Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae

ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ КОНЪЮГАТЫ КАПСУЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ В настоящем изобретении раскрыта иммуногенная композиция для лечения или предупреждения заболевания, вызванного инфекцией Streptococcus pneumoniae, содержащая по меньшей мере 11 конъюгатов капсульных сахаридов S. pneumoniae, представляющих собой капсульный сахарид,ковалентно связанный с белком-носителем, включающих конъюгаты капсульных сахаридов из серотипов 1, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 23F, 19 А и 19F, где 19 А конъюгирован с первым бактериальным анатоксином, 19F конъюгирован со вторым бактериальным анатоксином, 7 или 8 капсульных сахаридов S. pneumoniae конъюгированы с белком D и где иммуногенная композиция содержит 3, 4, 5 или 6 белков-носителей, выбранных из следующего перечня: столбнячный анатоксин,дифтерийный анатоксин, CRM197, пневмолизин и PhtD или их слитые белки. Также описана вакцина, включающая иммуногенную композицию по изобретению, и способ ее изготовления. Область изобретения Настоящее изобретение относится к усовершенствованной вакцине Streptococcus pneumoniae. Предшествующий уровень техники Дети в возрасте младше 2 лет не вырабатывают иммунный ответ на большинство полисахаридных вакцин, поэтому необходимо придание этим полисахаридам иммуногенности путем химической конъюгации с белковым носителем. Сочетание полисахарида, Т-независимого антигена, с белком, Т-зависимым антигеном, придает полисахариду свойства Т-зависимости, включая переключение изотипа, "созревание аффинности" и сенсибилизацию. Однако проблемы могут иметь место при повторном введении полисахаридно-белковых конъюгатов или комбинации полисахаридно-белковых конъюгатов с образованием поливалентных вакцин. Например, сообщали, что полисахаридная вакцина Haemophilus influenzae типа b (PRP), в которой использован столбнячный анатоксин (ТТ) в качестве белка-носителя, была испытана в диапазоне дозировки с одновременной иммунизацией (свободным) ТТ и вакциной на основе конъюгата пневмококковый полисахарид-ТТ, следуя стандартной схеме для детей младшего возраста. Когда дозировка пневмококковой вакцины была увеличена, иммунный ответ на полисахаридный участок PRP конъюгатной вакцины Hib был снижен, что указывает на иммунную интерференцию полисахарида, возможно, за счет применения одного и того же белка-носителя (Dagan et al., Infect Immun. (1998); 66: 2093-2098). Также доказано, что эффект дозировки белка-носителя на гуморальный ответ на сам белок является многосторонним. Сообщали, что у детей увеличение дозировки четырехвалентного конъюгата столбнячного анатоксина привело в результате к сниженному ответу на столбнячный носитель (Dagan et al. см. выше). Классический анализ этих эффектов комбинированных вакцин описан как эпитопная супрессия,индуцированная носителем, которая не полностью понятна, но ее считают результатом избыточного количества белка-носителя (Fattom, Vaccine 17: 126 (1999. Как оказалось, это приводит к конкуренции Вклеток на белок-носитель и В-клеток на полисахарид за Th-клетки. Если В-клетки на белок-носитель преобладают, доступных Th-клеток недостаточно для обеспечения необходимой помощи В-клеткам,специфичным к полисахариду. Однако наблюдаемые иммунологические эффекты противоречивы, поскольку суммарное количество белка-носителя в некоторых случаях повышает иммунный ответ, а в других случаях снижает иммунный ответ. Следовательно, остаются технические сложности при комбинировании множественных полисахаридных конъюгатов в едином эффективном вакцинном препарате.Streptococcus pneumoniae представляет собой грамположительную бактерию, ответственную за значительную заболеваемость и смертность (в частности, в молодом и пожилом возрасте), вызывая инфекционные заболевания, вызванные инвазивной микрофлорой, такие как пневмония, бактериемия и менингит, и заболевания, связанные с колонизацией, такие как острый средний отит. Частоту пневмококковой пневмонии в США для людей в возрасте старше 60 лет оценивают как от 3 до 8 на 100000. В 20% случаев она приводит к бактериемии и другим проявлениям, таким как менингит, при смертности, близкой к 30% даже при лечении антибиотиками. Пневмококк инкапсулирован химически сшитым полисахаридом, который придает специфичность серотипа. Существует 90 известных серотипов пневмококков, и капсула является главной детерминантой вирулентности для пневмококков, поскольку капсула не только защищает внутреннюю поверхность бактерий от комплемента, но сама по себе является слабо иммуногенной. Полисахариды представляют собой Т-независимые антигены и не могут претерпевать процессинг или презентацию на молекулах главного комплекса гистосовместимости (МНС) для взаимодействия с Т-клетками. Они могут, однако, стимулировать иммунную систему посредством альтернативного механизма, в который вовлечено сшивание поверхностных рецепторов на В-клетках. В нескольких экспериментах было показано, что защита против инфекционного заболевания, вызванного инвазией пневмококков, показывает наиболее сильную корреляцию с антителом, специфичным к капсуле, и эта защита специфична для серотипа.Streptococcus pneumoniae является наиболее распространенным возбудителем инфекционного заболевания, вызванного инвазией бактерий, и среднего отита у детей младшего и ясельного возраста. Подобным образом, пожилые люди вырабатывают слабые иммунные ответы на пневмококковые вакцины[Roghmann et al. (1987), J. Gerontol. 42:265-270], следовательно, в этой группе населения повышена заболеваемость бактериальной пневмонией [Verghese and Berk (1983), Medicine (Baltimore), 62:271-285]. Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка усовершенствованного препарата полисахаридной конъюгатной вакцины против множественных серотипов Streptococcus pneumoniae. Краткое изложение сущности изобретения Согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция для лечения или предупреждения заболевания, вызванного инфекцией Streptococcus pneumoniae, содержащая по меньшей мере 11 конъюгатов капсульных сахаридов S. pneumoniae, представляющих собой капсульный сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, включающих конъюгаты капсульных сахаридов из серотипов 1,4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 23F, 19 А и 19F, где 19 А конъюгирован с первым бактериальным анатоксином,19F конъюгирован со вторым бактериальным анатоксином, 7 или 8 капсульных сахаридов S. pneumoniae конъюгированы с белком D и где иммуногенная композиция содержит 3, 4, 5 или 6 белков-носителей,выбранных из следующего перечня: столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, CRM197, пневмолизин и PhtD или их слитые белки. В одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению первый бактериальный анатоксин представляет собой белок, отличный от второго бактериального анатоксина. В частности, первый бактериальный анатоксин выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, CRM197, коклюшного анатоксина, бактериального цитолизина и пневмолизина. В еще одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению второй бактериальный анатоксин выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, CRM197,коклюшного анатоксина, бактериального цитолизина и пневмолизина. В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит конъюгат капсульного сахарида S. pneumoniae серотипа 22F. В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит конъюгат капсульного сахарида 3 S. pneumoniae. В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит конъюгат капсульного сахарида 6 А S. pneumoniae. В еще одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению 3 различных белка-носителя отдельно конъюгированы по меньшей мере с 3 различными капсульными сахаридами S. pneumoniae различных серотипов. В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит один или более чем один неконъюгированный или конъюгированный белок S. pneumoniae. В частности, указанный один или более чем один белок S. pneumoniae выбран из семейства полигистидиновых триад (PhtX), семейства белков, связывающих холин (CbpX), укороченных CbpX, семейства LytX, укороченных LytX, химерных белков укороченный CbpX - укороченный LytX, детоксифицированного пневмолизина (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 и Sp133. В конкретном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит пневмолизин в виде свободного белка или белка-носителя. В другом конкретном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит белок PhtX в виде свободного белка или белка-носителя. В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит адъювант. Согласно настоящему изобретению также предложена вакцина для лечения или предупреждения заболевания, вызванного инфекцией Streptococcus pneumoniae, включающая иммуногенную композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Согласно настоящему изобретению также предложен способ изготовления вакцины по изобретению, включающий стадию смешивания иммуногенной композиции по изобретению с фармацевтически приемлемым эксципиентом. Краткое описание графических материалов Фиг. 1. Иммуногенность конъюгата у пожилых макак-резусов (уровни пост-II анти-PS IgG). Гистограмма, показывающая иммуногенность 11-валентного конъюгата у пожилых макак резусов. Более светлыми столбиками представлена ГСК (геометрическая средняя концентрация) после двух инокуляций 11-валентным конъюгатом в адъюванте, представляющем собой фосфат алюминия. Более темными столбиками представлена ГСК после двух инокуляций 11-валентным конъюгатом в адъюванте С. Фиг. 2. Иммуногенность конъюгата у пожилых макак-резусов (частоты В-клеток памяти пост-II анти-PS3). Гистограмма, показывающая В-клетки памяти для PS3 после инокуляции 11-валентным конъюгатом в адъюванте С или в адъюванте, представляющем собой фосфат алюминия. Фиг. 3. Иммуногенность PS19F у мышей Balb/c (уровни пост-Ill IgG). Гистограмма, показывающая иммуногенность против полисахарида 19F у мышей Balb/C для 4 валентных несмешанных полисахаридов и 4-валентных конъюгатов dPIy. Фиг. 4. Иммуногенность PS22F у мышей Balb/c (уровни пост-Ill IgG). Гистограмма, показывающая иммуногенность против полисахарида 22F у мышей Balb/C для 4 валентных несмешанных полисахаридов и 4-валентных конъюгатов PhtD. Фиг. 5. Сывороточные уровни антитела анти-PS IgG. Гистограмма, показывающая ответ анти-22F IgG у мышей Balb/c. Фиг. 6. Опсонофагоцитарные титры анти-22F у мышей Balb/c. Гистограмма, показывающая опсонофагоцитарные титры анти-22F у мышей Balb/c. Фиг. 7. Сравнение ответов IgG, индуцированных у молодых мышей C57BI после III иммунизации с новыми адъювантами или AlPO4. Гистограмма, сравнивающая ответы IgG, индуцированные у молодых мышей C57BI после иммунизации 13-валентной конъюгатной вакциной, включенной в препарат в различных адъювантах. Столбики находятся в том же порядке, который указан в правой колонке. Фиг. 8. Протективная эффективность комбинации белков PhtD и dPIy против колонизации легких типом 19F у макак-резусов. Гистограмма, показывающая протективную эффективность различных комбинаций вакцин в модели пневмонии макак. Категория "умершие" включает макак, которые умерли бы, если бы не введение терапии антибиотиками. Фиг. 9. Ответ сывороточного анти-PhtD IgG. Гистограмма, показывающая ответ анти-PhtD IgG у мышей Balb/c после иммунизации конъюгатами 22F-PhtD или 22F-AH-PhtD. Фиг. 10. Защита против контрольного заражения пневмококком типа 4 у мышей. Защита против контрольного заражения пневмококком типа 4 у мышей после иммунизации 22FPhtD или 22F-AH-PhtD. Фиг. 11. Защита против летального контрольного заражения штаммом 3/43 S. pneumoniae после иммунизации PhtD и пассивной иммунизации антителами против полисахарида серотипа 3. Фиг. 12. Защита против летального контрольного заражения штаммом 1/57 S. pneumoniae после иммунизации PhtD и пассивной иммунизации антителами против полисахарида серотипа 1. Фиг. 13. