Антигенсвязывающие белки

Антигенсвязывающие белки, которые связываются с -амилоидным пептидом; фармацевтические композиции, содержащие указанные антигенсвязывающие белки, для лечения ассоциированных с Алар Филипп Марк Луи (BE), Эллис Джонатан Генри, Форд Сюзанна Карен, Гермашевски Фолькер, Льюис Алан Питер, Соден Питер Эрнест,Томас Памела Джоан, Уоттам Тревор Энтони Кеннет, Гоф Джеральд Уэйн,Кэтчпол Айан Ричард (GB) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB) Изобретение относится к антигенсвязывающим белкам, в том числе антителам, которые связываются с -амилоидным пептидом и в частности -амилоидным пептидом человека. Настоящее изобретение также касается способов лечения заболеваний или расстройств, характеризующихся повышенными уровнями -амилоида или -амилоидными отложениями, в частности болезни Альцгеймера, и заболеваний или расстройств, поражающих глаз или зрительный нерв, характеризующихся повышенными уровнями -амилоида или -амилоидными отложениями, включая возрастную макулярную дегенерацию,заболевания глаукомой разного типа и образование -амилоидзависимой катаракты с применением антигенсвязывающих белков, которые связываются с -амилоидным пептидом, в частности -амилоидным пептидом человека. Другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже описания. Предшествующий уровень техники Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой наиболее распространенную причину возрастного снижения когнитивных функций, поражающую более 12 млн людей во всем мире (Citron M. (2002) Nat.Neurosci. 5, Suppl. 1055-1057). Самые ранние стадии данного заболевания характеризуются прогрессирующей потерей памяти с ассоциированным снижением когнитивных функций и развитием языковых и поведенческих дефицитов. На более поздних стадиях заболевания у пациентов развивается глобальная амнезия и значительно снижается моторная функция. Обычно смерть наступает через 9 лет после постановки диагноза и часто связана с другими состояниями, обычно с пневмонией (Davis K.L. и Samules S.C.J.T. (McGraw-Hill, New York, pp. 267-316. Современные терапии представляют собой симптоматические подходы, фокусирующиеся на уменьшении когнитивной недостаточности и улучшении поведенческих симптомов, ассоциированных с этиологией прогрессирующего заболевания. На практике эти виды лечения оказывают лишь непродолжительное благоприятное воздействие на когнитивную функцию в отношении степени когнитивной недостаточности, длящееся по сообщениям только до 2 лет включительно. Потенциал болезнь-модифицирующей терапии, замедляющей и возможно останавливающей прогрессирование данного заболевания, огромен. Такие подходы обеспечили бы радикальное и продолжительное улучшение качества жизни пациентов и, что важно, лиц, осуществляющих за ними уход, а также снижение очень большой суммарной стоимости медицинского обслуживания этого заболевания. Клинический диагноз болезни Альцгеймера в настоящее время основан на комбинации тестов физических и умственных способностей, приводящих к постановке диагноза возможной или вероятной болезни Альцгеймера, хотя диагностические биомаркеры и визуализация остаются предметом исследования (Sonnen et al. (2007) Expert. Rev. Neurotherapeutics 7(8): 1021-1028; Lockhart et al. (2007) Brain 130: 2607-2615). После смерти наличие заболевания подтверждают присутствием хорошо охарактеризованных неврологических признаков в головном мозге, которые включают отложение А в паренхимальных бляшках и сосудах головного мозга, внутринейронное образование нейрофибриллярных клубков, повреждение синапсов и повреждение нейронных субпопуляций в специфических участках головного мозга(Terry R.D. (1991) J. Neural. Trans. Suppl. 53: 141-145). Изобилие генетических, гистологических и функциональных доказательств подтверждает, что амилоидный пептид (А) является ключевым звеном в прогрессировании болезни Альцгеймера (SelkoeD.J. (2001) Physiological Reviews 81: 741-766), хотя не так давно стало менее понятно, являются ли фактически существующие А-отложения, обнаруживаемые при обследовании после смерти, истинной причиной снижения когнитивных функций (Ferreira S.T. (2007) Life 59(4-5): 332-345). Известно, что А продуцируется в результате расщепления белка-предшественника -амилоида (также известного как АРР) ферментом аспартилпротеазой, известным как ВАСЕ 1 (бета-сайт-АРР-расщепляющий фермент 1) (также известным как -секретаза, Asp2 или мемапсин-2) (De Strooper В. and Konig G. (1999) Nature 402: 471472). В дополнение к отложению в паренхимальных тканях и сосудах постулируется, что растворимые олигомерные формы А вносят вклад в начало развития AD и что они могут оказывать воздействие на нейронную функцию первоначально посредством ослабления синаптической функции (Lambert et. al.(2007) Life 59: 332-345). Несмотря на то что при AD и при умеренной когнитивной недостаточности(MCI) рано обнаруживаются нерастворимые амилоидные бляшки, у таких индивидуумов также увеличиваются уровни растворимых А-агрегатов (иногда называемых олигомерами или происходящими из А диффундирующими лигандами (ADDL, и уровни растворимого А лучше коррелируют с нейрофибриллярной дегенерацией и потерей синаптических маркеров по сравнению с амилоидными бляшками(Naslund et. al. (2000) J. Am. Med. Assoc. 283: 1571-1577, Younkin S. (2001) Nat. Med. 1: 8-19). К тому же эти олигомеры могут являться предшественниками на пути образования фибрилл, и их удаление или нейтрализация могут предотвратить токсические эффекты и образование фибрил (Ferreira S.T. (2007) Life 59(4-5): 332-345; Gong Y. (2003) PNAS 100: 10417-10422). Несмотря на результаты этих исследований,высоко амилоидогенный А 42 и укороченные с аминоконца формы Ах-42 представляют собой преобладающие виды А, обнаруживаемые как в диффузных, так и в сенильных бляшках (Iwatsubo T. (1994)Neuron. 13: 45-53, Gravina S.A. (1995) J. Biol. Chem. 270: 7013-7016) и, по-видимому, относительные уровни А 42 не только являются биомаркером для AD, но также ключевым регулятором агрегации А в амилоидные бляшки. Показано, что А 42 образует агрегаты in vitro легче, чем другие формы А (JarrettJ.T. (1993) Biochemistry, 32: 4693-4697), и как таковой, А 42 вовлечен в качестве инициирующей молекулы в патогенез AD (Younkin S.G. (1998) J. Physiol. (Paris). 92: 289-292). Несмотря на то что обычно А 42 представляет собой минорный продукт метаболизма АРР, незначительные сдвиги в его продуцировании связывают со значительным влиянием на отложение А, и поэтому утверждается, что снижение только уровня А 42 может давать эффективный путь лечения AD (Younkin S.G. (1998) J. Physiol. (Paris). 92: 289-292; Levites et al. (2007) J. Clin. Invest. 116(1): 193-201). В подтвержение этого имеется сообщение, что мутации в генах белка-предшественника амилоида (АРР) и пресенилина главным образом увеличивают относительные уровни А 42 и вследствие этого сокращают время наступления болезни Альцгеймера (AD) (Selkoe D.J., Podlisny M.B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3: 67-99). Однако следует подчеркнуть, что скорость амилоидного отложения также зависит от общих уровней амилоида, катаболизма и эффективности клиренса А из ЦНС, при этом отмечено негативное влияние возраста и повышенных уровней амилоида, как обнаружено при AD (Deane et al. (2005) J. Neurosci. 25(50): 1149511503; Wang et al. (2006) Drug Discovery Today 11(19/20): 931-938). В этом отношении неожиданно стало очевидно, что транспорт А между центральной нервной системой (ЦНС) и плазмой играет основную роль в регуляции уровней амилоида в головном мозге (Shibata, et al. (2000) J. Clin. Invest. 106: 1489-1499),при этом А быстро транспортируется из ЦНС в плазму посредством транспортных механизмов, как например с использованием LRP-1 (белок, подобный рецептору липопротеинов низкой плотности (low density lipoprotein receptor-related protein 1, и А быстро импортируется из плазмы в ЦНС посредством связывания с RAGE (рецептор конечных продуктов усиленного гликозилирования (receptor for advanced glycation endproducts (Zlokovic B.V. (2004) J. Neurochem. 89: 807-811). По этой причине способы активной вакцинации А-пептидами или пассивного введения специфичных к А антител, которые связываются с периферическим А и, следовательно, воздействуют на динамическое равновесие между плазмой, CSF(цереброспинальной жидкостью) и ЦНС, находятся в стадии разработки. Действительно, в настоящее время проводится много исследований, которые демонстрируют, что оба эти подхода могут приводить к снижению уровней А, ослаблять ассоциированную с А патологию и в некоторых случаях обеспечивать благоприятное воздействие на когнитивную функцию в различных трансгенных моделях амилоидоза. Кроме того, проведены ограниченные исследования на видах высших животных (Lemere C.A. (2004)Am. J. Pathology 165: 283-297; Gandy, S (2004) Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 18: 44:46). Животные модели амилоидного отложения созданы посредством сверхэкспрессии мутантных человеческих трансгенов у мышей. У мышей, сверхэкспрессирующих только трансгены АРР человека, обычно развиваются бляшкоподобные -амилоидные отложения в сосудах головного мозга, начиная с 12 месячного возраста (Games D. et al., (1995) Nature 373: 523-527; Hsiao K. et al., (1996) Science 274: 99102, тогда как у мышей, несущих оба трансгена, мутантного человеческого АРР и пресенилина-1 (PS1), бляшкоподобные -амилоидные отложения в сосудах головного мозга обычно развиваются уже в 2 месячном возрасте (Kurt M.A. et al., (2001) Exp.Neurol. 171: 59-71; McGowan E. et al., (1999) Neurolbiol.Dis. 6: 231-244). Такие существенные биологические различия между этими разными используемыми трансгенными мышиными моделями создают трудности при сравнении фармакологии и эффективности разных подходов. Нет единого согласованного мнения относительно того, как в действительности работают иммунотерапии, направленно воздействующие на -амилоид и его различные формы. Весьма вероятно, что разные антитела с разными связывающими свойствами дают различные результаты в этих животных моделях. Кроме этого, кажется обоснованным, что антитела могут действовать множественными механизмами и что разные описанные способы действия не являются взаимоисключающими (Levites etal. (2007) J. Clin. Invest. 116(1): 193-201). Первой примененной в клинике иммунотерапией, направленно воздействующей на амилоид в головном мозге, было использование AN-1792, активной вакцины от Elan/Wyeth. Это лечение было прекращено после развития клинических признаков, сходных с менингоэнцефалитом. Анализ в подгруппах подтвердил, что лечение замедляло снижение когнитивной функции (Nature Clin. Pract. Neurol. (2005) 1: 84-85). Посмертный анализ пациентов также показал факт очищения от бляшек (Gilman S. et al., (2005)Neurology 64 (9), 1553-1562). Бапинеузумаб (Bapineuzumab, AAB-001, Elan/Wyeth), моноклональное антитело для пассивной иммунотерапии, находится в стадии разработки. Другие заболевания или расстройства, характеризующиеся повышенными уровнями -амилоида или -амилоидными отложениями, включают умеренную когнитивную недостаточность (Kelley B.J.(2007) Neurologic. Clinics 25 (3), 577-609), наследственную церебральную геморрагию с -амилоидозом типа Dutch, церебральную -амилоидную ангиопатию и различные типы дегенеративных деменций, как,например, таковые, ассоциированные с болезнью Паркинсона, прогрессирующим супрануклеарным параличом, кортико-базальной дегенерацией и болезнью Альцгеймера по типу болезни диффузных телецOijen M., Lancet Neurol. 2006, 5: 655-60), синдромом Дауна (Mehta P.D. (2007) J. Neurol. Sci. 254: 22-7),возрастной макулярной дегенерацией (AMD) (Johnson L.V. et al. (2002) PNAS USA 99: 11830-11835; Anderson D.H. et al. (2004) Exp. Eye Res. 78: 243-256), заболеваниями глаукомой разного типа (Guo L. et al.L.E. et al. (2003) Lancet 361: 1258-1265; Li G. et al. (2003) Mol. Vision 9: 179-183). Возрастная макулярная дегенерация (AMD) является ведущей причиной слепоты в развитом мире. Существуют две основные клинические формы AMD. Атрофическая (сухая) AMD характеризуется дегенерацией ретинального пигментного эпителия (RPE) и зрительного нерва и сетчатки. Ранние стадии атрофической AMD связывают с образованием друз под слоем клеток RPE. Ранняя атрофическая AMD может прогрессировать в конечную стадию заболевания, когда RPE дегенерирует полностью и образуются четко различимые зоны атрофии RPE в области макулы: "географическая атрофия". При этой форме заболевания дегенерация RPE вызывает вторичную гибель палочек и колбочек пятна сетчатки, и в таких случаях это приводит к тяжелой возрастной потере зрения. Доля пациентов с AMD возрастает, что может быть отнесено либо к другой форме, либо к дальнейшему осложнению заболевания. Приблизительно у 10-20% пациентов с AMD развивается неоваскуляризация хориоидеи (CNV). Когда это происходит, форма данного заболевания известна как "влажная AMD" и это может сопровождаться некоторыми наиболее тяжелыми случаями потери зрения. При влажной AMD новые сосуды, относящиеся к сосудистой оболочке глаза, прорастают сквозь мембрану Бруха, ломают ее и пролиферируют внутрь и подRPE и зрительный нерв и сетчатку. В типичных случаях атрофическая AMD развивается в глазу до развития влажной формы, однако в редких случаях неоваскулярная форма может развиться без предварительного развития атрофической формы. При обеих формах заболевания потеря зрения происходит вследствие гибели фоторецепторных клеток, хотя при влажной AMD внутреннее кровотечение из дающих утечку сосудов, образовавшихся в процессе CNV, также приводит к потере зрения. В области терапии AMD наметился некоторый прогресс в разработке новых видов лечения, адресованных некоторым аспектам влажной AMD, в частности в отношении снижения кровотечения из дающих утечку сосудов при CNV под действием различных молекул, которые ингибируют или VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), или путь передачи сигнала через рецептор VEGF. Однако в настоящее время не существует никаких оптимальных средств ни как для лечения очень распространенной атрофической формы AMD, ни как для предупреждения прогрессирования ранней сухой AMD либо в сторону географической атрофии, либо в сторону влажной AMD (Petrukhin К. (2007) Expert. Opin. Then Targets, 11: 625-639). Несмотря на то что точные механизмы, вызывающие продуцирование А в RPE, и точный механизм или механизмы, посредством которых А влияет на AMD, полностью не понятны, эти результаты означают, что "устранение" А посредством агентов, которые связываются с и потенциально нейтрализуют или даже удаляют А, может обеспечить возможный путь "устранения" друз при AMD путем уменьшения активации комплемента при AMD, уменьшения атрофии RPE и возможного уменьшения индукции экспрессии VEGF в RPE и его высоких уровней, локализованных вокруг друз. Поэтому такая терапия могла бы обеспечить средства предупреждения, задержки, ослабления или реверсирования потери зрения в результате AMD и ее прогрессирования в сторону географической атрофии и/или эксудативной AMD. Это может приводить к снижению уровней А-содержащих друз и/или локально расположенных А в окружении RPE и поэтому препятствовать как ранней, так и поздней стадии AMD, и воздействовать на лежащее в основе уменьшение количества клеток, которое вызывает потерю зрения. Некоторые недавно опубликованные данные проливают свет на взаимодействие белков комплемента и бета-амилоида в развитии AMD (Wang J. et al., (2008) J. Immunol. 181: 16651-6). Показано, что бетаамилоид связывается с фактором комплемента I, кофактором, который вместе с фактором Н отвечает за расщепление белка комплемента С 3 из формы С 3b в его неактивную форму, iC3b (Wang J. и др., 2008). Результаты недавно опубликованного исследования in vitro подтвердили гипотезу, согласно которой бета-амилоид активирует систему комплемента внутри друз, блокируя функцию фактора комплемента I,что приводит к слабо выраженному хроническому воспалению в субретинальных тканях; таким образом,воедино связываются четыре фактора из факторов, ассоциированных с развитием AMD: воспаление, активация комплемента, отложение амилоида-бета и друзы (Wang J. и др., 2008). Такое прямое доказательство влияния бета-амилоида на активацию альтернативного пути комплемента в результате возможного конкурирования с фактором комплемента Н за связывание с фактором комплемента I ранее не было документально подтверждено (Wang J. и др., 2008)."Заболевания глаукомой разного типа" представляет собой термин, используемый для группы заболеваний, которые могут вызывать повреждение глазного зрительного нерва и приводить к слепоте. Это основная причина слепоты в мире, вызываемая в конечном счете повышенным внутриглазным давлением (IOP) и сниженной остротой зрения. Связь между IOP и то, каким образом это приводит к апоптозу ганглиозных клеток сетчатки (RGC), понятны недостаточно. Высокое IOP само может вызывать апоптозOphtalmol. Visual Sci. 36: 774-786), но само по себе оно не является единственной причиной гибели кле-3 022913 ток оптических нейронов. Кроме этого, отмечено, что зрение может продолжать ухудшаться даже после нормализации IOP после лечения понижающими глазное давление агентами (Oliver J.E. et al. (2002) Am.He так давно сообщено о связи возможных цитотоксических эффектов -амилоида на апоптоз RGC при глаукоме (McKinnon S.J. et al. (2002) Invest. Ophtamol. Visual Sci. 43: 1077-1087). В животных моделях глаукомы продемонстрировано, что протеаза каспаза-3 активируется в RGC, что приводит к аномальному процессингу белка-предшественника амилоида (АРР) под действием каспазы-3 с образованием потенциально токсичных фрагментов АРР, включая -амилоид (McKinnon и др. (2002); Cheung Z.H. et al.