Среда для культивирования клеток для экспрессии белков adamts
Номер патента: 23193
Опубликовано: 31.05.2016
Авторы: Хасслахер Майнхард, Шпенгер Александра, Грилльбергер Рана, Райтер Манфред, Грилльбергер Леопольд
Формула / Реферат
1. Способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей от 3 до 12 мкМ цинка.
2. Способ по п.1, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 5 мкМ цинка.
3. Способ по п.1 или 2, в котором культуральная среда содержит:
(a) по меньшей мере 0,5 мМ кальция или
(b) между 0,5 и 1,5 мМ кальция.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором культуральная среда дополнительно содержит:
(a) по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3) или
(b) между 2 и 10 мг/л никотинамида.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере 0,5 мг/л полиамина.
6. Способ по п.5, в котором полиамин представляет собой путресцин.
7. Способ по п.6, в котором культуральная среда содержит между 2 и 8 мг/л путресцина.
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором культуральная среда не содержит животных белков или является химически определенной.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором клетка выбрана из группы, состоящей из бактериальной клетки, дрожжевой клетки, клетки насекомого, клетки птицы и клетки млекопитающего.
10. Способ по п.9, в котором клеткой млекопитающего является линия клеток, выбранная из группы, состоящей из линии клеток человека, линии клеток хомячка и линии клеток мыши.
11. Способ по п.10, в котором линия клеток выбрана из группы, состоящей из линии клеток СНО, линии клеток BHK и линии клеток HEK.
12. Способ по любому из пп.1-11, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая белок ADAMTS, дополнительно содержит индуцируемый промотор.
13. Способ по любому из пп.1-12, в котором способ включает периодическое культивирование клеток.
14. Способ по п.13, в котором периодическое культивирование клеток представляет собой культивирование с многократным получением партий или культивирование клеток с подпиткой.
15. Способ по любому из пп.1-12 и 14, в котором способ включает непрерывное культивирование клеток.
16. Способ по п.15, в котором непрерывное культивирование клеток включает непрерывное культивирование клеток в суспензии или непрерывное культивирование прикрепленных клеток.
17. Способ по п.16, в котором:
(a) непрерывное культивирование клеток в суспензии осуществляют в режиме хемостата или
(b) непрерывное культивирование прикрепленных клеток осуществляют в режиме перфузии.
18. Способ по п.16 или 17, в котором для культивирования клетки используют микроноситель.
19. Способ по п.18, в котором микроносителем является пористый микроноситель.
20. Способ по любому из пп.14-19, в котором:
(a) культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток;
(b) культуру поддерживают в течение по меньшей мере одного месяца или
(c) культуру поддерживают в течение по меньшей мере двух месяцев.
21. Способ по любому из пп.1-20, в котором культуру поддерживают при температуре между 35 и 37°С.
22. Способ по любому из пп.1-21, в котором:
(а) культуру поддерживают при рН между 6,9 и 7,3 или
(b) культуру поддерживают при рН между 7,05 и 7,15.
23. Способ по любому из пп.1-22, в котором культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида.
24. Способ по любому из пп.1-23, в котором удельная активность белка ADAMTS13 в культуральной среде:
(a) составляет по меньшей мере 600 единиц на миллиграмм белка ADAMTS13 или
(b) составляет по меньшей мере 800 единиц на миллиграмм белка ADAMTS13.
25. Способ по любому из пп.1-24, в котором культура дает:
(a) по меньшей мере 400 единиц активности ADAMTS13 на 1 л культуры в сутки (единиц/л/сутки) или
(b) по меньшей мере 800 единиц активности ADAMTS13 на 1 л культуры в сутки (единиц/л/сутки).
26. Способ получения композиции ADAMTS, причем способ включает стадии:
(a) культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS, в культуральной среде, не содержащей животных белков;
(b) извлечения фракции супернатанта из культуры;
(c) осуществления стадии фильтрования или центрифугирования, чтобы удалить любые оставшиеся клетки;
(d) осуществления стадии ультрафильтрации для концентрирования белка ADAMTS и
(e) осуществления стадии диафильтрации с использованием буфера, содержащего по меньшей мере 0,5 мкМ цинка и по меньшей мере 0,1 мМ кальция; с получением, таким образом, композиции ADAMTS.
27. Способ по п.26, в котором стадия культивирования (а) включает периодическое культивирование клеток.
28. Способ по п.26, в котором стадия культивирования (а) включает непрерывное культивирование клеток.
29. Способ по любому из пп.26-28, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 0,5 мМ кальция.
30. Способ по любому из пп.26-29, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 3 мкМ цинка.
31. Способ по любому из пп.26-30, в котором культуральная среда содержит от 3 до 12 мкМ цинка.
32. Способ по любому из пп.26-31, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 5 мМ цинка.
33. Способ по любому из пп.26-32, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3).
34. Способ по любому из пп.26-33, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина В3).
35. Способ по любому из пп.26-34, в котором буфер для диафильтрации содержит по меньшей мере 5 мкМ цинка и по меньшей мере 2 мМ кальция.
36. Способ по любому из пп.26-35, в котором белок ADAMTS представляет собой ADAMTS13.
37. Способ по п.36, в котором потери удельной активности ADAMTS13 составляют менее чем 20% в период с конца стадии (с) до конца стадии (е).
38. Способ по п.36, в котором потери удельной активности ADAMTS13 составляют менее чем 10% в период с конца стадии (с) до конца стадии (е).
39. Способ по любому из пп.36-38, в котором композиция ADAMTS13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1000 единиц/мг белка ADAMTS13.
40. Способ по любому из пп.36-38, в котором композиция ADAMTS13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1500 единиц/мг белка ADAMTS13.
41. Способ по любому из пп.1-25, в котором белок ADAMTS13 представляет собой белок ADAMTS13 человека.
42. Способ по любому из пп.26-40, в котором белок ADAMTS13 представляет собой белок ADAMTS13 человека.
Текст
СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ ADAMTS Изобретение относится к культуральным средам, которые применимы для экспрессии белковADAMTS, таких как ADAMTS13. Также предлагаются способы экспрессии и очистки белковADAMTS. В некоторых вариантах среды и способы согласно изобретению применимы для экспрессии белков ADAMTS, обладающих высокими удельными активностями. Также предлагаются композиции белков ADAMTS, например ADAMTS13, с высокими удельными активностями, которые экспрессированы и очищены согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении. Перекрестная ссылка на родственные заявки По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США 61/230477, поданной 31 июля 2009, которая специально включена в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. Заявление о правах на изобретения, сделанные при исследовании или разработке, финансируемой из федерального бюджета, не применимо. Уровень техники Белки ADAMTS (дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина типа I) представляют собой семейство металлопротеиназ, содержащих несколько консервативных доменов, включая цинкзависимый каталитический домен, богатый цистеином домен, подобный дезинтегрину домен и по меньшей мере один, а в большинстве случаев несколько повторов тромбоспондина типа I (обзор см. в публикации Nicholson et al., ВМС Evol Biol. 2005 Feb 4; 5(1):11). Такие белки, которые эволюционно родственны семействам металлопротеиназ ADAM и ММР (Jones G.C., Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb; 7(1):25-31), являются секретируемыми ферментами, которые связаны с рядом заболеваний и состояний,включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТР) (Moake J.L., Semin Hematol. 2004 Jan; 41(1):4-14), соединительнотканные заболевания, злокачественные опухоли, воспаление (Nicholson et al.) и тяжелую малярию, вызванную Plasmodium falciparum (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar; 5(3):e1000349). В связи с указанной ассоциацией ферменты ADAMTS были признаны потенциальными терапевтическими мишенями для ряда патологий (Jones G.C., Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb; 7(1):2531). Соответственно, существует необходимость в способах получения больших количеств белковADAMTS, обладающих высокими удельными активностями, которые не содержат примесей, таких как вирусы, ГЭКРС (BSE) и патогены, подобные бактериям Mycoplasma. Для культивирования клеток, особенно эукариотических клеток, и более конкретно, клеток млекопитающих, постоянно требуется использование специальных культуральных сред, обеспечивающих питательные вещества, которые необходимы для эффективного роста клеток и для продуцирования биологических продуктов, особенно биофармацевтических веществ, таких как, например, рекомбинантные белки, антитела, вирусы, вирусные антигены и вирусоподобные частицы. Для эффективного продуцирования указанных биологических продуктов важно достижение оптимальной плотности клеток, а также увеличение самой экспрессии белка, чтобы получить максимальный выход продукта. В составы сред для культивирования клеток дополнительно вводили ряд добавок, включая неидентифицированные компоненты, подобные фетальной сыворотке теленка (FCS), несколько полученных от животных белков и/или гидролизатов бычьего белка, а также гидролизаты белков, полученных из растений или дрожжей. Как правило, сыворотка или полученные из сыворотки вещества, такие как, например, альбумин,трансферрин или инсулин, могут содержать нежелательные агенты, которые могут загрязнять культуры клеток и полученные из них биологические продукты. Кроме того, полученные из сыворотки человека добавки необходимо тестировать в отношении всех известных вирусов, включая вирусы гепатита и ВИЧ,которые могут передаваться через сыворотку. Кроме того, бычья сыворотка и полученные из нее продукты несут риск заражения ГЭКРС. Кроме того, все полученные из сыворотки продукты могут быть загрязнены неизвестными веществами. При использовании в культуре клеток сыворотки или белковых добавок, полученных от человека или из животных источников, существуют многочисленные проблемы(например, варьирующий качественный состав разных партий и риск загрязнения микоплазмой, вирусами или ГЭКРС), особенно если клетки используют в производстве лекарственных средств или вакцин для введения человеку. Поэтому было предпринято множество попыток получения эффективных систем хозяев и условий культивирования, которые не требуют использования сыворотки или других соединений животных белков. Такие бессывороточные среды были разработаны на основе белковых экстрактов, полученных из растений или дрожжей. Например, известно, что соевые гидролизаты применимы для процессов ферментации и могут усиливать рост многих требовательных к среде организмов, дрожжей и грибов. В публикации WO 96/26266 описано, что продукты расщепления папаином соевой муки являются источником углеводов и азота, и многие компоненты можно использовать в культурах тканей. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692) описали стимулирующие рост и продуктивность эффекты определенных пептидных фракций гидролизатов сои и пшеницы. В WO 96/15231 описана бессывороточная среда, состоящая из синтетической минимальной необходимой среды и дрожжевого экстракта, для размножения клеток позвоночных и способа получения вирусов. Состав среды, состоящей из основной среды для культуры клеток, содержащей пептид риса и экстракт дрожжей и продукт его ферментативного расщепления, и/или липид растений, для роста клеток животных описан в WO 98/15614. Среда, содержащая очищенный соевый гидролизат, для культивирования рекомбинантных клеток описана в WO 01/23527. В WO 00/03000 описана среда, которая содержит соевый гидролизат и дрожжевой экстракт, но также требует присутствия рекомбинантных форм животных белков, таких как факторы роста. В ЕР-А-0481791 описана биохимически определенная культуральная среда для культивирования сконструированных клеток СНО, которая не содержит белков, липидов и углеводов, выделенных из животного источника, дополнительно содержащая рекомбинантный инсулин или аналог инсулина, от 1 до 0,025% мас./об. расщепленного папаином соевого пептона и путресцин. В WO 98/08934 описана бессывороточная культура эукариотических клеток, содержащая гидролизованные соевые пептиды (1-1000 мг/л), от 0,01 до 1 мг/л путресцина и разнообразные компоненты животного происхождения, включая альбумин, фетуин, различные гормоны и другие белки. В контексте настоящего описания следует отметить, что путресцин, как известно, также содержится в стандартных средах, подобных DMEM/среде Хама F12, в концентрации 0,08 мг/л. Однако растительные и/или дрожжевые гидролизаты представляют собой неопределенные смеси олигопептидов и других неизвестных компонентов и примесей. Кроме того, качество коммерчески доступных партий гидролизатов сильно варьирует. В результате имеет место широкое варьирование при получении рекомбинантных белков или вирусных продуктов (до трехкратного варьирования) в зависимости от партий используемых гидролизатов ("варьирование от партии к партии"). Такой недостаток сказывается на пролиферации клеток, а также экспрессии белка в каждой клетке. В публикации US 2007/0212770 описаны различные не содержащие животных белков и не содержащие животных олигопептидов, химически определенные культуральные среды, которые применимы для получения биофармацевтических препаратов рекомбинантных белков в большом масштабе. Один из представителей семейства ADAMTS, ADAMTS13, расщепляет фактор фон Виллебранда(vWF) между остатками Tyr1605 и Met 1606, и такая функция ответственна за распад крупных мультимеров vWF in vivo. Утрата активности ADAMTS13 связывали с рядом состояний, таких как ТТР (Moake(Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar; 5(3):e1000349). Тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТР) представляет собой расстройство, характеризуемое тромботической микроангиопатией, тромбоцитопенией и тромбозом микрососудов, который может вызывать различные степени ишемии тканей и инфаркта. Клинически пациентов с ТТР диагностируют по симптомам, таким как тромбоцитопения, шизоциты (фрагменты эритроцитов) и повышенные уровни лактатдегидрогеназы (Moake J.L. Thrombotic microangiopathies. N Engl J Med. 2002; 347:589-600;purpura. Hematology (Am Soc. Hematol Educ Program). 2004:407-423; Sadler J.E. New concepts in von Willebrand disease. Annu Rev Med. 2005; 56:173-191). В 1982 г. Moake с соавторами обнаружили необычно крупные мультимеры фактора фон Виллебранда (UL-vWF) в плазме пациентов с хронической рецидивирующей ТТР (Moake J.L., Rudy C.K., TrollJ Med. 1982; 307:1432-1435). Связь между UL-vWF и ТТР была подтверждена независимыми данными,полученными Furlan с соавторами и Tsai и Lian, о том, что большинство пациентов, страдающих от ТТР,имеют недостаточное количество в плазме металлопротеазы, в настоящее время известной какN Engl J Med. 1998; 339:1585-1594). Протеаза ADAMTS13 является гликозилированным белком с молекулярной массой 190 кД, продуцируемым, главным образом, в печени (Levy G.G., Nichols W.С., Lian E.С., Foroud T., McClintick J.N.,McGee В.M., Yang A.Y., Siemieniak D.R., Stark K.R., Gruppo R., Sarode R., Shurin S.B., Chandrasekaran V.,Stabler S.P., Sabio H., Bouhassira E.E., Upshaw J.D., Jr., Ginsburg D., Tsai H.M. Mutations in a member of theADAMTS-13, является более распространенным расстройством, которое встречается у взрослых и детей старшего возраста и может рецидивировать с регулярными интервалами у 11-36% пациентов (Tsai H.M.,Lian E.С. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura.He нейтрализующие аутоантитела также могут ингибировать активность ADAMTS13 благодаря индукции выведения из циркуляции (Scheiflinger F., Knobl P., Trattner B., Plaimauer B., Mohr G., Dockal M.,Dorner F., Rieger M. Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease(ADAMTS-13) in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2003; 102:3241-3243). Активность ADAMTS13 в плазме у здоровых взрослых людей колеблется в диапазоне от 50 до 178% (MoakeJ.L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433). У большинства пациентов с наследственной или приобретенной ТТР активностьADAMTS13 в плазме отсутствует или составляет менее 5% от нормальной активности. Без лечения уровень смертности в случае ТТР превышает 90%, но плазмотерапия снижала смертность приблизительно до 20% (Moake J.L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch PatholR.L., Hatcher V.B., Sussman, I.I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Tsai H.M., Nagel R.L., Hatcher V.B., Sussman I.I. Multimeric composition of endothelial cellderived von Willebrand factor. Blood. 1989; 73:2074-2076). После секреции из эндотелиальных клеток такие мультимеры UL-vWF расщепляются в кровообращении под действием ADAMTS13 на серию более мелких мультимеров в конкретных участках расщепления в молекуле vWF (Tsai H.M., Nagel R.L.,Hatcher V.В., Sussman I.I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is convertedADAMTS13 расщепляет связь Tyr842-Met843 в центральном домене А 2 зрелой субъединицы vWF и требует присутствия цинка или кальция для своей активности (Dent J.A., Berkowitz S.D., Ware J., Kasper С.K., Ruggeri Z.M. Identification of a cleavage site directing the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87:6306-6310). vWF существует в форме "клубка пряжи" и нитчатой форме, как видно под электронным микроскопом (Slayter H., Loscalzo J., Bockenstedt P., Handin R.I. Native conformation of human von Willebrand protein. Analysis by electron microscopy and quasi-elastic light scattering. J Biol Chem. 1985; 260:8559-8563). Кроме того, атомносиловая микроскопия подтверждает, что vWF существует в глобулярной конформации в статических условиях и в подвергнутом фолдингу нитчатом состоянии после воздействия сдвигового напряженияchanges in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 1996; 88:2939-2950). Такое явление может иметь место также in vivo, когда один конец филамента vWF заякорен на поверхности. Тромбы у пациентов с ТТР состоят из небольшого количества фибрина и, главным образом, из vWF и тромбоцитов, свидетельствуя о том, что причиной тромбоза является опосредованная vWF агрегация тромбоцитов (Asada Y., Sumiyoshi A., Hayashi T., Suzumiya J., Kaketani K. Immunohistochemistry of vascular lesion in thrombotic thrombocytopenic purpura, with special reference to factor VIII related antigen. ThrombRes. 1985; 38:469-479). Пациенты с рецидивирующей ТТР имеют сверхкрупные мультимеры в плазме. Мультимеры UL-vWF накапливаются с течением времени, так как длительное присутствие ингибитораthrombocytopenic purpura. J Thromb Haemost. 2003; 1:2038-2040; discussion 2040-2035). Предполагается, что присутствие гиперреактивных мультимеров UL-vWF в плазме из-за недостаточности ADAMTS13 может быть ассоциировано с повышенным риском артериального тромбоза, связанного с коронарной болезнью сердца. Так как белки ADAMTS вовлечены в ряд заболеваний и состояний, в данной области существует необходимость способов крупномасштабного получения рекомбинантных белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью, которые подходят для приготовления и введения фармацевтических препаратов. Настоящее изобретение относится к способам, которые удовлетворяют указанные и другие потребности в данной области для получения и очистки белков ADAMTS. Сущность изобретения В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белков дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина (ADAMTS). В некоторых вариантах способы, предлагаемые в изобретении, преимущественно приводят к повышенным уровням экспрессия и к получению белков ADAMTS со значимо повышенными активностями. Такие улучшенные свойства в одном примере могут быть достигнуты благодаря добавлению в культуральную среду, применяемую для экспрессии белков ADAMTS, повышенных уровней различных компонентов, таких как кальций, цинк или никотинамид (витамин В 3). В предпочтительном варианте белком ADAMTS является белок ADAMTS13. В другом аспекте изобретение относится к способам увеличения экспрессии и/или уровней активности белка ADAMTS посредством культивирования рекомбинантных клеток, несущих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS, в не содержащих животных белков и химически определенных средах в условиях периодической культуры, культуры с подпиткой или непрерывной культуры клеток. В некоторых вариантах такие способы включают применение периодического культивирования, культивирования с подпиткой, проточного культивирования или культивирования клеток в хемостате, причем культивирование может быть осуществлено либо в виде суспензии клеток, либо в виде прикрепленных клеток. В предпочтительном варианте белком ADAMTS является белок ADAMTS13. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам уменьшения степени утраты активности во время очистки белка ADAMTS. В некоторых вариантах способы включают добавление в буферы для очистки дополнительных уровней кальция и/или цинка. В конкретном варианте способы относятся к стабилизации активности белка ADAMTS во время стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации,используемых в ходе очистки. В предпочтительном варианте белком ADAMTS является белокADAMTS13. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам получения белка ADAMTS с повышенной активностью для применения при получении фармацевтической композиции. В некоторых вариантах такие способы включают применение не содержащих животных белков и/или химически определенных культуральных сред в условиях, подходящих для повышенной экспрессии белка ADAMTS,обладающего повышенной активностью. В предпочтительном варианте белком ADAMTS является белокADAMTS13. В родственном аспекте настоящее изобретение относится к не содержащим животных белков, не содержащим олигопептидов и химически определенным средам, которые применимы для экспрессии белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью. В предпочтительном варианте белкомADAMTS является белок ADAMTS13. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Объемная FRETS-VWF73-продуктивность рекомбинантного ADAMTS13 человека, экспрессированного в клетках СНО, культивируемых в не содержащей животных белков среде в различных условиях температуры и рН. Результаты различных экспериментов по культивированию клеток показаны в виде (А) изображения в изолиниях и (В) графика поверхности, представляющих нормализованную объемную FRETS-VWF73-продуктивность ADAMTS13 в виде функции температуры и рН культуры. Фиг. 2. Уровни удельной активности (FRETS-VWF73/антиген по данным ELISA) клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный ADAMTS13 человека, культивируемых в не содержащей животных белков среде в различных условиях температуры и рН. Результаты различных экспериментов по культивированию клеток показаны в виде (А) изображения в изолиниях и (В) графика поверхности, представляющих удельную активность в виде функции температуры и рН культуры. Подробное описание изобретенияI. Введение Белки ADAMTS (т.е. ADAMTS-1-ADAMTS-20) представляют собой семейство секретируемых цинковых металлопротеиназ, которые имеют общую модульную организацию доменов (см. обзор Flannery С.R., Front Biosci. 2006 Jan 1; 11:544-69). Все белки ADAMTS имеют общую структуру коровых доменов, состоящих из сигнального пептида, за которым следует продомен, цинкзависимый металлопротеиназный каталитический домен, подобный дезинтегрину домен, повтор тромбоспондина типа I, богатый цистеином домен и спейсерный домен (Apte S.S., J Biol Chem. 2009 Nov 13; 284 (46) :31493-7). Кроме того, все они, кроме ADAMTS-4, содержат по меньшей мере еще один повторяющийся домен тромбоспондина типа I, и многие из белков ADAMTS содержат один или несколько дополнительных вспомогательных доменов. Причем сообщалось, что все белки ADAMTS, по-видимому, содержат по меньшей мере один участок связывания кальция и по меньшей мере один участок связывания цинка, локализованные в каталитическом домене металлопротеиназы (Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4(3), pp 881-888). Сообщалось о биологической роли белков ADAMTS в случае различных заболеваний и состояний,включая антиангиогенез, интерстициальный фиброз почек, ремоделирование кости, фолликулогенез яичников, атеросклероз, развитие мочеполовой системы и рост опухолей/ремоделирование (ADAMTS-1); синдром Элерса-Данлоса типа 7 С и дерматоспараксис крупного рогатого скота (ADAMTS-2); артрит,атеросклероз и тендинопатию (ADAMTS-4); артрит и глиобластому (ADAMTS-5); артрит (ADAMTS-7); антиангиогенез, злокачественное новообразование головного мозга, артрит и атеросклероз (ADAMTS-8); артрит (ADAMTS-9, 12); тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ADAMTS-13); и антитромбоз/инсульт (ADAMTS 18) (обзор см. в публикации Lin and Liu, Open Access Rheumatology Research andReviews 2009:1 121-131). Рекомбинантный ADAMTS13 (A13) ранее экспрессировали в клетках млекопитающих, однако удельная активность широко варьировала в зависимости от условий культивирования. Было обнаружено,что многие коммерчески доступные культуральные среды недостаточны для экспрессии А 13 с высокими удельными активностями, выраженными в виде отношения активности, измеряемой в анализе FRETSVWF73, к содержанию антигена, которое определяют методом ELISA. В одном аспекте способы, предлагаемые в настоящем изобретении, основаны на нескольких полезных данных, которые позволяют осуществлять в культуре клеток экспрессию А 13, обладающего повышенными уровнями общей и удельной активности. Исследования, описанные в настоящей публикации, показывают, что некоторая минимальная концентрация кальция в культуральной среде, приблизительно от 0,5 мМ до приблизительно 1,5 мМ, требуется для экспрессии активного А 13. Кроме того, было обнаружено, что при добавлении в культуральную среду повышенных уровней цинка полученный экспрессированный белок А 13 обладал более высокой общей и удельной активностью. Например, в культурах с добавлением дополнительного количества цинка в концентрации в 2-3 раза выше нормальной концентрации, по сравнению с концентрациями в стандартных химически определенных средах, таких как основанные на DMEM/F12 среды, удельная активность А 13 была значимо повышена. Кроме того, дополнительное увеличение удельной активности А 13 может быть достигнуто за счет увеличения концентрации никотинамида (витамина В 3) приблизительно от 2 мг/л, как в стандартных основанных на DMEM/F12 средах, до приблизительно 7 мг/л. При культивировании рекомбинантных клеток СНО или HEK293 в средах с добавлением дополнительного кальция,цинка и/или никотинамида, могут быть получены удельные активности, составляющие по меньшей мере приблизительно от 500 миллиединиц/мкг, 1000 миллиединиц/мкг до приблизительно 2000 миллиединиц/мкг рекомбинантного А 13 человека в крупномасштабных экспрессирующих культурах. Ранее не сообщалось о таких уровнях удельной активности рекомбинантно полученных белков А 13. Преимущественно такие повышенные уровни активности А 13 были достигнуты в химически определенной среде, не содержащей полученных от животных компонентов, обеспечивающей возможность стабильной и воспроизводимой экспрессии белков ADAMTS в крупном масштабе, подходящем для получения белков для производства фармацевтических препаратов. Кроме того, такие среды не содержат даже рекомбинантных белков, например инсулина, что приводит к получению продуктов, которые можно более безопасно использовать в препаратах для фармацевтического введения. Настоящее изобретение также относится к способам, которые предотвращают потерю активности и удельной активности во время стандартной ультра/диафильтрации и других стадий очистки. Предпочтительно было обнаружено, что при добавлении в буфер, используемый для диафильтрации, дополнительного количества кальция и цинка можно достичь значимого снижения потери активности А 13, измеряемой в анализе FRETS-VWF73. Соответственно, вследствие общей взаимосвязи структуры-функции между представителями семейства ADAMTS секретируемых металлопротеиназ, способы, предлагаемые в настоящем изобретении,обеспечивают экспрессию всех белков ADAMTS в культуре клеток и извлечение из культуральной среды.II. Определения В используемом в настоящем описании смысле термины "витамин В 3", "никотинамид", "ниацинамид", "ниацин" и "никотиновая кислота" могут быть использованы взаимозаменяемо по отношению к любому представителю семейства витаминов В 3. Соответственно, любой представитель данного семейства может быть использован для дополнения среды, применяемой в способах согласно настоящему изобретению. В используемом в настоящем описании смысле "белок ADAMTS" относится к полипептиду дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина типа I из семейства металлопротеиназ. Представители данного семейства включают белки человека ADAMTS1 (NM006988), ADAMTS2NM080722), ADAMTS15 (NM139055), ADAMTS16 (NM139056), ADAMTS17 (NM139057),ADAMTS18 (NM199355; NM139054), ADAMTS19 (NM133638) и ADAMTS20 (NM025003,NM175851). Белки ADAMTS включают как полноразмерные белки, так и частичные полипептиды, которые проявляют, по меньшей мере, частичную биологическую активность, например по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более активности, проявляемой полноразмерным белком, в частности протеазной активности, проявляемой полноразмерным белком. В некоторых случаях белок ADAMTS будет модифицирован посттрансляционно либо in vivo, либо in vitro, например, ферментативными или химическими способами. Понятно, что белки ADAMTS согласно настоящему изобретению включают альтернативно сплайсируемые изоформы, консервативно модифицированные белки, по существу, идентичные белки, гомологи и тому подобное. В контексте настоящего изобретения белок ADAMTS включает любого представителя семействаADAMTS, например млекопитающего, такого как примат, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызун,мышь, крыса, хомячок, песчанка, собака, кошка, и его биологически активные производные. Также включены мутантные белки ADAMTS и варианты белков ADAMTS, обладающие активностью, так же как функциональные фрагменты и слитые белки белков ADAMTS. Кроме того, белки ADAMTS согласно изобретению могут дополнительно содержать метки, которые облегчают очистку, регистрацию или и то и другое. Белки ADAMTS, описанные в настоящей публикации, могут быть дополнительно модифицированы терапевтическим остатком или остатком, подходящим для визуализации in vitro или in vivo. В используемом в настоящем описании смысле термин "белок ADAMTS13" относится к любому белку или полипептиду с активностью ADAMTS13, в частности, способностью расщеплять пептидную связь между остатками Tyr-842 и Met-843 VWF. В иллюстративном варианте белок ADAMTS13 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая в высокой степени сходна с аминокислотной последовательностью NP620594 (ADAMTS13, изоформа 1, препробелок) или аминокислотами 75-1427 NP620594 (ADAMTS13, изоформа 1, зрелый полипептид). В другом варианте белок ADAMTS13 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая в высокой степени сходна с аминокислотной последовательностью NP620596 (ADAMTS13, изоформа 2,препробелок) или аминокислотами 75-1371 NP620594 (ADAMTS13, изоформа 2, зрелый полипептид). В еще одном варианте белки ADAMTS13 включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в высокой степени сходную с аминокислотной последовательностью NP620595(ADAMTS13, изоформа 3, препробелок) или аминокислотами 75-1340 NP620595 (ADAMTS13, изоформа 1, зрелый полипептид). В используемом в настоящем описании смысле белок ADAMTS13 включает природные варианты с расщепляющей vWF активностью и искусственные конструкции с расщепляющейvWF активностью. В используемом в настоящем изобретении смысле ADAMTS13 охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, которые сохраняют некоторую базальную активность. Примеры мутаций ADAMTS13, встречающихся в популяции человека, включают, без ограничения, R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V,R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, Р 618 А, R625H, I673F, R692C, A732V,S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, А 1033 Т, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W,многие из которых, как было обнаружено, ассоциированы с тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТР). Белки ADAMTS13 также включают полипептиды, содержащие посттрансляционные модификации. Например, было показано, что ADAMTS13 модифицирован N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) по остаткам 614, 667 и 1354, и было высказано предположение, что остатки 142, 146, 552, 579, 707,828 и 1235 также могут быть модифицированы таким образом. Протеолитически активный рекомбинантный ADAMTS13 может быть получен при экспрессии в культурах клеток млекопитающих, как описано в публикации Plaimauer с соавторами (2002, Blood. 