Гуманизированное антитело к pcrv, обладающее активностью против псевдомонас

ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К PCRV, ОБЛАДАЮЩЕЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНАС Предложено гуманизированное моноклональное антитело против PcrV или часть указанного антитела и фармацевтическая композиция, которая их содержит в качестве активного ингредиента,в качестве эффективного средства лечения инфекции, в частности инфекции, вызываемойPseudomonas aeruginosa. В частности, гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению обладает исключительной активностью ингибирования цитотоксичности в отношении клеток, являющихся мишенями для Pseudomonas aeruginosa. Также указанное гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению обладает высоким сродством к PcrV. Область техники Изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу, которое распознат PcrV или части указанного антитела. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителу, обладающему более высокой нейтрализующей активностью (далее, также обозначается как активность ингибирования цитотоксичности), чем известные антитела против PcrV или их части, и к фармацевтической композиции, содержащей указанное антитело или его часть. Уровень техникиPseudomonas aerugenosa представляет собой облигатно-аэробные грамотрицательные бациллы, широко распространенные в природе. Хотя обычно ее патогенность низка, она представляет собой патоген,который вызывает оппортунистические инфекции, часто возникающие у пациентов, страдающих разными первичными заболеваниями, такими как рак или диабет, и у пациентов, которым вводят лекарственные препараты, угнетающие иммунитет, и часто может вызывать пневмонию, инфекцию мочевыводящих путей, сепсис, или подобные состояния, приводящие к тяжелым последствиям. В клинической области инфекцию Pseudomonas aerugenosa рассматривают как одну из самых трудноизлечимых инфекций, поскольку Pseudomonas aerugenosa не только обладает исходно низкой чувствительностью к существующим антибиотикам, но также демонстрирует выраженную тенденцию к легкому приобретению устойчивости к разным антибиотикам, что делает е трудноизлечимой. Таким образом, поскольку возможности последовательной разработки новых антибиотиков против Pseudomonas aerugenosa ограничены, существует ясная необходимость в способе лечения, который не был бы основан на антибиотиках. Pseudomonasaerugenosa проявляет высокую цитотоксичность вследствие введения токсина в клетки эукариот при участии системы секреции экзотоксина III типа. PcrV представляет собой белок, состоящий из 294 остатков( доступа NCBI ААС 45935, SEQ ID : 1), образующих систему секреции экзотоксина III типа, а последовательность оперона, кодирующая его, доступна для ознакомления (патентный документ 1, непатентный документ 1). Поскольку контроль PcrV потенциально может привести к созданию терапевтических средств для борьбы с инфекцией, вызванной Pseudomonas aerugenosa (непатентный документ 2),есть сообщения о поликлональных антителах (непатентные документы 3, 4) и моноклональных антителах (патентный документ 2, непатентные документы 5, 6) против PcrV, обладающих нейтрализующей активностью. Однако поликлональные антитела трудно гуманизировать и применять в качестве фармацевтических композиций из-за трудностей с улучшением их антигенных свойств. Также моноклональные антитела, о которых сообщалось до настоящего времени, обладают низкой нейтрализующей активностью и не могут удовлетворять требованиям, предъявляемым в клинических областях. Патентный документ 1: патент США 655179510. Патентный документ 2: перевод на японский язык публикации РСТ 2005-500250. Непатентный документ 1: Yahr, T.L. et al., J. Bacteriol., 1997, vol. 179, p. 7165. Непатентный документ 2: Т. Sawa et al., Nature Medicine, 1999, vol. 5, p. 392. Непатентный документ 3: Shime N et al., J. Immunol. 2001, vol. 167, p. 5880 15. Непатентный документ 4: Imamura Y et al., Eur. Respir. J., 2007, vol. 29, p. 965. Непатентный документ 5: Karine Faure et al., J. Immune. Based. Therapies and Vaccines, 2003, vol. 1. Непатентный документ 6: Dara W. Frank et al., J. Infect. Disease, 2002, vol. 186, p. 64. Краткое описание изобретения Проблема, которую должно решить изобретение Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить средство, которое эффективно при лечении инфекции, в частности, инфекции, вызванной Pseudomonas aerugenosa. Способы решения проблемы В результате настойчивых попыток получить моноклональные антитела против PcrV авторы настоящего изобретения достигли успеха в получении нового гуманизированного моноклонального антитела, которое, как предполагают, обладает более выраженным терапевтическим действием на заболевание, чем традиционно известные моноклональные антитела против PcrV, и создали настоящее изобретение. В частности, настоящее изобретение относится к:(1) гуманизированному моноклональному антителу против PcrV или части указанного антитела, которое обладает по меньшей мере одним свойством, выбранным из (А)-(D):(B) в концентрации от 1 до 50 нМ ингибирует 50% или более цитотоксичности, проявляемой Pseudomonas aerugenosa в отношении клеток миеломы in vitro;(C) имеет константу диссоциации (KD) с PcrV, равную 210-9 (М) или менее, и(2) гуманизированному моноклональному антителу или части указанного антитела, которое имеет последовательность аминокислот, в которой гипервариабельный участок (CDR) соответствует участку моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, депонированной с номером доступа FERM АВР-11805;(3) гуманизированному моноклональному антителу против PcrV или части указанного антитела, которое имеет: 1) следующую последовательность аминокислот в гипервариабельном участке, вариабельной области тяжелой цепи: SFTSYWMH (SEQ ID : 15), INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID : 16), YGNYWYYTMDY (SEQ ID : 17) и 2) следующую последовательность аминокислот в гипервариабельном участке, вариабельной области легкой цепи: SASTSVSYME (SEQ ID : 18), TTSKLAS (SEQ ID : 19), HQWRNYPFT (SEQ ID(4) гуманизированному моноклональному антителу против PcrV или части указанного антитела, которое имеет: 1) следующую последовательность аминокислот в гипервариабельном участке, вариабельной области тяжелой цепи: SFTSYWMH (SEQ ID : 15), INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID : 16), YGNYWYYTMDY (SEQ ID : 17) или по меньшей мере в одном CDR из набора из трех CDR, вариабельной области тяжелой цепи, присутствует замена, вставка или делеция одной или нескольких аминокислот и 2) следующую последовательность аминокислот в гипервариабельном участке, вариабельной области легкой цепи: SASTSVSYME (SEQ ID : 18), TTSKLAS (SEQ ID : 19), HQWRNYPFT (SEQ ID: 20) или по меньшей мере в одном CDR из набора из трех CDR, вариабельной области легкой цепи присутствует замена, вставка или делеция одной или нескольких аминокислот и обладает по меньшей мере одним свойством, выбранным из (А)-(D):Pseudomonas aerugenosa в отношении клеток миеломы in vitro;(C) имеет константу диссоциации (KD) с PcrV, равную 210-9 (М) или менее, и(5) гуманизированному моноклональному антителу против PcrV или части указанного антитела, которое имеет 1) вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID : 27, и 2) вариабельную область легкой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID : 28;(6) фармацевтической композиции, которая содержит указанное антитело или часть указанного антитела по любому из (1)-(5), в качестве активного ингредиента;(7) полинуклеотиду, кодирующему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела по любому из (1)-(5).(9) способу лечения инфекционного заболевания, вызываемого Pseudomonas aerugenosa, включающему введение эффективного количества моноклонального антитела или части указанного антитела в соответствии с любым из (1)-(5);(10) применению моноклонального антитела или части указанного антитела согласно любому из пп.(1)-(5) при производстве лекарственного препарата для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых Pseudomonas aerugenosa, и(11) фармацевтической композиции, содержащей антитело согласно любому из (1)-(5), для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых Pseudomonas aerugenosa. Результат настоящего изобретения Гуманизированное моноклональное антитело или часть указанного антитела в соответствии с настоящим изобретением можно применять в качестве агента для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, вызываемых Pseudomonas aerugenosa, благодаря его исключительно высокой нейтрализующей активности в отношении PcrV. Краткое описание рисунков На фиг. 1 представлены кривые, на которых меченный биотином PcrV заменяют немеченным PcrV в антителах к PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166). На фиг. 2 предсгавлено сродство антител против PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166), определенное способом поверхностного плазменного резонанса. На фиг. 3 представлены результаты сэндвич-анализа для антител против PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 иMab166) и Mab166. На фиг. 4 показано ингибирующее действие антител против PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166) на цитотоксичность, проявляемую штаммом SR24 Pseudomonas aeruginosa в отношении клеток U937. На фиг. 5 показано ингибирующее действие антител против PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166) на цитотоксичность, проявляемую штаммом SR24 Pseudomonas aeruginosa в отношении клеток миеломыP3U1. На фиг. 6 представлены кривые, на которых меченный биотином PcrV, заменяют немеченным полноразмерным PcrV и процессированным PcrV в антителах к PcrV (1F3, 2 А 4, 9D12,12 Н 9 и Mab166). На фиг. 7 показана реакционная способность в отношении полноразмерного PcrV и процессированного PcrV в антителах к PcrV (1F3, 2 А 4, 9D12, 12 Н 9 и Mab166) при вестерн-блоттинге. На фиг. 8 показана корреляция между антителом и полноразмерным PcrV в отношении подавления активности ингибирования цитотоксичности. На фиг. 9 показана корреляция между антителом и процессированным PcrV в отношении подавления активности ингибирования цитотоксичности. На фиг. 10 показана последовательность аминокислот вариабельной области антитела 1F3. Подчеркивание указывает участок CDR. На фиг. 11 показана последовательность аминокислот вариабельной области антитела 2 А 4. Подчеркивание указывает участок CDR. На