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19 А у пожилых мышей C57Black, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Фиг. 14. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22F у пожилых мышей C57Black, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Фиг. 15. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19 А у мышей Balb/c, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Столбик 2 - 11V + 19A-dPly gmbs + 22F-PhtD 0,1 мкг/50 мкл; столбик 4 - 11V + 19A-dPlygmbs + 22F-PhtD-E 0,1 мкг/50 мкл; столбик 62 - 11V + 19A-DT + 22F-PD 0,1 мкг/50 мкл. Фиг. 16. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22F у мышей Balb/c, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Фиг. 17. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19 А у морских свинок, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Фиг. 18. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22F у морских свинок, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Фиг. 19. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19 А у мышей Balb/c, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Фиг. 20. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22F у мышей Balb/c, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Фиг. 21. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19 А у мышей OF1, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Фиг. 22. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22F у мышей OF1, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Подробное описание изобретения Термин "капсульный сахарид" включает капсульные полисахариды и олигосахариды, производные от капсульного полисахарида. Олигосахарид содержит по меньшей мере 4 сахарных остатка. Термины"конъюгат" и "конъюгированный" относятся к капсульному сахариду, ковалентно связанному с белкомносителем. Для целей данного изобретения "иммунизация человека-хозяина против обострений ХОБЛ (хроническая обструктивная болезнь легких)", либо "лечение или предупреждение обострений ХОБЛ", либо"уменьшение тяжести обострений ХОБЛ" относится к снижению заболеваемости или частоты обострений ХОБЛ (например, снижение частоты на 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20% или более), например, в пределах группы пациентов, иммунизированных композициями или вакцинами по изобретению. Термин "бактериальный анатоксин" включает бактериальные токсины, которые инактивированы либо за счет генетической мутации, либо химической обработкой, либо конъюгацией. Пригодные бактериальные анатоксины включают столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, коклюшный анатоксин, бактериальные цитолизины или пневмолизин. Описаны мутации пневмолизина (Ply), которые снижают токсичность пневмолизина (WO 90/06951, WO 99/03884). Подобным образом, известны генетические мутации дифтерийного токсина, которые снижают его токсичность (см. ниже). Генетически детоксифицированные аналоги дифтерийного токсина включают CRM197 и другие мутации, описанные в US 4709017, US 5843711, US 5601827 и US 5917017. CRM197 представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но она иммунологически неотличима от дифтерийного токсина. CRM197 продуцируется С. diphtheriae при инфекции нетоксигенной фазой 197tox-, образованной в результате мутагенеза нитрозогуанидином токсигенного коринефага b (Uchida et al. Nature New Biology (1971) 233; 8-11). Белок CRM197 имеет такую же молекулярную массу, как дифтерийный токсин, но отличается от него единственной заменой основания в структурном гене. Это приводит к замене аминокислоты глицина на глутамин в положении 52, которая образует фрагмент А, неспособный связывать NAD и, следовательно, нетоксичный (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983, p. 560-564). Первый и второй бактериальный анатоксин могут быть одинаковыми или разными. Где первый и второй бактериальный анатоксин являются разными, это означает, что они имеют различные аминокислотные последовательности. Например, 19 А и 19F могут быть конъюгированы со столбнячным анатоксином и столбнячным анатоксином; дифтерийным анатоксином и дифтерийным анатоксином; CRM197 и CRM197, пневмолизином и пневмолизином, столбнячным анатоксином и дифтерийным анатоксином; столбнячным анатоксином иCRM197; столбнячным анатоксином и пневмолизином; дифтерийным анатоксином и столбнячным анатоксином; дифтерийным анатоксином и CRM197, дифтерийным анатоксином и пневмолизином; CRM197 и столбнячным анатоксином, CRM197 и дифтерийным анатоксином; CRM197 и пневмолизином; пневмолизином и столбнячным анатоксином; пневмолизином и дифтерийным анатоксином или пневмолизином и CRM197 соответственно. Иммуногенная композиция по изобретению содержит 7 или 8 конъюгатов капсульных сахаридов, в которых белок D является белком-носителем. Например, сахарид из серотипа 1, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 9V,14, 18 С, 19 А, 19F, 22F или 23F конъюгирован с белком D. Например, 7 или 8 сахаридов, выбранных из серотипа 1, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19 А, 19F, 22F и 23F, конъюгированы с белком D. В одном воплощении половина либо меньше половины конъюгатов капсульных сахаридов, присутствующих в иммуногенной композиции по изобретению, содержит белок D в качестве белка-носителя. Например, в 14-валентной вакцине S. pneumoniae 7 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком D. Например, в 15-валентной вакцине S. pneumoniae 7 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком D. Например, в 16-валентной вакцине S. pneumoniae 7 или 8 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком D. Например, в 17 валентной вакцине S. pneumoniae 7 или 8 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком D. Например, в 18-валентной вакцине S. pneumoniae 7 или 8 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком D. Например, в 19-валентной вакцине S. pneumoniae 7 или 8 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком D. Возможно, серотипы, конъюгированные с белком D, выбраны из групп, описанных выше. Типично вакцина Streptococcus pneumoniae по настоящему изобретению содержит капсульные сахаридные антигены (возможно конъюгированные), где сахариды имеют происхождение по меньшей мере от одиннадцати серотипов S. pneumoniae. Число капсульных сахаридов S. pneumoniae может находиться в диапазоне от 11 различных серотипов (или "v", валентностей) до 23 различных серотипов (23v). В одном воплощении присутствует 11, 12, 13, 14 или 15 различных серотипов. В другом воплощении изобретения вакцина может содержать конъюгированные сахариды S. pneumoniae и неконъюгированные сахариды S. pneumoniae. Возможно, общее число сахаридных серотипов меньше или равно 23. Например, вакцина может содержать 11, 12, 13, 14 или 16 конъюгированных сахаридов и 12, 11, 10, 9 или 7 неконъюгированных сахаридов соответственно. В одном воплощении поливалентная пневмококковая вакцина по изобретению выбрана из приведенных ниже серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 A, 12F, 14, 15, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20,22F, 23F и 33F, хотя понятно, что один или два серотипа могут быть заменены в зависимости от возраста реципиента, получающего вакцину, и от географического положения, где вводят вакцину. Например, 11 валентная вакцина может также включать сахариды из серотипа 3 или 19 А. 12- или 13-Валентная педиатрическая (детская) вакцина может также включать 11-валентный препарат (содержащий сахарид из серотипа 3) с добавлением серотипов 6 А и 19 А, либо 6 А и 22F, либо 19 А и 22F, либо 6 А и 15, либо 19 А и 15, либо 22F и 15, тогда как 13-валентная вакцина для пожилых может включать 11-валентный препарат с добавлением серотипов 19 А и 22F, 8 и 12F, либо 8 и 15, либо 8 и 19 А, либо 8 и 22F, либо 12F и 15, либо 12F и 19 А, либо 12F и 22F, либо 15 и 19 А, либо 15 и 22F. В следующем воплощении изобретения включают по меньшей мере 12 или 13 сахаридных антигенов, например, вакцина может включать капсульные сахариды, имеющие происхождение из серотипов 1,3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19 А, 19F и 23F или капсулыные сахариды, имеющие происхождение из серотипов 1, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19 А, 19F, 22F и 23F, хотя дополнительные сахаридные антигены,например, 23-валентные (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11A, 12F, 14, 15, 17F,18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F), также рассмотрены изобретением. Иммуногенная композиция по настоящему изобретению содержит белок D (PD) из Haemophilus influenzae (см., например, ЕР 0594610 фиг. 9). Haemophilus influenzae является ключевым организмом-4 020817 возбудителем среднего отита, и авторы настоящего изобретения показали, что включение данного белка в вакцину Streptococcus pneumoniae обеспечит уровень защиты против среднего отита, обусловленногоHaemophilus influenzae (Pyrmula et al. Lancet 367; 740-748 (2006. Белок D может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. В следующем аспекте белок D присутствует и в качестве белка-носителя, и в виде свободного белка. Белок D можно использовать в виде полноразмерного белка или в виде фрагмента (WO 0056360). В следующем аспекте белок D присутствует в качестве белканосителя для большинства сахаридов, например, 7 или 8 сахаридов может быть конъюгировано с белкомD. В данном аспекте белок D может также присутствовать в виде свободного белка. Каждый тип белка-носителя может