Способ мультипраймерной амплификации для штрихового кодирования целевых нуклеиновых кислот
Номер патента: 23190
Опубликовано: 31.05.2016
Авторы: Мэй Эндрю, Ван Цзюнь, Капер Фиона, Андерсон Меган, Чэнь Пэйлинь
Формула / Реферат
1. Способ амплификации множества целевых нуклеиновых кислот в образце, включающий следующие стадии:
получение амплификационной смеси для каждой целевой нуклеиновой кислоты, при этом указанная амплификационная смесь содержит
прямой праймер, содержащий мишень-специфичную часть;
обратный праймер, содержащий мишень-специфичную часть, где прямой праймер дополнительно содержит первую нуклеотидную метку и/или обратный праймер дополнительно содержит вторую нуклеотидную метку; и
по меньшей мере один штрих-кодовый праймер, содержащий штрих-кодовую нуклеотидную последовательность и специфичную к первой и/или второй нуклеотидной метке часть, где штрих-кодовый праймер находится по меньшей мере в 5-кратной концентрации по отношению к прямому и/или обратному праймеру(праймерам);
амплификацию каждой амплификационной смеси с получением множества целевых ампликонов, содержащих меченые целевые нуклеотидные последовательности, при этом каждая содержит первую и/или вторую нуклеотидные метки, фланкирующие целевую нуклеотидную последовательность, и по меньшей мере одну штрих-кодовую нуклеотидную последовательность на 5' или 3' конце целевого ампликона.
2. Способ по п.1, где получают более чем 100 амплификационных смесей и где по меньшей мере 50% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов.
3. Способ по п.1 или 2, где
прямой праймер содержит внутренний прямой праймер, содержащий указанную мишень-специфичную часть и указанную первую нуклеотидную метку;
обратный праймер содержит внутренний обратный праймер, содержащий указанную мишень-специфичную часть и указанную вторую нуклеотидную метку; и
амплификационная смесь содержит два внешних праймера, где один из этих внешних праймеров представляет собой указанный штрих-кодовый праймер, где
первый внешний праймер содержит специфичную к указанной первой нуклеотидной метке часть и
второй внешний праймер содержит специфичную к указанной второй нуклеотидной метке часть, где один или оба внешних праймера содержат указанную штрих-кодовую нуклеотидную последовательность, где концентрация внешних праймеров является по меньшей мере 5-кратной по отношению к концентрации внутренних праймеров.
4. Способ по п.3, где
первый внешний праймер содержит первый дополнительный сайт связывания праймера выше штрих-кодовой нуклеотидной последовательности, которая находится выше специфичной к первой нуклеотидной метке части; и
второй внешний праймер содержит вторую метка-специфичную часть, дополнительную штрих-кодовую нуклеотидную последовательность и ниже ее второй дополнительный сайт связывания праймера.
5. Способ по п.1 или 2, где прямой праймер дополнительно содержит первую нуклеотидную метку.
6. Способ по пп.1, 2 или 5, где обратный праймер дополнительно содержит вторую нуклеотидную метку.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где концентрация штрих-кодового праймера в амплификационных смесях является по меньшей мере 50-кратной от концентрации прямого и/или обратного праймера(праймеров).
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где первую и/или вторую нуклеотидные метки и/или штрих-кодовую нуклеотидную последовательность выбирают так, чтобы избежать существенного отжига с целевыми нуклеиновыми кислотами.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где штрих-кодовая нуклеотидная последовательность определяет конкретный образец.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где штрих-кодовый праймер содержит штрих-кодовую нуклеотидную последовательность и специфичную к первой нуклеотидной метке часть.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где множество прямых праймеров содержит одинаковую первую нуклеотидную метку.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где все прямые праймеры, используемые для амплификации целевых последовательностей в каждом из множества образцов, содержат одинаковую первую нуклеотидную метку.
13. Способ по п.12, где прямой и обратный праймеры для каждой мишени изначально объединяют отдельно от образца и каждый штрих-кодовый праймер изначально объединяют с его соответствующим образцом.
14. Способ по п.13, где Т мишеней амплифицируют в S образцах, при этом Т и S являются целыми числами больше единицы, при этом способ дополнительно включает получение S´T амплификационных смесей, где изначально объединенный прямой и обратный праймеры добавляют к изначально объединенным образцам и штрих-кодовым праймерам.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где амплификацию проводят в течение по меньшей мере 3 циклов для введения первой и второй нуклеотидных меток и штрих-кодовой нуклеотидной последовательности.
16. Способ по п.15, где амплификацию проводят в течение от 5 до 50 циклов.
17. Способ по любому из пп.1-15, где амплификацию проводят в течение достаточного числа циклов для нормализации числа копий целевого ампликона во всех мишенях и во всех образцах.
18. Способ амплификации множества целевых нуклеиновых кислот в образце, включающий следующие стадии:
получение амплификационной смеси для каждой целевой нуклеиновой кислоты, при этом
указанная амплификационная смесь содержит
прямой праймер, содержащий мишень-специфичную последовательность; и
обратный праймер, содержащий мишень-специфичную последовательность;
амплификацию каждой амплификационной смеси с получением множества целевых нуклеотидных последовательностей;
мечение целевых нуклеотидных последовательностей с получением множества целевых ампликонов, при этом каждый содержит первую и/или вторую нуклеотидные метки, фланкирующие целевую нуклеотидную последовательность;
где по меньшей мере 50% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов.
19. Способ по п.18, где более чем 100 амплификационных смесей получают в микрофлюидном устройстве.
20. Способ по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере 70% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, где средняя длина целевых ампликонов составляет по меньшей мере 25 оснований.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где средняя длина целевых ампликонов составляет по меньшей мере 50 оснований.
23. Способ по любому из предшествующих пунктов, где средняя длина целевых ампликонов составляет по меньшей мере 100 оснований.
24. Способ по любому из предшествующих пунктов, где средняя длина целевых ампликонов составляет по меньшей мере 200 оснований.
25. Способ по любому из предшествующих пунктов, где средняя длина целевых ампликонов составляет по меньшей мере 1 т.н.
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере 90% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов.
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, где объем амплификационных смесей находится в диапазоне от приблизительно 1 пл до приблизительно 50 нл.
28. Способ по п.27, где объем амплификационных смесей находится в диапазоне от приблизительно 5 пл до приблизительно 25 нл.
29. Способ по любому из предшествующих пунктов, где амплификационные смеси образуются в отдельных компартментах микрофлюидного устройства или смеси распределяют в них перед амплификацией.
30. Способ по п.29, где микрофлюидное устройство изготавливают, по меньшей мере частично, из эластомерного материала.
31. Способ по любому из предшествующих пунктов, где амплификацию проводят с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
32. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий извлечение целевых ампликонов из амплификационных смесей.
33. Способ по п.32, где целевые ампликоны извлекают в объеме и/или числе копий, которое варьирует менее чем приблизительно 50% среди извлеченных целевых ампликонов.
34. Способ по п.32, дополнительно включающий амплификацию по меньшей мере одного целевого ампликона с помощью праймеров, специфичных для первой и второй нуклеотидных меток, с получением целевого ампликона, в котором отсутствует штрих-кодовая нуклеотидная последовательность.
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, где целевые нуклеиновые кислоты включают геномную ДНК.
36. Способ по любому из пп.1-17 или 20-35, где один или несколько из прямого праймера, обратного праймера и штрих-кодового праймера содержат по меньшей мере один дополнительный сайт связывания праймера.
37. Способ по п.36, где штрих-кодовый праймер содержит, по меньшей мере, первый дополнительный сайт связывания праймера выше штрих-кодовой нуклеотидной последовательности, которая находится выше первой нуклеотидной метки.
38. Способ по п.37, где обратный праймер содержит, по меньшей мере, второй дополнительный сайт связывания праймера ниже второй нуклеотидной метки.
39. Способ по п.38, где первый и второй дополнительные сайты связывания праймера способны связываться праймерами ДНК-секвенирования.
40. Способ по любому из пп.18-39, где первая и вторая нуклеотидные метки способны связываться праймерами ДНК-секвенирования.
41. Способ по п.39 или 40, дополнительно включающий ДНК-секвенирование по меньшей мере одного целевого ампликона.
42. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий определение количества целевых ампликонов в амплификационных смесях.
43. Способ по п.42, где указанное количественное определение включает извлечение целевых ампликонов и их цифровую амплификацию.
44. Способ по п.43, где указанная цифровая амплификация включает
распределение предварительно амплифицированных целевых ампликонов в дискретных реакционных смесях, где каждая реакционная смесь, в среднем, включает не более одного ампликона на реакционную смесь; и
амплификацию реакционных смесей.
45. Способ по п.44, где указанная цифровая амплификация включает ПЦР в реальном времени.
46. Способ по п.44, где указанная цифровая амплификация включает ПЦР с детекцией по конечной точке.
47. Способ по п.44, где амплификационные смеси образуются в отдельных компартментах микрофлюидного устройства или смеси распределяют в них перед амплификацией.
48. Способ по п.47, где микрофлюидное устройство изготавливают, по меньшей мере частично, из эластомерного материала.
49. Способ по любому из предшествующих пунктов, где присутствие целевого ампликона определяют с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qPCR).
50. Способ по любому из предшествующих пунктов, где универсальный qPCR-зонд используют в амплификационных смесях для обнаружения целевых ампликонов.
51. Способ по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько мишень-специфичных qPCR-зондов используют в амплификационных смесях для обнаружения целевых ампликонов.
52. Способ по любому из предшествующих пунктов, где присутствие целевого ампликона обнаруживают с помощью флуорогенного нуклеазного анализа.
53. Способ по любому из предшествующих пунктов, где присутствие целевого ампликона обнаруживают с помощью флуорогенного гидролизного олигонуклеотидного зонда с двойной меткой.
54. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий определение количества каждой целевой нуклеиновой кислоты, присутствующей в каждом образце.
55. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ проводят при определении числа копий целевых нуклеиновых кислот в каждом образце.
56. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ проводят при определении генотипов в локусах, соответствующих целевым нуклеиновым кислотам.
57. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ проводят при определении уровней экспрессии целевых нуклеиновых кислот.
58. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ проводят для подготовки целевых нуклеиновых кислот для секвенирования.
59. Способ по любому из предшествующих пунктов, где множество целевых нуклеиновых кислот амплифицируют из каждого множества различных образцов.
Текст
СПОСОБ МУЛЬТИПРАЙМЕРНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ ШТРИХОВОГО КОДИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В определенных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы амплификации, в которых нуклеотидную метку(и) и, факультативно, штрих-кодовую нуклеотидную последовательность добавляют к целевым нуклеотидным последовательностям. В других вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает микрофлюидное устройство,которое включает множество первых линий ввода и множество вторых линий ввода. Микрофлюидное устройство также включает множество наборов первых камер и множество наборов вторых камер. Каждый набор первых камер находится в жидкостной связи с одним из множества первых линий ввода. Каждый набор вторых камер находится в жидкостной связи с одним из множества вторых линий ввода. Микрофлюидное устройство дополнительно включает множество первых плунжерных пар в жидкостной связи с первой частью множества вторых линий ввода и множество вторых плунжерных пар в жидкостной связи с второй частью множества вторых линий ввода. Перекрестная ссылка на родственные заявки Данная заявка заявляет преимущество предшествующей предварительной заявки на патент США 61/166181, поданной 2 апреля 2009 г.; предшествующей предварительной заявки на патент США 61/166105, поданной 2 апреля 2009 г.; предшествующей предварительной заявки на патент США 61/186327, поданной 11 июня 2009 г.; и предшествующей предварительной заявки на патент США 61/305907, поданной 18 февраля 2010 г., все из которых, таким образом, включены посредством ссылки в их полных объемах. Область изобретения Данное изобретение относится, в целом, к области высокопроизводительных исследований для обнаружения и/или секвенирования конкретных целевых нуклеиновых кислот. В определенных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы амплификации, в которых нуклеотидную метку(и) и штрих-кодовую нуклеотидную последовательность добавляют к целевым нуклеотидным последовательностям. Предпосылки изобретения Возможность обнаруживать специфические последовательности нуклеиновых кислот в образце привела в результате к новым подходам в диагностической и предсказательной медицине, в мониторинге окружающей среды, пищи и сельскохозяйственной продукции, молекулярно-биологическом исследовании и многих других областях. Кроме того, новые методики секвенирования предоставляют средства для быстрого высокопроизводительного секвенирования нуклеиновых кислот. Имели бы большое преимущество дополнительные способы, особенно способы, которые облегчают анализ многих мишеней и/или анализ многих образцов одновременно среди широкого спектра концентраций в образце. Микрофлюидные устройства могут использоваться для аналитической, препаративной, измерительной и других манипуляционных функций в масштабе, который невозможно было представить до недавнего времени. Преимущества микрофлюидных устройств включают сохранение драгоценных реагентов и образцов, высокую плотность и производительность анализа или синтеза образцов, флюидную точность и правильность на уровне, почти не видимом для невооруженного взгляда, и сокращение пространства, сопровождающее замену эквивалентного оборудования, которое работает в макрофлюидном масштабе. С уменьшением размера и увеличением плотности микрофлюидных устройств связана повышенная сложность и более высокие стоимости конструирования и производства, связанные с возрастающей сложностью структуры устройства. Недавно были согласованы усилия по разработке и производству микрофлюидных систем для проведения различных химических и биохимических анализов и синтезов. Дополнительно микрофлюидные устройства имеют потенциал к адаптации для использования с автоматизированными системами, тем самым обеспечивая дополнительные преимущества дальнейших снижений стоимости и уменьшения ошибкок оператора из-за уменьшения вмешательства человека. Микрофлюидные устройства были предложены для использования в различных областях применения, включая, например, капиллярный электрофорез, газовую хроматографию и разделение клеток. Тем не менее, реализация этих преимуществ часто была затруднена из-за различных осложнений,связанных с микрофлюидными устройствами, которые производились до настоящего момента. Например, многие из существующих микрофлюидных устройств производят из основ на основе кремнезема,которые являются трудными и сложными для механической обработки. В результате многие устройства,изготовленные из таких материалов, являются хрупкими. Более того, транспорт жидкости через многие существующие микрофлюидные устройства требует регуляции сложных электрических полей для транспорта жидкостей контролируемым способом через устройство. Таким образом, в виду вышеупомянутых преимуществ, которые можно получить с микрофлюидными устройствами, но принимая во внимание имеющие место ограничения существующих устройств,остается необходимость в микрофлюидных устройствах, разработанных для применения при проведении ряда химических и биохимических анализов. Из-за их важности в современной биохимии существует особенная необходимость в устройствах, которые могут быть использованы для проведения ряда реакций амплификации нуклеиновых кислот, имеющих при этом достаточную многофункциональность для применения также в других типах анализов. Устройства со способностью к проведению амплификаций нуклеиновых кислот будут приносить большую пользу. Например, такие устройства могут быть использованы в качестве аналитического инструмента для определения того, присутствует или отсутствует в образце конкретная целевая представляющая интерес нуклеиновая кислота. Таким образом, устройства могут быть использованы для проведения испытания на присутствие конкретных патогенов (например, вирусов, бактерий или грибов) и с целью идентификации (например, при определении отцовства или в практике судебной экспертизы). Такие устройства также можно использовать для обнаружения или определения характеристик специфических нуклеиновых кислот, для которых ранее была установлена корреляция с конкретными заболеваниями или генетическими нарушениями. При использовании в качестве аналитических инструментов устройства можно также использовать для проведения анализов по генотипированию и анализов генной экспрессии (например, исследования дифференциальной генной экспрессии). Альтернативно, устройства можно использовать препаративным способом для амплификации достаточного количества нуклеиновой кислоты для дальнейшего анализа, такого как секвенирование амплифицированного продукта, клеточного типирования, ДНК-генотипоскопии и подобного. Амплифицированные продукты можно также использовать в различных областях применения генной инженерии, таких как вставка в вектор, который может затем использоваться для трансформации клеток для продуцирования необходимого белкового продукта. Несмотря на эти достижения в разработке и применении микрофлюидных устройств было бы полезным снизить сложность микрофлюидных чипов и упростить работу с ними. Кроме того, существует необходимость повышенной возможности извлечения продуктов реакции из микрофлюидных устройств. Таким образом, в области техники существует необходимость в улучшенных способах и системах, связанных с микрофлюидными устройствами. Краткое описание изобретения В определенных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ амплификации,мечения и штрихового кодирования множества целевых нуклеиновых кислот во множестве образцов. Способ включает получение амплификационной смеси для каждой целевой нуклеиновой кислоты. Каждая амплификационная смесь включает прямой праймер, содержащий мишень-специфичную часть; обратный праймер, содержащий мишень-специфичную часть, где прямой праймер дополнительно содержит первую нуклеотидную метку, и/или обратный праймер дополнительно содержит вторую нуклеотидную метку; и по меньшей мере один штрих-кодовый праймер, включающий штрих-кодовую нуклеотидную последовательность и первую и/или вторую специфичную для нуклеотидной метки часть, где штрихкодовый праймер находится в избытке по отношению к прямому и/или обратному праймеру(ам). Каждая амплификационная смесь подвергается амплификации с продуцированием множества целевых ампликонов, где каждый целевой ампликон включает меченую целевую нуклеотидную последовательность, с первой и/или второй нуклеотидными метками, фланкирующими целевую нуклеотидную последовательность, и по меньшей мере одну штрих-кодовую нуклеотидную последовательность на 5' или 3' конце целевого ампликона. В специфических вариантах осуществления прямой праймер дополнительно включает первую нуклеотидную метку. При необходимости обратный праймер может дополнительно включать вторую нуклеотидную метку. В определенных вариантах осуществления способа мечения/штрихового кодирования концентрация штрих-кодового праймера в амплификационных смесях по меньшей мере в 4 раза выше концентрации прямого и/или обратного праймера(ов). В вариациях таких вариантов осуществления концентрация штрих-кодового праймера в амплификационных смесях по меньшей мере в 50 раз выше концентрации прямого и/или обратного праймера(ов). В конкретных вариантах осуществления способа штрихового кодирования/мечения первую и/или вторую нуклеотидные метки и/или штрих-кодовую нуклеотидную последовательность выбирают так,чтобы избежать существенного отжига с целевыми нуклеиновыми кислотами. В иллюстративных вариантах осуществления штрих-кодовая нуклеотидная последовательность определяет конкретный образец. Если штрих-кодовый праймер включает штрих-кодовую нуклеотидную последовательность и специфичную к первой нуклеотидной метке часть, то в определенных вариантах осуществления множество прямых праймеров включает одинаковую первую нуклеотидную метку. Например, если множественные мишени должны быть амплифицированы в различных образцах, то весь набор прямых праймеров, соответствующий набору мишеней, может иметь одинаковую первую нуклеотидную метку. В конкретных вариантах осуществления способа штрихового кодирования/мечения прямой и обратный праймеры для каждой мишени изначально объединяют отдельно от образца, и каждый штрихкодовый праймер изначально объединяют с его соответствующим образцом. Например, если Т мишеней должны быть амплифицированы в S образцах, при этом Т и S являются целыми числами больше единицы, то способ может дополнительно включать получение ST амплификационных смесей, где изначально объединенные прямой и обратный праймеры добавляют к изначально объединенным образцам и штрих-кодовым праймерам. В определенных вариантах осуществления способа штрихового кодирования/мечения амплификацию проводят в течение по меньшей мере 3 циклов для введения первой и второй нуклеотидных меток и штрих-кодовой нуклеотидной последовательности. В вариациях этих вариантов осуществления амплификацию проводят в течение 5-50 циклов. В конкретных вариантах осуществления амплификацию проводят в течение достаточного количества циклов для нормализации числа копий целевого ампликона по всем мишеням и во всех образцах. В определенных вариантах осуществления способа штрихового кодирования/мечения по меньшей мере 50% целевых ампликонов, продуцируемых при амплификации, присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов. В других вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ, в котором штриховое кодирование, факультативно, опускают и целевые нуклеотидные последовательности метят после амплификации. Этот способ включает амплификацию множества целевых нуклеиновых кислот, как правило, во множестве образцов. Амплификационную смесь получают для каждой целевой нуклеиновой кислоты, где каждая амплификационная смесь включает прямой праймер, включающий мишень-специфичную последовательность; и обратный праймер, включающий мишень-специфичную последовательность. Каждая амплификационная смесь подвергается амплификации с получением множества целевых нуклеотидных последовательностей. Целевые нуклеотидные последовательности затем метят (например,лигированием нуклеотидных меток с одним или несколькими концами целевых нуклеотидных последовательностей) с получением множества целевых ампликонов. Каждый целевой ампликон включает первую и/или вторую нуклеотидные метки, фланкирующие целевую нуклеотидную последовательность. