Антитела к гепцидину и варианты их применения

Предложены моноклональные антитела, которые избирательно связывают человеческий гепцидин-25 и характеризуются высоким сродством к гепцидину-25 человека и выраженной способностью к нейтрализации зрелого гепцидина человека. Антитела согласно изобретению можно применять в терапии для повышения уровня железа в сыворотке, числа ретикулоцитов,эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита у человека, а также для лечения и диагностики заболеваний, опосредуемых гепцидином, например анемии, у субъекта.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) 023406 Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к антителам против зрелого гепцидина человека. Более конкретно, изобретение относится к селективным моноклональным антителам к гепцидину-25, которые способны нейтрализовывать биологическую активность зрелого гепцидина человека и, соответственно, полезны для увеличения уровня железа в крови, количества ретикулоцитов,количества эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита у человека в целях лечения или профилактики заболеваний, патологических состояний или расстройств, в развитии которых участвуют зрелый гепцидин человека, таких как анемия. В настоящее время существуют ограничения для адекватных и эффективных средств против анемии, или против анемии при хронических заболеваниях. В частности, введение эритропоэтина эффективно только приблизительно у 50% всех пациентов, и с ним связаны нежелательные побочные эффекты. Кроме того, трансфузии нежелательны из-за риска заражения, инфекции и перегрузки железом. Считается, что гепцидин человека представляет собой полипептид, экспрессируемый гепатоцитами,и является белком, играющим важную роль в регуляции уровня железа, который подавляет всасывание железа в кишечнике, повторное использование макрофагами и мобилизацию железа из депо железа в печени. Гиперпродукция гепцидина, по-видимому, играет ведущую роль в патофизиологии анемии и/или анемии при хронических заболеваниях. Гепцидин человека представляет собой препропептид из 84 аминокислот, содержащий на N-конце сигнальную последовательность, обеспечивающую узнавание эндоплазматической сетью, состоящую из 24 аминокислот, и проучасток из 35 аминокислот с консенсусным сайтом расщепления фурина, за которым следует обладающий биологической активностью гормон, регулирующий уровень железа, из 25 аминокислот на С-конце - гепцидин-25 человека (SEQ ID NO: 1). Также известны образующиеся in vivo формы гепцидина-25 человека с усеченным N-концом, такие как гепцидин-20 человека (т.е. аминокислоты 6-25 по SEQ ID NO: 1) и гепцидин-22 человека (аминокислоты 4-25 по SEQ ID NO: 1). Хотя антитела к гепцидину человека были описаны ранее (см., например, публикации заявок на патент США 2004/0096990 и 2007/0224186 и публикацию международной заявки на патент РСТWO 2008/097461), в данной области техники все еще существует большая потребность в дополнительных препаратах для лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с анемией, включая анемию при хронических заболеваниях, таких как анемия при раке и анемия при воспалении. Поскольку гепцидин-25 является основной, если не единственной, физиологически в значительной степени формой гепцидина у человека, существует конкретная потребность в антителах, которые направлены селективно к гепцидину-25 по сравнению с полипептидами гепцидина, которые не являются физиологически значимыми. Соответственно, в настоящем изобретении предложены селективные высокоафинные рекомбинантные терапевтические антитела к гепцидину-25 человека, которые имеют множество преимуществ в лечении или диагностике расстройств, ассоциированных с повышенным уровнем зрелого гепцидина,таких как анемия. Например, такие обладающие высоким сродством (аффинностью) нейтрализующие искусственные антитела человека, рекомбинантные, высокоселективные в отношении физиологически значимых форм гепцидина у человека будут обеспечивать снижение риска побочных эффектов и клиническую дозу и частоту введения, необходимые для эффективного лечения. Настоящее изобретение также включает предпочтительные нуклеиновые кислоты, кодирующие предпочтительные селективные антитела к гепцидину-25, где нуклеиновые кислоты были созданы для удаления участков скрытого сплайсинга, которые приводят к нежелательной агрегации определенных антител, предложенных в настоящем изобретении, при их экспрессии клетками-хозяевами млекопитающего. Таким образом, дополнительные преимущества, получаемые от данного изобретения, включают повышенный выход продукта антител с желаемой степенью чистоты, что ведет к снижению цены продукции, а также более высокой степени клинической эффективности и безопасности вводимого продукта - антител. Кроме того, имеющиеся в продаже средства для иммунного анализа гепцидина человека не позволяют отличать активные, физиологически значимые формы гепцидина человека от неактивных, физиологически незначимых форм гепцидина (например, см., Kemna, Е.Н., et al., Haematologica, 93(1):90-7(2008. В настоящее время большинство способов селективного анализа на гепцидин-25 включает ЖХ/МС (жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию) или аналогичные трудоемкие способы, которые требуют разделения разных форм гепцитина (например, см. Gutierrez, J.A., et al., BioTechniques,38:S13-S17 (2005), Murphy, et al., Blood, 110:1048-54 (2007) and Kemna, E.H., et al., Clin. Chem. 53:620-8(2007. Хотя данные виды анализа могут быть точными и прецизионными, их сложность, высокая стоимость и высокие требования к квалификации ограничивают их внедрение в повседневную практику. Соответственно, также имеет место большая потребность в дополнительных антителах, которые связывали бы зрелый гепцидин человека с высоким сродством для их применения в области относительно простого,быстрого и надежного иммунного анализа для специфичной детекции или измерения зрелых форм гепцидина человека для диагностических и/или прогностических приложений. В настоящем изобретении предложены антитела, которые связывают гепцидин-25 человека со сродством связывания (KD) около 800 пМ или менее, определяемым методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) при 25 С. Предпочтительно, чтобы антитела имели скорость диссоциации (koff) к-1 023406 гепцидину-25 человека от 8,510-3 до 1,810-4 с-1 (ППР) при 25 С. Более предпочтительно, чтобы антитела имели KD к гепцидину-25 человека от приблизительно 400 до приблизительно 30 пМ, определенное методом ППР при 25 С. Даже более предпочтительно, чтобы антитела имели IC50 от приблизительно 100 до приблизительно 25 нМ при анализе биоактивности гепцидина-25 in vivo, где анализ позволяет определить индуцируемое IL-6 снижение уровня железа в сыворотке. Даже более предпочтительно, чтобы антитела имели IC50 от приблизительно 100 приблизительно 50 нМ при анализе биоактивности гепцидина 25 in vitro, где анализ позволяет определить индуцируемую гепцидином интернализацию и/или разрушение ферропортина. В более предпочтительном случае антитела содержат по меньшей мере один из CDR,выбранных из группы, включающей i) HCDR3, имеющий последовательность аминокислот, обозначенную в списке последовательностей SEQ ID NO: 75, и ii) LCDR3, имеющий последовательность аминокислот, обозначенную в списке последовательностей SEQ ID NO: 62. Настоящее изобретение включает антитела, которые селективно связывают гепцидин-25 человека сKD примерно 800 пМ или менее и содержат полипептид вариабельной области тяжелой цепи (HCDR) и полипептид вариабельной области легкой цепи (LCDR), где (i) полипептиды HCDR и LCDR имеют последовательности аминокислот, обозначенные в списке последовательностей SEQ ID NO: 148 и 126 соответственно; (ii) HCDR и LCDR имеют последовательности аминокислот, обозначенные в списке последовательностей SEQ ID NO: 128 и 127; (iii) полипептиды HCDR и LCDR имеют последовательности аминокислот, обозначенные в списке последовательностей SEQ ID NO: 151 и 125 соответственно; или(iv) полипептиды HCDR и LCDR имеют последовательности аминокислот, обозначенные в списке последовательностей SEQ ID NO: 150 и 124 соответственно. Настоящее изобретение включает антитела, которые селективно связывают гепцидин-25 человека сKD примерно 800 пМ или менее и содержат полипептид вариабельной области тяжелой цепи и полипептид вариабельной области легкой цепи, где (i) полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи имеют последовательности аминокислот, обозначенные в списке последовательностей SEQ ID NO: 6 и 14 соответственно; (ii) полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи имеют последовательности аминокислот, обозначенные в списке последовательностей SEQ ID NO: 7 и 15 соответственно; (iii) полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи имеют последовательности аминокислот, обозначенные в списке последовательностейSEQ ID NO: 9 и 17 соответственно; или (iv) полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи имеют последовательности аминокислот, обозначенные в списке последовательностей SEQ ID NO: 8 и 16 соответственно. Настоящее изобретение включает антитела, которые селективно связывают гепцидин-25 человека сKD примерно 800 пМ или менее и содержат полипептид HCDR, содержащий последовательности 3 CDR,которые присутствуют вместе в Fab, перечисленных в табл. 1 в настоящем документе, и которые присутствуют в антителах в том же положении CDR, как показано в табл. 1. В предпочтительном случае такие антитела содержат полипептид LCVR, несущий последовательность аминокислот, выбранную из группы,включающей SEQ ID NO: 101-127. Настоящее изобретение включает антитела, которые селективно связывают гепцидин-25 человека сKD примерно 800 пМ или менее и содержат полипептид HCDR, содержащий последовательности 3 CDR,которые присутствуют вместе в Fab, перечисленных в табл. 2 в настоящем документе, и которые присутствуют в антителах в том же положении CDR, как показано в табл. 2. В предпочтительном случае такие антитела содержат полипептид LCVR, имеющий последовательность аминокислот, обозначенную в списке последовательностей SEQ ID NO: 128-151. Настоящее изобретение включает антитела, которые селективно связывают гепцидин-25 человека сKD примерно 800 пМ или менее и содержат i) полипептид LCDR, содержащий последовательности 3CDR, которые присутствуют вместе в Fab, перечисленных в табл. 1 в настоящем документе, и которые присутствуют в антителах в том же положении CDR, как показано в табл. 1, и ii) полипептид HCDR, содержащий последовательности 3 CDR, которые присутствуют вместе в Fab, перечисленных в табл. 2, и которые присутствуют в антителах, предложенных в настоящем изобретении, в том же положении CDR,как показано в табл. 2. В предпочтительном случае такие антитела содержат 6 CDR, которые присутствуют вместе в Fab, перечисленных в табл. 3 в настоящем документе, и которые присутствуют в антителах в том же положении CDR, как показано в табл. 3. Настоящее изобретение включает антитела, которые селективно связывают гепцидин-25 человека сKD примерно 200 пМ или менее и содержат (i) полипептид LCDR, имеющий последовательность аминокислот, обозначенную в списке последовательностей SEQ ID NO: 101-127, и (ii) полипептид LCDR, имеющий последовательность аминокислот, обозначенную в списке последовательностей SEQ ID NO: 128151. Также настоящее изобретение включает антитела, которые селективно связывают гепцидин-25 человека с KD примерно 200 пМ или менее и содержат два полипептида тяжелых цепей и два полипептида легких цепей, причем каждый из полипептидов тяжелых цепей имеет последовательность аминокислот,обозначенную в списке последовательностей SEQ ID NO: 8, а каждый из полипептидов легкой цепи имеет последовательность аминокислот, обозначенную в списке последовательностей SEQ ID NO: 16. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены отдельные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению; векторы, содержащие молекулы нук-2 023406 леиновых кислот, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению, возможно функционально связаны с контролирующими последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, трансформированной при помощи вектора; клетки-хозяева, содержащие векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению; способ получения антител, предложенных в изобретении, включающий культивирование клеток-хозяев, содержащих векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению, обеспечивающие экспрессию нуклеиновой кислоты, и, по возможности выделения антител из культуральной среды клеток-хозяев. Согласно другому настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитела согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемую основу или разбавитель. Предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция содержала однородную или в значительной степени однородную популяцию антител, предложенных в изобретении, и фармацевтически приемлемую основу или разбавитель. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены антитела, которые селективно связывают гепцидин-25 человека с KD примерно 800 пМ или менее, для применения в терапии. Также в изобретении предложены антитела, которые селективно связывают гепцидин-25 человека с KD примерно 800 пМ или менее, для применения в лечении или профилактике анемии у человека. Настоящее изобретение включает применение антител, которые селективно связывают гепцидин-25 человека с KD примерно 800 пМ или менее, для приготовления лекарственного средства для лечения анемии, включая анемию при хронических заболеваниях и анемию при раке. Также изобретение включает применение антител, которые селективно связывают гепцидин-25 человека с KD примерно 800 пМ или менее, для приготовления лекарственного средства для повышения уровня железа в сыворотке, количества ретикулоцитов, количества эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита у животных, преимущественной у видов млекопитающих, более преимущественно у субъекта. Настоящее изобретение включает способ повышения уровня железа в сыворотке, количества ретикулоцитов, количества эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита, который включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антител, которые селективно связывают гепцидин-25 человека с KD примерно 800 пМ или менее. Согласно другому настоящего изобретения предложен способ лечения у субъекта расстройства, в развитии которого участвует зрелый гепцидин, при котором может быть полезно повышение уровня железа в сыворотке, количества ретикулоцитов, количества эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита,включая анемию, например анемию, развившуюся вследствие инфекции, воспаления, хронического заболевания и/или рака, но не ограничиваясь ими, причем указанный способ включает введение эффективного количества гепцидин-25-селективных антител, предложенных в изобретении, пациенту, нуждающемуся в них. Дополнительно в настоящем изобретении предложен способ иммунного анализа, селективный в отношении зрелого гепцидина человека. Способ включает, во-первых, получение образца для определения зрелого гепцидина человека и приведение пробы в контакт с антителами, предложенными в изобретении,в условиях, подходящих для связывания и обеспечения возможности образования комплекса антигенантитело присутствующим зрелым гепцидином человека; затем определение присутствия или отсутствия комплекса и/или определение количества комплекса в пробе при помощи иммунного анализа. Дополнительно в настоящем изобретении предложен способ диагностики патологического состояния, в развитии которого участвует зрелый гепцидин человека, у пациентов путем определения уровня зрелого гепцидина человека в пробе биологической жидкости, взятой у пациента, и сравнение уровня зрелого гепцидина человека в пробе с уровнем зрелого гепцидина человека в пробе биологической жидкости, взятой у одного или более контрольных лиц, или с эталонным стандартом. Также предложен способ мониторинга у пациентов расстройств, в развитии которых участвует зрелый гепцидин. Данный способ включает определение уровня зрелого гепцидина в пробе биологической жидкости, взятой у пациента, страдающего расстройством, в развитии которого участвует зрелый гепцидин, или имеющего риск развития такого заболевания, в начальный момент времени; определение уровня зрелого гепцидина в одной или более пробах биологической жидкости, взятой у пациента, в один или более моментов времени; сравнение уровня зрелого гепцидина, определенного в разные момент времени,что обеспечивает мониторинг расстройства, в развитии которого участвует зрелый гепцидин. Дополнительно в изобретении предложен набор для осуществления иммунного анализа, включающий антитела