действовать в качестве носителя более чем для одного сахарида,где эти сахариды могут быть одинаковыми или разными. Например, серотипы 3 и 4 могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с различными молекулами одного и того же белка-носителя. В одном воплощении два или более чем два различных сахарида могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с различными молекулами одного и того же белка-носителя. Любые капсульные сахариды Streptococcus pneumoniae, присутствующие в иммуногенной композиции по изобретению помимо 19 А и 19F, могут быть конъюгированы с белком-носителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С ТТ, PhtD, PhtBE или слитых PhtDE(в частности, тех, которые описаны в WO 01/98334 и WO 03/54007), детоксифицированного пневмолизина и белка D. Более полный перечень белков-носителей, которые можно использовать в конъюгатах по изобретению, представлен ниже. Белок-носитель, конъюгированный с одним или более чем одним капсульным сахаридом Streptococcus pneumoniae в конъюгатах, присутствующих в иммуногенных композициях по изобретению, возможно является членом семейства полигистидиновых триад (Pht) белков, их фрагментов или слитых белков. Белки PhtA, PhtB, PhtD или PhtE могут иметь аминокислотную последовательность, обладающую 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичностью с последовательностью, раскрытой в WO 00/37105 илиWO 00/39299 (например, с аминокислотной последовательностью 1-838 или 21-838 SEQ ID NO: 4 WO 00/37105 для PhtD). Например, слитые белки состоят из полноразмерных белков или фрагментов 2, 3 или 4 из PhtA, PhtB, PhtD, PhtE. Примерами слитых белков являются PhtA/B, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/A, PhtB/D,PhtB/E. PhtD/A. PhtD/B, PhtD/E, PhtE/A, PhtE/B и PhtE/D, где белки сшиты с упомянутым первым белком при N-конце (см., например, WO 01/98334). При использовании фрагментов белков Pht (отдельно или в виде части слитого белка) каждый фрагмент содержит один или более чем один мотив гистидиновой триады и/или суперспирализованные участки таких полипептидов. Мотив гистидиновой триады представляет собой участок полипептида,который имеет последовательность НххНхН, где Н представляет собой гистидин и х представляет собой аминокислоту, отличную от гистидина. Суперспирализованный участок представляет собой участок,предсказанный алгоритмом "Спирали" Lupus, A. et al. (1991), Science 252; 1162-1164. В воплощении фрагмент или каждый фрагмент включает один или более чем один мотив гистидиновой триады, а также по меньшей мере один суперспирализованный участок. В воплощении фрагмент или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 мотивов гистидиновой триады (возможно с нативной последовательностью Pht между 2 или более чем двумя триадами, либо последовательность между триадами, которая более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100% идентична нативной пневмококковой последовательности Pht между триадами, например, последовательности между триадами, показанной в SEQ IDNO: 4 WO 00/37105 для PhtD). В воплощении фрагмент или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3 или 4 суперспирализованных участка. В воплощении белок Pht, раскрытый в данном изобретении, содержит полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот при Nконце), природные варианты белка Pht и иммуногенные фрагменты белка Pht (например, фрагменты,которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 непрерывных аминокислот из аминокислотной последовательности в WO 00/37105 (SEQ ID NO: 4, 6, 8 или 10) или WO 00/39299 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 или 14), где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный для указанной аминокислотной последовательности в WO 00/37105 или WO 00/39299. В частности, термин "PhtD", при использовании здесь, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот при N-конце), природные варианты белка Pht и иммуногенные фрагменты белка Pht (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 непрерывных аминокислот из аминокислотной последовательности в WO 00/37105 (SEQ ID NO: 4, 6, 8 или 10) или WO 00/39299 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 или 14), где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный для указанной аминокислотной последовательности в WO 00/37105 или WO 00/39299 (например, SEQ ID NO: 4 WO 00/37105 или SEQ ID NO: 14WO 00/39299 для PhtD). Все вышеупомянутые формы PhtD можно использовать в настоящем изобретении. Если белок-носитель является одним и тем же для 2 или более чем двух сахаридов в композиции,эти сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белка-носителя (молекулы носителя, с которыми конъюгировано 2 или более чем два различных сахарида) [см., например, WO 04/083251]. Альтернативно сахариды могут быть каждый по отдельности конъюгированы с различными молекулами белка-носителя (каждая молекула белка-носителя, с которой конъюгирован только один тип сахарида). Примерами белков-носителей, которые можно использовать в настоящем изобретении, являютсяDT), другие точечные мутации DT, такие как CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 и CRM107 и другие мутации, описанные Nicholls и Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делеция или мутация Glu148 на Asp, Gln или Ser и/или Ala 158 на Gly и другие мутации, раскрытые в US 4709017 или US 4950740; мутация по меньшей мере одного или более чем одного остатка Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и другие мутации, раскрытые в US 5917017 или US 6455673; или фрагмент, раскрытый в US 5843711,пневмококковый пневмолизин (Kuo et al. (1995), Infect Immun 63; 2706-13), включая ply, детоксифицированный каким-либо способом, например dPLY-GMBS (WO 04081515, РСТ/ЕР 2005/010258) или dPLYформол, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE и слитые белки Pht, например слитые белки PhtDE, слитые белки PhtBE (WO 01/98334 и WO 03/54007) (Pht A-E более подробно описаны ниже), ОМРС (менингококковый наружный мембранный белок, обычно выделенный из N. meningitidis серогруппы В - ЕР 0372501), PorB (от N. meningitidis), PD (белок D Haemophilus influenzae - см., например, ЕР 0594610 В) или его иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), коклюшные белки (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (WO 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные эпитопы Т клеток человека CD4+ от различных антигенов патогенного происхождения (Falugi et al. (2001), Eur J. Immunol 31; 3816-3824), такие как белок N19 (Baraldoi et al. (2004),Infect Immun 72; 4884-7), пневмококковый поверхностный белок PspA (WO 02/091998), белки накопления железа (WO 01/72337), токсин А или В С. difficile (WO 00/61761). Авторы Nurkka et al. Pediatric Infectious Disease Journal. 23(11): 1008-14, 2004 Nov. описали 11 валентную пневмококковую вакцину со всеми серотипами, конъюгированными с PD. Однако авторы настоящего изобретения показали, что опсонофагоцитарная активность была улучшена для антител, индуцированных конъюгатами, в которых 19F конъюгирован с DT, по сравнению с 19F, конъюгированным с PD. Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что большую перекрестную реактивность 19 А наблюдают с 19F, конъюгированным с DT. Следовательно, признаком композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19F конъюгирован с бактериальным анатоксином, например ТТ,пневмолизином, DT или CRM197. В одном аспекте серотип 19F конъюгирован с DT. Признаком изобретения также является то, что серотип 19 А конъюгирован с бактериальным анатоксином, например ТТ,пневмолизином, DT или CRM197. Остальные серотипы сахаридов иммуногенной композиции могут быть все конъюгированы с одним или более чем одним белком-носителем, который не представляет собой DT (т.е. только 19F конъюгирован с DT), или могут быть распределены между одним или более чем одним белком-носителем, который не представляет собой DT, и самим DT. В одном воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD и ТТ, либо DT, либоCRM197. В следующем воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, и не более чем один сахарид конъюгирован с ТТ. В одном аспекте данного воплощения указанный один сахарид представляет собой 18 С или 12F. В следующем воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, и не более чем два сахарида конъюгировано с ТТ. В следующем воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ и DT или CRM197. В следующем воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ и пневмолизином. В следующем воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ иCRM197. В следующем воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ, пневмолизином и возможно PhtD или слитым белком PhtD/E. В следующем воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, 19 А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ, пневмолизином и возможно PhtD или слитым белкомPhtD/E. В следующем воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, 19 А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, один дополнительный сахарид конъюгирован с ТТ, один дополнительный сахарид конъюгирован с PhtD или PhtD/E, а все другие сахариды конъюгированы с PD. В следующем воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, 19 А конъюгирован с пневмолизином, один дополнительный сахарид конъюгирован с ТТ, один дополнительный сахарид конъюгирован с пневмолизином, 2 дополнительных сахарида конъюгировано с PhtD или PhtD/E, и все другие сахариды конъюгированы с PD. Термин "сахарид" везде в данном описании может означать полисахарид или олигосахарид и включает оба. Полисахариды выделяют из бактерий, и они могут быть до некоторой степени отсортированы по размеру известными способами (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525) и возможно путем микрофлюидизации. Полисахариды могут быть отсортированы по размеру с целью уменьшения вязкости в полисахаридных образцах и/или улучшения фильтруемости конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют низкое число повторяющихся звеньев (типично 5-30 повторяющихся звеньев) и типично представляют собой гидролизованные полисахариды. Капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae содержат повторяющиеся олигосахаридные звенья, которые могут содержать вплоть до 8 сахарных остатков. Обзор олигосахаридных звеньев для ключевых серотипов Streptococcus pneumoniae см. в JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surfaceISSN 0001-3765. В одном воплощении капсульный сахаридный антиген может представлять собой полноразмерный полисахарид, однако, в других он может представлять собой одно олигосахаридное звено или более короткую цепь, чем сахарид нативной длины, повторяющихся олигосахаридных звеньев. В одном воплощении все сахариды, присутствующие в вакцине, представляют собой полисахариды. Полноразмерные полисахариды могут быть "отсортированы по размеру", т.