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 50% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов. В определенных вариантах осуществления способов амплификации, описанных в данном документе, по меньшей мере 70% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов. В иллюстративных вариантах осуществления по меньшей мере 90% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов. В различных вариантах осуществления средняя длина целевых ампликонов составляет по меньшей мере 25 оснований, 50 оснований, 100 оснований, 200 оснований, 500 оснований и 750 оснований. Также возможны более длинные средние длины, такие как 1 т.п.н. (тысяча пар нуклеотидов) или более, так, например, если амплификацию проводят с помощью ПЦР длинных фрагментов. В таких вариантах осуществления амплификация может давать на выходе целевые ампликоны, где по меньшей мере 70% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов. Преимущество способов, описанных в данном документе, состоит в том, что амплификация может(но не обязательно) быть проведена в малых реакционных объемах. В конкретных вариантах осуществления объем амплификационных смесей находится в диапазоне от приблизительно 1 пл до приблизительно 50 нл. В определенных вариантах осуществления объем амплификационных смесей находится в диапазоне от приблизительно 5 пл до приблизительно 25 нл. Способы, описанные в данном документе, могут, факультативно, включать извлечение целевых ампликонов из амплификационных смесей. В определенных вариантах осуществления целевые ампликоны извлекают в объеме и/или числе копий, которое изменяется менее чем на приблизительно 50% среди извлеченных целевых ампликонов. Извлеченные ампликоны могут быть использованы для дальнейшей амплификации и/или анализа (например, ДНК-секвенирования). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один целевой ампликон можно подвергнуть амплификации с помощью праймеров,специфических для первой и второй нуклеотидных меток, с получением целевого ампликона, в котором отсутствует штрих-кодовая нуклеотидная последовательность, если это необходимо. В конкретных вариантах осуществления способов, описанных в даном документе, целевые нуклеиновые кислоты включают геномную ДНК. В вариациях этих вариантов осуществления геномная ДНК может быть ДНК, предусмотренной для ДНК-секвенирования, например автоматизированного ДНКсеквенирования. В определенных вариантах осуществления один или несколько прямых праймеров, обратных праймеров и штрих-кодовых праймеров могут включать по меньшей мере один дополнительный сайт связывания праймера. Например, если используется штрих-кодовый праймер, то штрих-кодовый праймер может включать, по меньшей мере, первый дополнительный сайт связывания праймера выше штрихкодовой нуклеотидной последовательности, которая расположена выше первой нуклеотидной метки. В таком варианте осуществления обратный праймер может включать, по меньшей мере, второй дополнительный сайт связывания праймера ниже второй нуклеотидной метки. В конкретных вариантах осуществления, если целевые нуклеотидные последовательности должны быть секвенированы с помощью автоматизированного ДНК-секвенирования, то первый и второй дополнительные сайты связывания праймеров способны связываться праймерами ДНК-секвенирования. Если штрих-кодовый праймер не используется и целевые нуклеотидные последовательности метят после амплификации, то первая и вторая нуклеотидные метки могут быть способны связываться праймерами ДНК-секвенирования. Таким образом, способы, описанные в данном документе, могут, факультативно, включать ДНКсеквенирование по меньшей мере одного целевого ампликона. В определенных вариантах осуществления способ может, факультативно, включать количественное определение количества целевых ампликонов в амплификационных смесях. Этот этап может быть проведен, например, до автоматизированного ДНК-секвенирования. В конкретных вариантах осуществления количественное определение включает извлечение целевых ампликонов и их цифровую амплификацию. Цифровая амплификация включает в конкретных вариантах осуществления распределение предварительно амплифицированных целевых ампликонов в дискретные реакционные смеси, где каждая реакционная смесь, в среднем, включает не более одного ампликона на реакционную смесь; и амплификацию реакционных смесей. Количественное определение в цифровой амплификации может быть проведено с помощью ПЦР в реальном времени и/или ПЦР с детекцией по конечной точке. Способы амплификации, описанные в данном документе, могут, факультативно, включать определение количества каждой целевой нуклеиновой кислоты, присутствующей в каждом образце. В определенных вариантах осуществления способы могут быть проведены для определения числа копий целевых нуклеиновых кислот в каждом образце. В конкретных вариантах осуществления способы могут быть проведены при определении генотипов в локусах, соответствующих целевым нуклеиновым кислотам. В других вариантах осуществления способы могут быть проведены при определении уровней экспрессии целевых нуклеиновых кислот. В конкретных вариантах осуществления данное изобретение относится к микрофлюидным устройствам. Более конкретно, данное изобретение относится к микрофлюидному устройству, которое обеспечивает извлечение продуктов реакции. Исключительно в качестве примера способ и аппарат применяли к системе подготовки образцов ПЦР, используемой для получения библиотек для секвенирования следующего поколения. Тем не менее, следует понимать, что данное изобретение имеет намного более широкий диапазон применимости. Согласно варианту осуществления данного изобретения обеспечивается микрофлюидное устройство. Микрофлюидное устройство включает множество первых линий ввода и множество вторых линий ввода. Микрофлюидное устройство также включает множество наборов первых камер и множество наборов вторых камер. Каждый набор первых камер находится в жидкостной связи с одной из множества первых линий ввода и каждый набор вторых камер находится в жидкостной связи с одной из множества вторых линий ввода. Микрофлюидное устройство дополнительно включает множество первых плунжерных пар в жидкостной связи с первой частью множества вторых линий ввода и множество вторых плунжерных пар в жидкостной связи со второй частью множества вторых линий ввода. Согласно другому варианту осуществления данного изобретения обеспечивается способ эксплуатации микрофлюидного устройства, имеющего камеру для химического реактива, камеру для образца и порт для сбора. Способ включает закрытие линии для жидкости между камерой для химического реактива и камерой для образца, подачу образца в камеру для образца через линию ввода образца и подачу химического реактива в камеру для химического реактива через линию ввода химического реактива. Способ также включает открытие линии для жидкости между камерой для химического реактива и камерой для образца, объединение по меньшей мере части образца и по меньшей мере части химического реактива с образованием смеси и реагирование смеси с образованием продукта реакции. Способ дополнительно включает закрытие линии для жидкости между камерой для химического реактива и камерой для образца, подачу собирающего реагента из порта для сбора в камеру для образца и удаление продукта реакции из микрофлюидного устройства. Согласно конкретному варианту осуществления данного изобретения обеспечивается способ получения продуктов реакции. Способ включает обеспечение М образцов и обеспечение N химических реактивов. Способ также включает смешивание М образцов и N химических реактивов с образованием MN попарных комбинаций. Каждая из MN попарных комбинаций содержится в закрытом объеме. Способ дополнительно включает образование MN продуктов реакции из MN попарных комбинаций и извлечение MN продуктов реакции. Многие преимущества достигаются с помощью данного изобретения по сравнению с общепринятыми методиками. Например, варианты осуществления данного изобретения обеспечивают смешивание и реакцию MN образцов и химических реактивов с последующим извлечением продуктов реакции в пулах последовательных образцов. Кроме того, используют контроль нагнетания расширением для удаления, по сути, всех продуктов реакции из микрофлюидного устройства, обеспечивая однородность между различными пулами продуктов реакции. Используя системы и способы, описанные в данном документе, сокращается время и трудовые ресурсы, необходимые для получения библиотек, по сравнению с общепринятыми методиками. Эти и другие варианты осуществления данного изобретения наряду со многими их преимуществами и признаками описаны более детально совместно с текстом ниже и прилагаемыми фигурами. Краткое описание графических материалов Данное изобретение может быть понято, исходя из следующего описания, которое приводится совместно с прилагаемыми графическими материалами, которые иллюстрируют определенные специфические варианты осуществления данного изобретения. Фиг. 1 показывает иллюстративное микрофлюидное устройство матричного типа в горизонтальной проекции; фиг. 2 представляет собой упрощенный чертеж в перспективе несущего элемента и микрофлюидного устройства, которое позволяет извлекать продукты реакции; фиг. 3 - упрощенную принципиальную схему микрофлюидного устройства, которое позволяет извлекать продукты реакции; фиг. 4 - упрощенную принципиальную схему нескольких элементарных ячеек микрофлюидного устройства, показанного на фиг. 3; фиг. 5 А - упрощенную принципиальную схему микрофлюидного устройства, которое позволяет извлекать продукты реакции; фиг. 5 В - упрощенную принципиальную схему частей микрофлюидного устройства, показанного на фиг. 5 А; фиг. 6 - упрощенную принципиальную схему некоторых элементарных ячеек микрофлюидного устройства, показанного на фиг. 5 А; фиг. 7 - упрощенное графическое представление способа эксплуатации микрофлюидного устройства, которое позволяет извлекать продукты реакции; фиг. 8A-8D - упрощенные принципиальные схемы, иллюстрирующие поток жидкости через элементарные ячейки микрофлюидного устройства, которое позволяет извлекать продукты реакции в ходе эксплуатации; фиг. 9A-9D - упрощенные принципиальные схемы, иллюстрирующие поток жидкости через микрофлюидное устройство, которое позволяет извлекать продукты реакции в ходе эксплуатации; фиг. 10 иллюстрирует вариант осуществления 3-праймерного способа амплификации для штрихового кодирования целевых нуклеиновых кислот перед секвенированием; фиг. 11 показывает фотографию геля, описанного в примере 1. Дорожки представляют собой следующее: (2) молекулярные маркеры, (4) образец, амплифицированный с 454-хвостами; (5) образец(8) образец (NTC), амплифицированный с праймерной парой А 5; (10) образец, амплифицированный с 3 праймерами; и (11) образец (NTC), амплифицированный с 3 праймерами; фиг. 12 показывает гелевые электроферограммы, полученные с 4 чипов Agilent 1K Biolanalyzer для каждого из отдельных образцов, обработанных на Access Array IFC (Integrated Fluidic Circuit) в примере 4. Каждая колонка на фигуре показывает распределение по размеру ДНК-продуктов в каждом образце. Все образцы дают сходные распределения продуктов; фиг. 13A-13 В показывают результаты из примера 4. А) прогнозируемые размеры всех ПЦРпродуктов для этого набора мишень-специфичных праймеров; В) электроферограмма одного из пулов образцов, полученных из Access Array IFC. Распределение размеров продукта в пределах одного пула продуктов. Все продукты попадали в прогнозируемый диапазон, показанный в (В); фиг. 14 А-14 С показывает результаты из примера 4. А) число последовательностей, подсчитанное на штрих-код после 454-секвенирования. Верхняя горизонтальная линия представляет 2 среднее число счетов на штрих-код. Нижняя горизонтальная линия представляет 50% среднего числа счетов на штрихкод; В) число последовательностей, подсчитанных на ампликон. Каждая точка на графике представляет число раз, которое последовательность измеряли на секвенаторе на отдельную камеру на Access ArrayIFC. Треугольные точки представляют ПЦР-реакции с более чем 2 средним представлением. Темносерые точки представляют ПЦР реакции с менее чем 0,5 средним представлением; С) частотное распределение представления ампликона. Темно-серая линия представляет число ампликонов, присутствующих в данном представлении. Светло-серая линия представляет число считываний, которые будут измерены при данном охвате (например, 98% при 20 охвате). Процентная доля ампликонов в пределах 2-кратного среднего: 95,8%; процентная доля ампликонов в пределах 5-кратного среднего: 99,7%; фиг. 15 А-15 В показывают пример модели мультипраймерной реакции с помощью 4 внешних праймеров с различными комбинациями сайта связывания праймера и нуклеотидных меток (пример 5), А) два прямых штрих-кодовых праймера (454B-BC-Tag8, 454A-BC-Tag8 и два обратных штрих-кодовых праймера (454A-BC-Tag5, 454B-BC-Tag8) объединяют с одной внутренней праймерной парой (Tag8-TSF иTag5-TSR); В) два основных ПЦР-продукта, образованных в результате данной ПЦР-реакции. ПЦРпродукты, содержащие 454A-Tag8 и 454A-Tag5 на каждом конце или 454B-Tag8 и 454B-Tag5 на каждом конце, не дают значительных ПЦР-продуктов из-за ПЦР-супрессии; фиг. 16 А-16 В показывают представление каждой из праймерных последовательностей в каждом из образцов для каждого из ампликонов на фиг. 15 В. Число последовательностей, подсчитанное на ампликон, нормализовали к среднему числу единиц на ампликон в пределах образца. Нормализованные единицы для отдельного ампликона суммировали между А и В эмульсиями (А) для Tag5-ампликонов в эмульсии А вместе с Tag 8-ампликонами в эмульсии В и (В) для Tag5-ампликонов в эмульсии В вместе с Tag 8-ампликонами в эмульсии А. Средняя темно-серая линия представляет среднее представление каждого ампликона. Верхняя светло-серая линия представляет 2 средний охват. Нижняя светло-серая линия представляет 50% среднего представления; фиг. 17 показывает результаты из примера 6: успешная амплификация ПЦР-продукта с помощью 4 праймерного метода, разработанного для использования на секвенаторе Illumina GA II. Штрих-кодовые праймеры, представленные в табл. 14, помечают как Outer Short (внешний короткий); фиг. 18 показывает результаты из примера 8: ПЦР реакции трех пулов 10 наборов ПЦР-праймеров(А, В, С), когда ПЦР реакции проводили только для специфических к матрице праймеров и 4 праймерным способом. Присутствие продуктов с более высоким молекулярным весом в 4-праймерном методе демонстрирует успешную 4-праймерную сборку; фиг. 19 показывает результаты из примера 8: изменение соотношения внутреннего и внешнего праймеров влияет на выход в мультиплексной 4-праймерной ПЦР с применением внутренних и внешних праймеров. Подробное описание изобретения В определенных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы амплификации, в которых нуклеотидную метку(метки) и штрих-кодовую нуклеотидную последовательность добавляют к целевым нуклеотидным последовательностям. Добавленные последовательности могут затем служить в качестве праймера и/или сайтов связывания зонда. Штрих-кодовая нуклеотидная последовательность может кодировать информацию, такую как, например, источник образца, о целевой нуклеотидной последовательности, к которой она прикрепляется. Мечение и/или штриховое кодирование целевых нуклеотидных последовательностей может увеличить число образцов, которые могут быть проанализированы на одну или множество мишеней за один анализ, при этом минимизируя увеличения стоимости анализа. Способы являются особенно хорошо подходящими для увеличения эффективности анализов, проводимых на микрофлюидных устройствах. В конкретных вариантах осуществления используют способы для получения нуклеиновых кислот для ДНК-секвенирования путем, например, добавления сайтов связывания для праймеров ДНКсеквенирования, факультативно, с последующей калибровкой образца для ДНК-секвенирования. В специфических иллюстративных вариантах осуществления способ может быть использован для добавления сайтов связывания для праймеров ДНК-секвенирования в микрофлюидном устройстве, которое позволяет извлекать продукты реакции. В иллюстративных устройствах этого типа может использоваться контроль нагнетания расширением для удаления, по сути, всех продуктов реакции из микрофлюидного устройства, обеспечивая однородность между различными пулами продуктов реакции. Таким образом,можно получить пулы штрих-кодированных продуктов реакции, которые являются однородными в отношении объема и числа копий. В различных вариантах осуществления однородность объема и/или числа копий является такой, что изменчивость в отношении объема и/или числа копий каждого пула, извлеченного из устройства, составляет менее чем приблизительно 100%, менее чем приблизительно 90, менее чем приблизительно 80, менее чем приблизительно 70, менее чем приблизительно 60, менее чем приблизительно 50, менее чем приблизительно 40, менее чем приблизительно 30, менее чем приблизительно 20,менее чем приблизительно 17 или менее чем приблизительно 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2,1,5, 1 или 0,5%. Специалистам в данной области техники понятно, что изменчивость объема и/или числа копий может попадать в любой диапазон, ограниченный любым из этих значений (например, от приблизительно 2 до приблизительно 7%). В иллюстративном варианте осуществления объем образцов, извлеченных из микрофлюидного устройства, варьирует не более чем примерно на 10%. Стандартная ошибка отмеривания пипеткой составляет порядка 5-10%. Таким образом, наблюдаемая изменчивость в объемах,в основном, приписывается ошибке отмеривания пипеткой. При использовании систем и способов, описанных в данном документе, время и трудовые ресурсы, необходимые для получения библиотек секвенирования, уменьшаются по сравнению с общепринятыми методиками. Понятно, что данное изобретение не ограничивается конкретными методиками, протоколами и реагентами и т.