие как образцы биопсии или тканевой культуры, или клетки, полученные из культуры и их предшественники. Определение также включает образцы, над которыми уже производились действия после их получения, такие как обработка реактивами, погружение в растворы или добавления компонентов, таких как полинуклеотиды. Термин"биологический образец" охватывает клинические образцы, а также включает клетки в культуре, клетки из надосадочной жидкости, клеточный лизат, сыворотку, плазму, биологическую жидкость (например,цереброспинальная жидкость, жидкость бронхоальвеолярных выделений, моча, кровь, фракции крови(например, плазма, сыворотка), слюна и подобные) и образцы тканей. В некоторых случаях биологический образец включает клетки, в некоторых - нет. Термин "функционально связанный" означает функциональную связь между молекулами для обеспечения необходимой функции. Например, термин "функционально связанные", в контексте нуклеиновых кислот означает функциональную связь между нуклеиновыми кислотами для обеспечения необходимых функций, таких как транскрипция, трансляция и подобных, например функциональная связь между последовательностью (такой как промотор, сигнальная последовательность или порядок сайтов связывания фактора транскрипции), контролирующей экспрессию нуклеиновой кислоты и вторым полинуклеотидом, когда последовательность, контролирующая экспрессию влияет на транскрипцию и/или трансляцию второго полинуклеотида. Термин "функционально связанный" в контексте полипептида означает функциональную связь аминокислотных последовательностей (например, из разных доменов) для обеспечения описанного действия полипептида. Термин "изолированный" означает протеин или нуклеиновую кислоту, которые, если образуются естественным путем, находятся в среде, отличной от той, в которой они могли образоваться естественным путем. "Изолированный", значит содержащий протеины или нуклеиновые кислоты, находящиеся в образцах, которые в значительной степени включают интересующий протеин или нуклеиновую кислоту,и/или в которых интересующий протеин или нуклеиновая кислота частично или в значительной степени химически чисты. Там, где протеин или нуклеиновая кислота возникают неестественным путем, термин"изолированный" обозначает протеин или нуклеиновую кислоту, которые отделены от среды, в которой возникли синтетическими или рекомбинантными путями. Термин "практически чистый" означает, что объект (например, полипептид или нуклеиновая кислота) составляет более чем 50% общего состава композиции (например, общего белка композиции) и обычно более чем 60% от общего содержания белка. В некоторых вариантах воплощения "практически чистый" относится к композициям, в которых по меньшей мере 75%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или более от общего состава является объектом интереса (например, 95% от общего белка). В некоторых вариантах воплощения белок или нуклеиновая кислота, представляющие интерес, будут составлять больше чем примерно 90%, больше чем примерно 95%, больше чем примерно 98% или больше чем примерно 99% общего белка или нуклеиновой кислоты в композиции. Перед дальнейшим описанием изобретения следует отметить, что это изобретение не ограничивается описанием частных случаев, которые конечно могут быть разными. Также следует понять, что используемая терминология подходит только для описания конкретных вариантов воплощения, и не является предметом ограничений, поскольку масштаб настоящего изобретения ограничен только представленной формулой изобретения. В тех местах, где представлен диапазон значений, очевидно, что каждое промежуточное значение,вплоть до десятых долей единицы нижнего предела, если в тексте не указывается обратное, между верхним и нижним пределом диапазона или другим указанным или промежуточным значением в указанном диапазоне, находится в рамках изобретения. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться в меньшие диапазоны, также находиться в рамках изобретения, и могут быть исключены из указанного диапазона. Там, где указанный диапазон включает один или два предела, диапазон, исключающий любой из двух или оба этих включенных предела, также включен в изобретение. Если не указано обратное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, что и используемые в области, к которой принадлежит изобретение. Хотя некоторые способы и материалы, похожие или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы на практике или тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны в данной работе. Все публикации, упомянутые здесь, объединены описанием для раскрытия и характеристики способов и/или материалов, в связи с которыми и приводятся эти публикации. Следует отметить, что используемые здесь и в представленных формулах изобретения артикли в единственном числе используются и во множественном, если в тексте не указано обратное. Т.е., например, использование термина "сайт-специфичная эндорибонуклеаза" указывает и на множественное число таких сайт-специфичных эндорибонуклеаз, а использование термина "целевой полирибонуклеотид" указывает на один или более целевых полирибонуклеотидов или их эквивалентов, известных специалистам в этой области и так далее. Также отмечено, что формула изобретения может быть разработана для ис-2 024121 ключения других дополнительных элементов. Т.е., это утверждение может быть основой для использования такой исключающей терминологии как "исключительно", "только" и подобных в связи с перечислением элементов формулы изобретения или для использования "отрицательных" ограничений. Материалы, представленные здесь, опубликованы исключительно до подачи настоящей заявки. Ничто здесь не должно быть истолковано как признание того, что данное изобретение не имеет права задним числом на такие публикации до вступления в силу предшествующего изобретения. В дальнейшем,представленные даты публикации могут отличаться от даты реальной публикации, которая может быть подтверждена независимо. Детальное описание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает вариант Csy4 эндорибонуклеазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант Csy4 эндорибонуклеазы и содержащие их клетки, генетически модифицированные нуклеиновыми кислотами. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы находи т разные применения, которые также обеспечены. Настоящее изобретение также обеспечивает способы определения специфических последовательностей в искомых полирибонуклеотидах и способы регуляции производства целевой РНК в эукариотической клетке. Методы определения последовательности в целевом полирибонуклеотиде Настоящее изобретение описывает способ определения последовательности в целевом полирибонуклеотиде. Способы полезны для определения наличия определенной последовательности в полирибонуклеотиде и, как следствие, могут быть использованы для определения полирибонуклеотида, содержащего определенную последовательность. Например, способ может быть использован для определения наличия полирибонуклеотида патогена в образце (например, в биологическом образце). Этим способом можно определить только около 100 копий, вплоть до определения каждой копии искомого полирибонуклеотида. Таким образом, к примеру, этот способ позволяет определить от около 1 до примерно 5, от около 5 до примерно 10, от около 10 до примерно 50, от около 50 до примерно 100, или более чем 100 копий искомого полирибонуклеотида в образце (например, в одиночной клетке, одиночном эмбрионе или другом биологическом образце). Таким образом, этот метод применим в различных судебных, исследовательских, диагностических целях. В некоторых вариантах воплощения способ определения специфической последовательности в полирибонуклеотиде включает: а) взаимодействие целевого полирибонуклеотида с олигонуклеотидным зондом, содержащим специфическую последовательность и ферментативно активную сайтспецифическую Csy4 эндорибонуклеазу, в условиях, способствующих образованию дуплекса между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, где дуплекс расщепляется Csy4 эндорибонуклеазой; и b) определение специфического связывания между олигонуклеотидным зондом и искомым полирибонуклеотидом, где определение образования дуплекса между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом указывает на присутствие специфической последовательности в целевом полирибонуклеотиде. В некоторых случаях олигонуклеотидный зонд связан с пептидом, и пептид высвобождается при расщеплении дуплекса Csy4 эндорибонуклеазой; в этих случаях на этапе определения детектируется и высвободившийся пептид. Например, высвободившийся пептид определен связыванием с антителом,специфичным для пептида, например, когда антитело иммобилизированно. В некоторых вариантах воплощения, полирибонуклеотид иммобилизирован на твердом носителе. Искомые полирибонуклеотиды включают вариант полинуклеотиды, например, искомый полирибонуклеотид может быть полирибонуклеотидом патогена. Как сказано выше, в некоторых вариантах воплощения, антитело или искомый полинуклеотид иммобилизированы на твердом носителе (нерастворимый носитель). Подходящие нерастворимые носители включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тестовые полоски, многолуночные планшеты и им подобные. Нерастворимый носитель может включать различные вещества(стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон,амилозу, натуральную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, агарозы и магнетит) и может быть представлен в различных формах, включая, например, агарозные шарики, полистирольные шарики,латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стеклянные и/или кремниевые пластинки и поверхности, нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, лунки реакционных лотков (например, мультилуночные планшеты), пластиковые трубки и т.д. В некоторых вариантах воплощения, в общем, способ включает: а) взаимодействие искомого полирибонуклеотида с сайт-специфической эндорибонуклеазой иb) определение продуктов расщепления в результате сайт-специфической реакции расщепления целевого полирибонуклеотида, когда выход продуктов расщепления, ожидаемых в реакции расщепления специфической последовательности в полирибонуклеотиде, указывает на присутствие специфической последовательности. В других вариантах воплощения способ определения последовательности в искомом полирибонуклеотиде включает: а) взаимодействие искомого полирибонуклеотида с: i) сайт-специфической эндорибонуклеазой и ii) олигонуклеотидным зондом, содержащим связанную определяемую функциональную группу, когда олигонуклеотидный зонд содержит специфическую известную нуклеотидную последовательность; в то время как образец олигонуклеотида формирует дуплекс с комплементарной последовательностью искомого полирибонуклеотида, основанный на связывании известной нуклеотидной последовательности, присутствующей в олигонуклеотидном зонде, с комплементарной последовательностью в искомом полирибонуклеотиде, и где сайт-специфическая эндорибонуклеаза расщепляет дуплекс путем, специфическим для последовательности, таким образом высвобождая определяемую функциональную группу из олигонуклеотидного зонда; иb) определение высвободившейся определяемой функциональной группы, в то время как высвобождение определяемой функциональной последовательности указывает на присутствие специфической последовательности. В некоторых вариантах воплощения используются два или более разных олигонуклеотидных зонда, каждый из которых содержит разную специфическую известную нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах воплощения определяемая функциональная группа является полипептидом. Полипептид может быть определен с использованием иммунологического теста (например, тест на фермент-связанный иммуносорбент (ELISA); радиоиммунотест (RIA) и т.д.), использование антитела, специфичного для определения функциональной группы полипептида. Антитело, специфичное для определения полипептидной функциональной группы может включать определяемый маркер. Иммуннотест может быть выполнен с использованием тестовой полоски (например, в проточном тесте) или другой подходящей среде, такой как мультилуночный планшет. В некоторых вариантах воплощения, определяемая функциональная группа - флуоресцирующие белки, описание которых включено в документ. В других вариантах воплощения определяемая функциональная группа - люциферин или другой субстрат для люциферазы. Подходящие люциферины или другие люциферазные вещества включают, например, люциферин (например, люциферин светлячка), аминолюциферин; коэлентирозин; модифицированный коэлентирозин, описанный в патенте США 7537912: аналог коэлентирозина, описанный в патенте США 2009/0081129 (например, мембранпроникающий аналог коэлентирозина, описанный в патенте США 2009/0081129, например, одна из структурa red-shifted thermostable luciferase. Mol. Imaging Biol. (2009, Nov. 9, online; PubMed ID: 19937390). Неограничивающий пример использования способа определения схематически представлен на фиг. 7. В примере, изображенном на фиг. 7, небольшие олигонуклеотиды, которые связывают дискретные области искомого полинуклеотида (например, вирусная РНК), контактируют с искомым полинуклеотидом, тогда как олигонуклеотиды включают определяемые функциональные группы (например, лиганды; пептиды и т.д.). Также приведена последовательность ферментативно активной сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции (RRE), которая помечает комплекс олигонуклеотид/вирусная РНК. Фермент расщепляет комплекс олигонуклеотид/вирусная РНК и лиганды становятся доступны для определения. Фермент расщепляет последующие дуплексы, таким образом, усиливая сигнал. Высвобожденные лиганды определяются проточным (например, тестовыми полосками) или иммунологическим методом (например, ELISA). Необходимая сайт-специфическая эндорибонуклеаза ферментативно активна. Эндорибонуклеазы,пригодные для использования в данном способе определения, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с субстратом полирибонуклеотида и расщепляют его в зависимости от последовательности,включая ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99%, или на 100% идентичную последовательность в наборе аминокислот, изображенных на фиг. 4 (Csy4 аминокислотная последовательность). Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования в данном способе определения, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат полирибонуклеотида, в зависимости от последовательности, включая ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%,по меньшей мере около 99% или на 100% идентичную последовательность в наборе аминокислот, изображенных на фиг. 5 (Csy4 аминокислотная последовательность). На фиг. 5 изображена последовательность, специфически связанная различными эндорибонуклеазами. В некоторых случаях подходящая сайт-специфическая ферментативно активная Csy4 эндорибонуклеаза может включать аминокислотную последовательность Csy4 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5. Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования в данном способе определения, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат полирибонуклеотида, в зависимости от последовательности, включая ферментативно активные полипептиды, которые отличаются от аминокислотной последовательности в одной из фиг. 4 или 5 на от 1 до 20 (например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19 или 20) замещенных аминокислот, и/либо дополнительно включенных,-4 024121 и/либо отсутствующих. Целевой полирибонуклеотид для определения может присутствовать в образце, например биологическом образце, таком как кровь, компонент крови (например, плазма), моча, цереброспинальная жидкость, жидкость бронхоальвеолярного секрета, слюна, ткань, клетки и т.д. Целевой полирибонуклеотид может быть изолирован или очищен. Целевой полирибонуклеотид может быть мессенджером РНК(мРНК), вирусной РНК, бактериальной РНК, паразитной РНК или другим типом РНК. Вирусные РНК включают, но не ограничиваются этим, любой компонент флавивирида, например, вирус гепатита С, вирус лихорадки Денге, вирус желтой лихорадки, вирус западного Нила и т.д.; любой компонент Ретровирида; вирус иммунодефицита (например, вирус иммунодефицита человека) и т.д. Целевой полирибонуклеотид для определения может присутствовать в клетке многоклеточного организма (или может быть получен из клетки многоклеточного организма). Целевой полирибонуклеотид для определения может присутствовать в или быть получен из клетки организма любого из 6 царств, например бактерии (например, эубактерии); архебактерии; одноклеточные; грибы; растения и животные. Подходящий источник целевого полирибонуклеотида включает растениеподобных представителей из царства одноклеточных, включая, но не ограничиваясь этим, водоросли (например, зеленые водоросли, красные водоросли, глаукофитовые водоросли, цианобактерии); грибоподобных представителей одноклеточных, например, слизевиков, оомицетов и т.д.; животноподобных представителей одноклеточных, например, жгутиконосцы (например, эвглена), саркодовые (например,амеба), апикомплексы (например, апикомплекса, миксозоа, микроспоридия) и инфузории (например,парамеция). Подходящий источник искомых полирибонуклеотидов включает представителей царства грибы, включающих, но не ограничивающихся этим, представителей групп: базидиомицеты (клавароидные грибы: например, представители агариковых, аманитовых, болетовых, лисичковых и т.