е. их размер может быть уменьшен различными способами, такими как обработка кислотным гидролизом, обработка пероксидом водорода, сортировка по размеру Emulsiflex с последующей обработкой пероксидом водорода с получением олигосахаридных фрагментов, или микрофлюидизация. Авторы изобретения также отметили, что данная область техники сосредоточена на использовании олигосахаридов для легкости получения конъюгата. Авторы изобретения обнаружили, что путем использования конъюгатов нативных или слегка отсортированных по размеру полисахаридов можно реализовать одно или более чем одно из приведенных ниже преимуществ: 1) конъюгат, обладающий высокой иммуногенностью, который является фильтруемым, 2) отношение полисахарида к белку в конъюгате может быть изменено таким образом, что отношение полисахарида к белку (мас./мас.) в конъюгате можно увеличить (что может воздействовать на эффект супрессии носителя), 3) иммуногенные конъюгаты,склонные к гидролизу, можно стабилизировать путем использования для конъюгации сахаридов большего размера. Использование полисахаридов большего размера может привести в результате к большему сшиванию с носителем конъюгата и может уменьшить высвобождение свободного сахарида из конъюгата. Конъюгатные вакцины, описанные на уровне техники, имеют тенденцию к деполимеризации полисахаридов перед конъюгацией в целях улучшения конъюгации. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вакцины на основе сахаридных конъюгатов, сохраняющие больший размер сахарида, могут обеспечить хороший иммунный ответ против пневмококкового заболевания. Иммуногенная композиция по изобретению может, таким образом, содержать один или более чем один сахаридный конъюгат, где средний размер (средневесовая молекулярная масса; Mw) каждого сахарида перед конъюгацией выше 80, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 Да. В одном воплощении конъюгат после конъюгации должен быть легко фильтруемым через 0,2-микронный фильтр, так что после фильтрования получают выход более чем 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с образцом до фильтрования. Для целей настоящего изобретения "нативный полисахарид" относится к сахариду, который не подвергнут процессу, целью которого является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может слегка уменьшиться в размере во время обычных процедур очистки. Такой сахарид является по-прежнему нативным. Только если полисахарид подвергнут методикам сортировки по размеру, этот полисахарид не следует считать нативным. Размер нативного полисахарида составляет, например, 250-2000 кДа, 4001500 кДа, 750-1250 кДа, 300-600 кДа, 500-1000 кДа или 1000-1500 кДа, где различные серотипы имеют разные размеры нативного полисахарида, что должно быть понятно специалисту в данной области техники. Для целей настоящего изобретения "отсортирован по размеру с коэффициентом вплоть до х 2" означает, что сахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера сахарида, но сохранения размера, составляющего более половины размера нативного полисахарида. х 3, х 4 и т.д. следует интерпретировать таким же образом, сахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера сахарида, но сохранения размера, составляющего более трети, четверти и т.д. размера нативного полисахарида. В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды Streptococcus pneumoniae по меньшей мере от 11 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или каждый сахарид S. pneumoniae представляет собой нативный полисахарид. В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды Streptococcus pneumoniae по меньшей мере от 11 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или каждый сахарид S. pneumoniae отсортирован по размеру с коэффициентом х 2, х 3, х 4,х 5, х 6, х 7, х 8, х 9 или х 10. В одном воплощении данного аспекта большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или более, отсортировано по размеру с коэффициентом вплоть до х 2, х 3, х 4, х 5, х 6, х 7, х 8, х 9 или х 10. Молекулярная масса или средняя молекулярная масса сахарида здесь относится к средневесовой молекулярной массе (Mw) сахарида, измеренной до конъюгации, и ее измеряют с помощью MALLS(рассеивания лазерного излучения с кратными углами). Методика MALLS хорошо известна в данной области техники, и ее типично осуществляют, как описано в примере 2. Для анализа MALLS пневмококковых сахаридов можно использовать две колонки зуя детектор светорассеивания (например, Wyatt Dawn DSP, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и интерферометрический рефрактометр (например, Wyatt Otilab DSP, оборудованный ячейкой Р 100 и красным фильтром при 498 нм). В одном воплощении сахариды S. pneumoniae представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, которые уменьшены в размере во время процесса обычной экстракции. В одном воплощении сахариды S. pneumoniae сортируют по размеру путем механического расщепления, например, с помощью микрофлюидизации или обработки ультразвуком. Микрофлюидизация и обработка ультразвуком обладают преимуществами в том, что уменьшение размера нативных полисахаридов большего размера достаточно для получения фильтруемого конъюгата. Сортировка по размеру происходит с коэффициентом не более чем х 20, х 10, х 8, х 6, х 5, х 4, х 3 или х 2. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит конъюгаты S. pneumoniae, которые получены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, которые отсортированы по размеру с коэффициентом не более чем х 20. В одном аспекте данного воплощения большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или более, отсортировано по размеру с коэффициентом х 2, х 3, х 4, х 5 или х 6. В одном воплощении сахарид Streptococcus pneumoniae конъюгирован с белком-носителем через линкер, например бифункциональный линкер. Линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имея, например, реакционную аминогруппу и реакционную группу карбоновой кислоты, 2 реакционные аминогруппы или две реакционные группы карбоновой кислоты. Линкер имеет,например, число атомов углерода между 4 и 20, 4 и 12, 5 и 10. Возможным линкером является дигидразид адипиновой кислоты (ADH). Другие линкеры включают В-пропионамидо (WO 00/10599), нитрофенилэтиламин (Gever et al. (1979), Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), галогениды галогеноалкилов(US 4057685), гликозидные линкеры (US 4673574, US 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (US 4459286). В одном воплощении ADH используют в качестве линкера для конъюгации сахарида из серотипа 18 С. Сахаридные конъюгаты, присутствующие в иммуногенных композициях по изобретению, могут быть получены с помощью любой известной методики сочетания. Способ конъюгации может быть основан на активации сахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP) с образованием эфира цианата. Активированный сахарид можно, таким образом, подвергать сочетанию непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию с носителем через тиоэфирную связь, полученную после взаимодействия с белком-носителем, активированным малеимидом (например, используя малеимидобутирилоксисукцинимидный эфир (GMBS, или галогеноацетилированным белком-носителем (например, используя йодацетамид [например, этилйодацетамид HCl], либо N-сукцинимидилбромацетат, либо Nсукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоат (SIAB), либо N-сукцинимидилйодацетат (SIA), либо сукцинимидил-(3-бромацетамидо)пропионат (SBAP. Возможно цианатный эфир (возможно полученный с помощью химии CDAP) подвергают сочетанию с гександиамином или ADH, и аминопроизводное сахарида конъюгируют с белком-носителем, используя химию карбодиимидов (например, 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимид (EDAC или EDC, посредством карбоксильной группы на белкеносителе, такие конъюгаты описаны в опубликованной заявке РСТ WO 93/15760 Uniformed Services University, а также WO 95/08348 и WO 96/29094. Другие пригодные методики включают карбодиимиды, карбиниды, гидразиды, активные эфиры,норборнан, паранитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, тетрафторборат О-(Nсукцининимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония (TSTU). Многие описаны в WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может быть образован путем взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (Bethell et al. J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al. J. Chromatogr. 1981, 218; 509-18) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление апомерного конца до первичной гидроксильной группы, возможную защиту/удаление защиты первичной гидроксильной группы взаимодействием первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке. Конъюгаты могут быть также получены способами прямого восстановительного аминирования, как описано в US 4365170 (Jennings) и US 4673574 (Anderson). Другие способы описаны в ЕР 0161188, ЕР 208375 и ЕР 0477508. Следующий способ включает сочетание сахарида, активированного цианогенбромидом (илиCDAP), преобразованного гидразидом адипиновой кислоты (ADH), с белком-носителем путем карбодиимидной конденсации (Chu С. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256), например, используя EDAC. В одном воплощении гидроксильную группу (возможно активированную гидроксильную группу,например гидроксильную группу, активированную с получением цианатного эфира [например, используя CDAP]) на сахариде подвергают сочетанию с амино- или карбоксильной группой на белке либо прямо, либо косвенно (посредством линкера). Где присутствует линкер, гидроксильную группу на сахариде возможно подвергают сочетанию с аминогруппой на линкере, например, путем использования конъюга-8 020817 ции CDAP. Следующую аминогруппу в линкере, например, ADH, можно конъюгировать с группой карбоновой кислоты на белке, например, путем использования химии карбодиимидов, например, путем использования EDAC. В воплощении пневмококковый капсульный сахарид(ы) сначала конъюгируют с линкером, после чего линкер конъюгируют с белком-носителем. Альтернативно линкер может быть конъюгирован с носителем перед конъюгацией с сахаридом. Можно также использовать комбинацию методик, где некоторые сахаридно-белковые конъюгаты получают с помощью CDAP, а некоторые путем восстановительного аминирования. Как правило, приведенные ниже типы химических групп на белке-носителе можно использовать для сочетания/конъюгации.A) Карбоксил (например, через аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту). В одном воплощении эту группу подвергают сочетанию с аминогруппами прямо на сахаридах или с аминогруппой на линкере с помощью химии карбодиимидов, например с EDAC. Б) Аминогруппу (например, через лизин). В одном воплощении эту группу подвергают сочетанию с карбоксильными группами прямо на сахаридах или с карбоксильной группой на линкере с помощью химии карбодиимидов, например с EDAC. В другом воплощении эту группу подвергают сочетанию с гидроксильными группами, активированными CDAP или CNBr, прямо на сахаридах или с такими группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами,имеющими группу эфира сукцинимида.B) Сульфгидрил (например, через цистеин). В одном воплощении эту группу подвергают сочетанию с бром- или хлорацетилированными сахаридами или линкерами с помощью химии малеимида. В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином. Г) Гидроксильную группу (например, через тирозин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином. Д) Имидазолильную группу (например, через гистидин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином. Е) Гуанидильную группу (например, через аргинин). Ж) Индолильную группу (например, через триптофан). На сахариде, как правило, для сочетания можно использовать приведенные ниже группы: ОН, СООН или NH2. Альдегидные группы можно образовать после различных обработок, известных в данной области техники, таких как периодат, кислотный гидролиз, пероксид водорода и т.д. Примечание: вместо вышеуказанного EDAC можно использовать любой подходящий карбодиимид. В итоге, типы химической группы белка-носителя, которые можно, как правило, использовать для сочетания с сахаридом, представляют собой аминогруппы (например, на остатках лизина), группы СООН (например, на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислоты) и группы SH (если доступны) (например, на остатках цистеина). Возможно отношение белка-носителя к сахариду S. pneumoniae составляет от 1:5 до 5:1; от 1:2 до 2,5:1; от 1:1 до 2:1 (мас./мас.). В одном воплощении большинство конъюгатов, например 6, 7, 8, 9 или большее число конъюгатов, имеет отношение белка-носителя к сахариду, которое выше чем 1:1, например 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 или 1,6:1. В одном воплощении по меньшей мере один сахарид S. pneumoniae конъюгирован с белкомносителем посредством линкера, используя CDAP и EDAC. Например, 18 С может быть конъюгирован с белком посредством линкера (например, линкеров с двумя группами гидразино на их концах, таких какADH), используя CDAP и EDAC, как описано выше. Когда используют линкер, CDAP можно использовать для конъюгации сахарида с линкером, и EDAC можно затем использовать для конъюгации линкера с белком, либо альтернативно EDAC можно использовать сначала для конъюгации линкера с белком,после чего можно использовать CDAP для конъюгации линкера с сахаридом. Как правило, иммуногенная композиция по изобретению может содержать дозу каждого сахаридного конъюгата от 0,1 до 20 мкг, от 1 до 10 мкг или от 1 до 3 мкг сахарида. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит каждый капсульный сахарид S. pneumoniae в дозе 0,1-20 мкг; 0,5-10 мкг; 0,5-5 мкг или 1-3 мкг сахарида. В воплощении капсульные сахариды могут присутствовать в различных дозировках, например, некоторые капсульные сахариды могут присутствовать в дозе примерно или точно 1 мкг, либо некоторые капсульные сахариды могут присутствовать в дозе примерно или точно 3 мкг. В одном воплощении сахариды от серотипов 3,18 С и 19F (или 4, 18 С и 19F) присутствуют в более высокой дозе, чем другие сахариды. В одном аспекте данного воплощения серотипы 3, 18 С и 19F (или 4, 18 С и 19F) присутствуют в дозе примерно или точно 3 мкг, тогда как другие сахариды в иммуногенной композиции присутствуют в дозе примерно или точно 1 мкг."Около" или "примерно" для целей изобретения определяют как в пределах 10% более или менее данной цифры. В одном воплощении по меньшей мере один из капсульных сахаридов S. pneumoniae прямо конъюгирован с белком-носителем. Возможно по меньшей мере один из капсульных сахаридов S. pneumoniae прямо конъюгирован с помощью CDAP. В одном воплощении большинство капсульных сахаридов, например 5, 6, 7, 8, 9 или более, прямо связывают с белком-носителем с помощью CDAP (см. WO 95/08348 и WO 96/29094). Иммуногенная композиция может содержать белки Streptococcus pneumoniae, в данном изобретении называемые белками Streptococcus pneumoniae по изобретению. Такие белки можно использовать в качестве белков-носителей, либо они могут присутствовать в виде свободных белков, либо могут присутствовать и в качестве белков-носителей, и в виде свободных белков. Белки Streptococcus pneumoniae по изобретению либо представляют собой поверхностные белки, по меньшей мере, в течение части жизненного цикла пневмококка, либо представляют собой белки, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Возможно белки по изобретению выбраны из приведенных ниже категорий, таких как белки, имеющие мотив сигнальной последовательности типа II LXXC (где X представляет собой любую аминокислоту, например, семейства полигистидиновых триад (PhtX, белки, связывающие холин(CbpX), белки, имеющие мотив сигнальной последовательности типа I (например, Sp101), белки, имеющие мотив LPXTG (где X представляет собой любую аминокислоту, например Sp128, Sp130), и токсины(например, Ply). Примерами в пределах данных категорий (или мотивов) являются приведенные ниже белки или их иммунологически функциональные эквиваленты. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один белок, выбранный из группы, состоящей из семейства полигистидиновых триад (PhtX), семейства белков, связывающих холин (CbpX), укороченных вариантов CbpX, семейства LytX, укороченных вариантов(Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 и Sp133. В следующем воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более чем два белка, выбранных из группы, состоящей из семейства полигистидиновых триад (PhtX), семейства белков, связывающих холин (CbpX), укороченных вариантов CbpX, семейства LytX, укороченных вариантов LytX, химерных белков (или слитых белков) укороченный CbpX укороченный LytX, пневмолизина (Ply), PspA, PsaA и Sp128. Еще в одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более чем два белка, выбранных из группы, состоящей из семейства полигистидиновых триад (PhtX), семейства белков, связывающих холин (CbpX), укороченных вариантовCbpX - укороченный LytX, пневмолизина (Ply) и Sp128. Семейство Pht (полигистидиновых триад) включает белки PhtA, PhtB, PhtD и PhtE. Это семейство характеризуется последовательностью липидизации, двумя доменами, разделенными пролин-богатой областью, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно, вовлеченными в связывание металлов или нуклеозидов или ферментативной активностью, (3-5) суперспирализованными участками, консервативным N-концом и гетерогенным С-концом. Они присутствуют во всех протестированных штаммах пневмококков. Гомологичные белки также обнаружены в других Streptococci и Neisseria. В одном воплощении изобретения белок Pht по изобретению представляет собой PhtD. Понятно, однако, что термины Pht А, В, D и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных ниже ссылках, а также их встречающимся в природе (и полученным человеком) вариантам, которые обладают гомологией последовательности, которая составляет по меньшей мере 90% идентичности со стандартными белками. Возможно она является по меньшей мере на 95% идентичной или по меньшей мере на 97% идентичной. Что касается белков PhtX, PhtA раскрыт в WO 98/18930, и его также называют Sp36. Как отмечено выше, он представляет собой белок из семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив типа II LXXC. PhtD раскрыт в WO 00/37105, и его также называют Sp036D. Как отмечено выше, он представляет собой белок из семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив типа II LXXC.PhtB раскрыт в WO 00/37105, и его также называют Sp036B. Другим членом семейства PhtB является С 3 разлагающий полипептид, как раскрыто в WO 00/17370. Этот белок также является белком из семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив типа II LXXC. Например, иммунологически функциональным эквивалентом является белок Sp42, раскрытый в WO 98/18930. Укороченный PhtB (примерно 79 кД) раскрыт в WO 99/15675, и его также считают членом семейства PhtX. PhtE раскрыт в WO 00/30299, и его называют BVH-3. Где в данном изобретении ссылаются на любой белок Pht, это означает,что можно использовать его иммуногенные фрагменты или слитые белки Pht. Например, ссылка на PhtX включает его иммуногенные фрагменты из любого белка Pht или слитые белки. Ссылка на PhtD или PhtB также является ссылкой на слитые PhtDE или PhtBE, как раскрыто, например, в WO 0198334. Пневмолизин представляет собой многофункциональный токсин с отдельной цитолитической (ге- 11020817 молитической) активностью и активностью активации комплемента (Rubins et al., Am. Respi. Cit CareMed, 153:1339-1346 (1996. Этот токсин не секретируется пневмококками, но высвобождается при лизисе пневмококков под влиянием автолизина. Его эффекты включают, например, стимуляцию продуцирования воспалительных цитокинов моноцитами человека, ингибирование биения ресничек на респираторном эпителии человека и снижение бактерицидной активности и миграции нейтрофилов. Наиболее очевидным эффектом пневмолизина является лизис эритроцитов, в который вовлечено связывание с холестерином. Поскольку он представляет собой токсин, необходима его детоксификация (т.е. нетоксичность для человека при обеспечении в дозировке, пригодной для защиты) перед его введением in vivo. Экспрессия и клонирование пневмолизина дикого типа или нативного пневмолизина известны в данной области техники. См., например, Walker et al. (Infect Immun, 55:1184-1189 (1987, Mitchell et al. (BiochimBiophys Acta, 1007:67-72 (1989) и Mitchell et al. (NAR, 18:4010 (1990. Детоксификацию ply можно проводить химическими способами, например подвергать обработке формалином или глутаральдегидом,либо комбинации этих обработок (WO 04081515, РСТ/ЕР 2005/010258). Такие способы хорошо известны в данной области техники для различных токсинов. Альтернативно ply можно детоксифицировать генетическим путем. Таким образом, изобретение включает производные пневмококковых белков, которые могут представлять собой, например, мутированные белки. Термин "мутированный" используют здесь для обозначения молекулы, которая претерпела делецию, добавление или замену одной или более чем одной аминокислоты с использованием хорошо известных методик сайт-направленного мутагенеза или любого другого общепринятого способа. Например, как описано выше, мутантный белок ply может быть изменен таким образом, что он является биологически неактивным, при этом все же сохраняя его иммуногенные эпитопы, см., например, WO 90/06951, Berry et al. (Infect Immun, 67:981-985 (1999 и WO 99/03884. При использовании здесь, понятно, что термин "Ply" относится к мутированному или детоксифицированному пневмолизину, пригодному для медицинского применения (т.