(2004) Mol. Cell Neurosci. 25: 383-393). Показано, что среди других клеток RGC экспрессируют АРР, и таким образом по-видимому являются вероятным источником -амилоида. Как повышенные уровни АРР, так и повышенные уровни -амилоида непосредственно связаны с активацией каспазы-3, хотя это преимущественно наблюдали в in vitro системах. Неясно, повышены ли также и уровни АРР в RGC при глаукоме, что может вносить вклад в образование еще большего количества -амилоида по механизму положительной обратной связи. Совсем недавно на крысиной модели глаукомы подтверждено вовлечение -амилоида в апоптоз RGC (Guo и др. (2007. Тестировали некоторые агенты, направленно воздействующие на -амилоид или на продуцирование -амилоида, и было показано уменьшение гибели ганглиозных клеток сетчатки in vivo с возможным умеренным эффектом улучшения в случае, когда все три вида лечения использовали совместно. Самый сильный эффект наблюдали при использовании антитела против -амилоида, который был полностью равносилен эффектам, наблюдаемым для всех трех агентов совместно. Несмотря на то что точные механизмы, вызывающие продуцирование -амилоида в RGC и связь сIOP, полностью не понятны, эти результаты означают, что "устранение" -амилоида посредством агентов, которые связываются с -амилоидом и потенциально нейтрализуют или даже удаляют его, может обеспечить возможный путь предупреждения апоптоза RGC при глаукоме и, таким образом, обеспечить способ задержки, ослабления или реверсирования потери зрения при глаукоме. Это может приводить к снижению уровней -амилоида в RGC и в окружающей их среде и поэтому воздействовать на лежащее в основе уменьшение количества клеток, которое вызывает потерю зрения.-Амилоид может играть роль в других глазных болезнях, и его связывают с образованием надъядерных катаракт, особенно наблюдаемых у пациентов с AD, и компоненты пути образования и процессинга А присутствуют в хрусталике (Goldstein L.E. и др. (2003); Li G. и др. (2003. Таким образом, терапевтические подходы, описанные для воздействия при AMD и заболеваниях глаукомой разного типа,могут быть применимы для предупреждения образования катаракты.WO 2008/110885 относится к способам лечения глазных заболеваний ингибиторами, направленными против -амилоидного пептида. Конкретно, описано антитело 6G, связывающееся с эпитопом на А 140, который по всей видимости включает остатки 25-34 и 40. Краткое изложение сущности изобретения В одном из аспектов настоящего изобретения предложено терапевтическое антитело, которое связывается с -амилоидным пептидом, содержащее VH-домен, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO:65, и VL-домен, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO:71. В другом аспекте изобретения предложено терапевтическое антитело, которое связывается с амилоидным пептидом, содержащее тяжелую цепь, имеющую последовательность, приведенную в SEQID NO:27, и легкую цепь, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:28. В еще одном аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения ассоциированных с -амилоидным пептидом заболеваний, содержащая указанное терапевтическое антитело. Краткое описание графических материалов На фиг. 1 показана детекция с помощью вестерн-блоттинга различных форм бета-амилоида с использованием антитела 6F6 или 6 Е 10 (антитело, специфичное к А 1-16 человека; имеющийся в продаже реагент, Eurogentec) и 5G5 (антитело, специфичное к А 1-42; реагент собственной разработки); на фиг. 2 - диаграммы, демонстрирующие отложение бляшек в срезах коры и гиппокампа головного мозга hAPP-трансгенных мышей после обработки 6F6 (17 или 33 мг/кг), выраженное в % площади кортикальных бляшек, приведенной в виде средней величиныстандартная ошибка средней величины; на фиг. 3 - диаграммы, демонстрирующие отложение бляшек в срезах коры и гиппокампа головного мозга hAPP-трансгенных мышей после обработки 6F6 (17 или 33 мг/кг), выраженное в количестве бляшек на мм 2, приведенном в виде средней величиныстандартная ошибка средней величины; на фиг. 4 - детекция бета-амилоида в сетчатке старых CFH-/- мышей; на фиг. 5 - перекрестная реактивность 6F6 к бета-амилоиду в сетчатке старых CFH-/- мышей. Подробное описание изобретения 1. Антигенсвязывающие белки. Термин "антигенсвязывающий белок", как он использован в данном описании, относится к антителам, фрагментам антител и другим белковым конструкциям, таким как домены, конкретно к тем, кото-4 022913 рые способны связываться с -амилоидом, как дополнительно обсуждается ниже. В одном из воплощений настоящего изобретения предложен терапевтический антигенсвязывающий белок, представляющий собой антигенсвязывающий белок, такой как антитело или его антигенсвязывающие фрагмент и/или производное, которые связываются с -амилоидным пептидом и которые содержат следующие CDR (гипервариабельные участки):CDRH1: VYYVH (SEQ ID NO:1),CDRH2: RIDPENGETIYTPKFQD (SEQ ID NO:2),CDRH3: SGY (SEQ ID NO:3),CDRL1: RSSKSLLHRNGITYLY (SEQ ID NO:4),CDRL2: QMSNLAS (SEQ ID NO:5),CDRL3: AQNLELWT (SEQ ID NO:6). По всему данному описанию термины "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2","CDRH3" соответствуют системе нумерации Kabat, которая приведена в Kabat et al.; Sequences of proteinsof Immunological Interest, NIH, 1987. Следовательно, CDR по изобретению определены следующим образом:IGHV1-24 (SEQ ID NO:13) представляет собой последовательность зародышевой линии человека,которая является подходящим акцепторным каркасом для привития CDR VH. В конкретном аспекте акцепторный каркас тяжелой цепи антитела человека происходит из IGHV1-24. Чтобы сконструировать полную V-область, каркасную область 4 необходимо добавить к IGHV1-24,кодируемой V-геном зародышевой линии. Подходящие последовательности каркасной области 4 включают таковые, кодируемые минигеном JH4 человека (Kabat):YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:15). Специалисту очевидно, что V-ген и J-ген зародышевой линии не содержат кодирующей последовательности для полного CDR3 тяжелой цепи. Тем не менее в антителах по изобретению полный CDR3 тяжелой цепи обеспечивается донорным иммуноглобулином. Соответственно комбинации гена VH, такого как IGHV1-24, минигена JH, такого как JH4, и набора CDR тяжелой цепи, такого как SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 (собранной вместе так, чтобы имитировать зрелую, полностью реаранжированную вариабельную область тяжелой цепи), достаточно для задания вариабельной области тяжелой цепи по изобретению.IGKV2-28 (SEQ ID NO:16) представляет собой последовательность антитела зародышевой линии человека, которая является подходящим акцепторным каркасом для привития CDR VL. В конкретном аспекте акцепторный каркас легкой цепи антитела человека происходит из IGKV2-28. Чтобы полностью сконструировать V-область, каркасную область 4 необходимо добавить к IGKV228, кодируемой V-геном зародышевой линии. Подходящие последовательности каркасной области 4 включают таковые, кодируемые минигеном JK-1 человека (Kabat):WTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:18). Специалисту очевидно, что V-ген и J-ген зародышевой линии не содержат кодирующей последовательности для полного CDR3 легкой цепи. Тем не менее в антителах по изобретению последовательностьCDR3 обеспечивается донорным иммуноглобулином. Первые два остатка из остатков минигена JK-1 попадают в область CDR3. Для минигена JK-1 эти остатки идентичны последним двум остаткам в легкой цепи CDRL3 (SEQ ID NO:6). Соответственно комбинации VL-гена, такого как IGKV2-28, FR4 (каркасной области 4), такой как JK-1, и набора CDR легкой цепи, такого как SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ IDNO:6, (собранной вместе с тем, чтобы имитировать зрелую, полностью реаранжированную вариабельную область легкой цепи) достаточно для задания вариабельной области легкой цепи по изобретению. В конкретном воплощении изобретения акцепторный каркас тяжелой цепи антитела человека происходит из IGHV1-24 и минигена JH4, а акцепторный каркас легкой цепи антитела человека происходит из IGKV2-28 и минигена JK-1, возможно с одной или более заменами аминокислотных остатков на основе соответствующих остатков, найденных в донорном VH-домене, имеющем последовательность: SEQ IDNO:19, и VL-домене, имеющем последовательность: SEQ ID NO:21, которые обеспечивают всю или, по существу, всю аффинность связывания донорного антитела с -амилоидным пептидом. Под термином"по существу, вся аффинность связывания" понимают, что терапевтическое антитело характеризуется не более чем пятикратным, более конкретно двукратным уменьшением аффинности связывания по сравнению с донорным антителом. В более конкретном воплощении акцепторный каркас тяжелой цепи антитела человека, происходя-5 022913 щий из IGHV1-24 и JH4, содержит следующие остатки (или их консервативную замену): В более конкретном воплощении изобретения акцепторный каркас легкой цепи антитела человека,происходящий из IGKV2-28 и JK-1, содержит следующие остатки (или их консервативную замену): 1.1. Интактные антитела. Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут представлять собой "интактные антитела". Антигенсвязывающий белок по изобретению включает терапевтическое антитело, представляющее собой антитело или его антигенсвязывающие фрагмент и/или производное. Интактные антитела обычно представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелые и две легкие цепи. За исключением IgM интактные антитела представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой приблизительно 150 кДа, составленные из двух одинаковых легких (L) цепей и двух одинаковых тяжелых (Н) цепей. Обычно каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями разных изотипов иммуноглобулинов варьирует. Кроме того, каждая тяжелая и легкая цепь имеют дисульфидные мостики внутри цепи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL) и константную область на его другом конце; константная область легкой цепи располагается на одной линии с первой константной областью тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи располагается на одной линии с вариабельным доменом тяжелой цепи. Легкие цепи антител большинства видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух типов, называемых каппа и лямбда на основании аминокислотной последовательности константной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области своих тяжелых цепей человеческие антитела могут быть отнесены к пяти разным классам: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgG и IgA могут быть дополнительно подразделены на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; и IgA1 и IgA2. Видовые варианты существуют у мышей и крыс, имеющих по меньшей мере IgG2a, IgG2b. Вариабельный домен антитела обуславливает специфичность связывания антитела благодаря наличию определенных областей, проявляющих особую вариабельность, называемых определяющими комплементарность участками (CDR). Наиболее консервативные части вариабельной области называются каркасными областями (FR). Вариабельные домены каждой из интактных тяжелых и легких цепей содержат четыре FR, соединенные тремя CDR. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга благодаря FR-областям и вместе сCDR другой цепи вносят вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител. Константные области непосредственно не вовлечены в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), в фагоцитозе посредством связывания с Fc-рецептором, в регулировании периода полувыведения/скорости клиренса посредством неонатального Fc-рецептора (FcRn) и в комплементзависимой цитотоксичности посредством компонента C1q каскада комплемента. Сообщалось, что константная область IgG2 человека,по существу, лишена способности активировать комплемент классическим путем или опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность. Сообщалось, что константная область lgG4 лишена способности активировать комплемент классическим путем и только слабо опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность. Антитела, по существу, лишенные этих эффекторных функций, могут быть названы "нелитическими" антителами. 1.1.2. Химерные и гуманизированные антитела. Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут представлять собой "химерные" или "гуманизированные" антитела. Применение интактных антител, отличных от человеческих, в лечении заболеваний или расстройств человека влечет за собой хорошо установленные в настоящее время проблемы возможной иммуногенности, особенно после повторного введения антител: то есть иммунная система пациента может распознавать интактное антитело, отличное от человеческого, как "не свое" и вызывать нейтрализующий ответ. В дополнение к разработке полностью человеческих антител (см. выше) с годами были разработаны различные методики для преодоления этих проблем, и они как правило включают уменьшение состава отличных от человеческих аминокислотных последовательностей в интактном терапевтическом антителе при одновременном сохранении относительной простоты в получении отличных от человеческих антител из неиммунизированных животных, например мыши, крысы или кролика. Для достижения этого широко используются два подхода. Первый представляет собой получение химерных антител, которые, как правило, содержат отличный от человеческого (например, от грызуна, такого как мышь) вариабельный домен, слитый с константной областью человеческого антитела. Поскольку антигенсвязывающий сайт антитела локализован внутри вариабельных областей, такое химерное антитело сохраняет присущую ему аффинность связывания с антигеном, но приобретает эффекторные функции константной области человеческого антитела и, следовательно, способно осуществлять эффекторные функции, как, например, описанные выше (выше). Химерные антитела обычно получают, используя методы рекомбинантной ДНК. Выделяют ДНК, кодирующую антитела, (например, кДНК) и секвенируют, используя традиционные методики (например, используя олигонуклеотидные зонды, способные специфически связываться с генами, кодирующими вариабельные области Н- и L-цепей антитела по изобретению, например ДНК с SEQ ID NO:19 и 21, описанную выше). Гибридомные клетки служат в качестве типичного источника такой ДНК. После выделения ДНК помещают в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфицируют клетки хозяина, такие как Е.coli, клетки COS (фибробласты африканской зеленой мартышки), клетки СНО, клетки PerC6 (человеческой сетчатки) или клетки миеломы,которые без этого не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для синтеза антитела. ДНК может быть модифицирована посредством замены кодирующей последовательности L- и Н-цепей на соответствующие Н- и L-константные области отличного от человеческого антитела (например, мышиного), см., например, Morrison, PNAS 81, 6851 (1984). Таким образом, в другом воплощении изобретения предложено химерное антитело, содержащее VH-домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:19, и VL-домен,имеющий последовательность SEQ ID NO:21, слитые с константной областью (которая может быть изотипом IgG, например IgG1) антитела человека. Второй подход вовлекает создание гуманизированных антител, где содержание отличного от человеческого антитела уменьшено посредством гуманизации вариабельных областей. Популярны две методики гуманизации. Первая представляет собой гуманизацию посредством CDR-привития. CDR формирует петли близко к N-концу антитела, где они формируют поверхность, закрепленную на остове, обеспечиваемом каркасными областями. Специфичность связывания антигена с антителом определяется главным образом топографией и химическими характеристиками поверхности его CDR. Эти характеристики,в свою очередь, определяются конформацией индивидуальных CDR, относительным расположениемCDR и природой и расположением боковых цепей остатков, входящих в состав CDR. Большое снижение иммуногенности может быть достигнуто посредством привития только CDR нечеловеческого антитела(например, мышиного) ("донорного" антитела) на подходящий каркас ("акцепторный каркас") и константные области антитела человека (см. Jones et al. (1986) Nature, 321, 522-525 и Verhoeyen M. et al.