д.); аскомицеты (сумчатые грибы, включая, например, сахаромицеты); микофитофиты (лишайники); зигомицеты и дейтеромицеты. Подходящий источник для целевых полирибонуклеотидов включает представителей царства растения, включая, но не ограничиваясь этим, представителей любых из следующих таксонов: бриофиты (например, мхи), антоцеротофиты (например, антоцеротовидные), гепатикофиты (например,печеночные мхи), ликофиты (например, плауновидные), сфенофиты (например, хвощи), псилофиты (например, риниофиты), офиоглоссофиты, птерофиты (например, папоротниковидные), цикадофиты, гинкгофиты, пинофиты, гнетофиты и магнолиевые (например, цветковые растения). Подходящий источник для целевых полирибонуклеотидов включает представителей царства животные, включая, но не ограничиваясь этим, представителей любых из следующих таксонов: порифера (губки), пластинчатые, ортонектиды (паразиты морских беспозвоночных); дициемиды, стрекающие (кораллы, актинии, медузы, морское перо, морские анютины глазки, кубомедуза), ктенофора (гребневики); платегельминты (плоские черви); немертины (ленточные черви); гнатостомулиды; гастротрихии, коловратки, приапулиды, киноринхии,лорициферы, скребни, внутрипорошициевые; нематоды; волосатики; циклиофоры, моллюски; сипункулиды; аннелиды (кольчатые черви); тихоходки (водяные медведи); онихофоры (бархатные черви); членистоногие (включая таксоны низшего порядка: хелицеровые, многоножки, шестиногие и ракообразные,при этом хелицеровые включают, например, паукообразные, меростоматовые, морские пауки, при этом многоножки включают, например, губоногие (сороконожки), двупарноногие(многоножки), параподии и симфилы, при этом шестиногие включают насекомых, ракообразные включают креветок, криль, усоногих и т.д.; форониды; мшанки; плеченогие; иглокожие (например, морская звезда, ксилоплакса, морские лилии, морские ежи, морские огурцы, офиуры, эуриалины и т.д.); щетинкочелюстные (морские стрелки); хемихордаты (полухордовые черви); и хордовые. Подходящие представители хордовых включают любых представителей следующих низших таксонов: оболочники (включая асцидий, сальп и аппендикулярий); головохордовые (ланцетники); миксины; и позвоночные, включая представителей, например, петромизантиды (миноги), хондрихтии (хрящевые рыбы), актиноптеригии (лучеперстные рыбы), актинисты(целакантообразные), двоякодышащие, рептилии (например, змеи, аллигаторы, крокодилы, ящерицы и т.д.), птицы и млекопитающие. подходящие растения включают любых представителей однодольных или двудольных. Таким образом, например, целевой полирибонуклеотид может присутствовать или быть получен из клеток организма, который включает, но не ограничивается этим, простейшее, растение, гриб, клетку водоросли, дрожжи, рептилию, амфибию, млекопитающее, морской микроорганизм, морское беспозвоночное, членистоногое, равноногое, насекомое, паукообразное, архебактерию и эубактерию. Целевой полирибонуклеотид может присутствовать или быть получен из нечеловеческого эмбриона, например эмбриона дрозофилы, эмбриона данио-рерио, мышиного эмбриона и т.д. Целевой полирибонуклеотид может присутствовать или быть получен из стволовой клетки, например стволовой клетки in vitro, нечеловеческой стволовой клетки и т.д. Подходящие стволовые клетки включают стволовые клетки эмбриона, стволовые клетки взрослого и стимулированные плюрипотентные клетки (iPS). В некоторых вариантах воплощения целевой полирибонуклеотид будет изолирован от ткани организма; от конкретной клетки или группы клеток, изолированных от организма и т.д. Например, если организм - растение, искомый полирибонуклеотид будет в некоторых вариантах воплощения изолирован из ксилемы, лубяной ткани, камбия, листьев, корней и т.д. Если организм - животное, искомый полирибонуклеотид будет в некоторых вариантах воплощения изолирован из конкретной ткани (например, легкого, печени, сердца, почки, головного мозга, селезенки, кожи, фетальной ткани и т.д.) или конкретного типа клеток (например, нейронов, эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток, астроцитов, макрофагов, клеток глии, островковых клеток, Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и т.д.). Способы регуляции производства целевой РНК Представленное изобретение описывает способ регуляции производства целевой РНК в клетке. В общем, способ включает в себя взаимодействие генетически модифицированной клетки-носителя с реагентом, который активирует индуцируемый промотор, в то время как генетически модифицированная клетка-носитель генетически модифицирована рекомбинантным вектором экспрессии, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который катализирует расщепление в сайте расщепления определенной последовательности субстрата полирибонуклеотида, в то время как ферменткодирующая нуклеотидная последовательность активно связана с индуцируемым промотором, и при этом, в результате активации индуцируемого промотора, фермент продуцируется в клетке и расщепляет оговоренную целевую РНК из РНК-предшественника. Фиг. 10 схематически изображает примерный способ регуляции производства целевой РНК. На фиг. 10 эндогенная целевая РНК модифицирована и включает Csy4 РНК субстрат (например, GUUCACUGCCGUAUAGGCAG (SEQ ID NO: 103); или SEQ ID NO:1) в 3' нетранслируемой зоне (3' UTR). Экспрессия Csy4 в клетке-носителе ведет к связыванию и расщеплению РНК субстрата. В этот момент расщепленная РНК теряет свой полиА хвост и распадается. Например, в некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение описывает способ регуляции производства целевой РНК в эукариотической клетке, в то время как способ включает взаимодействие генетически модифицированных клеток-носителей с реагентом, который активирует индуцированный промотор, в то время как генетически модифицированная клетка-носитель генетически модифицирована рекомбинантным вектором экспрессии, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую ферментативно активную сайт-специфическую Csy4 эндорибонуклеазу, которая катализирует расщепление сайта расщепления в определенной последовательности субстрата полинуклеотида, тогда как фермент-кодирующая нуклеотидная последовательность активно связана с индуцируемым промотором, и при этом, в результате активации индуцируемого промотора, фермент продуцируется в клетке и расщепляет оговоренную целевую РНК из РНК-предшественника. В некоторых случаях вид искомой РНК - регуляторная РНК. В некоторых случаях расщепление указанной целевой РНК из РНК-предшественника инактивирует РНК-предшественник. Подходящая сайт-специфическая эндорибонуклеаза ферментативно активна. Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования способом регуляции производства целевой РНК, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат полирибонуклеотида в сайт-специфической манере, включая ферментативно активные полипептиды, имеющие по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 или 100% аминокислотную последовательность, идентичную набору аминокислот на фиг. 4 (Csy4 аминокислотная последовательность). Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования в способе регуляции производства целевой РНК, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат полирибонуклеотида, в сайт-специфической манере, включая ферментативно активные полипептиды, которые содержат по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 или 100% аминокислотную последовательность идентичную аминокислотной последовательности на фиг. 5 (Csy4 аминокислотную последовательность). Фиг. 5 предлагает сайт-специфические последовательности, связанные различными эндорибонуклеазами. Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования в способе регуляции производства целевой РНК, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат сайтспецифического полирибонуклеотида, включая ферментативно активные полипептиды, которые отличаются от аминокислотной последовательности на любой из фиг. 4 или 5 на от 1 до 20 (например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16,17, 18,19 или 20) замещенных аминокислот и/или дополнительно включенных, и/или отсутствующих. Подходящий индуцированный промотор может включать промотор, который функционирует в эукариотической клетке. Подходящий индуцированный промотор известен в данной области техники. Например, подходящий индуцированный промотор включает, но не ограничивается, GAL1 промотор,GAL10 промотор, ADH2 промотор, РНО 5 промотор, CUP1 промотор, GAL7 промотор, МЕТ 25 промотор,МЕТ 3 промотор, CYC1 промотор, HIS3 промотор, ADH1 промотор, PGK промотор, GAPDH промотор,ADC1 промотор, TRP1 промотор, URA3 промотор, LEU2 промотор, ENO промотор, ТР 1 промотор и АОХ 1. Подходящие индуцированные промоторы включают тетрациклин-индуцированные промоторы; металлотионеиновый промотор; тетрациклин-индуцированные промоторы, метионин-индуцированные промоторы; галактоза-индуцированные промоторы, которые хорошо известны в данной области техники. Другие подходящие промоторы включают промотор ADH2 алкогольдегидрогеназу (инактивированный в глюкозе, индуцированный в условиях, когда этанола образуется больше, чем имеется глюкозы) и промотор CUP1 металлотионеиновый (индуцированный в присутствии Cu2+, Zn2+). Реагенты, которые индуцируют любой имеющийся индуцированный промотор, известны в данной области техники. Например, тетрациклин-регулируемые промоторы могут регулироваться тетрациклином или доксициклином; углеводы могут быть использованы для индукции углевод-индуцируемых промоторов (например, галактоза для галактоза-индуцируемого промотора); метионин может быть использован для индукции метионин-индуцируемого промотора; металлы могут быть использованы для индукции металлотионеинового промотора. Целевая РНК может быть регуляторной РНК. Регуляторные РНК хорошо известны в данной области техники и включают, например, микро-РНК, РНК, образующие шпильки (shRNA), и подобные. В некоторых вариантах воплощения отщепление целевой РНК от предшественника РНК инактивирует предшественника РНК. Генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой in vitro, например прокариотическая клетка или эукариотическая клетка (например, клетка млекопитающего, включая исходные клетки, трансформированные клеточные линии и подобные). Генетически модифицированная клетканоситель может быть клеткой in vivo. В некоторых случаях клетка in vivo является нечеловеческой клеткой. Генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой многоклеточного организма(или может быть получена из клетки многоклеточного организма). Генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой, полученной от или присутствующей в организме любого из 6 царств, например, бактерии (например, эубактерии); архебактерии; одноклеточные; грибы; растения и животные. подходящие организмы включают растениеподобных представителей из царства одноклеточных, включая, но не ограничиваясь этим, водоросли (например,зеленые водоросли, красные водоросли, глаукофитовые водоросли, цианобактерии); грибоподобных представителей одноклеточных, например, слизевиков, оомицетов и т.д.; животноподобных представителей одноклеточных, например, жгутиконосцы (например, эвглена), саркодовые (например, амеба),апикомплексы (например, апикомплекса, миксозоа, микроспоридия) и инфузории (например, парамеция). Подходящие организмы включают представителей царства грибы, включающих, но не ограничивающихся этим, представителей групп: базидиомицеты (клавароидные грибы: например, представители агариковых, аманитовых, болетовых, лисичковых и т.д.); аскомицеты (сумчатые грибы, включая, например, сахаромицеты); микофитофиты (лишайники); зигомицеты и дейтеромицеты. подходящие организмы включают представителей царства растения, включая, но не ограничиваясь этим, представителей любых из следующих таксонов: бриофиты (например, мхи), антоцеротофиты (например, антоцеротовидные),гепатикофиты (например, печеночные мхи), ликофиты (например, плауновидные), сфенофиты (например, хвощи), псилофиты (например, риниофиты), офиоглоссофиты, птерофиты (например, папоротниковидные), цикадофиты, гинкгофиты, пинофиты, гнетофиты и магнолиевые (например, цветковые растения). подходящие организмы включают представителей царства животные, включая, но не ограничиваясь этим, представителей любых из следующих таксонов: порифера (губки), пластинчатые, ортонектиды(паразиты морских беспозвоночных); дициемиды, стрекающие (кораллы, актинии, медузы, морское перо,морские анютины глазки, кубомедуза), ктенофора (гребневики); платегельминты (плоские черви); немертины (ленточные черви); гнатостомулиды; гастротрихии, коловратки, приапулиды, киноринхии, лорициферы, скребни, внутрипорошициевые; нематоды; волосатики; циклиофоры, моллюски; сипункулиды; аннелиды (кольчатые черви); тихоходки (водяные медведи); онихофоры (бархатные черви); членистоногие (включая таксоны низшего порядка: хелицеровые, многоножки, шестиногие и ракообразные, при этом хелицеровые включают, например паукообразные, меростоматовые, морские пауки, при этом многоножки включают, например, губоногие (сороконожки), двупарноногие (многоножки), параподии и симфилы, при этом шестиногие включают насекомых, ракообразные включают креветок, криль, усоногих и т.д.; форониды; мшанки; плеченогие; иглокожие (например, морская звезда, ксилоплакса, морские лилии, морские ежи, морские огурцы, офиуры, эуриалины и т.д.); щетинкочелюстные (морские стрелки); хемихордаты (полухордовые черви); и хордовые. Подходящие представители хордовых включают любых представителей следующих низших таксонов: оболочники (включая асцидий, сальп и аппендикулярий); головохордовые (ланцетники); миксины; и позвоночные, включая представителей, например, петромизантиды (миноги), хондрихтии (хрящевые рыбы), актиноптеригии (лучеперстные рыбы), актинисты(целакантообразные), двоякодышащие, рептилии (например, змеи, аллигаторы, крокодилы, ящерицы и т.д.), птицы и млекопитающие. Подходящие растения включают любых представителей однодольных или двудольных. Таким образом, например, генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой,полученной из или существующей в простейшем, растении, грибе, клетке водоросли, дрожжах, рептилии, амфибии, млекопитающем, морском микроорганизме, морском беспозвоночном, членистоногом,равноногом, насекомом, паукообразном, архебактерии и эубактерии. Подходящие клетки млекопитающего включают исходные клетки и иммортализованные клеточные линии. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают человеческие клеточные линии, нече-7 024121 ловеческие клеточные линии приматов, клеточные линии грызунов (например, мышь, крыса) и подобные. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, клетки HeLa(АТССCCLI.3), клетки почки эмбриона человека (HEK) (АТССCRL1573), HLHepG2 клетки и подобные. Генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой, полученной из или присутствующей в нечеловеческом эмбрионе, например, эмбрионе дрозофилы; эмбрионе данио-рерио; мышином эмбрионе и т.д. Генетически модифицированная клетка-носитель может быть стволовой клеткой, например стволовой клеткой in vitro; нечеловеческой стволовой клеткой и т.д. Подходящие стволовые клетки включают стволовые клетки эмбриона, стволовые клетки взрослого организма и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS). Способы изолирования целевой нуклеиновой кислоты Настоящее изобретение представляет способы изолирования искомой нуклеиновой кислоты из смеси нуклеиновых кислот. В общем, способы включают: а) взаимодействие смеси нуклеиновых кислот с иммобилизированной сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой, в которой смесь нуклеиновых кислот включает целевую нуклеиновую кислоту, содержащую "меченую" (или "распознаваемую") нуклеотидную последовательность,которая специфически связана иммобилизированной сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой, так что целевая нуклеиновая кислота, содержащая меченую нуклеотидную последовательность ("узнаваемая целевая нуклеиновая кислота"), связывается с иммобилизированной сайтспецифической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой, формируя комплекс узнаваемая целевая нуклеиновая кислота/иммобилизированная сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза, в котором этапы взаимодействия протекают в жидком растворе ("связывающий раствор"); иb) посредством добавления имидазола к жидкому раствору в завершающей концентрации от около 100 до около 500 мМ (например, от около 100 мМ до около 150 мМ, от около 150 мМ до около 200 мМ,от около 200 мМ до около 250 мМ, от около 250 мМ до около 300 мМ, от около 300 мМ до около 350 мМ, от около 350 мМ до около 400 мМ, от около 400 мМ до около 450 мМ, от около 450 мМ до около 500 мМ), таким образом, формируя активационный раствор, который ферментативно возобновляет ферментно неактивную эндорибонуклеазу так, что эндорибонуклеаза становится ферментативно активной и отщепляет целевую нуклеиновую кислоту от "меченой" нуклеотидной последовательности, таким образом высвобождая целевую нуклеиновую кислоту. Фиг. 9 схематически изображает примерный способ изолирования целевой РНК. Способ в дальнейшем может включать один или два очищающих этапа. Например, после этапа (а) и перед этапом (b), иммобилизированная сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза, которая содержит связанную целевую нуклеиновую кислоту, содержащую "меченую" нуклеотидную последовательность, может быть дополнительно очищена один или два раза связывающим раствором, так что целевая нуклеиновая кислота остается связанной с сайтспецифической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой и любые несвязанные нуклеиновые кислоты вымываются. Смесь нуклеиновых кислот может включать РНК и ДНК. Целевая нуклеиновая кислота - это РНК,которая содержит "меченую" или "распознаваемую" нуклеотидную последовательность, которая связана сайт-специфической эндорибонуклеазой. В своем ферментативно неактивном состоянии ("неиндуцированное" состояние), эндорибонуклеаза может связать, но не расщепить, узнаваемую целевую РНК. В своем ферментативно активном состоянии ("индуцированное" состояние) (например, в присутствии имидазола в концентрации от около 100 мМ до около 500 мМ), эндорибонуклеаза может как связывать,так и расщеплять распознаваемую нуклеотидную последовательность в узнаваемой целевой нуклеиновой кислоте, таким образом, высвобождая целевую нуклеиновую кислоту. Связывающий раствор может включать буфер и соль; остальное - имидазол. Реактивационный раствор может включать имидазол в конечной концентрации от около 100 до около 500 мМ, например, от около 100 до около 150 мМ, от около 150 до около 200 мМ, от около 250 до около 350 мМ, от около 350 до около 400 мМ, или от около 400 до около 500 мМ. Наличие имидазола восстанавливает активность сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазы, так что эндорибонуклеаза становится ферментативно активной, например, эндорибонуклеаза демонстрирует по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или более 95% сайтспецифической эндорибонуклеазы дикого типа (например, аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5 (например, SEQ ID NO:6, 8 или 9. Как один неограничивающий пример, сайтспецифическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза - это мутант Н 29 А из Csy4 (как описано ниже; и изображено на фиг. 6); содержащая мутант Csy4(H29A) с имидазолом, как описано выше, реактивирует эндорибонуклеазу так, что она способна расщеплять сайт-специфическим образом распознаваемую последовательность в целевой рибонуклеиновой кислоте. Также подходит для использования Н 29 А, двойная мутантная S50C из Csy4 (как описано ниже). В некоторых вариантах воплощения, "меченая" последовательность включает нуклеотидную последовательность 5'-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3' (SEQ ID NO:1)."