е. нетоксичному). Что касается семейства белков, связывающих холин (CbpX), члены этого семейства были исходно идентифицированы как пневмококковые белки, которые могут быть очищены аффинной хроматографией на холине. Все белки, связывающие холин, нековалентно связаны с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты клеточной стенки и мембраносвязанной липотейхоевой кислоты. Структурно они имеют несколько общих участков для всего семейства, хотя точная природа этих белков (аминокислотная последовательность, длина и т.д.) может варьировать. В целом белки, связывающие холин, содержат N-концевой участок (N), консервативные повторяющиеся участки (R1 и/или R2), участок, богатый пролином (Р), и консервативный участок связывания холина (С), состоящий из множественных повторов, который составляет примерно половину белка. Как используют в данном изобретении, термин"семейство белков, связывающих холин (CbpX)", выбран из группы, состоящей из белков, связывающих холин, которые идентифицированы в WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD и CbpG. CbpA раскрыт в WO 97/41151. CbpD и CbpG раскрыты в WO 00/29434. PspC раскрыт в WO 97/09994. PbcA раскрыт в WO 98/21337. SpsA представляет собой белок, связывающий холин, раскрытый в WO 98/39450. Возможно белки, связывающие холин, выбраны из группы, состоящей из CbpA, PbcA, SpsA и PspC. Одно воплощение изобретения включает укороченные варианты CbpX, где "CbpX" определен выше, и "укороченные варианты" относятся к белкам CbpX, в которых отсутствует 50% или более участка связывания холина (С). Возможно в таких белках полностью отсутствует участок связывания холина. Возможно, в таких укороченных вариантах белка отсутствует (1) участок связывания холина и (2) также часть N-концевой половины белка, но все же сохранен по меньшей мере один повторяющийся участок(R1 или R2). Возможно укороченный вариант имеет 2 повторяющихся участка (R1 и R2). Примерами таких воплощений являются NR1xR2 и R1xR2, как проиллюстрировано в WO 99/51266 или WO 99/51188, однако, другие белки, связывающие холин, в которых отсутствует подобная область связывания холина, также рассмотрены в пределах объема данного изобретения. Семейство LytX представляет собой мембраносвязанные белки, связанные с клеточным лизисом. Nконцевой домен включает домен(ы), связывающий холин, однако, семейство LytX не обладает всеми признаками, обнаруженными в семействе CbpA, отмеченными выше, и, следовательно, для настоящего изобретения семейство LytX рассматривают отдельно от семейства CbpX. В противоположность семейству CbpX С-концевой домен содержит каталитический домен семейства белков LytX. Это семейство включает LytA, В и С. В отношении семейства LytX, LytA раскрыт в Ronda et al., Eur J. Biochem, 164:621624 (1987). LytB раскрыт в WO 98/18930, и его также называют Sp46. LytC также раскрыт в WO 98/18930, и его также называют Sp91. Воплощение изобретения включает LytC. Другое воплощение включает укороченные варианты LytX, где "LytX" определен выше, и "укороченные варианты" относятся к белкам LytX, в которых отсутствует 50% или более участка связывания холина. Возможно в таких белках полностью отсутствует участок связывания холина. Еще одно другое воплощение данного изобретения включает химерные белки (или слитые белки) укороченный CbpX укороченный LytX. Возможно они включают NR1xR2 (или R1xR2) CbpX и С-концевой участок (Cterm,т.е. с отсутствующими доменами связывания холина) LytX (например, LytCCterm или Sp91Cterm). Возможно CbpX выбран из группы, состоящей из CbpA, PbcA, SpsA и PspC. Возможно он представляет собой CbpA. Возможно LytX представляет собой LytC (также называемый Sp91). Другое воплощение настоящего изобретения составляет укороченный вариант PspA илиPsaA, в котором отсутствует домен связывания холина (С), и он экспрессируется в виде слитого белка сLytX. Возможно LytX представляет собой LytC. Что касается PsaA и PspA, оба они известны в данной области техники. Например, PsaA и его трансмембранные делеционные варианты описаны BerryPaton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12):5255-62.PspA и его трансмембранные делеционные варианты раскрыты, например, в US 5804193, WO 92/14488 иSp128 и Sp130 раскрыты в WO 00/76540. Sp125 является примером поверхностного белка пневмококка с мотивом заякоривания в клеточной стенке LPXTG (где X представляет собой любую аминокислоту). Обнаружено, что любой белок в пределах данного класса поверхностных белков пневмококка с этим мотивом полезен в контексте данного изобретения, и, следовательно, его считают дополнительным белком по изобретению. Сам Sp125 раскрыт в WO 98/18930 и также известен как ZmpB, цинковая металлопротеиназа. Sp101 раскрыт в WO 98/06734 (где он имеет ссылкуу 85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью типа I. Sp133 раскрыт в WO 98/06734 (где он имеет ссылкуу 85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью типа I. Примерами белковых антигенов Moraxella catarrhalis, которые можно включать в комбинированную вакцину (в частности, для предупреждения среднего отита), являются ОМР 106 [WO 97/41731 (Antex) иWO 96/34960 (PMC)]; OMP21 или его фрагменты (WO 0018910); LbpA и/или LbpB [WO 98/55606OmplA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257) и OmpE. Примеры антигенов или их фрагментов нетипируемых штаммов Haemophilus influenzae, которые можно включать в комбинированную вакцину (в частности, для предупреждения среднего отита), включают белок фимбрин [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] и слитые белки, содержащие пептиды из него [например, слитые белки пептида(WO 94/12641); P2 и Р 5 (WO 94/26304). Белки по изобретению можно также полезно комбинировать. Под комбинированием подразумевают, что иммуногенная композиция включает все белки в пределах приведенных ниже комбинаций, либо в качестве белков-носителей, либо в виде свободных белков или смеси из двух белков. Например, в комбинации двух белков, как изложено здесь ниже, оба белка можно использовать в качестве белковносителей, либо оба белка могут присутствовать в виде свободных белков, либо оба могут присутствовать в качестве носителя и в виде свободного белка, либо один может присутствовать и в качестве белканосителя, и в виде свободного белка, тогда как другой присутствует только в качестве белка-носителя или только в виде свободного белка, либо один может присутствовать в качестве белка-носителя, а другой в виде свободного белка. Где приведена комбинация из трех белков, существуют подобные возможности. Комбинации включают, но не ограничены ими, PhtD + NR1xR2, PhtD + химерные или слитые белки NR1xR2-Sp91Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + химерные или слитые белки NR1xR2-Sp91Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA,NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA,R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Возможно NR1xR2 (или R1xR2) принадлежат CbpA или PspC. Возможно эти участки принадлежат CbpA. Другие комбинации включают комбинации 3 белков, такие как PhtD + NR1xR2 + Ply, и PhtA + NR1xR2 + PhtD. В одном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и PhtD или PhtDE в качестве белковносителей. В следующем воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и PhtD или PhtDE в виде свободных белков. В независимом аспекте в настоящем изобретении описана иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере четыре конъюгата капсульных сахаридов S. pneumoniae, включающих сахариды от различных серотипов S. pneumoniae, где по меньшей мере один сахарид конъюгирован с PhtD или его слитым белком, и иммуногенная композиция способна вызывать эффективный иммунный ответ противPhtD. Эффективный иммунный ответ против PhtD или его слитого белка измеряют, например, с помощью протективного анализа, такого как описан в примере 15. Эффективный иммунный ответ обеспечивает по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80 или 90% выживание через 7 суток после контрольного заражения гетерологичным штаммом. С учетом того, что штамм для контрольного заражения является гетерологичным,обеспечиваемая защита является следствием иммунного ответа против PhtD или его слитого белка. Альтернативно эффективный иммунный ответ против PhtD измеряют с помощью ELISA, как описано в примере 14. Эффективный иммунный ответ дает ответ анти-PhtD IgG по меньшей мере 250, 300,350, 400, 500, 550 или 600 мкг/мл ГСК. Например, в иммуногенной композиции по меньшей мере 3, 4, 5 или 6 капсульных сахаридов S.pneumoniae от различных серотипов конъюгированы с PhtD или его слитым белком. Например, серотипы 22F и 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, дополнительно выбранные из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А,11 А, 12F, 14, 15, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 23F и 33F, конъюгированы с PhtD. В воплощении два или три из серотипов 3, 6 А и 22F конъюгированы с PhtD или его слитым белком. В одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению капсульные сахариды S. pneumoniae конъюгированы с PhtD или его слитым белком посредством линкера, например ADH. В одном воплощении используют один из химических способов конъюгации, описанных ниже. В одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению, где капсульные сахариды S.pneumoniae конъюгированы с PhtD или его слитым белком, отношение PhtD к сахариду в конъюгате составляет от 6:1 до 1:5, от 6:1 до 2:1, от 6:1 до 2,5:1, от 6:1 до 3:1, от 6:1 до 3,5:1 (мас./мас.) или выше (т.е. содержит большую долю PhtD) 2,0:1, 2,5:1, 3,0:1, 3,5:1 или 4,0:1 (мас./мас.). В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит пневмолизин. Далее в настоящем изобретении предложена вакцина, содержащая иммуногенные композиции по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Вакцины по настоящему изобретению могут содержать адъюванты, в частности, когда они предназначены для применения у пожилого населения, а также для применения у детей младшего возраста. Пригодные адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия, либо фосфат алюминия, либо квасцы, но могут также представлять собой соли других металлов, такие как соли кальция, магния, железа или цинка, либо могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионных или анионных производных сахаридов или полифосфазенов. Адъювант возможно выбран таким образом, что является преимущественным индуктором ТН 1 типа ответа. Такие высокие уровни цитокинов Th1-типа склонны способствовать индукции клеточноопосредованных иммунных ответов на данный антиген, тогда как высокие уровни цитокинов Th2-типа склонны способствовать индукции гуморальных иммунных ответов на антиген. Различие иммунного ответа Th1 и Th2-типа не является абсолютным. В действительности индивидуум должен поддерживать иммунный ответ, который описан как преимущественно Th1 или преимущественно Th2. Однако часто удобно рассматривать семейства цитокинов относительно тех, которые описаны в мышиных Т-клеточных клонах CD4 +ve Mosmann и Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L.