фиг. 12 показана ориентация последовательности аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела мыши (1F3 мышь), эталонного гуманизированного антитела (эталон), мутантного гуманизированного антитела (обратная мутация) и гуманизированного антитела (1F3 гуманизированное). На фиг. 13 показано сродство между антигеном PcrV и каждой из комбинаций тяжелой цепи химерного антитела мыши-человека (Н-химера), его легкой цепи (L-химера), тяжелой цепи эталонного гуманизированного антитела (НТ), его легкой цепи (LT), тяжелой цепи мутантного гуманизированного антитела (НВ) и его легкой цепи (LB). На фиг. 14 показано сродство антитела, включая каждую из комбинаций тяжелой цепи химерного антитела мыши-человека (Н-химера), легкой цепи химерного антитела мыши-человека (L-химера), мутантных вариантов тяжелой цепи мутантного гуманизированного антитела (I48M, A67V, L69M, V71R, A78V, V93A и L94R) и легкой цепи эталонного гуманизированного антитела (LT) к антигену PcrV. На фиг. 15 показана последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела. Подчеркивание показывает участок CDR. На фиг. 16 показана последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела. Подчеркивание показывает участок CDR. На фиг. 17 показано сродство между антигеном PcrV и каждой из комбинаций тяжелой цепи химерного антитела мыши-человека (Н-химера), его легкой цепи (L-химера), тяжелой цепи гуманизированного антитела (h1F3 Н) и его легкой цепи (h1F3 L). На фиг. 18 показано ингибирующее действие антител против PcrV (гуманизированное антитело кPcrV, антитело мыши к PcrV и Mab166) на цитотоксичность, проявляемую штаммом Pseudomonas aeruginosa SR24 в отношении клеток U937. На фиг. 19 показано ингибирующее действие антител против PcrV (гуманизированное антитело кPcrV, антитело мыши к PcrV и Mab166) на цитотоксичность, проявляемую штаммом Pseudomonas aeruginosa SR24 в отношении клеток миеломы. Способ осуществления изобретения Моноклональное антитело, которое является предметом настоящего изобретения, представляет собой моноклональное антитело, которое специфически связывается с упоминаемым выше белком PcrV. Более конкретно, указанное моноклональное антитело против PcrV, которое обладает по крайней мере одним из свойств, выбранным из группы, включающей: (1) в концентрации от 1 нМ до 200 нМ ингибирование 50% или более цитотоксичности, проявляемой Pseudomonas aerugenosa в отношении лейкоцитовin vitro; (2) в концентрации от 1 нМ до 50 нМ ингибирование 50% или более цитотоксичности, проявляемой Pseudomonas aerugenosa в отношении клеток миеломы in vitro; (3) константу диссоциации (KD) сPcrV, равную 210-9 (М) или менее; и (4) направленность на эпитоп, расположенный в положениях 136233 в последовательности аминокислот, SEQ ID :1; Одно из свойств моноклонального антитела согласно настоящему изобретению - это высокая активность в отношении ингибирования цитотоксичности. Например, когда применяют лейкоциты, указанное моноклональное антитело имеет такую активность ингибирования (нейтрализации), которая приводит к ингибированию 50% или более цитотоксичности, вызываемой Pseudomonas aeruginosa, при концентрации антитела в диапазоне от 1 до 200 нм, предпочтительно от 2 до 100 нм и еще более предпочтительно - от 5 до 25 нм. Когда применяют клетки миеломы, указанное моноклональное антитело имеет такую активность ингибирования (нейтрализации), которая приводит к ингибированию 50% или более цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa, при концентрации антитела в диапазоне от 1 до 50 нм, предпочтительно от 2 до 30 нм и еще более предпочтительно - от 4 до 20 нм. Данные значения намного превышают значения активности, которые приводятся для Mab166 в данных W. Frank el al. (J. Infect. Disease,2002, vol. 186, p. 64). Еще одно свойство моноклонального антитела согласно настоящему изобретению это его направленность на эпитоп, расположенный в участке с положениями с 136 по 223 в полноразмерной последовательности аминокислот PcrV (SEQ : 1). Авторы настоящего изобретения показали, что антитело, которое распознает данный участок, обладает более высокой активностью (активностью ингибирования цитотоксичности), чем антитело, которое распознает другой участок. Антитело, которое распознает данный участок, можно применять при лечении инфекционных заболеваний, поскольку оно об-3 021101 ладает высокой активностью ингибирования цитотоксичности. Эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом можно идентифицировать следующим образом. Сперва, получают несколько разных частичных структур молекулы, которую должно распознавать указанное моноклональное антитело. Для получения частичных структур известны способ получения разных частичных белков для молекулы с известным способом синтеза олигопептидов, способ получения их в клетке хозяина, такой как Е. coli, или вне ее, путем встраивания в пригодную экспрессионную плазмиду последовательности ДНК, кодирующей целевой частичный пептид, при помощи способа рекомбинации генов или подобного известного способа, однако для вышеупомянутой цели обычно применяют сочетание указанных способов. Например, после приготовления серий полипептидов, которые получают путем укорочения белка антигена с С-конца или N-конца на определенную длину при помощи способа рекомбинации генов, хорошо известного специалистам в этой области техники, оценивают реактивность моноклонального антитела в отношении данных полипептидов и приблизительно определяют сайт распознавания. После этого, разные полипептиды соответствующей части, мутанты пептидов или подобные молекулы синтезируют более точно посредством способа синтеза олигопептидов, хорошо известного специалистам в этой области техники, и проводят определение эпитопа путем оценки способности к связыванию моноклонального антитела, которое включает агент для профилактики или лечения согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, с указанными пептидами, или путем оценки конкурентной ингибирующей активности указанных пептидов в отношении связывания моноклонального антитела с антигеном. В качестве подходящего способа получения разных олигопептидов можно также применять коммерческий набор (например, набор SPOTs (поставляемый компанией "Genosys Biotechnologies, Inc."), или серии наборов для многоканального/пептидного синтеза со способом многоканального синтеза (поставляется компанией "Chiron Corporation"). Активность ингибирования цитотоксичности можно измерить следующим образом. Сперва, моноклональное антитело, для которого измеряют активность ингибирования цитотоксичности, разводят в соответствующих концентрациях путем серии 2-кратных разведений. Затем клетки, которые подвергают действию токсина Pseudomonas aeruginosa или подобного (в дальнейшем именуются как клеткимишени), разводят, например, при помощи питательной среды для культур клеток, чтобы получить требуемое количество. В частности, предпочтительно получить концентрацию 3106-5106 клеток/мл, когда применяют клетки миеломы, и получить концентрацию 1106-3106 клеток/мл, когда применяют лейкоциты. Аналогично, клетки Pseudomonas aeruginosa также получают в концентрации 1107-5108 KOE/мл,например, при помощи питательной среды. В присутствии моноклонального антитела клетки Pseudomonas aeruginosa культивируют в той же пробирке или лунке (например, условия in vitro, такие как лунка на микропланшете) при подходящих условиях культивирования. На этом этапе условия культивирования могут соответствовать обычно применяемым условиям, которые считают приемлемыми для роста клеток и бактерий. Что касается периода культивирования, оптимальные условия изменяют должным образом в зависимости от типа клеток-мишеней и, например, в случае применения клеток миеломы предпочтительный период культивирования составляет приблизительно 1-3 ч, в случае применения лейкоцитов также 1-3 ч. Концентрацию, при которой наблюдается 50% ингибирования по сравнению с контрольной группой (эффективная концентрация), рассчитывают относительно лунки, в которую не добавляли антитела (контрольная группа). Для решения вопроса о том, живы или мертвы клетки-мишени, хотя и были разработаны разные процедуры, применяют, например, измерение поглощения на определенной длине волны (например, 400-500 нм) после добавления красителя (для справки см. Nature Medicine 1999, vol.5,p. 392-395). Одним из свойств моноклонального антитела согласно настоящему изобретению является высокое сродство к PcrV. Константу диссоциации, которую применяют в качестве показателя сродства антитела для моноклонального антитела, можно измерить разными способами. Например, можно с легкостью провести анализ по способу Скатчарда с применением антигена, меченного разными веществами для мечения, или посредством применения коммерческого набора для измерения Biacore X (поставляемый компанией "Amersham Pharmacia") или аналогичного набора в соответствии с инструкциями по применению и протоколом экспериментов, прилагаемыми к набору. Оценку активности связывания можно проводить в соответствии с способом ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), ИФА (иммуноферментный анализ), РИА (радиоиммунный анализ) или анализа флуоресценции антител. Константу диссоциации (значение KD), определяемую при помощи такого способа, выражают в единицах М (моль). Чем ниже константа диссоциации тестируемого моноклонального антитела, тем более высоким сродством обладает тестируемое антитело. Что касается моноклонального антитела согласно настоящему изобретению или части указанного антитела, константа диссоциации (KD) с PcrV составляет 210-9 (М) или меньше, а более предпочтительно 1,210-9 (М) или меньше. Моноклональное антитело, соответствующее настоящему изобретению, предпочтительно должно содержать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, включая гипервариабельный участокCDR1, который содержит следующую последовательность аминокислот SFTSYWMH (SEQ ID : 15);CDR2, который содержит следующую последовательность аминокислот INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID: 16); CDR3, который содержит следующую последовательность аминокислот YGNYWYYTMDY (SEQID : 17) и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, включая гипервариабельный участокCDR1, который содержит следующую последовательность аминокислот SASTSVSYME (SEQ ID : 18):CDR2, который содержит следующую последовательность аминокислот TTSKLAS (SEQ ID : 19);CDR3, который содержит следующую последовательность