Составной белок

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, к которой относятся: vi. молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента; vii. молекула нуклеиновой кислоты, включающая фрагмент из как минимум 1500 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента; viii. молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как минимум на 85% идентичную SEQ ID NO: 2;ix. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем фрагмент включает как минимум 500 заменимых аминокислот SEQ ID NO: 2; и х. молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий гуманизированный иммуноглобулин или части иммуноглобулина,имеющие специфичность связывания с CD133; молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем молекула нуклеиновой кислоты гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее комплемент, в условиях инкубации при 45 С в 6,0SSC с последующим промыванием в 0,2SSC/0,1% SDS при 65 С. Область изобретения Изобретение касается молекулы нуклеиновой кислоты и полипептида, способных одновременно и избирательно связываться с коллагеном и CD133 белком. Настоящее изобретение также касается клеткихозяина, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение касается способа получения полипептида согласно изобретению. Полипептид может применяться для профилактики, лечения или диагностики сердечно-сосудистого заболевания. Соответственно, настоящее изобретение также касается фармацевтической композиции, содержащей полипептид согласно изобретению, который предпочтительно является димером. Уровень техники Эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) находятся в костном мозге и высвобождаются в кровоток, где они принимают участие в гемостазе и восстановлении тканей. CD133 белок, трансмембранный гликопротеин пентаспан, экспрессируется на поверхности ЕРС, и, таким образом, экспрессия подавляется после дифференциации ЕРС в эндотелиальные клетки. CD133 не экспрессируется ни на каком другом типе клеток крови, что делает его привлекательным объектом для рекрутинга ЕРС. Биспецифический белок, способный привлекать эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) к местам повреждений сосудов, известен из документа WO 2008/101700. Белок, описанный в документе WO 2008/101700, содержит компонент, способный связываться с CD133 на ЕРС с высокой аффинностью. Кроме того, белок, описанный в документе WO 2008/101700, содержит компонент, способный распознавать и связываться с местами повреждений в эндотелиальной выстилке кровеносных сосудов. Согласно документу WO 2008/101700, белок получают путем связывания первого белка, способного к связыванию с эндотелиальными клетками-предшественниками, и второго белка, способного к связыванию с коллагеном. Первый и второй белки связывают с использованием SPDP (N-сукцинимидил 3-(2 пиридилдитио)пропионата), который является гетеробифункциональным сшивающим агентом. Поскольку первый белок содержит около 25 лизиновых остатков, реагирующих с SPDP, а второй белок содержит около 18 лизиновых остатков, количество возможных димерных продуктов составляет как минимум 450(1825). Кроме того, нельзя избежать образования высших олигомеров. Соответственно, сшитый продукт содержит гетерогенную смесь продуктов. При этом смесь не содержит какого бы то ни было составного белка из первого и второго белков, поскольку продукты не образуются путем соединения двух или большего количества генов, кодирующих первый и второй белки. Соответственно, ни один из продуктов, получаемых согласно документу WO 2008/101700, не может рассматриваться как продукт трансляции составного гена или как отдельный полипептид с функциональными качествами, унаследованными от каждого из исходных белков. Смесь белков, описанная в документе WO 2008/101700, неприемлема для применения в качестве медикамента, поскольку эта смесь не может обеспечиваться со стандартизированным и определенным составом и достаточной степенью чистоты для терапевтического применения. Кроме того, поскольку олигомеров невозможно избежать, выход и эффективность смеси согласно документу WO 2008/101700 представляют проблему. С другой стороны, при попытках получения составного белка, содержащего полипептидные последовательности, присутствующие в смеси согласно документу WO 2008/101700, не удалось связать второй белок, способный избирательно и одновременно связываться с эндотелиальными клеткамипредшественниками и коллагеном. Краткое описание изобретения Таким образом цель настоящего изобретения состоит в обеспечении полипептида малого размера,способного одновременно и избирательно связываться с коллагеном и CD133 белком, благодаря чему белок может быть получен с большим выходом и высокой степенью чистоты, позволяющей применять его в фармацевтической композиции для усиления процессов заживления непосредственно путем дифференциации ЕРС в эндотелиальные клетки стенок сосудов или посредством секреции положительных модулирующих факторов. Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный составной белок. Составной белок может применяться для лечения или профилактики сердечнососудистого заболевания путем хоминга ЕРС к открытому коллагену или для диагностических целей. Согласно первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, к которой относятся:i. молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента;ii. молекула нуклеиновой кислоты, включающая фрагмент из как минимум 1500 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента;iii. молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как минимум на 85% идентичную SEQ ID NO: 2;iv. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем фрагмент включает как минимум 500 заменимых аминокислот SEQ ID NO: 2; иv. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем молекула нуклеиновой кислоты гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее комплемент, в условиях инкубации при 45C в 6,0SSC с последующим промыванием в 0,2SSC/0,1% SDS при 65C. Нуклеиново-кислотная последовательность SEQ ID NO: 1 представлена ниже Согласно второму аспекту настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяин, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту настоящего изобретения. Согласно третьему аспекту настоящее изобретение обеспечивает полипептид, способный одновременно и избирательно связываться с коллагеном и CD133 белком, выбранный из группы, к которой относятся:a) фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем фрагмент включает как минимум 600 заменимых аминокислот SEQ ID NO: 2;b) вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем вариант кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее комплемент, в условияхc) полипептид, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеиновой кислоте, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента; иd) полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична SEQ ID NO: 2. Полипептид согласно третьему аспекту предпочтителен для применения в профилактике или лечении сердечно-сосудистого заболевания. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2 представлена ниже Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения полипептида,включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем способ включает культивирование клетки-хозяина согласно третьему аспекту в условиях, в которых экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты. Согласно пятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию,включающую полипептид согласно третьему аспекту изобретения. Согласно шестому аспекту настоящее изобретение обеспечивает применение полипептида согласно третьему аспекту для производства медикамента для профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания. Настоящее изобретение демонстрирует, что составной белок согласно настоящему изобретению,который может экспрессироваться в культуре клеток млекопитающих с высокой эффективностью, способен связываться с его мишенями CD133 и коллагеном с высокой аффинностью и иммобилизоватьCD133, экспрессирующий клетки HEK 293 на покрытой коллагеном поверхности даже в динамических условиях, как показывает эксперимент с проточной камерой. По сравнению со смесью белков согласно документу WO 2008/101700, которая содержит W6B3H10mAb, химически связанное с GPVI-Fc, составной белок согласно настоящему изобретению способен рекрутировать CD133-положительные клетки-предшественники, выделенные из пуповинной крови человека, к местам искусственного повреждения сосудов на мышиной модели. Кроме того, рекрутированные ЕРС дифференцируются в эндотелиальные клетки и, таким образом, прямо способствуют регенерации эндотелиальной стенки. Таким образом, составной белок согласно настоящему изобретению усиливает реэндотелиализацию и может быть выгодно использован в медицине для восстановления сосудов. Полипептид согласно изобретению может использоваться для усиления процессов заживления непосредственно путем дифференциации в эндотелиальные клетки стенки сосуда или косвенно, путем секреции положительных модулирующих факторов. Новый составной белок превосходит существующие химически связанные последовательности в том, что обладает более высокой аффинностью к коллагену (см. фиг. 9). В этом состоит преимущество при использовании в качестве медикамента с более высокой эффективностью для местного связывания с местами повреждения сосудов. Среди различных возможных составных белков лишь scFv-lh демонстрирует сравнимую высокую аффинность к CD133, в отличие от других производных последовательностей(см. фиг. 5). Помимо применения полипептида согласно настоящему изобретению для процессов восстановления сосудов, он также может применяться для улучшения хоминга трансплантированных стволовых клеток к костному мозгу после абляции костного мозга путем химиотерапии или радиотерапии. Настоящее изобретение обеспечивает полипептид малого размера в соответствии с SEQ ID NO: 2,способный одновременно и избирательно связываться с коллагеном и CD133 белком. Белок согласно настоящему изобретению может быть получен в большом выходном количестве и с высокой степенью чистоты, что обусловливает его высокую пригодность в фармацевтической композиции. Полипептид согласно изобретению представляет собой составной белок, т.е., продукт трансляции составного гена. Составной белок содержит домен одноцепочечного антитела против CD133, линкер, Fcкомпонент и GPVI-компонент. Белок согласно настоящему изобретению может быть в форме димера. Полипептид согласно настоящему изобретению образуется на основе одноцепочечного антитела(scFv), состоящего исключительно из вариабельных последовательностей легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, которые комбинируются на одной полипептидной цепи соединительным линкерным пептидом. Это одноцепочечное антитело сохраняет специфичность родительского mAb к антигену с неожиданно высокой аффинностью. Родительское mAb, применяемое согласно настоящему изобретению, может вырабатываться клоном клеток гибридомы мыши W6B3H10, субклоном серийно выпускаемого клона W6B3C1 (Miltenyi, Bergisch Gladbach). Так как компонент антитела полипептида согласно настоящему изобретению взят из моноклонального антитела мыши, составной белок, содержащий этот компонент, является химерным белком мышичеловека. Поскольку существуют технологии замены последовательностей мышиного происхождения в фармацевтических средствах на основе антител, в данной отрасли стали традиционно применять разработку терапевтических молекул, являющихся гуманизированными или полностью человеческими. Это снижает или предотвращает иммунную реакцию против терапевтического белка, особенно при периодическом введении. Таким образом, одноцепочечный компонент полипептида согласно настоящему изобретению может подвергаться процессу гуманизации с применением способов, называемых трансплантацией CDR. При этом гипервариабельные участки (CDR) мышиного происхождения, включающие антигенсвязывающий центр антитела, переносят на каркасные остатки человеческого происхождения. Компонент антитела составного белка, взятого из организма мыши, может быть успешно гуманизирован путем трансплантации мышиных CDR на консенсусную акцепторную каркасную последовательность человека. Гуманизированный составной белок сохраняет свойства связывания с белкамимишенями CD133 и коллагеном I и связывается с подобной аффинностью по сравнению с составным белком с одноцепочечной последовательностью мыши. Второй партнер слияния способен распознавать и связываться с местами повреждения в эндотелиальной выстилке кровеносных сосудов. После повреждения слоя эндотелиальных клеток вследствие хирургического вмешательства, такого как имплантация стента, или после разрыва атеросклеротических бляшек коллаген, как составляющая субэндотелиального матрикса, открывается для воздействия кровотока. Это приводит к быстрому прикреплению и активизации тромбоцитов, что, в свою очередь, может вызывать образование тромба и окончательной закупорки кровеносного сосуда. Гуманизированный составной белок способен ингибировать связывание тромбоцитов с поврежденными стенками сосудов, как видно из уменьшения площади образования тромба (см. фиг. 22). Ожидается,что по сравнению с молекулой-предшественником с последовательностью антитела мыши гуманизированный составной