п., описанными в данном документе, поскольку их может изменить специалист в данной области техники. Также понятно, что терминология, используемая в данном документе, используется с целью описания исключительно конкретных иллюстративных вариантов осуществления и не предусмотрена для ограничения объема данного изобретения. Также отмечают, что, как используется в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа, если только контекстом четко не продиктовано иное. Таким образом, например, отсылка к "клетке" представляет собой отсылку к одной или нескольким клеткам и их эквивалентам, известным специалистам в данной области техники. Варианты осуществления данного изобретения и их различные признаки и преимущественные детали объясняются более подробно на основании неограничивающих вариантов осуществления и примеров, которые описаны и/или проиллюстрированы в прилагаемых графических материалах и детализированы в последующем описании. Следует отметить, что признаки, проиллюстрированные в графических материалах, не обязательно изображены в масштабе, и признаки одного варианта осуществления могут быть использованы с другими вариантами осуществления, что понятно специалистам в данной области техники, даже если это четко не обозначено в данном документе. Описания хорошо известных компонентов и методов обработки могут быть опущены для того, чтобы чрезмерно не запутывать варианты осуществления данного изобретения. Определения Выражения, используемые в формуле изобретения и описании изобретения, определяются, как изложено ниже, если только не уточняется иное. Эти выражения определяют, в частности, для ясности, но все из определений соответствуют тому, как специалисты в данной области техники поймут эти выражения. Выражение "смежный" при использовании в данном документе с упоминанием двух нуклеотидных последовательностей в нуклеиновой кислоте может относится к нуклеотидным последовательностям,разделенным от 0 до приблизительно 20 нуклеотидами, более конкретно в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 10 нуклеотидами, или последовательностям, которые непосредственно примыкают друг к другу. Выражение "нуклеиновая кислота" относится к нуклеотидному полимеру и, если только не ограничено иным способом, включает известные аналоги натуральных нуклеотидов, которые могут функционировать схожим образом (например, гибридизироваться) со встречающимися в природе нуклеотидами. Выражение "нуклеиновая кислота" включает любую форму ДНК или РНК, включающую, например, геномную ДНК; комплементарную ДНК (кДНК), которая является ДНК-представлением мРНК,обычно получаемым с помощью обратной транскрипции матричной РНК (мРНК) или путем амплификации; ДНК-молекулы, полученные синтетически или путем амплификации; и мРНК. Выражение "нуклеиновая кислота" охватывает двух- или трехцепочечные нуклеиновые кислоты, а также одноцепочечные молекулы. В двух- или трехцепочечных нуклеиновых кислотах цепи нуклеиновых кислот не должны быть одинаковыми по протяженности (а именно, двухцепочечная нуклеиновая кислота не обязательно должна быть двухцепочечной вдоль всей длины обеих цепей). Выражение "нуклеиновая кислота" также охватывает любую ее химическую модификацию, например, с помощью метилирования и/или путем кэппирования. Модификации нуклеиновых кислот могут включать добавление химических групп, которые вносят дополнительный заряд, поляризуемость, водородную связь, электростатическое взаимодействие и функциональность по отношению к отдельным основаниям нуклеиновых кислот или к нуклеиновой кислоте в целом. Такие модификации могут включать модификации оснований, такие как модификации сахара в положении 2', модификации пиримидина по 5 положению, модификации пурина по 8 положению, модификации в цитозиновых экзоциклических аминах, замены 5-бром-урацила, модификации остова, необычные комбинации спаривания оснований, такие как изоосновный изоцитидин и изогуанидин, и подобное. Более конкретно, в определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты могут включать полидезоксирибонуклеотиды (содержащие 2-дезокси-D-рибозу) полирибонуклеотиды (содержащие Dрибозу) и любой другой тип нуклеиновой кислоты, который представляет собой N- или С-гликозид пуринового или пиримидинового основания, а также другие полимеры, содержащие ненуклеотидные остовы, например полиамидные (например, пептидо-нуклеиновые кислоты (PNA и полиморфолино (коммерчески доступные от Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, как Neugene) полимеры, и другие синтетические специфические к последовательности полимеры нуклеиновых кислот, при условии, что полимеры содержат нуклеооснования в конфигурации, которая позволяет осуществить спаривание оснований и стэкинг оснований, такое как имеет место в ДНК и РНК. Выражение нуклеиновая кислота также включает связанные нуклеиновые кислоты (LNA), которые описаны в патентах США 6794499, 6670461,6262490 и 6770748, которые включены в данный документ посредством ссылки в их полном объеме для их раскрытия LNA. Нуклеиновая кислота(кислоты) может быть получена в результате способа полностью химического синтеза, такого как твердофазно-опосредованный химический синтез, из биологического источника, например, путем выделения из любого вида, который продуцирует нуклеиновую кислоту, или в результате способов, которые включают манипуляцию с нуклеиновыми кислотами с помощью инструментов молекулярной биологии, таких как ДНК-репликация, ПЦР-амплификация, обратная транскрипция или комбинации этих способов. Выражение "целевые нуклеиновые кислоты" используется в данном документе для обозначения конкретных нуклеиновых кислот, подлежащих обнаружению в способах изобретения. Используемое в данном документе выражение "целевая нуклеотидная последовательность" относится к молекуле, которая включает нуклеотидную последовательность целевой нуклеиновой кислоты,такой как, например, продукт амплификации, полученный путем амплификации целевой нуклеиновой кислоты или кДНК, получаемой при обратной транскрипции РНК целевой нуклеиновой кислоты. Используемое в данном документе выражение "комплементарные" относится к способности точного спаривания между двумя нуклеотидами. А именно, если нуклеотид в данном положении нуклеиновой кислоты способен к образованию водородной связи с нуклеотидом другой нуклеиновой кислоты, то две нуклеиновые кислоты рассматриваются как комплементарные друг другу в этом положении. Комплементарность между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновой кислоты может быть "частичной", при которой только некоторые из нуклеотидов связываются, или она может быть полной, если существует полная комплементарность между одноцепочечными молекулами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновой кислоты имеет существенные влияния на эффективность и силу гибридизации между цепями нуклеиновой кислоты."Специфическая гибридизация" относится к связыванию нуклеиновой кислоты с целевой нуклеотидной последовательностью в отсутствие существенного связывания с другими нуклеотидными последовательностями, присутствующими в смеси гибридизации при установленных условиях строгости. Специалистам в данной области техники понятно, что ослабление строгости условий гибридизации позволяет допускать несовпадения последовательностей. В конкретных вариантах осуществления гибридизации проводят при строгих условиях гибридизации. Фраза "строгие условия гибридизации", как правило, относится к температуре в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 20 С или на 25 С ниже температуры плавления (Tm) для специфической последовательности при определенной ионной силе и рН. Используемая в данном документе Tm представляет собой температуру, при которой популяция двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты становится наполовину диссоциированной на отдельные цепи. Способы расчета Tm нуклеиновых кислот являются хорошо известными в данной области техники (см., например, Berger and Kimmel (1987)METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 152: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, San Diego: Academic Press, Inc. and Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ND ED., VOLS. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory), обе включены в данный документ с помощью ссылки). Как указано в стандартных ссылках простая оценка значения Tm может быть рассчитана в с помощью уравнения: Tm = 81,5+0,41 (% G+C), если нуклеиновая кислота находится в водном растворе при 1 М NaCl (см., например, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (1985. На температуру плавления гибрида (и, таким образом, условия для строгой гибридизации) влияют различные факторы, такие как длина и природа (ДНК, РНК, состав оснований) праймера или зонда и природа целевой нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК, состав оснований, присутствующие в растворе или иммобилизированные, и подобное), а также концентрация солей и других компонентов(например, присутствие или отсутствие формамида, сульфата декстрана, полиэтиленгликоля). Эффекты этих факторов являются хорошо известными и обсуждаются в стандартных справочниках в данной области техники. Иллюстративные строгие условия, пригодные для достижения специфической гибридизации большинства последовательностей, представляют собой температуру по меньшей мере приблизительно 60 С и концентрацию солей приблизительно 0,2 мол. при рН 7. Выражение "олигонуклеотид" используется в данном документе для обозначения нуклеиновой кислоты, которая является относительно короткой, как правило, короче 200 нуклеотидов, более конкретно короче 100 нуклеотидов, наиболее конкретно короче 50 нуклеотидов. Как правило, олигонуклеотиды являются одноцепочечными ДНК-молекулами. Выражение "праймер" относится к олигонуклеотиду, который способен гибридизоваться (также называемой "отжиг") с нуклеиновой кислотой и служить в качестве сайта инициации для полимеризации нуклеотидов (РНК или ДНК) при соответствующих условиях (а именно, в присутствии четырех различных нуклеозидтрифосфатов и средства для полимеризации, такого как ДНК- или РНК-полимераза или обратная транскриптаза) в соответствующем буфере и при приемлемой температуре. Соответствующая длина праймера зависит от предполагаемого использования праймера, но праймеры типично имеют длину по меньшей мере 7 нуклеотидов и более типично в диапазоне от 10 до 30 нуклеотидов или даже более типично от 15 до 30 нуклеотидов в длину. Другие праймеры могут быть немного длиннее, например 3050 нуклеотидов в длину. В этом контексте "длина праймера" относится к части олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с комплементарной "целевой" последовательностью и запускает синтез нуклеотидной последовательности. Короткие молекулы праймера, как правило, требуют более низких температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Праймер не обязательно отражает точную последовательность матрицы, но должен быть достаточно комплементарным для гибридизации с матрицей. Выражение "сайт праймера" или "сайт связывания праймера" относится к сегменту целевой нуклеиновой кислоты, с которой гибридизуется праймер. О праймере говорят, что он отжигается с другой нуклеиновой кислотой, если праймер или его часть гибридизуется с нуклеотидной последовательностью в нуклеиновой кислоте. Утверждение, что праймер гибридизуется с конкретной нуклеотидной последовательностью не подразумевает, что праймер гибридизуется либо полностью, либо исключительно с этой нуклеотидной последовательностью. Например, в определенных вариантах осуществления о праймерах амплификации, используемых в данном документе,говорят, что они "отжигаются с нуклеотидной меткой". Это описание охватывает праймеры, которые отжигаются полностью с нуклеотидной меткой, а также праймеры, которые отжигаются частично с нуклеотидной меткой и частично со смежной нуклеотидной последовательностью, например, целевой нуклеотидной последовательностью. Такие гибридные праймеры могут увеличивать специфичность реакции амплификации. Используемый в данном документе выбор праймеров "так, чтобы избежать существенного отжига с целевыми нуклеиновыми кислотами", означает, что праймеры выбирают так, чтобы большинство ампликонов, обнаруживаемых после амплификации, были "полной длины" в том смысле, что их получают в результате праймирования на предполагаемых сайтах на каждом конце целевой нуклеиновой кислоты в отличие от ампликонов, полученных в результате праймирования внутри целевой нуклеиновой кислоты,которая продуцирует более короткие, чем предполагалось ампликоны. В различных вариантах осуществления праймеры выбирают так, чтобы по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% были полной длины. Выражение "праймерная пара" относится к набору праймеров, включающему 5' "верхний праймер" или "прямой праймер", который гибридизируется с комплементарной цепью 5' конца ДНКпоследовательности, подлежащей амплификации, и 3' "нижний праймер" или "обратный праймер", который гибридизируется с 3' концом последовательности, подлежащей амплификации. Как понятно специалистам в данной области техники, выражения "верхний" и "нижний" или "прямой" и "обратный" не подразумеваются как ограничивающие, а скорее обеспечиваютиллюстративное ориентирование в конкретных вариантах осуществления."Зонд" представляет собой нуклеиновую кислоту, способную связываться с целевой нуклеиновой кислотой комплементарной последовательности посредством одного или более типов химических связей, главным образом, посредством спаривания комплементарных оснований, обычно посредством образования водородных связей, таким образом, образуя структуру дуплекса. Зонд связывается или гибридизуется с "сайтом связывания зонда". Зонд может быть помечен обнаруживаемой меткой для обеспечения легкого обнаружения зонда, в частности, сразу после того, как зонд гибридизовался с его комплементарной мишенью. Альтернативно, тем не менее, зонд может быть немеченым, но может быть обнаруживаемым с помощью специфического связывания с лигандом, который помечен либо прямо, либо опосредованно. Зонды могут значительно варьировать в размере. Как правило, зонды имеют длину по меньшей мере 7-15 нуклеотидов. Другие зонды имеют длину по меньшей мере 20, 30 или 40 нуклеотидов. Еще одни зонды являются несколько длиннее, составляя по меньшей мере 50, 60, 70, 80 или 90 нуклеотидов в длину. Еще одни зонды являются еще более длинными и составляют по меньшей мере 100, 150, 200 или более нуклеотидов в длину. Зонды могут также быть любой длины, которая находится в пределах любого диапазона, ограниченного любым из вышеуказанных значений (например, 15-20 нуклеотидов в длину). Праймер или зонд может быть абсолютно комплементарным последовательности целевой нуклеиновой кислоты или может быть менее чем абсолютно комплементарным. В определенных вариантах осуществления праймер имеет по меньшей мере 65% идентичность с комплементарной цепью целевой нуклеиновой кислоты на протяжении последовательности по меньшей мере из 7 нуклеотидов, более типично на протяжении последовательности в диапазоне 10-30 нуклеотидов и часто на протяжении последовательности по меньшей мере из 14-25 нуклеотидов и чаще имеет по меньшей мере 75% идентичность,по меньшей мере 85% идентичность, по меньшей мере 90% идентичность или по меньшей мере 95, 96,97, 98 или 99% идентичность. Следует понимать, что определенные основания (например, 3' основание праймера), как правило, желательно абсолютно комплементарны соответствующим основаниям последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Праймер и зонды типично отжигаются с целевой последовательностью при строгих условиях гибридизации. Выражение "нуклеотидная метка" используется в данном документе для обозначения предварительно определенной нуклеотидной последовательности, которую добавляют к целевой нуклеотидной последовательности. Нуклеотидная метка может кодировать единицу информации о целевой нуклеотидной последовательности, например идентичность целевой нуклеотидной последовательности или идентичность образца, из которого целевая нуклеотидная последовательность была получена. В определенных вариантах осуществления такая информация может кодироваться в одной или нескольких нуклеотидных метках, например комбинация двух нуклеотидных меток, одна на любом конце целевой нуклеотидной последовательности может кодировать идентичность целевой нуклеотидной последовательности. Используемое в данном документе выражение "штрих-кодовый праймер" относится к праймеру,который включает специфическую штрих-кодовую нуклеотидную последовательность, которая кодирует информацию об ампликоне, продуцируемом при использовании штрих-кодового праймера в реакции амплификации. Например, различный штрих-кодовый праймер может применяться для амплификации одной или нескольких целевых последовательностей из каждого из ряда различных образцов так, чтобы штрих-кодовая нуклеотидная последовательность указывала на источник образца полученных ампликонов. Используемое в данном документе выражение "реакция кодирования" относится к реакции, в которой по меньшей мере одну нуклеотидную метку добавляют к целевой нуклеотидной последовательности. Нуклеотидные метки могут быть добавлены, например, с помощью "кодирующей ПЦР", в которой по меньшей мере один праймер содержит мишень-специфичную часть и нуклеотидную метку, расположенную на 5' конце мишень-специфичной части, и второй праймер, который содержит только мишеньспецифичную часть или мишень-специфичную часть и нуклеотидную метку, расположенную на 5' конце мишень-специфичной части. Для иллюстративных примеров протоколов ПЦР, применимых для кодирующей ПЦР, см. находящуюся на рассмотрении WO заявкуUS 03/37808, а также патент США 6605451. Нуклеотидные метки могут также быть добавлены посредством любой реакции "кодирующего лигирования", которая может включать реакцию лигирования, в которой по меньшей мере один праймер содержит мишень-специфичную часть и нуклеотидную метку, расположенную на 5' конце мишеньспецифичной части, и второй праймер, который содержит только мишень-специфичную часть или мишень-специфичную часть и нуклеотидную метку, расположенную на 5' конце мишень-специфичной части. Иллюстративные реакции кодирующего лигирования описаны, например, в патентной публикации США 2005/0260640, которая тем самым включена с помощью ссылки в ее полном объеме и, в частности, для реакций лигирования. Используемая в данном документе "кодирующая реакция" производит "меченую целевую нуклеотидную последовательность", которая включает нуклеотидную метку, связанную с целевой нуклеотидной последовательностью. Используемое в данном документе в отношении части праймера выражение "мишень-специфичная" нуклеотидная последовательность относится к последовательности, которая может специфически отжигаться с целевой нуклеиновой кислотой или целевой нуклеотидной последовательностью при приемлемых условиях отжига. Используемое в данном документе в отношении части праймера выражение "специфичная к нуклеотидной метке нуклеотидная последовательность" относится к последовательности, которая может специфически отжигаться с нуклеотидной меткой при приемлемых условиях отжига. Амплификация согласно данному методу охватывает любые средства, с помощью которых репродуцируется по меньшей мере часть по меньшей мере одной целевой нуклеиновой кислоты, как правило,матрица-зависимым способом, включая без ограничений широкий диапазон методов амплификации последовательностей нуклеиновых кислот либо линейно, либо экспотенциально. Иллюстративные средства для проведения этапа амплификации включают следующее: лигазная цепная реакция (LCR), реакция лигазной детекции (LDR), лигирование с последующей Q-репликазной амплификацией, ПЦР, достройка праймера, амплификация с вытеснением цепи (SDA), амплификация с вытеснением гиперразветвленных цепей, амплификация с множественным вытеснением цепи (MDA), амплификация, основанная на цепи нуклеиновой кислоты (NASBA), двухэтапные мультиплексные амплификации, амплификация по типу катящегося колеса (RCA) и подобное, включая их мультиплексные версии и комбинации, например, без ограничений, следующее: OLA/ПЦР, ПЦР/OLA, LDR/ПЦР, ПЦР/ПЦР/LDR, ПЦР/LDR, LCR/ПЦР,ПЦР/LCR (также известная как комбинированная цепная реакция-CCR) и подобное. Описания таких техник можно найти среди других источников в Ausbel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002); Msuih etal., Genome Res. 2003 Feb.; 13(2):294-307, and Landegren et al., Science 241:1077-80 (1988), Demidov, V.,Expert Rev Mol Diagn. 2002 Nov.; 2(6):542-8., Cook et al., J. Microbiol. Methods. 2003 May; 53(2): 165-74,Schweitzer et al., Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb.; 12(l):21-7, патент США 5830,711, патент США 6027889, патент США 5686243, РСТ публикацияWO 0056927 A3 и РСТ публикацияWO 9803673 A1. В некоторых вариантах осуществления амплификация включает по меньшей мере один цикл последовательных процедур из следующего: отжиг по меньшей мере одного праймера с комплементарными или, по сути, комплементарными последовательностями по меньшей мере в одной целевой нуклеиновой кислоте; синтез по меньшей мере одной цепи нуклеотидов матрица-зависимым способом с помощью полимеразы и денатурирование новообразованных дуплексов нуклеиновых кислот с разделением цепей. Цикл может быть или не быть повторен. Амплификация может включать термоциклирование или может быть проведена изотермально. Выражение "qPCR" используется здесь для обозначения количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, которая также известна как "ПЦР в реальном времени" или "кинетическая полимеразная цепная реакция"."Реагент" в широком смысле относится к любому средству, используемому в реакции, отличному от анализируемого образца (например, анализируемой нуклеиновой кислоты). Иллюстративные реагенты для реакции амплификации нуклеиновой кислоты включают, но не ограничиваются следующим: буфер,ионы металла, полимераза, обратная транскриптаза, праймеры, матричная нуклеиновая кислота, нуклео- 10023190 тиды, метки, красители, нуклеазы и подобное. Реагенты для ферментных реакций включают, например,субстраты, кофакторы, буфер, ионы металла, ингибиторы и активаторы. Выражение "универсальный детекторный зонд" используется в данном документе для обозначения любого зонда, который определяет присутствие продукта амплификации, не обращая внимание на идентичность целевой нуклеотидной последовательности, присутствующей в продукте. Выражение "универсальный qPCR-зонд" используется в данном документе для обозначения любого такого зонда, который определяет присутствие продукта амплификации в ходе qPCR. В конкретных вариантах осуществления нуклеотидные метки согласно данному изобретению могут содержать нуклеотидную последовательность, с которой связывается детекторный зонд, такой как универсальный qPCRзонд. Если метку добавляют к обоим концам целевой нуклеотидной последовательности, то каждая метка может, при необходимости, включать последовательность, которую распознает детекторный зонд. Комбинация таких последовательностей может кодировать информацию об идентичности или источнике образца меченой целевой нуклеотидной последовательности. В других вариантах осуществления один или несколько праймеров амплификации могут содержать нуклеотидную последовательность, с которой связывается детекторный зонд, такой как универсальный qPCR-зонд. Таким образом, в ходе этапа амплификации способов данного изобретения к продукту амплификации можно добавить один, два или более сайтов связывания зонда. Специалистам в данной области техники понятно, что возможность введения множественных сайтов связывания зонда в ходе предварительной амплификации (если ее проводят) и амплификации облегчает множественное обнаружение, где могут быть обнаружены два или более различных продуктов амплификации в данной амплификационной смеси или ее аликвоте. Также подразумевается, что выражение "универсальный детекторный зонд" охватывает праймеры,меченые обнаруживаемой меткой (например, флюоресцентной меткой), а также неспецифичные для последовательности зонды, такие как ДНК-связывающие красители, включая красители для двухцепочечных ДНК, такие как SYBR Green. Выражение "мишень-специфичный qPCR-зонд" используется в данном документе для обозначенияqPCR-зонда, который определяет присутствие продукта амплификации в ходе qPCR на основании гибридизации qPCR-зонда с целевой нуклеотидной последовательностью, присутствующей в продукте."