Меченая" или "распознаваемая" нуклеотидная последовательность может быть представлена в нуклеиновой кислоте с использованием стандартных рекомбинантных способов. Таким образом, узнаваемая целевая нуклеиновая кислота будет включать распознаваемый элемент, который ферментативно расщеплен, таким образом, высвобождая искомую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах воплощения узнаваемая целевая нуклеиновая кислота (РНК) будет иметь один или более полипептидов, связанных с ней. Узнаваемая целевая РНК, которая имеет один или более полипептидов, связанных с ней, означает протеиновый комплекс РНК. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения целевая РНК, которая изолирована описанным способом, это РНК протеиновый комплекс. В некоторых вариантах воплощения описанный способ может включать в дальнейшем анализирование полипептида (ов), связанного (х) с изолированной целевой РНК. Описанный способ используется для изоляции целевой РНК (или РНК протеинового комплекса). В некоторых вариантах воплощения способ используется для очистки целевой РНК (или РНК протеинового комплекса), так чтобы целевая РНК (или РНК протеиновый комплекс) была очищена, по меньшей мере около 50% чистоты, по меньшей мере около 60% чистоты, по меньшей мере около 70% чистоты, по меньшей мере около 80% чистоты, по меньшей мере около 90% чистоты, по меньшей мере около 95% чистоты, по меньшей мере около 98% чистоты или более чем на 98% чистоты. В некоторых вариантах воплощения протеин, связанный с целевой РНК в целевом РНК/протеин комплексе может быть извлечен из РНК/протеин комплекса. Извлеченный протеин может быть подвергнут дальнейшему анализу, например секвенированию, ферментативному расщеплению, функциональному химическому анализу и т.д. Смесь нуклеиновых кислот может присутствовать в клеточном лизате. Например, вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую узнаваемую целевую РНК, представлен в клетке (например, in vitro или in vivo), так что клетка синтезирует узнаваемую целевую РНК. Лизат готовится из клетки и лизат (опционально разделение на один или более этапов для обогащения нуклеиновыми кислотами) используется с иммобилизированной сайтспецифическойной ферментативно неактивной эндорибонуклеазой. Сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза может быть иммобилизирована на всевозможных нерастворимых носителях. Подходящие нерастворимые носители включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тестовые полоски, многолуночные планшеты и подобное. Нерастворимый носитель может включать различные вещества (стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, натуральную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, агарозы и магнетит) и может быть представлен в различных формах, включая, например, агарозные шарики, полистирольные шарики, латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стекло и/или силиконовые пластинки и покрытия,нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, лунки в реакционных кюветах (например,многолуночные планшеты), пластиковые трубки и т.д. Настоящее изобретение также описывает способ изолирования полипептида, который связывает целевую РНК, при этом способ включает: а) взаимодействие иммобилизированного комплекса с жидким раствором, содержащим полипептид,который связывает целевую РНК, при этом иммобилизированный комплекс включает вариант Csy4 эндорибонуклеазы и узнаваемую целевую РНК, содержащую нуклеотидную последовательность, которая специфически связана различными Csy4 эндорибонуклеазами, при этом результаты взаимодействия при связывании полипептида с искомой РНК, при котором взаимодействие выполняется в связывающем растворе без имидазола; иb) извлечение связанного полипептида. Эндорибонуклеазы Настоящее изобретение описывает сайт-специфические эндорибонуклеазы. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение описывает сайт-специфические эндорибонуклеазы, которые связывают распознаваемую последовательность в целевом полирибонуклеотиде,но не расщепляют целевой полирибонуклеотид, например, сайт-специфическая эндорибонуклеаза является ферментативно неактивной при гидролизе целевого полирибонуклеотида. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение описывает сайт-специфические эндорибонуклеазы, которые связываются с распознаваемой последовательностью в целевом полирибонуклеотиде, и расщепляют целевой полирибонуклеотид в или рядом с распознаваемой последовательностью, например сайт-специфическая эндорибонуклеаза является ферментативно активной при гидролизе целевого полирибонуклеотида. В некоторых вариантах воплощения описанная сайт-специфическая эндорибонуклеаза иммобили-9 024121 зирована на нерастворимом субстрате. Подходящие нерастворимые субстраты включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тестовые полоски, многолуночные планшеты и подобное. Нерастворимый субстрат может включать различные вещества (стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, натуральную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, агарозы и магнетит) и может быть представлен в различных формах, включая, например, агарозные шарики, полистирольные шарики, латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стекло и/или силиконовые пластинки и покрытия,нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, лунки в реакционных кюветах (например,многолуночные планшеты), пластиковые трубки и т.д. Ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза Настоящее изобретение описывает ферментативно неактивную сайт-специфическую эндорибонуклеазу, где ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связывается с искомой последовательностью в полирибонуклеотиде сайт-специфическим способом. Описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связывается с искомым полирибонуклеотидом сайтспецифическим образом, но не расщепляет искомый полирибонуклеотид. Описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза пригодна для изолирования целевой РНК из смеси нуклеиновых кислот, как описано выше. В некоторых вариантах воплощения, описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает один или более аминокислотных остатков, замещенных на естественно образовавшиеся ферментативно активные Csy4, CasE или Cas6 полипептиды. В некоторых вариантах воплощения, ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает аминокислотный остаток в His-29 Csy4 полипептида или в эквивалентной позиции в CasE или Cas6 полипептида. В некоторых вариантах воплощения, ферментативно неактивная сайтспецифическая эндорибонуклеаза включает аминокислотный остаток в Ser-148 Csy4 полипептида или в эквивалентной позиции в CasE или Cas6 полипептида. Фиг. 6 изображает неограничивающий пример подходящей ферментативно неактивной сайтспецифической эндорибонуклеазы аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 или 100% аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 6, при этом аминокислотная последовательность включает заместитель в His-29, Ser-50 или оба His-29 и Ser-50. Например, вариант Csy4 эндорибонуклеазы может включать Н 29 А (от His-29 до А 1 а-29) заместитель, S50C (от Ser-50 до Cys-50) заместитель или оба Н 29 А и S50C заместители. В некоторых вариантах воплощения ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза является разновидностью Csy4 эндорибонуклеазы. В некоторых случаях вариант варианты Csy4 эндорибонуклеазы включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 95% аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 6, где эндорибонуклеаза включает аминокислотный заместитель в His-29, где разновидность Csy4 эндорибонуклеазы ферментативно неактивна в отсутствии имидазола, и где разновидностьCsy4 эндорибонуклеазы активируется в присутствии имидазола. В некоторых случаях аминокислотный заместитель - это заместители от His29 до Ala29. В некоторых случаях, разновидность Csy4 эндорибонуклеазы также включает Ser-50 заместитель. В некоторых случаях, описанная разновидность Csy4 эндорибонуклеазы связывает РНК субстрат, который включает нуклеотидную последовательность 5'GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3' (SEQ ID NO:1). Описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза "условно" ферментативно неактивна, например, описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Csy4 эндорибонуклеазы), ферментативно неактивна в отсутствии имидазола; и ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Csy4 эндорибонуклеазы) активируемая имидазолом. Например, ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Csy4 эндорибонуклеазы) могут быть ферментативно активированы взаимодействием эндорибонуклеазы с имидазолом в концентрации от около 100 до около 500 мМ. Присутствие имидазола (например, в концентрации от около 100 мМ до около 500 мМ) восстанавливает сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу, так что эндорибонуклеаза становится ферментативно активной, например эндорибонуклеаза демонстрирует по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или более чем 95% сайт-специфической эндорибонуклеазы дикого типа (например, аминокислотная последовательность, изображенная на фиг. 5 (например, SEQ ID NO:6, 8 или 9. В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эн- 10024121 дорибонуклеаза (например, различные варианты Csy4 эндорибонуклеазы) содержит определяемый фрагмент, включающий функциональную группу, которая создает определяемый сигнал. Подходящий определяемый фрагмент и/или функциональная группа, которая создает определяемый сигнал, включает, но не ограничивается этим, фермент, радиоизотоп, компонент FRET пары, компонент специфично связанной пары, флюорофор; флюоресцентный белок; квантовую точку и подобное.EDANS/флюоресцеин, IAEDANS/флюоресцеин, флюоресцеин/тетраметилродамин, флюоресцеин/Су 5,IEDANS/DABCYL, флюоресцеин/QSY-7, флюоресцеин/LC Red 640, флюоресцеин/Су 5.5 и флюоресцеин/LC Red 705. Дополнительно может использоваться флюорофор/квантовая точка пара донор/акцептор. Подходящие флюорофоры ("флюоресцентные метки") включают любую молекулу, которая может быть определена посредством присущих ей флюоресцентных свойств, которые включают флюоресцентное определение возбужденной молекулы. Подходящие флюоресцентные метки включают, но не ограничиваются этим, флюоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малахитовый зеленый, стилбен, Lucifer Yellow, Cascade Blue, Texas Red, IAEDANS,EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705 и Oregon green. Подходящие оптические красители описаны в 2002 Molecular Probes Handbook, 9th Ed., by Richard P. Haugland, включенной здесь в виде ссылки. Подходящий фермент включает, но не ограничивается этим, пероксидазу хрена, люциферазу, галактозидазу и подобные. Подходящие флюоресцентные белки включают, но не ограничиваются этим, зеленый флюоресцентный белок (GFP), например GFP из Aequoria Victoria или мутантный, или производный от него, например, как описано в патентах США 6066476; 6020192; 5985577; 5976796; 5968750; 5968738; 5958713; 5919445; 5874304; красный флюоресцентный белок; желтый флюоресцентный белок; любой из возможных флюоресцентных и цветных белков из видов корраловых полипов, как описано, например, вMatz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973, и подобные. Подходящие наночастицы включают, например, квантовые точки (QDs), флюоресцентные или люминесцентные наночастицы и магнитные наночастицы. Любые оптические или магнитные свойства или параметры наночастиц могут быть определены.QDs и способы их синтеза хорошо известны в данной области техники (см., например, патенты США 6322901; 6576291 и 6815064). QDs могут быть водорастворимыми благодаря применению покрывающих слоев, включающих различные материалы (смотри, например, патенты США 6423551; 6251303; 6319426; 6426513; 6444143 и 6649138). Например, QDs могут быть растворены с использованием амфифильных полимеров. Примерные полимеры, которые используются, включают октиламинмодифицированную низкомолекулярную полиакриловую кислоту, полиэтиленгликоль (PEG)производные фосфолипидов, полиангидриды, блоковые кополимеры и т.д. QDs могут быть соединены с полипептидом через любое количество разных функциональных групп или связывающих агентов, которые могут быть напрямую или не напрямую связаны с покрывающим слоем (смотри, например патенты США 5990479; 6207392; 6251303; 6306610;6325144 и 6423551).QDs с широким спектром абсорбции и эмиссии с коммерческой точки зрения доступны, например,от Quantum Dot Corp. (Hayward Calif.; сейчас собственником является Invitrogen) или от Evident Technologies (Troy, N.Y.). Например, QDs, имеющие пик длины волны возбуждения приблизительно 525, 535,545, 565, 585, 605, 655, 705 и 800 нм доступны. Таким образом, QDs могут иметь диапазон различных цветов в видимой части спектра, а в некоторых случаях и за его пределами. Подходящие радиоизотопы включают, но не ограничиваются этим, 14 С, 3 Н, 32 Р, 33 Р, 35S,125I и 131I. Использование изотопов в качестве меток хорошо известно в данной области техники. В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Csy4 эндорибонуклеазы) иммобилизирована на нерастворимом субстрате. Подходящие нерастворимые субстраты включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тестовые полоски, многолуночные планшеты и им подобные. Нерастворимый субстрат может включать различные вещества (стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, натуральную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, агарозы и магнетит) и может быть представлен в различных формах,включая, например, агарозные шарики, полистирольные шарики, латексные шарики, магнитные шарики,коллоидные металлические частицы, стеклянные и/или кремниевые пластинки и поверхности, нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, лунки реакционных кювет (например, мультилуночные планшеты), пластиковые трубки и т.д. В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Csy4 эндорибонуклеазы) химически чистая, например,по меньшей мере на 80% чистоты, по меньшей мере 85% чистоты, по меньшей мере 90% чистоты, по меньшей мере 95% чистоты, по меньшей мере 98% чистоты, по меньшей мере 99% чистоты или более чем на 99% чистоты. Композиции Настоящее изобретение описывает композиции, включающие сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу. Композиция может включать в дополнении к сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазе одно или более следующих веществ: соль, например NaCl,MgCl, KCl, MgSO4 и т.д.; буферный агент, например Tris-буфер, N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2 этансульфоновую кислоту) (HEPES), 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), 2-(Nморфолино)этансульфоновую кислоту натриевую соль (MES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту (MOPS), N-трис[гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS) и т.д.; растворяющий агент; детергент, например неионный детергент, такой как Tween-20, и т.д; ингибитор протеазы и подобные. Ферментативно активная сайт-специфическая эндорибонуклеаза В некоторых вариантах воплощения ферментативно активная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает функциональную группу, которая обеспечивает детектирование. Например, описанная ферментативно активная сайт-специфическая эндорибонуклеаза может включать ковалентно или нековалентно связанную функциональную группу, которая обеспечивает детектирование. Подходящие метки детекции включают любую композицию, детектируемую спектроскопическими,фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими методами. Функциональные группы, которые обеспечивают детектирование, включают, но не ограничиваются этим, флюоресцентную молекулу, квантовую точку, фермент (отличный от эндорибонуклеазы), при этом фермент катализирует переход субстрата в детектируемый продукт, при этом продукт непосредственно определяемый; наночастицу; и подобные. Подходящие флюоресцентные белки, которые могут быть связаны с ферментативно активной сайтспецифической эндорибонуклеазой, включают, но не ограничиваются этим, зеленый флюоресцентный белок (GFP), например, GFP из Aequoria Victoria или мутантный, или производный от него, например,как описан в патентах США 6066476; 6020192; 5985577; 5976796; 5968750; 5968738; 5958713; 5919445;5874304; красный флюоресцентный белок; желтый флюоресцентный белок; любой из возможный флюоресцентных и цветных белков из видов коралловых полипов, как описаны, например, в Matz etal. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973, и подобные. Подходящие наночастицы включают, например, квантовые точки (QDs), флюоресцентные или люминесцентные наночастицы и магнитные наночастицы. Любые оптические или магнитные свойства и параметры наночастиц могут быть определены.QDs и способы их синтеза хорошо известны (смотри, например, патенты США 6322901; 6576291 и 6815064). QDs могут быть водорастворимыми благодаря применению покрывающих слоев, включающих различные материалы (см., например, патенты США 6423551; 6251303; 6319426; 6426513; 6444143 и 6649138). Например, QDs могут быть растворены с использованием амфифильных полимеров. Примерные полимеры, которые используются, включают октиламин-модифицированную низкомолекулярную полиакриловую кислоту, полиэтиленгликоль (РЕО)-производные фосфолипидов, полиангидриды, блоковые кополимеры и т.д. QDs могут быть соединены с полипептидом через любое количество разных функциональных групп или связывающих агентов, которые могут быть напрямую или не напрямую связаны с покрывающим слоем (см., например патенты США 5990479; 6207392; 6251303; 6306610; 6325144 и 6423551).QDs с широким спектром абсорбции и эмиссии с коммерческой точки зрения доступны, например,от Quantum Dot Corp. (Hayward Calif.; сейчас собственником является Invitrogen) или от Evident Technologies (Troy, N.Y.). Например, QDs, имеющие пик длины волны возбуждения приблизительно 525, 535,545, 565, 585, 605, 655, 705 и 800 нм доступны. Таким образом, QDs могут иметь диапазон различных цветов в видимой части спектра, а в некоторых случаях и за его пределами. В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно активная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Csy4 эндорибонуклеазы) химически чистая, например, на,по меньшей мере 80% чистоты, по меньшей мере 85% чистоты, по меньшей мере 90% чистоты, по меньшей мере 95% чистоты, по меньшей мере 98% чистоты, по меньшей мере 99% чистоты или более чем на 99% чистоты. Композиции Настоящее изобретение описывает композиции, включающие сайт-специфическую ферментативно активную эндорибонуклеазу. Композиция может включать в дополнение к описанной сайтспецифической ферментативно активной эндорибонуклеазе одно или более следующих веществ: соль,например, NaCl, MgCl, KCl, MgSO4 и т.д.; буферный агент, например, Tris буфер, N-(2 гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновую кислоту) (HEPES), 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту натриевую соль (MES), 3-(Nморфолино)пропансульфоновую кислоту (MOPS), N-трис[гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS) и т.д.; растворяющий агент; детергент, например неионный детергент, такой как Tween-20 и т.д.; ингибитор протеазы и подобные. Настоящее изобретение описывает композиции, включающие сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу (например, различные варианты Csy4 эндорибонуклеазы). Композиция может включать в дополнение к описанной сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазе одно или более следующих веществ: соль, например, NaCl, MgCl, KCl, MgSO4 и т.д.; буферный агент, например Tris буфер, N-(2-гидроэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновую кислоту) (HEPES), 2-(Nморфолино)этансульфоновую кислоту (MES), 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту натриевую соль (MES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту (MOPS), N-трис[гидроксиметил]метил-3 аминопропансульфоновую кислоту (TAPS) и т.д.; растворяющий агент; детергент, например неионный детергент, такой как Tween-20, и т.д.; ингибитор протеазы и подобные. В некоторых вариантах воплощения композиция не содержит имидазол. В некоторых вариантах воплощения композиция включает имидазол в концентрации от около 100 до около 500 мМ. Способы получения сайт-специфической эндорибонуклеазы Сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза; сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза) может быть получена любым известным способом, например традиционными синтетическими способами для белкового синтеза; способами рекомбинирования ДНК и т.д. Там, где сайт-специфическая эндорибонуклеаза химически синтезирована, синтез может проходить через жидкую фазу или твердую фазу. Твердая фаза полипептидного синтеза (SPPS), в которой Стерминальная аминокислота последовательности соединяется с нерастворимым субстратом за последующим присоединением оставшихся аминокислот в последовательности, - это пример подходящего способа для химического синтеза сайт-специфической эндорибонуклеазы. Различные варианты SPPS,такие как Fmoc и Boc, доступны для синтеза описанной сайт-специфической эндорибонуклеазы. Методики для твердофазного синтеза описана Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 inPept Lett. 12:723-8. Стандартные рекомбинантные способы могут быть использованы для получения сайтспецифической эндорибонуклеазы. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие сайт-специфическую эндорибонуклеазу, вставлены в векторы экспрессии. ДНК сегменты, кодирующие сайт-специфическую эндорибонуклеазу активно связаны с контролирующими последовательностями в векторе/-ах экспрессии, который/-ые обеспечивают экспрессию кодирующих полипептидов. Последовательности контроля экспрессии включают, но не ограничиваются этим, промоторы (например, естественно-связанные или разнородные промоторы), сигнальные последовательности, элементы усиления и последовательности прерывания транскрипции. Последовательности контроля экспрессии могут быть системами эукариотических промоторов в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотических клетокносителей (например, COS или СНО клетки). Как только вектор стал частью подходящего носителя, носитель сохраняется в условиях высокоуровневой экспрессии нуклеотидных последовательностей, и в условиях сборки и очищения эндорибонуклеазы. Нуклеиновые кислоты и клетки-носители Настоящее изобретение описывает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза; сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза). В некоторых вариантах воплощения нуклеиновая кислота - это вектор экспрессии, при этом вектор экспрессии способствует получению сайт-специфической эндорибонуклеазы, например, в клетке. Нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза; сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза) может быть активно связана с одним или более регуляторными элементами, такими как промотор или усилитель, что способствует экспрессии нуклеотидной последовательности в определенных клетках-мишенях (например, клетка, которая генетически модифицирована чтобы синтезировать кодируемую эндорибонуклеазу). В некоторых вариантах воплощения нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 или 100% с аминокислотной последовательностью, изображенной на фиг. 4 или 5. В некоторых вариантах воплощения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую различные Csy4 полипептиды, как описано выше. Нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза; сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза) может быть активно связана с элементом контроля транскрипции (например, промотором, усилителем и т.д.). Подходящие промоторные и усилительные элементы хорошо известны в данной области техники. Для экспрессии в бактериальной клетке подходящие промоторы включают, но не ограничиваются этим, lacI, lacZ, Т 3, Т 7, gpt, lambda Р и trc. Для экспрессии в эукариоти- 13024121 ческой клетке подходящие промоторы включают, но не ограничиваются этим, цитомегаловируса медиаторный ранний промотор, промотор тимидинкиназы простого вируса герпеса; ранний и поздний SV40 промоторы; промотор, присутствующий в длинных терминальных повторениях ретровируса; мышиный металлотионеин-I промотор и различные известные в данной области техники тканевые специфические промоторы. В некоторых вариантах воплощения , например, для экспрессии в дрожжевых клетках, подходящий промотор является конститутивным промотором, таким как ADH1 промотор, PGK1 промотор, ENO промотор, PYK1 промотор и подобные; или регулирующий промотор, такой как GAL1 промотор, GAL 10 промотор, ADH2 промотор, РНО 5 промотор, CUPl промотор, GAL7 промотор, МЕТ 25 промотор, МЕТ 3 промотор, CYC1 промотор, HIS 3 промотор, ADH1 промотор, PGK промотор, GAPDH промотор, ADC1 промотор, TRP1 промотор, URA3 промотор, LEU2 промотор, ENO промотор, ТР 1 промотор, и АОХ 1(например, для использования в Pichia). Выбор подходящего вектора и промотора обуславливается навыками специалиста в определенной области техники. Подходящие промоторы для использования в прокариотических клетках-носителях включают, но не ограничиваются этим, бактериофаг Т 7 РНК полимеразный промотор; trp промотор; lac опероновый промотор; двойной промотор, например, lac/tac двойной промотор, tac/trc двойной промотор, trp/lac промотор, Т 7/1 ас промотор; trc промотор, tac промотор и подобные; araBAD промотор; промоторы, регулируемые in vivo, такие как ssaG промотор или родственный промотор (см., например патент США 20040131637),pagC промотор (Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol, 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al,PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), nirB промотор (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), и подобные(см., например, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:32433255; и Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); sigma70 промотор, например консенсусный sigma70 промотор (см., например, GenBank Accession Nos. AX798980, AX798961 и АХ 798183); стационарный фазовый промотор, например, dps промотор, spv промотор и подобные; промотор, выделенный из патогенетического островка SPI-2 (см., например, WO 96/17951); actA промотор (см., например, Shetron-RamaHeinemann,U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan,London, UK, Vol. 10, pp. 143-162); SP6 промотор (см., например, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035) и подобные. Подходящие сильные промоторы для использования в прокариотических клетках,таких как Escherihia coli включают, но не ограничиваются этим, Trc, Тас, Т 5, Т 7 и PLambda. Неограничивающий пример операторов для использования в бактериальных клетках-носителях включают лактозный оператор промотора (LacI репрессорный протеин изменяет конформацию при контакте с лактозой, таким образом предохраняя LacI репрессорный протеин от связывания с оператором), триптофановый оператор промотора (при связывании с триптофаном, TrpR репрессорный протеин имеет конформацию, которая связывается с оператором; при отсутствии триптофана, TrpR репрессорный протеин имеет конформацию, которая не связывается с оператором) и tac оператор промотора (см., например, deBoer et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). Нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическую ферментативно активную эндорибонуклеазу; сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу) может быть представлена в векторе экспрессии и/или векторе клонирования. Вектор экспрессии может включать в себя селективный маркер начала репликации и другие функции, которые обеспечивают репликацию и/или поддержание вектора. Большое количество подходящих векторов и промоторов известно специалистам в данной области техники, многие из них являются коммерчески доступными для генерации описанной рекомбинантной конструкции. Следующие векторы предоставляются в качестве примера. Бактериальные: pBs, phagescript,PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA);pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL (Pharmacia). Векторы экспрессии, как правило, имеют удобные сайты рестрикции, которые располагаются рядом с промоторной последовательностью для обеспечения введения нуклеиновых кислот, кодирующих гетерологичные белки. Выборочный маркер оперативный в экспрессии носителя может присутствовать. Подходящие векторы экспрессии включают, но не ограничиваются ими, вирусные векторы (например,вирусные векторы на основе вируса коровьей оспы, вируса полиомиелита, аденовирусы (см., например,Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704,1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097,1999; WO 94/12649, WO 93/03769;SV40; вируса простого герпеса, вируса иммунодефицита человека (см., например, Miyoshi et al., PNASSarcoma Virus, Harvey Sarcoma Virus, вирус птичьего лейкоза, вирус иммунодефицита человека, миелопролиферативный вирус саркомы и вирус опухоли молочной железы); и тому подобное. Настоящее изобретение обеспечивает изолированные генетически модифицированные клеткиносители (например, in vitro клетки), которые являются генетически модифицированными нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах воплощения, изолированная генетически модифицированная клетканоситель может производить сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическую ферментативно активную эндорибонуклеазу; сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу). Подходящие клетки-носители включают эукариотические клетки-носители, такие как клетки млекопитающих, клетки-носители насекомых, дрожжевые клетки, и прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки. Введение нуклеиновой кислоты в клетку-носитель может быть осуществлено,например, путем осаждения фосфата кальция, DEAE декстран опосредованной трансфекции, липосомоопосредованной трансфекции, электропорации, или других известных способов. Подходящие клетки млекопитающих включают первичные клетки и иммортализованные клеточные линии. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают в себя человеческие клеточные линии,нечеловеческие клеточные линии приматов, клеточные линии грызунов (например, мыши, крысы), и тому подобное. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают, но не ограничиваются этим,HeLa клетки (например, Американской коллекции типовых культур (АТСС)CCL-2), клетки СНО (например, АТССCRL9618, CCL61, CRL9096), 293 клетки (например, АТССCRL-1573), Vero клетки,NIH 3 Т 3 клетки (например, АТССCRL-1658), Huh-7 клетки, ВНК клетки (например, АТССCCL10),РС 12 клетки (АТССCRL1721), COS клетки, COS-7 клетки (АТССCRL1651), RAT1 клетки, L клетки мыши (АТССCCLI.3), эмбриональные клетки человеческих почек (НЕК) (АТССCRL1573),HLHepG2 клетки и тому подобное. Подходящие клетки дрожжей включают, но не ограничиваются ими, Pichia pastoris, Pichiaalbicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii,VL подобные. Подходящие прокариотические клетки включают, но не ограничиваются ими, любые из множества лабораторных штаммов кишечной палочки, Escherichia coli, Lactobacillus sp., Salmonella sp., Shigella sp., и тому подобные. См., например, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181, патент США 6447784;Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302. Примеры штаммов сальмонелл, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, Salmonella typhi и S. typhimurium. Подходящие штаммы Shigella включают, но не ограничиваются ими, Shigella flexneri, Shigella sonnei иShigella disenteriae. Как правило, лабораторный штамм не является патогенным. Не ограничивающие примеры других подходящих бактерий включают, но не ограничиваются ими, Bacillus subtilis, Pseudomonas pudita, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Rhodobacter sphaeroides, Rhodohacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Rhodococcus sp., и тому подобные. В некоторых вариантах воплощения клеткой-носителем является Escherichia coli. Наборы Настоящее изобретение также предоставляет наборы для определения нуклеотидной последовательности целевого полирибонуклеотида. Настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения сайт-специфического расщепления субстрата полирибонуклеотида. Настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения обнаружения последовательности РНК в целевом полирибонуклеотиде. Настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения изоляции РНК-мишени. Настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения изоляции полипептида, который связывается с РНКмишенью. Наборы для проведения прямого секвенирования полирибонуклеотида Комплект для проведения прямого секвенирования полирибонуклеотида включает в себя, по меньшей мере, сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу, где сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза очищена. В некоторых вариантах воплощения, сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза связана с молекулой акцептором или молекулой донором, для FRET детекции. Комплект для проведения прямого секвенирования полирибонуклеотида включает в себя, по меньшей мере, сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу, а также может включать в себя один или более дополнительных компонентов, в которых один или более дополнительных компонентов могут быть: 1) буфером; 2) олигонуклеотидным зондом, содержащим определенную последовательность; 3) олигонуклеотидный зондом, содержащим определенную последовательность, в которой олигонуклеотидный зонд связан с молекулой акцептором или молекулой донором, для FRET детекции; 4) нерастворимой подложкой, для соединения с целевым полирибонуклеотидом; 5) положительным контрольным полирибонуклеотидом, где положительный контрольный полирибонуклеотид содержит известную последовательность нуклеотидов; 6) положительным контрольным олигонуклеотидным зондом, который связывает и образует дуплекс с известной последовательностью положительного контрольного полирибонуклеотида. В дополнение к вышеупомянутым компонентам комплект может дополнительно включать в себя инструкции по использованию компонентов набора в практике способов. Инструкции для практикующих способов, как правило, отражаются на соответствующем носителе. Например, инструкции могут быть напечатаны на подложке, такой как бумага или пластик и т.д. Таким образом, инструкции могут быть представлены в комплектах как листок-вкладыш, в маркировке контейнера набора или его компонентов(например, связанного с упаковкой или субупаковкой) и т.д. В других вариантах воплощения инструкции присутствуют в виде электронного файла хранения данных, присутствующих на подходящих машиночитаемых носителях, например, CD-ROM, дискетах и т.