белок должен улучшить толерантность иммунной системы пациента после введения. Тромбоциты прилипают к коллагену через гликопротеин VI (GPVI), мембранный гликопротеиновый рецептор, который экспрессируется на поверхности тромбоцитов. Растворимая часть гликопротеинаVI человеческих тромбоцитов, соответствующая внеклеточному домену белка, демонстрирует высокую аффинность связывания с коллагеном.GPVI связывает коллаген с высокой аффинностью как гомодимер. Для облегчения димеризации с одной стороны и очищения составного белка путем аффинной хроматографии с другой стороны Fcкомпонент человеческого IgG присоединяется к растворимому GPVI-компоненту. Fc-фрагмент образует димеры через ковалентные дисульфидные связи в оставшейся части шарнирного участка, что способствует димеризации GPVI, которая, возможно, поддерживается образованием дисульфидной связи. Кроме того, Fc-метка увеличивает время полужизни составного белка в кровотоке. Краткое описание фигур Фиг. 1 показывает собранные последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепи кДНК W6B3H10. В частности, фиг. 1 А показывает последовательность каппа-легкой цепи. Подчеркнутая последовательность относится к константной области последовательности легкой цепи. Фиг. 1 В показывает последовательность для гамма-тяжелой цепи; фиг. 2 - нуклеотидную последовательность конструктов scFv-lh, показанного в части А, и scFv-hl,показанного в части В. Подчеркнутая последовательность в части А взята из константной области тяжелой цепи, а в части В - из константной области легкой цепи. Линкерная последовательность Gly-Ser показана курсивом; фиг. 3 - вестерн-блоттинг очищения одноцепочечного антитела scFv-lh из супернатанта клеток СНО с применением матрицы Strep-Tactin, обнаруженного при помощи антитела StrepMAb-Classic-HRP. Показаны проточная фракция (FT), первые две фракции промывания (W1, W2), фракции элюата с 1 по 5(Е 1-Е 5) и матрикс после элюирования (М). Специфическая полоса показана в ожидаемом размере приблизительно 27 кДа в рядах Е 2-Е 5. Ряд М показывает неспецифические сигналы; фиг. 4 - результаты проводимого с применением окрашивания геля Кумасси анализа очищенияscFv-hl от бактерий. В - бактериальный лизат, Е 2/3 - комбинированные элюаты 2 и 3, Е 4, Е 5 - фракция элюата 4 и 5; фиг. 5 - связывание одноцепочечных антител с CD133 на фиксированных клетках АС 133/293. А -4 023016 зависимые от концентрации свойства связывания, В - конкурентное связывание 2 нмоль/л W6B3H10mAb с CD133 на фиксированных клетках АС 133/293 с применением scFv-lh одноцепочечного антитела; фиг. 6 - нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1) и аминокислотную последовательность(SEQ ID NO: 2) составного белка scFv-lh-GPVI-Fc. Фиг. 1 А показывает нуклеотидную последовательность, являющуюся кодон-оптимизированной для эффективной экспрессии в клетках СНО, причем последовательность, кодирующая одноцепочечный компонент, выделяется подчеркиванием. Фиг. 1 В показывает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2), выведенную из нуклеотидной последовательности. Показанный лидерный пептид из 20 аминокислот в зрелом белке отсутствует. Последовательность одноцепочечного компонента выделяется подчеркиванием. GPVI и FcIgG2 соединяются GGRлинкером, показанным жирным шрифтом; фиг. 7 - составной белок, который отделяли на 4-20% полиакриламидном геле в невосстановительных и восстановительных условиях, с окрашиванием геля бриллиантовым синим Кумасси; фиг. 8 - характеризацию связывания составного белка с CD133 на фиксированных клетках АС 133/293. Фиг. 8 А показывает ELISA-титрование для сравнения связывания составного белка и родительского mAb W6B3H10. Фиг. 8 В показывает конкурентный ELISA-анализ с 2 нМ W6B3H10 mAb и составным белком в качестве конкурента; фиг. 9 - измерение связывания составного белка в сравнении с GPVI-FcIgG1 с 0,1 мкг коллагена I крупного рогатого скота с применением ELISA. Фиг. 9 А демонстрирует зависимое от концентрации связывание. Фиг. 9 В демонстрирует конкурентное связывание составного белка с 1 мкг/мл иммобилизированного коллагена I, конкурирующего с увеличиваемым количеством растворимого коллагена I; фиг. 10 демонстрирует опосредованное составным белком связывание экспрессирующих CD133 клеток и контрольных клеток HEK 293 с коллагеном при сдвиговом усилии 2000/с; фиг. 11 - опосредованное составным белком связывание qEPC с сонной артерией мыши после вызванного лигированием повреждения in vivo, измеряемое путем интравитальной флуоресцентной микроскопии; фиг. 12 показывает влияние составного белка на функцию левого желудочка (А) и на размер инфаркта (В). N=5/6,р 0,05,р 0,005 (t-тест); фиг. 13 - измерение аффинности путем FACS-анализа клонов фагов, содержащих гуманизированные последовательности в сравнении с фаговым m1h, включающим одноцепочечную последовательность мыши. Фиг. 13 А показывает аффинность клона фага 26 в сравнении с фаговым m1h. Фиг. 13 В показывает аффинность клона фага 27 и клона фага 29 в сравнении с фаговым m1h. Анализ осуществляли с применением программы Graphpad Prism 4.0. Показатели относительной аффинности в рМ измеряют на основе введенных среднего FI (показатель флуоресценции), среднего геометрического FI или медианного FI; фиг. 14 - оценку гуманизации последовательности гуманизированного антитела с донорной последовательностью в качестве отрицательного контроля и акцепторной последовательности в качестве положительного контроля. А - донорный VL; В - акцепторный VL; С - клон 26 VL; D - донорный VH; Е акцепторный VH; F - клон 26 VH; фиг. 15 - сравнение белковых последовательностей с применением программы BlastP NCBI. Фиг. 15 А показывает выравнивание последовательности родительского одноцепочечного антитела мыши(SEQ ID NO: 22; мышь) и акцепторной последовательности человека (SEQ ID NO: 23; Sbjct). Фиг. 15 В показывает выравнивание последовательности клона 26 гуманизированного одноцепочечного антитела(SEQ ID NO: 24; гуманизированное) и акцепторной последовательности человека (SEQ ID NO: 23; Sbjct). Гипервариабельные участки легких (CDR-L1 (SEQ ID NO: 25), CDR-L2 (SEQ ID NO: 26) и CDR-L3 (SEQNO: 30 указываются заключением в рамку; фиг. 16 - выравнивание белковой последовательности гуманизированного составного белка (SEQ IDNO: 15; верхняя строка) с составным белком, содержащим одноцепочечный компонент мышиного происхождения (SEQ ID NO: 2; нижняя строка) с применением программы Blastx NCBI. Последовательности демонстрируют идентичность 95% на уровне белка; фиг. 17 - нуклеотидную (SEQ ID NO: 14) и аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 15) гуманизированного составного белка hscFv-lh-GPVI-Fc с одноцепочечным компонентом, производным от распознанного клона фага 26. Фиг. 17 А показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 14),которая является кодон-оптимизированной для эффективной экспрессии в клетках СНО, причем последовательность, кодирующая гуманизированный одноцепочечный компонент, выделяется подчеркиванием. Фиг. 17 В показывает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 15), выведенную из нуклеотидной последовательности. Показанный лидерный пептид из 20 аминокислот в зрелом белке отсутствует. Последовательность гуманизированного одноцепочечного компонента выделяется подчеркиванием; фиг. 18 - гуманизированный составной белок hscFv-lh-GPVI-Fc (h), который отделяли вместе с scFvlh-GPVI-Fc (m) на 4-20% полиакриламидном геле в восстановительных и невосстановительных условиях соответственно. Гель окрашивали бриллиантовым синим Кумасси; фиг. 19 - характеризацию связывания составного белка с антигеном CD133 на фиксированных клетках АС 133/293. Фиг. 19 А показывает ELISA-анализ клеток для сравнения связывания гуманизированно-5 023016 го и негуманизированного составного белка. Фиг. 19 В показывает конкурентное связывание 2 нМW6B3H10 mAb с фиксированными клетками АС 133/293 с использованием гуманизированного и негуманизированного составных белков. Fc-белок использовали в качестве отрицательного контроля; фиг. 20 показывает зависимое от дозы связывание гуманизированного и негуманизированного составных белков с 0,1 мкг иммобилизированного коллагена крупного рогатого скота I, измеряемое с применением ELISA. Fc-белок использовали в качестве отрицательного контроля; фиг. 21 - нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 16; на фиг. 21 А) и аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 17; на фиг. 21 В) гуманизированного одноцепочечного антитела, производного от клона фага 27. Фиг. 21 С показывает выравнивание последовательностей ДНК, кодирующих составные белки, включающие гуманизированную последовательность клона 27 (SEQ ID NO: 18; Query) и последовательность одноцепочечного антитела мыши (SEQ ID NO: 2; Sbjct), причем идентичность последовательностей составляет 96%; фиг. 22 - нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 19; на фиг. 22 А) и аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 20; на фиг. 22 В) гуманизированного одноцепочечного антитела, производного от клона фага 29. Фиг. 22 С показывает выравнивание последовательностей ДНК, кодирующих составные белки, включающие гуманизированную последовательность клона 29 (SEQ ID NO: 21; Query) и последовательность одноцепочечного антитела мыши (SEQ ID NO: 2; Sbjct), причем идентичность последовательностей составляет 96%; фиг. 23 - анализ размера агрегатов тромбоцитов после лигирования левой общей сонной артерии. Результаты показаны как средний показательSEM для 5 субъектов на группу. Описание предпочтительных вариантов осуществления Полипептид способен одновременно связываться с коллагеном и CD133 белком, когда полипептид может существовать в состоянии, в котором он образует мостик между CD133 белком и коллагеновым белком, в частности в условиях, описанных в представленных примерах. Аминокислотные или нуклеотидные последовательности, имеющие приблизительно 85% идентичности, предпочтительно 90, 95 или 98% идентичности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 соответственно, определяются авторами как достаточно идентичные. Соответственно, термин "достаточно идентичный" касается первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество идентичных или равноценных (например, аминокислотный остаток, имеющий подобную боковую цепь) аминокислотных остатков или нуклеотидов со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2), таким образом, что первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общий структурный домен и/или общую функциональную активность. В контексте данного описания "составной белок" означает полипептид, обеспечивающий активность составного белка. В контексте данного описания "активность составного белка", "биологическая активность составного белка" или "функциональная активность составного белка" означают одновременное и выборочное связывание с коллагеном и CD133 белком. Молекулы нуклеиновых кислот. Изобретение касается молекулы нуклеиновой кислоты, которая является достаточно идентичной,т.е. как минимум на 85% (90, 95 или 98%) идентичной нуклеотидной последовательности, показанной вSEQ ID NO: 1, или ее комплементу. Настоящее изобретение касается молекулы нуклеиновой кислоты, включающей фрагмент из как минимум 1500 (1600, 1800, 2000, 2200) нуклеотидов нуклеотидной последовательности, показанной вSEQ ID NO: 1, или ее комплемента. В варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1. Также изобретение охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Изобретение также включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, причем нуклеиновая кислота гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, которая состоит из SEQID NO: 2, в жестких условиях (например, гибридизации в 6 хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при приблизительно 60 С, с последующим одним или несколькими промываниями в 0,2SSC, 0,1% SDS при 65 С), и нуклеиновая кислота кодирует полипептид длиной как минимум 500 аминокислот, предпочтительно как минимум 700 аминокислот, имеющий молекулярную массу приблизительно от 65 до 85 кДа,перед посттрансляционными модификациями и в восстановленной форме. Один аспект изобретения касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют составные белки или их биологически активные части, а также молекулы нуклеиновых кислот, достаточные для использования в качестве зондов гибридизации для распознавания кодирующих составной белок нуклеиновых кислот (например, мРНК составного белка) и фрагменты для использования в качестве праймеров ПЦР для амплификации или мутации молекул нуклеиновых кислот составных белков. В контексте данного описания термин "молекула нуклеиновой кислоты" включает молекулы ДНК (например,кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, образованные с использованием аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, однако предпочтение отдается двухцепочечным ДНК."Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты является молекулой, отделенной от других молекул нуклеиновых кислот, присутствующих в природном источнике нуклеиновой кислоты. Предпочтительно"выделенная" нуклеиновая кислота не содержит последовательностей (предпочтительно кодирующих белок последовательностей), которые в природе примыкает к нуклеиновой кислоте в геномной ДНК организма, из которого взята нуклеиновая кислота. Кроме того, "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, такая, как молекула кДНК, может практически не содержать другого клеточного материала или культуральной среды, если ее получают при помощи рекомбинантных технологий, или практически не содержать химических предшественников или других химических веществ в случае ее химического синтеза. Молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, например молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, или комплемент любой из этих нуклеотидных последовательностей, может быть выделена с применением стандартных способов молекулярной биологии и представленной в данном описании информации о последовательности (SambrookLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). В другом варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, или ее часть. Молекула нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной данной нуклеотидной последовательности, достаточно комплементарна данной нуклеотидной последовательности, которую она может гибридизировать с нуклеотидной последовательностью, с образованием, таким образом, устойчивого дуплекса. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может включать лишь часть нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей составной белок, например фрагмент, который может использоваться в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий биологически активную часть составного белка. Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий "биологически активную часть" составного белка,может быть получен путем выделения части SEQ ID NO: 1, которая кодирует полипептид, имеющий биологическую активность составного белка, который экспрессирует кодированную часть составного белка (например, путем рекомбинантной экспрессии in vitro) и оценки активности кодированной части составного белка. Изобретение также охватывает молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 вследствие дегенерации генетического кода, и, таким образом,кодируют такой же составной белок, как тот, который кодируется нуклеотидной последовательностью,показанной в SEQ ID NO: 1. Соответственно, в другом варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению имеет длину как минимум 1500 (1600, 1800, 2000, 2200) нуклеотидов и гибридизируется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, предпочтительно кодирующую последовательность SEQ ID NO: 1. В контексте данного описания термин "гибридизируется в жестких условиях" означает условия гибридизации и промывания, при которых нуклеотидные последовательности, как минимум на 85% (95,98%) идентичные между собой, обычно остаются гибридизированными одна с другой. Такие жесткие условия известны специалистам в данной области и описываются в публикации Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Примером жестких условий гибридизации может быть гибридизация в 6 хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при приблизительно 4 С с последующим одним или несколькими промываниями в 0,2SSC, 0,1% SDS при 50-65C (например, 50 или 60 или 65 С). Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая гибридизируется в жестких условиях, соответствует природной молекуле нуклеиновой кислоты. Изменения, вносимые путем мутации в нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, таким образом, ведут к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемого белка без изменения функциональной способности составного белка. Например, могут осуществляться нуклеотидные замещения, которые ведут к аминокислотным замещениям в "заменимых" аминокислотных остатках. "Заменимый" аминокислотный остаток является остатком, который может быть изменен по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 2 без изменения биологической активности, в то время, как "незаменимый" аминокислотный остаток является необходимым для биологической активности составного белка. Соответственно, другой аспект изобретения касается молекул нуклеиновых кислот, кодирующих составные белки, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, которые не являются существенными для активности. Такие составные белки отличаются по аминокислотной последовательности от SEQ ID NO: 2, сохраняя при этом биологическую активность. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 85, 95 или 98% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая составной белок, имеющий последователь-7 023016 ность, отличающуюся от последовательности SEQ ID NO: 1, может быть создана путем включения одного или нескольких нуклеотидных замещений, добавлений или делеций в нуклеотидную последовательность составного белка (SEQ ID NO: 1), таким образом, чтобы одно или несколько нуклеотидных замещений, добавлений или делеций были включены в кодированный белок. Мутации могут включаться стандартными способами, такими как сайт-специфический мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Предпочтительно консервативные аминокислотные замещения осуществляют в одном или нескольких заданных заменимых аминокислотных остатках. Таким образом, например, 1, 2, 3, 5 или 10% аминокислот могут быть заменены путем консервативного замещения. "Консервативное аминокислотное замещение" представляет собой замещение, при котором аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. Группы аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи, известны специалистам в данной области. Эти группы включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизином, аргинином, гистидином), кислотными боковыми цепями(например, аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой), неизменными полярными боковыми цепями (например, глицином, аспарагином, глутамином, серином, треонином, тирозином, цистеином), неполярными боковыми цепями (например, аланином, валином, лейцином, изолейцином, пролином, фенилаланином, метионином, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонином,валином, изолейцином) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозином, фенилаланином,триптофаном, гистидином). Таким образом, прогнозируемый заменимый аминокислотный остаток в составном белке предпочтительно заменяется другим аминокислотным остатком из той же группы боковых цепей. В альтернативном варианте мутации могут быть включены случайно по всей кодирующей последовательности составного белка или ее части, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут подвергаться отбору на биологическую активность составного белка для распознавания мутантов, сохраняющих активность. После мутагенеза кодированный белок может рекомбинантно экспрессироваться, и может определяться активность белка. Мутантный составной белок подвергают анализу на способность к одновременному и выборочному связыванию с CD133 и коллагеном. Изобретение также касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновокислотную последовательность, которая кодирует гуманизированный иммуноглобулин согласно настоящему изобретению (например, одноцепочечное антитело), а также выделенных молекул нуклеиновых кислот, включающих последовательность, которая кодирует легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 12, 13, 14 или 15 и/или последовательность, кодирующую аминокислоту SEQ ID NO: 111, 116 или ее части) или тяжелую цепь (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, 18, 19 или 20 и/или последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110, 114 или ее части. Кроме того, изобретение касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, включающих нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую гуманизированный иммуноглобулин, который включает гипервариабельные участки (CDR) иммуноглобулина взятого из не принадлежащего человеку антитела (например, одноцепочечного антитела), имеющие специфичность связывания с CD133 (например,последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 и/или 30 или ее части) и каркасный участок, взятый из иммуноглобулина человеческого происхождения (например, последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 23 или ее части). Настоящее изобретение также касается молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей составной белок, который содержит гуманизированный иммуноглобулин, имеющий специфичность связывания сCD133, или части цепи такого иммуноглобулина. Например, обеспечивается вектор экспрессии, включающий ген, кодирующий легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR, взятую из легкой цепи не принадлежащего человеку антитела, имеющего специфичность связывания с CD133 (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая включает SEQ ID NO: 25, 26 и/или 27 или ее части), и каркасный участок, взятый из легкой цепи человеческого происхождения. Вектор экспрессии, включающий ген, кодирующий тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR, взятый из тяжелой цепи не принадлежащего человеку антитела,имеющего специфичность связывания с CD133 (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую SEQ ID NO: 28, 29 и/или 30 или ее части), и каркасный участок, взятый из тяжелой цепи человеческого происхождения, является еще одним примером такой последовательности. В одном варианте осуществления вектор экспрессии может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую гуманизированный иммуноглобулин, который включает первую нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи, включающий CDR,взятый из легкой цепи не принадлежащего человеку антитела, имеющего специфичность связывания сCD133, и каркасный участок из легкой цепи человеческого происхождения, и вторую нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи, включающий CDR,-8 023016 взятый из тяжелой цепи не принадлежащего человеку антитела, имеющего специфичность связывания сCD133, и каркасный участок из тяжелой цепи человеческого происхождения (например, последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую SEQ ID NO: 17, 20 или 24). В одном варианте осуществления вектор экспрессии может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, которая включает первую нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи, например, из SEQ ID NO: 1 (нуклеотиды с 61 по 381) и вторую нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи, например, изSEQ ID NO: 1 (нуклеотиды с 427 по 798) или ее часть. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, описанную авторами, и нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, описанную авторами. Выделенный составной белок и антитела против составного белка. Настоящее изобретение также касается полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85, предпочтительно на 95 или 98% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Один аспект изобретения касается выделенных составных белков и их биологически активных частей, а также фрагментов полипептидов, приемлемых для применения в качестве иммуногенов для выработки антител против составного белка. В одном варианте осуществления составные белки образуют при помощи технологий рекомбинантных ДНК. В варианте, альтернативном рекомбинантной экспрессии,составной белок ил полипептид может быть синтезирован химически с применением стандартных технологий синтеза пептидов."Выделенный" или "очищенный" белок или его биологически активная часть практически не содержат клеточного материала или других примесных белков клеточного или тканевого происхождения,от которых происходит составной белок, или практически не содержит химических предшественников или других химических веществ в химически синтезированной форме. Термин "практически не содержит клеточного материала" включает композиции составного белка, в которых белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых его выделяют или получают рекомбинантным путем. Таким образом,составной белок, практически не содержащий клеточного материала, включает композиции составного белка, имеющие менее чем приблизительно 30, 20, 10 или 5% (по сухой массе) несоставного белка (в контексте данного описания также называемого "примесным белком"). При рекомбинантном получении составного белка или его биологически активной части он также предпочтительно практически не должен содержать культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет менее чем приблизительно 20,10 или 5% от объема белковой композиции. Если составной белок получают путем химического синтеза,он предпочтительно практически не должен содержать химических предшественников или других химических веществ, т.