15; 100(10):3626-32) и в US 2005/0266528, описание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. Способы получения рекомбинантной культуры экспрессирующихADAMTS13 клеток описаны в публикации Plaimauer В., Scheiflinger F. (Semin Hematol. 2004 Jan; 41(1):24-33), содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. В используемом в настоящем описании смысле "одну единицу активности ADAMTS" определяют как количество активности в 1 мл объединенной нормальной плазмы человека, независимо от используемого анализа. Например, когда белком ADAMTS является ADAMTS13, одной единицей FRETSVWF73-активности белка ADAMTS13 является количество активности, необходимой для расщепления такого же количества субстрата FRETS-VWF73 (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Apr; 129(1):93-100),которое расщепляется одним миллилитром объединенной нормальной плазмы человека. В соответствующем случае, активность ADAMTS13 может быть определена в функциональных анализах, таких как функциональные анализы с использованием модифицированных пептидов факторов фон Виллебранда в качестве субстрата для ADAMTS13 (Tripodi et al. J Thromb Haemost. 2008 Sep.; 6(9):1534-41). Предпочти-6 023193 тельный способ определения активности рекомбинантного ADAMTS13 человека описан Gerritsen с соавторами (Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinityof degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thromb Haemost 1999; 82:1386-1389). В одном варианте, чтобы считаться белком ADAMTS13, который определен выше,полипептид или белок должен обладать активностью в расщеплении vWF, составляющей по меньшей мере 1% активности нативного ADAMTS13. В других вариантах белок ADAMTS13 будет обладать активностью, составляющей по меньшей мере 10% активности нативного ADAMTS13. В следующих вариантах белок ADAMTS13 будет обладать активностью, составляющей по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40,50, 60, 70, 80, 90 или 100% активности нативного ADAMTS13. Количество белка ADAMTS13 также может быть определено путем измерения антигена ADAMTS13, например, с использованием способа ELISA, описанного Rieger с соавторами (2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212-20). В используемом в настоящем описании смысле "мкг ADAMTS13" или "мкг антигена ADAMTS13" означает количество ADAMTS13, которое обеспечивает такой же уровень регистрируемого белка в анализе ELISA, как и 1 мл объединенной нормальной плазмы человека. Такое определение основано на опубликованных оценках, свидетельствующих о том, что 1 мг ADAMTS13 присутствует в 1 мл нормальной плазмы человека и, следовательно, является приблизительным измерением. В используемом в настоящем описании смысле термин "биологически активное производное" при использовании в контексте белка ADAMTS также охватывает полипептиды, полученные с использованием методики рекомбинантной ДНК. Такая методика может включать любой способ, известный в данной области для (i) получения рекомбинантной ДНК посредством генетической инженерии, например,благодаря обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК, (ii) введения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки с использованием трансфекции, т.е. посредством электропорации или микроинъекции, (iii) культивирования указанных трансформированных клеток, например, непрерывным или периодическим образом, (iv) экспрессии белка ADAMTS, например, конститутивно или после индукции, и (v) выделения указанного белка ADAMTS, например, из культуральной среды или сбором трансформированных клеток, чтобы (vi) получить, по существу, очищенный рекомбинантный белок ADAMTS, например, с использованием ионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии по размеру, аффинной хроматографии, хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия и тому подобное. Термин "биологически активное производное" также включает химерные молекулы, такие как, например, белок ADAMTS или его функциональный фрагмент, в сочетании со вторым полипептидом, например доменом иммуноглобулина Fc или доменом альбумина, чтобы улучшить биологические/фармацевтические свойства, такие как, например, время полужизни белка ADAMTS в системе кровообращения млекопитающего, в частности человека. В используемом в настоящем описании смысле термин "ультрафильтрация" охватывает множество способов мембранной фильтрации, в которых гидростатическое давление продавливает жидкость, преодолевая сопротивление полупроницаемой мембраны. Суспендированные твердые вещества и растворенные вещества с высокой молекулярной массой задерживаются, тогда как вода и растворенные вещества с низкой молекулярной массой проходят через мембрану. Указанный процесс разделения часто используют для очистки и концентрирования растворов макромолекул (103-106 Да), особенно растворов белков. Имеется несколько мембран для ультрафильтрации в зависимости от размера молекул, которые они задерживают. Ультрафильтрация обычно характеризуется использованием мембран с размером пор от 2 нм до 0,05 мкм и рабочего давления от 1 до 10 бар (0,1-1 МПа), и она особенно применима для отделения коллоидов, подобных белкам, от небольших молекул, подобных сахарам и солям. Напротив, нанофильтрация является другим управляемым давлением способом фильтрации, обычно характеризуемым использованием мембраны с размером пор от 0,5 до 2 нм и рабочего давления от 5 до 40 бар (0,5-4 МПа). Нанофильтрацию часто используют для осуществления разделения сахаров, других органических молекул и поливалентных солей, с одной стороны, и одновалентных солей и воды, с другой. В общем, ультрафильтрацию можно осуществлять в режиме "тупиковой" фильтрации или в режиме тангенциальнопроточной фильтрации (TFF). В используемом в настоящем описании смысле термин "диафильтрация" относится к другому способу мембранной фильтрации, иногда называемому тангенциально-проточной фильтрацией (TFF), где жидкость прокачивают насосом тангенциально по отношению к поверхности мембраны для ультрафильтрации. Обычно жидкость концентрата разбавляют буфером для диафильтрации после пропускания над мембраной и затем возвращают на мембрану непрерывным проточным способом. В общем, диафильтрация может быть осуществлена либо в режиме "тупиковой" фильтрации, либо в режиме тангенциально-проточной фильтрации (TFF). В связи с этим, одну систему можно использовать как для операций ультрафильтрации, так и для операций диафильтрации, например, чтобы сначала сконцентрировать образец с использованием ультрафильтрации, а затем осуществить замену буфера диафильтрацией. В используемом в настоящем описании смысле термин "полиамин" относится к любой группе органических соединений, состоящих из углерода, азота и водорода и содержащих две или больше аминогрупп. Например, термин охватывает молекулы, выбранные из группы, состоящей из кадаверина, путресцина, агматина, орнитина, спермина и спермидина. В некоторых вариантах химически определенной культуральной среды, используемой для экспрессии белка ADAMTS, концентрация полиамина, присутствующего в среде, находится в диапазоне концентраций приблизительно от 0,5 мг/л до приблизительно 30 мг/л, или приблизительно от 0,5 мг/л до приблизительно 20 мг/л, или приблизительно от 0,5 мг/л до приблизительно 10 мг/л, или приблизительно от 1 мг/л до приблизительно 10 мг/л, или приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 10 мг/л, или приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 8 мг/л, или приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 5 мг/л. В одном конкретном варианте полиамином является путресцин в концентрации приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 8 мг/л. В используемом в настоящем описании смысле термин "химически определенная среда" относится к синтетической ростовой среде, в которой идентифицированы все компоненты и известна их концентрация. Химически определенные среды не содержат бактериальных, дрожжевых, животных или растительных экстрактов, хотя они могут содержать или не содержать отдельные полученные из растений или животных компоненты (например, белки, полипептиды и т.д.). Не ограничивающие примеры коммерчески доступных химически определенных сред включают различные среды EX-CELL (SAFCBiosciences, Inc.), различные модифицированные по Дульбекко среды Игла (DME) (Sigma-Aldrich Co;SAFC Biosciences, Inc.), питательную смесь Хама (Sigma-Aldrich Со; SAFC Biosciences, Inc.), и тому подобные. Способы получения химически определенных культуральных сред известны в данной области и описаны, например, в патентах США 6171825 и 6936441, WO 2007/077217 и публикациях заявок на выдачу патентов США 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. В используемом в настоящем описании смысле термин "не содержащая олигопептидов среда" относится к не содержащей белков среде, которая не содержит олигопептидов, таких как, например, олигопептиды, полученные из гидролизата белка. В одном варианте среда не содержит олигопептидов, имеющих двадцать или больше аминокислот. В одном варианте осуществления настоящего изобретения среда не содержит олигопептидов, имеющих пятнадцать или больше аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения среда не содержит олигопептидов, имеющих десять или больше аминокислот. В одном варианте среда не содержит олигопептидов, имеющих семь или больше аминокислот. В другом варианте среда не содержит олигопептидов, имеющих пять или больше аминокислот. В еще одном варианте среда не содержит олигопептидов, имеющих три или больше аминокислот. Согласно следующему варианту осуществления настоящего изобретения среда не содержит олигопептидов, имеющих две или больше аминокислот. Способы получения не содержащей олигопептидов культуральной среды известны в данной области, например описаны в патентах США 6171825 и 6936441, в WO 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. В используемом в настоящем описании смысле термин "бессывороточная культуральная среда" относится к культуральной среде, в которую не добавлена сыворотка животных. Хотя зачастую бессывороточные среды представляют собой химически определенные среды, в бессывороточные среды могут быть добавлены отдельные животные или растительные белки или фракции белков. Способы получения бессывороточной культуральной среды известны в данной области, например, описаны в патентах США 6171825 и 6936441, в WO 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. В используемом в настоящем описании смысле термин "культуральная среда, не содержащая животных белков" относится к культуральной среде, которая не дополнена сывороткой, белком или фракцией белка животных. Хотя зачастую культуральные среды, не содержащие животных белков, представляют собой химически определенные среды, культуральные среды, не содержащие животных белков,могут содержать растительные или дрожжевые гидролизаты. Способы получения культуральной среды,не содержащей животных белков, известны в данной области, например, описаны в патентах США 6171825 и 6936441, WO 2007/077217 и публикациях заявок на выдачу патентов США 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей."Экспрессирующий вектор" представляет собой конструкцию нуклеиновой кислоты, созданную рекомбинантно или синтетически, содержащую ряд специальных элементов нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают возможность транскрипции конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Экспрессирующий вектор может быть частью плазмиды, вируса или фрагмента нуклеиновой кислоты. Обычно экспрессирующий вектор содержит нуклеиновую кислоту, которую необходимо транскрибировать, функционально связанную с промотором. Термин "гетерологичный" при использовании в отношении частей нуклеиновой кислоты указывает,что нуклеиновая кислота содержит две или больше подпоследовательностей, которые не встречаются в такой же взаимосвязи друг с другом в природе. Например, нуклеиновую кислоту обычно получают путем рекомбинации, и она имеет две или больше последовательностей из неродственных генов, скомбинированных для того, чтобы получить новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промо-8 023193 тор из одного источника и кодирующую область из другого источника. Подобным образом, термин "гетерологичный белок" указывает, что белок содержит две или больше подпоследовательности, которые не встречаются в такой же взаимосвязи друг с другом в природе (например, слитый белок)."Промотор" определяют как ряд регуляторных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые управляют транскрипцией нуклеиновой кислоты. В используемом в настоящем описании смысле промотор содержит необходимые последовательности нуклеиновой кислоты вблизи стартового сайта транскрипции, например, как в случае промотора для полимеразы II, элемент ТАТА. Промотор также необязательно включает дистальные энхансерный или репрессорный элементы, которые могут быть расположены на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. "Конститутивным" промотором является промотор, который активен в большинстве условий окружающей среды и условий развития. "Индуцируемым" промотором является промотор, который активен при регуляции условиями окружающей среды и регуляции в ходе развития. Термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между последовательностью регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты(такой как промотор или ряд сайтов связывания факторов транскрипции) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, причем последовательность регуляции экспрессии управляет транскрипцией нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности. В используемом в настоящем описании смысле термин "приблизительно" означает приблизительный диапазон плюс или минус 10% от указанного значения. Например, выражение "приблизительно 20%" охватывает диапазон 18-22%.III. Экспрессия белков ADAMTS В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина (ADAMTS), обладающего высокой удельной активностью. В одном варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS, в культуральной среде, дополненной по меньшей мере одним компонентом,выбранным из кальция, цинка и никотинамида (витамина В 3). В конкретном варианте белок ADAMTS экспрессируется в среде с добавлением по меньшей мере двух компонентов, выбранных из кальция, цинка и никотинамида (витамина В 3). В еще одном варианте культуральную среду дополняют кальцием,цинком и никотинамидом (витамином В 3). В некоторых вариантах культуральная среда, применяемая для экспрессии белка ADAMTS, может включать не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В одном аспекте предлагаются способы получения белка ADAMTS. В одном варианте способы включают стадии культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белокADAMTS, в культуральной среде, дополненной по меньшей мере одним компонентом из цинка, кальция и никотинамида; извлечения фракции супернатанта из культуры; осуществления стадии центрифугирования или фильтрации, чтобы удалить любые остаточные клетки; осуществления стадии ультрафильтрации, чтобы сконцентрировать белок ADAMTS; и осуществления стадии диафильтрации с использованием буфера, содержащего, по меньшей мере, кальций или цинк. В некоторых вариантах концентрация кальция может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,3, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 5 или более 5 мМ кальция. В других вариантах концентрация цинка может составлять по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 или более 10 мкМ цинка. В некоторых вариантах собранный материал, бесклеточный супернатант или буфер для диафильтрации содержит комбинацию кальция и цинка в указанных выше концентрациях. В некоторых вариантах предел отсечения мембран для ультрафильтрации и/или диафильтрации может составлять, например, приблизительно 150 или 125, или 100, или 75, или 50, или 30,или 10, или менее 10 кД. В некоторых вариантах белком ADAMTS является ADAMTS13 или его биологически активное производное. В конкретном варианте белком ADAMTS13 является белок ADAMTS13 человека или его биологически активное производное. В некоторых вариантах культуральной средой,применяемой в способе, может быть не содержащая животных белков, не содержащая олигопептидов или химически определенная среда. В одном варианте способ дополнительно включает стадию очистки, выбранную из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии по размеру, аффинной хроматографии и хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия. В еще одном варианте добавка цинка может быть осуществлена путем добавления препарата белка или полипептида, содержащего цинк. Например, обычные препараты инсулина содержат цинк в таких концентрациях, что добавление в среду приблизительно от 1 мг/л до приблизительно 10 мг/л инсулина также может приводить к добавлению приблизительно от 0,03 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ цинка,как рассчитано на основе подробной монографии для новолина N InnoLet SubQ, рекомбинантного инсулина человека, которую можно найти на сервере Medscape. Соответственно, в одном варианте культуральная среда, применяемая для экспрессии белка ADAMTS, может быть дополнена содержащим цинк препаратом инсулина. Базовая среда, которую дополняют цинком, кальцием и/или никотинамидом (витамином В 3), как описано в настоящей публикации, выбранная для культивирования линии клеток хозяев, не является решающей для настоящего изобретения и может быть любой средой или сочетанием сред, известных в данной области, которые подходят для культивирования клеток млекопитающих. Такие среды, как модифицированная по Дульбекко среда Игла, среда Хама F-12, минимальная необходимая среда Игла и среда RPMI-1640 и тому подобное, являются коммерчески доступными. Добавление факторов роста, таких как рекомбинантный инсулин, является необязательным. В одном варианте базовая среда, применяемая для культивирования клетки, экспрессирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS13), может содержать смесь одной или нескольких коммерчески доступных химически определенных сред, например, модифицированной по Дульбекко среды Игла(DMEM) и среды Хама F-12, которая дополнена одним или несколькими другими компонентами, отличными от цинка, кальция и никотинамида (витамина В 3). Не ограничивающие примеры компонентов, которые можно использовать для дополнения коммерчески доступной среды, включают незаменимые аминокислоты (например, глутамин), неионогенные поверхностно-активные вещества (например, синпероник), первичные амины (например, этаноламин), полиамины (например, путресцин), следовые количества металлов (например, железа) и буферные средства (например, бикарбонат натрия). В конкретном варианте средой является среда BCS, которая представлена в табл. 1. В другом конкретном варианте среда представляет собой среду BACD, например среду BACD-A13. Таблица 1. Состав среды для культивирования клеток BCS Исторически, клетки животных культивировали в средах, содержащих сыворотку животных. Однако такие среды не полностью определены и несут риск инфекции. Поэтому специалисты в данной области разработали "не содержащие белков" среды, которые либо совсем не содержат никаких белков, либо не содержат, по меньшей мере, какого-либо белка, который не получен рекомбинантно. Сывороточный альбумин человека обычно используют в качестве добавки в бессывороточную культуру для получения рекомбинантных белков. Предпочтительные среды включают среды, описанные в патентах США 6171825 и 6936441, в WO 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США 2008/0009040 и 2007/0212770. Необязательно, неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как полипропиленгликоль(например, плюроник F-61, плюроник F-68, плюроник F-71, плюроник F-108 или синпероник),может быть добавлено в среду в качестве противопенного средства. Такое средство обычно применяют для защиты клеток от негативного действия аэрации ("барботирования"). Количество неионогенного поверхностно-активного вещества может быть в диапазоне от 0,05 до 10 г/л, предпочтительно от 0,1 до 5 г/л. Среда, описанная в US 6936441, особенно хорошо подходит для культивирования клеток СНО, но также может быть использована для других клеток. Другой подходящей средой является не содержащая олигопептидов среда, описанная в заявке на выдачу патента США 2007/0212770 (Baxter International Таблица 2. Примеры концентраций цинка, кальция и никотинамида (витамина В 3), которые могут быть использованы для добавок в культуральные среды, применимые для экспрессии белка ADAMTS В одном варианте настоящее изобретение относится к способу экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина (ADAMTS), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS, в культуральной среде, содержащей по меньшей мере один из компонентов: цинк в концентрации по меньшей мере приблизительно 2 мкМ или кальций в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 мМ. В одном варианте белкомADAMTS является ADAMTS1. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS2. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS3. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS4. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS5. В другом варианте белком ADAMTS являетсяADAMTS6. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS7. В другом варианте белкомADAMTS является ADAMTS8. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS9. в другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS10. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS11. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS12. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS13. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS14. В другом варианте белкомADAMTS является ADAMTS15. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS16. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS17. В другом варианте белком ADAMTS являетсяADAMTS18. В другом варианте белком ADAMTS является ADAMTS19. В другом варианте белкомADAMTS является ADAMTS20. В предпочтительном варианте белком ADAMTS является ADAMTS13. В одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит приблизительно от 2 мкМ до приблизительно 12 мкМ цинка. В еще одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 5 мкМ до приблизительно 12 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 0,5 мМ кальция. В еще одном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 0,5 мМ до приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 2 мкМ цинка и по меньшей мере приблизительно 0,5 мМ кальция. В следующих вариантах было обнаружено, что добавление никотинамида (витамина В 3) дополнительно усиливает экспрессию и повышает удельную активность белков ADAMTS в культуре клеток. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3). В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3). В еще одном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 10 мг/л никотинамида (витамина В 3). В некоторых вариантах культуральная среда представляет собой не содержащую животных белков культуральную среду. В другом варианте культуральная среда представляет собой химически определенную среду. В некоторых вариантах культуральная среда может содержать один или несколько поли- 11023193 аминов. В конкретном варианте полиамином является путресцин, например, в концентрации по меньшей мере 0,5 мг/л. В конкретном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 8 мг/л путресцина. В некоторых вариантах клетка или линия клеток, используемых в культуре, представляет собой бактериальную клетку, дрожжевую клетку, клетку насекомого, клетку птицы или клетку млекопитающего. В конкретном варианте линия клеток представляет собой линию клеток человека, линию клеток хомячка или линию клеток мыши. В более конкретном варианте линией клеток является линия клеток СНО, BHK или HEK. В предпочтительном варианте линией клеток является линия клеток CHO. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота, кодирующая белок ADAMTS, содержит регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок ADAMTS. В одном варианте регуляторной последовательностью является промотор. В некоторых вариантах промотор является конститутивным промотором. В других вариантах промотор является индуцируемым промотором. В некоторых вариантах способы, предлагаемые в настоящем описании, включают применение системы непрерывной культуры клеток (т.е. непрерывное культивирование клеток). В одном варианте система непрерывной культуры представляет собой систему хемостатной культуры (т.е. культивирование клеток в хемостате). В другом варианте система непрерывной культуры представляет собой систему турбидостатной культуры (т.е. культивирование клеток в турбидостате). В еще одном варианте система непрерывной культуры представляет собой систему перфузируемой культуры (т.е. культивирование клеток с перфузией). В некоторых вариантах система непрерывной культуры может функционировать в режиме суспензии. В других вариантах система непрерывной культуры может функционировать в режиме прикрепления клеток. В некоторых вариантах режим прикрепления включает использование микроносителя,например, пористого микроносителя. В некоторых вариантах способы, предлагаемые в изобретении, включают применение системы периодической культуры клеток (т.е. периодическое культивирование клеток). В одном варианте система периодической культуры представляет собой систему культуры в виде отдельных партий (т.е. культивирование по одной партии культуры). В другом варианте система периодической культуры представляет собой систему культуры с подпиткой (т.е. культивирование клеток с подпиткой). В еще одном варианте система периодической культуры представляет собой систему культуры с выходом множества партий(т.е. культивирование с многократным получением партий). В некоторых вариантах система периодической культуры может функционировать в режиме суспензии. В других вариантах система периодической культуры может функционировать в режиме прикрепления. В некоторых вариантах режим прикрепления включает использованием микроносителя, например, пористого микроносителя. В некоторых вариантах культуру можно поддерживать при температуре приблизительно от 35 С до приблизительно 37 С. В других вариантах культуру можно поддерживать при рН приблизительно от 6,9 до приблизительно 7,3. В конкретном варианте культуру можно поддерживать при рН приблизительно от 7,05 до приблизительно 7,15. В некоторых вариантах способы, предлагаемые в настоящем изобретении, будут давать белкиADAMTS13 в культуральной среде (т.е. экспрессируемые ADAMTS13) с удельными активностями, составляющими по меньшей мере 600 единиц на миллиграмм белка ADAMTS13. В других вариантах удельная активность может составлять по меньшей мере 800 единиц на миллиграмм белка ADAMTS13. В других вариантах удельная активность может составлять по меньшей мере 1000 единиц на миллиграмм белка ADAMTS13. В других вариантах удельная активность может составлять по меньшей мере 1500 единиц на миллиграмм белка ADAMTS13. В других вариантах удельная активность может составлять по меньшей мере 2000 единиц на миллиграмм белка ADAMTS13. В других вариантах способы обеспечивают получение культур, которые дают по меньшей мере 400 единиц активности ADAMTS13 на литр культуры в сутки (единиц/л/сутки). В одном варианте способы обеспечивают получение культур, которые дают по меньшей мере 800 единиц активности ADAMTS13 на литр культуры в сутки (единиц/л/сутки).A. ADAMTS13 В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка ADAMTS13, обладающего повышенной общей и/или удельной активностью. Было обнаружено, что предпочтительно путем дополнения ростовой среды кальцием, цинком и/или никотинамидом (витамином В 3) полипептидыADAMTS13, обладающие высокой удельной активностью, могут быть рекомбинантно экспрессированы и извлечены из культуры клеток. Способы экспрессии ADAMTS13 предложены в публикации WO 2009/086309, содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. В указанной публикации описаны подходящие способы и условия культивирования, которые можно поддерживать на протяжении культивирования. Как описано в настоящей публикации, культуры клеток, используемые для экспрессии белков ADAMTS13, обычно можно поддерживать при температуре приблизительно от 34 до 37 С и рН приблизительно от 6,8 до 7,3. Способы контролирования температуры и рН при культивировании хорошо известны в данной об- 12023193 ласти и, как правило, основаны на использовании датчиков, которых помещают в биореактор или помещают в петли, по которым циркулирует культуральная среда, или помещают в отбираемые образцы культуральной среды. Подходящие встроенные в систему рН-сенсоры включают сенсор Mettler ToledoInPro 3100/125/Pt100 (Mettler-Toledo Ingold, Inc., Bedford, MA). Способы изменения конкретного параметра для того, чтобы поддерживать его на предварительно определяемом уровне, также хорошо известны. Например, поддержание постоянной температуры обычно заключается в нагревании или охлаждении биореактора или подаваемой среды (если осуществляют процесс с подпиткой или непрерывный процесс); поддержание постоянного рН обычно заключается в подборе и введении достаточного количества подходящего буфера (обычно бикарбоната) и добавление при необходимости кислоты, такой как хлористо-водородная кислота, или щелочи, такой как гидроксид натрия, бикарбонат натрия или их смесь, в подаваемую среду для подпитки. Возможно калибровка встроенного в систему датчика рН может отклоняться с течением времени, например, в течение периодов времени, составляющих дни или недели, в течение которых культивируют клетки. В таком случае может быть полезным повторная установка встроенного в систему датчика с использованием измерений, полученных от недавно откалиброванного дополнительного, не входящего в систему датчика. В одном варианте способы включают культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, дополненной по меньшей мере одним компонентом, выбранным из кальция, цинка и никотинамида (витамина В 3). В конкретном варианте белокADAMTS экспрессируется в среде, дополненной по меньшей мере двумя компонентами, выбранными из кальция, цинка и никотинамида (витамина В 3). В еще одном варианте культуральная среда дополнена кальцием, цинком и никотинамидом (витамином В 3). В некоторых вариантах культуральная среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную культуральную среду. 1. Добавка цинка Преимущественно было обнаружено, что повышенная ферментативная активность и удельная активность ADAMTS13 может быть извлечена из культуры клеток, выращенной в среде, дополненной цинком. Например, в примере 1 показано, что белок ADAMTS13, экспрессированный в культуральной среде, содержащей 1,432 мг/л ZnSO47H2O (5 мкМ цинка), имеет на 40-100% более высокую удельную активность, чем белок ADAMTS13, экспрессированный в культуральной среде, содержащей только 0,432 мг/л ZnSO47H2O (1,5 мкМ цинка) (сравн. табл. 10 и 11). Кроме того, такой эффект воспроизводим, как показано в примере 2 (сравн. таблицу 13 и 14); примере 4 (табл. 16 и 19); и примере 5 (табл. 20 и 21). Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белкаADAMTS (например, ADAMTS13), обладающего повышенной удельной активностью, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS (например,ADAMTS13), в культуральной среде, дополненной цинком, например, содержащей по меньшей мере 2 мкМ цинка. Подобным образом, настоящее изобретение также относится к способам получения композиции белка ADAMTS (например, композиции ADAMTS13), имеющей повышенную общую активность или удельную активность, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS (например, ADAMTS13), в культуральной среде, дополненной цинком, например, содержащей по меньшей мере 2 мкМ цинка. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде,содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. Подходящие диапазоны концентрации цинка обычно определяют по токсичности для культуры клеток, которая может возникать в присутствии высоких концентраций цинка, например, при концентрациях выше 20,25, 30, 40 мкМ и тому подобное. Как будет понятно специалисту в данной области, степень, в которой концентрации цинка являются ингибирующими для конкретной системы культивирования, будет в высокой степени зависеть, наряду с другими факторами, от типа клетки, используемой для экспрессии белка ADAMTS, компонентов используемой культуральной среды и рабочего режима, используемого для культивирования (например, периодический по сравнению с непрерывным; суспензия по сравнению с прикрепленными клетками; хемостат по сравнению с перфузией; и т.