аминокислот HQWRNYPFT (SEQ ID : 20). Что касается последовательности участка CDR, настоящее изобретение включает также модифицированный участок с добавлением, вставкой, заменой или делецией одной или нескольких аминокислот по меньшей мере в одном CDR из трех вышеперечисленных CDR, при условии, что биологическая активность (например, сродство, ингибирование цитотоксичности или подобное), требующаяся в соответствии с настоящем изобретением, будет сохранена. В качестве предпочтительного аспекта настоящего изобретения можно назвать гуманизированную версию моноклонального антитела, обладающего требуемыми свойствами. Гуманизированное моноклональное антитело получают посредством трансплантации гипервариабельного участка (CDR) антитела млекопитающего, отличного от человека, например, мыши, на CDR антитела человека. Следовательно,каркасный участок (FR) получают из антитела человека. Подходящий каркасный участок (TR) можно выбрать в соответствии с документами Kabat Е.A. et al. FR можно выбирать таким образом, чтобы CDR мог образовать соответствующий антиген-связывающий сайт. При необходимости аминокислоту в FR вариабельной области можно заменить таким образом, чтобы CDR преобразованного гуманизированного антитела мог образовать соответствующий аниген-связывающий сайт (Sato.K. et al., Cancer Res. 1993, vol. 53. p. 851). В указанном случае описываемые выше этапы можно повторить. Также известен общий способ получения гуманизированного моноклонального антитела (например,WO 95/14041 и WO 96/0257 и др.). В частности, последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область, созданную для соединения CDR антитела мыши с FR антитела человека, синтезируют посредством ПЦР (полимеразно-цепной реакции) из нескольких олигонуклеотидов, созданных так, чтобы они содержали перекрывающиеся участки на своих концах (см. WO 98/13388). Полученную ДНК соединяют с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, и образующуюся в результате ДНК встраивают в вектор экспрессии. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, можно вводить в вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую константную область антитела. Чтобы получить антитело, соответствующее настоящему изобретению, ген антитела можно ввести в вектор экспрессии, для экспрессии под контролем регуляторной области, например, энхансера/промотора. Затем, клетки хозяина трансформируют с применением указанного вектора экспрессии, и они, таким образом, могут вырабатывать антитело. В качестве клеток хозяина можно перечислить клетки позвоночных, такие как клетки COS или СНО, клетки прокариот или дрожжей. Для экспрессии гена антитела тяжелую цепь (Н-цепь) или легкую цепь (L-цепь) антитела можно по раздельности встраивать в векторы экспрессии, и клетку хозяина можно трансформировать указанными векторами экспрессии, или ДНК, кодирующую Н-цепь и L-цепь, можно встраивать в одиночный вектор экспрессии для трансформации клетки хозяина полученным в результате вектором экспрессии (см. WO 94/11523). Подходящие трансформанты, полученные посредством способов, описанных ранее, можно культивировать посредством способов, известных специалистам. Посредством указанного культивирования гуманизированное моноклональное антитело против PcrV получают в трансформантах или за пределами клеток. Среду для культивирования можно должным образом выбрать из традиционных сред в зависимости от клеток хозяина. Для описываемых выше клеток COS существуют такие среды как RPMI-1640,модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), и при необходимости можно добавлять ингредиенты сыворотки, такие как фетальная бычья сыворотка (FBS). Температуру для культивирования трансформантов не ограничивают, при условии, что не происходит серьезного снижения способности к выработке белка в клетке. Предпочтительной является температура 32-42 С. Более предпочтительна температура 37 С. При необходимости культивирование можно проводить в атмосфере, содержащей диоксид углерода 1-10% (о/о). Фракции, содержащие гуманизированное антитело против PcrV согласно настоящему изобретению,полученные в трансформантах или вне клеток при помощи способов, описанных ранее, можно очищать при помощи известных способов разделения. Указанные способы основаны на физических свойствах или химических свойствах целевого белка. В частности, можно применять, например, обработку веществом,осаждающим белки, хроматографию, такую как ультрафильтрация, размерно-эксклюзионная хроматография, хроматография с абсорбционной фильтрацией, ионообменная хроматография, аффинная хроматография или высокоэффективная жидкостная хроматография, диализ и их сочетания. В соответствии с ранее описанными способами желательное гуманизированное моноклональное антитело против PcrV можно с легкостью получить с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Последовательности аминокислот вариабельной области оптимизированных антител приведены под номерами SEQ ID:27 на фиг. 15 и SEQ ID: 28 на фиг. 16. Указанные антитела были сконструированы путем прививки к антителу человека полных аминокислотных последовательностей CDR и частичных последовательностей FR, которые определены для гуманизации моноклонального антитела 1F3. По сравнению с антителом мыши (1F3), полученным с применением клеток гибридомы, указанное гуманизированное антитело (h1F3) обладает эквивалентной активностью ингибирования цитотоксичности. Хотя гуманизация антитела с сохранением активности исходного антитела обычно затруднена, авторам настоящего изобретения удалось получить гуманизированное антитело, обладающее активностью,эквивалентной активности исходного антитела мыши. Гуманизированное антитело можно применять в лечебных целях за счт более низкой антигенности такого антитела в организме человека. Что касается гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению - доступна константная область антитела человека. Что касается предпочтительной константной области антитела человека,для тяжелой цепи можно перечислить С и можно применять C1, С 2, С 3 и С 4, а для легкой цепи можно перечислить Ck и С. Дополнительно С-область антитела человека можно модифицировать в целях повышения стабильности антитела или его продуктивности. При гуманизации доступное антитело человека может принадлежать к любому изотипу, например, IgG, IgM, IgA, IgE или IgD. Что касается настоящего изобретения, предпочтительно IgG и еще более предпочтительно IgG1 и IgG4. Гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению может быть конъюгированным антителом, которое получают путем конъюгации с какой-либо молекулой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), радиоактивное вещество или токсин. Указанные конъюгированные моноклональные антитела получают путем химической модификации антитела. Способы модификации антител известны в данной области техники. Гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению включает в себя указанные конъюгированные моноклональные антитела. Гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению можно соединять с другими белками через сайт на N-конце или С-конце гуманизированного моноклонального антитела(Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281). Специалисты в данной области техники могут выбрать подходящие белки для присоединения. Гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению может быть таким антителом, у которого повышена активность ингибирования цитотоксичности. Указанные антитела включают, например, антитело с удаленной фукозой, антитело, конъюгированное с разветвляющим Nацетилглюкозамином через его углеводную цепь (GlcNAc), или антитело, у которого активность связывания с Fcy-рецептором изменена путем замены остатка аминокислоты в области Fc. Указанные антитела можно получить посредством способов, которые известны специалистам в данной области техники. В отношении настоящего изобретения фраза "часть моноклонального антитела" относится к области, которая является частью упомянутого выше антитела согласно настоящему изобретению и обладает способностью к специфическому связыванию с PcrV подобно указанному моноклональному антителу (в дальнейшем именуется просто "фрагмент антитела"). В частности, можно перечислить Fab (фрагмент, связывающий антиген), F(ab')2, Fab', одноценочечное антитело (одноцепочечный Fv; далее именуемый scFv), стабилизированное дисульфидными связями антитело (стабилизированный дисульфидными связями Fv, далее именуемый dsFv), фрагмент димеризованной вариабельной области (далее именуемый диателом), содержащий белки CDR, обладающий способностью к специфическому связыванию с PcrV человека (Expert opinion on therapeutic patents, vol. 6,No. 5, p. 441-456, 1996).Fab представляет собой фрагмент антитела, обладающий молекулярной массой приблизительно 50000, со способностью связывать антиген, состоящий приблизительно из половины Н-цепи (со стороныN-конца) и целой L-цепи, полученных путем расщепления с участием фермента папаина части пептида выше двух дисульфидных связей (S-S связь), сшивающих две Н-цепи в шарнирной области IgG. Fab,применяемый в настоящем изобретении, можно получить путем обработки моноклонального антитела папаином согласно настоящему изобретению. В качестве альтернативы Fab можно получить путем встраивания ДНК, кодирующей Fab моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, в вектор экспрессии для клетки и путем введения указанного вектора в клетку, чтобы вызвать экспрессию.F(ab')2 представляет собой фрагмент антитела, обладающий молекулярной массой приблизительно 100000 со способностью связывать антиген, образованный путем связывания двух областей Fab' в шарнирной части. Указанные области Fab' получают путем расщепления с участием пепсина ниже двух S-S связей шарнирной области IgG. F(ab')2, применяемый в настоящем изобретении, можно получить путем обработки пепсином моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, В качестве альтернативы F(ab')2 можно получить путем встраивания ДНК, кодирующей F(ab')2 указанного моноклонального антитела, в вектор экспрессии для клетки и путем введения указанного вектора в клетку E.coli, дрожжей или животного, чтобы вызвать экспрессию.Fab' представляет собой фрагмент антитела, обладающий молекулярной массой приблизительно 50000, со способностью связывать антиген, полученный путем разрыва S-S-связи между шарнирными областями упоминаемого выше F(ab')2. Fab', применяемый в настоящем изобретении, можно получить