е. он должен быть отделен от химических предшественников или других химических веществ, задействованных в синтезе белка. Соответственно, такие композиции составного белка составляют менее чем приблизительно 30, 20, 10, 5% (по сухой массе) химических предшественников или отличных от составного белка химических веществ. Биологически активные части составного белка включают пептиды, включающие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные аминокислотной последовательности составного белка или производные от нее (например, аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2), которые включают меньшее количество аминокислот по сравнению с составным белком полной длины, и демонстрируют как минимум активность составного белка. Как правило, биологически активные части включают домен или мотив как минимум с активностью составного белка. Биологически активной частью составного белка может быть полипептид, имеющий длину, например, как минимум 500, 550, 600,650 или 700 аминокислот. Предпочтительные биологически активные полипептиды включают один или несколько структурных доменов составного белка, в частности домен, взятый из одноцепочечного антитела, выборочно связывающегося с CD133, линкер, Fc-компонент и GPVI-компонент. Приемлемым для применения составным белком является белок, который включает аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 85, предпочтительно на 95 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и сохраняет функциональную активность составного белка SEQ ID NO: 2. Поскольку компонент антитела составного белка происходит из моноклонального антитела мыши,составной белок является мышино-человеческим химерным белком, мышиные последовательности которого, кроме тех, которые принимают участие в распознавании антигена, могут быть заменены последовательностями человека путем гуманизации антитела. Как правило, частично человеческие антитела и полностью человеческие антитела имеют более длительное время полужизни в человеческом организме по сравнению с другими антителами. Соответственно, часто существует возможность введения меньших доз с меньшей частотой. Модификации, такие как липидизация, могут применяться для стабилизации антител и для усиления поглощения и проникновения в ткани (например, в головной мозг). Способ липидизации антител описывается в публикации Cruikshank et al. 1997) J. Acquired Immune DeficiencySyndromes and Human Retrovirology 14:193). Определение процентной гомологии между двумя последовательностями может осуществляться с применением математического алгоритма. Предпочтительным неограничивающим примером математического алгоритма, применяемым для сравнения двух последовательностей, может быть алгоритм Карлина и Альтшуля (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:2264-2268, модифицированный согласно публикации Karlin and Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм включается в программы NBLAST и XBLAST согласно публикации Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Поиски нуклеотидов BLAST могут выполняться при помощи программы NBLAST, сумма баллов = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, подобных или гомологичных молекулам нуклеиновых кислот согласно изобретению. Для получения выровненных последовательностей с учетом разрывов с целью сравнения применяют Gapped BLAST согласно описанию в публикации Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST используют параметры соответствующих программ по умолчанию (например, XBLAST и NBLAST). См.http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Процент идентичности между двумя последовательностями определяют с применением способов,подобных описанным выше, с учетом или без учета разрывов. При вычислении процента идентичности обычно учитывают точные соответствия. Предпочтительно составной белок согласно изобретению получают при помощи стандартных технологий рекомбинантных ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные полипептидные последовательности, сшивают внутри рамки в соответствии с традиционными технологиями, например,путем применения тупых концов или ступенчатых концов для лигирования, расщепления рестрикционным ферментом для обеспечения соответствующих концов, заполнение "липких концов" в соответствующих случаях, обработки щелочной фосфатазой для избежания нежелательного соединения и ферментного лигирования. В другом варианте осуществления составной ген может быть синтезирован традиционными способами, включая применение автоматических синтезаторов ДНК. Выделенный составной белок, или его часть, или фрагмент может применяться в качестве иммуногена для выработки антител, связывающихся с составным белком, с применением стандартных способов для получения композиции поликлонального и моноклонального антитела. Может применяться составной белок полной длины, или, в альтернативном варианте, изобретение обеспечивает антигенные пептидные фрагменты составного белка для применения в качестве иммуногенов. Антигенный пептид составного белка включает как минимум 8 (предпочтительно 10, 15, 20 или 30) аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и включает эпитоп составного белка таким образом, что антитело, выработанное против пептида, образует специфичный иммунный комплекс с составным белком. Настоящее изобретение также обеспечивает полипептид, содержащий вариабельный участок гуманизированного иммуноглобулина, который обладает специфичностью связывания с CD133. В частности,настоящее изобретение также касается полипептида составного белка согласно настоящему изобретению, содержащего фрагмент гуманизированного иммуноглобулина, который обладает специфичностью связывания с CD133, причем иммуноглобулин включает антиген-связывающий участок отличного от человеческого происхождения (например, из организма грызуна) и как минимум часть иммуноглобулина человеческого происхождения (например, человеческий каркасный участок, человеческую константную область гамма-типа). В некоторых вариантах осуществления полипептид согласно настоящему изобретению также может включать полную константную область человеческого происхождения или ее часть, например, полную константную область тяжелой цепи человека или ее часть и/или константную область легкой цепи человека. Кроме того, полипептид согласно настоящему изобретению может включать гуманизированный иммуноглобулин, включающий полную человеческую константную область или ее часть, имеющую одну или несколько мутаций, например, одну или несколько мутаций, которые уменьшают связывание с Fc рецепторами и/или способность к фиксации комплемента. Составной белок в качестве иммуногена может использоваться для получения антител путем иммунизации соответствующего субъекта, например кроля, козы, мыши или другого млекопитающего, иммуногеном. Иммунизация соответствующего субъекта композицией иммуногенного составного белка вызывает реакцию поликлонального антитела против составного белка. Соответственно, другой аспект изобретения касается антител против составного белка. Поликлональные антитела против составного белка могут быть получены путем иммунизации соответствующего субъекта составным белком в качестве иммуногена. Молекулы антител, направленных против составного белка, могут быть выделены из организма млекопитающего (например, из крови) и подвергнуты дальнейшему очищению общеизвестными способами, такими, как хроматография белка А,для получения фракции IgG. В соответствующий момент времени после иммунизации вырабатывающие антитело клетки могут быть получены от субъекта и использованы для получения моноклональных антител стандартными способами, такими как гибридомная технология, описанная в публикации Kohlerand Milstein (1975) Nature 256:495-497, гибридомная технология на В клетках человека (Kozbor et al. Рекомбинантные векторы экспрессии и клетки-хозяева. Другой аспект изобретения касается векторов, предпочтительно векторов экспрессии, содержащих нуклеиновую кислоту, которая кодирует составной белок (или ее часть). В контексте данного описания термин "вектор" касается молекулы нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединяется. Одним типом вектора является"плазмида", которая означает циклическую петлю двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Векторы могут быть способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую она введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) включаются в геном клетки-хозяина после включения в клетку-хозяин и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. В целом векторы экспрессии, применяемые согласно технологиям рекомбинантных ДНК, предпочтительно имеют форму плазмид (векторов). Однако изобретение также включает другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефицитом репликации, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы). Рекомбинантные векторы экспрессии согласно изобретению включают нуклеиновую кислоту согласно изобретению в форме, приемлемой для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Соответственно, рекомбинантные векторы экспрессии включают одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, применяемых для экспрессии, и функционально связанных с нуклеиново-кислотной последовательностью, подлежащей экспрессии. В контексте рекомбинантного вектора экспрессии "функционально связанный" означает, что соответствующая нуклеотидная последовательность связывается с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) таким образом, чтобы обеспечивалась возможность экспрессии нуклеотидной последовательности (например, в in vitro системе транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, если вектор вводится в клетку-хозяин). Термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описываются, например, в публикации Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). К регуляторным последовательностям относятся те, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и те, которые направляют экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Векторы экспрессии согласно изобретению могут включаться в клетки-хозяева для образования таким образом составных белков или пептидов, которые кодируются нуклеиновыми кислотами согласно изобретению. Рекомбинантные векторы экспрессии согласно изобретению могут предназначаться для экспрессии составного белка в прокариотных или эукариотных клетках, например бактериальных клетках, таких как Е.coli, клетках насекомых (с применением бакуловирусных векторов экспрессии), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих (Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990. В альтернативном варианте рекомбинантный вектор экспрессии может быть транскрибирован и транслирован in vitro, например, с применением регуляторных последовательностей Т 7 промотора и Т 7 полимеразы. Экспрессию белков в прокариотах осуществляют в Е.coli с использованием векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, направляющие экспрессию белков. Слитые векторы добавляют определенное количество аминокислот к кодируемому в них белку, как правило к аминоконцу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы обычно служат для трех целей: 1) увеличения экспрессии рекомбинантного белка; 2) увеличения растворимости рекомбинантного белка; и 3) способствования очищению рекомбинантного белка путем воздействия в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто в слитых векторах экспрессии сайт протеолитического расщепления включают в месте соединения слитого компонента и рекомбинантного белка для обеспечения возможности отделения рекомбинантного белка от слитого компонента после очищения составного белка. Такие ферменты и их последовательности когнатного распознавания включают Фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. К типичным слитым векторам экспрессии относятся pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67:31-40),pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) и pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.), которые сливают глутатион S-трансферазу (GST), мальтоза Е-связывающий белок или белок А соответственно, с заданным рекомбинантным составным белком. Примерами подходящих индуцируемых неслитых векторов экспрессии Е.coli могут быть pTrcEnzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Экспрессия гена-мишени из вектора pTrc основывается на транскрипции РНК-полимеразы хозяина из промотора слияния гибрида trp-lac. Экспрессия гена-мишени из вектора рЕТ 11d основывается на транскрипции из промотора слияния Т 7 gn10-lac,- 11023016 опосредованной коэкспрессированной вирусной полимеразой РНК (Т 7 gn1). Эта вирусная полимераза обеспечивается штаммами-хозяевами BL21(DE3) или HMS174(DE3) из резидентного лямбда-профага,включающего ген Т 7 gn1 при транскрипционном контроле промотора lacUV5. Одна методология максимизации экспрессии рекомбинантного белка в Е.coli состоит в экспрессии белка в бактериях, имеющих ослабленную способность к протеолитическому расщеплению рекомбинантного белка (Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, Calif. (1990) 119-128). Другая методология состоит в изменении нуклеиново-кислотной последовательности нуклеиновой кислоты, вставляемой в вектор экспрессии таким образом, чтобы отдельными кодонами для каждой аминокислоты были предпочтительно используемые в Е.coli (Wada et al. (1992)Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Такое изменение нуклеиново-кислотных последовательностей согласно изобретению может осуществляться с применением стандартных способов синтеза ДНК. В другом варианте осуществления вектором экспрессии составного белка согласно настоящему изобретению является вектор экспрессии дрожжей. Примерами векторов для экспрессии в дрожжах S.Diego, Calif.), pGBT9 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pGAD10 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pYADE4 и pYGAE2 и pYPGE2 (Brunelli and Pall (1993) Yeast 9:1299-1308), pYPGE15 (Brunelli and Pall (1993) Yeast 9:1309-1318), pACT11 (Dr. S.E. Elledge, Baylor College of Medicine) и picZ (InVitrogen