согласно настоящему изобретению, и соответствующий контейнер. Описание фигур На фиг. 1 показан масс-спектр MALDI-TOF множественных форм гепцидина человека, выделенных из сыворотки крови. Сигнал 1 имеет массу, которая соответствует ожидаемой массе интактного гепцидина-25 человека. Сигналы 2, 3 и 4 имеют массы, которые соответствуют укороченным по N-концу формам зрелого гепцидина человека (гепцидин-24, гепцидин-22 и гепцидин-20). Масс-спектр получили методом MALDI-TOF с применением положительных ионов, линейного режима с а-циано-4 гидроксикоричной кислотой (пептидный матрикс) в качестве пробного матрикса, как описано в примере 5 ниже. На фиг. 2 показан масс-спектр MALDI-TOF той же пробы, что и на фиг. 1 с применением 3,5-диметил-4-гидроксикоричной кислоты (матрикс из синапиновой кислоты). Сигнал 1 отображает интактный гепцидин-25 человека. Никакого сигнала от прогепцидина не наблюдали. Масс-спектр получили на масс-спектрометре с применением положительных ионов, способа линейного режима с а-циано-4 гидроксикоричной кислотой (пептидный матрикс) в качестве пробного матрикса, как описано в примере 5 ниже. На фиг. 3 А показаны последовательности аминокислот полностью человеческой каркасной области легкой цепи O2 с рассеянными CDR. Четыре каркасных участка отмечены как FRL1, 2, 3 и 4(SEQ ID NO: 39, 40, 96 и 97 соответственно). На фиг. 3 В показана последовательность аминокислот каркасной области тяжелой цепи человекаVH1-69 с рассеянными CDR. Четыре каркасных участка отмечены как FRH1-4 (SEQ ID NO: 35-38 соответственно). На фиг. 4 А показаны последовательности аминокислот каркасной области легкой цепи человека 018 с рассеянными CDR. Четыре каркасных участка отмечены как FRL1, 2, 3 и 4 (SEQ ID NO: 154, 40,156 и 97 соответственно). На фиг. 4 В показана последовательность аминокислот каркасной тяжелой цепи человека VH1-18 с рассеянными CDR. Четыре каркасных участка отмечены как FRH1, 2, 3 и 4 (SEQ ID NO: 157, 36, 158 и 38 соответственно). На фиг. 5 А показаны последовательности аминокислот каркасной области легкой цепи человекаL12 с рассеянными CDR. Четыре каркасных участка отмечены как FRL1, 2, 3 и 4 (SEQ ID NO: 159, 40,160 и 97 соответственно). На фиг. 5 В показана последовательность аминокислот каркасной тяжелой цепи человека VH1-4 6 с рассеянными CDR. Четыре каркасных участка отмечены как FRH1, 2, 3 и 4 (SEQ ID NO: 157, 36, 161 и 38 соответственно). В настоящем документе применяются следующие сокращения: АЦН: ацетонитрил,БСА: бычий сывороточный альбумин,ДТТ: дитиотреитол,ЭДТА: этилендиаминтестрауксусная кислота,ELISA: твердофазный иммуноферментный анализ,ИМАХ: иммобилизованная металл-афинная хроматография,ИПТГ: изопропилD-1-тиогалактопиранозид,МАТ: моноклональное антитело,MALDI-TOF: время-пролетная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы,ФРФБ: физиологический раствор с фосфатным буфером,ППР: поверхностный плазмонный резонанс,ТФУ: трифторуксусная кислота. Все сокращения аминокислот, применяемые в настоящем раскрытии, соответствуют общепринятым сокращениям в патентах США и Бюро по регистрации патентов и товарных знаков, как изложено в 37C.F.R.1.822 (B) (2). В настоящем описании термин "гепцидин" относится к любой форме белка гепцидина, о которой известно, что она присутствует у млекопитающих. В настоящем описании термин "зрелый гепцидин" относится к любой зрелой, биологически активной форме белка гепцидина, экспрессируемой у млекопитающих. В настоящем описании термин "гепцидин человека" относится к любой форме белка гепцидина,присутствующей у человека. В настоящем описании термин "гепцидин-25 человека" относится к зрелой форме гепцидина человека, обладающей последовательностью аминокислот, как показано вSEQ ID NO:1. В настоящем описании термин "антитело" в отношении антитела к гепцидину согласно настоящему изобретению (или просто "антитело согласно настоящему изобретению") относится к рекомбинантным моноклональным антителам человека или полностью человеческим моноклональным антителам, если не указано другое. В предпочтительном случае антитела согласно настоящему изобретению представляют собой рекомбинантные антитела человека. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены при помощи, например, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, технологий синтеза, например CDR-прививка, или при помощи сочетаний таких технологий или других технологий,-4 023406 известных в данной области техники. Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, которое получено из отдельной копии или клона, включая, например, любой клон эукариот, прокариот или фагов,а не к способу, которым его получают. В настоящем описании антитело может представлять собой интактное антитело (содержащее целую или полноразмерную область Fc) или часть или фрагмент антитела,содержащие антигенсвязывающую часть, например фрагмент Fab, фрагмент Fab' или фрагмент F(ab')2 рекомбинантного антитела человека или полностью человеческого антитела. Предпочтительные антигенсвязывающие фрагменты антитела согласно настоящему изобретению сохраняют способность к ингибированию или нейтрализации одного или более видов биологической активности, характерной для зрелой формы гепцидина млекопитающих in vivo или in vitro. Например, согласно одному варианту реализации антигенсвязывающая часть антитела согласно настоящему изобретению может ингибировать взаимодействие гепцидина-25 человека с одним или более рецепторами, например ферропортином человека (SEQ ID NO: 25), и/или может ингибировать индуцируемую гепцидином интернализацию ферропортина. Кроме того, "антитело согласно настоящему изобретению " или " антитело" в настоящем описании могут быть фрагментом одиночной цепи Fv, который можно получить путем слияния ДНК, кодирующейAntibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Pinger-Verlag, New York, p. 269-315, 1994). Следует понимать, что независимо от того, указаны антигенсвязывающие фрагменты или части, термин "антитело" в настоящем описании включает такие фрагменты или части, а также формы одиночных цепей, если не указано другого. Термины "селективный" или "селективно" в настоящем описании применительно к антителу к гепцидину-25, связывающему его, соответственно, относятся к антителу, которое селективно связывает гепцидин-25 с KD примерно в 1000, 500, 200, 100, 50, 10 или примерно в 5 раз ниже, чем KD связывания антителом по меньшей мере одной формы-предшественника гепцидина-25, и/или по меньшей мере одну укороченную по N-концу молекулу зрелого гепцидина, о котором известно, что он образуется у того же вида млекопитающих, определенной при 25 С. Дополнительно или в качестве альтернативы, селективное к гепцидину-25 антитело согласно настоящему изобретению связывает гепцидин-25, но не связывает или связывает минимально по меньшей мере одну форму-предшественник гепцидина-25 и/или по меньшей мере один укороченный по N-концу вид зрелого гепцидина, о котором известно, что он образуется у того же вида млекопитающих, что определено путем иммунного анализа и/или метода массспектрометрии MALDI-TOF, применяемых специалистами в данной области техники, включая анализ,описанный в примере 5, но не ограничиваясь им. В предпочтительном случае селективное к гепцидину 25 антитело, предложенное в настоящем изобретении, связывает гепцидин-25 человека с KD примерно в 1000, 500, 200, 100, 50, 10 или примерно в 5 раз ниже, чем для связывания антителом прогепцидина человека, предпочтительно прогепцидина человека, содержащего последовательность аминокислот, показанную в SEQ ID NO: 34, и/или по меньшей мере одной укороченной по N-концу формы зрелого гепцидина человека, определенном методом ППР при 25 С. Дополнительно или в качестве альтернативы, селективное к гепцидину-25 антитело согласно настоящему изобретению связывает гепцидин-25, но не связывает или связывает минимально прогепцидин человека, предпочтительно прогепцидин человека,содержащий последовательность аминокислот, обозначенную SEQ ID NO: 34, и/или по меньшей мере один укороченный по N-концу вид зрелого гепцидина, о котором известно, что он образуется у того же вида млекопитающих, что определено методом иммунного анализа или методами масс-спектрометрииMALDI-TOF, применяемых специалистами в данной области техники, включая анализ, описанный в примере 5. Более предпочтительно, чтобы селективное к гепцидину-25 антитело согласно настоящему изобретению связывало гепцидин-25 человека с KD примерно в 1000, 500, 200, 100, 50, 10 или примерно в 5 раз ниже, чем это антитело связывает прогепцидин человека, содержащий последовательность аминокислот, показанную в SEQ ID NO: 34, и по меньшей мере одну укороченную по N-концу форму зрелого гепцидина человека, определенным методом ППР при 25 С. Дополнительно или в качестве альтернативы, селективное к гепцидину-25 антитело согласно настоящему изобретению связывает гепцидин-25 человека, но не связывает или связывает минимально прогепцидин человека (SEQ ID NO: 34) и по меньшей мере один укороченный по N-концу вид зрелого гепцидина, о котором известно, что он образуется у того же вида млекопитающих, как определено методом иммунного анализа или методами массспектрометрии MALDI-TOF, применяемых специалистами в данной области техники, включая анализ,описанный в примере 5, но не ограничиваясь им. Предпочтительней всего, чтобы селективное к гепцидину-25 антитело согласно настоящему изобретению i) связывало гепцидин-25 человека с KD примерно в 1000, 500, 200, 100, 50, 10 или примерно в 5 раз ниже, чем это антитело связывает прогепцидин человека(SEQ ID NO: 34), и ii) связывало гепцидин-25 человека с KD примерно в 1000, 500, 200, 100, 50, 10 или примерно в 5 раз ниже, чем это антитело связывает гепцидин-20 человека (т.е. аминокислоты 6-25 вSEQ ID NO: 1) и/или гепцидин-20 человека (т.е. аминокислоты 4-25 в SEQ ID NO: 1), определенном методом ППР при 25 С. Дополнительно или в качестве альтернативы, селективное к гепцидину-25 антитело согласно настоящему изобретению связывает гепцидин-25 человека, но не связывает или связывает минимально i) прогепцидин человека (SEQ ID NO: 34) и ii) гепцидин-20 человека и/или гепцидин-22 че-5 023406 ловека, что определено методом иммунного анализа или методами масс-спектрометрии MALDI-TOF,применяемыми специалистами в данной области техники, включая анализ, описанный в примере 5, но не ограничиваясь им. В настоящем описании термин "определять" (детектировать) или "определение" (детектирование) применяют в самом широком смысле, включая количественные, полуколичественные и качественные измерения целевой молекулы. Согласно одному аспекту, описываемые в настоящем описании способы позволяют определять только присутствие или отсутствие конкретного полипептида гепцидина в биологической пробе и, таким образом, что полипептид гепцидина определим или в качестве альтернативы не определим в пробе при определении данным способом. Термин "эпитоп" относится к той части молекулы, которую может распознавать и связывать антитело в одной или более антигенсвязывающих областях антитела. Термин "биологическая активность" применительно к антителу согласно настоящему изобретению включает сродство связывания с эпитопом или антигеном, стабильность антитела in vivo и/или in vitro,иммуногенные свойства антитела, например, когда его вводят человеку, и/или способность к нейтрализации или антагонизму в отношении биоактивности гепцидина, in vivo или in vitro, включая ингибирование нарушения регулировки уровня железа в сыворотке при воспалении, например, IL-6, провоцирующие пробы, как описано в примере 4, но не ограничиваясь ими. Указанные свойства или характеристики можно наблюдать или измерять при помощи известных в данной области техники методов, включая сцинтилляционный анализ сближения, ELISA, иммунный анализ ORIGEN (IGEN), гашение флуоресценции, флуоресцентный ELISA, конкурентный ELISA, анализ ППР, включая анализ ППР с применением биосенсера BIAcore, анализ на основании нейтрализации in vitro и in vivo без ограничений (см., например, международную публикацию WO 2006/062685), связывание рецепторов и иммуногистохимию на срезах ткани из разных источников, включая человека, приматов или любые другие источники, которые могут быть нужны, но не ограничиваясь ими. Термин "биологическая активность" применительно к зрелому гепцидину, включая гепцидин-25,включает специфичное связывание зрелого гепцидина с другим белком, включая его рецептор ферропортин, одну или более опосредуемых ферропортином функций зрелого гепцидина, таких как интернализация и/или разрушение ферропортина, опосредуемый зрелым гепцидином (see, e.g., Nemeth, E., et al.,Hepcidin Regulates Iron Efflux by Binding to Ferroportin and Inducing Its Internalization, Science, 306, 20902093, (2004, регуляция зрелым гепцидином ферропортин-опосредуемого выхода железа, уровня железа в сыворотке, содержания ретикулоцитов, содержания эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита у человека, стабильности белков, например влияние зрелого гепцидина на уровень или активность другого белка in vivo или in vitro, и уровень экспрессии гепцидина и/или его распределение в тканях, но не ограничиваясь ими. Термин "ингибирует" или "нейтрализует" в настоящем описании в отношении биоактивности антитела согласно настоящему изобретению обозначает способность значительно противодействовать, препятствовать, предотвращать, сдерживать, замедлять, нарушать, исключать, прекращать, снижать или обращать биоактивность зрелого гепцидина человека, включая биоактивность зрелого гепцидина человека,измеряемую в примере 3 или 4, но не ограничиваясь ими. Антитела согласно настоящему изобретению характеризуются KD к гепцидину-25 человека, которое ниже чем примерно 1000 пМ, предпочтительно меньше чем примерно 800 пМ, более предпочтительно меньше чем примерно 400 пМ, даже более предпочтительно меньше чем примерно 200 пМ, даже более предпочтительно меньше чем примерно 100 пМ, даже более предпочтительно меньше чем примерно 75 пМ или наиболее предпочтительно меньше чем примерно 50 пМ, определенной методом ППР при 25 С. Предпочтительно, чтобы антитело селективно связывало гепцидин-25 человека с KD меньше чем примерно 800 пМ, предпочтительно меньше чем примерно 400 пМ, более предпочтительно меньше чем примерно 200 пМ, даже более предпочтительно меньше чем примерно 100 пМ, даже более предпочтительно меньше чем примерно 75 пМ или наиболее предпочтительно меньше чем примерно 50 пМ, определенным методом ППР при 25 С, а также селективно связывало по меньшей мере один гепцидин-25 другого вида, такого как гепцидин-25 обезьяны циномольгус. Более предпочтительно, чтобы такие антитела селективно связывали гепцидин-25 обезьяны циномольгус с KD меньше чем примерно 800 пМ, даже более предпочтительно меньше чем примерно 400 пМ, даже более предпочтительно меньше чем примерно 200 пМ, даже более предпочтительно меньше чем примерно 100 пМ, даже более предпочтительно меньше чем примерно 75 пМ или наиболее предпочтительно меньше чем примерно 50 пМ, определенным методом ППР при 25 С. Антитела согласно настоящему изобретению включают селективные антитела антигепцидин-25,обладающие KD в отношении гепцидин-25 человека от приблизительно 800 до приблизительно 30 пМ,предпочтительно от приблизительно 400 до приблизительно 30 пМ, более предпочтительно от приблизительно 200 до приблизительно 30 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 30 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 75 до приблизительно 30 пМ или наиболее предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 30 пМ, определенным методом ППР при 25 С. Предпочтительно, чтобы такие антитела также обладали KD в отношении гепцидина-25 яванского-6 023406 макака от приблизительно 800 до 10 пМ, более предпочтительно от приблизительно 400 до приблизительно 10 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 200 до приблизительно 10 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 10 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 75 до 10 пМ или наиболее предпочтительно от приблизительно 50 до 10 пМ, определенным методом ППР при 25 С. Антитела согласно настоящему изобретению также включают антитела, обладающие KD в отношении гепцидина-25 человека и/или гепцидина-25 яванского макака, которое по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз,по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 90 раз, по меньшей мере в 100 раз или по меньшей мере в 200 раз меньше, чем KD антител в отношении гепцидина-25 мыши и/или гепцидина-25 крысы, определенным методом ППР при 25 С. Антитела согласно настоящему изобретению также включают антитела, обладающие скоростью диссоциации от гепцидина-25 человека koff от приблизительно 110-2 до приблизительно 1,810-4 