д.). В некоторых случаях могут потребоваться более высокие концентрации цинка, когда компоненты культуральной среды могут связывать цинк из раствора, например, в случаях, когда культуральная среда содержит альбумин. Соответственно, подходящие диапазоны концентрации цинка обычно определяют в соответствии с типом культи- 13023193 вируемых клеток, используемой средой и рабочим режимом. Специалист легко сможет определить подходящие верхние пределы использования добавки цинка на основании используемой индивидуальной системы культивирования. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белокADAMTS13, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей,по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в химически определенной культуральной среде, содержащей,по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в химически определенной культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте химически определенная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте химически определенная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В некоторых вариантах химически определенная среда не будет содержать полученных от животных белков и/или полипептидов. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (AQAMTS13), причем способ включает культивирование клетки млекопитающего,несущего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей,по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту,кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK 293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, в условиях непрерывного культивирования или куль- 14023193 тивирования с подпиткой. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условиями непрерывного культивирования являются условия культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условия непрерывного культивирования представляют собой условия культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белокADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО,линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации,равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, при этом культуру поддерживают при температуре,равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белокADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей 36 С. В одном варианте температуру культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации,равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белокADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте культуральная среда, применяемая для экспрессии белка ADAMTS, может быть дополнена цинком в конечной концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно от 2 мкМ до по меньшей мере приблизительно 12 мкМ. В некоторых вариантах культуральная среда может быть дополнена цинком в конечной концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 2 мкМ или по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или более высокие уровни цинка. Как правило, можно использовать любую соль цинка для дополнения среды согласно изобретению, не ограничивающие примеры приемлемых солей включают ZnSO47H2O,ZnSO32H2O, (C6H5O7)2Zn32H2O, ZnBr2, ZnBr22H2O, ZnCl2, Zn(NO3)26H2O, Zn(H2PO4)2H2O,(С 2 Н 3 О 2)2Zn2 Н 2 О и тому подобное. В некоторых вариантах фармацевтически приемлемую соль цинка используют для дополнения культуральных сред согласно изобретению. 2. Добавка кальция Было успешно обнаружено, что повышенная ферментативная активность и удельная активностьADAMTS13 может быть извлечена из культуры клеток, выращенной в среде, дополненной кальцием. Традиционные среды для культивирования клеток, например DMEM/F12, обычно содержали приблизительно 1 мМ кальция. Исторически такие высокие уровни кальция вводили в среду, способствующую росту культур прикрепленных клеток. Однако в настоящее время коммерчески доступные среды, предназначенные для суспензионных культур, содержат значительно более низкие уровни кальция, например приблизительно 0,1 мМ кальция. Такие более низкие уровни кальция используют исходя из того, что необходимо предотвратить агрегацию клеток, культивируемых способами на основе выращивания в суспензии. Известно, что более низкие уровни кальция достаточны для размножения клеток в суспензии и экспрессии рекомбинантных белков, однако авторы изобретения обнаружили, что такие низкие уровни кальция недостаточны для экспрессии белков ADAMTS (например, ADAMTS13). Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белкаADAMTS (например, ADAMTS13), обладающего повышенной удельной активностью, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS (например,ADAMTS13), в культуральной среде, дополненной кальцием, например, содержащей по меньшей мере 0,5 мМ кальция. Подобным образом, настоящее изобретение также относится к способам получения композиции белка ADAMTS (например, композиции ADAMTS13), обладающего повышенной общей активностью или удельной активностью, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS (например, ADAMTS13), в культуральной среде, дополненной кальцием, например, содержащей по меньшей мере 0,5 мМ кальция. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде,содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В других вариантах культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5,2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белокADAMTS13, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей,по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В других вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0,3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в химически определенной культуральной среде, содержащей,по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в химически определенной культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте химически определенная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В других вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0,2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах химически определенная среда не будет содержать полученных от животного белков и/или полипептидов. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белокADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 или,по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9,2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5,2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13,в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В других вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде,содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5,5,0 мМ или больше кальция, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре,равной или приблизительно составляющей 36 С. В одном варианте температуру культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клетокBHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концен- 18023193 трации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно на уровне от 6,9 до 7,3. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно на уровне от 6,9 до 7,3. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белокADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция,при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно на уровне от 6,9 до 7,3. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту,кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3,1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция, при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно на уровне от 6,9 до 7,3. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту,кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 3 0 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации,составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации,составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополни- 20023193 тельно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7,0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5,2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5,1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. Как правило, можно использовать любую соль кальция для дополнения среды согласно изобретению. Не ограничивающие примеры приемлемых солей включают CaCl2, CaFPO32H2O, CaI2, CaBr2,(С 2 Н 3 О 2)2 Са, (СНО 2)2 Са, (С 6 Н 7 О 6)2 Са, (С 6 Н 5 О 7)2 Са 32 Н 2 О и тому подобное. В некоторых вариантах используют фармацевтически приемлемую соль кальция для дополнения культуральных сред согласно изобретению. 3. Добавка никотинамида (витамина В 3) Было успешно обнаружено, что повышенная ферментативная активность и удельная активностьADAMTS13 может быть извлечена из культуры клеток, выращенной в среде, дополненной никотинамидом (витамином В 3). Например, пример 2 показывает, что белок ADAMTS13, экспрессированный в культуральной среде, содержащей 7 мг/л никотинамида (витамина В 3), обладает на 60% более высокой удельной активностью, чем белок ADAMTS13, экспрессированный в культуральной среде, содержащей только 2 мг/л никотинамида (табл. 13; сравн. дни 4 и 7 с 11 днем). Удивительно, что такое действие является синергетическим с действием добавки цинка, так как экспрессия ADAMTS13 в среде, содержащей 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и 5 мкМ цинка, приводит к увеличению удельной активности белкаADAMTS13 на 200-300% (сравн. табл. 14 (11 день) с табл. 13 (4 и 7 дни. Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белкаADAMTS (например, ADAMTS13), обладающего повышенной удельной активностью, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS (например,ADAMTS13), в культуральной среде, дополненной никотинамидом (витамином В 3), например, содержащей по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В 3). Подобным образом, настоящее изобретение также относится к способам получения композиции белка ADAMTS (например, композицииADAMTS13), обладающего повышенной общей активностью или удельной активностью, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS (например,ADAMTS13), в культуральной среде, дополненной никотинамидом (витамином В 3), например, содержащей по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В 3). В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3). В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида(витамина В 3). В одном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3). В других вариантах культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3). Подходящие диапазоны концентраций никотинамида (витамина В 3) обычно определяют на основании токсичности для культуры клеток, которая может возникать в присутствии высоких концентраций никотинамида (витамина В 3), например, при концентрациях выше чем 15, 20, 30,40 мг/л и тому подобное. Как будет понятно специалисту в данной области, степень, в которой концентрации никотинамида (витамина В 3) ингибируют конкретную систему культивирования, будет в значительной мере зависеть, наряду с другими факторами, от типа клетки, используемой для экспрессии белкаADAMTS, компонентов используемой культуральной среды и рабочего режима, используемого для культивирования (например, периодический по сравнению с непрерывным; суспензия по сравнению с прикрепленными клетками; хемостат по сравнению с перфузией; и т.