Corp, San Diego,Calif.). В альтернативном варианте составные белки согласно настоящему изобретению могут экспрессироваться в клетках насекомых с применением бакуловирусных векторов экспрессии. К бакуловирусным векторам, подходящим для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых, относятся группа рАс (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) и группа pVL (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39). В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота согласно изобретению экспрессируется в клетках млекопитающих с применением вектора экспрессии млекопитающего. Примерами векторов экспрессии млекопитающих могут быть pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840), pCI (Promega) и рМТ 2 РС(Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). При использовании в клетках млекопитающих контрольные функции вектора экспрессии часто обеспечиваются вирусными регуляторными элементами. Например,традиционно применяемые промоторы берут из вируса полиомы, Аденовируса 2, цитомегаловируса иSimian Virus 40. Другие подходящие экспрессионные системы как для прокариотных, так и для эукариотных клеток представлены в разделах 16 и 17 публикации Sambrook et al. (см. выше). В другом варианте осуществления рекомбинантный вектор экспрессии млекопитающего способен предпочтительно направлять экспрессию нуклеиновой кислоты в конкретном типе клеток. Тканеспецифические регуляторные элементы известны специалистам в данной области. Неограничивающими примерами подходящих тканеспецифических промоторов могут быть альбуминовый промотор (печеночноспецифический; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), лимфоидноспецифические промоторы (Calameand Baltimore (1983) Cell 33:741-748). Еще один аспект изобретения касается клеток-хозяев, в которые включен рекомбинантный вектор экспрессии согласно изобретению или выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Термин касается не только конкретной клетки, являющейся предметом изобретения, но потомства или потенциального потомства такой клетки. Поскольку могут происходить определенные модификации в последующих поколениях вследствие мутации или воздействия окружающей среды, такое потомство фактически может быть не идентичным родительским клеткам, но все же охватывается объемом данного термина в контексте данного описания. Клетка-хозяин может быть любой прокариотной или эукариотной клеткой. Например, составной белок может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких, как Е.coli, клетках насекомых, клетках дрожжей или млекопитающих (таких, как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или COS-клетки). Вектор ДНК или выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут включаться в прокариотные или эукариотные клетки при помощи традиционных способов трансформации или трансфекции. В контексте данного описания термины "трансформация" и "трансфекция" относятся к разным технологиям включения инородной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяин,включая соосаждение с фосфатом кальция или хлоридом кальция, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, липофекцию или электропорацию. Приемлемые способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев описываются в публикации Sambrook et al. и других лабораторных пособиях. Для распознавания и отбора этих компонентов ген, который кодирует селектируемый маркер (например, резистентность к антибиотикам), обычно вводят в клетки-хозяева вместе с нужным геном. Предпочтительными селектируемыми маркерами являются те, которые обеспечивают резистентность к медикаментам, таким, как G418, гигромицин и метотрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селектируемый маркер, может быть включена в клетку-хозяин на том же векторе, что и тот, который кодирует составной белок, или может быть включена на отдельном векторе. Клетки, устойчиво трансфицированные включенной нуклеиновой кислотой, могут распознаваться путем отбора медикаментов. Клетку-хозяин согласно изобретению, такую как прокариотная или эукариотная клетка-хозяин в культуре, используют для получения составного белка согласно настоящему изобретению. Соответственно, изобретение также обеспечивает способы получения составного белка с применением клетокхозяев согласно изобретению. В одном варианте осуществления способ включает культивирование клеток-хозяев согласно изобретению (в которую включен рекомбинантный вектор экспрессии или выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая составной белок) в приемлемой для образования составного белка среде. В другом варианте осуществления способ также включает выделение составного белка из среды или клетки-хозяина. Фармацевтические композиции. Молекулы нуклеиновых кислот и полипептиды (также называемые "активными соединениями") согласно изобретению могут включаться в фармацевтические композиции, приемлемые для введения. Такие композиции обычно включают молекулу нуклеиновой кислоты, составной белок или антитело и фармацевтически приемлемый носитель. В контексте данного описания определение "фармацевтически приемлемый носитель" включает растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, совместимые с вводимым фармацевтическим средством. В композиции могут быть включены дополнительные активные соединения. Фармацевтическую композицию согласно изобретению рецептируют таким образом, чтобы она была совместимой с предусмотренным способом введения. К предпочтительным способам введения относятся парентеральное, например внутривенное или внутриартериальное введение. Растворы или суспензии, применяемые для парентерального введения: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций,солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Уровень рН может регулироваться кислотами или основаниями, такими как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Композиция для парентерального введения может быть помещена в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы из стекла или пластика. К фармацевтическим композициям, приемлемым для введения инъекционным путем, относятся стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов и дисперсий, предназначенных для немедленного инъекционного введения. К подходящим для внутривенного введения носителей относятся физиологический раствор, Cremophor EL (BASF; Parsippany, N.J.) или фосфатно-буферный раствор (PBS). В любом случае композиция должна быть стерильной и достаточно жидкой для того, чтобы ее можно было без труда ввести через шприц. Она должна быть устойчивой в условиях производства и хранения и защищенной от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибки. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль) и их смеси. Надлежащую текучесть поддерживают, например, путем использования покрытия, например лецитинового,путем поддержания нужного размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностноактивных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов может достигаться при помощи различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлоробутанола, фенола,аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях предпочтение отдают включению в композицию изотонических агентов, например сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит или хлорида натрия. Стерильные растворы для инъекций получают путем включения активного соединения (например,составного белка или антитела против составного белка) в нужном количестве в соответствующий растворитель с одним из вышеперечисленных ингредиентов или их комбинацией в соответствии с требованиями, с последующей стерилизацией путем фильтрации. Как правило, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный наполнитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, которая обеспечивает на выходе порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый ингредиент из его предварительно стерильно фильтрованного раствора. Особое предпочтение отдают рецептированию композиций для перорального или парентерального введения в форме дозированной единицы для облегчения введения и единообразия доз. Форма дозированной единицы в контексте данного описания означает физически дискретные единицы, приемлемые в качестве единичных доз для субъекта, подвергающегося лечению. Каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для обеспечения необходимого терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут включаться в векторы и использоваться в качестве векторов для генной терапии. Векторы для генной терапии могут доставляться в организм субъекта, например, путем внутривенной инъекции, местного введения (US-A 5328470) или стереотаксической инъекции (см., например, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). Фармацевтическая композиция вектора для генной терапии может включать вектор для генной терапии в приемлемом разбавителе или может включать медленно высвобождающийся матрикс, в который включен наполнитель для доставки гена. В альтернативном варианте, в котором полный вектор для доставки гена может быть образован в целом виде из рекомбинантных клеток, например ретровирусных векторов, фармацевтическая композиция может включать одну или несколько клеток, образующих систему доставки гена. Фармацевтические композиции могут содержаться в таре, упаковке или дозаторе вместе с инструкциями по применению. Применение и способы согласно изобретению. Описанные авторами молекулы нуклеиновых кислот, белки, гомологи белков и антитела могут применяться с использованием одного или нескольких из следующих способов:c) предиктивной медицины (например, диагностических анализов, прогностических анализов). Составной белок взаимодействует с другими клеточными белками, в частности стволовыми клетками, и, таким образом, может применяться для усиления процессов заживления непосредственно путем дифференциации ЕРС в эндотелиальные клетки стенок сосудов или посредством секреции положительных модулирующих факторов. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут применяться для экспрессии составного белка (например, через рекомбинантный вектор экспрессии в клетке-хозяине при применении генной терапии). Кроме того, составной белок может применяться для отбора медикаментов или соединений, модулирующих активность или экспрессию составного белка, а также для лечения заболеваний. Кроме того, могут применяться антитела против составного белка согласно изобретению для модулирования активности составного белка. Способы лечения. Настоящее изобретение обеспечивает как профилактические, так и терапевтические способы лечения субъекта, подверженного риску (или восприимчивого) сердечно-сосудистого заболевания или страдающего от сердечно-сосудистого заболевания, связанного с открытым субэндотелиальным коллагеном. Профилактические способы. В одном аспекте изобретение обеспечивает способ профилактики у субъекта заболевания или состояния, связанного с открытым субэндотелиальным коллагеном. Субъекты, подверженные риску заболевания, вызываемого или возникающего при участии открытого субэндотелиального коллагена, могут распознаваться, например, традиционными способами идентификации субъекта, подверженного риску сердечно-сосудистых явлений, таких как высокий уровень LDL холестерина, артериальная гипертензия,сахарный диабет, курение, и при помощи существующих и новых биомаркеров для неустойчивых артериальных бляшек, таких как увеличение бляшек при контрастной ЯМР-визуализации, тропонин Т и I илиRGD пептиды. В частности, полипептид согласно изобретению применяют для лечения сердечно-сосудистого заболевания. Некоторые сердечно-сосудистые заболевания связаны с эндотелиальными повреждениями,открывающими коллаген для воздействия тромбоцитов. Для лечения таких нарушений может применяться полипептид согласно изобретению. К таким нарушениям относятся все осложнения атеросклероза, такие как острые коронарные синдромы (такие как инфаркты миокарда) и острые или хронические цереброваскулярные нарушения, такие как преходящие ишемические нарушения мозгового кровообращения (TIA) или инсульт, кардиологического или коронарного вмешательства путем чрескожного введения катетера (PCI) и операция на сердце. Кроме того, путем предварительной инкубации кроветворных стволовых клеток с составным белком и связывания коллагена костного мозга через гликопротеин VI составного белка может быть улучшена репопуляция костного мозга стволовыми клетками после трансплантации. Терапевтические способы. Полипептид согласно настоящему изобретению может применяться согласно терапевтическим способам профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания. Предпочтительно полипептид согласно настоящему изобретению применяют в форме димера. В частности, полипептид согласно настоящему изобретению может применяться для хоминга клеток-предшественников для улучшения восстановления сосудов. Режим дозирования при введении полипептида зависит от возраста, массы, пола и состояния субъекта, подвергаемого лечению. Доза предпочтительно может пребывать в диапазоне от 0,01 до 2 г поли- 14023016 пептида согласно настоящему изобретению на пациента в день. Полипептид предпочтительно вводят парентерально. Введение может осуществляться от 1 до 5 раз в день. В одном варианте осуществления способ включает введение полипептида согласно настоящему изобретению в комбинации с другим агентом или комбинацией агентов. Примерами других агентов могут быть GPVI-Fc, тромболитические агенты, такие как рекомбинантный тканевой активатор плазминогена, антитромбоцитарные агенты, такие как блокаторы ADP-рецептора (клопидогрель, тикагрелор, кангрелор и другие), антагонисты тромбина (дабигатран или другие) или антагонисты фактора X (такие как ривароксабан) или гепарин. Примеры Материал. Помимо комплектов и материалов, упомянутых в представленном ниже разделе о способах, применяли указанные ниже вещества. Олигонуклеотиды приобретали у Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Германия). Полимеразу геркулазу (Stratagene, La Jolla, California) использовали для ПЦР-амплификации. Среды для клеточных культур и PBS приобретали у Biochrom (Berlin, Германия). Химикаты приобретали у Roth (Karlsruhe, Германия) и Sigma-Aldrich (Seelze, Германия). Коллаген I крупного рогатого скота приобретали у BD Biosciences (San Jose, California). Амплификация и распознавание вариабельных последовательностей легкой и тяжелой цепей линии клеток гибридомы W6B3H10. МРНК выделяли из клеток 4106 и 1,4107 линии клеток гибридомы W6B3H10 с применением комплекта Oligotex Direct mRNA (QIAGEN, Hilden, Германия) в соответствии с протоколом производителя. 