Гидролитические зонды" в целом описаны в патенте США 5210015, который включен в данный документ с помощью ссылки в его полном объеме для описания гидролитических зондов. Гидролитические зонды пользуются 5'-нуклеазной активностью, присутствующей в термостабильном ферменте Taq полимеразе, обычно используемом в ПЦР-реакции (технология зондов TaqMan, Applied Biosystems,Фостер-Сити, Калифорния). Гидролитический зонд помечен с помощью флюоресцентного детекторного красителя, такого как флюоресцеин, и акцепторного красителя или гасителя. В общем, флюоресцентный краситель ковалентно прикрепляется к 5' концу зонда, а гаситель прикрепляется к 3' концу зонда, и когда зонд является интактным, флюоресценция детекторного красителя гасится с помощью резонансного переноса энергии флюоресценции (FRET). Зонд отжигается ниже одного из праймеров, который определяет один конец целевой нуклеиновой кислоты в ПЦР-реакции. С помощью полимеразной активности Taq фермента амплификация целевой нуклеиновой кислоты управляется одним праймером, который расположен выше зонда и второго праймера, который расположен ниже зонда, но отжигается с противоположной цепью целевой нуклеиновой кислоты. По мере удлинения верхнего праймера Taq полимераза достигает участка, где меченый зонд отжигается, распознает гибрид зонд-матрицы в качестве субстрата и гидролизирует фосфодиэфирные связи зонда. Гидролитическая реакция необратимо высвобождает гасящий эффект красителя-гасителя на краситель-репортер, таким образом, приводя к увеличению детекторной флюоресценции с каждым последующим циклом ПЦР. В частности, гидролитические зонды, пригодные для применения в данном изобретении, могут быть способны обнаруживать 8-мерный или 9 мерный мотивы, которые являются обычными в геноме человека и других геномах и/или транскриптомах и могут иметь высокую Tm, равную приблизительно 70 С, обеспечиваемую путем применения аналогов связанной нуклеиновой кислоты (LNA). Используемое в данном документе выражение "метка" относится к любому атому или молекуле,которая может быть использована для обеспечения обнаруживаемого и/или количественно определяемого сигнала. В частности, метка может быть прикреплена, напрямую или опосредованно, к нуклеиновой кислоте или белку. Приемлемые метки, которые могут быть прикреплены к зондам, включают, но не ограничиваются следующим: радиоизотопы, флюорофоры, хромофоры, метки по массе, электронноплотные частицы, магнитные частицы, спиновые метки, молекулы, которые испускают хемилюминесценцию, электрохимически активные молекулы, ферменты, кофакторы и ферментные субстраты. Применяемое в данном документе выражение "краситель" в целом относится к любой органической или неорганической молекуле, которая поглощает электромагнитное излучение при длине волны, равной или более 340 нм. Применяемое в данном документе выражение "флюоресцентный краситель" в целом относится к любому красителю, который испускает электромагнитное излучение с более длинной длиной волны с помощью флюоресцентного механизма при облучении источником электромагнитного излучения, таким как лампа, фотодиод или лазер. Выражение "эластомер" имеет общее значение, используемое в данной области техники. Таким образом, например, Allcock et al. (Contemporary Polymer Chemistry, 2-е изд.) описывает эластомеры, в целом, как полимеры, существующие при температуре между их температурой стеклования и температурой сжижения. Эластомерные материалы проявляют эластические свойства, поскольку полимерные цепи легко подвергаются крутильному движению с обеспечением разматывания остовных цепей в ответ на силу, причем остовные цепи повторно сворачиваются с принятием предыдущей формы при отсутствии силы. В целом, эластомеры деформируются при приложении силы, но они возвращаются затем в их исходную форму при устранении силы."Полиморфный маркер" или "полиморфный сайт" представляет собой локус, на котором возникает дивергенция нуклеотидной последовательности. Иллюстративные маркеры имеют по меньшей мере два аллеля, каждый из которых встречается с частотой более 1% и более типично более 10 или 20% в выбранной популяции. Полиморфный сайт может иметь размер до одной пары оснований. Полиморфные маркеры включают полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP), варьирующее число тандемных повторов (VNTR), гипервариабельные участки, минисателлиты, динуклеотидные повторы, тринуклеотидные повторы, тетрануклеотидные повторы, простые повторы последовательности, элементы делеций и вставок, такие как Alu. Первая определенная аллельная форма произвольно обозначается как эталонная форма, и другие аллельные формы обозначаются как альтернативные или вариантные аллели. Аллельная форма, встречающаяся наиболее часто в выбранной популяции, иногда имеет название "форма дикого типа". Диплоидные организмы могут быть гомозиготными или гетерозиготными по аллельным формам. Диаллельный полиморфизм имеет две формы. Триаллельный полиморфизм имеет три формы."Однонуклеотидный полиморфизм" (SNP) возникает на полиморфном сайте, занятом одним нуклеотидом, который является сайтом изменчивости между аллельными последовательностями. Сайту обычно предшествует и после него следует высококонсервативные последовательности аллеля (например, последовательности, которые варьируют у менее чем 1/100 или 1/1000 членов популяций). SNP обычно возникает из-за замещения одного нуклеотида на другой на полиморфном сайте. Транзиция представляет собой замещение одного пурина на другой пурин или одного пиримидина на другой пиримидин. Трансверсия представляет собой замещение пурина на пиримидин или наоборот. SNP могут также возникать в результате делеции нуклеотида или вставки нуклеотида относительно эталонного аллеля. Способы амплификации В общем плане В конкретных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ амплификации для введения множества (например, по меньшей мере трех) выбранных нуклеотидных последовательностей в одну целевую нуклеиновую кислоту или несколько целевых нуклеиновых кислот. Способ включает амплификацию множества целевых нуклеиновых кислот, как правило, во множестве образцов. В иллюстративных вариантах осуществления один и тот же набор целевых нуклеиновых кислот может быть амплифицирован в каждом из двух или более различных образцов. Образцы могут отличаться друг от друга любым образом, например образцы могут быть из различных тканей, субъектов, источников окружающей среды и т.п. По меньшей мере три праймера могут быть использованы для аплификации каждой целевой нуклеиновой кислоты, а именно: прямой и обратный праймеры амплификации, причем каждый праймер включает мишень-специфичную часть, и один или оба праймера включают нуклеотидную метку. Мишень-специфичные части могут специфично отжигаться с мишенью при приемлемых условиях отжига. Нуклеотидная метка для прямого праймера может иметь последовательность, которая является такой же или отличной от нуклеотидной метки для обратного праймера. Как правило, нуклеотидные метки располагаются на 5' мишень-специфичных частей. Третий праймер представляет собой штрихкодовый праймер, содержащий штрих-кодовую нуклеотидную последовательность и специфичную к первой или второй нуклеотидной метке часть. Штрих-кодовая нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность, выбранную для того, чтобы кодировать информацию о продуцируемом ампликоне при использовании штрих-кодового праймера в реакции амплификации. Меткаспецифичная часть может специфично отжигаться с одной или обеими нуклеотидными метками в прямом и обратном праймерах. Штрих-кодовый праймер находится, как правило, на 5' метка-специфичной части. Штрих-кодовый праймер, как правило, присутствует в амплификационной смеси в избытке по отношению к прямому и/или обратному праймеру(праймерам). Более специфически, если штрих-кодовый праймер отжигается с нуклеотидной меткой в прямом праймере, то штрих-кодовый праймер, как правило, присутствует в избытке по отношению к прямому праймеру. Если штрих-кодовый праймер отжигается с нуклеотидной меткой в обратном праймере, то штрих-кодовый праймер, как правило, присутствует в избытке по отношению к обратному праймеру. В каждом случае третий праймер в амплификационной смеси, а именно обратный праймер или прямой праймер соответственно, может присутствовать в иллюстративных вариантах осуществления в концентрации, приблизительно сходной с таковой для штрихкодового праймера. Как правило, штрих-кодовый праймер присутствует в существенном избытке. Например, концентрация штрих-кодового праймера в амплификационных смесях может быть по меньшей мере 2-кратная, по меньшей мере 4-кратная, по меньшей мере 5-кратная, по меньшей мере 10-кратная, по меньшей мере 15-кратная, по меньшей мере 20-кратная, по меньшей мере 25-кратная, по меньшей мере 30-кратная, по меньшей мере 35-кратная, по меньшей мере 40-кратная, по меньшей мере 45-кратная, по меньшей мере 50-кратная, по меньшей мере 100-кратная, по меньшей мере 500-кратная, по меньшей мере 103-кратная, по меньшей мере 5103-кратная, по меньшей мере 104-кратная, по меньшей мере 5104 кратная, по меньшей мере 105-кратная, по меньшей мере 5105-кратная, по меньшей мере 106-кратная или выше по отношению к концентрации прямого и/или обратного праймера(праймеров). Кроме того,концентрационный избыток штрих-кодового праймера может попадать в любой диапазон, имеющий любое из вышеперечисленных значений в качестве предельных значений (например, от 2-кратной до 105 кратной). В иллюстративных вариантах осуществления, если штрих-кодовый праймер имеет меткаспецифичную часть, которая является специфичной для нуклеотидной метки на прямом праймере, то прямой праймер может присутствовать в концентрациях от пикомолярной до наномолярной, например приблизительно 5 пМ - 500 нМ, приблизительно 5 пМ -100 нМ, приблизительно 5 пМ - 50 нМ, приблизительно 5 пМ - 10 нМ, приблизительно 5 пМ - 5 нМ, приблизительно 10 пМ - 1 нМ, приблизительно 50 приблизительно 500 пМ, приблизительно 100 пМ или любой другой диапазон, имеющий любое из этих значений в качестве предельных значений (например, от 10 до 50 пМ). Приемлемые, иллюстративные концентрации штрих-кодового праймера, которые могут быть использованы в комбинации с любой из этих концентраций прямого праймера, включают от приблизительно 10 нМ до приблизительно 10 мкМ,от приблизительно 25 нМ до приблизительно 7,5 мкМ, от приблизительно 50 нМ до приблизительно 5 мкМ, от приблизительно 75 нМ до приблизительно 2,5 мкМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 мкМ, от приблизительно 250 до приблизительно 750 нМ, приблизительно 500 нМ или любой другой диапазон, имеющий любое из этих значений в качестве предельных значений (например, 100-500 нМ). В реакциях амплификации, использующих такие концентрации прямого и штрих-кодового праймеров, обратный праймер имеет концентрацию такого же порядка, как и штрих-кодовый праймер (например, в пределах приблизительно 10-кратной, в пределах приблизительно 5-кратной или равную). Каждая амплификационная смесь может подвергаться амплификации с получением целевых ампликонов, содержащих меченые целевые нуклеотидные последовательности, где каждая содержит первую и вторую нуклеотидные метки, фланкирующие целевую нуклеотидную последовательность, и по меньшей мере одну штрих-кодовую нуклеотидную последовательность на 5' или 3' конце целевого ампликона (относительно одной цепи целевого ампликона). В определенных вариантах осуществления первую и вторую нуклеотидные метки и/или штрих-кодовую нуклеотидную последовательность выбирают так, чтобы избежать существенного отжига с целевыми нуклеиновыми кислотами. В таких вариантах осуществления меченые целевые нуклеотидные последовательности могут включать молекулы, имеющие следующие элементы: 5'-(штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-(первая нуклеотидная метка из прямого праймера)-(целевая нуклеотидная последовательность)-(последовательность второй нуклеотидной метки из обратного праймера)-3'- или 5'-(первая нуклеотидная метка из прямого праймера)-(целевая нуклеотидная последовательность)-(последовательность второй нуклеотидной метки из обратного праймера)-(штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-3'. В иллюстративных вариантах осуществления штрих-кодовая нуклеотидная последовательность определяет конкретный образец. Таким образом, например, набор из Т целевых нуклеиновых кислот может быть амплифицирован в каждом из S образцов, где S и Т представляет собой целые числа, как правило,более единицы. В таких вариантах осуществления амплификация может быть проведена отдельно для каждого образца, где один и тот же набор из прямого и обратного праймеров используют для каждого образца и набор из прямого и обратного праймеров имеет по меньшей мере одну нуклеотидную метку,которая является общей для всех праймеров в наборе. Для каждого образца можно использовать различный штрих-кодовый праймер, где штрих-кодовые праймеры имеют различные штрих-кодовые нуклеотидные последовательности, но одну и ту же метка-специфичную часть, которая может отжигаться с общей нуклеотидной меткой. Этот вариант осуществления имеет преимущество перед уменьшением числа различных праймеров, которые необходимо было бы синтезировать для кодирования источника образца в продуцируемых ампликонах для множества целевых последовательностей. Альтернативно, для каждого образца можно использовать различные наборы из прямых и обратных праймеров, где каждый набор имеет нуклеотидную метку, которая является отличной от праймеров в другом наборе, и для каждого образца используют различные штрих-кодовые праймеры, где штрих-кодовые праймеры имеют различные штрих-кодовые нуклеотидные последовательности и различные метка-специфичные части. В любом случае амплификация дает набор Т ампликонов от каждого образца, который несет образецспецифичные штрих-коды. В вариантах осуществления, где одинаковый набор прямого и обратного праймеров используют для каждого образца, прямой и обратный праймеры для каждой мишени можно изначально объединить отдельно от образца и каждый штрих-кодовый праймер можно изначально объединить с его соответствующим образцом. Аликвоты изначально объединенных прямого и обратного праймеров можно затем добавить к аликвотам изначально объединенных образцов и штрих-кодового праймера с получением ST амплификационных смесей. Эти амплификационные смеси можно сформировать в любом продукте, который можно подвергнуть условиям, приемлемым для амплификации. Например, амплификационные смеси можно сформировать в или распределить в отдельные компартменты микрофлюидного устройства до амплификации. Приемлемые микрофлюидные устройства включают в иллюстративных вариантах осуществления микрофлюидные устройства матричного типа, такие как те, что описаны ниже. Любой способ амплификации может быть использован для получения ампликонов из амплификационных смесей. В иллюстративных вариантах осуществления используют ПЦР. Амплификацию, как правило, проводят в течение по меньшей мере трех циклов для введения первой и второй нуклеотидных меток и штрих-кодовой нуклеотидной последовательности. В различных вариантах осуществления амплификацию проводят в течение 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 циклов или в течение любого числа циклов, попадающего в диапазон, имеющий любое из этих значений в качестве предельных значений(например, 5-10 циклов). В конкретных вариантах осуществления амплификацию проводят в течение достаточного числа циклов с нормализацией числа копий целевого ампликона во всех мишенях и во всех образцах (например, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 циклов или в течение любого числа циклов, попадающего в диапазон, имеющий любое из этих значений в качестве предельных значений). Конкретные варианты осуществления описанного выше способа обеспечивают, по сути, однородную амплификацию, дающую на выходе множество целевых ампликонов, где основная часть ампликонов присутствует на уровне, относительно близком к среднему числу копий, рассчитанному для множества целевых ампликонов. Таким образом, в различных вариантах осуществления по меньшей мере 50,по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 91, по меньшей мере 92, по меньшей мере 93, по меньшей мере 94, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов. Данное изобретение также обеспечивает в определенных вариантах осуществления способ амплификации множества целевых нуклеотидов, в которых штриховое кодирование, факультативно, опускают и целевые нуклеотидные последовательности метят после амплификации. Более специфически, данное изобретение обеспечивает способ амплификации множества целевых нуклеиновых кислот, обычно во множестве образцов, который включает получение амплификационной смеси для каждой целевой нуклеиновой кислоты. Каждая амплификационная смесь включает прямой праймер, включающий мишеньспецифичную последовательность, и обратный праймер, включающий мишень-специфичную последовательность. Амплификационные смеси подвергают амплификации с получением множества целевых нуклеотидных последовательностей. Целевые нуклеотидные последовательности затем метят с получением множества целевых ампликонов, где каждый включает первую и/или вторую нуклеотидные метки, фланкирующие целевую нуклеотидную последовательность. Этот способ дает множество целевых ампликонов, где по меньшей мере 50% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов. В различных вариантах осуществления этого способа по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 91, по меньшей мере 92, по меньшей мере 93, по меньшей мере 94,по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов. В различных вариантах осуществления амплифицированная целевая нуклеотидная последовательность может быть длиной, например, 25 оснований, 50, 100, 200, 500 или 750 оснований. В определенных вариантах осуществления описанных выше способов можно использовать способ амплификации длинных фрагментов, такой как ПЦР длинных фрагментов, с получением ампликонов из амплификационных смесей. ПЦР длинных фрагментов позволяет проводить амплификацию целевых нуклеотидных последовательностей, находящихся в диапазоне от одного или нескольких тысяч нуклеотидов (т.н.) до свыше 50 т.н. В различных вариантах осуществления целевые нуклеотидные последовательности, которые амплифицируют с помощью ПЦР длинных фрагментов, составляют по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 т.н. в длину. Целевые нуклеотидные последовательности могут также попадать в любой диапазон, имеющий любое из этих значений в качестве предельных значений (например, 25 оснований - 100 оснований или 5-15 т.н.). Применение ПЦР длинных фрагментов в описанных выше способах может в некоторых вариантах осуществления давать на выходе множество целевых ампликонов, где по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65 или по меньшей мере 70% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий целевых ампликонов и менее 2-кратного от среднего числа копий целевых ампликонов. ПЦР длинных фрагментов является хорошо известной в данной области техники. См., например,Cheng S., Fockler С., Barnes W.M., Higuchi R. (June 1994). "Effective amplification of long targets fromcloned inserts and human genomic DNA". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (12): 5695-9. Ферменты, протоколы и наборы для ПЦР длинных фрагментов, которые пригодны для применения в способах, описанных здесь, являются коммерчески доступными; примеры включают SequalPrep Long PCR Kit (Invitrogen,США), PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase (Stratagene), Phusion DNA polymerases, Phusion FlashHigh Fidelity PCR Master Mix (Finnzymes). В определенных вариантах осуществления целевые ампликоны можно извлечь из амплификационных смесей. Например, микрофлюидное устройство матричного типа, которое адаптировано для обеспечения извлечения содержимого каждой реакционной камеры (см. ниже) может быть использовано для амплификации с образованием целевых ампликонов. В модификациях этих вариантов осуществления целевые ампликоны могут быть подвергнуты дальнейшей амплификации и/или анализу. Например, один целевой амплкон или несколько целевых ампликонов могут подвергаться амплификации с помощью праймеров, специфичных для первой и второй нуклеотидных меток с получением целевого ампликона, в котором отсутствует штрих-кодовая нуклеотидная последовательность. В определенных вариантах осуществления количество полученных целевых ампликонов в амплификационных смесях можно количественно оценить в ходе амплификации с помощью количественной ПЦР в реальном времени или после нее. В конкретных вариантах осуществления описанные выше способы амплификации используют для получения ампликонов, пригодных для автоматизированного ДНК-секвенирования. В частности, способность способов обеспечивать, по сути, однородную амплификацию, как описано выше, целевых нуклеотидных последовательностей, является полезной при получении библиотек ДНК-секвенирования,имеющих хороший охват. В контексте автоматизированного ДНК-секвенирования выражение "охват" относится к количеству раз, которое последовательность измеряют при секвенировании. Библиотека ДНК-секвенирования, которая имеет, по сути, однородный охват, может давать на выходе данные о последовательности, где охват также, по сути, будет однородным. Таким образом, в различных вариантах осуществления при проведении автоматизированного секвенирования множества целевых ампликонов,полученных, как описано здесь, последовательностей по меньшей мере из 50% целевых ампликонов присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий последовательностей целевого ампликона и менее 2-кратного от среднего числа копий последовательностей целевого ампликона. В различных вариантах осуществления этого способа по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90,по меньшей мере 91, по меньшей мере 92, по меньшей мере 93, по меньшей мере 94, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% последовательностей целевого ампликона присутствуют в количестве более 50% от среднего числа копий последовательностей целевого ампликона и менее 2-кратного от среднего числа копий последовательностей целевого ампликона. Получение нуклеиновых кислот для ДНК секвенирования Многие существующие методики ДНК-секвенирования основываются на "секвенировании синтезом". Эти методики включают создание библиотеки, широкомасштабную параллельную ПЦРамплификацию молекул библиотеки и секвенирование. Создание библиотеки начинается с превращения нуклеиновых кислот образца в фрагменты, имеющие соответствующий размер, лигирования адапторных последовательностей на концы фрагментов и отбора молекул, правильно присоединенных к адаптерам. Присутствие адапторных последовательностей на концах молекул библиотеки позволяет осуществить амплификацию вставок случайных последовательностей. Лигирование можно заменить на описанные выше способы мечения нуклеотидных последовательностей с введением адапторных последовательностей, как описано более детально ниже. В конкретных вариантах осуществления число молекул ДНК библиотеки, получаемых на этапе широкомасштабной параллельной ПЦР, является достаточно низким, что шанс того, что две молекулы, связанные с одинаковым субстратом, например одинаковой гранулой (в 454 секвенировании ДНК) или одинаковым поверхностным "пятном" (в Solexa секвенировании ДНК), является низким, но достаточно высоким, чтобы выход амплифицированных последовательностей был достаточным, что обеспечить высокую производительность. Как обсуждается дополнительно ниже, после введения приемлемых адапторных последовательностей можно провести цифровую ПЦР с калибровкой числа молекул ДНК библиотеки до секвенирования с помощью синтеза. Добавления праймеров ДНК-секвенирования к нуклеиновым кислотам ДНК, подлежащим секвенированию, могут быть любым типом ДНК. В конкретных вариантах осуществления ДНК представляет собой геномную ДНК из организма. В модификациях таких вариантов осуществления для секвенирования готовят общую геномную ДНК, полученную из образца, взятого из организма или из ДНКбиблиотеки. Как описано выше, по меньшей мере три праймера используют для подготовки ДНК для секвенирования: прямой, обратный и штрих-кодовый праймеры. Тем не менее, один или несколько из прямого праймера, обратного праймера и штрих-кодового праймера включают по меньшей мере один дополни- 15023190 тельный сайт связывания праймера. В специфических вариантах осуществления штрих-кодовый праймер включает, по меньшей мере, первый дополнительный сайт связывания праймера выше штрих-кодовой нуклеотидной последовательности, которая расположена выше специфичной к первой нуклеотидной метке части. В определенных вариантах осуществления два из прямого праймера, обратного праймера и штрих-кодового праймера включают по меньшей мере один дополнительный сайт связывания праймера(а именно, так, чтобы ампликон, продуцируемый при амплификации, включал последовательности нуклеотидной метки, штрих-кодовую нуклеотидную последовательность и два дополнительных сайта связывания). Например, если штрих-кодовый праймер включает первый дополнительный сайт связывания праймера выше штрих-кодовой нуклеотидной последовательности, то в специфических вариантах осуществления обратный праймер может включать, по меньшей мере, второй дополнительный сайт связывания праймера ниже второй нуклеотидной метки. Амплификация затем дает на выходе молекулу, имеющую следующие элементы: 5'-(первый дополнительный сайт связывания праймера)-(штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-(первая нуклеотидная метка из прямого праймера)-(целевая нуклеотидная последовательность)-(вторая нуклеотидная метка из обратного праймера)-(второй дополнительный сайт связывания праймера)-3'. В специфических вариантах осуществления первый и второй дополнительные сайты связывания праймера способны связываться праймерами ДНК-секвенирования с облегчением секвенирования всего ампликона, включающего штрих-код, который может, как обсуждается выше, указывать на источник образца. В некоторых вариантах осуществления можно использовать более трех праймеров для добавления необходимых элементов к целевой нуклеотидной последовательности. Например, можно использовать четыре праймера для получения молекул, имеющих такие же пять элементов, как обсуждались выше,плюс факультативный дополнительный штрих-кодовый например, 5'-(первый дополнительный сайт связывания праймера)-(штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-(первая нуклеотидная метка из прямого праймера)-(целевая нуклеотидная последовательность)-(вторая нуклеотидная метка из обратного праймера)-(дополнительная штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-(второй дополнительный сайт связывания праймера)-3'. В иллюстративном четырех-праймерном варианте осуществления прямой праймер включает мишень-специфичную часть и первую нуклеотидную метку, а обратный праймер включает мишень-специфичную часть и вторую нуклеотидную метку. Вместе эти два праймера составляют "внутренние праймеры". Оставшиеся два праймера представляют собой "внешние праймеры", которые отжигаются с первой и второй нуклеотидными метками, присутствующими во внутренних праймерах. Один внешний праймер представляет собой штрих-кодовый праймер, который может содержать, по меньшей мере, первый дополнительный сайт связывания праймера выше штрих-кодовой нуклеотидной последовательности, которая находится выше специфичной к первой нуклеотидной метке части (а именно, такой же штрих-кодовый праймер, как и обсуждаемый в предыдущем абзаце). Второй внешний праймер может включать вторую метка-специфичную часть, дополнительную штрих-кодовую нуклеотидную последовательность и ниже ее второй дополнительный сайт связывания праймера. Амплификация с введением элементов из более чем трех праймеров может быть проведена за одну или множество реакций амплификации. Например, четырехпраймерная амплификация может быть проведена за одну реакцию амплификации, в которой присутствуют все четыре праймера. Альтернативно,четырехпраймерная амплификация может быть проведена, например, за две реакции амплификации: одна для введения внутренних праймеров и отдельная реакция амплификации для введения внешних праймеров. Если все четыре праймера присутствуют в одной реакции амплификации, то внешние праймеры,как правило, присутствуют в реакционной смеси в избытке. Значения относительных концентраций,данные выше для штрих-кодового праймера относительно прямого и/или обратного праймеров, также применяют для относительных концентраций внешних праймеров относительно внутренних праймеров в одноэтапной, четырехпраймерной реакции амплификации. В иллюстративном варианте осуществления четырехпраймерной реакции амплификации каждый из внешних праймеров содержит уникальный штрих-код. Например, один штрих-кодовый праймер будет состоять из элементов 5'-(первый дополнительный сайт связывания праймера)-(первая штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-(первая нуклеотидная метка)-3', а второй штрих-кодовый праймер будет состоять из элементов 5'-(второй дополнительный сайт связывания праймера)-(вторая штрихкодовая нуклеотидная последовательность)-(вторая нуклеотидная метка)-3'. В этом варианте осуществления ряд (J) первых штрих-кодовых праймеров может быть скомбинирован с рядом (K) вторых штрихкодовых праймеров ссозданием JK уникальных продуктов амплификации. В дальнейшем иллюстративном варианте осуществления данного изобретения в одной реакции можно скомбинировать более четырех праймеров для добавления различных комбинаций дополнительных сайтов связывания праймера, штрих-кодовых последовательностей и нуклеотидных меток. Например, внешние штрих-кодовые праймеры, содержащие следующие элементы: 5'-(первый дополнительный сайт связывания праймера)-(первая штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-(первая нуклеотидная метка)-3',5'-(первый дополнительный сайт связывания праймера)-(первая штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-(вторая нуклеотидная метка)-3',5'-(второй дополнительный сайт связывания праймера)-(первая штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-(первая нуклеотидная метка)-3',5'- 16023190(второй дополнительный сайт связывания праймера)-(первая штрих-кодовая нуклеотидная последовательность)-(вторая нуклеотидная метка)-3', можно скомбинировать с внутренними мишеньспецифичными праймерами, как описано выше, с получением пулов продуктов амплификации, содержащих все комбинации штрих-кодовых праймеров с необходимой последовательностью ампликона. В других иллюстративных вариантах осуществления данного изобретения внешние штрих-кодовые праймеры в любой из комбинаций, описанных выше, или других комбинациях, которые могут быть очевидными для специалиста в данной области техники, могут быть скомбинированы с более чем одной парой целевых праймерных последовательностей, несущих такую же первую и вторую последовательности нуклеотидной метки. Например, внутренние праймеры, содержащие до десяти различных последовательностей мишень-специфичных прямых праймеров, комбинированных с одинаковой первой нуклеотидной меткой, и до десяти различных последовательностей мишень-специфичных обратных праймеров,комбинированных с одинаковой второй нуклеотидной меткой, могут быть скомбинированы с до 2 или до 4 внешними штрих-кодовыми праймерами с созданием множественных продуктов амплификации, как описано выше. В различных вариантах осуществления по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 500, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 2000, по меньшей мере 5000 или по меньшей мере 10000 различных мишеньспецифичных праймерных пар, несущих одинаковую первую нуклеотидную метку и вторую нуклеотидную метку, будут объединяться с до 2 или до 4 внешними штрих-кодовыми праймерами с созданием множественных продуктов амплификации. Способы данного изобретения могут включать ДНК-секвенирование по меньшей мере одного целевого ампликона с помощью любого доступного способа ДНК-секвенирования. В конкретных вариантах осуществления множество целевых ампликонов секвенируют с помощью способа высокопроизводительного секвенирования. Такие способы обычно используют этап клонирования in vitro для амплификации отдельных ДНК-молекул. Эмульсионная ПЦР (эПЦР) выделяет отдельные ДНК-молекулы вместе с покрытыми праймером гранулами в водных каплях в масляной фазе. ПЦР продуцирует копии ДНКмолекулы, которые связываются с праймерами на грануле с последующей иммобилизацией для последующего секвенирования. эПЦР используют в способах по Marguilis et al. (коммерциализированный 454Life Sciences, Брэнфорд, Коннектикут), Shendure and Porreca et al. (также известный как "полонисеквенирование") и SOLiD секвенирование (Applied Biosystems Inc., Фостер-Сити, Канада). См. М. Margulies, et al. (2005) "Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors" Nature 437: 376380; J. Shendure, et al. (2005) "Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome" Science 309 (5741): 1728-1732. Клональную амплификацию in vitro можно также провести с помощью"bridge PCR", где фрагменты амплифицируют на праймерах, прикрепленных к твердой поверхности. Braslavsky et al. разработали одномолекулярный способ (коммерциализированный Helicos Biosciences Corp.,Кембридж, Массачусетс), который опускает этот этап амплификации, напрямую фиксируя ДНК молекулы на поверхности. I. Braslavsky, et al. (2003) "Sequence information can be obtained from single DNA molecules" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100: 3960-3964. ДНК молекулы, которые физически связаны с поверхностью, можно секвенировать параллельно. При "секвенировании синтезом" электрофоретическое секвенирование с использованием красителеподобного терминатора, используют ДНК-полимеразу для определения последовательности оснований. В методах обратимых терминаторов (коммерциализированный Illumina, Inc., Сан-Диего, Калифорния иHelicos Biosciences Corp., Кембридж, Массачусетс) используют обратимые варианты красителейтерминаторов, добавляя один нуклеотид за раз, и обнаружение флюоресценции в каждом положении в реальном времени путем повторяемого удаления блокирующей группы с возможностью осуществления полимеризации другого нуклеотида. При "пиросеквенировании" также используют ДНК полимеризацию,добавляя один нуклеотид за раз и обнаруживая и количественное определяя число нуклеотидов, добавленных в данном положении посредством света, излучаемого при высвобождении прикрепленных пирофосфатов (коммерциализированный 454 Life Sciences, Бренфорд, Коннектикут). См. М. Ronaghi, et al.(1996). "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release" Analytical Biochemistry 242: 8489. Подготовка образца с помощью цифровой ПЦР В некоторых вариантах осуществления образцы загружают в устройство для амплификации, например планшет для ПЦР или микрофлюидное устройство, при концентрациях образца с содержанием в среднем менее одной матрицы амплификации на лунку или камеру. Каждую лунку или камеру в устройстве готовят так, чтобы она содержала приемлемые меченые мишень-специфичные праймеры и уникальную комбинацию прямого и обратного штрих-кодовых праймеров. Например, одна лунка может содержать штрих-кодовые праймеры, содержащие элементы 5'-(первый дополнительный сайт связывания праймера)-(первая штрих-кодовая последовательность)-(первая нуклеотидная метка)-3',5'-(второй дополнительный сайт связывания праймера)-(вторая штрих-кодовая последовательность)-(вторая нуклеотидная метка)-3'. Вторая лунка или камера может содержать штрих-кодовые праймеры, содержащие элементы 5'-(первый дополнительный сайт связывания праймера)-(третья штрих-кодовая последовательность)(первая нуклеотидная метка)-3',5'-(второй дополнительный сайт связывания праймера)-(четвертая штрих- 17023190 кодовая последовательность)-(вторая нуклеотидная метка)-3'. Продукты амплификации, продуцируемые в каждой лунке, будут помечены уникальным образом комбинациями штрих-кодовых последовательностей, загруженных в эти лунки. Калибровка образца с помощью цифровой ПЦР В конкретных вариантах осуществления число продуцируемых целевых ампликонов, например, из ДНК библиотеки, с помощью описанных выше способы, можно откалибровать с помощью способа цифровой амплификации. Этап находит конкретное применение при подготовке ДНК для секвенирования синтезом. Для обсуждений "цифровой ПЦР" см., например, Vogelstein and Kinzler, 1999, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 96:9236-41; McBride et al., публикации заявки на патент США 20050252773, особенно пример 5 (каждая из этих публикаций тем самым включена посредством ссылки в их полном объеме, и, в частности, для раскрытий в них цифровой амплификации). Способы цифровой амплификации могут применять устройства для определенных высокопроизводительных методик, приемлемые для цифровой ПЦР, такие как микрофлюидные устройства, обычно включающие большое количество и/или высокую плотность реакционных зон небольшого объема (например, реакционные зоны или реакционные камеры нанообъема). В иллюстративных вариантах осуществления цифровую амплификацию проводят с помощью микрофлюидного устройства, такого как микрофлюидные устройства Digital Array, описанные ниже. Цифровая амплификация может включать распределение или разделение образца среди от сотен до тысяч реакционных смесей, расположенных в реакционной/аналитической платформе или микрофлюидном устройстве. В таких вариантах осуществления предельное разведение образца делают во всем большом числе отдельных реакций амплификации так, чтобы большинство реакций не содержало матричных молекул и давало отрицательный результат амплификации. При подсчете числа положительных результатов амплификации, например, в конечной точке реакции, подсчитывают отдельные матричные молекулы, присутствующие во вводимых друг за другом образцах. Главное преимущество цифровой амплификации состоит в том, что количественное определение не зависит от изменений в эффективности амплификации - успешные амплификации подсчитываются как одна молекула, независимо от действительного количества продукта. В определенных вариантах осуществления цифровая амплификация может быть проведена после предварительной амплификации образцов нуклеиновых кислот. Обычно, предварительную амплификацию перед цифровой амплификацией проводят в течение ограниченного числа термических циклов (например, 5 циклов или 10 циклов). В определенных вариантах осуществления число термических циклов в ходе предварительной амплификации может находиться в диапазоне от приблизительно 4 до 15 термических циклов или приблизительно 4-10 термических циклов. В определенных вариантах осуществления число термических циклов может составлять 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более 15. Типичный этап предварительной амплификации можно заменить на описанную выше амплификацию с получением ампликонов, содержащих адапторные последовательности, для секвенирования ДНК. Способы цифровой амплификации описаны в публикации заявки на патент США 20090239308,опубликованной 24 сентября 2009 г., которая тем самым включена посредством ссылки в ее полном объеме и, в частности, для раскрытия в ней способов и устройств цифровой амплификации. Как правило, в цифровой амплификации идентичные (или, по сути, сходные) реакции амплификации проводят на образце нуклеиновой кислоты, таком как геномная ДНК. Число отдельных реакций для данного образца нуклеиновой кислоты может варьировать от приблизительно 2 до свыше 1000000. Типично, число реакций, проводимых на образце, составляет приблизительно 100 или больше, более типично приблизительно 200 или больше и даже более типично приблизительно 300 или больше. Можно также провести крупномасштабную цифровую амплификацию, в которой число реакций, проводимых на образце, составляет приблизительно 500 или больше, приблизительно 700 или больше, приблизительно 765 или больше, приблизительно 1000 или больше, приблизительно 2500 или больше, приблизительно 5000 или больше, приблизительно 7500 или больше или приблизительно 10000 или больше. Число проводимых реакций может также быть значительно выше, например в пределах приблизительно 25000, в пределах приблизительно 50000, в пределах приблизительно 75000, в пределах приблизительно 100000, в пределах приблизительно 250000, в пределах приблизительно 500000, в пределах приблизительно 750000, в пределах приблизительно 1000000 или даже более чем 1000000 анализов на геномный образец. В конкретных вариантах осуществления количество нуклеиновой кислоты, подвергаемой цифровой амплификации, как правило, выбирают такое, чтобы при распределении в отдельные реакционные смеси каждая отдельная реакция амплификации, как ожидается, включала одну или меньше способных к амплификации нуклеиновых кислот. Специалист в данной области техники может определить концентрацию продуцируемого целевого ампликона(ампликонов), как описано выше, и рассчитать соответствующее количество для использования в цифровой амплификации. Более удобно может быть проанализирован набор серийных разведений целевого ампликона(ампликонов). Например, устройство, которое коммерчески доступно от Fluidigm Corp. как микрофлюидное устройство 12.765 Digital Array, позволяет одновременно тестировать 12 различных разведений. Факультативно, приемлемое разведение может быть определено путем создания графика линейной регрессии. Для оптимального разведения линия должна быть прямой и проходить через нулевую точку. В дальнейшем концентрация исходных образцов может быть рассчитана из графика. Соответствующее количество целевого ампликона(ампликонов) может быть распределено в дискретные ячейки или реакционные лунки или камеры так, чтобы каждая реакция включала, например, в среднем не более приблизительно одного ампликона на объем. Целевой ампликон(ампликоны) можно объединить с реагентами, выбранными для количественной или неколичественной амплификации, до распределения или после него. После распределения реакционные смеси подвергают амплификации для определения тех реакционных смесей, которые содержали целевой ампликон. Можно использовать любой способ амплификации, но удобнее использовать ПЦР, например ПЦР в реальном времени или ПЦР с детекцией по конечной точке. Данная амплификация может использовать любые праймеры, способные к амплификации целевого ампликона(ампликонов). Таким образом, в конкретных вариантах осуществления праймеры могут быть праймерами ДНК-секвенирования, которые отжигаются с сайтами связывания праймеров, введенными на предыдущем этапе амплификации. Концентрация любого целевого ампликона (копий/мкл) коррелирует с числом положительных (а именно, содержащих продукт амплификации) реакционных смесей. См. одновременно рассматриваемую заявку на патент США 12/170414, имеющую название "Method and Apparatus for Determining CopyNumber Variation Using Digital PCR" ("Способ и аппарат для определения изменения числа копий с помощью цифровой ПЦР"), которая включена посредством ссылки для всех целей, и, в частности, для анализа результатов цифровой ПЦР. Также см. Dube et al., 2008, "Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic Device" PLoS ONE 3(8): e2876.doi:10,1371/journal.pone.0002876, которая включена посредством ссылки для всех целей, и, в частности,для анализа результатов цифровой ПЦР. В иллюстративном варианте осуществления калибровки образца для ДНК-секвенирования с помощью цифровой ПЦР ПЦР-реакционную смесь, содержащую ориентировочно 100-360 ампликонов на 1 мкл, можно загрузить на микрофлюидное устройство Digital Array, такое как микрофлюидное устройство 12.765 Digital Array от Fluidigm Corporation (Саут Сан Франциско, Калифорния), описанное ниже. Микрофлюидный чип имеет 12 панелей и каждая панель содержит 765 камер. Панели повторностей на цифровом чипе могут быть проанализированы для того, чтобы получить абсолютное количественное определение первоначальной концентрации библиотеки. Разведенные образцы, имеющие типичные относительные коэффициенты вариаций (между повторностями) в пределах 9-12% (или ниже) могут быть использованы для секвенирования. См., например, White III R.A., Blainey P.C., Fan C.H., Quake S.R. "DigitalPCR provides sensitive and absolute calibration for high throughput sequencing" BMC Genomics 10:116 doi: 10.1186/1471 -2164-10-116. Нуклеиновые кислоты-образцы Препараты нуклеиновых кислот ("образцы") могу быть получены из биологических источников и подготовлены с помощью традиционных способов, известные из уровня техники. В частности, ДНК или РНК, пригодные в способах, описанных в данном документе, могут быть экстрагированы и/или амплифицированы из любого источника, включая бактерии, простейшие, грибы, вирусы, органеллы, а также организмы, такие как растения или животные, в частности млекопитающие и более конкретно люди. Приемлемые нуклеиновые кислоты могут также быть получены из источников окружающей среды (например, прудовой воды), из созданных человеком продуктов (например, пищи), из образцов криминалистической практики и подобного. Нуклеиновые кислоты могут быть экстрагированы или амплифицированы из клеток, жидкостей организма (например, крови, фракции крови, мочи и т.