путем обработки F(ab')2 моноклонального антитела согласно настоящему изобретению восстановителем,например, дитиотреитолом. В качестве альтернативы F(ab') можно получить путем встраивания ДНК,-6 021101 кодирующей F(ab') указанного моноклонального антитела, в вектор экспрессии для клетки и путем введения указанного вектора в клетку E.coli, дрожжей или животного, чтобы вызвать экспрессию.scFv представляет собой пептид VH-P-VL или VL-P-VH, в котором одна цепь VH и одна цепь VL соединены посредством пептидного линкера (в дальнейшем именуемый Р), и является фрагментом антитела, обладающим антигенной активностью. VH и VL, содержащиеся в scFv, применяемом в настоящем изобретении, можно получить из моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. scFv,применяемый в настоящем изобретении, можно получить посредством получения ДНК, кодирующей VH и VL, из гибридомы, вырабатывающей моноклональное антитело, соответствующее настоящему изобретению, конструирования вектора экспрессии scFv и индуцирования экспрессии путем введения указанного вектора экспрессии в клетку E.coli, дрожжей или животного, чтобы вызвать экспрессию. Термин dsFv относится к молекуле, полученной путем связывания S-S связью полипептидов, в каждом из которых по одному остатку аминокислоты в VH в VL заменено на остаток цистеина. Аминокислоту, которую следует заменить остатком цистеина, можно выбрать на основании предсказания четвертичной структуры антитела при помощи способа, предложенного Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697(1994. VH или VL, содержащиеся в dsFv, применяемом в настоящем изобретении, можно получить из моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. dsFv, применяемый в настоящем изобретении, можно получить посредством получения кДНК, кодирующей VH или VL, из гибридомы, вырабатывающей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, конструирования вектора экспрессии dsFv и индуцирования экспрессии путем введения указанного вектора экспрессии в клетку"Диатело" представляет собой фрагмент антитела, в котором образуется димер scFvs, обладающий такой же или отличной специфичностью связывания антигена, и является фрагментом антитела, обладающим бивалентной активностью связывания антигена в отношении связывания одного и того же антигена или активностью а отношении связывания двух антигенов, специфичного для разных антигенов. Например, бивалентное диатело, которое реагирует с той же специфичностью, что и моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, можно получить посредством получения кДНК, кодирующей VH или VL моноклонального антитела согласно настоящему изобретению конструирования ДНК,кодирующей scFv, содержащего пептидный линкер из 3-10 остатков, встраивания указанной ДНК в вектор экспрессии для клетки и индуцирования экспрессии диатела путем введения полученного вектора экспрессии в клетку E.coli, дрожжей или животного. Пептид, содержащий CDR, включает по меньшей мере один участок CDR из VH или VL. Можно соединять несколько CDR напрямую или через подходящий пептидный линкер. Пептид, содержащийCDR, применяемый в настоящем изобретении, можно получить путем получения кДНК, кодирующейVH или VL моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, конструирования ДНК, кодирующей CDR, встраивания указанной ДНК в вектор экспрессии для клетки животного и индуцирования экспрессии путем введения полученного вектора экспрессии в клетку E.coli, дрожжей или животного. Пептид, содержащий CDR, также можно получить путем химического синтеза, например, по способуFmoc (способ с применением флуоренилметоксикарбонила) или по способу tBoc (способ с применениемt-бутилоксикарбонила). Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или часть указанного антитела можно модифицировать настолько, насколько это применимо в настоящем изобретении. В качестве модифицированного вещества можно применять антитела в форме, связанной с разными молекулами, включая полиэтиленгликоль (ПЭГ) или подобные. Модификации, производимые с антителом, могут включать модификацию путем введения химической связи или модификацию, производимую с последовательностью аминокислот антитела. Моноклональное антитело, согласно настоящему изобретению, или часть указанного антитела также включают указанные вещества, модифицированные с применением антитела. Для получения таких веществ, модифицированных с применением антитела, полученное антитело можно модифицировать. Такие методики уже разработаны в технике. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела (h1F3) согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, полинуклеотид согласно настоящему изобретению имеет последовательность оснований, соответствующую SEQ ID: 29 или 30. Также настоящее изобретение включает полинуклеотид, который может гибридизоваться с указанным полинуклеотидом в строгих условиях и кодирует антитело, обладающее активностью, эквивалентной активности антитела согласно настоящему изобретению. Полинуклеотид согласно настоящему изобретению представляет собой полимер, состоящий из нуклеотидов, таких как несколько дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) или рибонуклеиновых кислот(РНК), который кодирует антитело согласно настоящему изобретению. Нуклеотиды могут включать основания, отличные от тех, которые образуются в природе. Полинуклеотид согласно настоящему изобретению также можно применять в качестве зонда при скрининге антител, обладающих активностью, эквивалентной активности антитела согласно настоящему изобретению. Так, посредством применения в качестве зонда полинуклеотида, кодирующего антитело согласно настоящему изобретению или часть ука-7 021101 занного антитела, применяя методику, такую как гибридизация или способ амплификации генов, например, ПЦР, можно получить ДНК, которая гибридизуется с указанным полинуклеотидом в жестких условиях и кодирует антитело, обладающее активностью, эквивалентной активности антитела согласно настоящему изобретению. Такие ДНК также включены в понятие полинуклеотида согласно настоящему изобретению. Методика гибридизации (Sambrook, J et al., Molecular. Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring HarborLab. press, 1989) хорошо известна специалистам в данной области техники. Условия гибридизации могут,например, представлять собой нежесткие условия. Термин "нежесткие условия" означает, что этап отмывки после гибридизации проводят с применением 0,1SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), содержащего 0,1% SDS (додецилсульфат натрия) при 42 С, предпочтительно 0,1SSC, содержащего 0,1%SDS при 50 С. Более предпочтительные условия гибридизации - это очень жесткие. Термин "очень жесткие условия" означает, например, применение 0,5SSC, содержащего 0,1% SDS при 65 С. Предполагается, что при данных условиях с более высокой температурой можно эффективно получать полинуклеотид с более высоким сходством. Среди факторов, влияющих на жесткость гибридизации, можно перечислить несколько факторов, такие как температура или концентрация солей. Специалисты могут должным образом выбрать указанные факторы и достичь сходной жесткости. Антитела, функционально эквивалентные антителу согласно настоящему изобретению обычно обладают высоким сходством по последовательности аминокислот. Указанные антитела кодируются полинуклеотидами, которые получают путем описанной выше гибридизации или методик амплификации генов. Антитела, которые функционально эквивалентны антителу согласно настоящему изобретению и обладают высоким сходством с ним по последовательности аминокислот, включены в настоящее изобретение. Высокая степень сходства означает сходство последовательности аминокислот по меньшей мере более чем на 50%, предпочтительно более чем на 75%, а еще более предпочтительно сходство более чем на 85% и более, чем на 95%. Для определения сходства полипептида можно применять алгоритм, описанный в указанном документе (Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80,726730). Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или часть указанного антитела можно применять в виде фармацевтической композиции. Следовательно, фармацевтическую композицию,содержащую моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, и часть указанного антитела,можно вводить системно или местно пероральным или парентеральным путем. Для парентерального введения можно выбрать, например, внутривенные инъекции, такие как капельное введение, внутримышечные инъекции, внутрибрюшинные инъекции, подкожные инъекции, интраназальное введение, ингаляцию или подобные пути. Однако поскольку известно, что Pseudomonas aeruginosa обычно вызывает поражение клеток эпителия легких и макрофагов легочных альвеол, инфицируя дыхательные пути (Т.Sawa et al, Nature Medicine, 1999, vol. 5, p. 392), желательны интраназальный путь введения и ингаляции. Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят в качестве лекарственного средства пациенту, страдающему фиброзным кистозом или инфекцией, вызванной Pseudomonasaeruginosa. Например, эффективную дозу выбирают в диапазоне от 0,01 до 100 мг на 1 кг массы тела на один прием. В качестве альтернативы можно выбрать дозу от 1 до 1000 мг, предпочтительно дозу от 5 до 50 мг для одного пациента. Однако доза фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или часть указанного антитела, не ограничивается указанными дозами. Длительность введения можно выбрать должным образом в зависимости от возраста, симптомов или подобных характеристик пациента. Фармацевтическая композиция, соответствующая настоящему изобретению, также может включать фармацевтически приемлемую основу или вспомогательное вещество, также в зависимости от пути введения. Примеры таких основ и вспомогательных веществ включают воду, фармацевтически приемлемый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, альгинат натрия,водорастворимый декстран, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, казеин, диглицерид, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, альбумин сыворотки человека (HSA), маннитол, сорбитол, лактозу и поверхностно-активные вещества, разрешенные в качестве фармацевтических вспомогательных веществ. Вспомогательное вещество для применения выбирают должным образом или создают сочетания из перечисленных выше веществ в зависимости от лекарственной формы, но не ограничиваясь ими. Способ получения моноклонального антитела мыши против PcrV можно объяснить на следующих