Система для культивирования клеток

009722 Настоящее изобретение относится к области культивирования клеток. Оно касается жидкой культуральной системы для выращивания клеток вообще и, в частности, растительных клеток. Эта культуральная система основана на принципе создания волн, обеспечивающих удобное перемешивание и снабжение кислородом клеток в культуральной среде, содержащейся в одноразовом пластиковом мешке. Такая практичная и доступная система для культивирования в производственном масштабе может значительно снизить стоимость производства. Традиционные системы культивирования обычно состоят из жесткого резервуара из стекла или нержавеющей стали, имеющего средства аэрации и перемешивания содержимого культуры (воздушный барботер, лопастная мешалка). Эти системы являются сложными, и обычно оборудование и средства,обеспечивающие асептический биопроцесс, являются очень дорогими, поскольку крупномасштабное производство основано на емкостях из нержавеющей стали, стерилизуемых на месте. Более 60% издержек производства обусловлено фиксированными расходами: высокими капитальными затратами на оборудование для ферментации, амортизацией, долевыми и капитальными расходами. Текущие расходы также являются высокими вследствие низкого выхода и необходимости очищать и стерилизовать биореактор после каждого цикла культивирования. Для промышленных применений, конкретно - для выращивания растительных клеточных культур использовали различные, хорошо известные системы культивирования, такие как резервуар с мешалкой или эрлифтные реакторы. Несмотря на многочисленные попытки коммерциализации растительных метаболитов, немногие получили коммерческий успех. Одной из причин этого является низкая производительность, несмотря на возможность получения более высокого содержания желательного соединения,чем в целом растении (розмариновая кислота, шиконин и т.п.), до 20% по сухому веществу. Главным ограничивающим условием, ведущим к низкой производительности, остается низкая скорость роста (ниже 0,7 д-1, минимум 20 ч на удвоение) по сравнению с бактериями. Использование периодического выращивания культур в промышленных ферментерах означает проведение не более 10-20 циклов в год с растительными клеточными культурами при очень высокой стоимости оборудования. Это означает, что затруднения в отношении промышленного производства являются скорее экономическими, чем биологическими. Для преодоления этих проблем и снижения производственных расходов недавно появившиеся новые технологии основаны на применении различных одноразовых пластиковых мешков вместо ферментера из нержавеющей стали. В этих новых системах применение предварительно стерилизованных одноразовых пластиковых мешков является многообещающим, так как оно снижает капитальные вложения,так как пластик является недорогим материалом и, кроме того, исключает чистку, стерилизацию, проверку и обслуживание оборудования, что требует времени и расходов. Они также допускают большую гибкость процесса, который может управляться людьми, не являющимися специалистами в данной области,так как мешки являются предварительно стерилизованными. Кроме того, использование средств бесконтактного перемешивания позволяет минимизировать технологическую сложность и возможность заражения. Аэрация в данной системе осуществляется обычным впускным средством для воздуха и барботированием, осуществляющим аэрацию и перемешивание. Ферментер может также включать наполненный воздухом пластиковый мешок-вкладку в ферментер, содержащий верхнюю часть для введения культуры и отбора образцов культуральной среды. Одноразовые конические пластиковые мешки фирмы Osmotec пригодны для небольших объемов (несколько литров), использующих воздушные пузырьки для аэрации,которые поступают через входное отверстие. В патенте США 6432698 также описан одноразовый биореактор для культивирования микроорганизмов или клеток, в состав которого входит воздушный клапан, генерирующий пузырьки воздуха для перемешивания и аэрации, подобно эрлифтным биореакторам, за исключением того, что в данном случае он выполнен из пластика. В этих изобретениях маленькие пузырьки воздуха могут повреждать чувствительные клетки, способствовать образованию пены, повышать адгезию клеток к стенкам и/или удалять некоторые полезные газы из культуральной среды (например, этилен для растительных клеток). Для уменьшения повреждения клеток и усиления клеточного роста и производительности для таких одноразовых устройств были предложены различные системы аэрации/перемешивания. Например, предлагалось использовать проницаемые для газа пластиковые мешки, перемешиваемые с помощью механической системы или не перемешиваемые совсем. В патенте США 5057429 газопроницаемый мешок вращают или качают для диффузии кислорода и питательных веществ к животным клеткам. В патенте США 5225346 описан также неподвижный газопроницаемый мешок. На сегодняшний день не существует промышленной разработки такой системы культивирования, с одной стороны в основном по причине сложности масштабирования устройства для бесконтактного перемешивания, а с другой стороны недостаточного снабжения кислородом клеток в неподвижном мешке, содержащем несколько литров культуральной среды. В WO 00/66706 перемешивание осуществляется с помощью колебания около оси вращения несущей конструкции. В патенте Франции 2519020 также упоминается колебание вокруг оси,обеспечивающее перемешивание. Ось может быть установлена в центральной части устройства или на одном из его концов. Фирма Wave Biotech. (Singh V., патент США 6190913) также разработала систему с использованием надутого мешка, помещаемого на качающий механизм, который двигает мешок,-1 009722 создавая волнообразное движение жидкости, содержащейся в нем. Качающий механизм ограничивает размер ферментера, так как для перемешивания большого объема культуральной среды необходимо сложное оборудование; действительно, механизму волнообразования приходится поддерживать весь культивируемый объем. В патенте Франции 2519020 объем культуры не превышал лабораторный масштаб (2,5 л) и в WO 00/66706 объем был ограничен 200 л. В патенте США 6190913 заявлено использование объемов от 100 мл до 500 л. Во всех этих трех патентах вся культуральная емкость покачивается периодически с одной стороны на другую, создавая очень высокое давление на каждой стороне, что несовместимо с крупномасштабным производством. Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении эффективного и дешевого устройства для культивирования клеток с помощью дешевого устройства, которое легко масштабируется по сравнению с большинством одноразовых систем культивирования, описанных на данный момент. Настоящее изобретение относится к устройству для культивирования клеток, в состав которого входит гибкий мешок с культуральной жидкостью и механизм волнообразования, где механизм волнообразования поднимает от 5 до 50% длины культурального мешка. Изобретение также относится к использованию этого устройства для культивирования растительных клеток, клеток животных или микроорганизмов. На чертежах изображено: фиг. 1 - вид в перспективе устройства; фиг. 2 - вид устройства сбоку; фиг. 3 - схематичный вид образования волн посредством движения вверх-вниз механизма образования волн; фиг. 4 - диаграмма кинетики роста культуры соевых клеток в предлагаемой системе культивирования клеток, в колбе Эрленмейера и в ферментере с мешалкой, выраженная по сырому весу в г/л. фиг. 5 - диаграмма кинетики роста соевых клеток, культивируемых в предлагаемой системе культивирования клеток, в колбе Эрленмейера и в перемешиваемом ферментере, выраженная по сухому весу в г/л. Настоящее устройство обеспечивает простую систему для культивирования живых клеток. Оно состоит из двух компонентов: одноразовая культуральная камера и механизм волнообразования. Механизм волнообразования поднимает от 5 до 50% длины культуральной камеры. Недорогой, гибкий и одноразовый надутый пластиковый мешок образует культуральную камеру. Этот пластиковый мешок частично наполняется жидкой средой для культивирования и клетками, которые перемешиваются и обеспечиваются кислородом благодаря перемешиванию. Таким способом поверхность среды постоянно обновляется, и возможно образование свободных пузырьков воздуха, что не является разрушительным для клеток. Движение вверх и вниз по меньшей мере на одном конце пластикового мешка с помощью простого механизма вызывает образование волны. Данный механизм волнообразования состоит из небольшой пластинки, поднимаемой периодически с помощью мотора или толкателя, связанного с таймером. Этот простой механизм волнообразования