д.). В некоторых случаях могут требоваться более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3), когда компоненты культуральной среды могут связывать никотинамид (витамин В 3) из раствора. Соответственно, подходящие диапазоны концентраций никотинамида (витамина В 3) обычно определяют в соответствии с типом культивируемых клеток, используемой средой и рабочим режимом. Специалист легко сможет определить подходящие верхние пределы использования добавки никотинамида (витамина В 3) на основании используемой индивидуальной системы культивирования. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3). В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту,кодирующую белок ADAMTS13, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3). В одном варианте не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3). В других вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере,точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3). В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в химически определенной культуральной среде, содержащей,по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3). В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белокADAMTS13, в химически определенной культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3). В одном варианте химически определенная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3). В других вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3). В некоторых вариантах химически определенная среда не будет содержать полученных от животного белков и/или полипептидов. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3). В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую ки- 22023193 слоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3). В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3). В других вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере,точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3). В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3), в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3), в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3), в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3), в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3), при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3), при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В других вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3),при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей 36 С. В одном варианте температуру культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3), при этом рН культуры поддерживают на уровне точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13,в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида(витамина В 3), при этом рН культуры поддерживают на уровне точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3), при этом рН культуры поддерживают на уровне точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В других вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде,содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3), при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка,человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере,точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере,точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре,составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клетокHEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере,точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере,точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре,составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клетокHEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере,точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирова- 25023193 ния или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды, В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 2 0 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту,кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1,1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1,1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере,точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3) и,по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0,4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, явля- 27023193 ется клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клетокHEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В некоторых вариантах культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В 3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7,1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту,кодирующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ADAMTS13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ADAMTS13, в культуральной среде, содержащей цинк, кальций и никотинамид (витамин В 3). В некоторых вариантах цинк присутствует в культуральной среде в концентрации, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 5, от 2 до 12 мкМ, от 5 до 12 мкМ или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше. В некоторых вариантах кальций присутствует в культуральной среде в концентрации, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5, 1,5, от 0,5 до 1,5 или по меньшей мере 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2,1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше. В некоторых вариантах никотинамид (витамин В 3) присутствует в культуральной среде в концентрации, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 7, от 2 до 7 мг/л или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или больше. Как специально описано в настоящей публикации и указано в виде вариантов 14-93 (табл. 3-6),предполагается любое сочетание концентраций трех компонентов (т.е. цинка, кальция и никотинамида(витамина В 3 для применения в способах согласно изобретению. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37 С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36 С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, коди- 28023193 рующую белок ADAMTS13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток HEK293 или линия клеток BHK. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. Таблица 3. Примеры вариантов культуральных сред, содержащих по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В 3), которые применимы для экспрессии белка ADAMTS13 Таблица 4. Примеры вариантов культуральных сред, содержащих по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина В 3), которые применимы для экспрессии белка ADAMTS13
МПК / Метки
Метки: среда, клеток, культивирования, adamts, экспрессии, белков
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-23193-sreda-dlya-kultivirovaniya-kletok-dlya-ekspressii-belkov-adamts.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Среда для культивирования клеток для экспрессии белков adamts</a>
Система для культивирования клеток
Номер патента: 9722
Опубликовано: 28.02.2008
Авторы: Кувье Арно Робер Жилль, Куртуа Дидье, Эно Николя
МПК: C12M 1/00
Метки: клеток, культивирования, система
Формула / Реферат:
1. Устройство для культивирования клеток, содержащее гибкую культуральную камеру и механизм, обеспечивающий возможность периодического подъема части культуральной камеры с образованием волн в культуральной среде, причем указанный механизм образования волн поднимает от 5 до 50% длины культуральной камеры, при сохранении остальными частями камеры исходного положения. 2. Устройство по п.1, в котором механизм волнообразования поднимает от 8 до 20%...
Способ суспензионного культивирования клеток
Номер патента: 16451
Опубликовано: 30.05.2012
Авторы: Схилдер Якоб, Хоф Роберт Патрик, Зейлстра Гербен Мейле
Метки: клеток, способ, суспензионного, культивирования
Формула / Реферат:
1. Способ суспензионного культивирования эукариотических клеток в реакторе в культуральной среде, где клетки способны продуцировать желаемое биологическое вещество, кодируемое по меньшей мере одним геном, трансфицированным в клетки, где по меньшей мере один компонент культуральной среды для клеток добавляют в культуру клеток с тем, чтобы восполнить один или более компонентов, истощаемых в процессе культивирования; и где культура клеток,...
Система культивирования клеток
Номер патента: 8157
Опубликовано: 27.04.2007
Авторы: Эно Николя, Куртуа Дидье, Кувье Арно Робер Жилль
МПК: B01F 13/02, C12M 1/06, C12M 1/04...
Метки: система, культивирования, клеток
Формула / Реферат:
1. Биореактор для культивирования живых клеток в жидкой культуральной среде, содержащий по меньшей мере один неподвижный резервуар, содержащий клетки и жидкую культуральную среду, и по меньшей мере одно средство введения единственного большого газового пузыря в основание емкости, причем ширина единственного большого пузыря составляет 50-99% ширины резервуара, предпочтительно 60-99%, более предпочтительно 98,5%. 2. Биореактор по п.1, в котором...
Способ культивирования клеток
Номер патента: 9716
Опубликовано: 28.02.2008
Авторы: Ратенов Йорг, Асгари Соэйл, Кунстманн Йюрген, Бэн Андреас
МПК: C12N 5/00
Метки: клеток, способ, культивирования
Формула / Реферат:
1. Способ культивирования клеток, включающий следующие стадии: а) получение носителя на основе углерода из материала, выбранного из активированного углерода, спечённого активированного углерода, аморфного, кристаллического или частично кристаллического углерода, графита, пиролитического углеродистого материала, углеродных волокон или карбидов, карбонитридов, оксикарбидов и/или оксикарбонитридов металлов или неметаллов, а также их смесей, и...
Культуры e1-иммортализованных клеток и способы их культивирования с целью повышения выхода их продукции
Номер патента: 8670
Опубликовано: 29.06.2007
Автор: Яллоп Кристофер Адам
МПК: C12N 5/10
Метки: e1-иммортализованных, культивирования, выхода, целью, способы, клеток, культуры, продукции, повышения
Формула / Реферат:
1. Способ культивирования клеток, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, причем указанные клетки способны к росту в суспензии, включающий в себя следующие стадии: а) определение по меньшей мере один раз в ходе культивирования клеток концентрации по меньшей мере одного из компонентов среды, выбранного из группы, состоящей из глюкозы, глутамина, фосфата, лейцина, серина, изолейцина, аргинина, метионина, цистина, валина, лизина,...
Предыдущий патент: Автоматизированный термостабилизированный контейнер (варианты)
Следующий патент: Варианты глюкоамилазы
Случайный патент: Инерционный вибрационный преобразователь