(1988) Science, 239, 1534-1536). Однако само по себе CDR-привитие может не привести к полному сохранению антигенсвязывающих свойств, и часто обнаруживают, что некоторые остатки каркаса донорного антитела необходимо сохранить (иногда это называется как "обратная мутация") в гуманизированной молекуле, если необходимо восстановить значительную аффинность связывания антигена (см. Queen С. et al. (1989) PNAS, 86, 10029-10033; Co, M et al. (1991) Nature, 351, 501-502). В этом случае V-области антитела человека, демонстрирующие наибольшую гомологию последовательности (обычно на 60% или более) к донорному отличному от человеческого антителу, могут быть выбраны из базы данных для получения каркасных областей (FR) антитела человека. Отбор человеческих FR может быть проведен или на основании общих типичных элементов структуры антитела человека, или на основании индивидуальных антител человека. В случае необходимости ключевые остатки донорного антитела заменяют в акцепторном каркасе антитела человека для сохранения конформаций CDR. Для облегчения идентификации таких структурно важных остатков может быть использовано компьютерное моделирование антител,см. WO 99/48523. Альтернативно, гуманизация может быть достигнута в результате процесса "облицовки"("veneering"). Статистический анализ уникальных вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека и мыши показал, что точные картины экспонированных остатков различны в антителах человека и мыши, и для большинства индивидуальных положений на поверхности отдается строгое предпочтение небольшому числу разных остатков (см. Padlan E.A. et al; (1991) Mol. Immunol., 28,489-498 и Pedersen J.T. et al. (1994) J. Mol. Biol., 235: 959-973). Следовательно, возможно снизить иммуногенность Fv отличного от человеческого антитела посредством замены тех экспонированных остатков в их каркасных областях, которые отличаются от остатков, обычно обнаруживаемых в человеческих антителах. Поскольку антигенность белка может быть скоррелирована с доступностью поверхности, замена поверхностных остатков может быть достаточной для того, чтобы сделать вариабельную область антитела мыши "невидимой" для иммунной системы человека (см. также Mark G.E. и соавт. (1994) в Handbookof Experimental Pharmacology, vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp. 105-134). Эта методика гуманизации называется "облицовкой", потому что изменяется только поверхность антитела, опорные остатки остаются незатронутыми. Другие альтернативные подходы включают подходы, приведенные в WO 04/006955, и методику Humaneering (Kalobios), в которой применяют бактериальные экспрессирующие системы и продуцируют антитела, близкие по последовательности к антителам зародышевой линии человека (Alfenito-M. Advancing Protein Therapeutics, January 2007, San Diego.California). Специалистам в данной области техники будет очевидно, что термин "происходящий" предназначен для обозначения не только источника в смысле физического происхождения материала, но также и для определения материала, структурно идентичного данному материалу, но не происходящему из указанного источника. Так, "остатки, обнаруженные в донорном антителе" не обязательно являются остатками, выделенными из донорного антитела. В данной области техники общеизвестно, что некоторые аминокислотные замены считаются "консервативными". Аминокислоты подразделяют на группы на основании общих свойств боковой цепи, и замены внутри группы, при которых сохраняется вся или по существу вся аффинность связывания терапевтического антитела по изобретению, рассматриваются как консервативные замены (см. следующую далее табл. 1). Таблица 1 2. Способы продуцирования. Антитела по настоящему изобретению могут быть получены в трансгенных организмах, таких как козы (см. Pollock et al. (1999), J. Immunol. Methods, 231: 147-157), цыплята (см. Morrow K.J.J. (2000)Opinion Biotechnol. 11, 199-204; Ma J.K.-C. (1998), Nat. Med. 4: 601-606; Baez J. et al., BioPharm (2000) 13: 50-54; Stoger E et al. (2000) Plant Mol. Bid. 42: 583-590). Антитела также могут быть получены посредством химического синтеза. Тем не менее антитела по изобретению обычно получают, используя технологию рекомбинантного клеточного культивирования, хорошо известную специалистам в данной области техники. Полинуклеотид, кодирующий антитело, выделяют и вставляют в репликативный вектор, такой как плазмида, для дальнейшего размножения или экспрессии в клетке хозяина. Одной из полезных экспрессионных систем является глутаматсинтетазная система (как, например, поставляемая на рынокLonza Biologies), в частности, в которой клеткой-хозяином является СНО или NS0 (см. ниже). Полинуклеотид, кодирующий антитело, легко выделяют и секвенируют, используя общепринятые методики (например, олигонуклеотидные зонды). Векторы, которые могут быть использованы, включают плазмиду,вирус, фаг, транспозоны, минихромосомы, среди которых плазмиды являются типичным воплощением. Как правило, такие векторы дополнительно включают сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промоторную последовательность и последовательность терминации транскрипции, функционально связанные с полинуклеотидом, кодирующим легкую и/или тяжелую цепь, так чтобы облегчить экспрессию. Полинуклеотид, кодирующий легкую и тяжелую цепи, может быть вставлен в отдельные векторы и введен (например, посредством трансформации, трансфекции, электропорации или транедукции) в ту же клетку хозяина одновременно или последовательно или, если это желательно, обе цепи, и тяжелая цепь и легкая цепь, могут быть вставлены в один и тот же вектор перед таким введением. Специалистам в данной области техники будет естественно очевидно, что ввиду избыточности генетического кода также применимы альтернативные изложенным в данном описании полинуклеотиды,которые будут кодировать полипептиды по изобретению. 2.1. Сигнальные последовательности. Антигенсвязывающие белки, например антитела по настоящему изобретению, могут быть продуцированы в виде слитого белка с гетерологической сигнальной последовательностью, имеющей специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка. Сигнальная последовательность должна распознаваться и процессироваться клеткой хозяина. В случае прокариотических клеток хозяина сигнальная по-8 022913 следовательность может представлять собой лидерные последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы или термостабильного энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах сигнальными последовательностями могут быть лидерная последовательность дрожжевой инвертазы, лидерная последовательность -фактора или лидерные последовательности кислой фосфатазы, см., например, WO 90/13646. В системах клеток млекопитающих приемлемыми являются вирусные секреторные лидерные последовательности, такие как сигнальная последовательность гликопротеина gD вируса простого герпеса, и природные сигнальные последовательности иммуноглобулинов (как например, тяжелой цепи Ig человека). Обычно сигнальную последовательность пришивают в рамке считывания к полинуклеотиду, кодирующему антитело по изобретению. 2.2. Ориджин репликации. Ориджины репликации хорошо известны в данной области техники, при этом ориджин от pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, от 2 мкм плазмиды - для большинства дрожжей, а различные ориджины вирусов, таких как SV40 (обезьяний вирус 40), вирус полиомы, аденовирус,VSV (вирус везикулярного стоматита) или BPV (папилломавирус крупного рогатого скота) для большинства клеток млекопитающих. Как правило, нет необходимости в компоненте ориджине репликацииSV40 для комбинированных экспрессирующих векторов для млекопитающих. Однако ориджин SV40 может быть включен, поскольку содержит ранний промотор. 2.3. Селектируемый маркер. Типичные селектируемые гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, или (б) дополняют ауксотрофные дефициты или снабжают питательными веществами, недоступными в составе сред или (в) комбинируют того и другого. Схема селекции может включать остановку роста клетки хозяина, не содержащей вектор или векторы. Клетки, которые успешно трансформированные генами, кодирующими терапевтическое антитело по настоящему изобретению, выживают ввиду, например,лекарственной устойчивости, придаваемой совместно доставляемым селектируемым маркером. Одним из примеров является селекционная система на основе DHFR (дигидрофолатредуктаза), где получают трансформантов отрицательных по DHFR штаммов хозяина (например, см. Page and Sydenham, 1991,Biotechnology 9: 64-68). В этой системе ген DHFR доставляется вместе с полинуклеотидными последовательностями антигенсвязывающего белка, то есть антитела, по изобретению, и DHFRположительные клетки затем отбирают посредством отмены нуклеозидов. При желании также используют ингибитор DHFR, метотрексат, для отбора трансформантов с амплифицированным геномDHFR. Благодаря функциональному связыванию гена DHFR с последовательностями по изобретению,кодирующими антигенсвязывающий белок, например антитело или его функциональные производные,амплификация гена DHFR приводит к сопутствующей амплификации представляющих интерес последовательностей желаемого антигенсвязывающего белка, например антитела. СНО-клетки являются особенно полезной клеточной линией для такой селекции с использованием DHFR/метотрексата, и методы амплификации и селекции клеток хозяина с использованием системы на основе DHFR общеприняты в данной области техники, см. Kaufman R.J. et al. J. Mol. Biol. (1982) 159, 601-621, в качестве обзора см. Werner R.G., Noe W., Kopp K., Schluter M., "Appropriate mammalian expression systemsfor biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8): 870-80, 1998 Aug. Другим примером является глутаматсинтетазная экспрессионная система (Bebbington et al. Biotechnology, 1992, Vol. 10, p. 169). Подходящим селектируемым геном для применения в дрожжах является ген trp1; см. Stinchcomb et al.Nature 282, 38, 1979. 2.4. Промоторы. Подходящие промоторы для экспрессии антигенсвязывающих белков, например антител, по изобретению функционально связаны с ДНК/полинуклеотидом, кодирующей/кодирующим антигенсвязывающий белок, например антитело. Промоторы для прокариотических хозяев включают phoA-промотор,бета-лактамазные и лактозные промоторные системы, промотор щелочной фосфатазы, триптофановый промотор и гибридные промоторы, такие как Тас (полученный из промоторов триптофанового и лактозного оперонов). Промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжевых клетках, включают промоторы 3 фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, например енолазы, глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, пируватдекарбоксилазы, фосфофруктокиназы, глюкозо-6 фосфатизомеразы, 3-фосфоглицератмутазы и глюкокиназы. Индуцибельные дрожжевые промоторы включают промоторы алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, металлотионеина и ферментов, отвечающих за метаболизм азота или утилизацию мальтозы/галактозы. Промоторы для экспрессии в системах клеток млекопитающих включают промоторы РНКполимеразы II, в том числе промоторы вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы домашних птиц и аденовирусы (например, аденовирус 2), папилломавирус крупного рогатого скота, вирус птичьей саркомы, цитомегаловирус (в особенности промотор немедленно ранних генов), ретровирус, вирус гепатита В,промотор актина, промотор вируса саркомы Рауса (RSV) и ранний или поздний промотор обезьянего вируса 40, и невирусные промоторы, такие как EF-1-альфа (Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Res. 1990 18(17): 5322). Выбор промотора может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой хозяина. 2.5. Энхансерный элемент. Там, где это целесообразно, например, для экспрессии в высших эукариотах, могут быть введены дополнительные энхансерные элементы вместо или вместе с таковыми, находящимися в описанных выше промоторах. Подходящие энхансерные последовательности для млекопитающих включают энхансерные элементы глобина, эластазы, альбумина, фетопротеина, металлотионина и инсулина. Альтернативно,можно использовать энхансерный элемент вируса эукариотических клеток, такой как энхансер SV40,энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы, бакуловирусный энхансер или локус мышиного IgG2a (см. WO 04/009823). Хотя такие энхансеры обычно располагаются в векторе в сайте вверх по течению по отношению к промотору, они могут быть расположены и в другом месте,например, внутри нетранслируемой области или вниз по течению по отношению к сигналу полиаденилирования. Выбор и расположение энхансера может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой хозяина. 2.6. Полиаденилирование/терминирование. В эукариотических системах сигналы полиаденилирования функционально связаны с полинуклеотидом, кодирующим антигенсвязывающий белок, например антитело, по данному изобретению. Такие сигналы обычно помещают с 3'-конца открытой рамки считывания. В системах млекопитающих неограничивающие примеры сигналов включают таковые, происходящие из ростовых гормонов, фактора элонгации 1-альфа и вирусных (например, SV40) генов или ретровирусных длинных терминальных повторов. В дрожжевых системах неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования/терминирования включают таковые, происходящие из генов фосфоглицераткиназы (PGK) и алкогольдегидрогеназы 1(ADH). В прокариотических системах сигналов полиаденилирования обычно не требуется, и вместо них обычно используются более короткие и более определенные терминирующие последовательности. Выбор последовательностей полиаденилирования/терминирования может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой хозяина. 2.7. Другие способы/элементы для увеличения выходов. В дополнение к упомянутому выше, другие особенности конструкции, которые могут быть использованы для увеличения выходов, включают хроматин-ремоделирующие элементы, интроны и модификацию кодонов, специфичную для клеток хозяина. Поэтому использование кодонов антигенсвязывающих белков, например антитела, по данному изобретению, может быть модифицировано с целью согласования статистического отклонения кодонов (codon bias) клетки-хозяина для увеличения выхода транскрипта и/или продукта (например, Hoekema A. et al., Mol. Cell Biol., 1987, 7(8): 2914-24). Выбор кодонов может основываться на подходящей совместимости с используемой для экспрессии клеткой хозяина. 2.8. Клетки хозяина. Подходящими клетками хозяина для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антигенсвязывающие белки, например антитела, по изобретению, являются прокариотические, дрожжевые клетки или клетки высших эукариот. Подходящие прокариотические клетки включают эубактерии, например энтеробактерии, такие как Escherichia, например Е.coli (например, АТСС 31446; 31537; 27325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например Serratiamarcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В .licheniformis (см. DD 266710),Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, и Streptomyces. Из дрожжевых клеток хозяев рассматриваются Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (например, АТСС 16045; 12424; 24178; 56500), Yarrowia (EP402, 226), Pichia pastoris (EP183070, см. также Peng et al., J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192), также рассматриваются клетки хозяина Candida, Trichoderma reesia (EP244234), Penicillin, Tolypocladium и Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger. Несмотря на то что данным изобретением рассматриваются конкретно прокариотические и дрожжевые клетки хозяина, тем не менее в общем случае клетки хозяина по настоящему изобретению представляют собой клетки позвоночных. Подходящие клетки хозяина позвоночных включают клетки млекопитающих, такие как COS-1 ( в АТСС: CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), клеточная линия 293 почки эмбриона человека, PerC6 (Crucell), клетки почки детеныша хомячка (ВНК) (АТСС CRL 1632),ВНК 570 ( в АТСС: CRL 10314), 293 ( в АТСС: CRL 1573), клетки яичников китайского хомячка СНОet al., Somat. Cell Mol. Genet. (1986) Vol. 12, pp. 555-566), в частности те клеточные линии СНО, которые адаптированы для суспензионной культуры, мышиные клетки Сертоли, клетки почки обезьяны, клетки почки зеленой африканской мартышки (АТСС CRL-1587), HELA-клетки, клетки почки собаки (АТССCCL 34), клетки легкого человека (АТСС CCL 75), Hep G2 (линия гепатоцеллюлярной карциномы человека) и клетки миеломы или лимфомы, например NS0 (см. US 5807715), Sp2/0, Y0. Таким образом, в одном из воплощений изобретения предложена стабильно трансфицированная клетка-хозяин, содержащая вектор, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь терапевтического антитела, как изложено в данном описании. Обычно такие клетки хозяина содержат первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий указанную тяжелую цепь. Такие клетки хозяина также могут быть дополнительно сконструированы или адаптированы с целью модификации качества, функции и/или выхода антигенсвязывающего белка, например антитела по данному изобретению. Неограничивающие примеры включают экспрессию специфически модифицирующих (например, посредством гликозилирования) ферментов и шаперонов белкового фолдинга. 2.9. Способы культивирования клеток. Клетки хозяина, трансформированные векторами, кодирующими терапевтические антигенсвязывающие белки, например антитела, по изобретению, можно культивировать любым способом, известным специалистам в данной области техники. Клетки хозяина можно культивировать в роллерных колбах,встряхиваемых колбах, роллерных флаконах, волновых реакторах (например, System 1000 отwavebiotech.com) или системах на полых волокнах, но предпочтительным для продуцирования в больших масштабах является использование реакторов с механическим перемешиванием или контейнерных реакторов (например, Wave Biotech, Somerset, New Jersey, USA), в особенности для суспензионных культур. Обычно реакторы с механическим перемешиванием адаптируют для аэрирования, используя например барботеры, дефлекторы или импеллеры с низкой скоростью сдвига. Для барботирующих ферментеров и аэролифтных реакторов можно использовать непосредственное аэрирование пузырьками воздуха или кислорода. Когда клетки хозяина культивируют в культуральной среде, не содержащей сыворотки,она может быть дополнена защищающим клетки агентом, таким как Плуроник F-68, для предупреждения разрушения клеток в результате процесса аэрирования. В зависимости от характеристик клетки хозяина либо можно использовать микроносители в качестве субстратов для нуждающихся в закреплении клеточных линий, либо клетки могут быть адаптированы к суспензионной культуре (что типично). Культивирование клеток хозяина, в частности клеток хозяина позвоночного, можно осуществлять в разнообразных рабочих режимах, таких как периодический, периодический со снабжением сырьем, повторяющийся периодический режим проведения процесса (см. Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109), длительный периодический режим проведения процесса или режим в проточной культуре. Хотя рекомбинантно трансформированные клетки хозяина млекопитающего можно культивировать в средах, содержащей сыворотку, такую как фетальная телячья сыворотка (FCS), предпочтительно, чтобы такие клетки хозяина культивировали в средах, не содержащих сыворотки, как например изложено в Keen et al. (1995)(Cambrex NJ, USA), дополненных при необходимости источником энергии, таким как глюкоза, и синтетическими ростовыми факторами, такими как рекомбинантный инсулин. Для культивирования клеток хозяина в несодержащих сыворотки средах может потребоваться адаптация этих клеток для роста в условиях отсутствия сыворотки. Один из подходов адаптации состоит в культивировании таких клеток хозяина в средах, содержащих сыворотку, и периодической замене 80% культуральной среды на несодержащие сыворотки среды, с тем чтобы "научить" клетки хозяина адаптироваться к условиям в отсутствие сыворотки (см., например, Scharfenberg К. et al. (1995) в Animal Cell technology: Developments towardsthe 21st century (Beuvery E.C. et al. eds), pp. 619-623, Kluwer Academic publishers). Антигенсвязывающие белки, например антитела, по изобретению, секретируемые в среды, можно извлечь и очистить из сред, используя разнообразные методики с получением степени чистоты, подходящей для предполагаемого использования. Например, использование терапевтических антигенсвязывающих белков, например антител, по изобретению для лечения пациентов людей обычно требует по меньшей мере 95% чистоты по данным SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, более типично 98% или 99% чистоты, по сравнению с культуральными средами, содержащими терапевтические антигенсвязывающие белки, например антитела. В первую очередь из культуральных сред обычно удаляют клеточный дебрис, используя центрифугирование с последующей стадией осветления супернатанта с применением, например микрофильтрации, ультрафильтрации и/или глубинной фильтрации. Альтернативно,антигенсвязывающий белок, например антитело, может быть собран микрофильтрацией, ультрафильтрацией или глубинной фильтрацией без предварительного центрифугирования. Доступно большое количество других методик, таких как диализ и гель-электрофорез, и хроматографических методик, таких как хроматография на гидроксиапатите (НА), аффинная хроматография (возможно с использованием системы аффинного мечения, например, с применением полигистидина) и/или хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC, см. US 5429746). В одном воплощении антигенсвязывающие белки, например антитела, по изобретению после различных стадий осветления захватывают с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном белке А или G с последующими хроматографическими стадиями,такими как ионообменная хроматография и/или хроматография на НА, анионный или катионный обмен,эксклюзионная хроматография и осаждение сульфатом аммония. Обычно кроме этого применяют различные стадии для удаления вирусов (например, нанофильтрацию с использованием, например фильтраDV-20). Проведение этих различных стадий обеспечивает получение очищенного (обычно моноклонального) препарата, содержащего по меньшей мере 10 мг/мл или более, например 100 мг/мл или более антитела по изобретению и следовательно составляет воплощение данного изобретения. Концентрация до 100 мг/мл или более может быть получена с применением ультрацентрифугирования. Соответственно такие препараты, по существу, не содержат агрегированных форм антител по изобретению. Для экспрессии фрагментов антител особенно пригодны бактериальные системы. Такие фрагменты локализуются во внеклеточном пространстве или в периплазме. Нерастворимые периплазматические белки можно экстрагировать и подвергнуть рефолдингу с образованием активных белков в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, см. Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20 и Cupit P.M. et al. (1999) Lett. Appl. Microbiol., 29, 273-277. 3. Фармацевтические композиции. Очищенные препараты антигенсвязывающих белков, например антител, по изобретению (в частности моноклональные препараты), как описано выше, могут быть включены в фармацевтические композиции для применения в лечении заболеваний и расстройств человека. Обычно такие композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый (то есть инертный) носитель, как его понимают и называют в приемлемой фармацевтической практике, см. например Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16 е издание (1980), Mack Publishing Co. Примеры таких носителей включают стерильные носители, такие как физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы, забуференные подходящими буферами, такими как тригидрат ацетата натрия, до фармацевтически приемлемого рН, как например рН в диапазоне от 5 до 8. Фармацевтические композиции для инъекции (например, посредством внутривенной, внутрибрюшинной, интрадермальной, подкожной, внутримышечной доставки, доставки через воротную вену или посредством местной доставки в глаз путем местного или периокулярного нанесения в область глаза или инъекции в стекловидное тело глаза) или непрерывной инфузии соответственно не содержат видимых твердых частиц и могут содержать от 1 мг до 10 г терапевтического антигенсвязывающего белка, например антитела, обычно 5 - 1 мг, в частности 5 - 25 мг или 50 мг антигенсвязывающего белка, например антитела. Способы изготовления таких фармацевтических композиций хорошо известны специалистам в данной области техники. В одном из воплощений фармацевтические композиции содержат от 1 мг до 10 г терапевтических антигенсвязывающих белков, например антител, по изобретению в стандартной лекарственной форме, возможно вместе с инструкциями по применению. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть лиофилизированными (подвергнутыми сублимационной сушке) для повторного разведения перед введением в соответствии со способами, хорошо известными или очевидными специалистам в данной области техники. В тех случаях, когда воплощения данного изобретения содержат антитела по изобретению с изотипом IgG1, в фармацевтическую композицию может быть добавлен хелатор ионов металлов, в том числе меди, такой как цитрат (например, цитрат натрия), или EDTA, или гистидин, для уменьшения степени металл-опосредованного разрушения антител этого изотипа, см. ЕР 0612251. Фармацевтические композиции также могут содержать солюбилизатор,такой как аргинин в форме основания, детергент/агент против агрегации, такой как полисорбат 80, и инертный газ, такой как азот, для замещения кислорода в свободном пространстве над поверхностью продукта. Эффективные дозы и схемы лечения для введения антигенсвязывающего белка, например антитела,по изобретению обычно определяют эмпирически, и они зависят от таких факторов как возраст, масса и состояние здоровья пациента и заболевание или расстройство, которое будет подвергнуто лечению. Такие факторы находятся в сфере компетенции лечащего врача. Руководство в выборе соответствующих доз можно найти, например в Smith et al. (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press,New York, но в общем случае они будут находиться в диапазоне от 1 мг до 10 г. В одном из воплощений режим дозирования для лечения пациента человека составляет от 1 мг до 1 г терапевтического антитела по изобретению, вводимого подкожно один раз в неделю или каждые две недели либо путем внутривенной инфузии каждый месяц или каждые 2 месяца. Такое введение соответствует дозе 0,014-140 мг/кг,например 0,014-14 мг/кг. Композиции по настоящему изобретению также можно использовать в профилактических целях. Кроме этого, композиции могут быть доставлены более локально в глаз или путем местного применения, или путем инъекции в стекловидное тело, или путем периокулярного введения, то есть под склеру посредством или ретробульбарной, или околобульбарной инъекции, или инъекции в субтеновое пространство глаза, или подконъюктивальной инъекции. Для уменьшения друз может быть достаточно системного введения посредством, например, внутривенного введения терапевтического антитела. С помощью других способов местного введения можно обеспечить более легкое достижение терапевтическим антителом заднего сегмента глаза при более низких дозах. Описано, что местное нанесение способствует проникновению фрагментов антител в заднюю часть глаза в мышиной модели (Williams K.A., BeretonH.M., Farrall A., Standfield S.D., Taylor S.D., Kirk L.A., Coster D.J. (2005) Eye 19: 910-913). Описана инъекция в стекловидное тело фрагментов антител или целых моноклональных антител, и она хорошо переносится пациентами с AMD, что касается продуктов ранибизумаба и бевацизумаба. Терапевтическое антитело также может быть введено с использованием интравитреального имплантата. Ретробульбарные и околобульбарные инъекции могут быть осуществлены с использованием специальных игл с размером от 23 до 26, и они менее инвазивны, чем инъекции в стекловидное тело. Благодаря инъекции в субтеновое пространство глаза композиция будет находиться в контакте со склерой длительное время, что может помочь проникновению в заднюю часть глаза. Инъекция белков точно под конъюнктиву описана в кроличьих моделях, и это позволяет молекулам напрямую диффундировать через склеру, достигая заднего сегмента глаза. Также могут быть применены системы доставки с непрерывным высвобождением лекарственного средства, которые позволяют осуществлять высвобождение вещества в течение длительного интервала времени в глаз или в область вокруг глаза для того, чтобы введение можно было осуществлять менее часто. Такие системы включают мицеллы, гели, гидрогели, наночастицы, микрокапсулы или имплантаты, которые могут быть заполнены или покрыты терапевтической композицией. Их можно доставлять в стекловидное тело глаза путем инъекции или любым другим описанным ранее менее инвазивным способом, то есть посредством периокулярного введения или введения под склеру. Примеры таких систем с непрерывным высвобождением и способы местной доставки включают термочувствительные гидрогели с медленным высвобождением для введения под склеру или интраветриального введения композиции на основе наночастиц, которая нацелена на задний слой сетчатки и RPE (Janoira K.G., Gunda S.,Boddu S.H.S., Mitra A.K., (2007) Expert. Opin. Drug Deliv. 4: 371-388; Birch DG, Liang FQ (2007) Int. J. Nanomed. 2: 65-77). Возможны многочисленные другие комбинации системы доставки и способа местного введения, и они могут быть рассмотрены для композиций терапевтического антитела. Кроме того, антитело можно доставлять с использованием физического устройства, такого как устройство для ионофореза (Association for Research in Vision and Ophthalmology, 2008, Annual meeting, April 27th - May 1st, Posters98/A125and1813/D693 от EyeGate Pharma: Blalock и др., и Ruiz-Perez и др.). 4. Клинические применения. Очевидно, что заболевания, характеризующиеся повышенными уровнями -амилоида или амилоидными отложениями, включают болезнь Альцгеймера, умеренную когнитивную недостаточность,синдром Дауна, наследственную церебральную геморрагию с -амилоидозом типа Dutch, церебральную-амилоидную ангиопатию и различные типы дегенеративных деменций, как, например, таковые, ассоциированные с болезнью Паркинсона, прогрессирующим супрануклеарным параличом, кортикобазальной дегенерацией и болезнью Альцгеймера по типу болезни диффузных телец Леви, возрастной макулярной дегенерацией (AMD), заболеваниями глаукомой разного типа и образованием А-зависимой катаракты. В одном из воплощений изобретения заболеванием, характеризующимся повышенными уровнями-амилоида или -амилоидными отложениями, является болезнь Альцгеймера. В следующем воплощении изобретения заболеванием, характеризующимся повышенными уровнями -амилоида или -амилоидными отложениями, является возрастная макулярная дегенерация (AMD),заболевания глаукомой разного типа и образование А-амилоид-зависимой катаракты. Несмотря на то что настоящее изобретение описано главным образом в отношении лечения заболеваний или расстройств человека, настоящее изобретение также может найти применение в лечении схожих заболеваний или расстройств у млекопитающих, не являющихся человеком. Примеры Методы.ABi8200 - система флуоресцентной макроконфокальной клеточной детекции Applied Biosystems 8200 для FMAT;Biacore/Biacore - устройство, позволяющее измерять кинетику молекулярных взаимодействий в режиме реального времени с использованием SPR (поверхностный плазмонный резонанс); СМ 5 - сенсорный чип Biacore с универсальной поверхностью, покрытой матрицей из карбоксиметилированного декстрана;cSLO - конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп;FMAT - технология флуориметрического микроанализа (Applied Biosystems);FPLC - быстрая жидкостная хроматография белков;RU - единицы резонансного отклика (условная единица для количественного измерения связывания с сенсорным чипом в измерениях с Biacore);SPR - поверхностный плазмонный резонанс - физическое явление, применяемое в устройствахBiacore для измерения изменений массы на сенсорном чипе;SPSS - программное обеспечение для статистического анализа;SRU - биосенсорная технология SRU BIND, позволяющая производить регистрацию биохимических взаимодействий без применения метки. Материалы.C57/BL6 - "С 57 black 6" - обычная инбредная линия лабораторных мышей;DMEM - модифицированная Дульбекко среда Игла;Glutamax - стабильная форма глутамина, добавляемая в культуральную среду (добавка: дипептид Lаланин-L-глутамин); НЕК - клетки почки эмбриона человека (293);HBS-EP-буфер - универсальный буфер для Biacore, содержащий 0,01 М HEPES рН 7,4; 0,15 МHistoclear - агент для осветления тканей;IMS - промышленный метилированный спирт; Липофектамин - агент для трансфекции на основе катионных липидов, поставляемый Invitrogen/Gibco;Opti-MEM - среда от Invitrogen/Gibco на основе модифицированной среды Игла;PBS - забуференный фосфатом физиологический раствор;RIBI - антигенный адъювант на основе эмульсии типа вода-в-масле;RT-PCR - полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой;TASTPM - линия дважды трансгенных мышей, созданная путем скрещивания мышей со шведской мутацией АРР 695 (TAS10) с линией PS-1M146V(TPM);TBS - забуференный трисом физиологический раствор;Transfast - агент для липосомальной трансфекции, поставляемый Promega; Трис HCl - гидрохлорид трис-(гидроксиметил)аминометана; Твин-20 - полиоксиэтиленсорбитан-монолаурат; Версен - хелатирующий ионы металлов агент (этилендиаминтетрауксусная кислота). Сокращения.CFI - фактор комплемента I; СНО - клетки яичников китайского хомячка;HIER - индуцированное нагреванием восстановление антигена;RPE - клетки ретинального пигментного эпителия. Образование мышиных моноклональных антител, специфичных к бета-амилоиду человека. Одну группу мышей первоначально иммунизировали пептидом CGGGNKGAIIGLMVGG (содержащим остатки 27-38 -амилоида) (SEQ ID NO:7), присоединенным за N-конец к PPD. Иммунный ответ этих мышей оценивали, отбирая образец сыворотки и тестируя его в ELISA с конъюгатами овальбумина этого же пептида для определения титра антитела для иммунизированных мышей. Наблюдали только слабые ответы. В другом эксперименте группу мышей иммунизировали 10 мкг пептидаCGGGEDVGSNKGAIIGLMVGG (содержащего остатки 22-38 -амилоида) (SEQ ID NO:73), конъюгированного за N-конец к PPD (очищенное белковое производное; Cambridge Research Biochemicals), в адъюванте RIBI посредством внутрибрюшинного введения. Иммунный ответ этих мышей оценивали как и ранее, отбирая образец сыворотки через 7 суток после каждой бустер-иммунизации и тестируя его в ELISA для определения титра антител у иммунизированных мышей. Как только мыши достигали состояния с оптимальным ответом (на основании сравнительного анализа титра антител в двух последних образцах сыворотки) после бустер-иммунизации с использованием 2,5 мкг конъюгата пептида, отбирали мышь с наилучшим титром антител и извлекали селезенку для получения гибридом. Гибридомы получали, выделяя клетки селезенки и производя их слияние с клетками миеломы, применяя методологию с использованием ПЭГ (полиэтиленгликоля). Полученную в результате смешанную клеточную популяцию затем высевали в 96-луночные планшеты для клеточных культур. Затем каждое из экспрессированных антител, содержащихся в культуральном супернатанте, подвергали скринингу в гомогенном иммуноанализе FMAT (технология флуориметрического микроанализа). В результате этого каскадного скрининга были идентифицированы 29 положительных антител, отрицательных в отношении белка овальбумина, пассивно