Справочных примерах. Справочный пример 1. Для проведения сравнительного эксперимента Mab166 (Заявка на патент Японии 2005-500250 или подобные) получали в виде рекомбинантного антитела. Сначала выделяли мРНК из гибридомы, которая вырабатывает антитело, по классификации относящееся к подклассу IgG2a, и клонировали константные области Н-цепи и L-цепи методом ОТ-ПЦР(ПЦР с обратной транскрипцией). Каждый фрагмент, амплифицированный посредством ПЦР, встраивали в сайт Nhel-NotI вектора pcDNA3.1 (+) (поставляемого компанией "Invitrogen Corporation"), и далее встраивали сайт множественного клонирования, для обеспечения возможности встраивания фрагмента ДНК вариабельной области. Затем, после расщепления последовательности гена Н-цепи и L-цепи вариабельной области Mab166 на четыре части, синтезировали их смысловую ДНК и антисмысловую ДНК, и отжигали их. После отжига фрагменты подвергали связыванию с ДНК-лигазой и проводили клонирование в область MfcI-BlpI для Н-цепи и в область EcoRV-BsiWI для L-цепи. Векторы Н-цепи и L-цепи, обладающие идентифицированной последовательностью оснований,вводили в клетки НЕК 239 Т при помощи Липофектамина 2000 (поставляемого компанией "InvitrogenCorporation"), и через 48 ч отбирали надосадочную жидкость культуры. Отобранный из надосадочной жидкости после культивирования клеток рекомбинантный Mab166 очищали при помощи колонки с белком-G (поставляемой компанией "PIERCE"). Справочный пример 2. Получение антигена. Экстрагировали хромосомную ДНК стандартного штамма Pseudomonas aeruginosa PAO1, предоставленного Университетом Токаи, Япония, и ген, кодирующий белок PcrV (SEQ ID : 2), амплифицировали посредством ПЦР, применяя в качестве матрицы указанную ДНК. Сайт распознавания фермента рестрикции Sphl находился на праймере 5'-конца, а сайт распознавания фермента рестрикции HindIII находился на праймере 3'-конца, (SEQ ID : 3, 4), и при встраивании в вектор экспрессии был выбран такой дизайн, чтобы цистеин встраивался между гистидиновой меткой и стартовым кодоном для мечения биотином. Фрагмент, амплифицированный в ходе ПЦР, клонировали в вектор pWE30 (поставляемый компанией "GE healthcare") в сайтах SphI и HindIII. После секвенирования указанный вектор вводили в клетки E.coli JM109 и получали рекомбинантные E.coli. (PcrWM109). PcrV-JM109 культивировали в 500 мл жидкой среды Лурия-Бертани с ампициллином при температуре 37 С, и когда OD600 (оптическая плотность на длине волны 600 нм) достигала 0,5, добавляли 200 мкл 0,1 М изопропилтиогалактозида(ИПТГ). После культивирования в течение дополнительных 1,5 часов при 37 С клетки бактерий центрифугировали и добавляли 15 мл буфера А (25 мМ трис-HCl (рН 8,0), 0,5 М NaCl, 2 мМ MgCl2), содержащего 0,5% лизоцима (поставляемого компанией "Sigma"). После инкубации в течение 30 минут при 0 С клетки подвергали действию ультразвука. После центрифугирования получали растворимую фракцию,пропускали ее через колонки His-Bind (поставляемые компанией "Novagen") и затем элюировали с буфером В (20 мМ фосфатный буфер (рН 7,4), 500 мМ NaCl), содержащим 200 мМ имидазола. Конечную элюированную фракцию подвергали диализу против 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), с заменой указанного буфера. Мечение антигена биотином Белку PcrV, экспрессированному и очищенному, как было описано выше, давали прореагировать в растворе меркаптоэтиламина с конечной концентрацией 10 мМ при 37 С в течение 150 мин в целях восстановления остатков цистеина. Биотин, активированный ПЭО-малеинимидом (поставляемый компанией"PIERCE"), добавляли в таком количестве, чтобы мольное соотношение к восстановленным SH-группам было 20:1, и давали прореагировать в течение ночи при 4 С, а затем проводили диализ, чтобы удалить непрореагировавший биотин. Иммунизация антигеном Каждые 20 мкг антигена PcrV с полным адьювантом Фрейнда вводили внутрибрюшинно семи самкам мышей Balb/c в возрасте 4 недель. Реиммунизацию проводили путем введения 20 мкг PcrV с неполным адъювантом Фрейнда через 14 и 35 дней. Далее конечную иммунизацию проводили через 77 дней путем внутрибрюшинного введения 20 мкг PcrV и введения в хвостовую вену 10 мкг PcrV. Получение гибридомы Селезенку извлекали хирургическим путем через 3 дня после конечной иммунизации и отбирали клетки селезенки. Проводили слияние клетки селезенки и клетки лимфомы мыши (р 363-Ag8.U1, лаборатория исследования опухолей Токио) при помощи 50% полиэтиленгликоля 4000 и проводили их селекцию на питательной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Селекция антител против PcrV Через 8 дней после слияния клеток проводили скрининг клеток, вырабатывающих специфические антитела. В каждую лунку в микропланшете на 96 лунок (поставляемом компанией "Nunc") добавляли 200 мкл трис-буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5), содержащего 2 мкг антитела против IgG мыши (поставляемого компанией "Shibayagi"), и осуществляли иммобилизацию в течение 16 ч при 4 С. Указанные лунки двукратно промывали 300 мкл промывочного раствора (физиологический раствор, содержащий 0,1% Tween 20), затем добавляли 300 мкл BlockAce (поставляемый компанией "Dainippon SumimotoPharma Co, Ltd.") и оставляли на два часа при комнатной температуре. После двукратного промывания каждой лунки 300 мкл промывочного раствора 50 мкл надосадочной жидкости из культуры гибридомы разбавляли 150 мкл буфера С (50 мМ трис-буфера, рН 7,6, содержащего 0,9% хлорида натрия, 0,05% азида натрия, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Tween 80 и 25 мкМ диэтилентриаминаN,N,N',N",N"-пентауксусной кислоты) и добавляли в каждую лунку, давали прореагировать в течение ночи при 4 С. После трехкратного промывания 300 мкл промывочного раствора добавляли 200 мкл буфера С, содержащего 10 нг меченного европием стрептавидина (поставляемого компанией "PERKINELMER"), добавляли 25 нг меченного биотином PcrV и давали прореагировать в течение 1 ч при комнат-9 021101 ной температуре. После протекания реакции и трехкратного промывания 300 мкл промывочного раствора добавляли 200 мкл стимулирующего реагента (1,39 г/л фталата калия, 19,3 мг/л три-nоктилфосфиноксида, 4,59 мг/л 2-нафтоилтрифторацетона, 1,0 г/л Тритона-X100, 6,0 г/л уксусной кислоты) и измеряли флуоресценцию с разрешением во времени. На основании результатов скрининга были отобраны 20 клонов гибридомы, которые проявляли высокое сродство к рекомбинантному PcrV, и в соответствии с примером 4 оценивали активность ингибирования цитотоксичности, вызываемой Pseudomonas aeruginosa. В результате активность ингибирования цитотоксичности обнаружили у 10 клонов, и указанные клоны затем двукратно клонировали при помощи способа серийных разведений, и таким образом проводили селекцию клеток гибридомы. Из полученных 10 клонов отобрали 4 клона, проявляющие высокую активность интибирования цитотоксичности, и их назвали 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7 соответственно. Для указанных антител подкласс антитела определяли при помощи набора ELISA для изотипирования моноклональных антител мыши (поставляемого компанией"BD Biosciences"), и было показано, что 1F3 является IgG2a, 2A4 является IgG2b, 6F5 является IgG2a, и 7 А 7 является IgG2a. Клетки гибридов, которые вырабатывают моноклональные антитела 1F3 и 2 А 4, были архивированы в Национальном институте прогрессивной промышленной науки и технологии, Международном депозитарии запатентованных организмов (Центр 6, 1-1-1, Хигаши, Тсукубаши, ИБАРАДЖИ, ЯПОНИЯ) 15 января 2009 г., с номерами доступа FERM АВР-11805 и FERM ABP-11806, соответственно. Справочный пример 3. Связывающая активность антитела. Для измерения связывающей активности антител (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7) применяли конкурентный иммуноанализ. В каждую лунку микропланшета на 96 лунок (поставляемый компанией "Nunc") добавляли 100 мкл трис-буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5), содержащего 1,5 мкг антитела против IgG мыши (поставляемый компанией "Jackson Immunoresearch"), и осуществляли иммобилизацию в течение 16 ч при 4 С. Указанные лунки двукратно промывали 300 мкл промывочного раствора, затем добавляли 300 мклBlockAce (поставляемый компанией "Dainippon Sumimoto Pharma Co, Ltd."), включающего 10% сахарозу,и оставляли на два часа при комнатной температуре, чтобы достичь блокирования (планшет с твердой фазой с антитела против IgG мыши). После двукратного промывания каждой лунки 300 мкл промывочного раствора добавляли 2 нг/лунку каждого антитела и немеченого PcrV в пяти концентрациях в сериях 10-кратного разведения, начиная с 500 нг/лунку. Затем добавляли 5 нг/лунку PcrV, связанного с биотином, и давали смеси прореагировать в течение ночи. После четырехкратного промывания 300 мкл промывочной жидкости и добавления 100 мкл/лунку стимулирующего реагента (поставляемого компанией"Wallak") и после перемешивания в течение 1 мин измеряли флуоресценцию с разрешением во времени. В результате 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7 продемонстрировали более высокую активность связывания с PcrV,чем Mab166 (фиг. 1). Далее сродство 1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166 к PcrV определяли способом поверхностного плазменного резонанса. Антитело против иммуноглобулина мыши иммобилизировали на сенсорном чипе СМ 5 при помощи набора для захвата антител мыши (поставляемого компанией "BIACORE"). Затем осуществляли захват каждого антитела к PcrV. Рскомбинантный PcrV загружали в инструмент BIAcore T100 с сенсорным чипом для определения сродства. В результате каждый клон демонстрировал более высокое сродство, чем Mab166, что подтверждалось значением сродства 3,710-10 для 1F3, 3,510-10 для 2 А 4, 1,110-10 для 6F5 и 1,110-9 для 7 А 7, в отличие от значения сродства для Mab166, равного 3,010-9 (фиг. 2). Справочный пример 4. Иммунологический сэндвич-анализ с Mab166. Чтобы показать, что 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7 обладают эпитопами, отличными от эпитопа Mab166,сравнивали результаты сэндвич-анализа для каждого из указанных антител и Mab166. Сначала Mab166 метили биотином. 