с-1,предпочтительно от приблизительно 8,510-3 до приблизительно 1,810-4 с-1, более предпочтительно от приблизительно 7,710-4 до приблизительно 1,810-4 с-1, даже более предпочтительно от приблизительно 6,510-4 до приблизительно 1,810-4 с-1 или наиболее предпочтительно от приблизительно 5,510-4 до приблизительно 2,010-4 с-1, определенной методом ППР при 25 С. Предпочтительно, чтобы такие антитела также селективно связывали гепцидин-25 человека с KD от приблизительно 800 до 30 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 400 до приблизительно 30 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 200 до приблизительно 30 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 30 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 75 до 50 пМ или наиболее предпочтительно от приблизительно 50 до 30 пМ, определенным методом ППР при 25 С. Также настоящее изобретение включает антитела, которые связывают гепцидин-25 человека, предпочтительно селективно, с KD примерно 200 пМ или менее, и нейтрализуют или противодействуют по меньшей мере одному виду биологической активности зрелого гепцидина человека in vitro или in vivo. Предпочтительно, чтобы антитело согласно настоящему изобретению обладало IC50 ниже чем примерно 200 нМ, более предпочтительно ниже чем примерно 100 нМ, даже более предпочтительно ниже чем примерно 75 нМ или наиболее предпочтительно ниже чем примерно 50 нМ при определении in vitro илиin vivo биологической активности зрелого гепцидина, которое описано, например, в примере 3 или 4. Антитела согласно настоящему изобретению также включают антитела к гепцидину-25 человека,связывающие, предпочтительно селективно, антитела, которые в значительной степени ингибируютIL-6-опосредованное снижение уровня железа в сыворотке при определении у яванского макака, которое описано, например, в примере 4. Предпочтительно, чтобы такие антитела ингибировали снижение уровня железа в сыворотке у яванского макака, вызываемое дозой IL-6 5 мкг/кг, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100% в течение 6 ч с момента получения внутривенной дозы антител примерно 10 мг/кг. Антитело согласно настоящему изобретению обладает IC50 ниже чем примерно 200 нМ, предпочтительно ниже чем примерно 100 нМ, более предпочтительно ниже чем примерно 75 нМ, даже более предпочтительно ниже чем примерно 50 нМ или наиболее предпочтительно ниже чем примерно 25 нМ в пробе на индуцируемую гепцидином интернализацию ферропортина, описанной в примере 3. Предпочтительно, чтобы антитело согласно настоящему изобретению обладало IC50 от приблизительно 200 до приблизительно 25 нМ, более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 50 нМ, более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 25 нМ, даже более предпочтительно от приблизительно 75 до приблизительно 25 нМ или наиболее предпочтительно от приблизительно 75 до приблизительно 50 нМ в пробе на индуцируемую гепцидином интернализацию ферропортина, описанной в примере 3. Согласно другому варианту реализации антитело согласно настоящему изобретению обладает IC50 от приблизительно 200 до приблизительно 25 нМ, предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 50 нМ, более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 25 нМ, даже более предпочтительно от приблизительно 75 до приблизительно 25 нМ или наиболее предпочтительно от приблизительно 75 до приблизительно 50 нМ в пробе на индуцируемую гепцидином интернализацию ферропортина, описанной в примере 3, скоростью диссоциации от гепцидина-25 человека koff от приблизительно 110-2 до приблизительно 1,810-4 с-1, предпочтительно от приблизительно 8,510-3 до приблизительно 1,810-4 с-1, более предпочтительно от приблизительно 7,710-4 до приблизительно 1,810-4 с-1,даже более предпочтительно от приблизительно 6,510-4 до приблизительно 1,810-4 с-1 или наиболее предпочтительно от приблизительно 5,510-4 до приблизительно 2,010-4 с-1, определенной методом ППР при 25 С, и селективно связывает гепцидин-25 человека с KD от приблизительно 800 до 30 пМ, предпочтительно от приблизительно 400 до приблизительно 30 пМ, более предпочтительно от приблизительно 200 до приблизительно 30 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 30 пМ, даже более предпочтительно от приблизительно 75 до 50 пМ или наиболее предпочтительно от-7 023406 приблизительно 50 до 30 пМ, определенной методом ППР. Термин "Нумерация по Кабат", используемый в настоящем описании, признан в данной области техники и относится к системе нумерации остатков аминокислот, которые более вариабельны (т.е. гипервариабельные), чем другие аминокислоты в областях тяжелых и легких цепей антитела (Rabat, et al.,Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, FifthEdition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication, No. 91-3242 (1991. Полинуклеотид является "функционально связанным" в случае, когда он находится в функциональной связи с другим полинуклеотидом. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию данной последовательности. Термины "субъект" или "пациент", употребляемые в настоящем описании равнозначно, относятся к млекопитающему, предпочтительно человеку. Согласно определенным вариантам реализации пациент страдает расстройством, при котором могло бы быть полезным снижение уровня гепцидина-25, снижение биологической активности гепцидина-25 и/или повышение уровня железа в сыворотке, количества ретикулоцитов, количества эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита. Термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она функционально связана, включая плазмиды и вирусные векторы, но не ограничиваясь ими. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят, а другие векторы могут интегрироваться в геном клетки-хозяина при их введении в клетку-хозяина и, тем самым, реплицируются вместе с геномом клетки-хозяина. Кроме того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем описании называют "рекомбинантными векторами экспрессии" (или просто "векторы экспрессии"). Примеры векторов хорошо известны в данной области техники Выражения "клетка" и "клетка-хозяин" в настоящем описании употребляются равнозначно в отношении любой клетки прокариот (например, клетки бактерий, таких как Е.coli) или предпочтительно клетки эукариот (например, клетки дрожжей, клетки растений, клетки насекомых или клетки млекопитающих, такие как СНО (клетки яичника китайского хомячка, расположенные либо in vitro, либо invivo. Клетка-хозяин включает клетки, трансформированные, трансдуцированные, трансфицированные или инфицированные одним или более рекомбинантными векторами экспрессии, содержащими полинуклеотид, кодирующий антитело согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин может находитьсяin vitro или in vivo. Например, клетки-хозяева могут находиться у трансгенного животного или в трансгенном растении. Каждая тяжелая цепь полноразмерного антитела состоит из N-концевой вариабельной области тяжелой цепи (в настоящем описании "HCVR") и С-концевой константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь полноразмерного антитела состоит из N-концевой вариабельной области легкой цепи (в настоящем описании "LCVR") и С-концевой константной области легкой цепи. HCVR и LCVR можно далее подразделить на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность ("CDR"), чередующиеся с областями, которые более консервативны, называемыми каркасными участками ("FR"). На функциональную способность антител к связыванию конкретного антигена или эпитопа в основном влияет шесть CDR, присутствующих в вариабельной области антитела. КаждаяHCVR и LCVR состоит из трех CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3 в HCVR и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вLCVR) и четырех каркасных областей, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Соответственно, термин "CDR" или "участок, определяющий комплементарность" в настоящем описании обозначает несмежные антигенсвязывающие сайты, обнаруживаемые в вариабельной области полипептидов и тяжелых и легких цепей. Эти конкретные области были описаны Kabat, et al., J. Biol.Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), by MacCallum, et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996) и Хотиа и др., Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) and by MacCallum, et al., J. Mol. Biol., 262:732745 (1996), где определения включают перекрывание или подсовокупности остатков аминокислот, когда их сравнивают друг с другом. В настоящем раскрытии распределение аминокислот в каждом домене соответствует хорошо известным условностям (например, Kabat, (1991) и/или Chothia (1987. CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. В табл. 1 и 2, представленных ниже, показаны последовательности аминокислот и консенсусные последовательности аминокислот, кодирующие предпочтительные CDR для антител, предложенных в настоящем изобретении. Константные области легких цепей человека делят на каппа или лямбда, каждая из которых характеризуется определенной константной областью, которая известна в данной области техники. Констант- 10023406 ные области тяжелых цепей человека делят на гамма, мю, альфа, дельта или ипсилон, что определяет изотип антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Некоторые изотипы могут быть дополнительно подразделены на подклассы, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Каждый тип тяжелых цепей обладает конкретной константной областью с последовательностью, хорошо известной в данной области техники. Константная область легкой цепи каппа и константные области тяжелой цепи IgG1, IgG2 и IgG4 являются предпочтительными константными областями в антителах, предложенных в изобретении. Предпочтительными константными областями тяжелых цепей для антител, предложенных в настоящем изобретении, является константная область тяжелых цепей с последовательностью аминокислот, обозначеннойSEQ ID NO: 90-94 и любыми ее вариантами, имеющими 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или примерно 15 изменений аминокислот (включая замены, вставки или делеции). Более предпочтительно, чтобы константными областями тяжелых цепей человека в антителах, предложенных в настоящем изобретении, были константные области тяжелых цепей с последовательностью аминокислот, обозначеннойSEQ ID NO: 93 и 94. Наиболее предпочтительно, чтобы константной областью тяжелых цепей человека в антителах, предложенных в настоящем изобретении, была константная область тяжелых цепей с последовательностью аминокислот, обозначенной SEQ ID NO: 93. Предпочтительными константными областями легких цепей для антител, предложенных в настоящем изобретении, является константная область легких цепей каппа с последовательностью аминокислот, обозначенной SEQ ID NO: 89 и любыми ее вариантами, имеющими 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или примерно 10 изменений аминокислот (включая замены,вставки или делеции). Наиболее предпочтительно, чтобы константной областью легких цепей человека в антителах, предложенных в настоящем изобретении, была константная область легких цепей каппа с последовательностью аминокислот, обозначенной SEQ ID NO: 89. В настоящем описании термин "антигенсвязывающая область" или "антигенсвязывающая часть" относится к той части молекулы антитела, в пределах вариабельной области, которая содержит остатки аминокислот, взаимодействующих с антигеном и придающих антителу его специфичность и сродство к антигену. Эта часть антигена включает каркасные остатки аминокислот, необходимые для поддержания правильной конформации антигенсвязывающих остатков. Настоящее изобретение включает антитело,которое селективно связывает гепцидин-25 с KD около 800 пМ или менее, определенным методом SPR при 25 С, где антитело содержит по меньшей мере CDR, выбранную из группы, включающей i) HCDR3,обладающую последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 75; и ii) LCDR3, обладающую последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO:62. Предпочтительно, чтобы такое антитело содержало шесть CDR, содержащих последовательности аминокислот и консенсусные последовательности аминокислот, выбранные из группы, включающей (i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1,HCDR2 и HCDR3, обладающие последовательностями аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 52, 60,62, 65, 71 и 75 соответственно; и (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 и HCDR3, обладающие последовательностями аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 42, 76, 62, 79, 87 и 46 соответственно. Более предпочтительно, чтобы антитело, предложенное в настоящем изобретении, содержало шестьHCDR3, обладающие последовательностями аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 43, 57, 61, 63, 84 и 46 соответственно. Даже более предпочтительно, чтобы антитело, предложенное в настоящем изобретении, содержало два полипептида тяжелых цепей и два полипептида легких цепей, в котором каждый из полипептидов тяжелых цепей обладал последовательностью аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 9,а каждый из полипептидов легких цепей обладал последовательностью аминокислот, как показано вSEQ ID NO: 17. Даже более предпочтительно, чтобы антитело обладало IC50 от примерно 100 до примерно 50 нМ в пробе на индуцируемую гепцидином интернализацию ферропортина, описанной в примере 3,скоростью диссоциации от гепцидина-25 человека koff от примерно 5,510-4 до примерно 2,010-4 с-1, определяемой методом SPR при 25 С, и селективно связывало гепцидин-25 человека с KD от примерно 100 до примерно 50 пМ. Наиболее предпочтительно, чтобы антитело, предложенное в изобретении, содержало два полипептида тяжелых цепей и два полипептида легких цепей, в котором каждый из полипептидов тяжелых цепей обладал последовательностью аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 8, а каждый из полипептидов легких цепей обладал последовательностью аминокислот, как показано вSEQ ID NO: 16, где антитело обладает IC50 от примерно 100 до примерно 50 нМ в пробе на индуцируемую гепцидином интернализацию ферропортина, описанной в примере 3, скоростью диссоциации от гепцидина-25 человека koff от примерно 5,510-4 до примерно 2,010-4 с-1, определяемой методом SPR при 25 С, и селективно связывает гепцидин-25 человека с KD от примерно 100 до примерно 50 пМ. Другие предпочтительные антитела, предложенные в изобретении, содержат LCVR, обладающую последовательностью аминокислот, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 124, 125, 126 и 127.SEQ ID NO: 124 и HCVR с последовательностью SEQ ID NO: 150. Такие LCVR предпочтительно должны быть связаны с константной областью легких цепей, происходящих от человека, или получены из константной области легких цепей, происходящих от человека, предпочтительно цепи человека каппа и наиболее предпочтительно цепи каппа с последовательностью SEQ ID NO: 89. Предпочтительно, чтобы такие HCVR были связаны с константной областью тяжелых цепей, происходящих от человека, или получены из константной области тяжелых цепей, происходящих от человека, предпочтительно IgG1, IgG2 или IgG4, более предпочтительно из константной области тяжелых цепей, содержащих последовательность аминокислот, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93 и 94, и наиболее предпочтительно, чтобы константная область тяжелых цепей содержала последовательность аминокислот SEQ ID NO: 93. Предпочтительно, чтобы антитело обладало IC50 от примерно 100 до примерно 50 нМ в пробе на индуцируемую гепцидином интернализацию ферропортина, описанной в примере 3,скоростью диссоциации от гепцидина-25 человека koff от примерно 5,510-4 до примерно 2,010-4 с-1, определяемой методом SPR при 25 С, и селективно связывает гепцидин-25 человека с KD от примерно 100 до примерно 50 пМ. Антитело согласно настоящему изобретению может содержать полипептид тяжелой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 6, и полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 14. Полипептид тяжелой цепи,обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 6, может кодироваться полинуклеотидом с последовательностью SEQ ID NO: 2. Полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 14, может кодироваться полинуклеотидом с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 10. Антитело согласно настоящему изобретению может содержать полипептид тяжелой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 7, и полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 15. Полипептид тяжелой цепи,обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 3, может кодироваться полинуклеотидом с последовательностью SEQ ID NO: 2. Полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 15, может кодироваться полинуклеотидом с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 11. Антитело согласно настоящему изобретению также содержит полипептид тяжелой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 8, и полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 16. Полипептид тяжелой цепи,обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 8, может кодироваться полинуклеотидом с последовательностью SEQ ID NO: 4. Полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 16, может кодироваться полинуклеотидом с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 12. Согласно другому варианту реализации, антитело согласно настоящему изобретению содержит полипептид тяжелой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 9, и полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 17. Полипептид тяжелой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 9,может кодироваться полинуклеотидом с последовательностью SEQ ID NO: 5. Полипептид легкой цепи,обладающий последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 17, может кодироваться полинуклеотидом с последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 13. Предпочтительные рекомбинантные антитела человека, предложенные в изобретении, обозначены здесь как Mab L1.5, Hu22, 3.12 и 3.23. SEQ ID NO последовательностей аминокислот, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей, а CDR для Mab L1.5, Hu22, 3.12 и 3.23 представлены в табл. 4. Таблица 4- 12023406 Для приготовления вектора рекомбинантной экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, выбора трансформантов, изолированных линий клеток-хозяев, вырабатывающих антитело согласно настоящему изобретению, культивирования этих клеток-хозяев и восстановления антитела из культуральной среды применяют стандартные методы молекулярной биологии. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, которые экспрессируют антитела к гепцидину, предложенные в изобретении. В данной области техники известен широкий спектр систем экспрессии хозяина, которые можно применять для экспрессии антитела, предложенного в настоящем изобретении, включая системы экспрессии прокариот (бактерий) и эукарот (такие как клетки дрожжей,бакуловируса, растений, млекопитающих и других животных, трансгенных животных и клеток гибридомы), а также системы экспрессии фагового дисплея. Антитело согласно настоящему изобретению можно приготовить путем рекомбинантной экспрессии генов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов в клетке-хозяине. Чтобы экспрессировать антитело рекомбинантно, клетку-хозяина трансформируют, трансдуцируют, инфицируют или выполняют подобные операции при помощи одного или более векторов рекомбинантной экспрессии, несущих фрагменты ДНК, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи иммуноглобулина антитела, такие, что легкие и/или тяжелые цепи экспрессировались в клетке-хозяине. Тяжелую цепь и легкую цепь можно экспрессировать независимо с разных промоторов, с которыми они функционально связаны в одном векторе или, в качестве альтернативы, тяжелую цепь и легкую цепь можно экспрессировать независимо с промоторов, с которыми они функционально связаны в двух векторах - одном, экспрессирующем тяжелую цепь, и другом, экспрессирующем легкую цепь. По выбору тяжелую и легкую цепь можно экспрессировать в разных клетках-хозяевах. Дополнительно, вектор рекомбинантной экспрессии может кодироваться сигнальным пептидом,который облегчает секрецию легкой и/или тяжелой цепи антитела из клетки-хозяина. Ген легкой и/или тяжелой цепи антитела можно клонировать в вектор, такой, чтобы сигнальный пептид был функционально связан внутри рамки считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом. В предпочтительном случае рекомбинантные антитела секретируются в среду, в которой культивируют клеткихозяева, из которой антитела можно восстановить или очистить. Изолированную ДНК, кодирующую HCVR, можно превращать в полноразмерный ген тяжелой цепи при помощи функционально-связывающей HCVR-кодирующей ДНК, в другую молекулу ДНК, кодирующую константную область тяжелой цепи. Последовательности генов константных областей тяжелых цепей человека, а также других млекопитающих, хорошо известны в данной области техники. Фрагменты ДНК, окружающие эти области, можно получить, например, методом стандартной амплификации ПЦР. Константная область тяжелых цепей может быть константной областью тяжелых цепей любого типа (например, IgG, IgA, IgE, IgM или IgD), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) или подкласса и любым их аллотипическим вариантом, как описано у Kabat (выше). Изолированную ДНК, кодирующую LCVR, можно превращать в полноразмерный ген легкой цепи(а также в ген легкой цепи Fab) при помощи функционально-связывающей LCVR-кодирующей ДНК, в другую молекулу ДНК, кодирующую константную область легкой цепи. Последовательности генов константных областей легких цепей человека, а также других млекопитающих известны в данной области техники. Фрагменты ДНК, окружающие эти области, можно получить, например, методом стандартной амплификации ПЦР. Константная область легких цепей может быть константной областью каппа или лямбда. Помимо гена(ов) тяжелых или легких цепей, вектор рекомбинантной экспрессии согласно настоящему изобретению несет регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Термин "регуляторная последовательность" должен включать промоторы, энхансеры и другие элементы для контроля экспрессии (например, сигналы к полиаденилированию), при необходимости, которые регулируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Дизайн вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которые будут трансформировать, уровня экспрессии желаемого белка. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающего, включают вирусные элементы, которые управляют высоким уровнем экспрессии в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, получаемые из цитомегаловируса (CMV), вируса Симиана 40 (SV40), аденовируса (например, аденовирусный главный поздний промотор (AdMLP и/или вирус полиомы. Дополнительно, вектор рекомбинантной экспрессии согласно настоящему изобретению может нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки инициации репликации) и один или более генов селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает отбор клеток-хозяев, в которых был введен вектор. Например, обычно ген селектируемого маркера придает резистентность к лекарственным препаратам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую ввели вектор. Предпочтительные гены селелктируемых маркеров включают ген дигидрофолат-редуктазы (dhfr) (для примене- 13023406 ния в dhfr-клетках-хозяевах с селекцией/амплификацией при помощи метотрексата), ген neo (для селекции G418) и ген глутаматсинтетазы (GS) в GS-отрицательной линии клеток (такой как NS0) для селекции/амплификации. Для экспрессии легких и/или тяжелых цепей вектор(ы) экспрессии, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи, вводят в клетку-хозяина при помощи стандартных методов, например электропорации, преципитации с фосфатом кальция, трансфекции с ДЭАЭ (диэтиламиноэтил)декстраном, трансдукции, инфицирования и подобное. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела, предложенные в изобретении в любых клетках-хозяевах - прокариот или эукариот, предпочтительны клетки эукариот и наиболее предпочтительны клетки-хозяева млекопитающих, поскольку такие клетки с большей вероятностью собирают и секретируют правильно скрученные и иммунологически активные антитела. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител, предложенных в изобретении, включают клетки яичника китайского хомячка (СНО клетки) [включая dhfr-клетки СНО,описанные в Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-20, 1980, применяемые с селектируемым маркером DHFR, например, описанным в Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982], клетки миеломы NS0, клетки COS и клетки SP2/0. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие гены антител, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела производятся культивируемыми клетками-хозяевами в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетке-хозяине, или более предпочтительно секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клеткихозяева при соответствующих условиях, известных в данной области техники. Антитела можно восстанавливать из клетки-хозяина и/или культуральной среды при помощи стандартных способов очистки. Также клетки-хозяева можно применять для получения частей, или фрагментов, антител, например фрагменты Fab или молекулы scFv при помощи традиционных методов. Например, может быть желательно трансфицировать клетку-хозяина ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь антитела, предложенного в настоящем изобретении. Чтобы удалить некоторые из всех ДНК, кодирующих либо легкую, либо тяжелую цепь, либо обе, которые не требуются для связывания с гепцидином-25 человека, можно также применять технологии рекомбинантных ДНК. Молекулы, экспрессируемые с таких процессированных молекул ДНК, также включены в антитела согласно настоящему изобретению. В изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, предложенной в настоящем изобретении. Предпочтительно, чтобы клетка-хозяин, предложенная в изобретении,содержала один или более векторов или конструкций, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты,предложенной в настоящем изобретении. Например, клетка-хозяин, предложенная в изобретении, представляет собой клетку, в которую ввели вектор согласно настоящему изобретению, причем указанный вектор содержит полинуклеотид, кодирующий LCVR антитела, предложенного в настоящем изобретении, и/или полинуклеотид, кодирующий HCVR антитела, предложенного в настоящем изобретении. В изобретении также предложена клетка-хозяин, в которую ввели два вектора: один, содержащий полинуклеотид, кодирующий LCVR антитела, предложенного в настоящем изобретении, и один, содержащий полинуклеотид, кодирующий HCVR антитела, предложенного в настоящем изобретении, каждый из которых функционально связан с регуляторными элементами - энхансером/промотором (например, полученными из SV40, CMV, аденовируса и подобных, таких как регуляторный элемент энхансерCMV/промотор AdMLP) для достижения высокого уровня транскрипции генов. После экспрессии интактные антитела, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулинов, предложенные в настоящем изобретении, можно очищать в соответствии со стандартными процедурами, включая преципитацию сульфатом аммония, ионообменную аффинную (например, белок А), обращенно-фазную колоночную хроматографию с гидрофобными взаимодействиями, гидроксиаппатитную хроматографию, гель-электрофорез и подобные стандартные процедуры для очищения терапевтических антител описаны, например, у Feng Li, Joe X. Zhou, Xiaoming Yang, Tim Tressel и у Brian Lee в статье, которая называется "Current Therapeutic Antibody Production and Process Optimization" (BioProcessing Journal, Sept./Oct. 2005). Дополнительно, стандартные методы для удаления вирусов из препаратов рекомбинантно экспрессированных антител также известны в данной области техники (см., например,Gerd Kern and Mani Krishnan, "Viral Removal by Filtration: Points to Consider" (Biopharm International, Oct. 2006. Эффективность фильтрации в целях удаления вирусов из препаратов терапевтических антител,как известно, по меньшей мере, частично зависят от концентрации белка и/или антитела в фильтруемом растворе. Процесс очистки антител, предложенных в настоящем изобретении, может включать этап фильтрации через нанофильтр фармацевтической чистоты для удаления вирусов, хроматографический поток, содержащий антитело, предложенное в настоящем изобретении, разводят или концентрируют,чтобы создать общую концентрацию белка и/или общую концентрацию антитела примерно 1-3 г/л. Даже более предпочтительно, чтобы нанофильтр представлял собой DV20 нанофильтр (например, PallCorporation; East Hills, Нью-Йорк). Предпочтительны иммуноглобулины со значительной степенью чистоты, по меньшей мере примерно 90%, примерно 92%, примерно 94% или примерно 96% гомогенности и наиболее предпочтительны от примерно 98 до примерно 99% гомогенности для фармацевтического применения. После очистки, частичной или до состояния желаемой гомогенности, стерильные антитела можно далее применять терапевтически, как указано в настоящем описании.- 14023406 Принимая во внимание предшествующее обсуждение, настоящее изобретение также относится к антителу, которое можно получить в ходе процесса, включающего два этапа культивирования клеткихозяина, включая клетку млекопитающих, растений, трансгенных животных или трансгенных растений,но не ограничиваясь ими, которые были трансформированы полинуклеотидом или вектором, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению, так, чтобы нуклеиновая кислота экспрессировалась, и, возможно, восстановление из культуральной среды клеток-хозяев. Предпочтительно, чтобы клетка-хозяин содержала вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот,как показано в SEQ ID NO: 14, 15, 16 или 17. Более предпочтительно, чтобы клетка-хозяин содержала вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 12 или 13. Даже более предпочтительно, чтобы трансформированной клеткой-хозяином была клетка яичника китайского хомячка, миеломы NS0, COS или SP2/0. Настоящее изобретение также направлено на способ получения антитела, предложенного в настоящем изобретении, включающий этапы трансформирования клетки-хозяина, включая клетку млекопитающих, растений, бактерий, трансгенных животных или трансгенных растений, но не ограничиваясь ими, полинуклеотидом или вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело согласно настоящему изобретению, так, чтобы нуклеиновая кислота экспрессировалась и восстанавливалась из культуральной среды клеток-хозяев. Предпочтительно, чтобы клетку-хозяина трансформировали вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи,обладающий последовательностью аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 14, 15, 16 или 17. Более предпочтительно, чтобы клетку-хозяина трансформировали вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид легкой цепи, обладающий последовательностью аминокислот,как показано в SEQ ID NO: 12 или 13. Еще более предпочтительно, чтобы трансформированной клеткойхозяином была клетка яичника китайского хомячка, миеломы NS0, COS или SP2/0. Термин "изолированный полинуклеотид" в настоящем описании обозначает полинуклеотид геномной кДНК или синтетический ориджин или определенное их сочетание, в которых изолированный полинуклеотид в силу своей природы (1) не ассоциирован со всем полинуклеотидом или частью полинуклеотида, в котором полинуклеотид обнаруживают в природе, (2) связан с полинуклеотидом, с которым он связан в природе или (3) не существует в природе как часть более крупной последовательности. Термин "изолированный белок" в настоящем описании обозначает, что рассматриваемый белок(1) свободен, по меньшей мере, от некоторых других белков, с которыми его обычно обнаруживают, (2) в значительной степени свободен от других белов из того же источника, например из того же вида, (3) экспрессируется клеткой другого вида, (4) был отделен по меньшей мере от 50% полинуклеотидов, липидов,углеводов или других веществ, с которыми он ассоциирован в природе, (5) не ассоциирован (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с частями белка, с которым "изолированный белок" ассоциирован в природе, (6) функционально связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он в природе не ассоциирован или (7) не существует в природе. Такой изолированный белок можно кодировать геномной ДНК, кДНК, мРНК или другой РНК или синтетической точкой инициации или любым их сочетанием. Предпочтительно, чтобы изолированный белок был в значительной степени очищен от белков или полипептидов или других примесей, которые обнаруживают в естественном окружении, которые могли бы препятствовать его применению (терапевтическому, диагностическому, профилактическому или другому)."Изолированное" антитело - это антитело, которое идентифицировали и выделили и/или очистили из компонента его природного окружения. Примеси его естественного окружения - это вещества, которые могут препятствовать терапевтическому или диагностическому применению антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Согласно предпочтительным вариантам реализации антитело очищают (1) до более чем 95 мас.% антитела, определяемой методом Лоури, и наиболее предпочтительно до 99 мас.%, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней последовательности аминокислот при применении секвенатора с вращающимся стаканом или (3) до гомогенности SDS-PAGE при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с применением голубого кумасси или предпочтительно серебряного красителя. Изолированное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках при условии,что по меньшей мере один компонент естественного окружения антитела не присутствует. Термины "по существу" или "по существу очищенный" в настоящем описании обозначает соединение или молекулу, которые являются преобладающим среди присутствующих видов (т.е. в расчете на моли более многочисленный, чем любой другой отдельный вид молекул в композиции). Согласно определенным вариантам реализации в значительной степени очищенная композиция - это композиция, в которой вид содержит по меньшей мере 50% (на основании молярности) от всех присутствующих видов макромолекул. Согласно определенным вариантам реализации в значительной степени очищенная композиция должна содержать более чем примерно 80, 85, 90, 95 или 99% от всех присутствующих в композиции видов макромолекул. Согласно определенным вариантам реализации вид очищают до значитель- 15023406 ной гомогенности (виды-примеси в композиции нельзя определить при помощи традиционных способов), где композиция содержит, по существу, единственный вид макромолекул. Также в настоящем изобретении предложен изолированный полинуклеотид, который кодирует последовательность аминокислот, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 124, 125, 126, 127, 128,148, 150 и 151. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен вектор рекомбинантной экспрессии, содержащий полинуклеотид, который кодирует последовательность аминокислот, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 124, 125, 126, 127, 128, 148, 150 и 151. В настоящем описании фраза "рекомбинантные антитела человека" относится к антителу, в котором по меньшей мере одна часть имеет происхождение от человека. Кроме того, в настоящем описании фраза"рекомбинантные антитела человека" относится к специфичным антителам, раскрываемым в настоящем описании, а также к дополнительным антителам, которые обладают функциональными свойствами, согласно изобретению, близкими к свойствам антител, раскрываемых в настоящем описании, и обладают каркасными участками, которые являются в значительной степени человеческими или полностью человеческими CDR, которые были получены из антитела не человека. В значительной степени человеческие каркасные участки (каркасные участки человека) - это участки, которые обладают последовательностью,по меньшей мере на 80% идентичной известной последовательности каркасного участка человека эмбрионального типа. Предпочтительно, чтобы в значительной степени человеческие каркасные участки обладали по меньшей мере примерно на 85%, примерно на 90%, примерно на 95% или примерно на 99% идентичной последовательностью с известной последовательностью каркасного участка человека эмбрионального типа. Наиболее предпочтительно, чтобы рекомбинантные антитела человека, предложенные в настоящем изобретении, содержали минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого антитела. Например, рекомбинантное антитело человека может содержать части, полученные из антитела нечеловеческого происхождения, такого как мышей, и части, полученные из антитела человеческого происхождения, соединенные вместе, например, химически посредством традиционных методов (например,синтеза) или приготовленные как смежный полипептид при помощи методов инжиниринга. В настоящем описании термин "каркас" применительно к вариабельной области антитела введен,чтобы обозначать все остатки аминокислот за пределами CDR в вариабельной области антитела. В настоящем описании термин "каркасный участок" введен, чтобы обозначать каждый домен каркаса, который разделен областью CDR. Каркасные участки для легкой цепи аналогично разделены каждой из вариабельных областей легких цепей CDR. Предпочтительно, чтобы вариабельная область легких цепей и/или вариабельная область тяжелых цепей содержала каркас или по меньшей мере часть каркасного участка (например, содержащий 2 или 3 подучастка, такие как FR2 и FR3). Более предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, FRL1, FRL2, FRL3 или FRL4 были полностью человеческими или, по меньшей мере, FRH1, FRH2, FRH3 или FRH4 были полностью человеческими. Даже более предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, FRL1, FRL2, FRL3 или FRL4 были последовательностью эмбрионального типа(например, эмбрионального типа человека) или содержали консенсусные последовательности человека для конкретного каркаса, известного в данной области техники, и/или, по меньшей мере, FRH1, FRH2,FRH3 или FRH4 последовательностью эмбрионального типа (например, человека эмбрионального типа) или содержали консенсусные последовательности человека для конкретного каркаса. Согласно предпочтительным вариантам реализации антитело, предложенное в настоящем изобретении, содержит последовательности каркаса легкой цепи эмбрионального типа человека и последовательности каркаса тяжелой цепи эмбрионального типа человека (см., например, РСТ WO 2005/005604). Более предпочтительно, чтобы каркасы легкой цепи эмбрионального типа человека были выбраны из группы, включающей A11,А 17, А 18, А 19, А 20, А 27, А 30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, O12, O18, O2 и O8. Даже более предпочтительно, чтобы каркасом легкой цепи эмбрионального типа человека был O2 или O18. Наиболее предпочтительно, чтобы каркасом легкой цепи эмбрионального типа человека был O2. Дополнительно, предпочтительные каркасы тяжелой цепи зародышевой линии человека выбирают из группы, включающей: VH25, VH2-2 6, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH169, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51, VH3-73, VH158, VH1-3 и VH1-2. Даже более предпочтительно, чтобы каркасом тяжелой цепи эмбрионального типа человека был VH1-69 или VH1-18. Наиболее предпочтительно, чтобы каркасом тяжелой цепи эмбрионального типа человека был VH1-69. Рекомбинантные антитела человека, помимо тех, которые раскрываются в настоящем описании, которые селективно связывали бы гепцидин-25 человека с функциональными свойствами в соответствии с изобретением, можно генерировать при помощи нескольких разных подходов. Специфические антитела,раскрываемые в настоящем описании, можно применять как шаблон или материнское антитело для производства дополнительных антител. Согласно одному подходу CDR материнского антитела имплантируют в каркас человека, который имеет высокую идентичность последовательности с каркасом материнского антитела. Идентичность последовательности нового каркаса обычно должна быть по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% по сравнению с каркасом в материнском антителе.- 16023406 Такое имплантирование может приводить к снижению сродства связывания по сравнению с материнским антителом. В таком случае каркас можно мутировать к первоначальному виду материнского каркаса в определенном положении на основании специфических критериев, опубликованных у Queen et al. Выявление остатков, которые следует рассматривать как мишень для обратной мутации, можно проводить, как указано ниже. Когда аминокислота попадает в следующую категорию, аминокислоту каркаса последовательности эмбрионального типа человека (каркас акцептора) заменяют на аминокислоту каркаса из каркаса материнского антитела (каркас донора):(а) аминокислота в каркасной области человека каркаса акцептора необычна для каркасов человека в данном положении, а соответствующая аминокислота в иммуноглобулине донора типична для каркасов человека в этом положении;(b) положение аминокислоты непосредственно соседствует с одним из CDR или(c) любой атом боковой цепи аминокислоты каркаса находится на расстоянии не более 5-6 ангстрем(от центра до центра) от атома аминокислоты CDR в трехмерной модели иммуноглобулина [Queen, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869 (1991)]. Когда каждая из аминокислот в каркасной области человека каркаса акцептора и соответствующая аминокислота в каркасе донора необычны для каркасов человека в целом в этом положении, такую аминокислоту можно заменить на аминокислоту, типичную для каркасов человека в этом положении. Такой критерий мутации к первоначальному виду не способен восстановить активность материнского антитела. Согласно другому подходу можно случайным образом мутировать привитые CDR без изменений в каркасной области и отобрать такие антитела по сродству связывания, когда оно хорошее или лучше, чем материнское антитело. Также возможно сочетание обоих этих подходов. После имплантирования специфические каркасные участки можно мутировать к первоначальному виду и наряду с этим сделать изменения в CDR. Такая общая методология описана в Wu, et al. (1999), Humanization of a murine monoclonalantibody by simultaneous optimization of framework and CDR residues", J. Mol. Biol., 294:151-162. В настоящем описании изобретения термином "донор" обозначают родительскую молекулу антитела или ее фрагмент, от которой получают фрагмент, который дает часть или участвует в построении молекулы другого антитела или ее фрагмента так, чтобы придать принимающей молекуле структурные или функциональные свойства родительской молекулы. Для конкретного примера пересадки CDR родительская молекула, от которой получают пересаживаемые CDR, является донорской молекулой. ДонорскиеCDR передают связывающую способность родительской молекулы принимающей молекуле. Следует понимать, что необязательно донорская молекула принадлежит другому виду, по сравнению с принимающей молекулой или ее фрагментом. Наоборот, важно, чтобы донор являлся отдельной и отличной молекулой. В настоящем описании термином "донор" обозначают молекулу антитела или ее фрагмент, который должен принимать даруемую часть родительской или донорской молекулы антитела или ее фрагмента. Принимающей молекуле антитела или ее фрагменту придают функциональные или структурные особенности донорской части родительской молекулы. Для конкретного примера пересадки CDR, принимающая молекула, которой передают CDR, является акцепторной молекулой. Акцепторная молекула антитела или ее фрагмент приобретает связывающую способность донорских CDR или родительской молекулы. Как и в случае донорской молекулы, следует понимать, что молекула-акцептор не обязательно должна принадлежать другому виду. Под термином "вариабельный участок" при использовании в отношении антитела или его тяжелой или легкой цепи, понимается аминоконцевой участок антитела, который придает молекуле способность связывать антиген и не является постоянным участком. Термин включает его функциональные части,которые сохраняют некоторые из всех связывающих функций целого вариабельной области. Поэтому под термином "гетеромерные фрагменты, связывающие вариабельный участок" понимают по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи и по меньшей мере один вариабельный участок легкой цепи или их фрагменты, организованные в гетеромерный комплекс. Гетеромерные фрагменты, связывающие вариабельный участок, включают, например, функциональные фрагменты Fab, F(ab)2, Fv, отдельную цепь Fv (scFv) и т.д. Такие функциональные фрагменты известны специалисту в данной области. Соответственно, использование данных терминов в описании функциональных фрагментов гетеромерных вариабельных участков направлено на то, чтобы соответствовать определениям, известным специалистам в данной области. Такие термины описываются, например, в Harlow and Lane, Antibodies:Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) and in Day, E.D.,Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). Предпочтительно, чтобы у сконструированного человеческого антитела были CDR, которые образуются из или которые получают от родительского антитела, т.е. нечеловеческого антитела, предпочтительно мышиного или его фрагмента, например мышиного Fab JXB7, в то время как основная часть и постоянный регион в том размере, в котором он представлен (или значительная часть его, т.е. по меньшей мере приблизительно 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%), кодируется последовательностью нуклеино- 17023406 вой кислоты, которая присутствует в районе иммуноглобулина гаметического типа человека (см., например, International ImmunoGeneTics Database) или присутствует в рекомбинированной или мутантной форме, вне зависимости от того, созданы ли эти антитела в клетке человека. Предпочтительно по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 CDR сконструированного человеческого антитела оптимизированы из CDR нечеловеческого родительского антитела, из которого было получено человеческое сконструированное антитело, для получения желаемого качества, например улучшенной специфичности, сродства или нейтрализации, которые можно определить с помощью, например, ИФА. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению включает HCDR3 идентичный HCDR3 родительскому мышиному Fab JXB7(то есть, SEQ ID NO: 46) и HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, по сравнению с родительским мышиным Fab JXB7. Определенные аминокислотные замены в CDR человеческих искусственных антител согласно изобретению по сравнению с родительским мышиным Fab JXB7 снижают вероятность нестабильности антитела (например, удаление одного или более CDR Asn остатков) или снижают вероятность иммуногенности антитела при введении человеку (например, как прогнозирует IMMUNOFILTER Technology (Xencor, Inc., Monrovia, CA. Человеческие искусственные антитела можно подвергать in vitro мутагенезу, используя традиционные способы в данной области, и, таким образом, каркасные области аминокислотной последовательности HCVR и LCVR человеческих искусственных рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые в естественных условиях in vivo могут не присутствовать в наборе антител половых клеток человека, несмотря на то, что их получили из последовательностей, связанных с последовательностями HCVR и LCVR половых клеток. Подразумевается, что такие аминокислотные последовательности основ HCVR и LCVR человеческих искусственных рекомбинантных антител по меньшей мере приблизительно на 85, 90, 92, 94, 95, 96,98%, или более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 99%, или более предпочтительно на 100% идентичны последовательности половых клеток человека. Соответственно, человеческие искусственные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют как в антителе-реципиенте, так и вCDR или в рамках последовательностей, введенных от родительского антитела. В данной области существует множество методов по созданию человеческих искусственных антител (см., например, РСТ International Patent Application Publication WO 2006/06046935; Queen, et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:2869 (1991); Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323327 (1988) and Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988. Например, человеческие искусственные антитела можно получить путем получения последовательностей полинуклеотида, кодирующих HCVR и LCVR родительского антитела (например, мышиное антитело или антитело, полученное с помощью гибридомы), которое избирательно связывает гепцидин-25, определения CDR в указанных HCVR и LCVR (нечеловеческих), и пересаживая такие CDR-кодирующие последовательности полинуклеотида на выбранные человеческие кодирующие основу последовательности полинуклеотида. Дополнительно, участок CDR можно оптимизировать с помощью случайного мутагенеза или мутагенеза в определенном положении для того, чтобы заменить одну или более аминокислоту в CDR на другую аминокислоту до того, как пересадить участок CDR на основу. С другой стороны участок CDR можно оптимизировать после вставки в человеческую основу с помощью методов, доступных специалисту в данной области. После пересадки CDR-кодирующих последовательностей на выбранную человеческую основу, кодирующую последовательности, полученные последовательности ДНК, кодирующие искусственные человеческие вариабельные тяжелые и легкие последовательности, затем экспрессируются для получения сконструированного человеческого антитела, которое избирательно связывает гепцидин-25. Человеческие искусственные HCVR и LCVR могут экспрессироваться в качестве части целой молекулы антитела к гепцидину-25, т.е. как с последовательностями человеческого постоянного домена. Однако последовательности HCVR и LCVR могут экспрессироваться в отсутствие постоянных последовательностей для получения человеческого сконструированного Fv или Fab против гепцидина-25 человека, например (см.,например, Watkins, J., et al., Anal. Biochem., 253:37-45 (1997) and Watkins, J., et al., Anal. Biochem. 