п.) или тканевых образцов с помощью любой из ряда стандартных методик. Иллюстративные образцы включают образцы плазмы, сыворотки, спинальной жидкости, лимфы, перитонеальной жидкости, плевральной жидкости,жидкости ротовой полости и внешних частей кожи; образцы из респираторного, пищеварительного и мочевыделительного трактов; образцы слез, слюны, клеток крови, стволовых клеток или опухолей. Например, образцы фетальной ДНК могут быть получены из эмбриона или из материнской крови. Образцы могут быть получены из живого или мертвого организмов или из культур in vitro. Иллюстративные образцы могут включать отдельные клетки, залитые парафином образцы ткани и пункционные биопсии. Нуклеиновые кислоты, пригодные в данном изобретении, могут также быть получены из одной или нескольких библиотек нуклеиновых кислот, включая кДНК, космидные, YAC,ВАС, Р 1, РАС библиотеки и подобное. Нуклеиновые кислоты, представляющие интерес, могут быть выделены с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, при этом выбор специфического способа зависит от источника, природы нуклеиновой кислоты и подобных факторов. Нуклеиновые кислоты-образцы не обязательно должны быть в чистой форме, но они обычно являются достаточно чистыми, чтобы позволить провести этапы амплификации способов данного изобретения. Если целевые нуклеиновые кислоты представляют собой РНК, то РНК можно обратно транскрибировать в кДНК с помощью стандартных способов, известных в области техники и как описано, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., MolecularCloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989). кДНК можно затем проанализировать согласно способам данного изобретения. Целевые нуклеиновые кислоты Любая целевая нуклеиновая кислота, которая может быть помечена в реакции кодирования данного изобретения (описанной в данном документе), может быть обнаружена с помощью способов данного изобретения. В типичных вариантах осуществления по меньшей мере некоторая информация о нуклеотидной последовательности будет известна для целевых нуклеиновых кислот. Например, если используемая реакция кодирования представляет собой ПЦР, то достаточная информация о последовательности, как правило, доступна для каждого конца данной целевой нуклеиновой кислоты с тем, чтобы позволить разработать приемлемые праймеры амплификации. В альтернативном варианте осуществления мишень-специфичные последовательности в праймерах могут быть замещены на случайные или дегенеративные нуклеотидные последовательности. Мишени могут включать, например, нуклеиновые кислоты, связанные с патогенами, такими как вирусы, бактерии, простейшие или грибы; молекулы РНК, например, такие, для которых сверх или недостаточная экспрессия является определяющей в заболевании, такие, которые экспрессируются тканеспецифичным или специфичным для стадии развития образом; или такие, которые индуцируются конкретными стимулами; геномную ДНК, которую можно проанализировать на специфические полиморфизмы(такие как SNP), аллели или гаплотипы, например, при генотипировании. Особый интерес представляют геномные ДНК, которые изменяются (например, амплифицируются, удаляются и/или мутируют) при генетических заболеваниях или других патологиях; последовательности, которые связаны с желательными или нежелательными признаками; и/или последовательности, которые уникальным образом определяют особь (например, при криминалистических определениях или определениях отцовства). Конструкция праймеров Праймеры, приемлемые для амплификации нуклеиновых кислот, являются достаточно длинными для запуска синтеза продуктов удлинения в присутствии средства для полимеризации. Точная длина и состав праймера будет зависеть от многих факторов, включая, например, температуру реакции отжига,источник и состав праймера, и при использовании зонда - близость сайта отжига зонда к сайту отжига праймера и соотношение концентрации праймер:зонд. Например, в зависимости от сложности последовательности целевой нуклеиновой кислоты олигонуклеотидный праймер обычно содержит в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 30 нуклеотидов, хотя он может содержать больше или меньше нуклеотидов. Праймеры должны быть достаточно комплементарными для избирательного отжига с их соответствующими цепями и образования стабильных дуплексов. Специалист в данной области техники знает, как выбрать соответствующие праймерные пары для амплификации целевой нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Например, ПЦР-праймеры могут быть сконструированы с помощью использования любого коммерчески доступного программного обеспечения или открытого программного обеспечения, такого какwww.broad.mit.edu/node/1060 и подобное) или с помощью доступа к сайту UPL Roche. Последовательности ампликонов вводят в программу Primer 3 с последовательностями зонда UPL в скобках для обеспечения того, что программа Primer 3 будет конструировать праймеры на любой стороне заключенной в скобки последовательности зонда. Праймеры могут быть получены с помощью любого приемлемого способа, включая, например,клонирование и рестрикцию соответствующих последовательностей или прямой химический синтез с помощью способов, таких как фосфотриэфирный способ Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; фосфодиэфирный способ Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; диэтилфосфорамидитный способ Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; способ на твердой подложке по патенту США 4458066 и подобное, или могут быть обеспечены из коммерческого источника. Праймеры можно очистить с помощью колонки Sephadex (Amersham Biosciences, Inc., Пискатавэй,Нью Джерси) или других способов, известных специалистам в данной области техники. Очистка праймеров может улучшить чувствительность способов данного изобретения. Микрофлюидные устройства В определенных вариантах осуществления любой из способов данного изобретения может быть выполнен с использованием микрофлюидного устройства. В иллюстративных вариантах осуществления устройством является микрофлюидное устройство матричного типа, которое допускает совместную комбинацию множества субстратных растворов с реагентными растворами в отдельных изолированных реакционных камерах. Понятно, что субстратный раствор может содержать один или множество субстратов, а реагентный раствор может содержать один или множество реагентов. Например, микрофлюидное устройство допускает совместную попарную комбинацию множества различных амплификационных праймеров и образцов. В определенных вариантах осуществления устройство сконфигурировано для содержания различной комбинации праймеров и образцов в каждой из различных камер. В других вариантах осуществления количество отдельных реакционных камер может быть больше 50, обычно больше 100, чаще больше 500, еще чаще больше 1000, а иногда больше 5000 или больше 10000. В конкретных вариантах осуществления микрофлюидным устройством матричного типа является микрофлюидное устройство Dynamic Array ("DA"), пример которого показан на фиг. 1. DA микрофлю- 20023190 идное устройство является микрофлюидным устройством матричного типа, предназначенным для выделения попарных комбинаций образцов и реагентов (например, амплификационных праймеров, детекторных зондов и т.п.) и подходящее для выполнения качественных и количественных ПЦР реакций, включая количественный ПЦР анализ в реальном времени. В некоторых вариантах осуществления DA микрофлюидное устройство изготовлено, по меньшей мере частично, из эластомера. DA микрофлюидные устройства описаны в РСТ публикации WO 05107938 A2 ("Термическое реакционное устройство и способ его применения") и в публикации патентной заявки США US 20050252773 A1, обе включенные в данный документ ссылкой во всей своей полноте для описаний DA микрофлюидных устройств. DA микрофлюидные устройства могут включать высокоплотные матричные решения, которые используют жидкостную связь между слоями микрофлюидного устройства для соединения контрольных линий и линий текучей среды через устройство и между слоями. Благодаря линиям текучей среды в нескольких слоях эластомерного блока возможны системы высокоплотных реакционных ячеек. Альтернативно, DA микрофлюидные устройства могут быть сконструированы так, что все каналы и для реагентов, и для образцов находятся в одном эластомерном слое, а контрольные каналы - в другом слое. Публикация патента США 2008/0223721 и РСТ публикация WO 05/107938 A2 описывают иллюстративные устройства матричного типа, которые могут быть использованы для осуществления способов, описанных в данном документе. Фиг. 21, воспроизведенная как фиг. 1, показывает иллюстративное матричное решение, имеющее первый эластомерный слой 2110 (1-й слой) и второй эластомерный слой 2120 (2-й слой), каждый из которых имеет выполненные в них флюидные каналы. Например, флюидный канал для реагента в первом слое 2110 соединен с флюидным каналом для реагента во втором слое 2120 через 2130, тогда как второй слой 2120 также имеет каналы для образца, каналы для образца и каналы для реагентов заканчиваются в камерах для образцов и реагентов 2180 соответственно. Камеры для образцов и реагентов 2180 находятся в жидкостной связи друг с другом через канал сопряжения 2150, который имеет клапан сопряжения 2140, связанный с ним для контроля жидкостной связи между каждой из камер 2180 реакционной ячейки 2160. При использовании сопряжение сначала закрыто, затем реагент вводится в канал для реагента из входа для реагента, а образец вводится в канал для образца через вход для образца; затем клапаны удержания 2170 закрываются для изолирования каждой реакционной ячейки 2160 от других реакционных ячеек 2160. Как только реакционные ячейки 2160 изолированы, клапан сопряжения 2140 открывается, чтобы камера для образца и реагентная камера находились в жидкостной связи друг с другом так, чтобы могла произойти требуемая реакция. Из этого будет очевидно (и из описания в WO 05/107938A2), что DA микрофлюидное устройство может быть использовано для реагирования М количества различных образцов с N количеством различных реагентов. Хотя DA микрофлюидные устройства, описанные выше в WO 05/107938, хорошо подходят для проведения способов, описанных в данном документе, данное изобретение не ограничивается какимлибо конкретным устройством или решением. Может быть использовано любое устройство, которое разделяет образец и/или предусматривает независимые попарные комбинации реагентов и образца. Публикация патента США 20080108063 (которая настоящим включена посредством ссылки во всей своей полноте) включает диаграмму, иллюстрирующую устройство 48.48 Dynamic Array IFC (Integrated FluidicCircuit), коммерчески доступное от Fluidigm Corp. (Южный Сан-Францииско, Калифорния). Будет понятно, что возможны и предполагаются другие конфигурации, такие как, например, 4896; 9696; 30120 и т.п. В специфических вариантах осуществления микрофлюидным устройством может быть микрофлюидное устройство Digital Array, которое адаптировано для выполнения цифровой амплификации. Такие устройства могут иметь встроенные каналы и клапаны, которые разделяют смеси образца и реагентов в реакционные камеры нанолитрового объема. В некоторых вариантах осуществления микрофлюидное устройство Digital Array изготовлено, по меньшей мере частично, из эластомера. Иллюстративные микрофлюидные устройства Digital Array описаны в находящихся на рассмотрении патентных заявках США заявителя Fluidigm, Inc., таких как патентная заявка США 12/170,414, под названием "Способ и устройство для определения вариации количества копий с использованием цифровой ПЦР". Один иллюстративный вариант осуществления имеет 12 портов ввода, соответствующих 12 отдельным вводам для образца в устройство. Устройство может иметь 12 панелей, а каждая из 12 панелей может содержать 765 6 нл реакционных камер с общим объем 4,59 мкл на панель. Микрофлюидные каналы могут соединять различные реакционные камеры на панелях с источниками текучей среды. Давление может быть применено к накопителю для открытия и закрытия клапанов, соединяющих реакционные камеры с источниками текучей среды. В иллюстративных вариантах осуществления 12 входов могут быть обеспечены для загрузки смеси реагента с образцом. 48 входов могут быть использованы для обеспечения источника реагентов, которые подаются на биочип, когда на накопитель оказывают давление. Кроме того, два или несколько входов могут быть обеспечены для гидратации биочипа. Гидратационные входы находятся в жидкостной связи с устройством для облегчения контроля влажности, связанным с реакционными камерами. Как будет понятно специалисту в данной области, некоторые эластомерные материалы, которые могут использоваться в изготовлении устройства, являются газопроницаемыми, позволяющими испа- 21023190 рившимся газам или пару из реакционных камер проходить сквозь эластомерный материал в окружающую атмосферу. В конкретном варианте осуществления линии текучей среды, расположенные на периферических частях устройства, обеспечивают защиту в виде гидратационной жидкости, например буфер или мастер-микс на периферических частях биочипа, окружая панели реакционных камер, таким образом, снижая или предотвращая испарение жидкостей, присутствующих в реакционных камерах. Таким образом, влажность на периферических частях устройства может быть снижена добавлением летучей жидкости, например воды, на гидратационные входы. В конкретном варианте осуществления первый вход находится в жидкостной связи с линиями гидратационной текучей среды, окружающими панели на одной стороне биочипа, а второй вход находится в жидкостной связи с линиями гидратационной текучей среды, окружающими панели на другой стороне биочипа. Тогда как микрофлюидные устройства Digital Array хорошо подходят для выполнения способов цифровой амплификации, описанных в данном документе, специалист в данной области определит много вариаций и альтернатив этим устройствам. Микрофлюидное устройство, которым является 12.765 Dynamic Array, коммерчески доступно от Fluidigm Corp. (Саут Сан-Франциско, Калифорния), включает 12 панелей, каждая имеет 765 реакционных камер с объемом 6 нл на реакционную камеру. Однако эта геометрия не нужна для способов цифровой амплификации, описанных в данном документе. Геометрия данного микрофлюидного устройства Digital Array будет зависеть от конкретного применения. Дополнительное описание устройств, приемлемых для использования в способах, описанных в данном документе, представлены в публикации патентной заявки США 2005/0252773, включенной в данный документ ссылкой, для раскрытия микрофлюидных устройств Digital Array. В определенных вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, могут быть выполнены с использованием микрофлюидного устройства, которое обеспечивает извлечение продуктов реакции. Такие устройства детально описаны в находящейся на рассмотрении патентной заявке США 61/166105, поданной 2 апреля 2009 г., которая настоящим включена ссылкой во всей своей полноте специально для описания микрофлюидных устройств, которые позволяют извлекать продукт реакции, и соответствующих способов. Например, способ цифровой ПЦР для калибровки образцов ДНК перед секвенированием может быть выполнен на таких устройствах, позволяющих извлечение продуктов амплификации, которые затем могут служить матрицами для ДНК секвенирования. Фиг. 2 является упрощенным перспективным изображением несущего элемента и микрофлюидного устройства согласно варианту осуществления данного изобретения. Как показано на фиг. 2, несущий элемент 100 служит опорой для микрофлюидного устройства 110, которое также может быть названо микрофлюидным устройством Digital Array. Несущий элемент 100 может быть выполнен из материалов,обеспечивающих приемлемую механическую поддержку для различных элементов несущего элемента. Например, несущий элемент делают с использованием пластического или другого приемлемого материала. Внешняя часть несущего элемента имеет ту же опорную поверхность, что и стандартный 384 луночный микропланшет, и делает возможной работу автономного клапана. Кроме того, несущий элемент 100 является совместимым с традиционными автономными устройствами организации термических циклов. Как описано ниже, имеется 48 портов ввода образца 120, расположенных на одной стороне несущего элемента 100, и 48 портов ввода химического реактива 122, расположенных на противоположной стороне несущего элемента. Блоки портов ввода образца 120 и портов ввода химического реактива 122 углублены по отношению к верхней части несущего элемента. С помощью этих особенностей углубления одновременно ко всем портам ввода образца или портам ввода химического реактива может быть приложено давление, приводящее в движение текучие среды, присутствующие в соответствующих портах, по линиям 140 текучей среды, соединяющим порты ввода и либо сквозные перемычки, либо линии ввода текучей среды, либо их сочетания, присутствующие в микрофлюидном устройстве 110. Образцы могут включать закодированные праймеры и химические реактивы, которые также могут быть названы ампликон-специфическими (AS) праймерами. Носитель 100 также включает четыре источника 130, 132, 134 и 136, которые могут быть использованы для приведения в действие контрольных линий, присутствующих в микрофлюидном устройстве. В варианте осуществления источники 130, 132 и 134 используются для нагнетания давления в контрольные линии, действующие с открытием и закрытием клапанов, присутствующих в микрофлюидном устройстве. Например, применение давления, большего чем атмосферное давление, к источнику 132 будет приводить к подаче жидкости, присутствующей в источнике 132, в контрольные линии, присутствующие в микрофлюидном устройстве, тем самым, приводя в действие клапаны, действующие с преграждением потока через одну или несколько линий ввода текучей среды, также присутствующие в микрофлюидном устройстве. В варианте осуществления источник 130 используется как лунка для текучей среды, содержащая собирающий реагент. Давление может быть применено к источнику 130, принуждая собирающий реагент течь по линиям текучей среды, обеспеченным на несущем элементе, к линиям текучей среды,обеспеченным в микрофлюидном устройстве. Таким образом, приложение давления к источнику 130 может привести к потоку собирающего реагента или другой приемлемой текучей среды через микрофлюидное устройство. Контрольные линии, которые находятся в жидкостной связи с источниками 130136, могут включать контрольные линии для клапанов сопряжения, клапанов удержания, клапанов, ис- 22023190 пользуемых для контроля нагнетания расширением, линии текучей среды для потока собирающего реагента или подобное. В конкретном варианте осуществления клапан 1 контролируется источником 132,клапан 2 контролируется источником 134, собирающий реагент обеспечивается в источнике 130, а гидратационный реагент обеспечивается в источнике 136. В этом конкретном варианте осуществления клапаны сопряжения контролируются источником 150, а клапаны удержания контролируются источником 152. Этот конкретный вариант осуществления не предназначен для ограничения данного изобретения, а исключительно обеспечивает пример одной конфигурации. Другие конфигурации могут быть использованы как подходящие для конкретных применений. Как описано более подробно в отношении фиг. 3, линии текучей среды 140, присутствующие на несущем элементе 100, находятся в жидкостной связи с одной или несколькими линиями текучей среды,присутствующими в микрофлюидном устройстве 110. Эти линии текучей среды могут служить для переноса текучих сред в и из микрофлюидного устройства или могут быть использованы как контрольные линии для приведения в действие клапанов, присутствующих в микрофлюидном устройстве. Таким образом, текучие среды, обеспеченные в портах ввода образца 120 или портах ввода химического реактива 122, могут наполнять подходящие линии ввода текучей среды и камеры микрофлюидного устройства. Другие текучие среды (например, жидкости), обеспеченные в источниках 130-136, также могут быть загружены или в линии ввода текучей среды, или в контрольные линии микрофлюидного устройства. Продукты реакции из камер микрофлюидного устройства могут быть возвращены, поскольку они нагнетаются через линии текучей среды в микрофлюидное устройство, обратно в линии текучей среды 140, присутствующие на несущем элементе, и в порты ввода образца или химического реактива 120 или 122. Накопители давления 150 и 152 могут быть использованы для повышения давления в других контрольных линиях, для обеспечения гидратации микрофлюидного устройства, или они могут не использоваться в некоторых вариантах осуществления. Хотя 48 портов ввода образца и 48 портов ввода химического реактива показаны в варианте осуществления данного изобретения, показанном на фиг. 2, это не является необходимым для данного изобретения. В других вариантах осуществления используются различные количества образцов и химических реактивов в зависимости от конкретного применения. Специалист в данной области определит многие вариации, модификации и альтернативы. Фиг. 3 является упрощенной схематической диаграммой микрофлюидного устройства согласно варианту осуществления данного изобретения. Микрофлюидное устройство 200 включает сквозные перемычки 210, соединенные с линиями ввода текучей среды 212, которые используются для обеспечения путей тока текучих сред для 24 различных образцов. 