100 мкг Mab166 и 7,853 мкг N-гидроксисукцимид-ПЭО 4 биотина (поставляемого компанией "PIERCE") смешивали в 0,1 М фосфатом буфере (рН 7,4) и давали прореагировать в течение 2 ч на льду. Затем для удаления непрореагировавшего биотина из реакционной смеси проводили гель-хроматографию (колонка G2000SW (поставляемая компанией "TOSOH". Иммунологический сэндвич-анализ проводили следующим образом. В каждую лунку микропланшета на 96 лунок (поставляемого компанией "Nunc") добавляли 100 мкл раствора фосфатного буфера (-),в каждой аликвоте содержалось по 500 мкг антитела против PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7) и осуществляли иммобилизацию в течение 16 ч при 4 С. Указанные лунки однократно промывали 300 мкл промывочного раствора (физиологический раствор, содержащий 0,01% Tween 20), затем добавляли 300 мкл BlockAce(поставляемый компанией "Dainippon Sumimoto Pharma Co. Ltd") и оставляли на два часа при комнатной температуре, чтобы достигнуть блокирования. После двукратного промывания каждой лунки 300 мкл промывочного раствора добавляли 100 мкл буфера для анализа (поставляемого компанией "Wallak"),содержащего 50 мкг PcrV и 50 нг меченного биотином Mab166 и давали прореагировать в течение ночи при 4 С. После четырехкратного промывания промывочным раствором добавляли 100 мкл буфера для анализа, содержащего 50 нг меченного европием стрептавидина (поставляемого компанией "Wallak") и давали прореагировать в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного промывания про- 10021101 мывочным раствором и добавления 100 мкл стимулирующего реагента перемешивали в течение 1 мин и затем измеряли флуоресценцию с разрешением во времени. В результате было показано, что иммунологический сэндвич-анализ возможен между 1F3, 2 А 4, 6F5,7 А 7 и Mab166, и таким образом выявили, что указанные антитела обладают эпитопами, отличными от эпитопа Mab166 (фиг. 3). Справочный пример 5. Измерение активности ингибирования цитотоксичности. Активность ингибирования цитотоксичности измеряли для 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7. Способ измерения был следующий. Сначала 1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 разводили с получением серий двукратных разведений, начиная с 32 мкг/мл, и в каждую лунку микропланшета на 96 лунок наливали по 10 мкл. Далее клетки миеломы мышиP3U1 (из Американской коллекции типовых культур) приводили к концентрации 5106 клеток/мл, или лейкоциты линии U937 (из Американской коллекции типовых культур) приводили к концентрации 1106 клеток/мл при помощи питательной среды для культивирования клеток (RPMI1640, содержащая гидрокарбонат натрия и не содержащая феноловый красный (поставляемая компанией "Сигма", и каждые 100 мкл суспензии клеток добавляли в микропланшет на 96 лунок. Далее штамм SR24 Pseudomonas aeruginosa, культивированный в течение ночи в среде Мюллера-Хинтона, скорректированной по содержанию катионов (Difco), приводили к концентрации 1108 KOE/мл при помощи питательной среды для культивирования клеток, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37 С в присутствии 5% СО 2. После перемешивания в течение 3 ч в каждую лунку добавляли 10 мкл WST-8 (поставляемого компанией "Kishida Chemical Co., Ltd.") и культивировали при 37 С в присутствии 5% СО 2 - в течение 3 ч в случае клеток миеломы P3U1 и в течение 1 часа в случае клеток U937. После завершения культивирования измеряли поглощение на длине волны 450 нм. В результате в случае применения лейкоцитов U937 активность ингибирования цитотоксичности(IC50) составила 5,3 нМ для антитела 1F3, 20,7 нМ для 2 А 4, 12,7 нМ для 6F5 и 14,7 нМ для 7 А 7, а для антитела Mab166 - более 213 нМ; при применении клеток миеломы U3P1 активность ингибирования цитотоксичности (IC50) составила 4,0 нМ для антитела 1F3, 16 нМ для 2 А 4, 7,3 нМ для 6F5 и 6,0 нМ для 7 А 7, а для антитела Mab166 - 54 нМ. То есть 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7 обладали более высокой активностью ингибирования цитотоксичности в отношении обоих типов клеток, чем Mab166, которое было описано ранее (Frank el al., The Journal of Infectious Diseases, 2002, vol. 186, p. 66) (фиг. 4 и 5). Справочный пример 6. Получение процессированного PcrV. Процессированный PcrV (136-233) получали следующим образом. Фрагмент, амплифицированный посредством ПЦР с праймером 5'-конца GCTCGAGGATCCCAAGGCGCTGACCGC (SEQ ID : 5) и праймером З'-конца GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC (SEQ ID : 6) с применением в качестве матрицы pQE30-PcrV, который является плазмидой для экспрессии антигена PcrV, обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и HindIII и встраивали в рЕТ 32b (поставляемый компанией "Novagen"). После секвенирования вектор вводили в клетку штамма Е. coli BL21-DE3 и получали рекомбинантную E.coli(процессированный PcrV-BL21). Указанный экспрессирующий штамм культивировали в течение одного дня и ночи при 37 С в 2 мл жидкой среды Лурия-Бертани с ампициллином. 2 мл культуральной жидкости из прекультуры добавляли к 500 мл жидкой среды Лурия-Бертани с ампициллином и культивировали при 37 С, и когда OD600 достигала значения 0,5, культуральную жидкость оставляли еще на 30 мин на льду. Добавляли ИПТГ для получения конечной концентрации 0,75 мМ и культивировали в ротационном шейкере при скорости вращения 160 об/мин при 15 С в течение одного дня и ночи. Клетки бактерий отбирали посредством центрифугирования культуральной жидкости при 4 С, скорости вращения 5000g в течение 30 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а к гранулам добавляли 10 мл буфера X (25 мМ ТрисHCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2), содержащего 0,1% лизоцима (поставляемого компанией "Сигма") и суспендировали, оставляя еще на 1 час на льду, а затем обрабатывали ультразвуком при охлаждении на льду. Затем растворимую фракцию загружали в колонку, заполненную Ni-NTA агарозой("Quiagen"), и элюировали с применением буфера Y (25 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 200 мМ имидазола). Элюированную фракцию подвергали диализу с применением 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4). Определение области эпитопа В каждую лунку микропланшета на 96 лунок (поставляемого компанией "Nunc") добавляли 150 мкл трис-буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5), содержащего 1,5 мкг Fc антитела против IgG мыши (поставляемого компанией "Jackson Immunoresearch"), и иммобилизировали в течение 16 ч при 4 С. Указанные лунки двукратно промывали 300 мкл промывочного раствора (физиологический раствор, содержащий 0,1%Tween 20), затем добавляли 300 мкл блокирующего раствора (500 мМ трис- HCl, рН 7,5,2% BlockAce(поставляемый компанией "Dainippon Sumimoto Pharma Co, Ltd"), 10% сахарозы) и оставляли на два часа при комнатной температуре, чтобы произошло блокирование каждой лунки (планшет с иммобилизованным антителом против IgG мыши). После однократного промывания каждой лунки 300 мкл промывочной жидкости в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора антител против PcrV, разведенного до концентрации 80 нг/мл буфером С (50 мМ трис-буфера, содержащего 0,9% хлорида натрия, 0,05% азида натрия,- 11021101 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% Tween 80 и 25 мкм диэтилентриамина-N,N,N',N",N"пентауксусной кислоты, рН 7,6), затем добавляли 20 мкл раствора Eu-меченного стрептавидина (поставляемого компанией "PERKIN ELMER"), разведенного до концентрации 200 нг/мл буфером С, 100 мкл процессированного белка PcrV, разведенного до нужной концентрации буфером для анализа DELFIA, и давали прореагировать в течение ночи при 4 С. После трехкратного промывания 300 мкл промывочного раствора добавляли 200 мкл стимулирующего реагента (1,39 г/л фталата калия, 19,3 мг/л три-nоктилфосфиноксида, 4,59 мг/л 2-нафтоилтрифторацетона, 1,0 г/л Тритона-X100, 6,0 г/л уксусной кислоты) и измеряли флуоресценцию с разрешением во времени (фиг. 6). В результате антитела против PcrV 1F3, 2 А 4, 9D12, 12 Н 9 и m166, производимое компанией "KaloBios Pharmaceuticals, Ink.", применяемое в качестве сравнительного образца, проявляли реакционную способность в отношении полноразмерного PcrV (1-294). С другой стороны, хотя 1F3 и 2 А 4 демонстрировали реакционную способность в отношении PcrV (136-233), m166, а также 9D12 и 12 Н 9 не обладали нейтрализующей активностью и не демонстрировали реакционной способности. Также проводили анализ связывания посредством вестерн-блоттинга. Очищенный рекомбинантный белок PcrV наносили на SDS-PAGE (полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия) и затем переносили на мембрану из ПВДФ. Указанную мембрану блокировали при помощи BlockAce (поставляемый компанией "Dainippon Sumimoto Pharma Co, Ltd.") при комнатной температуре в течение 2 ч при встряхивании. Раствор антител против PcrV, разведенный до концентрации 1 мкг/мл, добавляли на мембрану,давали прореагировать в течение ночи при 4 С и затем промывали промывочным буфером В (10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), 0,05% Tween 20). В качестве вторичного антитела на мембрану дополнительно наносили раствор меченного антитела против IgG мыши (поставляемого компанией "GE Healthcare"), и ему давали прореагировать в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем мембрану промывали промывочным буфером В и считывали сигнал при помощи системы детекции для вестерн-блоттингаECL Plus (поставляемой компанией "GE Healthcare"), визуализировали результаты при помощи прибораLAS-1000 (поставляемого компанией "FUJIFILM") (фиг. 7). Хотя нейтрализующие PcrV антитела 1F3 и 2 А 4 реагировали и с полноразмерным, и с процессированным PcrV, m166, а также 6F5 и 7 А 7 реагировали только с полноразмерным PcrV и не реагировали с процессированным PcrV. Данный факт демонстрирует, что область эпитопа для нейтрализации PcrV антителами 1F3 и 2 А 4 является областью, которая соответствует остаткам аминокислот 136-233, а антитела 6F5 и 7 А 7 исключительно не обладают областью эпитопа, соответствующей остаткам аминокислот 136-233. Справочный пример 7. Корреляция между специфичной областью белка PcrV и интенсивностью цитотоксичности. Тест на активность подавления цитотоксичности антителами 1F3, 2 А 4 и m166 проводили следующим образом при помощи полноразмерного белка PcrV (SEQ ID : 1) и процессированного белка PcrV(обладающего последовательностью аминокислот, соответствующей положениям 136-233 (SEQ ID : 1). Сначала 1F3, 2 А 4 и m166 разводили путем последовательных двукратных разведений, начиная с концентрации 200 нМ, 200 нМ и 400 нМ, соответственно, и 10 мкл раствора каждого антитела добавляли в планшет на 96 лунок. В указанном тесте диапазон концентраций 1F3, 2 А 4 и m166 приводили к 1,566,25 нМ, 6,25-25 нМ и 50-200 нМ соответственно. Для каждого