256:169-177 (1998. Следует понимать, что в применении преподавания настоящего изобретения специалист в данной области может использовать традиционные методы, например направленный мутагенез, для замещения,добавления, удаления аминокислот в пределах специфичного CDR и основ последовательностей, предложенных в настоящем описании, и при этом создавать дальнейшие аминокислотные последовательности вариабельной области, полученные из предложенных в настоящем описании последовательностей. Для всех 21 альтернативных природных аминокислот в специфический сайт можно ввести замены. В итоге in vitro или in vivo технологии скрининга, например, описанные в примере 2 настоящего описания,доступны сотруднику для отбора аминокислотных последовательностей вариабельной области фрагментов Fab с желаемой связывающей аффинностью к полипептидам гепцидина. Таким образом, далее можно определить фрагменты Fab, которые подходят для получения антител к гепцидину согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, аминокислотные замены, вставки и делеции в пределах основ ограничиваются одной, двумя, тремя или четырьмя позициями в пределах одной или каждой последовательности основного участка, (т.е. FRL1, FRL2, FRL3, FRL4, FRH1, FRH2, FRH3, FRH4), приведенные в настоящем- 18023406 описании. Предпочтительно аминокислотные замены, вставки и делеции в пределах CDR ограничены одной-тремя позициями в пределах одного или каждого CDR, более предпочтительно замены, вставки и делеции происходят в пределах одного или каждого CDR. Более предпочтительно аминокислотные замены, вставки и делеции происходят в одной или двух позициях в пределах CDR вариабельной области тяжелой цепи. Более предпочтительно аминокислотные замены, вставки и делеции происходят в одной или двух аминокислотах в пределах CDRH2. Полученные последовательности ДНК, кодирующие человеческие искусственные вариабельные тяжелые и легкие последовательности затем экспрессируются для получения искусственного антитела человека, которое избирательно с высоким сродством связывает человеческий гепцидин-25. Искусственные человеческие HCVR и LCVR могут экспрессироваться как часть целой молекулы антитела к гепцидину-25, т.е. как с последовательностями человеческого постоянного домена. В одном аспекте настоящего изобретения обеспечиваются способы применения антител согласно изобретению в относительно простых, но высокочувствительных и избирательных иммунологических исследованиях для определения и измерения уровня зрелого гепцидина в тканях человека и биологических жидкостях для диагностических и прогностических целей. Антитела согласно настоящему изобретению обеспечивают способы точного определении или обнаружения количеств зрелого гепцидина в тканях или биологических жидкостях человека для оценки предрасположенности к заболеваниям, опосредованных зрелым гепцидином, и для определения или диагностики таких заболеваний у пациентов, страдающих от них. Например, антитела согласно настоящему изобретению можно использовать в чувствительных и надежных иммунологических исследованиях, например ИФА, РИА, анализ иммунодиффузии или анализы по иммунодетекции, например поверхностный плазмонный резонанс. Аналогично, антитела согласно настоящему изобретению также можно использовать для иммуногистохимического анализа и анализа иммунофлуоресценции образцов тканей или биологических жидкостей. Такие анализы можно использовать для определения аберрантных уровней гепцидина-25 и поэтому диагностики заболеваний, связанных с гепцидином-25. Более точно, настоящее изобретение обеспечивает способы диагностики у пациента заболеваний, опосредованных зрелым гепцидином, путем измерения уровня человеческого гепцидина в образце ткани или биологической жидкости пациента и сравнения уровня человеческого зрелого гепцидина в образце с уровнем зрелого человеческого гепцидина в соответствующем образце от одного или более контрольных индивидов или с эталонным образцом, путем чего диагностируется заболевание, связанное с повышенным уровнем человеческого зрелого гепцидина. Болезненное состояние может включать одно или более негенетическое заболевание, связанное с пониженным уровнем железа, числа ретикулоцитов, эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита. Предпочтительно болезненное состояние может включать одно или более заболевание, связанное с анемией. Способ мониторинга заболевания пациента, опосредованного человеческим зрелым гепцидином,также обеспечивается. Способ включает определение уровня человеческого гепцидина в образце ткани или биологической жидкости пациента, страдающего или находящегося под риском развития заболевания, опосредованного человеческим зрелым гепцидином, на первое время определяя уровень человеческого зрелого гепцидина в одном или более образцов ткани или биологической жидкости пациента на один или более моментов времени, сравнение уровней человеческого зрелого гепцидина, определенных в различные периоды времени, путем чего наблюдают заболевание, опосредованное зрелым человеческим гепцидином. Селективные антитела к гепцидину согласно настоящему-изобретению особенно полезны при применении для методов с высокой пропускной способностью. Такие методы включают методы микрочипов и микроэррей методы, с помощью которых множество образцов можно тестировать на микропланшете или стекле, или другие субстратные методы, известные в данной области. Присутствие зрелого человеческого гепцидина или его уровень в биологическом образце можно определить путем объединения биологического образца, например, с антителом согласно настоящему изобретению при условиях, подходящих для образования комплекса антиген-антитело. Антитело непосредственно или более предпочтительно не напрямую помеченоопознавательной функциональной группой для облегчения определения связанного или несвязанного антитела. Широкий спектр способов определения образования иммунного комплекса известны в данной области, например ИФА, РИА, иммунный блоттинг (например, дот-блоттинг, слот-блоттинг, вестерн блоттинг и т.д.), способы непрямой иммунофлуоресценции и способы, которые основаны на определении изменения физических параметров, например ППР и т.д. Такие применения включают способы, в которых применяют избирательное антитело к гепцидину-25 согласно настоящему изобретению, конъюгированное с определимым функциональным веществом для того, чтобы определить гепцидин в биологическом образце, например биологической жидкости человека или экстракте клетки или ткани. Антитела согласно изобретению можно использовать в подобных анализах с модификацией или без модификации определяемым функциональным веществом. В случае модификации, определяемой молекулой, антитела согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы с помощью ковалентного или не ковалентного присоединения определяемого функционального вещества. В настоящем описании под термином "определяемый" подразумевает- 19023406 ся свойство вещества (конъюгата, вещества или функциональной группы), которое позволяет определить или проследить вещество с помощью детектора путем известных аналитических способов. К типичным примерам определяемых молекул относятся, но не ограничиваются, хромофоры, флуоресцентные функциональные вещества, фосфоресцентные вещества, люминесцентные вещества, радиоактивные вещества,различные ферменты (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена), магнитные вещества (например, диамагнитные, парамагнитные или ферромагнитные материалы) и кластеры тяжелых металлов, а также любые известные функциональные вещества. Количество образованного стандартного комплекса антиген-антитело можно измерить с помощью известных в данной области способов, например фотометрических и колориметрических анализов. Предпочтительно антитела согласно настоящему изобретению используются без модификаций, т.е. косвенно помеченные по способам известным в данной области. Изобретение включает способ определения человеческого зрелого гепцидина в биологическом образце, включающий инкубацию антитела согласно изобретению с биологическим образцом при условиях и на протяжении периода времени, достаточного для того, чтобы указанное антитело связалось с белками зрелого человеческого гепцидина, и определение указанного связывания. Настоящее изобретение также обеспечивает композиции, способы и наборы для скрининга образцов, в которых предположительно содержатся полипептиды человеческого зрелого гепцидина. Такой скрининг можно проводить на образцах пациента, лабораторных образцах, в которых предположительно содержится или получается указанный полипептид. Набор может содержать селективное антитело к гепцидину-25 согласно настоящему изобретению. Набор может содержать подходящий буфер и реагенты для определения взаимодействий между образцом и селективным антителом к гепцидину-25 согласно изобретению. Предложенные реагенты могут представлять собой радиоактивно меченый, флуоресцентно меченый или ферментативно меченый агент, способный связываться или взаимодействовать с антителом согласно настоящему изобретению, например противомышиным IgG антителом. Реагент набора может быть представлен в виде жидкого раствора, прикрепленного к твердой подложке, или в виде сухого порошка. Если реагент обеспечивается в форме жидкого раствора, жидкий раствор представляет собой водный раствор. Предпочтительно, если предложенный реагент прикреплен к твердой подложке, твердая подложка может представлять собой хроматографическую среду, тестовую планшету с множеством ячеек или микроскопическое стекло. Если предложенный реагент является сухим порошком, порошок можно растворить в добавленном соответствующем растворителе, который также может быть предложен в наборе. Набор согласно изобретению обеспечивают в контейнере, который обычно содержит пробирку, в которую можно поместить антитело, антиген или реагент детекции, и предпочтительно их можно распределить на аликвоты. Наборы согласно настоящему изобретению также обычно будут включать способ заключения в себе антигена, антитела и контейнеры для реагентов для коммерческого распространения. Такие контейнеры могут включать пластиковые контейнеры, в которых хранятся желаемые пробирки и один или более необходимые химикаты, например материал для хроматографии, растворители,элюирующие агенты, тестовые пробирки, детергенты, химикаты для реакции определения. Антитело согласно изобретению можно использовать для диагностики заболевания или расстройства, связанного с действием зрелого гепцидина. Сходным образом антитело согласно настоящему изобретению можно использовать в анализе для мониторинга уровня зрелого гепцидина у пациента, который лечится от заболевания, вызванного зрелым гепцидином. Такие применения включают способы, в которых используют антитело согласно изобретению и метку для определения зрелого гепцидина в биологическом образце, например в жидкости тела человека или экстракте клетки или ткани. Антитела согласно изобретению можно использовать с модификацией или без модификации и можно их метить с помощью ковалентного или не ковалентного присоединения определимого вещества. В данной области известны различные традиционные протоколы по определению уровня белка в биологическом образце, включая, например, ИФА, РИА и FACS, они создают основу для диагностики измененного или ненормального уровня экспрессии зрелого гепцидина. Нормальный или стандартный уровни гепцидина в образце определяют с помощью известных способов, например объединяя образец,содержащий полипептид зрелого гепцидина, например, с антителом согласно изобретению при условиях,подходящих для образования комплекса антиген-антитело. Антитело непосредственно или косвенно помечено определяемым веществом для облегчения определения связанного или не связанного антитела. К подходящим веществам относят различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные материалы. Количество образованного стандартного комплекса определяется с помощью различных методов, например фотометрических способов. Количество полипетида зрелого гепцидина, представленное в образцах, затем сравнивают со стандартными значениями. Предпочтительное антитело для использования в диагностических, прогностических и/или мониторинговых анализах, наборах и способах имеет (i) полипептид тяжелой цепи с последовательностью аминокислот, как показано на SEQ ID NO: NO: 6 и полипептид легкой цепи с последовательностью аминокислот, как показано на SEQ ID NO: 14; (ii) полипептид тяжелой цепи с последовательностью аминокислот, как показано на SEQ ID NO: 7, и полипептид легкой цепи с последовательностью аминокислот,как показано на SEQ ID NO: 15; (iii) полипептид тяжелой цепи с последовательностью аминокислот, как- 20023406 показано на SEQ ID NO: 9 и полипептид легкой цепи с последовательностью аминокислот, как показано на SEQ ID NO: 17; или (iv) полипептид тяжелой цепи с последовательностью аминокислот, как показано на SEQ ID NO: 8, и полипептид легкой цепи с последовательностью аминокислот, как показано наSEQ ID NO: 16. Выделенное избирательное антитело к гепцидину-25 согласно изобретению можно использовать для лечения, преимущественно лечения людей. Фармацевтическую композицию, содержащую антитело согласно изобретению, можно использовать для повышения уровня железа в сыворотке, числа ретикулоцитов, числа эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита, если эффективное количество вводится человеку, который нуждается в этом. Далее антитело согласно изобретению можно использовать для лечения заболеваний, расстройств и состояний,при которых наличие гепцидина-25 вызывает или способствует нежелательным патологическим эффектам или снижение уровня гепцидина-25 или его биологической активности приносит терапевтическую пользу людям. Такие состояния, заболевания или расстройства включают, но, без ограничения, анемию,включая, но не ограничиваясь, анемию, возникающую из-за инфекции, воспаления, хронического заболевания и/или рака. Люди могут быть мужчинами или женщинами. Настоящее изобретение включает способ повышения уровня железа в сыворотке, числа ретикулоцитов, числа эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита, который включает введение человеку, который нуждается в нем, эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению, которое избирательно связывает человеческий гепцидин-25 с KD приблизительно 800 пМ или меньше. Кроме того или с другой стороны, настоящее изобретение включает способ лечения заболевания, состояния или расстройства у человека, который получит пользу от повышения уровня железа в сыворотке, числа ретикулоцитов, числа эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита, включая, но не ограничиваясь, анемией,возникающей из-за инфекции, воспаления, хронического заболевания и/или рака. Предпочтительно человек имеет или находится в группе риска приобретения пониженного уровня железа в сыворотке, числа ретикулоцитов, числа эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита. Более предпочтительно человек находится в группе риска или страдает от анемии, включая, но не ограничиваясь, анемию, возникающую из-за инфекции, воспаления, хронического заболевания и/или рака. Даже более предпочтительно антитело содержитiii) HCDR3 с последовательностью аминокислот, как показано на SEQ ID NO: 46. Даже более предпочтительно антитело содержит полипептиды тяжелой и легкой цепи, имеющие(i) аминокислотные последовательности, как показано на SEQ ID NO: 6 и 14 соответственно;(ii) аминокислотные последовательности, как показано на SEQ ID NO: 7 и 15 соответственно;(iii) аминокислотные последовательности, как показано на SEQ ID NO: 9 и 17 соответственно; или(iv) аминокислотные последовательности, как показано на SEQ ID NO: 8 и 16 соответственно. Более предпочтительно антитело содержит полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи с последовательностью аминокислот, как показано на SEQ ID NO: 8 и 16 соответственно. Кроме того, указывается использование антитела согласно изобретению для приготовления медикаментов для лечения анемии или по меньшей мере одного из заболеваний, упомянутых выше. Предпочтительно антитело содержитiii) HCDR3 с последовательностью аминокислот, как показано на SEQ ID NO: 46. Более предпочтительно антитело содержит полипептиды тяжелой и легкой цепи, имеющие(i) аминокислотные последовательности, как показано на SEQ ID NO: 6 и 14 соответственно;(ii) аминокислотные последовательности, как показано на SEQ ID NO: 7 и 15 соответственно;(iii) аминокислотные последовательности, как показано на SEQ ID NO: 9 и 17 соответственно; или(iv) аминокислотные последовательности, как показано на SEQ ID NO: 8 и 16 соответственно. Более предпочтительно антитело содержит полипептиды тяжелой и легкой цепи, имеющие последовательности аминокислот, обозначенные в списке последовательностей SEQ ID NO: 8 и 16 соответственно. Терминами "лечение" или "лечить" обозначают все способы, для которых может быть показано замедление, прерывание, подавление, контроль или остановка прогрессии расстройств, приведенных в настоящем описании, но не обязательно указывают на полное устранение всех симптомов расстройств."