18 мкл выделенной мРНК брали для синтеза кДНК с применением комплекта Superscript III (Invitrogen,Carlsbad, California) в соответствии с протоколом производителя. Для амплификации последовательностей, кодирующих вариабельные участки тяжелых и легких цепей антитела W6B3H10, испытывали различные комбинации праймеров: Bi7/Bi5, Bi8/Bi5 для амплификации вариабельной последовательности легкой каппа-цепи, Bi3/Bi4, Bi3d/Bi4 для вариабельной последовательности тяжелой гамма-цепи (праймеры описываются в публикации Dtibel S. et al., 1994). Полученные в результате полосы вырезали из агарозного геля, очищали с применением комплекта GFX Gel Band Purification (GE Healthcare, Piscataway,New Jersey) и секвенировали при помощи Bi5seq (5' GGGAAGATGGATCCAGTTG 3'; SEQ ID NO: 7),Bi5fwd (5' CCATGTCCATGTCACTTG 3'; SEQ ID NO: 8) и Bi5rev (5' GGTTTCTGTTGATACCAG 3'; SEQID NO: 9) для секвенирования легкой цепи. Последовательности тяжелой цепи получали с использованием праймеров секвенирования Bi4seq (5' CAGGGGCCAGTGGATAGA 3'; SEQ ID NO: 10), Bi4fwd (5'CTGACCTGATGAAGCCTG 3'; SEQ ID NO: 11) и Bi4rev (5' TTCACCCAGTGCACGTAG 3'; SEQ ID NO: 12). Экспрессия и очищение одноцепочечных антител и составных белков. Последовательности ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела, получали путем синтеза генов и клонировали (Geneart, Regensburg, Германия) в вектор экспрессии млекопитающего pcDNA5-FRT (Invitrogen, Carlsbad, California). Временную трансфекцию клеток СНО осуществляли с применением реагентов для трансфекции Attractene (QIAGEN, Hilden, Германия) или Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad,California) в соответствии с протоколами производителей. Поскольку экспрессия при использовании конструкта scFv-hl не обнаруживалась, и экспрессия scFv-lh в клетках СНО была очень слабой, ДНК обоих конструктов субклонировали в бактериальный вектор экспрессии pET22b(+) (Merck, Darmstadt,Германия) через NcoI/XhoI. Последовательности контролировали путем секвенирования, и Е.coli экспрессионного штамма BL21(DE3) (Merck, Darmstadt, Германия) трансформировали с применением этих ДНК. Экспрессию одноцепочечных антител вызывали с использованием 0,2 мМ IPTG. Выделение белков осуществляли путем аффинной очистки Strep-Tactin (IBA BioTagnology, Gottingen, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Последовательность ДНК, кодирующую scFv-lh-GPVI-FdgG2 в pcDNA5-FRT получали от Geneart(Regensburg, Германия). Устойчиво экспрессирующую линию клеток СНО генерировали с применениемLipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad California) согласно прилагаемому протоколу. Для получения составного белка в большем масштабе клетки СНО культивировали в тройных флаконах Т 500 (NUNC,Rochester, New York). Для выделения составного белка клеточный супернатант собирали и очищали с применением 1 мл HP-колонок Hi Trap на белке G (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey). Выделенный белок диализировали в течение суток на PBS. Испытание связывания одноцепочечных антител с CD133 антигеном, экспрессируемым на клеткахHEK 293 путем ELISA-анализа клеток. На 96-луночный планшет с поли-L-лизином (BD Biosciences, San Jose, California) наносили линию экспрессирующих CD133 клеток АС 133/293 следующим образом. 1105 клеток в 0,2 мл среды добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение суток при 37 С, 5% СО 2, чтобы клетки могли присоединиться к поверхности планшета. На следующий день лунки один раз промывали 0,2 мл PBS и фиксировали с использованием 0,1 мл 2% параформальдегида (в PBS, рН 7,4) в течение 10-20 мин при комнатной температуре. Лунки промывали PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20) и блокировали при помощи 1 RotiBlock или 3% молока в PBS-T в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания PBS-T в лунки добавляли последовательные разведения соответствующего антитела и инкубировали при комнатной температуре в течение как минимум одного часа при взбалтывании. После промывания PBS-T добавляли 0,1 мл StrepMAb-Classic-HRP (1:10000 в PBS-T, Iba BioTagnology, Gttingen, Германия) или связанный с пероксидазой хрена IgG против мыши (1:10000 в PBS-T, Dianova, Hamburg, Германия) и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа при взбалтывании. После промывания PBS-T добавляли 0,1 мл субстрата 1-Step Ultra TMB-ELISA (Thermo Scientific, Braunschweig, Германия) и инкубировали до надлежащей проявки синего красителя. Для остановки реакции в каждую лунку добавляли 0,1 мл 1 М H2SO4 и измеряли оптическую плотность при 450 и 595 нм в качестве эталона при помощи планшетридера F200 (TECAN, Mnnedorf, Швейцария). Для определения специфичности связывания а конкурентный ELISA-анализ осуществляли с использованием 300 нг/мл (2 нМ) родительского mAb W6B3H10 и возрастающего количества конкурентного белка. Сигналы обнаруживали при помощи антитела IgGHRP против мыши (1:10000 в PBS-T, Dianova, Hamburg, Германия).ELISA-анализ связывания с иммобилизированным коллагеном I. На 96-луночный планшет Immulon 2 НВ (NUNC, Rochester, New York) наносили 0,1 мл 1 мкг/мл коллагена I крупного рогатого скота в 15 мМ Na2CO3, 35 мМ NaHCO3, pH 9,6 в течение суток при 4 С. Лунки промывали PBS-T, блокировали 0,1 мл 1 RotiBlock (Roth, Karlsruhe, Германия) в PBS-T в течение одного часа и снова промывали перед добавлением 0,1 мл составного белка в трехкратном разбавлении. После одного часа инкубации при комнатной температуре со взбалтыванием лунки промывали PBS-T. Лунки инкубировали с 0,1 мл IgG-HRP против человека (Dianova, Hamburg, Германия), 1:10000 в PBS-T в течение одного часа при комнатной температуре со взбалтыванием. Планшет промывали PBS-T и инкубировали с 0,1 мл 1-Step Ultra TMB-ELISA (PIERCE, Rockford, Illinois). После достаточного проявления окрашивания синим реакции останавливали путем добавления 0,1 мл 1 М H2SO4. Оптическую плотность измеряли при 450 и 595 нм в качестве эталона длины волны с применением планшет-ридера F200(TECAN, Mannedorf, Швейцария). Значения ЕС 50 вычисляли при помощи Sigma Plot 11 с применениемFour Parameter Logistic. Адгезия экспрессирующих CD133 клеток с коллагеном при сдвиговом усилии. На предметное стекло наносили 10 мкг/мл коллагена I согласно публикации Langer et al. (2005) и вставляли в проточную камеру (Oligene, Berlin, Германия). Покрытую коллагеном поверхность стекла предварительно обрабатывали 10 мкг/мл составного белка в течение 30 мин. Для демонстрации зависимости связывания от CD133 стекло также инкубировали с W6B3H10 mAb. Клетки АС 133/293 добавляли и инкубировали при сдвиговом усилии 2000 с-1. Эксперименты записывали на видео и оценивали в автономном режиме. Лигирование сонной артерии у мышей и оценка адгезии ЕРС путем прижизненной микроскопии. Клетки CD133+ выделяли из пуповинной крови человека согласно описанию (Bueltmann A. et al.,2003). Для оценки влияния составного белка на рекрутинг ЕРС in vivo, авторами применялась интравитальная флуоресцентная микроскопия согласно описанию (Massberg et al, 2002). Перед экспериментами ЕРС окрашивали сукцинимидиловым эфиром 5-карбоксифлуоресцеин диацетата (DCF) и инкубировали с составным белком (20 мкг/мл/100 нМ) или GPVI-Fc (15 мкг/мл/100 нМ) в течение 30 мин. МышейC57BL/6J дикого типа (Charles River Laboratories) подвергали анестезии путем внутрибрюшинной инъекции раствора мидазолама (5 мг/кг массы тела; Ratiopharm), медетомидина (0,5 мг/кг массы тела; Pfizer) и фентанила (0,05 мг/кг массы тела, CuraMed/Pharam GmbH). Полиэтиленовые катетеры (Portex) вводили в правую яремную вену и путем внутривенной инъекции вводили флуоресцентные ЕРС (5104/250 мкл). Общую сонную артерию высвобождали путем надреза и сильно лигировали в течение 5 мин, чтобы вызвать повреждение сосуда. До и после повреждения сосуда взаимодействие флуоресцентных ЕРС с поврежденными стенками сосуда визуализировали при помощи in situ in vivo видеомикроскопии общей сонной артерии с применением микроскопа Zeiss Axiotech (20 водно-иммерсионный объектив, W 20/0,5; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) с ртутной лампой HBO на 100 Вт для эпи-иллюминации. Количество прилипших ЕРС определяли путем подсчета клеток, которые не перемещались или не отделялись от поверхности эндотелия в течение 15 с. Их количество указывается как клетки/мм 2 поверхности эндотелия. Модель инфаркта миокарда на мышах NOD/Scid. Мышей NOD/Scid подвергали анестезии согласно представленному выше описанию. В трахею вставляли трубку для искусственного дыхания. После раскрытия грудной клетки левую нисходящую коронарную артерию лигировали на 45 мин, перевязав нитью. После реперфузии, которая обеспечивалась снятием лигатуры грудную клетку и трахею зашивали. Сразу после этого и через 48 ч выделенные человеческие клетки-предшественники CD34+, предварительно обработанные в течение 30 мин составным белком (20 мкг/мл) или эквимолярным количеством Fc-контрольного белка, вводили внутривенно через хвостовую вену. Другая контрольная группа не получала клеток-предшественников после операции. Фракционное изменение площади (FAC) определяли при помощи эхокардиографии через 7 и через 28 дней после хирургического вмешательства для оценки функции левого желудочка. Затем мышей умерщвляли и размер площади инфаркта анализировали путем окрашивания Evans Blue и ТТС. Гуманизация одноцепочечного антитела мыши путем трансплантации CDR. Одноцепочечный компонент составного белка, взятого из мышиных последовательностей, подвергали гуманизации путем трансплантации CDR. В качестве исходного материала использовали бактериальный вектор экспрессии pET22b-scFv-lh, включающий последовательность для одноцепочечного антитела, а также экспрессирующую CD133 линию клеток HEK 293 АС 133/293 вместе с контрольными клетками HEK 293. Способы, применяемые в процедуре гуманизации, детально перечисляются ниже. Протокол создания фаг-дисплейной библиотеки. 1. Получение хелперного фага. Хелперный фаг получали путем инфицирования бактериальных клеток TG1 лог-фазы хелперным фагом в различных степенях разбавления в течение 30 мин при 37 С и помещения на планшеты 2TY с агаром. Небольшую бляшку инкубировали в 3 мл жидкой среды 2TY вместе с 30 мкл суточной культурыTG1 и выращивали в течение 2 ч при 37 С. Эту культуру разбавляли в 1 л среды 2TY и выращивали в течение 1 ч. После добавления канамицина до 50 мкг/мл культуру выращивали в течение 16 ч при 37 С. Клетки удаляли путем центрифугирования (10 мин при 5000 g) и фаг осаждали из супернатанта путем добавления 0,25 объема осадителя фагов. После 30 мин инкубации на льду частицы фага собирали путем центрифугирования в течение 10 мин при 5000 g с последующим ресуспендированием бляшки в 5 млPBS и стерилизацией через фильтр 0,22 мкм. Хелперный фаг титровали путем определения количества бляшкообразующих единиц (pfu) на планшетах 2TY с верхними агаровыми слоями, которые содержали 100 мкл TG1 (насыщенная культура) и фаг в разных степенях разбавления. Исходный раствор фага разбавляли до 11013 pfu/мл и хранили в небольших аликвотных количествах при -20 С. 2. Приготовление исходных библиотечных фагов. Библиотечные фаги получали путем инокуляции 500 мл 2TY-G исходной библиотекой в глицерине и инкубации при 37 С со взбалтыванием при 250 об/мин до оптической плотности при 600 нм 0,8-0,9. К культуре добавляли хелперные фаги VCSM13 до окончательной концентрации 510 pfu/мл и культуру инкубировали в течение 30 мин при 37 С без взбалтывания, затем в течение 30 мин с легким взбалтыванием при 200 об/мин для инфицирования фагом. Клетки извлекали путем центрифугирования при 2200 g в течение 15 мин и их пеллет ресуспендировали в том же объеме 2TY-AK. Эту культуру инкубировали в течение суток при 30 С с быстрым взбалтыванием (300 об/мин). Клетки гранулировали путем центрифугирования при 7000 g в течение 15 мин при 4 С и супернатант, содержащий фаги, извлекали в предварительно охлажденные 1 л бутылки. 