адсорбированного на полистирольных гранулах,но положительных в отношении:(1) связанного с полистирольными гранулами конъюгата овальбумина с присоединенным за Nконец пептидом CGGGEDVGSNKGAIIGLMVGG (22-38) (SEQ ID NO:73);(2) биотинилированного по N-концу пептида -амилоида (1-40), связанного с покрытыми стрептавидином полистиролыными гранулами;(3) биотинилированного по С-концу пептида -амилоида (1-40), связанного с покрытыми стрептавидином полистирольными гранулами; и(4) биотинилированного по N-концу пептида -амилоида (24-34), где остатки 24-34 -амилоида представляют собой VGSNKGAIIGL (SEQ ID NO:8), связанного с покрытыми стрептавидином полистирольными гранулами. Отобранные образцы супернатанта с антителами анализировали на предмет кинетики связывания с пептидом -амилоида (1-40), как изложено ниже. Определение констант скоростей диссоциации (kd), характеризующих связывание, в анализе с использованием поверхностного плазмонного резонанса. Устройство Biacore A100 использовали для получения данных по кинетике диссоциации, характеризующих взаимодействие 29 отобранных антител с -амилоидом (1-40). Для этого проточные ячейки стрептавидинового сенсорного чипа Biacore модифицировали с использованием низких уровней биотинилированного по N-концу -амилоида (1-40). Для каждого образца антитела получали три кривые и апроксимироаали к уравнениям скорости для получения скоростей диссоциации. Для 12 клонов дать оценку на основании константы скорости диссоциации было невозможно, так как в выбранных условиях эксперимента невозможно было измерить скорость диссоциации. Однако в этих условиях все 12 клонов показали значения константы скорости диссоциации (kd), равные по меньшей мере 10-5. Связывание с -амилоидом человека по данным ELISA. Идентифицированные выше 29 антител, содержащихся в супернатантах гибридом, повторно тестировали на предмет связывания с -амилоидом (1-40) человека посредством ELISA. Для проведения обоснованного сравнения определяли концентрацию антител, содержащихся в культуральных супернатантах,используя количественный анализ IgG с помощью ELISA. Для определения изотипа функционального антитела, связывание с -амилоидом человека анализировали посредством ELISA, используя набор антител для изотип-специфической детекции. Все 29 антител связывались с -амилоидом (1-40) человека в этом формате ELISA. Изотипы для каждого связавшегося клонированного антитела могли быть идентифицированы с использованием изотипспецифического вторичного антитела к IgG1, IgG2a или IgG2b. В одном случае наблюдали смесь функциональных изотипов. Картирование эпитопов посредством ELISA с использованием перекрывающихся пептидов. Эпитопы, распознаваемые 29 антителами, отобранными в результате первичного скрининга и содержащимися в супернатантах гибридом, картировали с помощью ELISA, используя набор из 31-го 12 мерного перекрывающегося пептида, полностью перекрывающих последовательность пептида амилоида (1-42). Все пептиды содержали С-концевой линкер из 3 аминокислот (глицин-серин-глицин) и концевой биотинилированный остаток лизина. 96-луночные планшеты для иммуноферментного анализа в течение ночи при 4 С покрывали стрептавидином (Sigma) (100 мкл; 0,5 мкг/лунка) в дистиллированной воде. Планшеты три раза промывали(PBS/0,01% Твина 20) и лунки блокировали 3%-ным BSA (250 мкл/лунка) в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты три раза промывали и в трех повторах добавляли по 100 мкл растворов пептидов (0,5 мкг/лунка в 1%-ном BSA, 0,1%-ном Твине 20 в PBS) на 3 ч при комнатной температуре. Кроме этого готовили контрольные лунки, содержащие только DMSO. Планшеты промывали три раза и во все лунки добавляли по 100 мкл каждого из 29 супернатантов гибридом (разбавленных 1/20 в 1%-номBSA/0,1%-ном Твине 20) и инкубировали при 4 С в течение ночи. Планшеты промывали три раза и до- 15022913 бавляли по 100 мкл/лунка конъюгата антитела против IgG мыши с пероксидазой хрена (Amersham, разбавленного 1:2000 в 1%-ном BSA, 0,1%-ном Твине 20 в PBS). Планшеты инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре, промывали три раза и детекцию связывания антитела проводили с использованием субстрата тетраметилбензидина (Sigma) (100 мкл/лунка) в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре, регистрируя голубое окрашивание. Реакцию останавливали и оптическую плотность прочитывали для каждой лунки при 450 нм. Все антитела связывались с очень схожей областью, содержащей мотив KGAIIGLM (эквивалентный остаткам 28-35 -амилоида) (SEQ ID NO:9). Кинетика связывания, определенная в анализе с использованием поверхностного плазмонного резонанса. Аффинность связывания с -амилоидом и кинетику для 8 антител, отобранных из пула 29 моноклинальных антител, более детально оценивали с использованием технологии Biacore 3000. Захват очищенных препаратов антител мыши осуществляли на поверхности чипа с поликлональными антителами против IgG мыши. Свежеприготовленный -амилоид (1-40) человека разбавляли в буфере HBS-EP и пропускали над поверхностью с захваченными антителами в концентрациях в диапазоне 4-500 нМ в течение 5 мин. Диссоциацию после введения пробы наблюдали в течение следующих 20 мин. Регенерацию осуществляли импульсной подачей 100 мМ Н 3 РО 4. Было показано, что регенерация не влияла на последующие циклы захвата антитела и связывания с -амилоидом. Для всех измерений использовали двойное сравнение против пустой (бланковой) поверхности и введений буфера сравнения. Полученные данные приведены в табл. 2. Таблица 2. Данные по аффинности и кинетике для восьми отобранных очищенных антител, полученные с использованием Biacore; показаны величины KD, полученные в одном эксперименте Результаты показали, что аффинности всех 8 моноклинальных антител были сопоставимы, хотя для 16D4 показана по меньшей мере в 12-2,5 раза меньшая аффинность по сравнению с другими клонами. Различия в величинах KD между остальными 7 антителами в таком одном эксперименте составили до 4,4 раза включительно. Два из этих клонов, 5D1 и 6F6, отбирали для дальнейшего масштабирования и повторно тестировали в трех повторах. Эти данные показаны в табл. 3. Таблица 3. Данные по кинетике и аффинности, полученные с использованием Biacore,для очищенных моноклональных антител 6F6 и 5D1 (измерение в трех повторах) Этот же метод с использованием Biacore также применяли для изучения связывания 6F6 с человеческим и мышиным -амилоидом (1-40) и -амилоидом (1-42). Связывание 6F6 со всеми этими пептидами характеризовалось аналогичными величинами. Связывание с экспрессируемым клетками белком-предшественником амилоида (АРР).-Амилоид состоит из пептидов, образованных в результате протеолитического расщепления трансмембранного белка-предшественника I типа, называемого белком-предшественником амилоида(АРР). Поскольку АРР содержит большой внеклеточный домен, связывание с этим белком могло бы потенциально инициировать реакцию антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Анализ, основанный на использовании FMAT ABI8200. Технологию флуориметрического микроанализа (FMAT; система клеточной детекции 8200) использовали для проведения основанного на использовании клеток анализа связывания 8 отобранных выше антител с белком-предшественником амилоида, экспрессированным в клетках НЕК 293 Т. КлеткиHEK293 Т, либо трансфицированные мнимо, либо трансфицированные плазмидой, кодирующей полноразмерный АРР человека, собирали через 48 ч после трансфекции. Трансфицированные клетки инкубировали с супернатантами гибридом в различных разведениях или с очищенными мышиными антителамиIgG LN27 (Zymed) к внеклеточнуму домену АРР в качестве положительного контроля и антителом, которое распознает только свободный N-конец -амилоидного пептида (реагент собственной разработки), в качестве отрицательного контроля. Связывание антител выявляли, используя меченое красителем FMAT голубым антимышиное антитело и детектировали с использованием системы клеточной детекции 8200. Фоновые сигналы, полученные от мнимо трансфицированных клеток, вычитали из сигналов для клеток,трансфицированных АРР. 7 клонов не показали никакого связывания с АРР, экспрессированным в клетках НЕК 293 Т, по сравнению с моноклинальным антителом LN27, взятым в качестве положительного контроля. При изучении результатов, полученных с мнимо трансфицированными клетками НЕК 293 Т,для одного клона (5 С 9) было получено доказательство неспецифического связывания с клетками НЕК 293 Т, делающее интерпретацию способности связывания с АРР для этого конкретного клона затруднительной. Связывание с белком-предшественником амилоида (АРР) в срезах головного мозга трансгенных мышей. Срезы головного мозга мышей TASTPM (Howlett и др., 2008) в возрасте 2 месяцев или мышейTAS10 в возрасте 12 месяцев исследовали посредством IHC. Срезы обрабатывали 85%-ной муравьиной кислотой и окрашивали на предмет связывания с полноразмерным АРР. На момент выбранного возраста у соответствующих мышей не наблюдается никаких отложений амилоидных бляшек, хотя имеется некоторое окрашивание, достигаемое с использованием данной методики, возможно обусловленное присутствием внутриклеточного амилоида. 6F6 не давало никакого окрашивания на этих срезах, в то время как контрольное антитело на полноразмерный АРР (Zymed) давало окрашивание. Связывание с -амилоидом человека по данным ELISA с использованием Fab-фрагмента.Fab-фрагмент 6F6 получали стандартным протеолитическим расщеплением, используя папаин, иммобилизованный на гранулах (Pierce,20341). Проводили ELISA на предмет связывания очищенныхFab-фрагментов IgG 6F6 с А-пептидом (1-40), иммобилизованным на планшете для ELISA. Результаты одиночного эксперимента с примененим ELISA показали, что Fab-фрагмент 6F6 по-прежнему способен связываться с А-пептидом (1-40). Связывание 6F6 с нативным амилоидом человека в образцах плазмы волонтеров. Цельную кровь волонтеров (HVT) собирали в пробирку с K2-EDTA посредством венепункции и пробирку незамедлительно помещали на лед. Образец крови обрабатывали в течение 30 мин, откручивая при 2000g в течение 15 мин при 4 С для получения плазмы. Затем к плазме добавляли ингибитор протеаз (полный коктейль ингибиторов протеаз от Roche,по каталогу: 11 973 580 001, Roche Applied Science) в соответствии с инструкциями производителя. Затем аликвоты плазмы замораживали при температуре ниже -70 С перед проведением анализа. В анализе использовали 6F6 в качестве захватывающего антитела в формате 96-луночного иммуноанализа с применением ECL (электрохемилюминесценции) (Meso Scale Discovery (MSD. Кратко, 6F6 наносили точечно на 96-луночный планшет от MSD; затем добавляли образцы (калибровочный стандарт для анализа, отрицательный контроль, QC (контроль качества) и тестируемые образцы). После инкубации, несвязавшийся материал отмывали и далее проводили инкубацию с детектирующим антителом(биотинилированным 4G8 (специфичным к эпитопу (17-24) -амилоида. Вслед за этим после промывки добавляли метку стрептавидин-сульфо-TAG. По окончании этой инкубации применяли стадию промывки. Добавление в планшет буфера Т для прочтения от MSD позволяло прочесть электрохемилюминесцентный сигнал на визуализирующем устройстве Sector Imager 6000 от MSD. Концентрацию аналита получали из сигнала MSD путем обратных вычислений, используя калибровочную кривую для анализа,полученную с использованием известных концентраций А 1-42. Нижний предел количественного определения для данного анализа составлял 78,1 пг/мл. В табл. 4 суммированы концентрации А для 10 образцов плазмы HVT, измеренные в описанном выше анализе с применением антител 6F6-4G8. Все образцы тестировали в двух повторах. Таблица 4. Концентрация А в образцах HVT, измеренная с применением антител 6F6-4G8 Связывание с А 1-42 в нативных и денатурирующих условиях по данным вестерн-блоттинга. Изучали связывание очищенного моноклонального антитела 6F6 с различными формами А 1-42 и анализировали, используя SDS-PAGE в нативных или денатурирующих условиях. А 1-42 использовали или свежеприготовленным, или предварительно обработанным: PRF F12 в течение ночи при 4 С, в течение ночи в PBS при 37 С или в течение ночи в 10 мМ HCI при 37 С. Препараты разделяли, используяSDS-PAGE, и анализировали вестерн-блоттингом, применяя антитело 6F6 или 6 Е 10 (антитело, специфичное к А 1-16 человека; имеющийся в продаже реагент, Eurogentec) и 5G5 (антитело, специфичное к А 1-42; реагент собственной разработки). При анализе гелей было обнаружено, что в нативных условиях 6 Е 10 распознает более высокомолекулярные формы амилоида, в то время как 6F6 и 5G5 демонстрируют только относительно слабый сигнал по отношению к этим олигомерным и фибриллярным формам. В денатурирующих условиях 6F6 и 5G5 распознавали главным образом мономерные формы бетаамилоида, в то время как специфичное к N-концевой последовательности 6 Е 10 по-прежнему сохраняло способность связываться с более высокомолекулярными агрегатами бета-амилоида, которые не разделялись в денатурирующих условиях, использованных в этом эксперименте (фиг. 1). В заключении необходимо отметить, что это указывает на то, что в данных условиях и с использованием описанных выше препаратов амилоида 6F6 предпочтительно связывается с низкомолекулярными формами и мономерами А 1 -42. Картирование посредством ELISA эпитопов очищенного моноклонального антитела 6F6. Очищенное моноклональное антитело 6F6 использовали для повторения изложенной выше процедуры картирования эпитопов с применением ELISA. Использовали тот же самый протокол за исключением того, что добавляли 100 мкл раствора разведенного очищенного антитела (0,1 мкг/мл в 1%-номBSA) вместо разведенного культурального супернатанта гибридом. Очищенное моноклональное антитело 6F6 связывалось с мотивом KGAIIGL (эквивалентным остаткам 28-34 -амилоида), но связывание значительно усиливалось, если в пептид был включен остаток 35 М (мотив, эквивалентный остаткам 28-35 -амилоида: (SEQ ID NO:9. При использовании методики перекрывающихся эпитопов нельзя исключить незначительный вклад соседних остатков. Картирование эпитопов моноклонапьного антитела 6F6 с использованием поверхностного плазмонного резонанса. Очищенное моноклональное антитело 6F6 в концентрациях 8-64 нМ впрыскивали в течение 3 мин над биотинилированными по С-концу пептидами, соответствующими последовательностям 24-35 (SEQNO:12: IIGLMVGGVVIAGSG) -амилоида, захваченными на сенсорном чипе, покрытым стрептавидином. Эксперимент проводили, используя устройство Biacore 3000. Результаты показали, что 6F6 было способно связываться с пептидом 24-35 и 28-39, но не с пептидом 31-42 -амилоида, подтверждая полученные выше результаты с использованием перекрывающихся пептидов. Это также может указывать на то, что остатки 31-35 не являются существенными для связывания 6F6 и остатки выше положения 35 повидимому не вовлечены в связывание этого антитела. Влияние внутривенного введения моноклональных антител 6F6 и 5D1 против -амилоида на уровни амилоида в крови, обусловленные центрально введенным амилоидом. Целью этого исследования было изучение уровней радиоактивности в крови после интрацеребровентрикулярной (ICV) инъекции 125Iамилоида 1-40 (1 мкКи) мышам, которым предварительно было внутривенно введено тестируемое антитело. 