Лечение" при употреблении в настоящем описании включает введение соединения согласно настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния у млекопитающих, конкретно людей, и включает (а) подавление дальнейшей прогрессии заболевания, т.е. подавление ее развития; и (б) облегчение заболевания, т.е. вызывание регрессии заболевания или расстройства или облегчение ее симптомов или осложнений. Схему приема лекарственного средства можно регулировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (т.е. терапевтического ответа). Например, можно принимать одну таблетку, несколько поделенных доз постепенно или можно пропорционально уменьшать или увеличивать дозу в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Термин "предотвращение" (или "предотвращать" или "профилактика") означает препятствовать,сдерживать или подавлять проявление симптомов, расстройства или заболевания. Осложнения и хронические симптомы можно лечить и проводить их профилактику. При обострении антитело согласно изобретению вводится при проявлении симптомов, расстройств, заболевания и его перестают вводить, когда обострение прекращается. Наоборот, хронические симптомы, расстройства или состояния лечат на протяжении более длительного периода времени. Под термином "расстройство" понимают любое состояние, которое можно улучшить при лечении согласно настоящему изобретению. Термины "расстройство", "состояние" и "заболевание" в настоящем описании используются взаимозаменяемо, включают хронические и острые заболевания, опосредованные зрелым гепцидином, включая, но не ограничиваясь, анемию, включая, но не ограничиваясь, анемию,которая возникает из-за инфекций, воспаления и/или рака. Антитело согласно изобретению можно включить в фармацевтическую композицию, которая подходит для введения человеку. Антитело согласно изобретению можно вводить поодиночке или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или растворителем в виде одной дозы или нескольких доз. Такие фармацевтические композиции создают для того, чтобы они соответствовали выбранному способу введения, в качестве фармацевтически приемлемых растворителя, носителя и/или наполнителя используются, например, диспергирующие агенты, буферы, сурфактанты, консерванты, растворители,изотонические агенты, включая, но не ограничиваясь, хлорид натрия, стабилизирующие агенты и т.п. Указанные композиции можно создавать согласно традиционным способам, описанным, например, вRemington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton,PA, 1995, который представляет собой сборник методик разработки композиций, которые известны специалисту в данной области. Подходящие носители для фармацевтической композиции включают, но не ограничиваются, любой материал, который при объединении с антителом согласно изобретению, сохраняет активность молекулы и не является реактивным для иммунной системы человека. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция согласно изобретению включает i) антитело согласно изобретению, ii) цитратный буфер и iii) хлорид натрия. Предпочтительно антитело представлено в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 35 мг/мл, цитрат представлен в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 20 мМ, хлорид натрия представлен в концентрации от приблизительно 100 до приблизительно 300 мМ, и рН композиции равен от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,2. Более предпочтительно антитело представлено в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 30 мг/мл, цитрат представлен в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 15 мМ,хлорид натрия представлен в концентрации от приблизительно 150 до приблизительно 300 мМ, и рН композиции равен от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5, еще более предпочтительно антитело представлено в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 25 мг/мл, цитрат представлен в концентрации приблизительно 10 мМ, хлорид натрия представлен в концентрации от приблизительно 200 мМ до приблизительно 300 мМ, и рН композиции равен от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5. Фармацевтическую композицию, содержащую антитело к гепцидину-25 согласно настоящему изобретению, можно вводить человеку, который подвергается риску или имеет патологии, описанные в настоящем изобретении, например анемию, путем стандартных способов введения. Термином "эффективное количество" в настоящем описании изобретения обозначается количество(для доз, для длительности и для способов введения), необходимое для достижения желаемого терапев- 22023406 тического эффекта. Эффективное количество может различаться в зависимости от факторов, таких как стадия заболевания, возраст, пол, вес пациента, и способности антитела или дозы антитела вызывать желаемый ответ у пациента. Эффективное количество также представляет собой то количество, в котором благотворный терапевтический эффект превосходит любое токсическое или вредное действие антитела. Эффективное количество представляет собой, по меньшей мере, минимальное количество, но меньше, чем токсическая концентрация активного агента, которое необходимо для того, чтобы оказывать благотворное действие на человека. Другими словами, эффективное количество или терапевтически эффективное количество антитела согласно изобретению представляет собой количество антитела, которое у млекопитающих, предпочтительно человека, (i) повышает уровень железа в сыворотке, увеличивает число ретикулоцитов, эритроцитов, гемоглобина и/или гематокрита, или (ii) лечит заболевание, при котором зрелый гепцидин вызывает или способствует нежелательному патологическому эффекту, или(iii) понижает уровень зрелого гепцидина, или биологическая активность гепцидина дает терапевтический эффект у млекопитающих, предпочтительно человека, при, включая, но не ограничиваясь, анемии,включая, но не ограничиваясь, анемию хронической болезни, включая, но не ограничиваясь, анемию,возникающую в результате инфекции, воспаления и/или рака. Эффективное количество антитела согласно настоящему изобретению можно вводить в виде одной дозы или нескольких доз. Более того, эффективное количество антитела согласно изобретению можно вводить в виде нескольких доз количества,которое будет меньше эффективного количества, если вводить его не более одного раза. Как хорошо известно в медицине, дозировка лекарства зависит от многих факторов, включая вес пациента, площадь тела, возраст, лекарство, которое вводят, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, которые одновременно принимает пациент. Дозировки могут далее различаться в зависимости от типа и серьезности заболевания. Обычная доза может составлять, например,от приблизительно 1 до приблизительно 200 мг; предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 200 мг; более предпочтительно от 5 до 200 мг; еще более предпочтительно от 5 до 50 мг,еще более предпочтительно от 5 до 25 мг; еще более предпочтительно от 5 до 20 мг; еще более предпочтительно от 5 до 15 мг; однако, предусматриваются дозы меньше или больше этого примерного ряда, особенно, учитывая приведенные выше факторы. Ежедневные схемы приема лекарственного средства могут варьировать от приблизительно 10 мкг/кг до 20 мг/кг, преимущественно от приблизительно 25 мкг/кг до 20 мг/кг,более предпочтительно от приблизительно 50 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг,еще более предпочтительно от приблизительно 100 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг,еще более предпочтительно от приблизительно 200 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг,еще более предпочтительно от приблизительно 300 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг,еще более предпочтительно от приблизительно 400 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг,еще более предпочтительно от приблизительно 500 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг,от приблизительно 600 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 700 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг,от приблизительно 800 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг,от приблизительно 900 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг, еще более предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/кг, еще более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 20 мг/кг, еще более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 20 мг/кг, еще более предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 20 мг/кг, еще более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 20 мг/кг, еще более предпочтительно от приблизительно 6 до приблизительно 20 мг/кг, еще более предпочтительно от приблизительно 7 до приблизительно 20 мг/кг и еще более предпочтительно от приблизительно 8 до приблизительно 20 мг/кг. За прогрессом можно следить с помощью периодических оценок и, соответственно, можно регулировать дозу. Количество антитела будет определять врач. Ключевым фактором при выборе дозы и режима введения является полученный результат. Факторы, подлежащие рассмотрению, включают определенное заболевание, которое лечат, клиническое состояние пациента, причину заболевания, место доставки антитела, определенный тип антитела, способ введения, схему введения и другие факторы, которые известны врачам-терапевтам. Антитело согласно изобретению можно вводить орально, парентерально, с помощью ингаляции или наружно. Преимущественно, антитела согласно изобретению можно встроить в фармацевтическую композицию, приемлемую для парентерального введения. Термин "парентерально" в настоящем описании включает внутривенное, внутримышечное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Предпочтительна доставка парентерально путем внутривенных, внутрибрюшинных или подкожных инъекций. Наиболее предпочтительны подкожные инъекции. Подходящие способы инъекции известны в данной области. Традиционно фармацевтическая композиция должна быть стерильна и стабильна при условиях производства и хранения в обеспеченном контейнере, включая, например, запаянную пробирку, шприц или другое устройство для доставки, например ручку. С этой целью фармацевтическую композицию можно стерильно профильтровать после создания лекарственной формы или другими способами сделать- 23023406 микробиологически допустимой. Приведенные ниже примеры являются исключительно иллюстративными и не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Примеры Пример 1. Получение гепцидина-25 человека. Гепцидин-25 человека может быть получен из коммерческих источников (например, PeptideInternational (Louisville, Kentucky, США или получен с помощью различных методик синтеза или рекомбинантных методик, известных в данной области. В качестве альтернативы в Е.coli экспрессируют белок, включающий последовательность гепцидина-25 человека из 25 аминокислот и имеющий последовательность аминокислот, обозначенную в списке последовательностей SEQ ID NO: 95. Тельца включения выделяют из 3 л Е.coli, в которой экспрессируется человеческий гепцидин-25 после 3-6 часовой индукции 1 мМ IPTG при 37 С. Тельца включения выделяли в буфере А (50 мМ Tris и 8 M мочевины (рН 8,0. Супернатант пропускали через IMAC колонку (20 мл смолы). Колонку промывали буфером А до тех пор, пока поглощающая способность возвращалась на исходный уровень, и связавшиеся полипептиды совместно вымывали из колонки 0,5 М имидазолом в буфере А. Гибридный белок гепцидина-25 человека накапливали и восстанавливали 50 мМ ДТТ. Затем полученный гибридный белок подвергали рефолдингу путем разведения пула в 2 М мочевине, 3 мМ цистеине, 50 мМ Tris (pH 8,0) до достижения конечной концентрации пептида 50 мкг/мл. Этот материал перемешивали при комнатной температуре и окисляли на воздухе в течение 48 ч. Окисленные полипептиды пропускали через колонку IMAC (20 мл) при скорости потока 5 мл/мин и гибридный белок человеческого вымывали из колонки 0,5 М имидазолом в буфере А. Накопленные фракции, в которых содержится гибридный белок гепцидина-25 человека,концентрировали и пропускали через Superdex 75 (GE Healthcare, ХК 26/60) колонку, уравновешенную 50 мМ Tris, 4 M мочевины, рН 8,0, при скорости потока 3 мл/мин. Мономерный гибридный белок накапливали и затем разводили и разбавляли до 50 мМ Tris, 2 M мочевины, 5 мМ CaCl2, рН 8,0 и затем расщепляли энтерокиназой с получением гепцидина-25 человека последовательности SEQ ID NO: 1. Нерасщепленный гибридный белок гепцидина-25 человека удаляли с помощью пассивной IMAC хроматографии(как указано выше). Поток через колонку IMAC (хроматография на агарозной матрице с иммобилизованными металлами) затем пропускали через С-18 колонку для обращенно-фазовой хроматографии при скорости потока 4,0 мл/мин. Колонку промывали 0,1% TFA в воде до тех пор, пока поглощение не возвращается к исходному и связавшиеся полипептиды вымывали из колонки с линейным градиентом ACN от 20 до 40% 0,1% TFA при скорости 0,5%/мин. Фракции, в которых содержится полипептид гепцидина 25 человека, накапливали и анализировали с помощью секвенирования N-концевой аминокислоты и ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы - масс спектрометрии (MALDI-MS). Полипептиды, кодирующие гепцидин-25 крысы, мыши и яванского макака, различные формы гепцидина-25 человека, усеченные с N-конца, включая гепцидин-22 и гепцидин-20, получали коммерческим путем (например, Peptide International). Пример 2. Измерение аффинности связывания моноклональных антител и антигенсвязывающих фрагментов к гепцидину-25. Сенсор поверхностного плазмонного резонанса, например BIAcore T100, можно использовать для измерения кинетики и сродства связывания антител, приведенных в настоящем описании. В системе BIAcore используются оптические свойства ППР для определения изменений белковых концентраций взаимодействующих молекул в пределах декстранового биосенсорного матрикса. За исключением оговоренных случаев, все реагенты и материалы приобретали в BIAcore AB (Upsala, Швеция). Все измерения проводятся при 25 С. образцы разводят в буфере HBS-EP (150 мМ хлорида натрия,3 мМ EDTA, 0,05% по объему сурфактанта Р-20 и 10 мМ HEPES, рН 7,4). Для фиксации Fab с каппа человека, антитела козы к каппа-цепям человека иммобилизовали в проточных кюветах 1-4 сенсорного чипа СМ 5 при уровне 5000-10000 единиц ответа (Rus) с помощью набора для связывания аминов. Для фиксации антител с IgGl мыши, антитела козы к Fc-гамма мыши иммобилизовали в проточных кюветах 1-4 сенсорного чипа СМ 5 при уровне 5000-10000 Rus с помощью набора для связывания аминов. Для фиксации антител с IgG4 человека, белок А иммобилизовали в проточных кюветах 1-4 сенсорного чипа СМ 4 при уровне 400-700 Rus с помощью набора для связывания аминов. Fab, полученные из периплазмы Е.coli и МАТ, полученные из культуры клеток человека, измеряли с помощью различных аналитических циклов. Каждый цикл состоит из двух последовательных этапов: 0,3-2 мин введения Fab или МАТ в количестве приблизительно 10 мкл/мин с целью фиксации при 200-1000 Rus, 2 мин введения в количестве 50 мкл/мин различных концентраций гепцидина-25 человека (от 600 до 0,1 нМ), полученного как описано выше в примере 1, с последующей диссоциацией в течение 10 мин, восстановлением 30 мкл 10 мМ гидрохлорида глицина, рН 1,5. Измерения осуществляли при 25 С, скорости ассоциации и диссоциации в каждом цикле определяли с помощью связывающей модели "1:1 с переносом вещества" и программного обеспечения BIAevaluation.