д. В других вариантах воплощения, фактические инструкции не присутствуют в комплекте, что означает, что получение инструкций обеспечено от удаленного источника, например, через Интернет. Примером этого варианта воплощения является комплект,который включает в себя веб-адрес, где команды могут быть просмотрены и / или из которого команды могут быть загружены. Как и с инструкциями, это средство для получения инструкций, записанных на подходящий носитель. Наборы для проведения сайт-специфического расщепления субстрата полирибонуклеотида Комплект для проведения сайт-специфического расщепления субстрата полирибонуклеотида включает в себя, по меньшей мере, очищенную сайт-специфическую эндорибонуклеазу и/или нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт-специфическую последовательность конкретной эндорибонуклеазы. Комплект для проведения сайт-специфического расщепления субстрата полирибонуклеотида может включать в себя, в дополнение к очищенной сайт-специфической эндорибонуклеазе (и/или нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность конкретной эндорибонуклеазы), один или более дополнительных компонентов. Подходящие дополнительные компоненты включают в себя, например, буфер; полирибонуклеотидный субстрат, который служит в качестве положительного контроля; полирибонуклеотид стандартных размеров; субстрат отрицательного контроля; и тому подобное. Компоненты могут быть помещены каждый в отдельную емкость. Комплект может дополнительно включать в себя один или несколько положительных и отрицательных контролей. В дополнение к вышеупомянутым компонентам комплект может дополнительно включать в себя инструкции по использованию компонентов набора в практике способов. Инструкции для практикующих способов, как правило, отражаются на соответствующем носителе. Например, инструкции могут быть напечатаны на подложке, такой как бумага или пластик и т.д. Таким образом, инструкции могут быть представлены в комплектах как листок-вкладыш, в маркировке контейнера набора или его компонентов(например, связанного с упаковкой или субупаковкой) и т.д. В других вариантах воплощения инструкции присутствуют в виде файлов электронного хранения данных, присутствующих на подходящих машиночитаемых носителях, например, CD-ROM, дискетах и т.д. В других вариантах воплощения, фактические инструкции не присутствуют в комплекте, что означает, что получение инструкций обеспечено от удаленного источника, например, через Интернет. Примером этого варианта воплощения является комплект,который включает в себя веб-адрес, где команды могут быть просмотрены и / или из которого команды могут быть загружены. Как и с инструкциями, это средство для получения инструкций, записанных на подходящий носитель. Наборы для проведения обнаружения последовательности в целевом полирибонуклеотиде Комплект для проведения детектирования последовательности в целевом полирибонуклеотиде (например, для проведения детектирования полирибонуклеотида) может включать в себя олигонуклеотидный зонд, содержащий известную последовательность. В некоторых вариантах воплощения, комплект будет включать в себя олигонуклеотидный зонд, содержащий известную последовательность и содержащий функциональную группу детектирования, например, полипептида, который может быть обнаружен с помощью иммунологического анализа; флуоресцентный белок; люциферин и т.д. Комплект может дополнительно включать в себя положительный контрольный полирибонуклеотид, который содержит последовательность нуклеотидов, способных образовывать дуплекс с олигонуклеотидным зондом. Комплект может дополнительно включать ферментативно активную специфическую последовательность эндорибонуклеазы, которая специфично выявляет и расщепляет дуплекс, образованный олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом. Комплект может дополнительно включать в себя один или несколько буферов; компоненты для обнаружения детектируемой функциональной группы; тестполоски и тому подобное. Комплект может дополнительно включать в себя один или несколько положительных и отрицательных контролей. В дополнение к вышеупомянутым компонентам комплект может дополнительно включать в себя инструкции по использованию компонентов набора в практике способов. Инструкции для практикующих способов, как правило, отражаются на соответствующем носителе. Например, инструкции могут быть напечатаны на подложке, такой как бумага или пластик и т.д. Таким образом, инструкции могут быть представлены в комплектах как листок-вкладыш, в маркировке контейнера набора или его компонентов(например, связанного с упаковкой или субупаковкой) и т.д. В других вариантах воплощения инструкции присутствуют в виде файлов электронного хранения данных, присутствующих на подходящих машиночитаемых носителях, например CD-ROM, дискетах и т.д. В других вариантах воплощения фактические инструкции не присутствуют в комплекте, что означает, что получение инструкций обеспечено от удаленного источника, например через Интернет. Примером этого варианта воплощения является комплект,который включает в себя веб-адрес, где команды могут быть просмотрены и/или из которого команды могут быть загружены. Как и с инструкциями это средство для получения инструкций, записанных на подходящий носитель. Наборы для проведения изоляции РНК-мишени Комплект для проведения изоляции (например, очистки) РНК-мишени может включать в себя один или более из: 1) сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу; 2) экспрессирующую конструкцию, содержащую "меченую" нуклеотидную последовательность, то есть нуклеотидную последовательность, которая специфически связана сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой, где нуклеотидная последовательность, кодирующая РНК-мишень выбора может быть вставлена 3' "меченой" нуклеотидной последовательности; и 3)имидазола. Сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза может быть иммобилизована на нерастворимую подложку. Комплект может дополнительно включать в себя жидкую композицию для контакта смешанной популяции нуклеиновых кислот с иммобилизованой сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой. Комплект может дополнительно включать в себя промывочный буфер. Комплект может дополнительно включать в себя один или несколько положительных и отрицательных контролей. Положительный контроль может включать вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую отмеченную РНК-мишень, где метка специально связана посредством сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазы. Компоненты могут быть помещены каждый в отдельные емкости. Например, комплект может включать в себя сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу. Комплект может дополнительно включать в себя рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий в порядке от 5' до 3' и в функциональной связи: а) нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК субстрат, который специфически связывается различными Csy4 эндорибонуклеазами; и б) несколько сайтов клонирования, подходящих для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК-мишень. Нуклеотидная последовательность, кодирующая РНК субстрат, может быть функционально связана с промотором. В некоторых случаях промотор является индуцируемым промотором. РНК субстрат может содержать последовательность нуклеотидов 5'-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3' (SEQ ID NO: 1). В некоторых случаях, рекомбинантный вектор экспрессии включает в себя вставленную в сайт множественного клонирования нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК-мишень. Комплект может дополнительно включать в себя буфер, не содержащий имидазол. Комплект может дополнительно включать имидазол или раствор имидазола. Комплект может дополнительно включать в себя один или более буферов отмывки. В некоторых случаях комплект будет включать в себя положительный контрольный вектор экспрессии. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы может быть иммобилизованными на нерастворимую подложку, где подходящие нерастворимые носители включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тест-полоски, мультилуночные планшеты, и тому подобное. Нерастворимая подложка может включать в себя различные вещества (стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозу и магнетит) и может быть представлена в полистироле, шариками из латекса, магнитными шариками, коллоидными частицами металла, стекла и/или кремниевых пластин и поверхностей, нитроцеллюлозными полосками,нейлоновыми мембранами, листами, луночными реакционными кюветами (например, мультилуночными планшетами), пластиковыми трубками и т.д. В дополнение к вышеупомянутым компонентам, комплект может дополнительно включать в себя инструкции по использованию компонентов набора в практике способов. Инструкции для практикующих способов, как правило, отражаются на соответствующем носителе. Например, инструкции могут быть напечатаны на подложке, такой как бумага или пластик и т.д. Таким образом, инструкции могут быть представлены в комплектах как листок-вкладыш, в маркировке контейнера набора или его компонентов (например, связанного с упаковкой или субупаковкой) и т.д. В других вариантах воплощения инструкции присутствуют в виде файлов электронного хранения данных,присутствующих на подходящих машиночитаемых носителях, например, CD-ROM, дискетах и т.д. В других вариантах воплощения, фактические инструкции не присутствуют в комплекте, что означает, что получение инструкций обеспечено от удаленного источника, например, через Интернет. Примером этого варианта воплощения является комплект, который включает в себя веб-адрес, где команды могут быть просмотрены и/или из которого команды могут быть загружены. Как и с инструкциями это средство для получения инструкций, записанных на подходящий носитель. Способы непосредственного секвенирования целевого полирибонуклеотида Настоящее изобретение обеспечивает способ прямого определения нуклеотидной последовательности целевого полирибонуклеотида. Так, например, способ не требует синтеза полидезоксирибонуклеотидного дубликата целевого полирибонуклеотида в целях определения нуклеотидной последовательности целевого полирибонуклеотида. Вирусная диагностика, персонализированная медицина, одноклеточный транскрипционный анализ и трансляционное профилирование - все области, в которых прямое определение РНК и последовательности находит применение. Метод секвенирования полирибонуклеотида и метод обнаружения определенной последовательности в полирибонуклеотиде находят применение в таких различных областях. Метод секвенирования полирибонуклеотида обычно включает в себя: а) контакт целевого полирибонуклеотида с олигонуклеотидным зондом, содержащим определенную известную последовательность, и ферментативно неактивной сайт-специфической эндорибонуклеазой в условиях, которые способствуют формированию дуплекса между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, где ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связывает определенную последовательность в дуплекс; иb) выявление специфического связывания между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, где специфическое связывание ферментативно неактивной сайт-специфической эндорибонуклеазой в дуплекс указывает на наличие определенной последовательности в целевом полирибонуклеотиде. В некоторых случаях ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза является связанной (ковалентно или нековалентно) с эмиссионной меткой. Под "эмиссионной меткой" подразумевается любая молекула, которая может быть обнаружена с помощью своих неотъемлемых свойств излучения, которые включают в себя эмиссию, обнаруживаемую при возбуждении. Подходящие эмиссионных метки включают, но не ограничиваются этим, флюоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин,эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малахитовый зеленый, стильбен, Lucifer Yellow, CascadeBlue, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705 и Oregon green. Подходящие оптические красители описаны в 2002 году Richard P. Haugland в Molecular ProbesHandbook, 9th Ed. В некоторых случаях олигонуклеотидный зонд, используемый в способе секвенирования полирибонуклеотида, связан с молекулой донором, ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связана с акцепторной молекулой, и обнаружение образования дуплекса происходит посредством резонансного переноса энергии флуоресценции (также известного как "Форстер резонансный перенос энергии " или "FRET"). Форстер резонансный перенос энергии (FRET) - явление, известное в данной области техники, при котором возбуждение одного эмиссионного красителя переносится на другой без испускания фотона.FRET пара состоит из хромофора донора и хромофора акцептора (где акцепторный хромофор может быть гасителем люминесценции молекулы). Спектр излучения донора и спектр поглощения акцептора должны перекрываться, и две молекулы должны находиться в непосредственной близости. Расстояние между донором и акцептором, при котором 50% доноров деактивированы (передача энергии на акцептор) определяется радиусом Форстера, который, как правило, составляет 10-100 ангстрем. Изменения в спектре излучения содержащих FRET пар могут быть обнаружены, что указывает на изменения в количестве пар, которые находятся в непосредственной близости (т.е. на расстоянии 100 ангстрем друг от друга). Это, как правило, происходит в результате связывания и диссоциации двух молекул, одна из которых помечена FRET донором и другая из которых помечена FRET акцептором, в котором такое связывание приводит к FRET паре в непосредственной близости. Связывание таких молекул может привести к увеличению эмиссии акцептора и/или гашению флуоресцентного излучения донора. FRET пары (донор/акцептор), пригодные для использования, включают,но не ограничиваются этим, EDANS/флюоресцеин, IAEDANS/флюоресцеин, флюоресцеин/тетраметилродамин, флюоресцеин/Су 5, IEDANS/DABCYL, флюоресцеин/QSY-7, флюоресцеин/LCIAEDANS представляет собой 5-(2-[(йодацетил)амино]этиламино)нафталин-1-сульфокислота); DABCYL представляет собой 4-(4-диметиламинофенил)диазенилбензойная кислота. Су 3, Су 5, Су 5.5 и тому подобные являются цианинами. Например, Су 3 и Су 5 являются реакционноспособными растворимыми в воде флуоресцентными красителями цианинового семейства красителей. Су 3 красители - красные (ок.550 нм возбуждение, ок.570 нм излучения и, следовательно, проявляются зелеными), в то время как Су 5 является флуоресцентным в красной области (ок.650/670 нм), но поглощает в оранжевой области (ок.649 нм). Alexa Fluor красители, DyLight, IRIS красители, Seta красители, SeTau красители, SRfluor красители и Square красители также могут быть использованы. В другом аспекте FRET эмиссионная молекула донор и неэмиссионная молекула акцептор ("гаситель") могут быть использованы. В этом приложении излучение донора будет возрастать по мере гашения люминесценции при смещении ближе к донору, и излучение будет уменьшаться, когда гашение люминесценции приводит к непосредственной близости к донору. Используемые гасители люминесценции,включают, но не ограничиваются этим, DABCYL, QSY 7 и QSY 33. Используемые пары флуоресцентные доноры/гасители люминесценции включают, но не ограничиваются этим, EDANS/DABCYL, TexasRed/DABCYL, BODIPY/DABCYL, Lucifer yellow/DABCYL, кумарин/DABCYL и флюоресцеин/QSY 7 краситель. В некоторых случаях ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза является связанной (ковалентно или нековалентно) с ферментом меткой. "Фермент метка" означает фермент, который может вступать в реакцию в присутствии субстрата метки фермента, который производит обнаруживаемый продукт. Подходящие ферменты метки также включают оптически детектируемые метки (например, в случае с пероксидазой хрена (HRP. Подходящие ферменты метки включают, но не ограничиваются этим, HRP, щелочную фосфатазу, люциферазу, -галактозидазу и глюкозооксидазу. Способы использования таких субстратов хорошо известны в данной области техники. Наличие фермента метки, как правило, раскрывается через катализ ферментом реакции с субстратом фермента метки, производимым идентифицируемым продуктом. Такие продукты могут быть непрозрачными, такими как при реакции пероксидазы хрена с тетраметилбензидином и могут иметь различные цвета. Другие субстраты для фермента метки, которые производят флуоресцентные продукты реакции, такие как Luminol (доступен отPierce Chemical Co.), были разработаны. Способы определения ферментов меток с субстратами ферментов меток хорошо известны в данной области техники и многие коммерческие наборы доступны. Примеры и способы использования различных ферментов меток описаны в Savage et al., Previews 247:6-9(1998), Young, J. Virol. Methods 24:227-236 (1989). В некоторых случаях ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает в себя радиоизотоп. "Радиоизотоп" означает любые радиоактивные молекулы. Подходящие радиоизотопы для использования в данном изобретении, включают, но не ограничиваются этим, 14 С, 3 Н, 2 Р, Р, 5S, 125I и 131I. Использование радиоизотопов в качестве меток хорошо известно в данной области техники. В некоторых случаях ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза является связанной (ковалентно или нековалентно) с членами пар специфического связывания ("партнер связанная пара"). "Партнер связанная пара" или "член связанная пара" означает одну пару из первой и второй функциональной группы, где первая и вторая функциональная группа имеют специфическое сродство друг к другу. Подходящие связанные пары включают, но не ограничиваются этим, антиген/антитело (например, дигоксигенин/антидигоксигенин, динитрофенил (DNP)/анти-DNP, дансил/антидансил, флюоресцеин/антифлюоресцеин, люцифер желтый/антилюцифер желтый и родамин/антиродамин), биотин/авидин (или биотин/стрептавидин) и кальмодулин-связывающий белок (СВР)/кальмодулин. В некоторых вариантах воплощения олигонуклеотидный зонд содержит изменения, которые обеспечивают повышенную устойчивость к неспецифическому гидролизу. Такие модификации хорошо известны в данной области техники и включают, например, нуклеазоустойчивые межнуклеозидные связи,изменение основного скелета, базовые модификации, замены оснований, модификации сахара и тому подобное. Подходящее изменение олигонуклеотидного скелета, содержащего атом фосфора, включает, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил и другие алкилфосфонаты, в том числе 3'-алкиленфосфонаты, 5'алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3'аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидат, фосфородиамидаты, тионофосфоамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, селенофосфаты и боранофосфаты с нормальными 3'5'связями, 2'-5' связанные их аналоги, и тех, у которых инвертирована полярность за счет одной или нескольких межнуклеотидных связей, являющихся 3'-3', 5'-5' или 2'-2' связями. Подходящие олигонуклеотиды, имеющие обратную полярность, имеют одну 3'-3' связь с 3'- межнуклеотидной связью, т.