тестируемого диапазона концентраций в планшет на 96 лунок добавляли по 10 мкл полноразмерного белка PcrV и процессированного белка PcrV в мольных отношениях 30, 10, 3, 1 и 0,3 и оставляли еще на 30 минут при комнатной температуре. Далее клетки миеломы P3U1 приводили к концентрации 5106 клеток/мл посредством питательной среды(RPMI1640, содержащей гидрокарбонат натрия и не содержащей L-глутамин и феноловый красный (поставляемой компанией "Сигма" и добавляли их в объеме 70 мкл в каждую лунку микропланшета на 96 лунок. Затем жидкую культуру бактерий Pseudomonas aeruginosa (штамм SR24), культивируемую в течение ночи в среде Мюллера-Хинтона (Difco), концентрацию клеток в которой приводили к 1108 KOE/мл при помощи питательной среды для клеток, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37 С в присутствии 5% CO2. Спустя 3 ч в каждую лунку добавляли 10 мкл WST-8 (поставляемого компанией "Kishida Chemical Co., Ltd.") и культивировали при 37 С в присутствии 5% CO2 в течение 3 ч. После окончания культивирования измеряли поглощение на длине волны 450 нм. В результате, когда белок PcrV не добавляли, 1F3 и 2 А 4 проявляли более высокую активность ингибирования цитотоксичности, чем m166. С другой стороны, когда добавляли полноразмерный белокPcrV, эффекты ингибирования антител против PcrV угнетались с зависимостью от дозы PcrV (фиг. 8). Когда добавляли процессированный белок PcrV, активность ингибирования антителами 1F3 и 2 А 4 также угнеталась с зависимостью от дозы, а активность ингибирования антителом m166, которое не обладает указанным эпитопом, не изменялась (фиг. 9). На основании данных результатов можно предположить, что антитела, распознающие эпитоп в положении 136-233 остатков аминокислот (1F3 и 2 А 4), обладают более высокой активностью ингибирования цитотоксичности, чем антитела, не распознающие указанный эпитоп (m166). Иными словами, можно заключить, что активность ингибирования цитотоксичности зависит от области эпитопа, распознаваемой антителом против PcrV, и антитело, которое реагирует только с областью 136-233 в белке PcrV, обладает высокой нейтрализующей активностью. Справочный пример 8. Анализ последовательности аминокислот в моноклональном антителе мыши против PcrV человека (1F3 и 2 А 4). Из клеток стандартной гибридомы экстрагировали РНК при помощи набора RNeasy Mini (поставляемого компанией "QULAGEN"). Из 1 мкг экстрагированной РНК амплифицировали фрагмент ДНК при помощи Системы для быстрой амплификации концов кДНК 5'RACE, версия 2.0 (поставляемой компанией "Invitrogen"). На этом этапе для синтеза кДНК применяли следующие праймеры:(SEQ ID : 8) для 2 А 4. При реализации способа 5'RACE применяли праймеры AGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGT (SEQ ID : 9) для 1F3 и AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGGGGGTGT (SEQ ID : 10) для 2 А 4. Амплифицированные фрагменты клонировали при помощи набора для клонирования ТОРО ТА (поставляемого компанией "Invitrogen") и секвенировали при помощи генетического анализатора Applied Biosystems 3130 (поставляемого компанией "Applied Biosystems"). Результаты анализа для 1F3 показаны на фиг. 10, а для 2 А 4 - на фиг. 11. В результате поиска гомологии последовательностей аминокислот вариабельной области с применением базы данных последовательностей аминокислот в антителах "Последовательности белков, представляющих интерес для иммунологии" (Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, 1983 г.) полученной от Kabat, было выяснено, что гипервариабельным участком вариабельной области тяжелой цепи антитела 1F3 являются SFTSYWMH (SEQ ID :15),INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID :16) и YGNYWYYTMDY (SEQ ID :17); гипервариабельным участком вариабельной области легкой цени указанного антитела являются SASTSVSYME (SEQ ID :18),TTSKLAS (SEQ ID :19) и HQWRNYPFT (SEQ ID :20). Результат поиска, проведенного аналогичным образом для 2 А 4, показал, что гипервариабельным участком вариабельной области тяжелой цепи антитела 2 А 4 являются SITSDYAWN (SEQ ID :21), YITYNGDTSYNPSLKS (SEQ ID :22) и SRNYYGAWFAY (SEQ ID :23), и что гипервариабельным участком вариабельной области легкой цепи указанного антитела являются KASQYVGTTVA (SEQ ID :24), RASTRHT (SEQ ID :25) и QQYCSSPLT(SEQ ID :26). Настоящее изобретение более конкретно объясняется при помощи следующих неограничивающих примеров. В качестве методики получения антител применяли способы, описанные в "Immunochemistryin Practice" (Blackwell Scientific Publications), если не указано другое. В качестве методики генной инженерии применяли способы, описанные в "Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition" (Cold Spring HarborLaboratory), если не указано другое. Пример 1.(1) Гуманизация моноклонального антитела мыши 1F3. Для гуманизации моноклонального антитела мыши (1F3), полученного как описывалось выше, CDR из антитела мыши встраивали в акцепторную последовательность человека зародышевого типа. В частности, для поиска акцепторной последовательности человека зародышевого типа, демонстрирующей максимальную гомологию с последовательностью аминокислот области V-гена как легкой,так и тяжелой цени антитела мыши, применяли программу IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.gov/igblast/). Для области J-гена выбирали последовательности с высокой степенью гомологии с последовательностью ДНК антитела мыши из IMGT (Иммуногенетическая база данных) (httpV/imgt.cines.fr/). В результате поиска получили название гена из IMGT: IGHV1-4601 как последовательность гена антитела, которая получена из акцепторной последовательности человека зародышевого типа и демонстрирует самую высокую гомологию с областью V-гена тяжелой цепи антитела мыши, и название гена поIMGT: IGHJ601 как последовательность гена антитела, которая получена из акцепторной последовательности человека зародышевого типа и демонстрирует самую высокую гомологию с областью J-гена тяжелой цепи антитела мыши; указанные последовательности применяли в качестве каркасных последовательностей человека для встраивания тяжелой цепи. Аналогично получили название гена из IMGT:IGKV1-901 как последовательность гена антитела, которая получена из акцепторной последовательности человека зародышевого типа и демонстрирует самую высокую гомологию с областью V-гена легкой цепи антитела мыши, и название гена по IMGT: IGKJ202 как последовательность гена антитела, которая получена из акцепторной последовательности человека зародышевого типа и демонстрирует самую высокую гомологию с областью J-гена; указанные последовательности применяли в качестве каркасных последовательностей человека для встраивания легкой цепи. Далее CDRH1, CDRH2 и CDRH3 тяжелой цепи и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 легкой цепи антитела мыши характеризовали посредством нумерации последовательности аминокислот в соответствии с системой нумерации Кэбата (Wu, T.T. и Kabat, E.A., J. Ехр. Med. Augi;i32(2):211-50.(1970. Указанные области CDR встраивали в каркасные последовательности антитела человека, которые затем конструировали в качестве эталонного гуманизированного антитела. Различие между эталонным гуманизированным антителом, сконструированным таким образом, и последовательностью аминокислот в антителе мыши подтверждали в положениях последовательности аминокислот Н 5, Н 7, Н 11, Н 12, Н 20, Н 38, Н 40, Н 48,Н 66, Н 67, Н 69, Н 71, Н 75, Н 78, Н 81, H83, Н 87, Н 93, H94, H108, L1, L3, L9, L10, L11, L15, L17, L18, L19,L21, L40, L42, L43, L46, L70, L71, L72, L78, L79, L80, L83, L85 и L100 в соответствии с системой нуме- 13021101(1989). Для идентификации сайтов соматической мутации в антителе мыши проводили поиск последовательности аминокислот в области V-гена как тяжелой, так и легкой цепи антитела мыши при помощиIgBLAST и в результате получили название гена J558.33 и название гена 1GKV4-8001, как последовательности с наивысшей степенью гомологии в отношении тяжелой и легкой цепи, соответственно. Последовательность аминокислот области D-гена тяжелой цепи антитела мыши искали при помощи IgBLAST и получили название гена: IGHD2-101 как последовательность с наивысшей степенью гомологии в отношении тяжелой цепи. Последовательность ДНК области J-гена и тяжелой, и легкой цепи антитела мыши искали при помощи IMGT и получили название гена в IMGT: IGHJ401 и название гена вIMGT IGKJ401 как последовательности с наивысшей степенью гомологии в отношении последовательностей тяжелой и легкой цепи соответственно. Указанные последовательности мыши зародышевого типа сравнивали с антителом мыши, и остатки с разными боковыми цепями определяли как сайты соматических мутаций, и было подтверждено, что среди них Н 93, Н 94, L9 и L46 обладали боковыми цепями, различающимися у антитела мыши и эталонного гуманизированного антитела. Было подтверждено, что Н 71 и Н 94 обладают каноническими боковыми цепями (http.//www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html), различающимися у антитела мыши и эталонного гуманизированного антитела. Среди боковых цепей, различающихся у антитела мыши и эталонного гуманизированного антитела, расположенных в зоне Верньера (Foote et al., J. Mol. BioL, 224.487(1992, были Н 48, Н 67, Н 69, Н 71, Н 78,Н 93, Н 94, L46 и L71. Не было идентифицировано ни одного остатка, обусловливающего упаковку между цепями, различающегося у антитела мыши и эталонного гуманизированного антитела. Все перечисленные результаты вместе позволили нам сконструировать мутантное гуманизированное антитело, в котором все боковые цепи аминокислот в положениях Н 48, Н 67, Н 69, Н 71, Н 78, Н 93, Н 94, L9, L46 и L71 эталонного гуманизированного антитела были замещены боковыми цепями из антитела мыши (обратная мутация). Были сконструированы последовательности ДНК, в которых последовательность константной области JgG4Pro человека конъюгирована в качестве константной области тяжелой цепи, а последовательность константной области Igkappa человека конъюгирована в качестве константной области легкой цепи вариабельных областей эталонного гуманизированного антитела, сконструированного как было описано выше (фиг. 12; эталон), и мутантного гуманизированного антитела (фиг. 12; обратная мутация). Каждую из последовательностей ДНК применяли для конструирования плазмиды, экспрессирующей тяжелую цепь эталонного гуманизированного антитела (фиг. 13; НТ), плазмиды, экспрессируюшей легкую цепь эталонного гуманизированного антитела (фиг. 13; LT), плазмиды, экспрессирующей тяжелую цепь мутантного гуманизированного антитела (фиг. 13; НВ), или плазмиды, экспрессирующей легкую цепь мутантного гуманизированного антитела (фиг. 13; LB) в соответствии со способом, описанным выше.