- 24023406 Показатели связывания гепцидина-25 человека Fab мыши JXB7 и некоторыми человеческими сконструированными Fab к гепцидину показаны в табл. 5. Было установлено, что способность к связыванию(KD) других искусственных Fab человека в отношении гепцидина-25 человека, приведенные в табл. 3,составляют от приблизительно 214 до 54 пМ, у каждого скорость koff от гепцидина-25 человека составляла от 7,6810-4 до приблизительно 2,2210-4 с-1. Таким образом, обнаружили человеческие искусственныеFab к гепцидину с KD в 52 раза ниже, чем KD Fab JXB7. Искусственные Fab человека к гепцидину, приведенные в табл. 5, включают каркасные области легкой и тяжелой цепи предшественников половых клеток человека O2 и VH1-69 соответственно. Таблица 5 Способность к связыванию гепцидина-25 человека Характеристики связывания гепцидина-25 человека моноклональными антителами JXB7 мыши и некоторыми искусственными МАТ к гепцидину приведены в табл. 6. Таким образом, выявили искусственные МАТ человека к гепцидину со способностью к связыванию (KD) по отношению к гепцидину-25 приблизительно в 33 раза ниже, чем у МАТ мыши JXB7. Константные области тяжелых цепей для MATJXB7 и 31 В 2 являлись мышиными IgG1. Константные области тяжелых цепей для других МАТ в табл. 6 представляли собой IgG4 человека (SEQ ID NO: 94). Таблица 6 Связывание с гепцидином-25 человека Параметры связывания гепцидина-25 яванского макака и гепцидина-25 мыши различных искусственных МАТ человека к гепцидину приведены в табл. 7 и 8 соответственно. Связывание с гепцидином 25 крысы MAT Hu22, 3.23 и 3.8 определить не удалось. Показано, что KD MAT Hu22 и 3.23 зрелого гепцидина яванского макака сравнимо с KD гепцидина-25 человека. Однако было показано, что KD MAT 3.8 в отношении гепцидина-25 яванского макака в 10 раз меньше, чем для гепцидина-25 человека. С другой стороны, было показано, что MAT Hu22, 3.23 и 3.8 имеют значительно более низкую KD для гепцидина 25 человека, чем для гепцидина-25 мыши. Таблица 7 Связывание с гепцидином-25 яванского макака- 25023406 Пример 3. Клеточные анализы интернализации и разрушения ферропортина, вызванных гепцидином. Для измерения нейтрализующей активности МАТ в отношении гепцидина человека можно использовать in vitro систему анализа на основе клеток. Один in vitro анализ на основе клеток, который можно использовать для измерения нейтрализующей активности антител согласно настоящему изобретению,основан на интернализации гепцидина и разрушении рецептора гепцидина. Вкратце: получают стабильную линию клеток HEK-293, которая благоприятствует индуцибельной экспрессии ферропортина (FPN).FPN на С-конце связан с зеленым флуоресцентным белком (GFP) для того, чтобы можно было проследить его путь. Индуцибельную экспрессию молекулы FPN-GFP контролируют с помощью системы Т-REx, коммерчески доступной системы тетрациклин-зависимой экспрессии без вирусных трансактиваторов (Invitrogen, Carlsbad, СА). Кодирующую последовательность FPN-GFP клонировали в векторpCDNA4/T0, который содержит индуцибельный промотор и маркер устойчивости к зеоцину. Полученной конструкцией трансфицировали клетки T-REx-293, в которых экспрессируется регуляторный белок,который необходим для экспрессии, вызванной доксициклином. Клоны, устойчивые к зеоцину, проверяли на индуцибельную экспрессию FPN-GFP. Условия роста клеток описаны в руководстве изготовителя для системы T-REx. В общих чертах, клетки культивировании на среде DMEM, 10% диализной FBS,20 мкМ FAC (двойная соль лимонно-кислого железа и аммония) и 5 мкг/мл пенициллина-стрептомицина. Отбор проводили с помощью 100 мкг/мл зеоцина и 5 мкг/мл бластицидина. Клетки культивировали в 96-луночных планшетах, покрытых поли-D-лизином. Для определения общей флуоресценции в каждой лунке использовали флуоресцентный планшетный ридер с высоким разрешением. В целом, анализ проводили следующим образом: после трипсинизации на 96-луночные планшеты посеяли 9,000 клеток/лунку клеток стабильной клеточной линии с помощью FPN-GFP/TREx-293. В каждую лунку помещали по 80 мкл. Оставляли клетки прикрепляться к подложке на ночь. Рано утром в каждую лунку добавляли 9 мкл 30 нг/мл доксициклина для индукции экспрессии FPN-GFP. Индукцию проводили в течение 8 ч. После индукции среду удаляли и лунки промывали 120 мкл/лунка ФБР. Необходимо тщательно удалить всю жидкость из лунок, так как остатки среды продолжают вызывать индукцию экспрессии FPN-GFP. Желательную обработку готовили в формате 96-лунок для быстрого добавления в планшет после промывки. Конечный объем в каждой лунке составляет 45 мкл. Непосредственно после добавления реагентов планшет считывали с помощью флуоресцентного считывающего устройства для планшетов с высоким разрешением (550 В в канале 1). Это считывание представляет собой считывание нулевого часа,его используют для нормировки числа клеток в лунке, что соответствует общему FLU на лунку. Максимальная интернализация, вызванная гепцидином-25 человека, и разрушение ферропортина происходят при концентрации 0,5 мкМ. IC50 гепцидина-25 человека составляет приблизительно 8 нМ. Для анализа нейтрализации антител к гепцидину концентрацию гепцидина-25 человека поддерживают на уровне 100 нМ и антитела к гепцидину готовят в двух разведениях от 0,5 мкМ до 8 нМ. Планшеты инкубируют в течение 24 ч, после чего считывают снова. Результат рассчитывают по отношению общего числа флуоресцентных единиц (FLU) в лунке после 24 ч к общему числу FLU в лунке на нулевом часе. В данных анализах in vitro биологическую активность гепцидина-25 человека нейтрализовали различными МАТ к гепцидину, значения IC50 приведены в табл. 9. Таблица 9In vitro нейтрализующее действие искусственных человеческих МАТ к гепцидину-25 Пример 4. Введение моноклональных антител к гепцидину повышает уровень железа в сыворотке яванских макак, которым подкожно вводили интерлейкин-6. Влияние антител к гепцидину на нарушение баланса железа в сыворотке, вызванного IL-6, на модели яванских макак описано ниже. В общих чертах антитела к гепцидину вводили самцам яванских макак в количестве 1 и 10 мг/кг в форме внутривенного болюса. Приблизительно через 1 ч после введение антитела животным однократно вводили подкожно IL-6 человека в количестве 5 мкг/кг. Образцы крови собирали за 1 ч до введения, непосредственно перед введением дозы IL-6 и спустя 6, 12, 24, 48, 96, 168, 336, 504 и 672 ч после обработкиIL-6. В предпочтительном случае каждая опытная группа состоит из 3 животных. Уровень ионов железа в сыворотке можно определить с помощью любых способов, известных в данной области, которые являются стандартными приемлемыми медицинскими способами измерения уровня железа в сыворотке.- 26023406 Таблица 10 Подавление МАТ к гепцидину снижения уровня железа в сыворотке, вызванное IL-6 на яванских макаках По сравнению с контрольной группой животных, которым вводили ФБР, в группе, получавшей IL-6 человека, наблюдали временное снижение уровня железа в сыворотке до минимального уровня через 12 ч после введения IL-6. Внутривенное введение Hu22 и 3.23 в количестве 10 мг/кг приблизительно за 1 ч до введения IL-6 человека предотвращало понижение уровня железа в сыворотке в результате введения IL-6 и приводило к повышению уровня железа в сыворотке приблизительно на 52 и 108% соответственно, через 3 и 6 ч после обработки IL-6. После достижения пика концентрации железа в сыворотке в этих двух группах понижались и достигали уровней, полученных на 24 ч. Как Hu22 (р 0,01, 3 и 6 ч), так и 3.23 (р 0,01, 3, 6 и 12 ч) в количестве 10 мг/кг обеспечивали статистически в значительной степени повышению концентрации железа в сыворотке по сравнению с группой животных, которым вводили IL-6 с предварительным введением ФБР. Наоборот, ни Hu22, ни 3.23 в количестве 1 мг/кг не приводили к значительному различию в уровне железа в сыворотке по сравнению с контролем. Таким образом, результаты показали, что антитела согласно изобретению можно использовать для лечения анемии, возникшей из-за биологического действия зрелого гепцидина. Пример 5. Определение избирательности антител к гепцидину методом MALDI-TOF. Рутинная диагностика биологических маркеров в основном основана на иммунологических, количественных методах, например ИФА. Зачастую такие методы не подходят для малых антигенов или изоформ антигенов (Sparbier, K., International Meeting of the Association of Biomolecular Resource Facilities,Salt Lake City, UT, Poster V28-S (2008) and Gutierrez, J.A., et al., (2005.MAT 31B2 к гепцидину человека конъюгировали с активированной CNBr сефарозной смолой 6MB(GE healthcare, Piscataway, NJ) согласно протоколу изготовителя. Вкраце, сефарозную смолу трижды промывали 1 мМ HCl и антитело разводили в связывающем буфере (100 мМ NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3). Приблизительно 1,7 мг антитела использовали для конъюгации в течение ночи при 4 С на каждый 1 мг смолы. Несвязавшиеся антитела промывали 0,1 М ацетатным буфером рН 4. Приблизительно 100 мл образца сыворотки человека инкубировали с 0,8 мл сефарозной-31 В 2 смолы при 4 С. После инкубации в течение ночи смесь смолы и сыворотки загружали на колонку и промывали 10-20 объемами колонки 10 мМ фосфата натрия, 0,5 М NaCl, pH 7,4. Колонку промывали 5-10 объемами колонки 10 мМ фосфата натрия рН 7,4 без NaCl. В итоге колонку элюировали 0,2% TFA. Элюированные фракции исследовали на молекулярную массу на прибореVoyager-DE STR (Applied Biosystems, Foster City, CA) в линейном режиме. Для молекулярных масс меньше массы гепцидина-25 человека, масс-спектры получали с помощью пептидного матрикса. Определили доминантный пик, соответствующий гепцидину-25 человека, (2790Dalton). Также наблюдали менее доминантные пики различных укороченных форм гепцидина, а именно пики гепцидина-24 (2674 Dalton), гепцидина-22 (2436 Dalton) и гепцидина-20 (2192 Dalton). Для молекулярных масс больше массы гепцидина-25 человека масс-спектры получали с помощью белкового матрикса. По-прежнему определяли доминантный пик, соответствующий гепцидину-25 человека, но не наблюдали пиков, соответствующих препрогепцидину (84 аа, 9400 Dalton) или прогепцидину(60 аа, 6929 Dalton). Таким образом, иммунологические анализы, в которых используется 31 В 2 МАТ и их искусственные варианты, избирательны по отношению к гепцидину-25 человека, активной, наиболее физиологически соответствующей формы гепцидина в сыворотке человека по сравнению с предшественниками и/или его формами, усеченными на N-конце, которые присутствуют в сыворотке человека. Пример 6. Корректировка скрытого сплайсинга мРНК, кодирующей антитело к гепцидину-25, после- 27023406 экспрессии в клетках СНО. Для получения векторов рекомбинантной экспрессии используют стандартные молекулярнобиологические методики: трансфекцию клеток-хозяев, отбор трансформантов, выделение линии клетокхозяев, в которых может экспрессироваться антитело и выделение полученного антитела из культуральной среды. Удивительно, что после получения МАТ 3.12 и 3.23 в суспензии клеток яичника китайского хомячка (СНО) с помощью системы экспрессии рекомбинантной глютамин-синтетазы (GS) (LonzaBiologies, Inc., Slough, Великобритания) наблюдали повышенный уровень агрегации белков антитела(15 и 30% согласно результатам гель-хроматографии). Однако повышенный уровень агрегации не наблюдали, если два МАТ временно экспрессировали в клетках человека HEK-293. При исследовании мРНК из двух линий клеток СНО, обнаружили присутствие транскриптов неожиданных размеров, что позволяет предположить, что нуклеотидные последовательности, кодирующие белки антитела МАТ 3.12 и 3.23 подверглись скрытому сплайсингу. Также исследование образцов агрегированных белков выявило наличие укорочения в белке легкой цепи. Секвенирование кДНК, полученной на мРНК, выделенной из клеток СНО, в которых экспрессировались МАТ 3.12 и 3.23, подтвердило присутствие скрытых интронов в генах легкой цепи. Донор сплайсированного фрагмента находился в кодонах, кодирующих аминокислотные остатки R/VS LC CDR1 (аминокислоты 5-7 SEQ ID NO: 43 и "/" обозначает границу сплайсинга в рамке). Более того, обнаружили вероятную точку ветвления в кодонах, кодирующих, аминокислотные остатки LI FRL2 (SEQ ID NO: 40) с вероятной полипиримидиновой последовательностью в кодонах, кодирующих аминокислотные остатки STL и SPL в LCDR2 МАТ 3.12 и 3.23 соответственно. И, наконец,акцепторное сайты обнаружили в кодонах, кодирующих аминокислотные остатки C/Q/Q в LCDR3 обоих МАТ 3.12 и 3.23 (аминокислоты 1-3 SEQ ID NO: 61; "/" обозначает предполагаемое соединение сплайсированных участков). Исходную последовательность ДНК, кодирующую легкие цепи МАТ 3.12 и 3.23 (SEQ ID NO: 153 и 155 соответственно) затем модифицировали для того, чтобы удалить последовательности, придающие сплайсинговый донор, точку ветвления, акцептор и полипиримидиновый тракт скрытому интрону. Более точно, донорский сайт поменяли с CGC GTA AGT на AGA GTC ТСС (SEQ ID NO: 45). Точку ветвления поменяли с CTG АТС на СТС АТС (SEQ ID NO: 162); полипиримидиновый тракт с ТСС АСС CTG наAGC АСА CTG (SEQ ID NO: 77) и с ТСС ССС CTG на AGC CCA CTG (SEQ ID NO: 163) в 3.12 и 3.23 соответственно; и акцепторы с TGT CAG CAG TGG на TGC САА САА TGG (SEQ ID NO: 100). Соответственно на последующую экспрессию легких цепей МАТ 3.12 и 3.23 подействовал рекомбинантные векторы экспрессии, несущие последовательности ДНК, как показано на SEQ ID NO: 12 и 13 соответственно. Количество агрегировавшего антитела, полученного после экспрессии модифицированных последовательностей нуклеиновых кислот в клетках СНО, составило 1% или менее для 3.12 и 3.23 МАТ. Предполагается, что, вероятно, изменения в последовательностях ДНК, кодирующих легкие цепи различных других антител согласно настоящему изобретению, дадут большие преимущества, так как донор сплайсинга, полипиримидиновая последовательность и акцепторы сплайсинга происходят от кодонов, кодирующих LCDR, которые обеспечивают специфичность антитела. Точки ветвления находятся в FRL2, и последовательность LLIY является высококонсервативной в основе легких цепей. Более того,мотив QQ, кодирующая последовательность нуклеотидов которого охватывает определенные области акцептора сплайсинга, является консервативной в LCDR3 многих моноклональных антител к гепцидину согласно изобретению. Обычно во многих последовательностях легкой цепи половых клеток содержится один или все кодоны Q (CAG), которые служат акцепторами потенциальных скрытых интронов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Изолированное антитело, которое связывает человеческий гепцидин-25 с KD приблизительно 800 пМ или менее, по результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) при 25 С, и включает шесть CDR, выбранных из группы, состоящей из:(iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющих последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 43, 57, 61, 63, 84 и 46 соответственно. 2. Антитело по п.1, характеризующееся скоростью диссоциации (kof) в отношении гепцидина-25 человека от приблизительно 8,510-3 до приблизительно 1,810-4 с-1, по результатам измерения методом ППР при 25 С. 3. Антитело по любому из пп.1, 2, характеризующееся KD в отношении гепцидина-25 человека от приблизительно 400 до приблизительно 30 пМ, по результатам измерения методом ППР при 25 С. 4. Антитело по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что KD антитела в отношении гепцидина-25 человека составляет от приблизительно 200 до приблизительно 30 пМ, по результатам измерения методом ППР при 25 С. 5. Антитело по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что IC50 антитела составляет от приблизительно 100 до приблизительно 50 нМ в анализе in vitro биологической активности гепцидина-25. 6. Антитело по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что IC50 антитела составляет от приблизительно 100 до приблизительно 25 нМ в анализе in vivo биологической активности гепцидина-25. 7. Антитело по п.5, отличающееся тем, что в указанном анализе измеряют интернализацию и/или разрушение ферропортина, вызванные гепцидином. 8. Антитело по п.6, отличающееся тем, что в указанном анализе измеряют снижение уровня железа в сыворотке, вызванное IL-6. 9. Антитело по любому из пп.1-8, которое представляет собой искусственное антитело человека. 10. Антитело по любому из пп.1-9, которое содержит константную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из константной области тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG4 человека и их вариантов, где указанные варианты включают менее приблизительно 15 замен, делеций или вставок аминокислот. 11. Антитело по любому из пп.1-10, включающее вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), отличающееся тем, что:(iv) HCVR и LCVR имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 151 и 125 соответственно. 12. Антитело по любому из пп.1-11, которое включает тяжелую цепь и легкую цепь, которые:(iv) имеют последовательности аминокислот, приведенные в SEQ ID NO: 8 и 16 соответственно. 13. Антитело по любому из пп.1-12, которое включает два полипептида тяжелой цепи и два полипептида легкой цепи, где каждый полипептид тяжелой цепи имеет последовательность аминокислот,приведенную в SEQ ID NO: 8, и каждый полипептид легкой цепи имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 16. 14. Антитело по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что каркасный участок вариабельной области легкой цепи и каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи являются полностью человеческими. 15. Антитело по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что каркасный участок вариабельной области легкой цепи содержит последовательности FRL1, 2, 3 и 4, приведенные в