е. один инвертированный нуклеозидный остаток, который может быть основным (нуклеооснование отсутствует или имеет гидроксильные группы на их месте). Различные соли (такие как, например, калия или натрия),смешанные соли и формы свободных кислот также включены. Модифицированный олигонуклеотид может содержать одну или более фосфоротиоатных и/или гетероатомных межнуклеозидных связей, в частности -CH2-NH-О-СН 2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (известный как метилен (метилимино) или MMI скелет), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- и -ON(CH3)-CH2-CH2- (где нативное межнуклеотидное фосфодиэфирное связывание представлено как -ОР(=О)(ОН)-О-СН 2-). MMI тип межнуклеозидного связывания раскрыт в вышеупомянутых патентах США 5489677. Подходящее межнуклеозидное амидное связывание раскрыто в патенте США 5602240. Модифицированный олигонуклеотид может содержать одну или более морфолиновую скелетную структуру, как описано, например, в патенте США 5034506. Например, в некоторых вариантах воплощения модифицированный олигонуклеотид включает в себя 6-членное морфолиновое кольцо в месте кольца рибозы. В некоторых из этих вариантов воплощения фофсородиамидат или другая нефосфодиэфирная межнуклеозидная связь заменена фосфодиэфирной связью. Морфолинонуклеиновые кислоты ("morpholinos") включают в себя основания, связанные с морфолиновым кольцом вместо кольца дезоксирибозы; кроме того, фосфатный скелет может включать в себя нефосфатную группу, например,фосфородиамидатную группу вместо фосфата. Summerton (1999) Biochim. Biophys. Acta 1489:141; Heasman (2002) Dev. Biol. 243:209; Summerton and Weller (1997) AntisenseNucl. Acid Drug Dev. 7:187;Drug Dev. 6:169; Amantana et al. (2007) Bioconj. Chem. 18:1325; Morcos et al. (2008) BioTechniques 45:616. Модифицированный олигонуклеотид может включать в себя измененный скелет. Модифицированные полинуклеотидные скелеты, которые не включают атом фосфора в свой скелет, образуются короткими алкильными цепями или циклоалкил межнуклеозидными связями, смешанными гетероатом и алкил или циклоалкил межнуклеозидными связями, или одной или более короткой гетероатомной цепью или гетероциклической межнуклеозидной связью. К ним относятся те, которые имеют морфолиновую связь(образована в части из сахарного фрагмента нуклеозида); силоксановый скелет; сульфид, сульфоксид и сульфоновый скелет; формацетил и тиоформацетил скелет; метиленформацетил и тиоформацетил скелет; рибоацетил скелет; алкенсодержащий скелет; сульфамат скелет; метиленимино и метиленгидразино скелет; сульфонат и сульфонамид скелет; амид скелет, а также другие, имеющие смешанные N, О, S и СН 2 компонентные части. Модифицированный олигонуклеотид может содержать один или более замещенных остатков сахара. Подходящие олигонуклеотиды составляют группу заместителей сахара, выбранных из ОН, F, О-, Sили N-алкил; О-, S- или N-алкенил, О-, S- или N-алкинил, или О-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил и алкинил может быть замещенным или незамещенным C1-С 10 алкилом или С 2-С 10 алкенилом и алкинилом. Также подходящими являются OCH2)nO)mCH3,O(CH2)nOCH3,O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 иO(CH2)nONCH2)nCH3)2, где n и m от 1 до 10. Другие подходящие олигонуклеотиды составляют группу заместителей сахара, выбранных из C1-С 10 низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил,алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3,ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК расщепляющие группы, репортерные группы, интеркаляторы и тому подобное. Соответствующие модификации включают в себя 2'-метоксиэтокси (2'-О-СН 2 СН 2 ОСН 3, также известную как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), т.е. алкоксиалкоксигруппу. Еще соответствующие модификации включают в себя 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е.O(CH2)2ON(CH3)2 группу, также известную как 2'-DMAOE, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известную в данной области техники как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т. е. 2'-О-CH2-OCH2-N(CH3)2. Модифицированный олигонуклеотид может содержать одну или более нуклеооснований (часто называют в науке просто как "основание") модификаций или замен. Как здесь используется, "неизмененное" или "естественное" нуклеооснование включает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеооснования включают в себя другие синтетические и природные нуклеиновые основания, такие как 5-метилцитозин(5-me-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2 тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинил (-С = С-СН 3) урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5 урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8 замещенные аденина и гуанина, 5-гало особенно 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацила и цитозина, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин,7-диазагуанин и 7-диазааденин и 3-диазагуанин и 3-диазааденин. Дальнейшее изменение нуклеиновых оснований включает трициклические пиримидины, такие как феноксазина цитидин (1 Н-пиримидо (5,4-b)(1, 4) бензоксазин-2 (3 Н)-он), фенотиазина цитидин (1H-пиримидо (5,4-b) (1,4) бензотиазин-2 (3 Н)-он),G-зажимы, такие как замещенные феноксазина цитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-Н-пиримидо (5,4(b) (1, 4) бензоксазин -2(3 Н)-он), карбазол цитидин (2 Н-пиримидо (4,5-b) индол-2-он), пиридоиндол цитидин (Н-пиридо (3',2': 4,5) пирроло (2,3-d) пиримидин-2-он). Остатки гетероциклических оснований могут также включать те, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменяется другим гетероциклом, например, 7-диазааденином, 7-диазагуанозином,2-аминопиридином и 2-пиридоном. Подходящие ферментативно неактивные сайт-специфические эндорибонуклеазы включают в себя ферментативно неактивные сайт-специфические эндорибонуклеазы описанные ниже. Например, могут быть использованы ферментативно неактивные сайт-специфические эндорибонуклеазы, как показано на фиг. 6. В некоторых вариантах воплощения целевой полирибонуклеотид связан (ковалентно или некова- 20024121 лентно) на твердом носителе (на нерастворимом носителе). Подходящие нерастворимые носители включают, но не ограничиваются этим, шарики, планшеты (например, мультилуночные планшеты), полосы и т.д., где нерастворимый носитель может включать в себя различные материалы, включая, но не ограничиваясь этим, полистирол, полипропилен, агарозу и тому подобные. Олигонуклеотидные зонды ("олигонуклеотид обнаружения ") могут быть РНК, ДНК, или любой химически модифицированной версией РНК или ДНК, например пептидными нуклеиновыми кислотами(PNAs), заблокированными нуклеиновыми кислотами (LNAs), и тому подобное. Метод секвенирования полирибонуклеотида может включать в себя одну или несколько промывок,например, для удаления неспецифических родственных связанных компонентов, таких как неспецифически связанных олигонуклеотидных зондов, любых неспецифически связанных обнаруженных фрагментов и тому подобное. Неограничивающий пример того, как осуществлять способ секвенирования полирибонуклеотида заключается в следующем. Целевой полирибонуклеотид связан с твердой подложкой. Целевой полирибонуклеотид имеет неизвестную последовательность и является " РНК-последовательностью". Четыре олигонуклеотидных зонда из четырех различных известных нуклеотидных последовательностей каждая включают различные флуорофоры (флуорофоры 1-4). Флуорофоры являются членами FRET пар. Соответствующие члены FRET пар являются квантовыми точками. Квантовая точка связана с ферментативно неактивной сайт-специфической эндорибонуклеазой. Ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связывает, но не расщепляет, дуплекс, образующийся между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом. Только один из четырех олигонуклеотидных зондов связывает и образует дуплекс с целевым полирибонуклеотидом. Промывка удаляет любые несвязанные олигонуклеотидные зонды. Связывание олигонуклеотидного зонда-флуорофор 2 приводит к формированию дуплекса с целевым полирибонуклеотидом. Флуорофор 2, таким образом, находится в непосредственной близости от квантовой точки, связанной с ферментативно неактивной сайт-специфической эндорибонуклеазой, и флуоресценция гасится. Способы расщепления полирибонуклеотида Настоящее изобретение обеспечивает способ расщепления полирибонуклеотида сайтспецифическим образом. Способ обычно включает в себя взаимодействие субстрата полирибонуклеотида с ферментативно активной сайт-специфической эндорибонуклеазой (например, Csy4 эндорибонуклеазой) в условиях, которые способствуют сайт-специфическому расщеплению полирибонуклеотидного субстрата. Способ расщепления полирибонуклеотида сайт-специфическим образом может быть использован для: 1) снятия аффинной метки с подложки полирибонуклеотида; 2) для получения популяции полирибонуклеотидных продуктов, имеющих однородность на 5' конце, например, когда субстраты полирибонуклеотидов являются in vitro транскрибируемыми мРНК; и 3) для регулирования экспрессии генов в клетке in vitro или in vivo. Субстрат полирибонуклеотидов Термин "субстрат полирибонуклеотида" и "целевой полирибонуклеотид" являются используемыми здесь взаимозаменяемо для обозначения полирибонуклеотида, который связан сайт-специфической эндорибонуклеазой сайт-специфическим образом. Субстрат полирибонуклеотида может быть одноцепочечным. В некоторых случаях субстрат полирибонуклеотида двухцепочечный. Эндорибонуклеаза связывает и расщепляет субстрат полирибонуклеотида сайт-специфическим образом. Так, например, эндорибонуклеаза связывает и расщепляет субстрат полирибонуклеотида в определенной последовательности, называемые здесь "последовательность узнавания" или " сайт узнавания". Последовательность узнавания может быть тетрануклеотидной последовательностью, пентануклеотидной последовательностью, гексануклеотидной последовательностью, гептануклеотидной последовательностью, октануклеотидной последовательностью, или больше, чем октануклеотидной. Например, в некоторых вариантах воплощения последовательность узнавания составляет 9 рибонуклеотидов, 10 рибонуклеотидов, 11 рибонуклеотидов, 12 рибонуклеотидов, 13 рибонуклеотидов, 14 рибонуклеотидов, 15 рибонуклеотидов, 16 рибонуклеотидов, 17 рибонуклеотидов, 18 рибонуклеотидов, 19 рибонуклеотидов или 20 рибонуклеотидов в длину. В некоторых вариантах воплощения сайт-специфическая эндорибонуклеаза расщепляет сразу 5' последовательность узнавания. В некоторых вариантах воплощения сайтспецифическая эндорибонуклеаза расщепляет сразу 3' последовательность узнавания. В некоторых вариантах воплощения сайт-специфическая эндорибонуклеаза расщепляет внутри последовательность узнавания. В некоторых случаях последовательность узнавания является сразу 5' вторичной структурой. В некоторых случаях последовательность узнавания находится в 5' вторичной структуре и имеет внутри 1 нуклеотид (nt), 2 nt, 3 nt, 4 nt, 5 nt, или от 5 nt до 10 nt вторичной структуры. В некоторых случаях последовательность узнавания является сразу 3' вторичной структурой. В некоторых случаях последовательность узнавания находится в 3' вторичной структуре и имеет внутри 1 нуклеотид (nt), 2 nt, 3 nt, 4 nt, 5 nt,или от 5 nt до 10 nt вторичной структуры. В некоторых вариантах воплощения субстрат полирибонуклеотида включает в себя структуруXxX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15, где нуклеотиды Х 1-Х 5 пары оснований с X11-X15 также, как X1 и Х 15 образуют основания стволовой структуры, и такие, как Х 6, Х 7, X8, Х 9, и Х 10 образуют замкнутый контур (петлю); структура является регулярной А-образной спиральной структурой. В некоторых вариантах воплощения субстрат полирибонуклеотида включает в себя аффинную метку; и способ предусматривает удаление аффинной метки с субстрата полирибонуклеотида. Сайт-специфические эндорибонуклеазы Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые расщепляют (гидролизуют) субстрат полирибонуклеотида в ион металла независимым способом. Структурные особенности эндорибонуклеазы, которая связывает и расщепляет субстрат полирибонуклеотида сайт-специфическим и ион металла независимым образом, может включать в себя одну или несколько из следующих особенностей: 1) высокую основную альфа-спираль для сайт-неспецифического распознавания фосфатного скелета РНК по РНК основным бороздам, например, R114, R115, R118, R119,или их эквиваленты; 2) R102 и / или Q104, или их эквиваленты, создающие водородные связи при контакте с большой бороздкой РНК ствола; 3) и одного или более His29, Serl48 и Tyr176, или их эквивалентов, участвующих в катализе; и 4) F155 или их эквивалент. Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%,по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или на 100%,идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной на фиг. 4 (Csy4 аминокислотной последовательностью). Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%,по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 % или на 100%,идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной на фиг. 5 (Csy4 аминокислотной последовательностью). Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%,по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 % или на 100%,идентичность аминокислотной последовательности с Cas6 аминокислотной последовательностью. Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%,по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 % или на 100%,идентичность аминокислотной последовательности с CasE аминокислотной последовательностью. Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые отличаются от аминокислотной последовательности, изложенной в любой одной из фиг. 4 или 5 на от 1 до 20 (например, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислотных замен и/или вставок и/или удалений. Условия реакции Сайт-специфическая эндорибонуклеаза может гидролизовать субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом при температуре в диапазоне от примерно 15 до примерно 100 С, например, в диапазоне от примерно 15 до примерно 17 С, от примерно 17 до примерно 20 С, от примерно 20 до примерно 25 С, от примерно 25 до примерно 30 С, от примерно 30 до примерно 40 С, от примерно 40 до примерно 50 С, от примерно 50 до примерно 60 С, от примерно 60 до примерно 70 С, от примерно 70 до примерно 80 С, от примерно 80 до примерно 90 С, или от примерно 90 до примерно 100 С. Сайт-специфическая эндорибонуклеаза может гидролизовать субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом в диапазоне рН от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0, например, приблизительно от рН 4,0 до примерно 4,5, примерно от рН 4,5 до примерно 5,0, примерно от рН 5,0 до примерно 5,5, примерно от рН 5,5 до примерно 6,0, примерно от рН 6,0 до примерно 6,5, примерно от рН 6,5 до примерно 7,0, примерно от рН 7,0 до примерно 7,5, примерно от рН 6,5 до примерно 7,5, примерно от рН 7,5 до примерно 8,0, примерно от рН 6,5 до примерно 8,0 или примерно от рН 5,5 до примерно 7,5. Примеры Следующие примеры предложены так, чтобы обеспечить специалистам в этой области техники полное раскрытие и описание того, как создавать и использовать настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели считают своим изобретением, и они не предназначены для представления о том, что эксперименты ниже являются всеми или единственными экспериментами, которые выполнены. Были предприняты усилия, чтобы обеспечить точность по отношению к используемым числам, (например, количество, температура и т.