позволяет легко масштабировать процесс. Так как данное изобретение является простым и эффективным при крупномасштабном производстве, оно является хорошей альтернативой для уменьшения затрат при промышленном производстве. Кроме того, данная одноразовая система придает процессу гибкость и уменьшает мертвое время, поскольку отпадает необходимость чистки, ремонта или проверки, что необходимо для традиционных устройств из нержавеющей стали. Эта система культивирования может быть использована для растительных клеток, клеток животных или микроорганизмов с очень простым способом масштабирования от небольшого мешка к большому,поскольку механизм волнообразования очень простой. Данный способ может быть использован для получения метаболитов, вновь образуемых или полученных биотрансформацией, рекомбинантных белков или для получения множественных эмбриогенетических линий растительных клеток из периодической культуры, при периодическом или непрерывном культивировании, а также для любого другого возможного применения, понятного специалисту в данной области. Принципиальная схема изобретения показана на фиг. 1 (вид в перспективе) и фиг. 2 (вид сбоку). Биореактор состоит из различных частей, включающих, по меньшей мере, одну культуральную камеру 1,сделанную из материала, такого как, например, гибкие биосовместимые пластические листы, спаянных по краям 2, для образования внутренней камеры. Поскольку данное изобретение основано на принципе волнообразования, второй необходимой частью является механизм волнообразования 7, который может состоять из плашки, помещенной только под одним концом культуральной камеры, например, или любой другой подходящий механизм, поднимающий одну часть культуральной камеры. Механизм волнообразования может также включать плашку, которая движется вверх и вниз в средней части, или под любой другой частью культуральной камеры. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения культуральной камерой является мешок, сделанный из гибкого полипропилена, из-за его доступности и способности выдерживать автоклавирование, поэтому его можно простерилизовать в небольшом лабораторном автоклаве или лю-2 009722 бым другим способом. Однако подходящими могут быть и другие виды пластика, например, среди прочего, полиэтилен, а также могут быть использованы другие способы стерилизации. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гибкий биосовместимый, водоотталкивающий материал соединяется с помощью нагревания по краям 2, например с помощью импульсной сварочной машины. Однако другие методы сварки также могут быть использованы, например хорошо известные методы сварки с помощью ультразвука или с помощью радиоволн, но этим не ограничиваются. Другие виды пластиков, для которых не нужно сшивки, могут быть получены различными способами,например с помощью литья под давлением. Предпочтительно, чтобы культуральная камера была в форме подушки, однако могут быть использованы и другие формы, могут варьироваться также и размеры в зависимости от нужд пользователя. В настоящем изобретении мешок, формирующий культуральную камеру, может иметь квадратную, прямоугольную, овальную, округлую или трапециевидную поверхность. Предпочтительна, однако, прямоугольная форма для улучшения производительности способа и механизма изобретения. В особенности предпочтительны размеры мешка 3,2 м в длину и 0,9 м в ширину для 100-литровой культуры или 3 м в длину и 0,3 м в ширину для 25-литровой культуры. Однако длина может достигать 10 м или даже более, и настоящее изобретение позволяет использовать от 1 л культуральной среды до нескольких сотен литров, например 100, 300, 500, 1000 л или более. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере две трубы, соединенные с верхней частью культуральной камеры, могут быть использованы для обновления кислорода: первая 3 обеспечивает приток воздуха (сжатый воздух или другой газ, в соответствии с потребностями культуры), а вторая 4 удаляет отработанные газы. Эти две трубы оборудованы, в наиболее предпочтительном варианте осуществления, фильтрами для очистки воздуха, например 0,22 мкм фильтрами. Другим средством обеспечения кислородом и удаления отработанных газов является использование проницаемой для газа мембраны в качестве верхней поверхности мешка. Данная мембрана должна быть