125IАмилоид 1-40 (1 мкКи) вводили ICV-канюлированным самцам мышей C57BL6/J (n = 8-10 на одну обработку) посредством ICV-инфузии. За один час до ICV-инфузии 125Iамилоида 1-40 мышам внутривенно вводили или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) или 600 мкг моноклонального антитела против -амилоида 6F6 или 5D1. Животных возвращали в домашние клетки послеICV-инфузии и через 4 ч после ICV-инфузии сортировали, отбирали образцы крови и проводили измерение гамма-излучения, определяя число импульсов в минуту (СРМ). Подготовка к хирургической операции. Мышей подвергали анестезии посредством ингаляционного введения изофлурана -5%) и помещали в стереотаксический аппарат. Перед проведением каких-либо хирургических процедур мышам для аналгезии подкожно вводили 0,05 мл (разведение 1:10 из концентрированного раствора) vetergesic (бупренорфин). Делали разрез вдоль срединной линии кожи черепа и дорсальную часть черепа очищали и сушили. Через высверленное в черепе отверстие в латеральный желудочек вводили канюлю со следующими стереотаксическими координатами относительно брегмы (переднезаднее направление (АР): -0,5; боковое направление (L): +0,7; дорсально/вентральное направление (DV): -2,5). В черепе просверливали два дополнительных отверстия, в которые помещали кортикальные винты. Канюлю закрепляли на месте,используя цианоакрилатный гель, и разрез зашивали с загибом и окантовкой вокруг места нанесения цианоакрилатного геля. После операции мышам подкожно вводили 0,3 мл физиологического раствора и помещали в теплые условия для восстановления от анестезии. После восстановления установочного рефлекса мышей размещали поодиночке и обеспечивали стандартный послеоперационный уход в течение 5 суток или до тех пор, пока не восстанавливался предоперационная масса тела. Расположение канюли. После восстановления проверяли расположение канюли, наблюдая за потреблением питьевой воды в ответ на введение ангиотензина II. Каждой мыши вводили ICV 100 нг ангиотензина II. После введения наблюдали за потреблением воды в течение 15 мин. Результаты. Наблюдали значительное увеличение радиоактивности в крови животных, которым вводили оба моноклональных антитела 6F6 и 5D1, по сравнению с животными, которым вводили только растворитель, предпочтительно обусловленное способностью связывать в кровотоке меченый радиоактивной меткой -амилоид и таким образом продлевать полупериод существования в крови меченого пептида 140 -амилоида. Различия между этими моноклональными антителами были незначительными. Обработка 6F6 и 5D1 приводила к статистически значимому увеличению СРМ по сравнению с контрольным введением растворителя (СРМ: растворитель 1280 +/- 312; 5D1 8152 +/- 2001; 6F6 8875 +/- 2123). ОдномерныйANOVA (дисперсионный анализ), F (3,32) = 15,14, р 0,001 (логарифмическое преобразование данных),апостериорный сравнительный LSD(наименьшая значимая разность)-тест р 0,001; все группы сравнивали с растворителем. Изучение фармакокинетики образования комплекса 6 Р 6-амилоид у морских свинок. Целью этого исследования было изучение образования комплекса антителоамилоид in vivo у морских свинок, имеющих аминокислотную последовательность -амилоида, идентичную людям. Этого достигали посредством измерения концентрации свободного антитела и концентрации комплексов антителоамилоид в различные моменты времени в течение 19 суток. Метод. Самцам морских свинок Dunkin-Hartley делали хирургическую операцию, используя анестезию изофлураном, вводя двойную канюлю в яремную вену. Канюлированным морским свинкам внутривенной инфузией вводили антитело 6F6 (n = 6) в течение 1 ч. Препараты очищенного антитела в раствореPBS вводили в дозе 0,700 и 0,625 мл/кг/ч соответственно для достижения целевой дозы 3 мг/кг. У каждой морской свинки отбирали образцы крови (60 мкл) перед введением дозы (0 мин) и собирали, используя пробирки с EDTA, в следующие моменты времени (на протяжении 20 суток) после начала инфузии: 15,30, 45, 60 (завершение в/в инфузии), 90, 120, 180, 360 мин, 8, 10, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216,240, 264, 312, 360, 408 и 456 ч. Образцы большого объема (0,5 мл) отбирали в момент времени 0, 10, 96, 216, 312 и 456 ч после начала инфузии. После отбора последнего образца крови на 20-е сутки животных подвергали анестезии и обескровливали. Образцы плазмы хранили при -80 С до проведения ELISA-анализа. Уровни свободных антител оценивали посредством антигенсвязывающего ELISA, используя микротитрационные планшеты,покрытые р-амилоидом (1-40). В лунки добавляли образцы плазмы для 0, 10, 96, 196, 312 и 456 ч и связавшееся моноклональное антитело 6F6 детектировали, используя конъюгат антимышиного IgG и HRP. Комплексы -амилоид-антитело детектировали, посредством захвата на планшетах, покрытых поликлональным антителом, специфичным к С-концу 42 -амилоида. Захваченные комплексы детектировали посредством детекции моноклонального антитела 6F6 с использованием конъюгата анти-мышиного IgG с биотином и конъюгата стрептавидина и криптата европия. Результаты. Уровни содержания свободного антитела, как и ожидалось, быстро повышались после в/в (внутривенной) доставки, но также быстро снижались в течение первых 24 ч. Уровней устойчивого состояния достигали приблизительно через 160 ч. Согласно результатам показано, что скорость клиренса крови составляет 1,75 мл/ч/кг для антитела 6F6, а среднее время удержания (MRT) составляет 49,4 ч. Уровни содержания комплекса также быстро возрастали после введения антитела, и средние уровни содержания комплекса оставались устойчивыми на протяжении оставшегося периода исследования. Однако у отдельных животных были отмечены значительные отклонения. У некоторых животных уровни содержания комплекса снижались, у некоторых животных уровни содержания комплекса повышались,но в большинстве случаев уровни содержания комплекса оказывались стабильными, начиная примерно с момента времени 216 ч и далее. Эксперимент показал, что комплексы с эквивалентным количеством амилоида человека могут быть образованы in vivo и что уровень содержания комплексов в плазме после введения однократной дозы оказывается неизменным на протяжении длительного периода времени. Исследование введения 6F6 в течение 4 недель трансгенным мышам TASTPM. Трансгенные (tg) мыши, сверхэкспрессирующие белок-предшественник амилоида человека (hAPP),являются моделью амилоидоза и подходят для изучения влияния лекарственных средств на продуцирование, секвестрацию и отложение амилоида. В этом исследовании асторы изобретения использовали трансгенных мышей TASTPM, сверхэкспрессирующих белок-предшественник амилоида человека и мутантную форму пресенилина 1 (линию дважды трансгенных мышей, созданную путем скрещивания мышей со шведской мутацией АРР 695 (TAS10) с линией PS-1M146V (ТРМ) (Hewlett et al. 2008. Исследование проводили на самцах и самках мышей в возрасте приблизительно 10 недель. Животных разделяли на три обрабатываемые группы. Обрабатываемые группы:(A) Tg-животные, умерщвленные в 1-е сутки, не получавшие никакого соединения, для определения уровней амилоида в начальный момент исследования (n = 16: 9 самцов, 7 самок);(Б) Tg-животные, получавшие растворитель (PBS) посредством внутрибрюшинной инъекции дважды в неделю в течение 4 недель (n = 19: 9 самцов, 10 самок);(B) Tg-животные, получавшие 6F6 (300 мкг на мышь) посредством внутрибрюшинной инъекции дважды в неделю в течение 4 недель (n = 19: 9 самцов, 10 самок). Животных разделяли на 3 обрабатываемые когорты с началом режима дозирования с интервалом в одну неделю. Образцы крови отбирали из хвостовой вены перед введением 2-й, 4-й, 6-й и 8-й дозы у 3 самцов и 3 самок из каждой обрабатываемой группы. Конечные образцы плазмы с EDTA готовили для всех групп на 1-е сутки (группа А) или через 4 недели после введения первой дозы (группы Б и В). Отбирали левые и правые полушария головного мозга, мгновенно замораживали и хранили при -80 С до последующего анализа биохимических уровней амилоида. Также отбирали кончики хвостов и использовали для подтверждения генотипа. Определение биохимической нагрузки амилоида в гомогенатах головного мозга. Уровень А 1-40 и А 1-42 в выделенных образцах головного мозга определяли, используя технологию ORIGEN (Igen International Inc.). Кратко, полушария головного мозга взвешивали и экстрагировали в 5 М гуанидине HCl (Calbiochem), содержащем ингибитор протеаз Complete (Roche Diagnostic), в концентрации 150 мг/мл (мас./об.), используя ручной механический гомогенизатор. Экстракты разбавляли вIgen-буфере и в анализе использовали разведения 1:10 и 1:40, осветленные центрифугированием при 20000 д. В анализе ORIGEN использовали покрытые стрептавидином гранулы Dynabeads (Dynal) с иммобилизованным биотинилированным антителом 6 Е 10 (специфичным к А 1-16 человека; Signet Labs) для захвата А из образцов, и детекцию связанного А с применением меченного ori-меткой G210 (антитела,специфичного к А 1-40; реагента собственной разработки) или 5G5 (антитела, специфичного к А 1-42; реагента собственной разработки). Анализ посмертных отложений А 1-40 и A1-42 в каждой группе не показал никакого связанного с обработкой 6F6 уменьшения отложений амилоида в головном мозге в этом исследовании и с использованием примененного здесь аналитического метода. Окончательные заключения о возможном снижении уровня амилоида в головном мозге не могли быть сделаны из-за того, что картина увеличения А в головном мозге обработанных растворителем животных в ходе исследования была слабовыраженной и не единообразной среди всех животных. Определение уровней антитела 6F6 в плазме. Отбираемые в течение продолжительного времени и конечные образцы плазмы с EDTA оценивали по уровням антител посредством ELISA. Кратко, готовили разведения образцов 1:50, 1:500 и 1:5000 и добавляли в планшеты для ELISA вместе с 0,5 мкг/мл иммобилизованного пептида А 1-40, разбавленного в PBS. Образцы инкубировали в течение ночи при 4 С, промывали и связанное антитело 6F6 детектировали, используя конъюгат анти-мышиного антитела с пероксидазой хрена. Концентрации в образцах определяли, применяя стандартную кривую, полученную с использованием 6F6 в 8 известных концентрациях в диапазоне от 0 до 30 мкг/мл. Результаты показали, что введение всем мышам антитела 6F6 было выполнено успешно и что конечные концентрации в плазме характеризовались средней величиной приблизительно 250 мкг/мл. Для отобранных в течение продолжительного времени образцов плазмы было показано увеличение уровней в плазме между 2-й и 4-й дозой, обусловленное повторным введением, но сохранение уровня по меньшей мере равного 150 мкг/мл до конца исследования у всех животных, у которых отбирали образцы. Определение комплексов амилоид-антитело в плазме посредством иммунопреципитации и вестернблоттинга. Чтобы проверить, образовывались ли комплексы антитело-А в этом исследовании in vivo, образцы плазмы исследовали на предмет образования комплексов, используя иммунопреципитацию и последующий анализ вестерн-блоттингом. Кратко, образцы плазмы по 15 мкл инкубировали и встряхивали в течение 3 ч при 4 С с 10 мкл суспензии гранул сефарозы с иммобилизованным белком А. Гранулы промывали 5 раз, используя по 1 мл охлажденного во льду PBS, содержащего ингибитор протеаз. Каждый раз образцы центрифугировали в течение 2 мин при 2000 об/мин и 4 С. После промывки гранулы ресуспендировали в 20 мкл буфера для электрофоретических образцов, содержащего 0,1 М DTT. Образцы кипятили в течение 5 мин и центрифугировали, как описано выше. После повторного кипячения супернатанта образцы наносили на минигели (10% бис/трис) и разделение проводили, используя электрофорез. С гелей делали реплики на нитроцеллюлозную мембрану, блокировали и исследовали с применением антитела 6 Е 10 (специфичного к А 1-16 человека; Signet Labs). Детекцию связанного 6 Е 10 осуществляли с помощью ИК-красителя 800, конъюгированного с антителом козы против IgG (H+L) мыши (Rockland). Репли- 20022913 ки визуализировали, используя систему визуализации в инфракрасном излучении Odysee. Результаты показали, что низкомолекулярный А, очищенный с использованием метода совместной иммунопреципитации, может быть детектирован на репликах. Это позволяет сделать заключение,что образование комплексов 6F6 с А происходило in vivo, и они присутствовали в образцах плазмы. У протестированных самок животных интенсивность зон была слабее. В целом это подтвердило, что 6F6 способно связываться с А человека in vivo и образовывать стабильные комплексы, которые могут быть детектированы вестерн-блоттингом. Исследование введения 6F6 в течение 16 недель трансгенным по hAPP мышам. Использовали трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих hAPP(751) под контролем мышиного промотора Thy-1, которые экспрессируют АРР человека в высоких уровнях с лондонской (717) и шведской (670/671) мутациями, что приводит к зависящему от возраста увеличению уровней бета-амилоида(1-40) и бета-амилоида (1-42) (А 1-40 и А 1-42). У этих мышей развиваются бляшки, содержащие амилоидные отложения, в раннем возрасте, начиная приблизительно с 4 месяцев. Тяжесть патологии головного мозга коррелирует с увеличением возраста и поведенческими дефицитами. Это исследование было проведено вслепую исследователем, которому была неизвестна природа вводимого соединения. Самок трансгенных мышей в возрасте 4 месяцев распределяли на 3 группы (n = 15 на группу), а также создавали группу нетрансгенных детенышей одного помета и еженедельно обрабатывали внутрибрюшинно в течение 4 месяцев. Группа детенышей одного помета и одна Tg-группа,получавшие контрольный IgG, служили в качестве контролей. По окончании обработки проводили поведенческое тестирование (водный лабиринт Морриса, задание по распознаванию новых объектов (NewObject Recognition Task и животных умерщвляли. Собирали образцы головного мозга, CSF и плазмы крови. Одно полушарие каждого головного мозга подготавливали для гистологической оценки, второе незамедлительно замораживали для определения А 1-38, А 1-40 и А 1-42 во фракциях гомогената головного мозга в TBS, тритоне Х-100, SDS и муравьиной кислоте (FA), а также в CSF. Определяли отложение бляшек в головном мозге в фиксированных образцах, применяя иммуноокрашивание с использованием антитела 6 Е 10 против бета-амилоида, площадь поверхности бляшек и количество бляшек определяли и подсчитывали, применяя программное обеспечение (Image Pro Plus, версия 4.5.1.29) для компьютерного анализа изображений. Плотность синапсов изучали с использованием окрашивания специфичным к синаптофизину антителом (Neomarkers), меченым биотинилированным вторичным антителом с использованием системы детекции с применением VIP (визуальная иммунопреципитация (visual immunoprecipitation (Vector). Обрабатываемые группы: 3 группы Tg-животных (15/группа) и одна группа нетрансгенных C57BL6 животных (n = 15):(А) Tg-животные, получавшие соединение 6F6 (17 мг/кг массы тела еженедельно (n = 15;(Д) нетрансгенные детеныши одного помета, получавшие mIgG2a (17 мг/кг массы тела (n = 15. Определение биохимической нагрузки амилоида в последовательно экстрагированных гомогенатах головного мозга и CSF.CSF собирали у животных обрабатываемых групп А, Б и Г и незамедлительно замораживали до проведения дальнейшего анализа с использованием методики ELISA. Для получения гомогенатов головного мозга замороженные полушария от животных групп А, Б и Г гомогенизировали в 5 мл забуференного трисом физиологического раствора (TBS), содержащего коктейль ингибиторов протеаз. Приблизительно половину гомогенизатов головного мозга незамедлительно замораживали в виде аликвот. Другую половину центрифугировали при 74500 g в течение 1 ч и полученные супернатанты (= TBS-фракция) разделяли на аликвоты и хранили при -20 С до проведения определения. Осадки после центрифугирования суспендировали в тритоне X-100 (2,5 мл), центрифугировали, супернатанты разделяли на аликвоты и хранили при -20 С. Эти стадии повторяли с SDS (2,5 мл). Осадки после центрифугирования SDSфракции суспендировали в 70%-ной муравьиной кислоте (0,5 мл) перед последующим центрифугированием. Полученные супернатанты нейтрализовали 1 М трисом (9,5 мл), разделяли на аликвоты и хранили при -20 С. CSF, а также образцы четырех фракций головного мозга использовали для определения А 38,А 340 и А 342, применяя имеющийся в продаже набор -плексный набор для определения бета амилоида от Mesoscale Discovery (Mesoscale Discovery Abeta 3-plex kit)K15148E) с использованием SectorImager MS2400, следуя инструкциям производителя. Данные для головного мозга рассчитывали в виде количества А в нг на один г влажного мозга, данные для CSF рассчитывали в виде количества А в пг на мл. В TBS-фракции уровни А были наиболее низкими для животных группы Б для всех трех видов амилоида. Что касается А 342, то такое увеличение для групп А и Г с обработкой 6F6 было значительным по сравнению с контрольной группой Б (р 0,05 в сравнении с группой А и р 0,001 в сравнении с группой Г), но не было значительным для А 338 и А 340. Во фракциях с тритоном Х-100 средние уровни А 342 также были значительно повышены в группах с обработкой 6F6 (А (р 0,05) и Г (р 0,01 по сравнению с контрольной группой Б. Уровни А 340 в группах Б и Г не различались значительно, в то время как для группы А они были по-прежнему значительно повышенными по сравнению контрольной группой Б (р 0,05). Наблюдали увеличение, хотя и не статистически значимое, уровня А 338 в группе А с обработкой 6F6 по сравнению с контрольной группой Б, но в группе Г с обработкой 6F6 уровень А 38 был слегка снижен по сравнению с контрольной группой Б. Уровень связанного и нерастворимого в воде А по результатам измерений в SDS- и FA-фракции был значительно выше в головном мозге животных группы А с обработкой 6F6 по сравнению с группами Б (А 38 и А 42) или Г (А 38 и А 40). Контрольная группа Б и группа Г с обработкой 6F6 сильно не различались. В образцах CSF не наблюдали значительных различий между группами для А 38, А 40. Уровни А 38, А 40 и А 42 были немного ниже у животных в контрольной группе Б по сравнению с обработанной 6F6 группой А. Уровни А 42 в CSF у животных группы Г, обработанной 6F6, были значительно выше по сравнению с контрольной группой Б (р 0,05), что возможно указывает на мобилизацию растворимого А 42 посредством секвестрации в CSF или не напрямую через кровоток. Определение плотности синапсов. По три среза на одно животное окрашивают, используя антитело против синаптофизина (1:200; NeoMarkers;по каталогу RM9111-SO) и биотинилированное вторичное антитело (1:200; Vector Laboratories;по каталогу РК-6101) с последующим развитием окраски посредством VIP (субстратный набор для пероксидазы;по каталогу SK4600). Для определения индивидуальной средней плотности синапсов оценивают по три изображения на область (гранулярный слой из гиппокампальных структур СА 1,СА 3 и зубчатой извилины медиальной поверхности (DGmb и срез, применяя процедуру измерения в макромасштабе. В процессе макропрочтения изображения подвергают равномерному контрастированию и подсчитывают синапсы выше постоянного порога. Одиночные и последовательные синапсы подсчитывают по отдельности, используя ограничения по размеру. Общую площадь последовательных синапсов делят на средний размер одиночных синапсов. Окончательное количество синапсов рассчитывают по следующей формуле: Кроме того, площадь изображения корректируют с учетом фона в терминах уменьшения площади кровеносных сосудов и количество синапсов рассматривают с учетом общей площади