д.), но некоторые экспериментальные ошибки и отклонения должны быть учтены. Если не указано иначе, части являются частями по весу, мо- 22024121 лекулярная масса составляет среднюю молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, а давление находится на уровне или близком к атмосферному. Стандартные сокращения могут быть использованы, например, bp, пара(ы) оснований; kb, килобаза(ы); пкл, пиколитр(ы); с или сек, секунда(ы); мин, минута(ы); ч или час, час(ы); аа, аминокислота(ы); kb, килобаза(ы); bp, пара(ы) оснований; nt,нуклеотид(ы); i.m., внутримышечно (ые); i.p., внутрибрюшинно(ые); s.c, подкожно(ые), и тому подобное. Пример 1. Прямое обнаружение РНК и последовательность использования белков семейства Csy4 Материалы и способыCsy4 дикого типа, точечные мутанты и селенометионин (SeMet)-замещенные Csy4 были экспрессированы в Rosetta 2 (DE3) клетках, либо как His6-мальтоза связывающий гибридный белок (МВР) или His6 гибридный белок и очищали с помощью Ni-аффинной хроматографии с последующим протеолитическим удалением His(MBP) метки, с дальнейшим шагом Ni-сродства и гель-фильтрации. pre-crRNAs были транскрибированы in vitro с полимеразой Т 7 и очищены на денатурирующем геле. Комплекс был сформирован путем инкубации РНК с Csy4 в соотношении 2:1 в течение 30 мин при температуре 30 С с последующей гель-фильтрацией. Комплекс был кристаллизован с использованием висячего капельного способа в 200 мМ цитрата натрия, рН 5,0, 100 мМ хлорида магния, 20% (вес/об.) поли(этиленгликоля)(PEG)-4000 (дикого типа (WT) комплекс) или 150 мМ ацетата натрия рН 4,6,17% PEG4000 или 160 мМ ацетата натрия, рН 4,6, 18% PEG4000 (S22C содержащий комплекс). Структура WT Csy4-PHK комплекса определяется способом многоволновой аномальной дисперсии (MAD) с использованием SeMetзамещенных кристаллов. Структура Csy4 (S22C)-PHK комплекса была определена посредством молекулярной замены. Геномное аннотирование (картирование), клонирование, экспрессия и очистка белков Сравнительный анализ последовательности Csy4 генов у разных видов определенной консервативной области 20 кодонов вверх от аннотированного стартового кодона в РА 14 геноме. Lee, et al. GenomeBiol 7, R90 (2006). Консервативная Csy4 (PA 1433300) последовательность была ПЦР-амплифицирована из Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 геномной ДНК с использованием Pa14Csy4fwd: caccatggaccactacctcgacattcg и Pa14Csy4rev: gaaccagggaacgaaacctcc. Продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР) клонировали с использованием Gateway system в pENTR/TEV/D-ТОРО входного вектора (Invitrogen), после чего посредством сайт-специфической рекомбинации в вектор экспрессии pHGWA или pHMGWA.Busso, et al. Analytical Biochemistry 343, 313-321, (2005). Точечные мутации были введены в Csy4 с помощью QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Pa14Csy4 экспрессия плазмиды была трансформирована в E.coli Rosetta 2 (DE3) (Novagen) или совместно трансформирована с рМК вектором экспрессии CRISPR РНК, синтезированным Geneart (Regensburg, Germany). Rosetta 2 (DE3) выращивали в Luria Broth (LB) с добавлением ампициллина и хлорамфеникола. Экспрессию белка индуцировали 0,5 мМ изопропил P-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) (Affymetrix) при плотности клеток ок.0,5 OD с последующим встряхиванием при 18 С в течение 16 ч. Клетки осаждали и ресуспендировали в буфере для лизиса (15,5 мМ динатрийгидрофосфат, 4,5 мМ дигидрофосфат натрия, 500 мМ хлорида натрия, 10 мМ имидазола, ингибиторы протеаз, 5% глицерина, 0,01% Тритон Х-100, 100 мкМ / мл DNaseI, 1 мМ Трис[2-карбоксиэтил] фосфин гидрохлорид (ТСЕР), 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида, рН 7,4) и обрабатывали ультразвуком на льду в течение двух минут, очередями по 10 с. Лизат осветляли центрифугированием (24000g, 30 мин) и инкубировали с никель-нитрилотриуксусной кислотой (Ni-NTA) в аффинной смоле в пакете (Qiagen). Связанный белок элюировали высокоимидазольным буфером (15,5 мМ динатрийгидрофосфат, 4,5 мМ дигидрофосфат натрия, 500 мМ хлорида натрия, 300 мМ имидазола, 1 мМ ТСЕР, 5% глицерина, рН 7,4) и диализовали в течение ночи в диализном буфере (буфер элюирования только с 20 мМ имидазола) в присутствии вируса табачной мозаики (TEV) для расщепления His6 илиHis6MBP метки. Белок был сконцентрирован (Amicon) и очищен на никель аффинной колонке (GE), а затем на тандеме Sup75 (16/60) колонок в буфере для гель-фильтрации (100 мМ HEPES рН 7,5, 500 мМKCl, 5% глицерина, 1 мМ ТСЕР). Затем образец диализовали против буфера гель-фильтрации, содержащего только 150 мМ хлорида калия. Аналогичный протокол был использован для подготовки селенометионина (SeMet)-производного белка и единственным заметным отличием стала среда экспрессии. Коротко, BL21 (DE3) клетки трансформировали с Csy4 (pHGWA) вектором экспрессии и были выращены в М 9 минимальной среде с ампициллином, как описано выше Wiedenheft, et al. Structure 17, 904-912 (2009). Анализы нуклеазной активности 75 пикомоль дикого типа или мутантного Csy4 инкубировали с 5 пикомоль in vitro транскрипционной РАН pre-crRNA (полученной, как описано; Wiedenheft (2009) см. выше) в 10 мкл реакционной среды,содержащей 20 мМ HEPES рН 7,5, 100 мМ калия хлоридного буфера при 25 С в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл кислоты фенол-хлороформ (Ambion). 10 мкл дополнительного буфера реакции было добавлено и образцы центрифугировали (16000g, 30 мин) и 16 мкл водного образца было отобрано, смешано 1:1 с 2 Х заполняющего буфера с формамидом и разделено на 15% денатурирующем полиакриламидном геле. РНК визуализированы с SYBR Golg красителем (Invitrogen). Кристаллизация Все эксперименты кристаллизации проводились при температуре 18 С с использованием способа висячей капли диффузии водяного пара путем смешивания равных объемов (1 мкл + 1 мкл) комплекса и запасных растворов. Пластинчатые кристаллы дикого типа Csy4-PHK комплексов выращивали в 200 мМ цитрата натрия рН 5,0, 100 мМ хлорида магния, 20% (вес/об.) поли(этиленгликоля) -4000 (PEG4000). Эти кристаллы принадлежали к пространственной группе С 2, содержащей в одном экземпляре комплекс в асимметричной единице и дифрагированной с разрешением до 2,3 ангстрем на синхротронном рентгеновском источнике. При использовании воссоздания комплекса с Csy4S22C точечным мутантом две дополнительные формы кристаллов были получены в 150 мМ ацетата натрия рН 4,6, 17% (вес/об.)PEG4000 и 160 мМ ацетата натрия, рН 4,6,18% PEG4000. Первоначально гексагональные кристаллы появились в течение 24 ч. Эти кристаллы дифрагировали до разрешения 2,6 ангстрем, принадлежали к пространственной группе Р 61 и содержали одну копию комплекса в асимметричной единице. 48 ч спустя те же условия кристаллизации дали игольчатые кристаллы, которые принадлежали к пространственной группе Р 212121 и содержали в двух экземплярах комплекс и дифрагировали до разрешения 1,8 ангстрем. Для сбора данных все кристаллические формы были подвергнуты криозащите путем замачивания в своих маточных растворах с добавлением 30% глицерина до мгновенного охлаждения в жидком азоте. Определение структуры Все дифракционные данные были собраны при 100 К на каналах синхротронного излучения 8.2.2 и 8.3.1 Advanced Light Source (Lawrence Berkeley National Laboratory). Данные были обработаны с помощью XDS. Kabsch, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66,125-132 (2010). Экспериментальные фазы были определены из трех длин волн в эксперименте с многоволновой аномальной дисперсией (MAD) (максимум, перегиб и удаленные наборы данных) с использованием моноклинных Csy4-PHK кристаллов, содержащих селенометионин-замещенную Csy4 дикого типа. Два участка селена были локализованы с использованием Hybrid Substructure Search (HySS) модуля пакета Phenix. Grosse-Kunstleve, and Adams. ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 59, 1966-1973 (2003). Субструктурные уточнения, фазирование и модификация плотности проводились с использованием AutoSHARP. Vonrhein, et al. Methods Mol Biol 364, 215-230(2007). Полученная карта плотности электронов показала ясно слои плотности, связанные с белком и РНК, чередующиеся вдоль оси с, при этом слой РНК состоит из двух коаксиально соединенных спиралей РНК, участвующих в "целующейся петле" взаимодействия. Начальная атомная модель для Csy4 белка была получена автоматическим построением с помощью модуля Phenix AutoBuild. Terwilliger, et al, ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 64, 61-69, (2008). Комплексная модель была завершена путем итерационных циклов ручного построения в COOT (Emsley, and Cowtan, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 21262132 (2004 и уточнения с использованием Phenix.refme36 (Adams, et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66,213-221 (2010 против нативного набора данных при разрешении 2,33 ангстрем, что дало окончательную модель с кристаллографическим Rwork фактором 21,4% и Rfree фактором 26,4% (табл. 1). Таблица 1. Сбор данных, фазирование и уточнение статистики Модель включает в себя РНК нуклеотиды C1-G15 и фосфатные группы нуклеотидных остатков С 16 и остатков белка 1-104,109-120 и 139-187. Благодаря слоистому расположению белка и РНК в кристаллической решетке и отсутствию бокового контакта кристаллов в слое РНК, РНК демонстрирует значительные нарушения функциональности, о чем свидетельствуют резко повышенные температурные факторы( 100 А 2) и отсутствие интерпретации плотности для нуклеотидного основания U9. Нарушение проявляется также в остатках белка 109-120, соответствующих аргинин-богатой спирали, вставленной в паз основной РНК, на которых нужный полипептидный скелет может быть построен (за исключением остатковArg 115 и Arg 118). Структуры Csy4 (S22C)-PHK комплекса в гексагональной и орторомбической кристаллической формах были определены посредством молекулярной замены в Phaser (McCoy, et al. J ApplCrystallogr 40, 658-674 (2007, используя Csy4 белок (не хватает аргинин-богатой спирали) и РНК моделей моноклинной кристаллической формы в виде отдельных поисковых ансамблей. В обоих кристаллических формах, электронная плотность на аргинин-богатой спирали и линкерном регионе, включающемCsy4 остатки 105-108 было сразу заметно в 2Fo-Fc картах, полученных от молекулярных растворов замещения. Структура Csy4 (S22C)-PHK комплекса в гексагональной форме была уточнена до Rwork фактора на 25,5% и Rfree на 27,9 при разрешении 2,6 ангстрем. Окончательная модель включает в себя Csy4 остатки 1-120 и 139-187 и РНК нуклеотиды C1-G15 плюс фосфатную группу нуклеотида С 16. Орторомбическая кристаллическая форма Csy4 (S22C)-PHK комплекса была показана на уровне разрешения 1,8 ангстрем и уточнена до Rwork фактора на 18,7% и Rfree на 22,0%, с отличной стереохимией. Из двух комплексов в асимметричном блоке, комплекс 1 (цепи А и С) содержит Csy4 остатки 1-187 и РНК нуклеотиды C1G15 плюс фосфатную группу нуклеотида С 16, в то время как менее упорядоченный комплекс 2 (цепи В иD) включает в себя Csy4 остатки 1-187, за исключением остатков 13-15 и 135-138, которые показывают неупорядоченную электронную плотность, и РНК нуклеотиды C1-G15 и фосфатная группа нуклеотида С 16. Два экземпляра Csy4 дают суперпозицию с rmsd 1,15 ангстрем на 179 атомах С, наибольшие различия исходя из несколько иной позиции аргинин-богатой спирали. Эти две молекулы РНК в асимметричной совмещенной единице с rmsd 1,49 ангстрем, дают наибольшее отклонение, что связано с выпячиванием нуклеотида U9, который предполагает различные конформации в двух РНК. Наши обсуждения и иллюстрации через всю рукопись основаны на комплексе 1 орторомбической кристаллической формы. Все структурные иллюстрации были получены с использованием Pymol http://www(dot)pymol(dot)org).CRISPR-медиированный иммунитет, как полагают, происходит из примерно 90% простейших и 40% бактериальных геномов на основе наличия CRISPR локусов в последовательности геномов. Horvath andCRISPR ассоциированные (Cas) белки, принадлежащие к восьми известным CRISPR/Cas подтипам весьма расходятся на уровне первичной последовательности, скрывая идентификацию функциональных гомологов. Haft, et al. PLoS Comput Biol 1, e60 (2005); Makarova, et al. Biology Direct 1, 1-26 (2006). Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 (далее Pa14), грамотрицательный оппортунистический патоген, укрываетCRISPR/Cas систему подтипа Yersinia, содержит шесть Cas генов в окружении двух элементов CRISPR(фиг. 1 А). Хотя Casl находится универсально среди CRISPR содержащих организмов, и Cas3 очевидно,находится в большинстве подтипов, Csy1-4 являются уникальными для подтипа Yersinia. Оба CRISPR элемента содержат характерные расположения 28-нуклеотидных повторов, идентичных в обоих CRISPR(за исключением одного нуклеотида) и перемежаются с 32-нуклеотидными уникальными спейсерами,некоторые из этих совместимых последовательностей найдены в бактериофагах или плазмидах. Grissa, etal. ВМС Bioinformatics 8, 172 (2007). Во многих организмах было показано, что CRISPR локусы транскрибируются как длинные отдельные единицы и пост-транскрипционно обрабатываются для полученияcrRNAs, каждый из которых содержит одну уникальную последовательность в окружении последовательностей, полученных из повторяющихся элементов. Brouns et al. Science 321, 960-964 (2008); Carte, etMolecular Microbiology 55,469-481 (2005). Для определения белка (ов), ответственного (ых) за производство crRNAs от длинных CRISPR транскриптов (pre-crRNAs) в подтипе Yersinia, каждый из шести белков Cas из Pa14 был рекомбинантно экспрессирован, и рекомбинантно экспрессированные белки были протестированы на эндорибонуклеолитическую функцию, используя in vitro транскрибированную pre-crRNA. На основе сайтспецифической pre-crRNA обработки активности, было установлено, что эта Csy4 эндорибонуклеаза ответственна за биогенез crRNA. Как было отмечено для crRNA обработки при изучении двух другихCRISPR/Cas подтипов (Brouns et al. (2008) выше; Carte et al. (2008) выше), CRISPR транскрипционное расщепление является быстрой, ион металла независимой реакцией. Csy4 расщепляет pre-crRNA в повторных элементах на базе предсказываемой структуры стволовой петли, создавая ок.60 нуклеотидныхcrRNAs, состоящих из 32-нуклеотидных уникальных (фаг-производных) боковых последовательностей на 5' и 3' концах на восемь и 20 нуклеотидов, соответственно, повторяющейся последовательности (фиг. 1 А). Для Csy4 чтобы быть эффективной, было высказано предположение, что ее механизм РНК распознавания должен быть очень специфичным, чтобы быть предназначенным только для CRISPRпроизводных транскриптов, а не других клеточных РНК, содержащих шпильки и/или родственные последовательности. Чтобы проверить это, Csy4 была экспрессирована в Е. coli самостоятельно или совместно экспрессирована с Pa14 CRISPR РНК. Несмотря на высокую изоэлектрическую точку (PI = 10,2),Csy4 не ассоциируется с клеточными нуклеиновыми кислотами, однако, когда коэкспрессируется сCRISPR Pa14 белком, связанным с crRNA (фиг. 1 В, С). Эти наблюдения подчеркивают специфику Csy4 распознавания, приводя нас к изучению белок / РНК взаимодействия, необходимого для распознаванияCsy4 субстрата и расщепления. Csy4 анализы строения и активности проводили in vitro с использованием РНК олигонуклеотидов, соответствующих различным регионам 28-нуклеотидной Pa14 CRISPR повторяющейся последовательности. Используя этот подход, минимальный фрагмент РНК, распознаваемыйCsy4, состоящий из повторяющихся производных стволовых петель и одного опускающегося нуклеотида был идентифицирован. Анализ расщепления с использованием этой минимальной РНК в качестве субстрата показал, что Csy4 активность требует 2'ОН на рибозе непосредственно перед сайтом расщепления. 2'-дезоксирибоза в этом положении полностью отменяет расщепление, но не нарушает Csy4 фиксацию. Для того чтобы получить структурный взгляд на crRNA распознавание и расщепление, Csy4 была совместно кристаллизована в комплексе с минимальным субстратом РНК. Для создания стабильного комплекса для структурного анализа, Csy4 была связана с нерасщепляемым 16-нуклеотидным минимальным субстратом РНК, как описано выше, в котором нуклеотидом, предшествующим сайту расщепления, является 2'-дезоксинуклеотид. Кристаллы комплекса были получены в трех уникальных пространственных группах, демонстрируя различные упаковки кристалла, один содержащий Csy4 дикого типа и два содержащих Csy4 с точечными мутациями. Кристаллическая структура Csy4-PHK комплекса была определена с разрешением 1,8 ангстрем (фиг. 2 А, табл. 1), выявлен непредвиденный механизм, с помощью которого CRISPR РНК распознается и обрабатывается для использования CRISPR-опосредованным комплексом сайленсинга. Csy4 делает сайт-специфические контакты в большой бороздке ствола-петлиCRISPR повторяющейся последовательности и дополнительной последовательности неспецифических контактов со скелетом из стволовых РНК. Большинство характерных белок/РНК взаимодействий опо- 26024121 средуются малой бороздкой спирали РНК; распознавание РНК большой бороздки Csy4 является весьма необычным механизмом белок/РНК взаимодействия. На уровне первичной последовательности Csy4 сильно отличаются от других известных эндорибонуклеаз, участвующих в crRNA биогенезе (CasE от Thermus thermophiles (Ebihara et al. Protein Sci 15,1494-1499 (2006 и Cas6 от Pyrococcus furiosus Carte et al. (2008) см. выше), делясь только ок. 10% идентичностью. Кристаллические структуры в обоих CasE и Cas6 показывают, что эти белки принимают участие в тандеме ферродоксин-подобных складок. Примечательно, что Csy4 участвует в этой складке с этими ферментами; Csy4-PHK комплекс, N-концевой домен (остатки 1-94) из Csy4 действительно принимает ферредоксин-подобную складку. Однако, несмотря на то, что С-концевой домен (остатки 95-187) разделяет то же вторичное подключение структуры, как и ферредоксин-подобная складка, но его конформация заметно отличается. Поразительно, аргинин-богатая спираль (остатки 108-120) от предполагаемого С-концевого домена ферредоксин вставляет в большие бороздки шпильки РНК. Структурные суперпозиции с помощью DALI сервера (Holm, and Sander, J Mol Biol 233,123-138 (1993 показывают,что Csy4 в своей РНК-связывающей конформации образует суперпозицию с CasE и Cas6 со среднеквадратичным отклонением (rmsd) в 3,8 А (более 111 атомов Са) и 3,9 А (более 104 атомов Са), соответственно. Csy4, CasE и Cas6 могли быть потомками одной родовой эндорибонуклеазы, которые расходились заметно на уровне последовательности, совместно эволюционировали с повтора последовательности локуса CRISPR, сохраняя при этом аналогичную складку белка. Субстрат crRNA образует структуру шпильки, как и предсказывают для этого подкласса crRNA повторы (Kunin, et al. Genome Biol 8, R61 (2007, с нуклеотидами 1-5 и 11-15 парные основания дают регулярную А-форму винтового ствола. GUAUA пентапетля содержит рассеченную G6-A10 пару оснований и выступающий нуклеотид U9, его структура напоминает GNR(N)A пентапетлю, найденную в дрожжахU6 малых ядерных РНК внутримолекулярной ствол-петли (Huppler, et al. Nat Struct Biol 9, 431-435(2002 и бактериофага лямбда ВохВ РНК (Legault, et al. Cell 93, 289-299 (1998. В Csy4-PHK комплексе,РНК стволовая петля охватывает Р-шпильку, образованную нитями 7-8 из Csy4, с C1-G15 парами оснований, непосредственно соединенных на ароматической боковой цепи Phe155 (фиг. 2 В). Это якорь РНК ствола и ориентирует его на нужный угол, чтобы позволить сайт-специфические взаимодействия в большой бороздке. Два остатка в линкерном сегменте, соединяющем тело Csy4 с аргинин-богатой спиралью, Arg102 иGln104, образовали взаимодействия через водородные связи в большой бороздке РНК ствола, сайтспецифически распознавая G15 и А 14, соответственно (фиг. 2 В). Csy4-crRNA взаимодействие в