(2) Получение вектора для экспрессии генов антитела. Сначала серии в положении 228 замещали пролином, чтобы предотвратить расщепление S-S-связи в шарнирной области (Angal et al., 1993, Mol. Immunol. 30(1): 105-108, Schuurman et al., 2001, Mol. Immunol. 38:1-8), а ДНК константной области IgG4 делили на четыре части, для которых синтезировали смысловые и антисмысловые ДНК и отжигали их. Подвергнутые отжигу фрагменты сшивали при помощи ДНК-лигазы и встраивали в вектор pcDNA3.1(+) ("Invitrogen") в сайтах Nhel/NotI. Также вводили сайт множественного клонирования так, чтобы можно было встроить фрагмент ДНК вариабельной области. Далее последовательности генов тяжелых и легких целей вариабельной области гуманизированного антитела против PcrV соответственно делили на четыре части, затем синтезировали их смысловые и антисмысловые ДНК и отжигали их. Подвергнутые отжигу фрагменты сшивали при помощи ДНК-лигазы и сшитые тяжелые и легкие цепи клонировали в участки Mfel/BlpI and EcoRV/BsiWI соответственно. Далее подтверждали последовательности нуклеотидов антител. Химерное антитело мыши-человека 1F3 получали в качестве положительного контроля для оценки гуманизации антител. Последовательность константной области lgG4Pro человека конструировали на вариабельном участке тяжелой цепи антитела мыши в качестве последовательности константной области тяжелой цепи, а плазмиду экспрессии конструировали при помощи способа, описанного выше, чтобы получить плазмиду, экспрессирующую тяжелую цепь химерного антитела мыши/человека (фиг. 13; Нхимера). Последовательность ДНК конъюгированной последовательности константной областе Ig-kappa человека конструировали на вариабельном участке легкой цепи антитела мыши в качестве последовательности константной области легкой цепи, а вектор экспрессии конструировали при помощи способа, описанного выше, чтобы получить плазмиду, экспрессирующую легкую цепь химерного антитела мыши/человека (фиг. 13; L-химера). Плазмиды, экспрессирующие тяжелую и легкую цепь, подвергали совместной трансфекции в клетки млекопитающих в культуре, применяя одну из комбинаций плазмид,экспрессирующих тяжелые и легкие цепи химерного антитела мыши/человека: плазмиды, экспрессирующие тяжелые и легкие цепи эталонного гуманизированного антитела; плазмиды, экспрессирующие тяжелую цепь эталонного гуманизированного антитела и легкую цепь мутантного гуманизированного антитела; плазмиды, экспрессирующие тяжелую цепь мутантного гуманизированного антитела и легкую цепь эталонного гуманизированного антитела, и плазмиды, экспрессирующие тяжелую цепь мутантного гуманизированного антитела и легкую цепь мутантного гуманизированного антитела. Надосадочную жидкость от каждой культуры применяли для определения сродства к антигену - рекомбинантному PcrV способом поверхностного плазмонного резонанса (BIAcoreТ-100,"ЖЕ Хелскэа") (фиг. 13). Значение KD для химерного антитела мыши/человека, полученное при анализе сродства, составило 2,610-10 М. Значение KD для антитела, включающего тяжелые и легкие цепи эталонного гуманизированного антитела, составило 2,210-7 М; а значение для антитела, включающего тяжелую цепь эталонного гуманизированного антитела и легкую цепь мутантного гуманизированного антитела, составило 6,510-7 М, что подтверждает, что сродство было значительно снижено. Напротив, значение KD для антитела, включающего тяжелую цепь мутантного гуманизированного антитела и легкую цепь эталонного гуманизированного антитела составило 3,310-10 М, а указанное значение для антитела, включающего тяжелую и легкую цепь мутантного гуманизированного антитела составило 3,410-10 М, что указывает на то, что указанные антитела сохраняют сродство, близкое к сродству, характерному для химерного антитела мыши/человека. На основании данных результатов мы заключили, что тяжелая цепь мутантного гуманизированного антитела критична для сохранения сродства, а легкую цепь эталонного гуманизированного антитела или легкую цепь мутантного гуманизированного антитела можно применять, не изменяя сродства. Таким образом, для легкой цепи мы выбрали легкую цепь эталонного гуманизированного антитела, которая ближе к последовательности человека зародышевого типа. Для тяжелой цепи было получено гуманизированное антитело, в котором каждая из обратных мутаций в боковых цепях аминокислот в положениях Н 48, Н 67, Н 69, Н 71, Н 78, Н 93 и Н 94 была обращена с получением последовательности человека зародышевого типа, соответственно, и сродство к антигену оценивали способом поверхностного плазмонного резонанса (фиг. 14). В результате гуманизированное антитело, в котором Вал в положении Н 93 заменили на Ала, демонстрировало значение KD 1,010-9 М, а гуманизированное антитело, в котором Лей в положении Н 94 заменили на Apг, демонстрировало значение KD 3,210-7 М. Хотя указанные антитела демонстрировали пониженное сродство, у других гуманизированных антител с обратными мутациями относительно последовательности человека зародышевого типа значимого снижения сродства не наблюдалось. Указанные результаты позволили верифицировать последовательность гуманизированного антитела при помощи последовательности, полученных для антител мыши, для положений Н 93 и Н 94, и аминокислотной последовательности человека зародышевого типа для положений Н 48, Н 67, Н 69, Н 71 и Н 78(фиг. 15 и 16). Антитело, обладающее указанной последовательностью, получали при помощи способа,описанного ниже в (3), и его сродство подтверждали способом поверхностного плазмонного резонанса. В результате было подтверждено, что указанное антитело обладает таким же сродством, как и антитело мыши (фиг. 17).(3) Получение рекомбинантного антитела. Гены тяжелой и легкой цепи, полученные посредством способа, описанного выше, трансфецировали в клетки HEK293F при помощи Липофектамина 2000 ("Invitrogen"). Спустя 72 ч отбирали надосадочную жидкость у указанных клеток. Рекомбинантное антитело выделяли из отобранной надосадочной жидкости при помощи колонки с белком-G ("PIERCE"). Пример 2. Тестирование активности ингибирования цитотоксичности проводили для m1F3 (антитело мыши),h1F3 (гуманизированное антитело) и т 166. Применяли следующий способ. Сначала m1F3, h1F3 и m166 разводили посредством последовательных двукратных разведений, начиная с концентрации 200, 200 и 800 нМ соответственно. Каждое разведение (10 мкл) добавляли в лунки микропланшета на 96 лунок. Далее клетки миеломы P3U1 или клетки U937 приводили к плотности 5106 клеток/мл или 1106 клеток/мл, соответственно, посредством питательной среды (RPMI1640 (поставляемой компанией "Sigma Corporation"), содержащей гидрокарбонат натрия и не содержащей L-глутамин и феноловый красный) и добавляли их в объеме 70 мкл в каждую лунку микропланшета на 96 лунок. Затем жидкую культуру бактерий Pseudomonas aeruginosa (штамм SR24), культивируемую в течение ночи в среде Мюллера-Хинтона, скорректированной по содержанию катионов (Difco), приводили к плотности 1108 KOE/мл при помощи питательной среды для культивирования клеток, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37 С в атмосфере с 5% CO2. Через 3 ч в каждую лунку добавляли 10 мкл WST-8 (поставляемого компанией "Kishida Chemical Co., Ltd.") и культивировали в течение 1 ч при 37 С в атмосфере с 5% CO2. После окончания культивирования измеряли поглощение на длине волны 450 нм. Результаты показали, что активность ингибирования цитотоксичности (IC50) дляm166 составила 98,4 нМ, а для m1F3 и h1F3 составила 1,4 нМ и 1,5 нМ соответственно, когда применяли клетки U937 (фиг. 18), и для m166 составила 85,4 нМ, а для m1F3 и h1F3 составила 1,5 нМ и 1,3 нМ соответственно, когда применяли клетки миеломы (фиг. 19). Таким образом, активность ингибирования цитотоксичности m1F3 и h1F3 была почти одинаковой и была выше, чем активность m166. Применимость в промышленности Гуманизированное моноклональное антитело, соответствующее настоящему изобретению, или часть указанного антитела не только обладает высоким сродством к PcrV, но также проявляет высокую активность в отношении ингибирования цитотоксичности, проявляемой Pseudomonas aeruginosa в отношении клеток эукариот. Следовательно, фармацевтическую композицию, содержащую указанное моноклональное антитело или часть указанного антитела, можно применять в качестве лекарственного препарата при инфекции, вызываемой Pseudomonas aeruginosa, которую в медицинской сфере в настоящее время считают трудноизлечимой. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Гуманизированное моноклональное антитело против PcrV или сохраняющая способность к специфичному связыванию PcrV часть указанного антитела, которое имеет: 1) гипервариабельные участки вариабельной области тяжелой цепи, содержащие следующие последовательности аминокислот: SFTSYWMH (SEQ ID : 15) в CDR1, INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID : 16) в CDR2 и YGNYWYYTMDY (SEQ ID : 17) в CDR3, и 2) гипервариабельные участки вариабельной области легкой цепи, содержащие следующие последовательности аминокислот: SASTSVSYME (SEQ ID : 18) в CDR1, TTSKLAS (SEQ ID : 19) в CDR2 и HQWRNYPFT (SEQ ID : 20) в CDR3; и имеет по меньшей мере одно свойство, выбранное из (А)-(В):(A) способностью к ингибированию 50% или более цитотоксичности, проявляемой Pseudomonas aerugenosa в отношении лейкоцитов, при концентрации антитела от 1 до 200 нМ in vitro;(Б) способностью к ингибированию 50% или более цитотоксичности, проявляемой Pseudomonas aerugenosa в отношении клеток миеломы, при концентрации антитела от 1 до 50 нМ in vitro; и(B) константой диссоциации (Kd) с PcrV, равной 210-9 (М) или менее. 2. Гуманизированное моноклональное антитело против PcrV или часть указанного антитела, которое имеет: 1) вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID : 27 и 2) вариабельную область легкой цепи с последовательностью аминокислот SEQ ID : 28. 3. Фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения инфекции Pseudomonas aerugenosa, содержащая эффективное количество антитела или части антитела по п.1 или 2, в качестве активного ингредиента. 4. Полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи антитела по п.1 или 2. 5. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.4.