изображения,уменьшенной на площадь кровеносных сосудов. Измерение количества синапсов в области СА 1, СА 3 и GDmb срезов гиппокампа головного мозга,взятых у обрабатываемых групп А, Б и Г, показало, что плотность синапсов оставалась неизменной среди обрабатываемых групп. Определение уровней общего и несвязанного (свободного) -амилоида в образцах плазмы, отбираемых в течение продолжительного времени. Образцы крови in vivo отбирали перед началом обработки (0-е сутки) и вновь через 3, 6, 9 и 12 недель из лицевой вены/артерии, расположенной в области нижней челюсти. С целью получения плазмы образцы крови собирали во флаконы с EDTA, не имеющие крышек. Все образцы плазмы замораживали и хранили до проведения анализа. Уровни несвязанного (свободного) амилоида и уровни общего амилоида (несвязанного А и в комплексе с антителом) определяли, используя автоматизированное рабочее место Gyrolab. Биотинилированное mAb мыши 6F6 использовали в качестве захватывающего реагента для анализа свободного амилоида, а биотинилированное специфичное к N-концу антитело против -амилоида (реагент собственной разработки) использовали в качестве захватывающего реагента для анализа общего -амилоида. Захват обоих захватывающих реагентов осуществляли на захватывающей колонке Gyros Bioaffy CD, содержащей матрицу, покрытую стрептавидином. Захватывающие антитела добавляли в концентрации 700 нМ. Для детекции в обоих видах анализов использовали Alexa647-меченое (антитело) 4G8 (специфичное к эпитопу 17-24 -амилоида) в концентрации 12,5 нМ. Для количественного определения -амилоида в образцах получали калибровочную кривую, используя A1-42 (A1-42 от Innogenetics) в динамическом диапазоне от 31,25 до 20000 пг/мл. Разведения А 1-42 для получения калибровочной кривой и разведения образцов плазмы проводили в истощенной по -амилоиду плазме крови человека. Данные анализировали, используя собственное программное обеспечение компьютера, и затем представляли в графическом виде в Excel. Уровни общего -амилоида возрастали более чем в 2000 раз через 3 недели (первая временная точка) в обеих группах, обработанных 6F6 (как 17 мг/кг, так и 33 мг/кг). В группе, обработанной 33 мг/кг,уровень общего -амилоида, наблюдаемый на протяжении исследования, был незначительно выше, но не коррелировал с повышением уровня дозы, что возможно указывает на достижение эффекта насыщения. Уровни свободного р-амилоида для обеих обработанных 6F6 групп находились на уровне фона, соответствующего уровню для нетрансгенных мышей в первую временную точку обработки (3 недели), повидимому вследствие того, что большая часть, если не весь детектируемый в этом анализе -амилоид,- 22022913 был включен в состав комплексов антителоамилоид. При отсутствии обработки базисные уровни бета-амилоида у трансгенных мышей были приблизительно в 6 раз выше, чем у нетрансгенных контрольных мышей. Определение отложения бляшек посредством окрашивания с использованием 6 Е 10. Из полушарий головного мозга 18 Tg-мышей (по 6 из Tg-групп А, Б и Г) готовили достаточное количество срезов на каждый головной мозг для количественного определения амилоидного отложения. Иммунореактивность по отношению к 6 Е 10 количественно оценивали в гиппокампе и коре головного мозга. Делали по 15 сагиттальных срезов на один слой (в целом 5 слоев в соответствии с фиг. 104-105,107-108, 111-112, 115-116 и 118-119 согласно морфологическому атласу "The Mouse Brain" от Paxinos andFranklin, 2-е издание), каждый толщиной 5 мкм (Leica SM 2000R). С тканями всех исследуемых трансгенных животных манипулировали в точности одним и тем же образом, чтобы избежать ошибок, обусловленных отклонениями в данной процедуре. Амилоидные отложения и отложения бляшек определяли, используя моноклональное антитело 6 Е 10 (Signet), направленное против положения 1-17 амилоидного пептида человека. Измеряемые площади областей гиппокампа и коры головного мозга были постоянными во всех исследованных образцах головного мозга, что исключает негативное влияние на ткань стадий иммуногистохимического окрашивания (например, сжатия, разных условий получения срезов и т.д.), и указывает на отсутствие какой-либо вызванной обработкой атрофии. Данные об отложении бляшек соотносили с размером индивидуальной области на срезе для того, чтобы иметь возможность справиться с артефактами, образованием складок или потерей фрагментов. Обработка большой дозой 6F6 (группа Г) приводила к значительному уменьшению доли занятой бляшками площади в гиппокампе и коре головного мозга по сравнению с группой,обработанной низкой дозой 6F6, (группа А; ANOVA: кора головного мозга и гиппокамп: р 0,01) и контрольной группой Б (фиг. 2). Такая же тенденция наблюдалась и для количества бляшек на один мм 2,которое и в этом случае оказалось меньше в обработанной 6F6 группе Г по сравнению с контрольной группой Б (t-тест: кора головного мозга: р = 0,093) и группой А, обработанной низкой дозой 6F6 (t-тест: гиппокамп: р = 0,051; фиг. 3). Средний размер бляшек оставался неизменным среди всех обрабатываемых групп. Демонстрация наличия амилоидоза в глазах мышей, дефицитных по Фактору комплемента Н: модель "сухой" AMD. Животные.cfh-/-мышей в возрасте десяти недель, 3, 6, 9 месяцев и одного года (n = 6) (с обратным скрещиванием с генетической фоновой линией C57BL/6 в течение более 10 поколений) и обычных мышей C57BL/6 в соответствующем возрасте (n = 6) размещали в условиях контролируемой температуры с 12-часовым циклом день (160 люкс)-ночь и содержали на обычной лабораторной диете (лабораторный корм для грызунов без ограничений). Мышей подвергали анестезии (0,75 мл кетамина, 0,5 мл домитора, 0,75 мл стерильной воды в дозе по 0,2 мл/100 г, в/б, при необходимости с добавками) и их зрачки расширяли, вводя местно 1%-ный тропикамид и 2,5%-ный гидрохлорид фенилэфрина за 10-15 мин до получения изображения с помощью cSLO. Перед каждой последовательной серией получения изображения на глаз наносили капли гидроксипропил-метилцеллюлозы (0,3%-ной) для предотвращения высыхания. Все экспериментальные процедуры согласовывались и проводились в соответствии с Актом о животных (Порядок научных исследований) Великобритании (United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act) 1986 года. Получение изображений сетчатки. Изображения получали для cfh-/- мышей в возрасте 3, 6 и 12 месяцев (n = 12) и контрольных мышей(n = 6) в соответствующем возрасте, как подробно описано ниже. Изображения сетчатки с высоким разрешением и высокой контрастностью получали с помощью конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа, как описано ниже. Кратко, получение изображений в отраженных лучах осуществляли с использованием спектральных линий излучения лазера 488 и 820 нм. Изображения сетчатки мышей, полученные с помощью аутофлуоресценции и флуоресцентной ангиографии, регистрировали, используя 488 нм. Для возбуждения и внутренней стандартной эмиссии использовали фильтр с ограниченной полосой пропускания с краем барьера (величина 50% пропускания) при 498 нм. Мышей подвергали анестезии (0,75 мл кетамина, 0,5 мл домитора, 0,75 мл стерильной воды в дозе по 0,2 мл/100 г, в/б, при необходимости с добавками), и их зрачки расширяли, вводя местно 1%-ный тропикамид и 2,5%-ный гидрохлорид фенилэфрина за 10-15 мин до получения изображения. Перед каждой последовательной серией получения изображения на глаз наносили капли гидроксипропилметилцеллюлозы (0,3%-ной) для предотвращения высыхания. Изображения сетчатки с высоким разрешением и высокой контрастностью получали in vivo с помощью конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа (Heidelberg Retina Angiograph, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany), используя модификацию описанных методов (Guo L., Salt Т.Е., Maass A., Luong V., Moss S.E., Fitzke F.W., Cordeiro M.F.(2006) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47: 626-633). Кратко, диаметр точечного отверстия уменьшали до 100 мкм для улучшения аксиального разрешения и увеличивали мощность лазера для улучшения отношения сигнала к шуму. Было измерено, что мощность в области зрачка мыши составляла 1400 Вт при 488 нм. Мышам подбирали специально разработанные плоско-вогнутые контактные линзы, и подвод оптической энергии обеспечивали, используя 50-кратные линзы со сверхбольшим рабочим расстоянием, что улучшало оптическое разрешение и позволяло осуществлять детекцию структур микрокапилляров до 3 мкм в диаметре. Томографические слои регистрировали при последовательном передвижении плоскости осевого сечения с интервалами 15 мкм, в направлении стекловидное телосклера и центрпериферия для визуализации сосудистой сети сетчатки насквозь от первичного (сосудистого) сплетения до внешнего(сосудистого) сплетения. Захват всех последовательных серий изображений осуществляли при 8,9 Гц в поле зрения 10 и оцифровывали в виде файлов изображений 8-бит, 768768 пикселей, получая в результате боковое разрешение изображения 1,2 мкм/пиксель. Измеренное осевое разрешение в глазу мыши составило 5-8 мкм. Различия между cfh-/- и соответствующими по возрасту контрольными животными в количестве подсетчаточных аутофлуоресцентных отложений на уровне RPE анализировали, применяя к данным изображениям непарный t-тест Стьюдента с использованием SPSS (Chicago, IL). Гистология и иммуногистохимия. Кратко, животных подвергали глубокой анестезии кетамином и дормитором и затем cfh-/- мышей в возрасте десяти недель (n = 6), 3 месяцев (n=3), 6 месяцев (n=3), 9 месяцев (n=3) и 1 года (n=6) обрызгивали 0,1 М PBS, затем 4%-ным параформальдегидом (в 0,1 М PBS; рН 7,2). Извлекали глаза и помещали в 4%-ный параформальдегид, после чего осуществляли криопротекцию в 30%-ном растворе сахарозы (в 0,1 М PBS буфере) и оставляли на 24 ч при 4 С. Хрусталики извлекали, надрезая роговицу, и глаза быстро замораживали в смеси ОСТ (optimal cutting temperature compound) (смесь для поддержания оптимальной температуры при приготовлении срезов) и делали срезы толщиной 10 мкм для иммуногистохимического анализа, подробности см. ниже. У некоторых животных отделяли нейронную сетчатку и сосудистую оболочку глаза и независимо закрепляли на плоской поверхности. Глазные срезы от cfh-/- мышей (n = 20) и соответствующих по возрасту контрольных мышей (n = 20) инкубировали с первичными антителами (Таблица 5), затем с соответствующими конъюгированными с флуоресцентной меткой вторичными антителами и DAPI для окрашивания ядер, подробности см. ниже. Иммуногистохимию проводили при комнатной температуре на криостатных срезах глаз толщиной 10 мкм, фиксированных в 4%-ном параформальдегиде. Срезы сетчатки блокировали в течение 1 ч в 5%ной нормальной ослиной сыворотке в 0,1 М забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS),рН 7,4 с 0,3% тритона Х-100 и инкубировали в течение ночи с первичными антителами, разбавленными 1%-ной нормальной ослиной сывороткой в 0,1 М PBS с 0,3% Тритона Х-100. Разведения каждого первичного антитела осуществляли, как описано ниже. После обработки первичными антителами проводили отмывку и, если необходимо, обработку конъюгированными с флуоресцентной меткой соответствующими вторичными антителами (Santa Cruz, Biotechnology, Inc., ослиные анти-мышиные антитела sc-2099),приготовленными в PBS с 0,3% Тритона и 2% нормальной сыворотки (разведение 1:100 в том же растворителе, что и для первичных антител), и срезы оставляли на 2 ч (FITC Santa Cruz, Biotechnology, Inc., ослиные антимышиные антитела sc-2099). Отрицательные контроли представляли собой как равноценное антитело неродственного изотипа, так и контроль с отсутствием первичного антитела. После этого окрашивали ядра, используя 0,5 мл 4',6-диамино-2-фенилиндола (1 мкл концентрированного раствора DAPI в 5 мл 0,1 М PBS; Sigma-Aldrich) в течение 1 мин. Далее срезы несколько раз промывали 0,1 М PBS с последующими четырьмя промывками в забуференном трисом физиологическом растворе (рН 7,4) и в конце заключали в стеклянные покровные стекла в VECTASHIELD (поддерживающая среда для измерения флуоресценции) (Vector Laboratories). Срезы рассматривали и изображения запечатлевали либо с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа (Leica SP2; Leitz) в режиме 8 бит/канал и 10241024 пикселей, либо с использованием эпифлуоресцентного микроскопа для наблюдения по методу светлого поля (OlympusBX50F4, Olympus, Japan), при этом данные собирали в виде 24-битных цветных изображений с разрешением 38403072 пикселей, используя цифровую камеру Nikon DXM1200 (Nikon.Tokyo, Japan). Имеющиеся в продаже первичные антитела. С 3 (конъюгированные с FITC антимышиные антитела козы, разведение 1:100; ICN Biomedicals) использовали для окрашивания срезов сетчатки в указанных разведениях. В этой работе использовали следующие антитела против бета-амилоида:(1) кроличьи поликлональные Ab (Covance SIG-39153), специфичные к бета-амилоиду грызунов,рекомендованные для использования в IHC в залитых парафином срезах в разведении 1/250;(2) мышиные моноклональные Ab (Calbiochem NE1002 (4G8, (IgG2b), распознающие как человеческий, так и мышиный бета-амилоид, рекомендованные для использования в IHC в залитых парафином срезах при разведении 1/100 - 1/1000 (необходима предварительная обработка муравьиной кислотой);(3) кроличьи поликлональные Ab (ab2539 от Abeam), распознающие как человеческий, так и мышиный бета-амилоид, рекомендованные для использования в IHC в залитых парафином срезах в разведении 1/100 (перед процедурой IHC-окрашивания необходимо опосредованное нагреванием восстановление антигена). Имеющиеся в продаже вторичные антитела. Таблица 5. Использованные в этой работе имеющиеся в продаже вторичные Ab Детекция друзоподобных отложений у cfh-/- мышей. В сетчатке старых cfh-/- мышей можно детектировать аутофлуоресцентные отложения. Первые флуоресцентные липидные друзоподобные отложения у cfh-/- мышей можно детектировать примерно в возрасте 14 недель, их присутствие увеличивается с возрастом, и они располагаются в субретинальном пространстве (апикальная сторона RPE). Эти отложения также присутствуют у мышей дикого типа, но в значительно меньшей степени. Например, изображения сетчатки 6-месячной cfh-/- мыши, полученные с помощью cSLO, демонстрируют наличие некоторого количества аутофлуоресцентных белых пятен на сером фоне, и их можно видеть in vitro в сетчатке, растянутой на поверхности для проведения IHC, при 10-кратном и 40-кратном увеличении, которые легко идентифицируются в виде аутофлуоресцентных отложений в зеленом (FITC) канале. Эмиссионные спектры аутофлуоресцентных отложений характеризуются большим разнообразием (данные не показаны). При изучении срезов сетчатки cfh-/- мышей с использованием IHC можно наблюдать, что аутофлуоресцентные друзоподобные отложения ассоциированы с сайтами отложения компонента С 3 комплемента в субретинальном пространстве на апикальной стороне клеток RPE. Это можно наблюдать у 12 месячных cfh-/- мышей (данные не показаны). Анализ глаз cfh -/- мышей с использованием имеющихся в продаже Ab против бета-амилоида. На имеющихся в продаже срезах фиксированных образцов головного мозга людей с болезнью Альцгеймера было подтверждено положительное окрашивание на А (ab4582 от Abeam), когда их использовали для проверки перекрестной реактивности трех имеющихся в продаже Ab против бета-амилоида,показанных в табл. 6. Для этого использовали следующую методику. Для парафиновых срезов головного мозга: 1. ксилол -10 мин. 2. 100%-ный этанол - 8 мин. 3. 95%-ный этанол - 5 мин. 4. Дистиллированная вода - 5 мин. 5. Восстановление антигена:NE1002 (4G8) - 70%-ная муравьиная кислота; -SIG-39153. Для парафиновых и замороженных срезов: 6. промыть PBS, 3 раза по 5 мин каждый раз. 7. Блокировать 5%-ной нормальной ослиной сывороткой в течение 1 ч. 8. Быстро промыть PBS. 9. Применить первичное антитело в разведении:SIG-39153-1:250. Инкубировать в течение ночи. 10. Промыть PBS, 3 раза по 5 мин каждый раз. 11. Применить вторичное антитело в разведении: для Ab2539 - Ab sc-2090 1/100; для NE1002 - Ab sc-2099 1/100; для SIG-39153 - Ab sc-2090 1/100. Инкубировать в течение 1 ч. 12. Промыть PBS, 3 раза по 5 мин каждый раз. 13. DAPI в течение 1 мин. 14. Промыть PBS, 3 раза. 15. Промыть TBS, 4 раза по 5 мин каждый раз. 16. Закрепить, заключить под покровное стекло и герметично закрыть. Как и ожидалось, только для первичных антител, способных давать перекрестную реакцию с бетаамилоидом человека (NE1002 (4G8) и Ab2539), отмечали положительную детекцию бляшек бетаамилоида человека в тканях головного мозга людей с болезнью Альцгеймера (данные не показаны). Детекция бета-амилоида в глазах старых (в возрасте более 1 года) и 10-недельных CFH-/- мышей с использованием имеющихся в продаже Ab. Таблица 6. Использованные в этом исследовании первичные антитела против бета-амилоида Выполняли следующую методику. 1. Срезы высушить на воздухе в течение нескольких часов. 2. Промыть 3 раза. 3. Блокировать 5%-ной NDS в течение 1 ч. 4. Подготовить первичные антитела из табл.6 следующим образом:a) SIG39153-1:250; б) NE1002(4G8)-1:200; в)АЬ 2539-1:500. 