0,3 объема осадителя фагов добавляли к супернатанту, смешивали и инкубировали в течение 1 ч на льду для осаждения фага. Фаг гранулировали путем центрифугирования дважды при 7000 g в течение 15 мин в той же бутылке при 4 С. Как можно большее количество супернатанта удаляли и пеллет ресуспендировали в 8 мл PBS. Фаг повторно центрифугировали в меньших пробирках при 12000 g в течение 10 мин и фаг извлекали через супернатант, не повреждая бактериальный пеллет, который может образоваться. И наконец, исходные фаги титровали путем инфицирования клетокTG1 исходным фагом в разных степенях разбавления, помещения в 2TY-AG, инкубации и подсчета количества образовавшихся резистентных к ампициллину колоний. Затем фаги хранили в аликвотных количествах при 4 С. Протокол пэннинга фаг-дисплейной библиотеки. На лунки планшета для пэннинга с микротитрованием наносили CD133-комбинированные препараты мембран из экспрессирующих CD133 клеток АС 133/293 непосредственно путем инкубации в течение 2 ч при 37 С и блокировали при помощи блокирующего буфера (PBS, содержащего 2% молока) при 4C в течение суток. Блокированные лунки промывали 6 раз 0,1% PBST (PBS с 0,1-0,3% Tween 20 (об./об. и смесь одинаковых объемов библиотеки фагов и 4% PBSM в общем объеме 0,5 мл добавляли в контрольные лунки [предварительно блокированные]. В течение первого цикла отбора количество частиц фага должно быть как минимум в 100 раз большим, чем размер библиотеки (например, 1012 cfu для библиотеки из 1010 клонов). Разнообразие снижается до 106 после первого цикла, и, таким образом, на последующих циклах отбора такой необходимости нет. Планшет инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре для блокирования мест связывания. Входную смесь фагов добавляли в лунки для пэннинга[покрытые белками-мишенями], инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин и промывали 10-20 раз PBSMT (PBS с содержанием 2% молока). Фаг элюировали путем инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре с 200 мкл кислого элюирующего буфера. Супернатант, содержащий фаги переносили в новую пробирку и нейтрализовали Tris-HCl буфером. Свежую экспонентно выращиваемую культуру Escherichia coli TG1 инфицировали элюированными фагами и половину их амплифицировали для дальнейших циклов отбора. Оставшийся элюат хранили при 4 С. Протокол FACS фагового контроля качества. Клетки АС 133/293 собирали в 1 мл PBS с содержанием 5 микроМ EDTA (10 мкл 0,5 М исходного раствора), сразу же смешивали для предотвращения свертывания и держали на льду. Клетки промывали 2-3 FACS буфером (PBS с добавлением 1% BSA или 5% FBS и с содержанием 0,05% NaN3) и пеллет клеток после окончательного промывания суспендировали в 50 микролитрах FACS буфера. 10 мкл растворов фагов добавляли к 50 мкл суспензии клеток, осторожно смешивали и инкубировали в течение 30 мин на льду. Клетки промывали 2-3 FACS буфером и суспендировали в 50 мкл FACS буфера. 10 мкл раствора антитела [кроля против M13pAb-FITC] добавляли к 50 мкл суспензии клеток, осторожно смешивали и инкубировали в течение 30 мин на льду. Клетки промывали 2-3 FACS буфером и суспендировали в 200-300 мкл FACS буфера для анализа. Протокол измерения аффинности с применением фагового FACS и программы GraphPad Prism 4.0. Нужный фаг-дисплейный scFv нормализовали до одинаковых титров перед анализом, разбавляли до разных титров и анализировали согласно представленному выше описанию. Выход фагового FACS использовали для вычисления постепенного аффинности нужного scFv согласно примеру в руководстве для пользователей программы GraphPad Prism 4.0. Экспрессия и очищение гуманизированного составного белка. После получения информации о последовательности для клона 26 гуманизированного одноцепочечного антитела последовательность для гуманизированного составного белка собирали in silico, синтезировали и клонировали (Geneart, Regensburg, Германия) в вектор экспрессии млекопитающего pcDNA5FRT (Invitrogen, Carlsbad, California). Устойчивую линию клеток получали в соответствии с описанным выше протоколом, согласно которому составной белок экспрессировали и секретировали в супернатант клеток СНО и очищали с применением 1 мл HP-колонки Hi Trap на белке G (GE Healthcare, Piscataway,New Jersey). Выделенный белок диализировали в течение суток на PBS. Испытание связывания гуманизированного составного белка с антигеном CD133, экспрессированным на клетках HEK 293, путем ELISA-анализа клеток. Способ согласно представленному выше описанию, за исключением того, что на 96-луночный планшет с поли-L-лизином наносили только 6-7104 клеток АС 133/293 на лунку. Прижизненная микроскопия для определения агрегации тромбоцитов после лигирования левой общей сонной артерии. Для экспериментов с прижизненной микроскопией использовали самцов мышей C57B1/6J. Богатую тромбоцитами плазму получали путем центрифугирования при 120g в течение 10 мин из 1 мл цитратной крови мыши-донора, которую доводили до 2 мл буфером Tyrodes, pH 6,5. Супернатант, содержащий тромбоциты, отделяли и тромбоциты флуоресцентно метили путем добавления 20 мкл ацетоксиметилового эфира 5-карбоксифлуоресцеин диацетата (Invitrogen) и инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре в темноте. Объем дополняли до 4 мл при помощи Tyrodes, pH 6,5 и тромбоциты осаждали путем центрифугирования при 900g в течение 12 мин. Тромбоциты ресуспендировали в 250 мклTyrodes, pH 6,5, и Tyrodes, pH 7,4, соответственно, подсчитывали аликвотное количество и число тромбоцитов доводили до 2,81010/мл. Экспериментальных мышей (242 г) подвергали анестезии путем внутрибрюшинной инъекции раствора медетомидина (0,5 мг/кг массы тела, Pfizer), мидазолама (5 мг/кг массы тела, Roche) и фентанила (0,05 мг/кг массы тела, Janssen-Cilag). Температуру тела в течение операции поддерживали на неизменном уровне 38,5 С при помощи системы гомеотермического покрывала(Harvard Apparatus). Полиэтиленовый катетер (Portex) вводили в левую хвостовую вену и после вырезания левой общей сонной артерии 250 мкл (7109) меченых тромбоцитов вводили путем внутривенной инъекции в хвостовую вену. Затем внутривенно вводили 1 мг/кг массы тела гуманизированного составного белка или эквимолярное количество контрольного белка FcIgG2. Левую общую артерию сильно лигировали в течение 5 мин, перевязав нитью (7-0 Prolene, Ethicon), чтобы вызвать повреждение сосуда. Участок лигирования контролировали при помощи флуоресцентного микроскопа (Axioskop 2 FS mot,Carl Zeiss) с ртутной лампой HBO на 100 Вт для эпи-иллюминации и s/w-CCD камерой ВС 71 (Horn Imaging) с разными интервалами времени после лигирования. Агрегаты тромбоцитов определяли путем анализа среднего из трех неподвижных изображений при помощи программы Photoshop CS5, причем размер участков с более высокой интенсивностью света, образуемых агрегатами тромбоцитов, измеряли в пикселах, а затем переводили в мкм 2 с применением определенной сетки. Результаты и обсуждения Распознавание вариабельных последовательностей, кодирующих моноклональное антителоW6B3H10, и построение конструкта. После ПЦР-амплификации, которая обеспечивала продукты с каждой комбинацией праймера, полосы вырезали из геля, очищали и секвенировали. Собирали последовательности, полученные в результате секвенирования с тремя различными праймерами каждая (фиг. 1) и сравнивали с базой данных IgG с использованием IGBlast NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Для определения последовательностей для одноцепочечных антител (scFv) в двух возможных ориентациях "легкая-тяжелая" или "тяжелая-легкая" лидерную последовательность каждой выбирали из базы данных V-Base (см. http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) для обеспечения секреции антитела в среду клеточных культур млекопитающих. Последовательности тяжелых и легких цепей соединяли Gly-Ser линкером, кодирующим Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 13). Для возможности выделения одно- 18023016 цепочечных антител путем аффинной очистки последовательность, кодирующую Strep Tag II, добавляли на С-конце. Установленные последовательности конструктов под названием scFv-lh и scFv-hl показаны на фиг. 2. Экспрессия одноцепочечных антител и испытание связывания с CD133. После временной трансфекции клеток СНО одноцепочечными конструктами слабая экспрессия может быть обнаружена при помощи scFv-lh (см. фиг. 3). После крупномасштабной трансфекции может быть выделено достаточное количество белка, который подлежит испытанию на связывание с CD133 в ходе ELISA-анализа клеток. Параллельно белок также экспрессировался в E.coli для достаточного образования исходного материала. ScFv-hl, который не может экспрессироваться в клетках СНО, получали и очищали только из Е.coli. (см. фиг. 4). Для того чтобы определить, распознают ли одноцепочечные антитела их антиген CD133, трехкратные серийные разбавления одноцепочечных антител инкубировали на фиксированных клетках АС 133/293, экспрессирующих антиген CD133 на их поверхности. При явном связывании scFv-lh с высокой аффинностью в нижнем наномолярном диапазоне неожиданно было обнаружено отсутствие аффинностиscFv-hl к CD133 (см. фиг. 5 А). Этот факт был обусловлен не разными системами экспрессии, поскольку scFv-lh, очищенный от Е.coli, демонстрирует такие же характеристики связывания, что и у выделенного из культуры клеток млекопитающего. Для испытания на специфичность взаимодействия scFv-lh с CD133, связывание 2 нМ W6B3H10mAb с CD133 на фиксированных клетках АС 133/293 конкурировало с возрастающим количеством одноцепочечного антитела. Это четко продемонстрировало, что scFv-lh может эффективно блокировать связывание моноклонального антитела с антигеном CD133 (фиг. 5 В) с показателем IC50 3,1 нМ. Эта неожиданно высокая аффинность может быть обусловлена значительно меньшим размером молекулы, которая делает иммобилизованный CD133 для scFv-lh более доступным по сравнению с большим mAb. Построение, экспрессия и характеризация составного белка. После распознавания scFv-lh в качестве составляющей составного белка GPVI-FcIgG2 выбирали в качестве второго компонента для бифункционального белка. Если GPVI должен посредничать в связывании с коллагеном, то человеческий Fc-компонент IgG2 был выбран для обеспечения аффинной очистки с одной стороны и для избежания нежелательных эффекторных функций, связанных с более часто применяемым FcIgG1, с другой стороны. Таким образом, составной белок был построен таким образом,чтобы за компонентом одноцепочечного антитела scFv-lh следовали растворимый гликопротеин VI иFcIgG2, разделенные тремя аминокислотными GGR-линкерами для большей гибкости (фиг. 6). Составной белок экспрессировался в адгезионной культуре устойчиво трансфицированных клеток СНО в тройных флаконах Т 500. Супернатанты очищали при помощи аффинной хроматографии на белкеG. Типичный выход составного белка составлял в пределах 2-2,7 мг/л. Идентичность и степень чистоты белка контролировали путем вестерн-блоттинга с применением антитела IgG против человека, связанного с пероксидазой хрена (данные не показаны), и при помощи окрашенного бриллиантовым синим Кумасси полиакриламидного геля (фиг. 7). Отделение составного белка в восстановительных условиях в результате давало размер полосы приблизительно 90 кДа. Молекулярная масса в невосстановительных условиях составляла приблизительно 180 кДа, что явно демонстрировало, что белок существует в форме димера. Теоретическая молекулярная масса мономерного белка 79,1 кДа показывает, что он должен подвергаться посттрансляционной модификации, наиболее вероятно - путем гликозилирования. Для гликопротеина VI тромбоцитов описывается лишь один N-связанный центр гликозилирования на аминокислоте 92 (Kunicki et al., 2005). Компонент одноцепочечного антитела не имеет консенсусной последовательности для N-связанного гликозилирования, в то время, как Fc-часть IgG2 также включает один N-связанный центр гликозилирования. Поскольку эти два центра гликозилирования недостаточны для того, чтобы обусловливать наблюдаемую разницу в размерах, составной белок может содержать дополнительные О-связанные центры гликозилирования. Характеристики связывания составного белка с CD133 и коллагеном. Связывание составного белка и W6B3H10 mAb с CD133 сравнивали с применением ELISA с фиксированными клетками АС 133/293 (фиг. 8 А). Наблюдаемые значения ЕС 50 0,21 нМ для составного белка и 0,12 нМ для W6B3H10 mAb относились к одному порядку величин. Таким образом, свойства связывания составного белка с антигеном CD133 были улучшены в сравнении с одноцепочечным антителом, что может лишь частично объясняться димеризацией составного белка, которая приводит к двум идентичным антигенсвязывающим центрам, подобно ситуации, имеющей место в случае антитела полного размера. Полипептид GPVI-FcIgG2, следующий за одноцепочечным полипептидом, может иметь определенное стабилизирующее влияние на трехмерную структуру одноцепочечного антитела, что, по-видимому,способствует связыванию антигена. Для подтверждения специфичности связывания осуществляли конкурентный ELISA-анализ с 2 нМ W6B3H10 mAb и возрастающим количеством составного белка. Эффективное ингибирование связывания mAb с фиксированными клетками АС 133/293 подтвердило, что свя- 19023016 зывание опосредовано CD133 (см. фиг. 8 В). Также было продемонстрировано связывание составного белка со