24 образца, которые могут быть загружены в подгруппу портов ввода образца 120, показанных на фиг. 1, текут через сквозные перемычки 210 и линии ввода текучей среды 212 к линиям ввода образца 312 и в конечном итоге в камеры для образца 310, как показано на фиг. 4. Микрофлюидное устройство 200 также включает сквозные перемычки 220, соединенные с линиями ввода текучей среды 222, которые используются для обеспечения путей тока текучих сред для 21 различного химического реактива. Сквозная перемычка 250 на стороне микрофлюидного устройства, противоположной линиям ввода текучей среды химического реактива, обеспечивает гидратацию, приведение в действие контрольной линии или другие приемлемые операции. Матричная часть 230 микрофлюидного устройства показана (частично) на фиг. 4. В матричной части 230 образцы и химические реактивы загружаются в камеры для образца и химического реактива, а затем могут быть смешаны для образования попарных комбинаций. Как описано более подробно в настоящем описании, после того как образцы и химические реактивы смешаны и подвергнуты реакции, продукты реакции могут быть извлечены из микрофлюидного устройства путем протекания текучей среды для извлечения через линии ввода текучей среды 212, через матричную часть 230 микрофлюидного устройства, как показано на фиг. 4, и через выпускные линии текучей среды 240 и сквозные перемычки 242. Эти выпускные линии текучей среды находятся в жидкостной связи с выпускными портами, обеспеченными на несущем элементе. Таким образом, продукты реакции, объединенные из комбинации образца с каждым из различных химических реактивов, отдельно обеспечиваются через каждую из независимых выпускных линий текучей среды 240. Конкретное количество линий ввода образца и химического реактива, показанных на фиг. 3, представлены исключительно в качестве примера, и конкретные варианты осуществления не ограничены этими конкретными количествами. В других вариантах осуществления обеспечивают дополнительные линии ввода образца и химического реактива для облегчения дополнительных попарных комбинаций образцов и химических реактивов в микрофлюидном устройстве. Фиг. 4 является упрощенной схематической диаграммой микрофлюидного устройства с несколькими элементарными ячейками, показанного на фиг. 3. На фиг. 4 четыре элементарные ячейки из матричной части 230 показаны для ясности. Линии ввода образца 316 находятся в жидкостной связи с линиями ввода текучей среды 212, а линии ввода химического реактива 318 находятся в жидкостной связи с линиями ввода химического реактива 222, как показано на фиг. 3. Секция элементарных ячеек микрофлюидного устройства включает камеры для образца 310 и камеры для химического реактива 312. Линии текучей среды 314 обеспечивают жидкостную связь между камерами для образца и камерами для химического реактива, когда клапаны сопряжения 330 находятся в открытом положении. В конкретном вари- 23023190 анте осуществления линии ввода образца 316 обеспечивают в слое микрофлюидного устройства, лежащем под слоем, содержащим камеры для образца. Подобным образом, линии ввода химического реактива 318 обеспечивают в слое микрофлюидного устройства, лежащем под слоем, содержащим камеры для образца. Образцы текут от линий ввода образца 212, показанных на фиг. 3, к линия ввода образца 316 и через одну или несколько сквозных перемычек (не показано), идущих от линий ввода образца 316 к камерам для образца 310. Хотя линии ввода образца 316 показаны ветвящимися на три линии ввода, поскольку текучая среда проходит в камеры для образца, то это конкретное количество не является необходимым для данного изобретения, и могут быть использованы другие количества линий ввода образца,например, 1 линия ввода, 2, 4 или больше 4 линий ввода образца. Схожие критерии дизайна применимы к трем линиям текучей среды 314, соединяющим камеры для образца и соответствующие камеры для химического реактива. Линии ввода образца 316 обеспечивают путь непрерывного тока в направлении рядов фигуры, позволяя отдельному образцу распределиться равномерно между множественными камерами для образца, например между верхним набором камер для образца или нижним набором камер для образца. С использованием клапанов сопряжения 330 и клапанов удержания 340 каждая из камер для образца может быть отделена от любой другой камеры для образца, а также от камер для химического реактива. Камеры для химического реактива могут быть отделены от других камер для химического реактива с использованием клапанов удержания. И разделительные клапаны, и клапаны удержания приводятся в действие применением давления в соответствующей контрольной линии, присутствующей на несущем элементе, или другими средствами, например электростатическое приведение в действие. Фиг. 4 иллюстрирует линии ввода 318 химического реактива, которые обеспечивают поток химического реактива из линий ввода 222 химического реактива, показанных на фиг. 3, в камере 312 для химического реактива. Когда клапаны удержания находятся в открытом положении, химические реактивы могут течь из линий ввода химического реактива в камеры 312 для химического реактива. В конкретном варианте осуществления химические реактивы текут через сквозные перемычки, соединяющие линии ввода и камеры для химического реактива, способом, подобным наполнению камер для образца. Загрузка химических реактивов вдоль колонок микрофлюидного устройства обеспечивает отличный химический реактив для каждого ряда образцов, приводя в результате к МN попарным комбинациям. Открытие клапанов сопряжения 330 дает возможность образцам и химическим реактивам смешиваться в попарных комбинациях путем свободной межфазной диффузии. После смешивания образцов и химических реактивов может быть выполнено термоциклирование для образования продуктов реакции. Продукты реакции извлекают из микрофлюидного устройства открытием клапана 350 для сбора, которые дают возможность продуктам реакции течь в части 360 линий ввода образца расположенных рядом с камерами для образца. С помощью линий ввода 316 образца и находящихся внутри насосов (не показано) продукты реакции текут по линиям ввода образца по направлению к портам для извлечения на несущем элементе. В варианте осуществления, показанном на фиг. 4, образцы загружаются с одной стороны микрофлюидного устройства. Химические реактивы загружаются с прилежащей стороны микрофлюидного устройства. После обработки собирающий реагент вводится с первой стороны устройства с помощью линий ввода образца, а продукты реакции выходят из микрофлюидного устройства из линий текучей среды, проходящих по направлению к стороне микрофлюидного устройства, противоположной первой стороне. В этом варианте осуществления оставшаяся сторона микрофлюидного устройства не используется для загрузки образца или химического реактива или выгрузки продукта реакции. Другие конфигурации включены в объем данного изобретения, а образцовые конфигурации показаны на фиг. 4, представленные исключительно для примера. Специалист в данной области определит многие вариации, модификации и альтернативы. Преимущество, обеспеченное системами, описанными в данном документе, заключается в том, что объем образцов и химических реактивов, используемых в реакциях, фиксирован, независимо от объема пипетки, дозируемого в порты ввода образца и порты ввода химического реактива. Если объем в портах ввода образца и/или химического реактива выше установленного порога, достаточного для заполнения линий ввода образца/химического реактива и камер для образца/химического реактива, тогда применение давления к портам ввода образца/химического реактива приведет к полному наполнению камер для образца/химического реактива. Полностью наполненные камеры, таким образом, обеспечивают фиксированный реакционный объем, что не доступно с традиционными техниками титрационных микропланшетов. Хотя системы разработаны данным заявителем для выполнения многих одновременных анализов связывания, включая, но без ограничения, иммунологические эксперименты, такие как ИФА-анализы,варианты осуществления данного изобретения обеспечивают "внутренний" контроль нагнетания расширением, а также отдельные камеры для образца и камеры химических реактивов. Таким образом, попарные комбинации образцов и химических реактивов возможны с использованием вариантов осуществления, описанных в данном документе, которые не возможны с ранее разработанными техниками. Дополнительное описание анализов связывания представлено в публикации патентной заявки США 2007/0074972, поданной 13 сентября 2006 г., раскрытие которой настоящим включено ссылкой во всей своей полноте для всех целей. Варианты осуществления данного изобретения обеспечивают систему, приемлемую для получения ПЦР образцов, которая показывает снижение стоимости, времени и усилий при получении ампликоновых библиотек из входящей ДНК матрицы. В типичном случае применения первая амплификация будет использоваться для образования библиотек для секвенирования следующего поколения. С использованием вариантов осуществления данного изобретения образцы и закодированные праймеры комбинируются с ампликон-специфическими (AS) праймерами для создания смеси, которая приемлема для требуемых реакций. Исходя из МN строения микрофлюидного устройства, каждый из М образцов комбинируется с каждым из N AS праймеров (а именно, химических реактивов) для образования МN попарных комбинаций. То есть один реакционный сайт обеспечивается для каждой пары образца и химического реактива. После завершения реакции (например, ПЦР) продукты реакции извлекают из системы, обычно с использованием собирающего реагента, который течет по микрофлюидному устройству. В конкретном варианте осуществления продукты реакции, связанные с каждым образцом, извлекают в отдельный реакционный пул, обеспечивая последующую обработку или исследование пула, содержащего данный образец, реагировавший с каждым их различных химических реактивов. Таким образом, в вариантах осуществления, описанных в данном документе, представлено микрофлюидное устройство, в котором независимые вводы образцов комбинируют с вводами праймеров в МN конфигурации расстановки. Таким образом, каждая реакция является уникальной комбинацией конкретного образца и конкретного праймера. Как описано более подробно в данном описании, образцы загружаются в камеры для образца в микрофлюидном устройстве через линии ввода образца, организованные как колонки в одном варианте осуществления. AS праймеры или химические реактивы загружаются в камеры для химического реактива в микрофлюидном устройстве через линии ввода химического реактива, организованные как ряды, пересекающие колонки. Камеры для образца и камеры для химического реактива находятся в жидкостном разъединении во время загрузки. После завершения процесса загрузки клапан сопряжения, препятствующий движению линии текучей среды между парами камер образца и химического реактива, открывается, чтобы обеспечить свободную межфазную диффузию попарных комбинаций образцов и химических реактивов. Определенная смесь образцов и химических реактивов обеспечивает реакцию между различными попарными комбинациями, производя продукт реакции,включая серию специфических ПЦР реакций, для которых каждый образец эффективно закодирован уникальным штрихкодом. Продукты реакции собирают и могут затем использовать для последующих процессов секвенирования. Выражения "химический реактив" и "образец", как используется в данном документе, являются описанием конкретных применений устройств в некоторых вариантах осуществления. Однако применения устройств не ограничены применением "образца(образцов)" и "химического реактива(химических реактивов)" во всех вариантах осуществления. Например, в других вариантах осуществления "образец(образцы)" может относиться к "первому реагенту" или множеству "первых реагентов", а "химический реактив (химические реактивы)" может относиться ко "второму реагенту" или множеству "вторых реагентов". МN характеристика устройств дает возможность комбинации любой серии первых реагентов быть скомбинированными с любой серией вторых реагентов. Согласно одному конкретному процессу, выполненному с использованием варианта осуществления данного изобретения, после 25 циклов ПЦР продукты реакции из МN попарных комбинаций будут извлечены из микрофлюидного устройства в отдельные пулы, один для каждого из M образцов. Типично,отдельные пулы содержатся в порте ввода образца, обеспеченном на несущем элементе. В некоторых процессах продукты реакции могут быть собраны на основе "на ампликон" для целей стандартизации. Используя варианты осуществления данного изобретения, можно достичь результатов (для повторных экспериментов, составленных из тех же вводимых растворов образцов и химических реактивов), для которых количество копий продуктов амплификации варьирует не более чем на 25% в образце и не более чем на 25% между образцами. Таким образом, продукты амплификации, извлеченные из микрофлюидного устройства, будут типичными образцами для ввода, как измерено распределением специфических известных генотипов. Предпочтительно выпускная концентрация образца будет составлять более 2000 копий/ампликон/мкл, а извлечение продуктов реакции будет выполняться менее чем за 2 ч. Применения, в которых могут быть использованы варианты осуществления данного изобретения,включают получение ампликона, готового для использования в секвенаторе, и получение ПЦР длинных фрагментов ампликоновой библиотеки. Для получения ампликона, готового для использования в секвенаторе, могут быть использованы комбинированные протоколы для прямого праймера и 3-праймера. Фиг. 5 А является упрощенной схематической диаграммой микрофлюидного устройства согласно другому варианту осуществления данного изобретения. Микрофлюидное устройство, показанное на фиг. 5 А, имеет общие особенности, а также отличия от микрофлюидного устройства, показанного на фиг. 2. Образцы загружаются в микрофлюидное устройство через 48 сквозных перемычек и соответствующих линий ввода образца, обеспеченных на одном краю микрофлюидного устройства (а именно, нижний край на фиг. 5 А). Образцы текут по линиям ввода образца в матричную часть 430 микрофлюидного устройст- 25023190 ва. Химические реактивы загружаются из сквозных перемычек и линий ввода химического реактива на двух сторонах микрофлюидного устройства (а именно, левая и правая стороны на фиг. 5 А). Дополнительное обсуждение элементарных ячеек, присутствующих в матричной части 430, представлено в отношении фиг. 6. Продукты реакции удаляются через линии ввода образца и извлекаются в портах ввода образца 120, обеспеченных на несущем элементе 100. Таким образом, на фиг. 5 А загрузка образцов и извлечение продуктов реакции показаны как подача через нижнюю сторону микрофлюидного устройства. Фиг. 5 В является упрощенной схематической диаграммой частей микрофлюидного устройства, показанного на фиг. 5 А. Части, показанные на фиг. 5 В, включают линии ввода 410 образца, линии ввода химического реактива для четных химических реактивов (линии ввода 420 химического реактива), линии ввода химического реактива для нечетных химических реактивов (линии ввода 422 химического реактива) и линии ввода 430 собирающего реагента. В варианте осуществления линии ввода 410 образца находятся в жидкостной связи со скозными перемычками 412, которые находятся на одной линии с линиями ввода 140 образца, которые находятся в жидкостной связи с портами ввода образца 120, как показано на фиг. 2. В других вариантах осуществления обеспечивают дополнительные линии ввода образца (не показано) для обеспечения возможности жидкостной связи между портами ввода образца 120 и линиями ввода 410 образца. Таким образом, воздействие давлением на блок портов ввода образца будет давать поток различных образцов в показанные линии ввода 410 образца. Как указано в отношении фиг. 6 ниже, линии ввода образца 410 находятся в жидкостной связи с линиями ввода образца 516 и камерами для образца 510, присутствующими в микрофлюидном устройстве. Для матрицы с 48 камерами для образца и 48 камерами для химического реактива 48 линии ввода образца 410, показанные на фиг. 5 В, будут обеспечивать образцы для 48 отдельных колонок камер для образца, две из которых показаны на фиг. 6. Следует отметить, что различные линии текучей среды, показанные на фиг. 5 В, могут быть встроены в несущий элемент 100, встроены в микрофлюидное устройство 110 или присутствовать в одной или нескольких других структурах, в зависимости от конкретного воплощения. Таким образом, иллюстрация линий ввода образца 410 на фиг. 5 В не предназначена ограничивать объем данного изобретения, а исключительно иллюстрировать линии текучей среды, пригодные для обеспечения контролированного потока текучей среды в различные камеры микрофлюидного устройства. В варианте осуществления четные линии ввода химического реактива 420 и нечетные линии ввода химического реактива 422 находятся в жидкостной связи со сквозными перемычками 424, которые находятся на одной линии с линиями ввода химического реактива 140, которые находятся в жидкостной связи с портами ввода химического реактива 122, как показано на фиг. 2. В других вариантах осуществления дополнительные линии ввода химического реактива (не показано) обеспечены для предоставления возможности жидкостной связи между портами ввода химического реактива 122 и линиями ввода химического реактива 420 и 422. Таким образом, воздействие давлением на блок портов ввода химического реактива 122 приведет к подаче различных химических реактивов в показанные линии ввода химического реактива. После подачи через линии ввода, показанные на фиг. 5 В, различные текучие среды будут, в конечном итоге, попадать в элементарные ячейки, показанные на фиг. 6. Как обсуждалось выше, различные линии текучей среды могут быть встроены в несущий элемент,микрофлюидное устройство или другую приемлемую структуру. В конфигурации расстановки 48 образцов 48 химических реактивов 24 четные линии ввода химического реактива 420 обеспечат вводы в половину из рядов линий ввода химического реактива 518, показанных на фиг. 6. 24 нечетные линии ввода химического реактива 422 будут обеспечивать вводы в половину из рядов линий ввода химического реактива 518, показанных на фиг. 6. Таким образом, хотя загрузка химических реактивов показана только с правой стороны матрицы на фиг. 6, в фактическом варианте осуществления химические реактивы типично будут загружаться с обеих сторон в четной/нечетной конфигурации. В некоторых вариантах осуществления обеспечивают дополнительные сквозные перемечки для загрузки гидратационных текучих сред или подобного. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления для обеспечения совместимости с существующими несущими элементами некоторые линии текучей среды неиспользованы или модифицированы для обеспечения такой совместимости. Линия ввода 430 собирающего реагента обеспечивает собирающий реагент, используемый при извлечении продуктов реакции из микрофлюидного устройства. Линия ввода 430 для собирающего реагента, показанная на фиг. 5 В, находится в жидкостной связи с портом ввода собирающего реагента 136, показанным на фиг. 2, и проходит вдоль микрофлюидного устройства рядом с четными линиями ввода химического реактива в верхнюю часть устройства, а затем ветвятся на несколько линий ввода собирающего реагента. Мультиплексор для собирающего реагента имеет в целом равный объем для каждой линии ввода образца для обеспечения однородного нагнетания во время операции по извлечению продукта реакции. Следует отметить, что конкретная система ветвления, показанная на фиг. 5 В, представлена исключительно в качестве примера, и другие системы ветвления включены в объем данного изобретения. Линии ввода собирающего реагента 430 находятся в жидкостной связи с линиями ввода образца 516,описанными по отношению к фиг. 6. Как обсуждалось в отношении фиг. 9A-D, варианты осуществления используют отдельную линию ввода собирающего реагента для каждой колонки камер для образца, например 48 линий ввода собирающего реагента для микрофлюидного устройства с конфигурацией расстановки 4848. Дополнительно, хотя линия ввода собирающего реагента входит в микрофлюидное устройство в положении рядом с четными линиями ввода химического реактива 420, это не является необходимым для вариантов осуществления данного изобретения, и другие конфигурации охвачены объемом данного изобретения. Специалист в данной области определит многие вариации, модификации и альтернативы. Как описано по отношению к фиг. 8 С, собирающий реагент течет от порта ввода собирающего реагента на несущем элементе через линии ввода собирающего реагента 430 и в один конец линий ввода образца 516. Как обсуждалось более подробно в данном описании, линии ввода образца функционируют и как линии ввода, и как линии извлечения продукта реакции. Для загрузки путь тока образца идет от портов ввода образца 120, через линии ввода 140, через сквозные перемычки 412, через линии ввода образца 410, через линии ввода образца 516 в реакционные камеры 510 и в загрузочные резервуары 830. Для извлечения продукта реакции путь тока продукта идет от порта ввода собирающего реагента 136,через линии ввода собирающего реагента 430, через линии ввода образца 516, через линии ввода образца 410, через сквозные перемычки 412 и в порты ввода образца 120, которые служат во время сбора в качестве лунки для извлеченной текучей среды. Таким образом, применение выражения линии "ввода" должно рассматриваться в контексте конкретного выполняемого процесса, поскольку линии "ввода" линии могут служить и для загрузки образцов, и для извлечения или удаления продуктов реакции из микрофлюидного устройства и несущего элемента. Оказывая давление на блок портов ввода образцов 120 и на блок портов ввода химического реактива 122, образцы и реагенты могут быть загружены через показанные линии ввода образца и химического реактива в камеры для образца и химического реактива, присутствующие в микрофлюидном устройстве. Оказывая давление на порт ввода собирающего реагента 136, продукты реакции могут быть извлечены из камеры для образца и доставлены во порты ввода образца. Клапаны, имеющиеся в микрофлюидном устройстве, используются для контроля потока образцов, химических реактивов и продуктов реакции,как описано более подробно в данном описании. Фиг. 5 В иллюстрирует только часть линий ввода образца, линий ввода химического реактива и линий ввода собирающего реагента, а дополнительные части этих линий ввода показаны на фиг. 5 А и фиг. 6. Фиг. 6 является упрощенной схематической диаграммой нескольких элементарных ячеек микрофлюидного устройства, показанного на фиг. 5 А. На фиг. 6 для ясности показаны четыре элементарные ячейки из матричной части 430, показанной на фиг. 5 А. Секция элементарных ячеек микрофлюидного устройства включает камеры для образца 510 и камеры для химического реактива 512. Линии текучей среды 514 обеспечивают жидкостную связь между камерами для образца и камерами для химического реактива, когда клапаны сопряжения 530 находятся в открытом положении. В конкретном варианте осуществления линии ввода образца 516 предусмотрены в слое микрофлюидного устройства, лежащем под слоем, содержащим камеры для образца. Подобным образом, линии ввода химического реактива 518 предусмотрены в слое микрофлюидного устройства, лежащем под слоем, содержащим камеры для химического реактива. Образцы текут от линий ввода образца 410, показанных на фиг. 5 В, к линиям ввода образца 516 и через одну или несколько сквозных перемычек, проходящих от линий ввода образца в камеры для образца. Хотя две линии для образца показаны для каждой из камер для образца, это конкретное количество не является необходимым для данного изобретения, и могут быть использованы другие количества линий ввода образца, например 1 линия ввода, 3, 4 или более 4 линий ввода образца. Линии ввода образца 516 обеспечивают путь непрерывного тока в направлении колонки фигуры, позволяя отдельному образцу равномерно распределяться по нескольким камерам для образца. Фиг. 6 показывает линии ввода химического реактива 518, которые обеспечивают поток химического реактива от линий ввода химического реактива 420 и 422, показанных на фиг. 5 В, в камеры для химического реактива 512. Хотя фиг. 6 показывает только линии ввода химического реактива, входящие в элементарные ячейки с правой стороны фигуры, специалисту в данной области будет очевидно, что в варианте осуществления, показанном на фиг. 5 В, четные и нечетные химические реактивы загружаются с противоположных сторон микрофлюидного устройства. Изображение, представленное на фиг. 6, является упрощенным исключительно для ясности. В конкретном варианте осуществления химические реактивы загружаются через сквозные перемычки, соединяющие линии ввода и камеры для химического реактива, способом, подобным наполнению камер для образца. Загрузка химических реактивов вдоль рядов микрофлюидного устройства обеспечивает разный химических реактив для каждого из образцов, давая в результате количество попарных комбинаций, подходящих для МN матрицы. Как описано более подробно в данном описании, продукты реакции извлекают из микрофлюидного устройства с использованием линий ввода образца 516 и насосов (не показано). Клапаны удержания 540 обеспечивают локализацию между различными камерами для образца и химического реактива в каждом ряду. С использованием клапанов сопряжения 530 и клапанов удержания 540 каждая из камер для образца может быть отделена от каждой из других камер для образца, а также камер для химического реакти- 27023190 ва. Камеры для химического реактива могут быть отделены от других камер для химического реактива с использованием клапанов удержания. И запорные, и клапаны удержания приводятся в действие применением давления к соответствующей контрольной линии в жидкостной связи с источниками 130-134 или другими средствами, например электростатическим приведением в действие. На фиг. 6 в конфигурации расстановки показаны четыре камеры для образца 510. Четыре проиллюстрированные камеры показаны исключительно для примера, и варианты осуществления данного изобретения не ограничены четырьмя показанными камерами, но типично предусмотрено 2304 камеры в конфигурации расстановки 4848, 4096 камер в конфигурации расстановки 6464, 9216 камер в конфигурации расстановки 9696 или подобное. Варианты осуществления данного изобретения предусматривают элементарные ячейки с размерами порядка несколько сотен микрон, например элементарные ячейки с размером 500500 мкм, 525525 мкм,550550 мкм, 575575 мкм, 600600 мкм, 625625 мкм, 650650 мкм, 675675 мкм, 700700 мкм или подобное. Размеры камер для образца и камер для химического реактива выбирают для обеспечения количеств материалов, достаточных для необходимых процессов, при уменьшении количества используемого образца и химического реактива. Например, камеры для образца могут иметь размеры порядка 100400 мкм в ширину 200-600 мкм в длину 100-500 мкм в высоту. Например, ширина может составлять 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 мкм или подобное. Например, длина может составлять 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600 мкм или подобное. Например, высота может составлять 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400,425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600 мкм или подобное. Камеры для химического реактива могут иметь подобные диапазоны размеров, типично обеспечивая такие же размеры шага с меньшими диапазонами при меньших объемах камер. В некоторых вариантах осуществления соотношение объема камеры для образца и объема камеры для химического реактива составляет около 5:1,10:1,15:1, 20:1, 25:1 или 30:1. Объемы камер, меньше перечисленных диапазонов, включены в объем изобретения и легко изготавливаются с использованием техник изготовления микрофлюидного устройства. Микрофлюидные устройства с большей плотностью типично будут использовать меньшие объемы камер для уменьшения опорной поверхности элементарных ячеек. В применениях, для которых доступны очень маленькие размеры образца, уменьшенные объемы камер будут облегчать тестирование таких маленьких образцов. Размеры клапанов сопряжения 530 выбирают для обеспечения полного заграждения линий текучей среды 514, соединяющих камеры для образца и химического реактива. В некоторых вариантах осуществления диапазон размеров клапана составляет около 10-200 мкм 10-200 мкм, например 5050, 5065,5080, 50100, 6550, 6565, 6580, 65100, 8050, 8065, 8080, 80100, 10050, 10065, 100 80,100100 мкм или подобное. Линии ввода образца могут иметь различную ширину в зависимости от количества линий ввода образца и объемов камер для образца и требуемых скоростей потока для загрузки и извлечения продукта. Например, линии ввода образца могут иметь поперечное сечение 1-20 мкм в высоту и 50-100 мкм в ширину. Например, линии ввода образца могут иметь высоту 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мкм и ширину 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мкм. Другие параметры устройства, включая выравнивание слоя к слою, варьирующее от 20 до 100 мкм, а по размеру варьирующее от 50 до 200 мкм, выбирают для обеспечения желательных рабочих характеристик системы. Специалист в данной области определит многие вариации, модификации и альтернативы. В некоторых вариантах осуществления дополнительный вход для химического реактива обеспечивается на стороне микрофлюидного устройства, расположенной рядом с линиями ввода собирающего реагента. Кроме того, не предусмотрен вход для химического реактива на стороне микрофлюидного устройства, расположенной рядом с портами ввода образца на несущем элементе. В этой конфигурации дополнительный вход для химического реактива может быть использован для загрузки камеры дегидратации. Типично загрузка камер дегидратации будет использовать более 5 мкл раствора химического реактива. Альтернативно, отдельный раствор дегидратации может быть использован для поддержания одинаковых объемов химического реактива во всем микрофлюидном устройстве. Фиг. 7 является упрощенным графическим представлением способа эксплуатации микрофлюидного устройства согласно варианту осуществления данного изобретения. В показанном варианте осуществления микрофлюидное устройство включает по меньшей мере одну камеру для химического реактива, по меньшей мере одну камеру для образца и по меньшей мере один порт для сбора. В конкретном варианте осуществления микрофлюидное устройство включает множество камер для химического реактива и множество камер для образца. Способ 600 включает закрытие линии текучей среды между камерой для химического реактива и камерой для образца (610). Согласно фиг. 6 клапаны сопряжения 530 выполнены с возможностью закрытия линий текучей среды 514, проходящих между камерами для образца 510 в камеры для химического реактива 512. В некоторых вариантах осуществления клапаны сопряжения 530 являются "отжимными" клапанами, как описано более подробно ниже. Клапаны сопряжения образованы пересечением контрольной линии 532 или контрольного канала, т.е., по меньшей мере частично, находятся в первом слое микрофлюидного устройства. Линии текучей среды, по меньшей мере частично, находятся во втором слое микрофлюидного устройства. Контрольные линии 532 находятся в жидкостной связи с одним или несколькими устройствами создания и накопления давления или как показано на фиг. 2. Пересечение контрольной линии 532 с линией текучей среды 514 образует клапан на пересечении,названный клапаном сопряжения 530, поскольку клапан предотвращает смешивание при сопряжении между образцом и химическим реактивом. Клапан сопряжения 530 приводится в действие в ответ на давление текучей среды в контрольной линии и работает для предотвращения потока текучей среды по линиям текучей среды. Как правило, многослойное микрофлюидное устройство, описанное в данном документе, включает ряд эластомерных слоев и клапанов 530, включая отклоняемую мембрану между первым слоем и вторым слоем. В "отжимной" конфигурации отклоняемая мембрана клапана отклоняется в линию текучей среды 514, расположенную выше пересечения с контрольной линией 532. В этой конфигурации отклоняемая мембрана отклоняется вверх в линию текучей среды для закрытия линии текучей среды в положении клапана, поэтому названы "отжимными" клапанами. Стравливание давления в контрольной линии приведет в результате к возвращению отклоняемой мембраны в неотклоненное положение и, тем самым, к открытию закрытого клапана. Дополнительное описание микрофлюидных устройств, включающих клапаны, представлено в патентной заявке США 2005/0226742, полное описание которой настоящим включено ссылкой во всей своей полноте для всех целей. Как показано на фиг. 6, приведение в действие контрольных линий 532 будет преграждать линии текучей среды 514. Типично контрольные линии 532 приводятся в действие одновременно оказанием давления на устройство накопления давления. Снова обращаясь к фиг. 7, после закрытия клапанов сопряжения 530 образцы текут в камеры для образца 510 через линии ввода образца 516 (612). Как показано на фиг. 6, каждая камера для образца 510 находится в жидкостной связи с несколькими (например,двумя) линиями ввода образца 516. В других вариантах осуществления могут быть использованы другие количества линий ввода образца. Специалист в данной области определит многие вариации, модификации и альтернативы. Обычно линии ввода образца, которые, по меньшей мере частично, находятся во втором слое микрофлюидного устройства, проходят под камерами для образца, которые, по меньшей мере частично, находятся в третьем слое микрофлюидного устройства. Сквозная перемычка (не показана), идущая от линии ввода образца к камере для образца, обеспечивает поток текучей среды от линии ввода образца в камеру для образца. Как показано на фиг. 6, образцы текут, например, в колонки, мимо клапанов удержания 540, которые открыты, через сквозные перемычки, идущие от плоскости фигуры, и в разные камеры для образца. Текучие среды, такие как воздух, присутствующий в камерах для образца,выталкиваются во время загрузки образцов в результате проницаемости эластомерного материала, использованного для изготовления микрофлюидного устройства. Снова обращаясь к фиг. 7, химические реактивы текут в камеры для химического реактива 512 через линии ввода химического реактива 518 (614). Химические реактивы текут через линии ввода химического реактива 518, мимо клапанов удержания 540, которые открыты, и через сквозные перемычки (не показано), идущие от линий ввода химического реактива к камерам для химического реактива. Закрытие клапанов сопряжения 530 предотвращает смешивание образцов в камерах для образца и химических реактивов в камерах для химического реактива. Как только образец и химический реактив загружены, линия текучей среды между камерой для химического реактива и камерой для образца открывается (616). В вариантах осуществления данного изобретения многочисленные линии текучей среды 514 открываются одновременно открытием клапанов сопряжения 530. По меньшей мере часть образца и по меньшей мере часть химического реактива комбинируются для образования смеси (618). Смесь образца и химического реактива образуется по всем камерам для образца и химического реактива, а также линиям текучей среды, соединяющим эти камеры. Свободная межфазная диффузия является процессом, при котором смешивание является медленным, а степень равновесия частиц зависит от коэффициентов диффузии частиц. Небольшие молекулы, такие как соли, имеют большие коэффициенты диффузии и поэтому быстро уравновешиваются. Большие молекулы (например, белки) имеют небольшие коэффициенты диффузии, и равновесие наступает медленно. Смесь реагирует для образования продукта реакции (620). Типичной реакцией, включенной в объем данного изобретения, является ПЦР, которая вовлекает термоциклирование микрофлюидного устройства в ряд циклов, как будет понятно специалисту в данной области. Линия текучей среды между камерой для химического реактива и камерой для образца закрывается (622) приведением в действие клапанов сопряжения 530. Закрытие клапанов сопряжения отделяет продукт реакции, присутствующий в камерах для образца, от продуктов реакции, присутствующих в камерах для химического реактива. Дополнительно клапаны удержания 540 могут быть закрыты во время термоциклирования для предотвращения осаждения во время процесса термоциклирования. Собирающий реагент течет из порта для сбора в камеру для образца (624) для начала процесса сбора продуктов реакции, присутствующих в камерах для образца. Порт для сбора 136 является примером порта ввода текучей среды, используемого в процессе сбора. Как показано на фиг. 4, продукты реакции текут вниз через линии ввода образца 516 по направлению к портам ввода образца, из которых были изначально доставлены образцы. Таким образом, в описанном способе удаление продуктов реакции из микрофлюидного устройства включает подачу продуктов реакции по меньшей мере через часть линии ввода образца, которая была использована для загрузки образцов в
МПК / Метки
МПК: C12Q 1/68
Метки: кодирования, целевых, кислот, амплификации, мультипраймерной, нуклеиновых, способ, штрихового
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-23190-sposob-multiprajjmernojj-amplifikacii-dlya-shtrihovogo-kodirovaniya-celevyh-nukleinovyh-kislot.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ мультипраймерной амплификации для штрихового кодирования целевых нуклеиновых кислот</a>
Способ амплификации нуклеиновых кислот
Номер патента: 5739
Опубликовано: 30.06.2005
Авторы: Асада Киезо, Като Икуносин, Ямамото Дзунко, Мукаи Хироюки, Томоно Дзун, Сагава Хироаки, Кобаяси Еидзи, Уемори Такаси, Еноки Тацудзи
МПК: C12Q 1/68, C12N 15/09
Метки: амплификации, нуклеиновых, способ, кислот
Формула / Реферат:
1. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) получение реакционной смеси посредством смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы H, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и...
Способы амплификации нуклеиновых кислот
Номер патента: 6066
Опубликовано: 25.08.2005
Авторы: Като Икуносин, Сагава Хироаки, Еноки Тацудзи
МПК: G01N 33/53, C12Q 1/68, C12N 15/09...
Метки: способы, кислот, амплификации, нуклеиновых
Формула / Реферат:
1. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты как матрицы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи по меньшей мере одного химерного олигонуклеотидного праймера по меньшей мере одного верхнего (upstream) блокирующего олигонуклеотида и РНКазы H, где химерный олигонуклеотидный праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный...
Способы амплификации и секвенирования нуклеиновых кислот
Номер патента: 4271
Опубликовано: 26.02.2004
Авторы: Кавасима Эрик, Майер Паскаль, Адесси Селин, Туркатти Джерардо, Мермо Жан-Жак
МПК: C12N 15/11, C12Q 1/68
Метки: секвенирования, амплификации, кислот, способы, нуклеиновых
Формула / Реферат:
1. Способ амплификации по крайней мере одной нуклеиновой кислоты, включающий следующие стадии: (1) формирование по крайней мере одной нуклеиновой кислоты-матрицы, включающей предназначенную для амплификации нуклеиновую кислоту(ы), причем указанная нуклеиновая кислота(ы) включает на 5'-конце олигонуклеотидную последовательность Y и на 3'-конце олигонуклеотидную последовательность Z, и, кроме того, нуклеиновая кислота(ы) несет на 5'-конце средство...
Устройство для термозависимой цепной амплификации последовательностей – мишеней нуклеиновых кислот
Номер патента: 4719
Опубликовано: 26.08.2004
Автор: Фесток Габриель
МПК: B01L 7/00
Метки: мишеней, последовательностей, нуклеиновых, кислот, цепной, термозависимой, устройство, амплификации
Формула / Реферат:
1. Реакционный планшет, содержащий несколько реакционных камер (13) и по меньшей мере один резервуар (11), при этом каждая реакционная камера соединена с резервуаром при помощи канала (12) с поперечным сечением в виде круга диаметром меньше 3 мм; емкость резервуара меньше 10 мкл, а расположение реакционных камер и каналов по отношению к резервуару обеспечивает равномерное распределение текучей среды по реакционным камерам из резервуара, причем...
Диагностическая система для проведения амплификации и детекции последовательностей нуклеиновых кислот
Номер патента: 11753
Опубликовано: 30.06.2009
Авторы: Лихтенберг Ян, Фон Гермар Фритьоф, Ферпоорте Забет, Шонфельд Фридхельм, Карльсен Франк
МПК: G01N 27/447, C12Q 1/68, G01N 1/28...
Метки: нуклеиновых, детекции, амплификации, кислот, последовательностей, диагностическая, проведения, система
Формула / Реферат:
1. Интегрированная диагностическая система "лаборатория-на-чипе" для подготовки к анализу образца текучей среды, содержащего клетки и/или частицы, включающая следующие компоненты, расположенные на общей подложке: (a) входное отверстие для образца текучей среды; (b) блок лизиса для лизиса клеток и/или частиц, содержащихся в образце текучей среды; (c) блок экстракции нуклеиновой кислоты для экстракции нуклеиновых кислот из клеток и/или частиц,...
Предыдущий патент: Способ получения гальванического элемента
Следующий патент: Рекомбинантная клетка человека, способная экспрессировать белок длинного пентраксина ptx3 человека, и ее применение
Случайный патент: Комбинированная противоопухолевая терапия, включающая применение производных замещенного акрилоилдистамицина, таксанов и/или антиметаболитов