5. Быстро промыть и инкубировать с первичными антителами в течение ночи. 6. Промыть 3 раза. 7. Подготовить следующие вторичные антитела: а) анти-кроличьи FITC; б) анти-мышиные FITC,инкубировать в течение 1 ч. 8. Промыть 3 раза. 9. Применить DAPI в течение 1 мин. 10. Промыть 3 раза PBS. 11. Промыть 4 раза TBS. 12. Закрепить, заключить под покровное стекло и герметично закрыть. Первоначально фиксированную ткань сетчатки глаза соответствующих по возрасту cfh-/- мышей и контрольных мышей дикого типа одного помета (C57BI/6) в возрасте 12-13 месяцев изучали, используя три имеющиеся в продаже первичные антитела (Ab) против бета-амилоида, описанные выше. Каждое первичное Ab детектировали, используя релевантное вторичное флуоресцентно меченное Ab. Для Ab SIG39153 не удалось детектировать никакого сигнала в любой ткани, несмотря на следование рекомендованному производителем протоколу(как и в образцах головного мозга, описанных выше) (данные не показаны). Тем не менее оказалось возможным специфически детектировать бета-амилоид в сетчатке старых cfh-/- мышей (но не мышей дикого типа одного помета) с использованием двух других имеющихся в продаже первичных антител против бета-амилоида. Пример таких результатов показан на фиг. 4, где на панели (А) показана ткань сетчатки старой мыши дикого типа, а на панели (В) показана ткань старой cfh-/- мыши, при этом обе проанализированы с использованием Ab2539 в качестве первичного Ab; а на панели (С) показана ткань сетчатки старой мыши дикого типа, и на панели (D) показана ткань старой cfh-/- мыши, при этом обе проанализированы с использованием NE1002 (4G8) в качестве первичного Ab. Эти данные демонстрируют, что отложения бета-амилоида образуются вокруг мембраны Бруха, в особенности у старых cfh-/-мышей. Положительный сигнал перекрестной реактивности антител в отношении отложений бета-амилоида на границе раздела RPE/мембрана Бруха можно наблюдать в виде интенсивной белой полосы, отмеченной белой стрелкой на фиг. 4 (В) и (D). Некоторые амилоидные отложения также можно наблюдать в области слоя нервных волокон и ганглиоцитов глаз cfh-/- мышей, например белую полосу, отмеченную белой стрелкой в верхней части фиг. 4 (В). В дальнейшем фиксированную ткань сетчатки глаза 10-недельных cfh-/-мышей и соответствующих по возрасту мышей дикого типа из одного помета (C57BI/6) исследовали, используя оба (NE1002 (4G8) иAb2539) первичных антитела против бета-амилоида. И вновь оказалось возможным специфически детектировать бета-амилоид в сетчатке cfh-/- мышей, но не мышей дикого типа из одного помета (данные не показаны). Эти данные демонстрируют, что отложение бета амилоида имеется в 10% случаев в сетчатке 10-недельных cfh-/- мышей (n = 3) (данные не показаны). Отложение локализуется главным образом на базальной стороне слоя ретинального пигментного эпителия (RPE) и, по-видимому, ассоциировано с базальными ламинарными отложениями (данные не показаны). Отметим, что отложение бета-амилоида в возрасте 10 недель аналогично по времени тому моменту, когда впервые у cfh-/- мыши появляются "друзоподобные" аутофлуоресцентные отложения и отложения компонента С 3 комплемента. Перекрестная реактивность 6F6 с бета-амилоидом в сетчатке глаз cfh-/- мышей. Первичные антитела, использованные в этом исследовании.(2) Контрольное моноклональное мышиное Ab изотипа IgG2a (реагент собственной разработки),специфичное к антигену цитозиндезаминазы.(3) Контрольное моноклональное мышиное Ab (ab18413, Abcam) изотипа IgG2a-каппа (MOPC-173) неизвестной специфичности, происходящее из клона миеломы Balb/c. Выполняли следующую методику. 1. Срезы высушить на воздухе в течение нескольких часов. 2. Промыть 1PBS 3 раза по 5 мин каждый раз. 3. Блокировать 5%-ной нормальной ослиной сывороткой в PBS с 0,3% Тритона Х-100, инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. 4. Подготовить первичное антитело, разбавив в 1%-ной нормальной ослиной сывороткой в PBS с 0,3% Тритона Х-100: а) мышиное моноклональное против бета-амилоида 6F6: 1) - 1:1000, 1:2000 и 1:4000,б) контрольное мышиное IgG2a: 2) 1:1000, 1:2000 и 1:4000. Быстро промыть. 5. Применить первичное антитело и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день. 1. Промыть 1PBS 3 раза по 5 мин каждый раз. 2. Подготовить вторичные антитела, разбавив 1%-ной нормальной ослиной сывороткой в PBS с 0,3% Тритона Х-100: а) козьи анти-мышиные с Alexa Fluor 488 (1:2000). Применить вторичное антитело и инкубировать в течение 1 ч при КТ. 3. Промыть 1PBS 3 раза по 5 мин каждый раз. 4. Применить DAPI 1:5000 в PBS и инкубировать в течение 1 мин в темноте. 5. Промыть 1PBS 3 раза по 5 мин каждый раз. 6. Промыть 1TBS 4 раза по 5 мин каждый раз. 7. Закрепить с помощью Vectashield, заключить под покровное стекло и герметично закрыть. Первоначально фиксированную ткань сетчатки глаза соответствующих по возрасту cfh-/- мышей и контрольных мышей дикого типа одного помета (C57BI/6) в возрасте 12-13 месяцев изучали, как изложено выше. Несмотря на то, что имелась перекрестная реактивность 6F6 по отношению к той же области сетчатки, которую детектировали имеющимися в продаже Ab против бета-амилоида, имелась схожая перекрестная реактивность с контрольным антителом, хотя в некоторой степени это может быть обусловлено фоновой перекрестной реактивностью только вторичного Ab. Некоторое фоновое окрашивание также можно было наблюдать в образцах дикого типа. Чтобы разрешить описанное выше фоновое окрашивание, эксперимент повторяли, но для вторичного антитела заменяли меченное Alexa Fluor 488 анти-мышинное Ab (IgG) на меченную FITC молекулу. Кроме этого, первичное контрольное антитело заменяли на имеющееся в продаже контрольное антитело изотипа, указанного в (3). Для этого эксперимента использовали следующую методику. Срезы высушить на воздухе в течение нескольких часов. Промыть 1PBS 1 раз в течение 5 мин. Блокировать 5%-ной нормальной ослиной сывороткой в PBS 0,3% Тритона Х-100, инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Подготовить первичное антитело, разбавив 1%-ной нормальной ослиной сывороткой в PBS 0,3% Тритона Х-100: а) мышиное IgG2a-каппа Ab18413 (1:100). Быстро промыть. Применить первичное антитело и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день. Промыть 1PBS 3 раза по 5 мин каждый раз. Подготовить вторичные антитела, разбавив в 1 %-ной нормальной ослиной сыворотке в PBS с 0,3% Тритона Х-100. б) ослиные анти-мышиные с FITC (1:300). Применить вторичное антитело и инкубировать в течение 1 ч при КТ. Промыть 1PBS 3 раза по 5 мин каждый раз. Применить DAPI (1:5000) в PBS и инкубировать в течение 1 мин в темноте. Промыть 1PBS 3 раза по 5 мин каждый раз. Промыть 1TBS 4 раза по 5 мин каждый раз. Закрепить с помощью Vectashield, заключить под покровное стекло и герметично закрыть. Пример данных, полученных с применением изложенной выше методики окрашивания, показан на фиг. 5. На панели (А) показаны данные, полученные с использованием 6F6 в качестве первичного антитела в разведении 1:4000 для окрашивания секции сетчатки старой cfh-/- мыши, на панели (В) показаны данные,полученные с использованием контрольного изотипа (3) в качестве первичного антитела (в таком же разведении (мас./об.), как и 6F6) для окрашивания секции сетчатки старой cfh-/- мыши (имеющийся в продаже меченный cfh-/- отрицательный контроль), на панели (С) показаны данные, полученные с использованием 6F6 в качестве первичного антитела в разведении 1:4000 для окрашивания секции сетчатки мыши дикого типа соответствующего возраста, взятой в качестве контроля, на панели (D) показаны данные, полученные с использованием контрольного изотипа (2) (меченый cfh-/-отрицательный контроль) в качестве первичного антитела в разведении 1:4000 для окрашивания секции сетчатки старой cfh-/- мыши. Эти данные подтверждают, что 6F6 способно специфически детектировать отложение бетаамилоида в сетчатке cfh-/- мышей (фиг. 5 А), которого нет у соответствующих по возрасту мышей дикого типа (фиг. 5 С). Специфичность 6F6 была подтверждена полным отсутствием окрашивания с использованием имеющихся в продаже контрольных изотипов в качестве первичных антител в разведениях(мас./об.), аналогичных разведению 6F6, (фиг. 5 В). Данные, полученные с использованием другого антитела собственной разработки с контрольным изотипом (2) в разведении 1:4000, (фиг. 5D) подтверждают специфическое окрашивание сетчатки у cfh-/- мышей. Однако это может быть объяснено специфичностью такого изотипически сходного антитела, поскольку цитозиндезаминаза является маркером клеточного распада, который может иметь место в сетчатке старых cfh-/- мышей. Оглядываясь назад, можно сказать, что это был неудачный выбор для изотип-специфического контрольного Ab в этом эксперименте. Динамика перекрестной реактивности амилоида в сетчатке глаз cfh-/- мышей к 6F6 и 4G8. Мышей C57BI/6 (дикий тип) и соответствующих по возрасту cfh-/- мышей аналогичным образом анализировали посредством иммуногистохимии в промежуточные временные точки между 10 неделями и 12 месяцами: в возрасте 3 месяцев (n = 3), 6 месяцев (n = 3) и 9 месяцев (n = 3). Анализ осуществляли,используя либо 6F6, либо NE1002 (4G8) (Calbiochem) в качестве первичного детектирующего антитела. В возрасте трех месяцев можно было наблюдать небольшое различие между мышами дикого типа и cfh-/мышами в уровне общего роста. Однако для возраста шести месяцев можно было отчетливо детектировать амилоидное отложение вокруг границы раздела мембраны Бруха и клеток ретинального пигментного эпителия (RPE) у cfh-/- мышей, но не у соответствующих по возрасту контрольных мышей дикого типа(данные не показаны). Для момента времени шести месяцев окрашивание с использованием 4G8 выглядело покрывающим всю границу раздела между RPE и ВМ, в то время как аналогичное окрашивание с использованием 6F6 в качестве первичного антитела было более прерывистым (данные не показаны). Для момента времени, соответствующего возрасту шести месяцев, было показано четкое различие в уровне амилоидного отложения, зафиксированного посредством IHC, в сетчатке cfh-/- мышей по сравнению с соответствующими по возрасту контрольными мышами дикого типа. Суммируя, можно сказать, что cfh-/- мыши представляют собой модель быстрого развития амилоидоза глаза, особенно сетчатки, и это может быть тесно связано с фенотипом модели "сухой" AMD. Такие мыши будут представлять хорошую модель для анализа влияния терапевтических Ab против бетаамилоида, таких как 6F6, на бета-амилоид в сетчатке. Демонстрация способности 6F6 препятствовать связыванию бета-амилоида с фактором комплемента I. В недавно опубликованных данных показано, что непосредственное взаимодействие между бетаамилоидом-бета и фактором комплемента I (CFI), "партнером" и кофактором для фактора комплемента Н(CFH) (Wang J. и др., 2008) может помочь в объяснении быстрого появления отложения бета-амилоида в сетчатке cfh-/- мышей. В отсуствие CFH бета-амилоид может свободно связываться с любым "не имеющим партнера" CFI в сетчатке мыши (Wang J. и др., 2008; неопубликованные данные). Для демонстрации того, что терапевтическое антитело против бета-амилоида 6F6 или эквивалентное ему гуманизированное антитело может препятствовать взаимодействию между бета-амилоидом и CFI посредством связывания с бета-амилоидом, можно провести серии экспериментов, аналогичных описанным Wang J. и др. (2008). Влияние предварительной инкубации 6F6 с имеющимися в продаже препаратами белка бета-амилоида(например, от Peptide Institute) на его способность связываться с имеющимся в продаже белком CFI(Quidel Corporation) в присутствии и в отсутствие имеющегося в продаже белка CFH (Quidel Corporation) может быть определено, как описано (Wang, J. и др., 2008, с. 716-717), и проанализировано или с использованием стандартной коиммунопреципитации, и/или анализа с примененим BiaCore. Аналогично, способность антитела 6F6 разрушать сформированный ранее комплекс бета-амилоид:CPI в присутствии и в отсутствие CFH может быть установлена с использованием коиммунопреципитации и/или анализа с примененим BiaCore. Аналогично, влияние предварительной инкубации 6F6 с имеющимися в продаже препаратами белка бета-амилоида (например, от Peptide Institute) на его способность влиять на функцию имеющегося в продаже белка CFI (Quidel Corporation) в присутствии имеющегося в продаже белка CFH(Quidel Corporation) можно измерить, используя анализ расщепления с применением компонента С 3b комплемента (Quidel Corporation), как описано (Wang, J. и др., 2008, с. 717), и проанализировать посредством стандартного SDS-PAGE. Аналогично, способность антитела 6F6 разрушать сформированный ранее комплекс бета-амилоид:CFI в присутствии CFH и поэтому восстанавливать "расщепляющую" функцию С 3b в отношении комплекса CFI/CFH, можно установить, как уже описано (Wang, J. и др., 2008, с. 717), и проанализировать посредством стандартного SDS-PAGE. Результаты недавно опубликованного исследования in vitro подтвердили гипотезу, согласно которой бета-амилоид активирует систему комплемента внутри друз, блокируя функцию фактора комплемента I, что приводит к слабо выраженному хроническому воспалению в субретинальных тканях; таким образом, воедино связываются четыре фактора из факторов, ассоциированных с развитием AMD: воспаление, активация комплемента, отложение амилоида-бета и друзы (Wang J. и др., 2008). Такое прямое доказательство влияния бета-амилоида на активацию альтернативного пути комплемента в результате возможного конкурирования с фактором комплемента Н за связывание с фактором комплемента I ранее не было документально подтверждено (Wang J. и др., 2008). Вмешательство в негативное влияние бетаамилоида на клиренс компонентов СЗ системы активации комплемента посредством терапевтического введения антител, таких как 6F6, может составить новый механизм действия для остановки или реверсирования AMD. Детекция отложения бета-амилоида в глазах пожилых людей с использованием окрашивания тиофлавином Т и перекрестной реактивности 6F6. Образцы донорской ткани глаз человека получали из банка роговичных трансплантатов Мурфилдса офтальмологической больницы Мурфилдса в Лондоне, Великобритания (Moorfields Eye Bank, MoorfieldsEye Hospital, London, UK). Первым полученным образцом был образец от 65-летнего мужчины европеоидной расы (банк роговичных трансплантатов Мурфилдса офтальмологической больницы Мурфилдса в Лондоне, Великобритания). Глаза фиксировали и обрабатывали, как описано ранее, и срезы окрашивали тиофлавином Т (Sigma T3516), используя описанный ранее протокол (Anderson et al, Exp. Eye Res. (2004),78: 243-256; Levine H., Methods in Enzymology (1999), 309: 274-284). Данные, полученные с помощью окрашивания тиофлавином Т глазной ткани, показали наличие флуоресцентного сигнала тиофлавина Т,связанного с бета-амилоидом, который можно было наблюдать в виде дымчатого белого окрашивания вокруг базальных ламинарных отложений и друз в области границы раздела RPE и мембраны Бруха в глазной ткани внешней сетчатки человека. Следующие далее образцы глазной ткани донора человека получали из банка роговичных трансплантатов Мурфилдса офтальмологической больницы Мурфилдса в Лондоне, Великобритания, включая образцы от мужчины в возрасте 41 года и мужчины в возрасте 90 лет. Эти глаза опять фиксировали и обрабатывали, как описано ранее, но в этом случае срезы подвергали окрашиванию с помощью 6F6 в качестве первичного антитела и визуализировали с использованием конъюгированного с FITC вторичного антитела против IgG мыши, как описано ранее. Несмотря на то что образец глаз 90-летнего мужчины потерял во время обработки большую часть сетчатки, перекрестную реактивность 6F6 к амилоиду можно было детектировать во внешних сегментах оставшейся ткани. Это окрашивание отсутствовало как во внешних сегментах, так и в сетчатке глаза мужчины в возрасте 41 года. Людям, донорам глазной ткани,формально не был поставлен диагноз AMD, но наличие тяжелых базальных ламинарных отложений и также их ассоциация с бета-амилоидом является строгим подтверждением этиологии ранней сухой AMD в глазной ткани, окрашенной тиофлавином Т, у 65-летнего мужчины. Несмотря на то что в образце глаза 90-летнего мужчины обработка ткани приводила к потере большей части сетчатки, тот факт, что перекрестную реактивность 6F6 к амилоиду можно детектировать в оставшейся ткани, а не во внешних сегментах и не в сетчатке глаза мужчины в возрасте 41 года (представляется слишком молодым, чтобы иметь симптомы AMD), сулит хорошие возможности использования антител, подобных 6F6, в связывании с амилоидом, обнаруженным в глазах старых людей. Клонирование вариабельных областей антител гибридом. Последовательности вариабельных областей. Общую РНК экстрагировали из всех гибридомных клеточных линий и затем последовательности кДНК вариабельных областей тяжелых и легких доменов получали, используя обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (RT-PCR). Прямой праймер для RT-PCR представлял собой смесь вырожденных праймеров, специфичных для лидерных последовательностей генов иммуноглобулинов мыши, а обратный праймер был специфичным к константным областям антител, как например, для тяжелой цепи изотипа IgG2a 6F6 мыши и легкой цепи-каппа антитела мыши. Праймеры конструировали в соответствии со стратегией, описанной Jones и Bendig (Bio/Technology 9: 88, 1991). RT-PCR проводили в двух повторах для обеих последовательностей V-области с целью обеспечения последующей проверки корректных последовательностей V-области. Продукты V-области, созданные с помощью RT-PCR, клонировали (набор для клонирования от Invitrogen ТА) и получали данные о последовательностях. Аминокислотная последовательность VH 6F6 (SEQ ID NO: 19)