вторым партнером по связыванию коллагеном I. В ELISA-анализе с иммобилизированным коллагеном I связывание составного белка сравнивали со связыванием GPVI-FcIgG1. Для обоих наблюдалось зависящее от дозы связывание, однако показатели аффинности связывания неожиданно оказались разными (фиг. 9 А). Специфичность связывания составного белка с коллагеном подтверждалась конкурентным ELISA-анализом с растворимым коллагеном I (фиг. 9 В). Биспецифическое связывание составного белка в динамических условиях. В предыдущих экспериментах связывание составного белка с каждым из партнеров по связыванию демонстрировалось отдельно. Для подтверждения бифункциональности молекулы путем одновременного связывания с обоими белками-мишенями на предметное стекло наносили 10 мкг/мл коллагена I,вставляли в проточную камеру, предварительно инкубировали с 10 мкг/мл составного белка и инкубировали с экспрессирующими CD133 клетками АС 133/293 при сдвиговом усилии 2000/с, моделируя условия кровотока человека. Этот эксперимент демонстрирует, что составной белок очень эффективно посредничает в связывании экспрессирующих CD133 клеток с коллагеном даже при сдвиговом усилии. Связывание может быть ревертировано путем добавления родительского W6B3H10 mAb, что показывает, что иммобилизация клеток АС 133/293 на поверхности коллагена зависит от CD133 (фиг. 10).In vivo связывание ЕРС с поврежденными кровеносными сосудами. Для того чтобы испытать, могут ли экспрессирующие CD133 ЕРС эффективно рекрутироваться и присоединяться к стенкам поврежденного кровеносного сосуда, ЕРС выделяли из пуповинной крови человека, флуоресцентно метили и предварительно инкубировали с GPVI-Fc составного или контрольного белка, а затем внутривенно вводили в яремную вену подвергнутой анестезии мыши. После повреждения стенки сонной артерии количество присоединенных ЕРС подсчитывали с увеличивающимися интервалами времени. Было четко продемонстрировано, что составной белок значительно увеличивает количество присоединенных ЕРС в сравнении с контрольным белком, с наибольшим количеством клеток через 5 мин после повреждения и с сохранением значительного количества клеток через 60 мин (фиг. 11). То, что предварительная инкубация ЕРС с контрольным белком также приводит к значительному количеству прилипающих ЕРС, может объясняться установленным фактом, что ЕРС прилипают к местам повреждения сосудов посредством тромбоцитов (Abou-Saleh et al, 2009). Предварительная инкубация с составным белком может быть особенно благоприятной для пациентов с факторами риска заболевания коронарной артерии, у которых число циркулирующих ЕРС является низким и которые могут подвергаться лечению либо путем трансплантации аллогенных ЕРС, либо при помощи выращиваемых ex vivo аутологичных трансплантатов ЕРС. Влияние составного белка на функцию левого желудочка и площадь инфаркта в модели инфаркта миокарда на мышах NOD/Scid. Инфаркт у мышей NOD/Scid вызывали путем лигирования левой нисходящей коронарной артерии. Влияние применения клеток-предшественников CD34+, предварительно обработанных 20 мкг/мл составного белка, на функцию левого желудочка и размер площади инфаркта анализировали путем эхокардиографии и окрашивания сердца после умерщвления животного. Поскольку влияние на функцию левого желудочка могло наблюдаться через 7 дней после операции, на 28-й день были очевидными значительные расхождения по сравнению с животными, не получавшими клеток-предшественников, и животными, получавшими клетки-предшественники, инкубированные с Fc контролем (см. фиг. 12 А). Лечение с применением составного белка также приводило к значительному уменьшению размера площади инфаркта, как показано на фиг. 12 В. Механизмы, лежащие в основе наблюдаемого положительного влияния, до сих пор не выяснены. Многие исследования на животных показали, что лишь малая часть стволовых клеток, прививаемых для восстановления миокарда, дифференцирует в кардиомиоциты или сосудистые клетки, однако предполагается, что наблюдаемое улучшение сердечной функции может быть вызвано трофической поддержкой или паракринными факторами, секретируемыми клеткамипредшественниками, которые могут благоприятно влиять на соседние клетки или активизировать резидентные стволовые клетки сердца (GrecoLaughln, 2010). Характеризация фагов, экспрессирующих гуманизированное sc-антитело. Процедура гуманизации антитела путем трансплантации CDR, при которой последовательностиCDR переносили на консенсусную (H-SubI- и Н-SubI-VH) акцепторную каркасную последовательность человеческой подгруппы, приводила к распознаванию трех клонов фага (26, 27, 29) со значительной аффинностью к мембранно-связанному CD133. FACS-измерения серийных разбавлений фага показали KD 32,19 пМ для клона 26 (средний показатель флуоресценции) и 50,78 и 102,9 пМ для клона 27 и 29 соответственно (фиг. 13 А, 13 В). Для сравнения, фаг, включающий исходное одноцепочечное антитело мыши,демонстрировал KD 25,63 и 26,93 пМ в двух независимых экспериментах. Оценка гуманизации последовательностей VL и VH клона 26 в интерактивном режиме (http://www.bioinf.org.uk/abs/shab/) в сравнении с показателями мышиной донорной и человеческой акцепторной последовательности показала сдвиг в Zпоказателе в сторону значения человеческой акцепторной последовательности (см. фиг. 14), что подтверждает более свойственную для человеческой последовательности характеристику гуманизированной последовательности. Это также может быть продемонстрировано путем сравнения белковых последовательностей мышиного или гуманизированного одноцепочечного антитела с человеческой акцепторной последовательностью (см. фиг. 15). Гуманизированное антитело демонстрирует идентичность последовательности 76% с расхождениями, обусловленными главным образом, различными гипервариабельными участками, в то время как мышиное одноцепочечное антитело является лишь на 59% идентичным по аминокислотной последовательности в сравнении с человеческой акцепторной последовательностью. В обоих выравниваниях связующая линкерная пептидная последовательность была пропущена. Сопоставление выровненной нуклеотидной последовательности гуманизированного составного белка с аминокислотной последовательностью родительской молекулы с одноцепочечным компонентом мышиного происхождения в результате продемонстрировало идентичность последовательности 95% (см. фиг. 16). Образование гуманизированного составного белка и его экспрессия и характеризация. Последовательность гуманизированного одноцепочечного антитела, демонстрирующая наивысшую аффинность к мембранно-связанным CD133 (клон 26), которая относилась к одному порядку величин с одноцепочечной последовательностью мыши, выбирали для образования гуманизированного составного белка hscFv-lh-GPVI-Fc (см. фиг. 16). Партию белка образовывали из линии устойчиво трансфицированных клеток СНО и очищали от клеточного супернатанта путем аффинной хроматографии на белке G. Идентичность белка подтверждалась вестерн-блоттингом с антителом IgG против человека, которое связывается с Fc фрагментом составного белка. Степень чистоты контролировали в полиакриламидном геле,окрашенном бриллиантовым синим Кумасси. Как в восстановительных, так и в невосстановительных условиях гуманизированный составной белок демонстрировал одинаковый характер миграции с составным белком с мышиным одноцепочечным компонентом (см. фиг. 18). Таким образом, процесс гуманизации, очевидно, не вносил изменений в составной белок в плане посттрансляционных модификаций, таких, как характер гликозилирования или димеризация молекулы. Испытание связывания гуманизированного составного белка с антигеном CD133 и коллагеном. Связывание гуманизированного составного белка с трансмембранным белком CD133 на устойчивой линии клеток АС 133/293 путем ELISA-анализа клеток с фиксированными клетками сравнивали со связыванием родительского составного белка (фиг. 19). Показатель ЕС 50 обеих молекул, рассчитанный при помощи Sigma Plot 11.0, пребывал в том же диапазоне 0,25-0,3 нМ. Конкурентный ELISA с 2 нМW6B3H10 mAb и составными белками в качестве конкурентов подтвердил специфичность связывания и продемонстрировал значения IC50 2,7 и 31 нМ для гуманизированного и мышиного составного белка соответственно. Гуманизация составного белка не должна изменять свойства связывания его компонентаGPVI с коллагеном I. Для подтверждения этого предположения связывание измеряли с применениемELISA с иммобилизированным коллагеном крупного рогатого скота I. Зависимое от дозы связывание обоих белков может быть продемонстрировано с показателями ЕС 50 4,7 и 6,3 нМ для гуманизированного и родительского составного белка соответственно (см. фиг. 20).In-vivo влияние гуманизированного составного белка на агрегацию тромбоцитов после повреждения общей сонной артерии на мышиной модели. Для того чтобы определить, имеет ли гуманизированный составной белок какое-либо влияние на агрегацию тромбоцитов после повреждения общей сонной артерии, флуоресцентно меченные тромбоциты мыши-донора вводили внутривенно с последующим вливанием 1 мг/кг гуманизированного составного белка или эквимолярного количества Fc-контрольного белка и выполняемым сразу после этого лигированием кровеносного сосуда. Определение размера агрегатов тромбоцитов, образовавшихся до 60 мин после лигирования, продемонстрировало очень значительные расхождения между группой, получавшей гуманизированный составной белок, и контрольной группой (р 0,005, t-тест Стьюдента) см. фиг. 23),подтверждая способность гуманизированного составного белка к конкуренции со связанным с тромбоцитами GPVI за связывание с коллагеном in-vivo, что, в свою очередь, приводило к снижению активизации тромбоцитов и образованию агрегатов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, к которой относятся:i. молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента;ii. молекула нуклеиновой кислоты, включающая фрагмент из как минимум 1500 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента;iii. молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как минимум на 85% идентичную SEQ ID NO: 2;iv. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем фрагмент включает как минимум 500 заменимых аминокислот SEQ ID NO: 2; иv. молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем молекула нуклеиновой кислоты гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее комплемент, в условиях инкубации при 45C в 6,0SSC с последующим промыванием в 0,2SSC/0,1% SDS при 65C. 2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что выбирается из группы, к которой относятся:a) нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1; иb) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;c) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по п.1, включающий гуманизированный иммуноглобулин, имеющий специфичность связывания с CD133, или части иммуноглобулина, име- 22023016 ющего специфичность связывания с CD133. 3. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, отличающаяся тем, что включает векторные нуклеиново-кислотные последовательности. 4. Клетка-хозяин, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3. 5. Полипептид, способный одновременно и избирательно связываться с коллагеном и CD133 белком, который выбран из группы, к которой относятся:a) фрагмент полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем фрагмент включает как минимум 600 заменимых аминокислот SEQ ID NO: 2;b) вариант полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, причем вариант кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей полную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее комплемент в условиях инкубации при 45C в 6,0SSC с последующим промыванием в 0,2SSC/0,1% SDS при 65C;c) полипептид, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая как минимум на 85% идентична нуклеиновой кислоте, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента; иd) полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична SEQ ID NO: 2. 6. Полипептид по п.5, отличающийся тем, что включает аминокислотную последовательность SEQID NO: 2. 7. Полипептид по п.5 или 6, отличающийся тем, что включает гипервариабельные участки иммуноглобулина, имеющие специфичность связывания с CD133. 8. Полипептид по п.7, отличающийся тем, что включает в качестве гипервариабельных участков аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 и/или 30 или их части. 9. Полипептид по п.7 или 8, отличающийся тем, что включает каркасный участок иммуноглобулина, взятый из иммуноглобулина человеческого происхождения. 10. Полипептид по любому из пп.5-9, отличающийся тем, что является димером. 11. Способ получения полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 2, причем способ включает культивирование клетки-хозяина по п.4 в условиях, в которых экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты. 12. Фармацевтическая композиция, включающая полипептид по любому из пп.5-9. 13. Применение полипептида по любому из пп.5-9 для профилактики, лечения или диагностики сердечно-сосудистого заболевания. 14. Применение полипептида по любому из пп.5-9 для производства медикамента для профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания. 15. Применение полипептида по любому из пп.5-9 для получения диагностического маркера для неустойчивых бляшек.