проницаемой для газа, и ее поверхность должна быть достаточной для насыщения культуры кислородом. Мембрана, например, может быть приварена или пломбирована к мешку. Наиболее предпочтительно,чтобы эта мембрана была не проницаема для воды, водяных паров и загрязнителей. Кроме того, принципиальная схема, представленная на фиг. 1, содержит по меньшей мере две дополнительные трубы, соединенные с культуральной камерой. Одна 5 труба соединена с верхней поверхностью камеры для заполнения биореактора инокулятом, содержащимся в свежестерилизованной культуральной среде. Другая 6 труба соединена с нижней стороной мешка для отбора образцов или всей культуры. Предпочтительно, чтобы эти трубки были сделаны из автоклавируемого силикона (но этим не ограничиваются) с отношением внутренний диаметр/внешний диаметр 8/12 мм, это отношение может быть изменено в зависимости от задачи. Второй необходимой частью системы культивирования является механизм волнообразования 7. Как показано на фиг. 2, этот механизм, помимо всего прочего, состоит из небольшой плашки, предпочтительно помещенной под один конец культуральной камеры, но указанная плашка может быть помещена под среднюю или под любую другую часть культуральной камеры. В предпочтительном варианте осуществления ширина плашки равна ширине культуральной камеры и длина плашки составляет от 5 до 50%, более предпочтительно от 8 до 20% длины культуральной камеры. Двигаясь вверх и вниз на угол от 1 до 90, предпочтительно от 1 до 45, более предпочтительно от 1 до 25, небольшая плашка индуцирует волны 8 в жидкой культуральной среде 9, что обеспечивает как перемешивание, так и насыщение культуральной среды кислородом. Поскольку камера наполнена воздухом, это позволяет волне распространяться в культуральной камере 10. В предпочтительном варианте осуществления высота культуральной среды составляет от 10 до 30% высоты надутой культуральной камеры. Удивительно, что, когда волна образуется на противоположном конце 11, она возвращается в начальную точку 12 без затухания. Затем механизм опять создает импульс 13. Для улучшения возвращения волны можно также слегка поднимать противоположный конец. Небольшая плашка волнообразующего механизма может периодически подниматься с помощью рычага, соединенного с мотором, или с помощью толкателя, но могут быть использованы и другие средства. Предпочтительно, чтобы этот механизм был соединен с таймером, для того чтобы подобрать наиболее подходящую частоту образования волны. В случае использования очень длинной культуральной камеры для большого объема культуры, например больше 100 л, также возможно поместить механизм волнообразования под каждым концом культуральной камеры. В этом случае механизмы волнообразования поднимают попеременно от 5 до 50% или более предпочтительно от 7 до 20% длины культуральной камеры. Настоящее изобретение основано на том, что индукция волны обеспечивает перемешивание жидкой культуры и аэрацию без образования пузырьков. Перенос кислорода осуществляется посредством диффузии из воздуха в верхней части камеры в культуральную жидкость, что обеспечивает рост без касательного напряжения.-3 009722 Эта культуральная система легка в эксплуатации, поскольку как культуральная камера, так и средства перемешивания просты. Также легко осуществляется масштабирование с небольшого объема до нескольких сотен литров,поскольку механизм волнообразования не перемешивает полную культуральную камеру, но поднимает только по меньшей мере один ее конец. Предпочтительно, чтобы культуральная камера заполнялась клетками и культуральной средой на 20-80%, более предпочтительно на 20-40%. Примеры иллюстрируют некоторые продукты и способы их получения в соответствии с настоящим изобретением, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. В изобретении возможны изменения и модификации. Так, специалист может изменить состав, ингредиенты, условия получения и смеси для подбора оптимальных условий естественного синтеза веществ для различных целей. Пример. Сравнение роста культуры соевых клеток. Возможности изобретения для выращивания соевых клеток были продемонстрированы с использованием периодического культивирования. Выращивание в данной системе было сравнимым или лучше,чем в колбе Эрленмейера или в резервуаре биореактора с мешалкой, и даже в