дальнейшем стабилизировалось путем введения аргинин-богатой спирали в большую бороздку шпильки РНК в непосредственной близости от выпячивания нуклеотида U9 (фиг. 2 С). Боковые цепи Arg 114, Arg 115,Arg 118 и Arg 119 контактируют с фосфатными группами нуклеотидов 2-6. Кроме того, в боковой цепи из Arg 115 входит в зацепление с основанием G6, как только проявляется сайт-специфическое взаимодействие между богатой аргинином спиралью и шпилькой РНК. Интересно, что это взаимодействие очень напоминает, как некоторые вирусные белки взаимодействуют с большой бороздкой молекулdsPHK, например Tat/Tar взаимодействия в вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекции)23 и lambda-N/boxB комплексе в ламбдоидных фагах (Cai, et al. Nature Structural Biology 5, 203-212 (1998. В обоих случаях, высокоосновная -спираль используется для сайт-неспецифического распознавания фосфатного остова РНК по РНК большой бороздке.Csy4 распознает элемент шпильки CRJSPR повторяющейся последовательности и прикрепляется непосредственно после него. Структура, описанная в этом примере, содержит субстрат-мимическую РНК, которая не является компетентной для расщепления. В активном центре, плотность наблюдается только на фосфатной группе 3' предпоследнего нуклеотида, но не плотность для терминального сахара или основания, предположительно, из-за гибкости этого нуклеотида (фиг. 3 А). Расщепляющийся фосфат связывается в карман, расположенный между -поворотом 7-8 шпильки на одной стороне и 1 спирали и богатой глицином петли, ранее выявленных в Cas6 и CasE, на другой. Три остатка проксимальнее,что фосфатные группы, скорее всего, участвуют в катализе, His29, Ser148 и Тyr176. Эти остатки - инвариантны среди 12 Csy4 последовательностей, которые были определены с использованием BLAST поиска (Altschul, et al. Nucleic Acids Research 25, 3389-3402 (1997 в сочетании с ручной проверкой вблизиCRJSPR локуса (Grissa, et al. ВМС Bioinformatics 8, 172 (2007 (фиг. 4). Структура предполагает, что несколько остатков в Csy4 важны для медиирования субстрата распознавания/связывания и катализа. Точечные мутанты каждого из этих остатков были генерированы, их активность в реакциях расщепления была протестирована биохимически (фиг. 3 В). Мутация предполагаемого каталитического сайта остатков His29 или Ser148 отменяет активность расщепления. Тем не менее, мутация Тyr176 на фенилаланине не нарушает активность, указывая, что Тyr 176 может играть важную роль в ориентировании His29, хотя он непосредственно не участвует в катализе. Мутация Arg 102 на аланине отменяет накопление crRNAs,в то время как мутация Gln 104 на аланине несущественно нарушает активность, предполагая, чтоArg102, в котором распознается пара терминального основания, имеет важное значение для правильной ориентации субстрата РНК, но Gln 104 не требуется in vitro активности. Phe155, по-видимому, играет большую роль в надлежащей ориентации РНК субстрата, тогда как аланин мутация в этом остатке значительно ограничивает crRNA биогенез. Идентификация серина, участвующего в медиированном расщеплении РНК, является неожиданной. Хотя мутации His29 на аланине приводит к каталитически неактивной Csy4, мутация лизина частично восстанавливает активность, что сильно свидетельствует, что His29 выступает в качестве донора протонов, а не инициирует расщепление через нуклеофильную атаку.CRISPR являются генетической памятью на основе нуклеиновых кислот иммунной системы, которая опирается на небольшие CRISPR-производные РНК для направления иммунной системы родственных последовательностей, связанных с вторжением генетических элементов. Филогенетический анализCRISPR повторяющихся последовательностей определил различные категории CRISPR (Kunin, et al. Genome Biol 8, R61 (2007, которые коррелируют с определенным набором генов Cas. Совместное изменение генов Cas с определенными типами CRISPR повторяющихся последовательностей предполагает, чтоCRISPR повторы совместно эволюционировали с генами Cas, которые отвечают за адаптацию CRISPR,генерацию crRNAs и подавление вторжения генетических элементов. Структура, описанная здесь, детализирует необычный механизм распознавания того, что дискриминирует crRNA субстраты на основе сайт- и структурной специфичности, обеспечивая отличное понимание возможностей Csy4 и ее гомологов, чтобы легко отличить субстрат РНК от всех клеточных РНК. Фиг. 1 А-С.Pa14Csy4 специфически распознает только ее субстрат рrе-crRNA. а, Схема CRISPR/Cas локуса в Ра 14. Шесть Cas генов прикрепляются по бокам с обеих сторон CRISPR локусов. Расширение схематически показывает предсказанную ствол-петлю из 28-нуклеотидных прямых повторов (черного цвета), разделенных 32-нуклеотидной спейсерной последовательностью (синий). Красные стрелки отмечают связь,которую расщепляет Csy4. b,c Сравнение белка (b) и РНК (с) после Pa14Csy4 экспрессии в E.coli с (+) и без (-) плазмиды, содержащей Pa14 CRISPR локус. Очищенная Csy4 от обоих приготовлений была разделена на два пула. Половину из них разделяли на SDS-PAGE и визуализировали с окрашиванием кумасси синим, половину из них экстрагировали кислотой в фенол-хлороформе, разделяли на UREA- PAGE и визуализировали с SYBR Gold (Invitrogen). Фиг. 2 А-С. Кристаллическая структура Csy4 связана с субстратом РНК. а) Фронтальный и задний вид комплекса. Csy4 окрашена в синий и скелет РНК окрашен в оранжевый;b) Подробное взаимодействие между остатками R102 и Q104 и нуклеотидами А 14 и G15. Водородная связь изображена пунктирными линиями; с) Подробное взаимодействие между богатой аргинином альфа-спиралью и скелетом РНК и G6. Фиг. 3 А и 3 В. Предполагаемый активный центр а) Подробный обзор каталитического центра.b) Активность расщепления Csy4. Дикого типа (WT) Csy4 и серия одиночных точечных мутантов инкубировали in vitro транскрибированной pre-crRNA в течение 5 мин при температуре 25 С. Продукты были экстрагированы кислотой в фенол-хлороформе и разделены на UREA-PAGE и визуализированы окрашиванием Gold SYBR. Пример 2. Прямое секвенирование РНК РНК может быть секвенирована на одномолекулярном уровне с использованием Форстер Резонансного Переноса Энергии (FRET). РНК-последовательность будет прикреплена к твердой поверхности через ее 3 'рибозу. РНК должна быть расположена достаточно далеко от соседних молекул РНК на поверхности, чтобы позволить детекцию на одномолекулярном уровне. Расстояние продиктовано дифракционно-ограничивающими способами, в зависимости от длины волны излучаемого света. Альтернативно,РНК расположение может быть меньше, чем дифракционный предел, если используются методы визуализации с суперразрешением. На первом этапе обнаружения последовательности, белок семейства Csy4 с известным специфическим связыванием нуклеиновых кислот добавляют к РНК, последовательность которой определяют, наряду с пулом детектируемых олигонуклеотидов. Csy4 белок только тогда связывается с секвенируемой РНК, если один из детектируемых олигонуклеотидов может образовать 4 пары оснований двойной спирали с секвенируемой РНК. Кроме того, детектируемый нуклеотид должен иметь пару оснований с дополнительным 3 нуклеотидом 3' из 4-х пар оснований распознавания последовательности секвенируемой РНК, для того, чтобы Csy4 белок связался стабильно. Детектируемые олигонуклеотиды будут содержать расширение из 3 нуклеотидов 3' 4-нуклеотидных последовательностей распознавания. В пуле детектируемых олигонуклеотидов, 3-нуклеотидное расширение будет иметь определенный 5' нуклеотид в сопровождении двух случайных нуклеотидных позиций; или случайный нуклеотид в 5' положении, который следует за определенным нуклеотидом и случайным нуклеотидом; или 2 случайных нуклеотида на 5' конце, а затем определенные нуклеотиды. В любом из этих пулов определенные нуклеотиды известны на основании прикрепленных флуоресцентных молекул, излучение или возбуждения спектра которых определяется нуклеотидом. Csy4 белок будет прикреплен к квантовой точке, спектр возбуждения которой перекрывается со спектром излучения флуоресцентных молекул, прикрепленных к детектируемому олигонуклеотиду. После связывания детектируемых олигонуклеотидов и Csy4 избыток реагентов будет смыт. Положительное событие связывания детектируется только в том случае, когда детектируемый нуклеотид образует 7-нуклеотидные двойных спиралей с секвенируемой РНК. Если связывание происходит, в результате тройной комплекс секвенируемой РНК, детектируемого олигонуклеотида и Csy4 белка может быть обнаружен FRET по флуоресцентным молекулам, которые прикреплены к детектируемому олигонуклеотиду с квантовыми точками, прикрепленными к Csy4 белку. После каждого цикла связывания Csy4 белок и детектируемые олигонуклеотиды будут удалены из образца с использованием химической и/или тепловой денатурации и отмывки. На последующих шагах секвенирования другие Csy4 белки различной сайт-специфичности и соответствующие детектируемые олигонуклеотиды будут инкубированы с секвенируемой РНК в подобной манере. Другие варианты 3-нуклеотидных расширений на детектируемом олигонуклеотиде могут быть предусмотрены, такие как расширение разной длины, либо на 5' конце или на 3' конце детектируемого олигонуклеотида. Детектируемый олигонуклеотид может быть РНК, ДНК или любой химически модифицированной версией этих полимеров, такой какPNAs или LNAs. Пример 3. Индуцибельная сайт-специфическая эндорибонуклеаза Посредством биохимических и структурных методик были созданы точечные мутанты Csy4 с отсутствием активности расщепления при сохранении активности при связывании субстрата. Примером является описанный выше Csy4 (H29A) мутант. В противном случае каталитически неактивный Csy4(H29A) мутант может быть реактивирован в присутствии экзогенного имидазола. Добавление между 150 мМ и 300 мМ имидазола в буфере для реакции достаточно, чтобы стимулировать активность расщепления почти дикого типа. Результаты представлены на фиг. 8. На фиг. 8 показан анализ активности расщепления, изображающий восстанавливающее действие имидазола. Csy4H29A является каталитически неактивным мутантом Csy4, который сохраняет способность связывать свой субстрат с кд 1 нМ. Детали реакции: Каждые 10 мкл реакционной смеси содержат 5 пикомоль in vitro транскрибируемого субстрата precrRNA, 100 пикомоль Csy4 (WT или Н 29 А, как показано на фиг. 8), 20 мМ HEPES рН 7,5,100 мМ KCl и 150-300 мМ имидазола, как указано. Реакцию проводили в течение 30 минут при 25 С. Продукты были извлечены кислотой в фенол-хлороформе, разделены на 15% денатурирующем геле и визуализированы сGold SYBR. Биохимическая характеристика Csy4 (H29A) показывает, что она связывается с ее субстратом РНК с 1 нМ аффинностью.Csy4 (H29A) является полезной для обоих in vivo и in vitro приложений, для которых не существует альтернативного подхода.Csy4 (H29A) (также называемая здесь "индуцибельной" Csy4), полезна для очистки частичного РНК/белкового комплекса (RNP) из сложной смеси РНК и RNPs (РНК/белок комплексы). Например, исследователи могут быть заинтересованы в понимании того, какие белки связываются с конкретной транскрибируемой РНК. Используя эту систему, исследователи смогли спроектировать конструкцию экспрессии РНК для их выбора, который будет включать метку 5', состоящую из стволовой петли Csy4 целевой последовательности. Исследователи тогда трансфецируют эту конструкцию экспрессии на их выбор типа клеток, ведущих к получению многих РНК и RNPs. Клетки затем будет лизированы и лизат будет наноситься на колонку, которая содержит индуцибельную Csy4, иммобилизованную на гранулах агарозы. РНК или RNPs, которые имеют Csy4 последовательности-мишени будут связываться. Следующий отмывочный шаг удалит неспецифически связанные РНК. Отмывка с имидазолом (300 мМ) будет активировать индуцибельную Csy4, которая будет расщеплять последовательности-мишени и освободит связанные РНК/RNP. Этот метод схематически показан на фиг. 9. Аналогичный метод может быть полезен для сборки RNPs in vitro. Например, РНК выбора может быть транскрибирована in vitro с помощью построения экспрессии аналогичной плазмиды, предназначенной для эксперимента выше. (Конструкция должна ввести Csy4 ствол-петля целевую последовательность в 5' конец транскрибируемой РНК.) Этот in vitro продукт транскрипции может быть затем инкубирован с белками по известным или предполагаемым связям конкретного транскрипта. Колонка, содержащая индуцибельную Csy4, может быть использована для очистки invitro образуемых RNPs от свободного белка. Пример 4. Механизм специфического распознавания субстрата эндорибонуклеазой CasE является важным компонентом CRISPR иммунной системы у большинства бактерий и архей (van der Oost et al, Trends Biochem Sci. 34, 401-7 (2009, что было определено. С использованием структурных и биохимических методов было выявлено, что минимальная последовательность РНК, необходимая для оптимального расщепления субстрата, - 20 нуклеотидная последовательность (5-24 CRISPR повторяющаяся последовательность), которая включает в себя семь пар оснований ствол-петля, следующих за двумя неспаренными нуклеотидами. В структуре этой РНК связаны CasE из Thermus thermophilus, что было показано на разрешении в 2, 0 ангстрем с помощью рентгеновской кристаллографии. Эта структура раскрывает многочисленные последовательности конкретных контактов между белком и РНК, в том числе несколько
МПК / Метки
МПК: C12N 9/22, G01N 33/573, C12Q 1/34, C12Q 1/68, C12N 15/55
Метки: композиции, использования, способы, эндорибонуклеаз
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-24121-kompozicii-endoribonukleaz-i-sposoby-ih-ispolzovaniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Композиции эндорибонуклеаз и способы их использования</a>
Композиции, содержащие лактадгерин или его варианты, и способы их использования
Номер патента: 3643
Опубликовано: 28.08.2003
Авторы: Тери Клотильд, Рапосо Граса, Амигорена Себастьян
МПК: A61K 38/00, C07K 14/47, C12N 1/21...
Метки: лактадгерин, композиции, способы, варианты, использования, содержащие
Формула / Реферат:
1. Применение лактадгерина или его варианта для получения композиции для регулирования иммунного ответа. 2. Применение по п.1 для ингибирования перекрестного праймирования антигенов. 3. Применение по п.2 варианта лактадгерина, не содержащего функциональный сайт связывания с фосфолипидом и/или функциональный сайт связывания с интегрином. 4. Применение по п.1 для стимуляции фагоцитоза антигенов дендритными клетками. 5. Применение по п.1 для...
Опсинсвязывающие лиганды, композиции и способы использования
Номер патента: 21747
Опубликовано: 31.08.2015
Авторы: Гринвуд Джереми Роберт, Каш Тан, Коте Джеми Б., Лароса Грегори Дж., Берман Джадд, Гарви Дэвид С., Брюэр Марк Л.
МПК: A01N 35/00, A61K 31/11
Метки: лиганды, опсинсвязывающие, использования, способы, композиции
Формула / Реферат:
1. Соединение структурной формулы I,где А представляет собойВ представляет собой -(CH2)n-, -CH=CH-, -CH2-N(R22)- или -СН2-О-, где n = 0, 1 или 2;Q представляет собой -C(О)- или -СН2-С(О)-;V представляет собойгде b представляет собой 1 или 2, а представляет собой 1 или 2 и N-Q-U означает N-C(O)-U или N-S(O2)-U;Y представляет собой NR22, N-Q-U, CR22R23, кислород, S(O)n, N-C(S)-NR22R23, N-(C=N-CN)-NR22R23, N-(C=N-SO2CH3)-NR22R23, C=NOR22,...
Новые соединения, фармацевтические композиции, содержащие их, и способы их использования
Номер патента: 10484
Опубликовано: 30.10.2008
Авторы: Кухаджа Фрэнсис П., Макфэдден Джилл М., Тхупари Джаган Н., Медгалчи Сьюзен М., Таунсенд Крэйг А.
МПК: A61K 31/34, C07D 307/56
Метки: композиции, содержащие, новые, соединения, фармацевтические, использования, их, способы
Формула / Реферат:
1. Соединения формулы I в которой R1 означает C1-С20алкил или группу =СН2; R2 означает C1-С20алкил; X1 означает NHR4, где R4 представляет собой C1-С20алкил, С3алкенил и необязательно содержит карбоксильную группу, спиртовую группу, или когда R1 означает группу =СН2, и R2 означает С8алкил, X1 означает группу -NHCH2COOMe или группу -NHCH2COOtrBu. 2. Соединения по п.1, в которых R1 представляет C1-С10алкил или группу =СН2. 3. Соединения по п.2, в...
Композиции и способы использования нитроксидов в сочетании с биологически совместимыми макромолекулами
Номер патента: 618
Опубликовано: 29.12.1999
Автор: Хсиа Дзен-Чанг
МПК: A61K 31/40
Метки: композиции, сочетании, нитроксидов, совместимыми, макромолекулами, способы, использования, биологически
Формула / Реферат:
1. Способ стимулирования превращений in vivo гидроксиламиновой формы нитроксида в парамагнитную форму, отличающийся тем, что включает проведение реакции нитроксида в гидроксиламиновой форме с макромолекулой полинитроксида с получением фермент-имитирующей активности в качестве гидроксиламиноксидазы, причем фермент-имитирующим соединением является нитроксидсодержащее соединение, имеющее нитроксильную группу, которая является менее стабильной, чем...
Полипептиды, кодируемые геном, подобным гену липазы человека, содержащие их композиции и способы использования композиций
Номер патента: 3293
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Джей Майкл К., Доан Ким-Анх Тхи, Амин Дилип В., Линч Кевин Дж., Саут Виктория Дж., Кравик Джон А.
МПК: A61K 38/46, C12N 9/20, C07K 16/40...
Метки: человека, гену, способы, композиций, полипептиды, кодируемые, геном, композиции, подобным, использования, липазы, содержащие
Формула / Реферат:
1. Выделенный полипептид, кодируемый геном, подобным гену липазы, где указанный полипептид (a) связывается с гепарином; (b) имеет гомологию с липопротеидлипазой и липазой печени человека и (c) включает каталитический домен массой 39 кДа семейства триацилглицероллипаз, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8. 2. Выделенный полипептид по п.1, где указанный...
Предыдущий патент: Обратно-эмульсионные буровые растворы и способы бурения скважин
Следующий патент: Гибридная электростанция для повышения эффективности и улучшения динамической характеристики
Случайный патент: Способ контроля подлинности и перемещения алкогольной продукции (варианты) и система для осуществления способов