больших масштабах. Штаммы тканевой культуры Glycine max (L.) Merr. из различных культурных сортов были подращены на среде Gamborg et al. (1968), содержащей 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара (бакто-агар Difco) и 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. pH доводили до 5,8 до автоклавирования (30 мин при 115 С). Один штамм (13406, cv. Maple arrow) был перенесен в жидкую среду (такая же среда, как и для тканевых культур, но не содержащая агар и 30 г/л сахарозы) и предкультивирован в 250 мл колбе Эрленмейера (3 г/л свежих клеток в 100 мл среды) каждые две недели в тех же условиях, что и для коллекции культуры тканей. Колбу Эрленмейера культивировали во вращаемом шейкере при 100 об/мин (диаметр шейкера 20 мм). 14-литровый перемешиваемый ферментер (New Brunswick Scientific) с двумя шестилопастными мешалками использовали в той же среде при тех же температурных условиях и pH, как указано выше. Ферментер содержал 9 л свежей среды, автоклавированной 40 мин при 115 С. Двухнедельные соевые клетки фильтровались из двух однолитровых колб Эрленмейера (500 мл среды). 300 г сырого веса переносили в 1 л свежей среды в стерильный резервуар с помощью специального выпускного средства, асептически подсоединяемого к биореактору, для инокуляции. Скорость перемешивания была 100 об/мин. Растворенный кислород поддерживали на уровне 30% с помощью уменьшения или увеличения скорости потока воздуха, используя оборудование для биоконтроля со стерилизуемым датчиком кислорода (золото) и измеритель весового расхода. Систему для культивирования клеток (как описано выше) заполняли 10 л свежей культуральной среды, содержащей соевые клетки (30 г/л сырого веса). Температуру в комнате поддерживали 25 С и волну генерировали каждые 4 с (с помощью программирования волнообразующего механизма, как описано выше). Измерение роста. Образцы культивированной массы отбирали в определенные периоды роста из колбы, ферментера и системы для культивирования клеток и измеряли объем образца. Затем удаляли клетки из жидкой культуральной среды с помощью фильтрования и взвешивали (сырой вес). Аликвоту этой биомассы помещали в сушильную комнату на 24 ч при 100 С и затем точно взвешивали (сухой вес). Этот пример показывает, что 10-литровая система для культивирования клеток обеспечивает мягкие условия для выращивания клеток, сравнимые с колбой и лучше, чем в резервуаре ферментера с мешалкой. Повреждение клеток было минимальным, и массоперенос и подача газа были оптимальными в данных условиях. Как уже было упомянуто выше, настоящее изобретение обладает следующими преимуществами,обеспечивающими экономическую выгоду: обеспечивает мягкие условия выращивания растительных клеток; легко масштабируется; легкодоступно; является простым в применении. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Устройство для культивирования клеток, содержащее гибкую культуральную камеру и механизм,обеспечивающий возможность периодического подъема части культуральной камеры с образованием волн в культуральной среде, причем указанный механизм образования волн поднимает от 5 до 50% длины культуральной камеры, при сохранении остальными частями камеры исходного положения. 2. Устройство по п.1, в котором механизм волнообразования поднимает от 8 до 20% площади нижней поверхности культуральной камеры.-4 009722 3. Устройство по п.1 или 2, в котором механизм волнообразования поднимает часть нижней поверхности культуральной камеры на угол от 1 до 90, предпочтительно от 1 до 25. 4. Устройство по любому предшествующему пункту, в котором культуральная камера включает средства циркуляции воздуха, например трубу или воздухопроницаемую мембрану. 5. Устройство по любому предшествующему пункту, в котором механизм волнообразования поднимает поочередно от 5 до 50% длины культуральной камеры. 6. Устройство по любому предшествующему пункту, в котором культуральной камерой является гибкий пластиковый мешок. 7. Применение устройства для культивирования клеток по любому предшествующему пункту для культивирования растительных клеток, клеток животных или микроорганизмов. 8. Применение по п.7, в котором указанные клетки продуцируют клеточную биомассу, эмбриогенетические растительные клетки, метаболиты, вторичные растительные метаболиты и/или рекомбинантные молекулы.