(Annual Review of Immunology, 7, p. 145-173. Традиционно ответы Th1-типа связаны с продуцированием цитокинов ИФН- и ИЛ-2 Т-лимфоцитами. Другие цитокины, часто непосредственно связанные с индукцией иммунных ответов Th1-типа, не продуцируются Т-клетками, такие как ИЛ-12. Напротив, ответыTh2-типа связаны с секрецией ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10. Пригодные адъювантные системы, которые стимулируют преимущественно Th1 ответ, включают монофосфориллипид А или его производное (или детоксифицированный липид А в целом, см., например, WO 2005107798), в частности 3-де-Оацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) (его получение см. в GB 2220211 А); и комбинация монофосфориллипида А, возможно 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А, вместе либо с солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия), либо эмульсией масло-вводе. В таких комбинациях антиген и 3D-MPL содержатся в одних и тех же структурах в виде частиц,что дает возможность более эффективной доставки антигенного и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3D-MPL способен дополнительно усиливать иммуногенность антигена, адсорбированного на квасцах [Thoelen et al. Vaccine (1998), 16:708-14; ЕР 689454-B1]. Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию QS21 и 3D-MPL, как раскрыто в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 погашен холестерином, как раскрыто в WO 96/33739. Особо эффективный адъювантный препарат, включающий QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описан в WO 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой QS21. Препарат может также содержать эмульсию масло-в-воде и токоферол (WO 95/17210). Неметилированные CpG-содержащие олигонуклеотиды (WO 96/02555) и другие иммуномодуляторные олигонуклеотиды (WO 0226757 и WO 03507822) являются также преимущественными индукторами ТН 1 ответа и пригодны для применения в настоящем изобретении. Конкретные адъюванты представляют собой адъюванты, выбранные из группы солей металлов,эмульсий масло-в-воде, агониста Toll-подобных рецепторов (в частности, агониста Toll-подобного рецептора 2, агониста Toll-подобного рецептора 3, агониста Toll-подобного рецептора 4, агониста Tollподобного рецептора 7, агониста Toll-подобного рецептора 8 и агониста Toll-подобного рецептора 9),сапонинов или их комбинаций. Адъювант, который можно применять с вакцинными композициями по изобретению, представляет собой препараты пузырьков или наружных мембранных везикул из штаммов грамотрицательных бактерий, таких как заявлены WO 02/09746, в частности пузырьков N. meningitidis. Адъювантные свойства пузырьков могут быть улучшены за счет сохранения ЛОС (липоолигосахарида) на их поверхности (на- 14020817 пример, посредством экстракции низкими концентрациями детергента [например, 0-0,1% деоксихолатом]). ЛОС может быть детоксифицирован посредством мутаций msbB(-) или htrB(-), обсуждаемых вWO 02/09746. Адъювантные свойства могут быть также улучшены путем сохранения PorB (и возможно удаления PorA) из менингококковых пузырьков. Адъювантные свойства могут быть также улучшены путем укорочения наружной сердцевинной сахаридной структуры ЛОС на менингококковых пузырьках,например, посредством мутации IgtB(-), обсуждаемой в WO 2004/014417. Альтернативно, вышеупомянутый ЛОС (например, выделенный из штамма msbB(-) и/или IgtB(- можно очистить и применять в качестве адъюванта в композициях по изобретению. Следующий адъювант, который можно использовать с композициями по изобретению, может быть выбран из группы сапонина, липида А или его производного, иммуностимулирующего олигонуклеотида,алкилглюкозаминида фосфата, эмульсии масло-в-воде или их комбинаций. Следующий адъювант, который можно использовать с композициями по изобретению, представляет собой соль металла в комбинации с другим адъювантом. В воплощении адъювант представляет собой агонист Toll-подобного рецептора, в частности агонист Toll-подобного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 или 9, или сапонин, в частности QS21. В воплощении адъювантная система включает два или более чем два адъюванта из вышеприведенного перечня. В частности, комбинации возможно содержат адъювант сапонин (в частности, QS21) и/или агонист Toll-подобного рецептора 9, такой как иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий CpG. Другие комбинации включают сапонин (в частности, QS21) и агонист Toll-подобного рецептора 4, такой как монофосфориллипид А, или его 3-деацилированное производное, 3D-MPL, или сапонин (в частности,QS21) и агонист Toll-подобного рецептора 4, такой как алкилглюкозамидина фосфат. В одном воплощении адъюванты представляют собой комбинации 3D-MPL и QS21 (ЕР 0671948 В 1),эмульсии масло-в-воде, содержащие 3D-MPL и QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), или 3D-MPL, включенный в препарат с другими носителями (ЕР 0689454 В 1). В одном воплощении адъювантные системы включают комбинацию 3D-MPL, QS21 и олигонуклеотида CpG, как описано в US 6558670, US 6544518. В одном воплощении адъювант представляет собой лиганд Toll-подобного рецептора (TLR) 4 и,возможно, агонист, такой как производное липида А, в частности монофосфориллипид А или более конкретно 3-деацилированный монофосфориллипид А (3D-MPL). 3D-MPL имеется в продаже от фирмы GlaxoSmithKline Biologicals North America и, прежде всего,стимулирует ответы Т-клеток CD4+ с фенотипом ИФН-g (Th1). Он может быть получен в соответствии со способами, раскрытыми в GB 2220211 А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В одном воплощении композиции по настоящему изобретению используют 3D-MPL малого размера частиц. 3D-MPL малого размера частиц имеет такой размер частиц, что его можно стерильно фильтровать через 0,22 мкм фильтр. Такие препараты описаны в международной патентной заявке WO 94/21292. Синтетические производные липида А известны, и их считают агонистами TLR 4, включая, но не ограничиваясь ими: ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоноDглюкопиранозил]-2-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]D-глюкопиранозилдигидрофосфат)(AGP), такие как раскрыты в WO 9850399 или US 6303347 (также раскрыты способы получения AGP) или фармацевтически приемлемые соли AGP, как раскрыто в US 6764840. Некоторые AGP являются агонистами TLR4, и некоторые являются антагонистами TLR4. И те и другие считают полезными в качестве адъювантов. Другим иммуностимулятором для применения в настоящем изобретении является Quil А и его производные. Quil А представляет собой препарат сапонина, выделенного из южноамериканского дереваQuilaja Saponaria Molina, и был впервые описан как обладающий адъювантной активностью авторамиDalsgaard et al. в 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fr die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag,Berlin, p. 243-254). С помощью ВЭЖХ выделены очищенные фрагменты Quil А, которые сохраняют адъювантную активность без токсичности, связанной с Quil А (ЕР 0362278), например QS7 и QS21 (также известные как QA7 и QA21). QS-21 представляет собой природный сапонин, выделенный из корыQuillaja saponaria Molina, который индуцирует цитотоксические Т-клетки CD8+ (CTL), клетки Th1 и преимущественный ответ антител IgG2a, и является сапонином в контексте настоящего изобретения. Описаны конкретные препараты QS21, которые составляют воплощение изобретения, и эти препараты дополнительно содержат стерин (WO 96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть выделены в форме мицелл, смешанных мицелл (возможно с желчными кислотами),либо могут находиться в форме ISCOM-матриксов (ЕР 0109942 В 1), липосом или родственных коллоидных структур, таких как червеобразные или кольцеобразные мультимерные комплексы или липидно- 15020817 слоистые структуры и ламеллы при образовании их с холестерином и липидом, либо в форме эмульсии масло-в-воде (например, как в WO 95/17210). Сапонины могут быть ассоциированы с солью металла,такой как гидроксид алюминия или фосфат алюминия (WO 98/15287). Возможно, сапонин представлен в форме липосомы, ISCOM или эмульсии масло-в-воде. Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина, в частности, комбинацию QS21 и 3D-MPL, как раскрыто в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 блокирован холестерином, как раскрыто в WO 96/33739. Особенно эффективный адъювантный препарат, включающий токоферол с QS21 или без QS21 и/или 3D-MPL в эмульсии масло-в-воде, описан в WO 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой QS21. Можно также использовать иммуностимулирующие олигонуклеотиды или любой другой агонистToll-подобного рецептора (TLR) 9. Олигонуклеотиды для использования в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению возможно представляют собой CpG-содержащие олигонуклеотиды, возможно содержащие два или более чем два динуклеотидных мотива CpG, разделенных по меньшей мере тремя,возможно по меньшей мере шестью или большим числом нуклеотидов. Мотив CpG представляет собой нуклеотид цитозин со следующим за ним нуклеотидом гуанином. Олигонуклеотиды CpG по настоящему изобретению типично представляют собой дезоксинуклеотиды. В воплощении межнуклеотидная связь в олигонуклеотиде представляет собой фосфородитиоатную или фосфоротиоатную связь, хотя фосфодиэфирные и другие межнуклеотидные связи находятся в пределах объема изобретения. В объем изобретения также включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в US 5666153, US 5278302 иWO 95/26204. Примеры олигонуклеотидов имеют приведенные ниже последовательности. Эти последовательности возможно содержат межнуклеотидные связи, модифицированные фосфоротиоатом. Альтернативные олигонуклеотиды CpG могут содержать вышеприведенные последовательности, в которых присутствуют непоследовательные делеции или добавления. Олигонуклеотиды CpG, используемые в настоящем изобретении, можно синтезировать любым способом, известным в данной области техники (например, см. ЕР 468520). Такие олигонуклеотиды можно удобно синтезировать, используя автоматический синтезатор. Адъювант может представлять собой эмульсию масло-в-воде или может содержать эмульсию масло-в-воде в комбинации с другими адъювантами. Масляная фаза эмульсионной системы возможно содержит метаболизируемое масло. Значение термина "метаболизируемое масло" хорошо известно в данной области техники. Метаболизируемое можно определить как "способное к преобразованию посредством метаболизма" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974. Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное или синтетическое масло, которое нетоксично для реципиента и способно к преобразованию посредством метаболизма. Орехи, семена и зерно являются распространенными источниками растительных масел. Синтетические масла также составляют часть данного изобретения и могут включать имеющиеся в продаже масла, такие как NEOBEE и другие. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаруживают в больших количествах в жире печени акулы и в более низких количествах в оливковом масле, масле пшеничных проростков, масле рисовых отрубей и дрожжах, и это масло предназначено для использования в данном изобретении. Сквален является метаболизируемым маслом вследствие того факта, что он является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Merck index, 10th Edition, entry no. 8619). Токолы (например, витамин Е) также часто используют в масляных эмульсионных адъювантах (ЕР 0382271 В 1; US 5667784; WO 95/17210). Препараты токолов, используемые в масляных эмульсиях (возможно в эмульсиях масло-в-воде) по изобретению, можно готовить, как описано в ЕР 0382271 В 1, в которых токолы могут представлять собой дисперсии капель токола, возможно содержащие эмульгатор,возможно менее 1 мкм в диаметре. Альтернативно токолы можно использовать в комбинации с другим маслом для образования масляной фазы масляной эмульсии. Примеры масляных эмульсий, которые можно использовать в комбинации с токолом, описаны в данном изобретении, такие как вышеописанные метаболизируемые масла. Предположили, что адъюванты, представляющие собой эмульсию масло-в-воде, сами по себе полезны в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843 В), а также описаны комбинации эмульсий масло-в-воде и других активных агентов в качестве адъювантов для вакцин (WO 95/17210; WO 98/56414;WO 99/12565; WO 99/11241). Описаны другие адъюванты, представляющие собой масляную эмульсию,такие как эмульсии вода-в-масле (US 5422109; ЕР 0480982 В 2) и эмульсии вода-в-масле-в-воде (US 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют масляные эмульсионные системы (в частности, при включении токоферолов) с образованием адъювантов и композиций по настоящему изобретению. В одном воплощении масляная эмульсия (например, эмульсии масло-в-воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как Твин 80 и/или стерин, такой как холестерин. В одном воплощении масляная эмульсия (возможно эмульсия масло-в-воде) содержит метаболизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален или токоферол, такой как альфа-токоферол (и возможно и сквален, и альфа-токоферол) и возможно эмульгатор (или сурфактант), такой как Твин 80. Можно также включать стерин (например,холестерин). Способ получения эмульсий масло-в-воде хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно этот способ включает смешивание токолсодержащей масляной фазы с сурфактантом, таким как раствор ЗФР/Твин 80, с последующей гомогенизацией с использованием гомогенизатора; специалисту в данной области техники ясно, что способ, включающий пропускание смеси дважды через иглу шприца,должен быть пригоден для гомогенизации небольших объемов жидкости. В равной степени способ эмульгирования в микрофлюидизаторе (аппарат микрофлюидики M110S, максимум 50 пропусков за период 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (6105 Па) (давление на выходе примерно 850 бар(850105 Па может быть адаптирован специалистом в данной области техники для получения меньших или больших объемов эмульсии. Адаптация может быть достигнута путем рутинного экспериментирования, включающего измерение полученной в результате эмульсии до достижения препарата с масляными каплями требуемого диаметра. В эмульсии масло-в-воде масло и эмульгатор должны находиться в водном носителе. Водный носитель может представлять собой, например, фосфатно-солевой буферный раствор. Размер масляных капель, обнаруживаемых в стабильной эмульсии масло-в-воде, возможно составляет менее 1 мкм, может находиться в интервале, по существу, 30-600 нм, возможно, по существу, примерно 30-500 нм в диаметре, и возможно, по существу, 150-500 нм в диаметре, в частности примерно 150 нм в диаметре на основании измерения с помощью фотонно-корреляционной спектроскопии. В этом отношении 80% числа масляных капель должно находиться в этих интервалах, возможно более чем 90% и возможно более чем 95% числа масляных капель находятся в определенных интервалах размера. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, общепринято находятся в интервале 0,5-20% или 2-10% масла (от суммарного объема дозы), такого как сквален; и,когда присутствует, от 2 до 10% альфа-токоферола; и от 0,3 до 3% сурфактанта, такого как полиоксиэтиленсорбитана моноолеат. Возможно отношение масло (например, сквален):токол (например, токоферол) равно или меньше 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. Эмульгатор,такой как Твин 80 или Span 85, может также присутствовать на уровне примерно 1%. В некоторых случаях может быть предпочтительно, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор. Примеры эмульсионных систем описаны в WO 95/17210, WO 99/11241 и WO 99/12565, где раскрыты эмульсионные адъюванты на основе сквалена, -токоферола и Твин 80, возможно включенные в препарат с иммуностимуляторами QS21 и/или 3D-MPL. Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения адъювант по изобретению может дополнительно содержать дополнительные иммуностимуляторы, такие как ЛПС или его производные,и/или сапонины. Примеры дополнительных иммуностимуляторов описаны в данном изобретении и вPowell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X. В одном воплощении адъювантные и иммуногенные композиции согласно изобретению содержат сапонин (например, QS21) и/или производное ЛПС (например, 3D-MPL) в масляной эмульсии, описанной выше, возможно со стерином (например, холестерином). Дополнительно масляная эмульсия (возможно эмульсия масло-в-воде) может содержать Span 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин. Адъюванты, включающие эмульсию масло-в-воде, стерин и сапонин, описаны в WO 99/12565. Типично для введения человеку сапонин (например, QS21) и/или производное ЛПС (например, 3DMPL) должны присутствовать в дозе иммуногенной композиции для человека в диапазоне от 1 до 200 мкг, как, например, 10-100 мкг или 10-50 мкг на дозу. Типично масляная эмульсия (возможно эмульсия масло-в-воде) должна содержать от 2 до 10% метаболизируемого масла. Возможно, она должна содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% альфа-токоферола и от 0,3 до 3% (возможно 0,4-2%) эмульгатора(возможно Твин 80 [полиоксиэтиленсорбитана моноолеата]). Где присутствуют и сквален, и альфатокоферол, возможно отношение сквален:альфа-токоферол равно или меньше 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. Span 85 (сорбитана триолеат) может также присутствовать в эмульси- 17020817 ях, используемых в изобретении, на уровне от 0,5 до 1%. В некоторых случаях может быть предпочтительно, чтобы иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор, например другие эмульгаторы/сурфактанты, включая каприловую кислоту (Merckindex 10th Edition, entry no. 1739), например трикаприлин. Если включены сквален и сапонин (возможно QS21), включение стерина (возможно холестерина) в препарат также обладает пользой, поскольку это дает возможность снизить суммарный уровень масла в эмульсии. Это приводит к сниженной стоимости получения, улучшению общего комфорта вакцинации, а также к качественным и количественным улучшениям полученных в результате иммунных ответов, таким как улучшенное продуцирование ИФН-. Соответственно, адъювантная система по настоящему изобретению типично содержит отношение метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в интервале от 200:1 до 300:1, а также настоящее изобретение можно использовать в форме низкого содержания масла,возможный интервал которого составляет от 1:1 до 200:1, возможно от 20:1 до 100:1 или, по существу,48:1, и эта вакцина сохраняет полезные адъювантные свойства всех компонентов при значительно сниженном профиле реактогенности. Соответственно, некоторые воплощения имеют отношение сквален:QS21 (мас./мас.) в интервале от 1:1 до 250:1, либо от 20:1 до 200:1, либо от 20:1 до 100:1, либо, по существу, 48:1. Возможно также включают стерин (например, холестерин), присутствующий в соотношении сапонин:стерин, как описано в данном изобретении. Эмульсионные системы по настоящему изобретению возможно имеют малый размер масляных капель в субмикронном диапазоне. Возможно размеры масляных капель находятся в диапазоне от 120 до 750 нм или от 120-600 нм в диаметре. Особенно эффективный адъювантный препарат (для конечного комбинирования с AlPO4 в иммуногенных композициях по изобретению) включает сапонин (например, QS21), производное ЛПС (например, 3D-MPL) и масляную эмульсию (например, сквален и альфа-токоферол в эмульсии масло-в-воде),как описано в WO 95/17210 или в WO 99/12565 (в конкретном адъювантном препарате 11 в примере 2,табл. 1). Примеры агониста TLR2 включают пептидогликан или липопротеин. Имидазохинолины, такие как имиквимод и резиквимод, являются известными агонистами TLR7. Однонитевая РНК также является известным агонистом TLR (TLR8 у людей и TLR7 у мышей), тогда как двунитевая РНК и поли-IC (полиинозиновая - полицитидиловая кислота - коммерческий синтетический миметик вирусной РНК) являются примерами агонистов TLR3. 3D-MPL является примером агониста TLR4, тогда как CPG является примером агониста TLR9. Иммуногенная композиция может содержать антиген и иммуностимулятор, адсорбированные на соли металла. Вакцинные препараты на основе алюминия, где антиген и иммуностимулятор 3-де-Оацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) адсорбированы на одной и той же частице, описаны в ЕР 0576478 В 1, ЕР 0689454 В 1 и ЕР 0633784 В 1. Тогда в этих случаях сначала антиген адсорбируют на соли алюминия с последующей адсорбцией иммуностимулятора 3D-MPL на тех же частицах соли алюминия. Такие способы включают, во-первых, суспендирование 3D-MPL путем обработки ультразвуком в водяной бане до тех пор, пока частицы не достигнут размера между 80 и 500 нм. Антиген типично адсорбируют на соли алюминия в течение одного часа при комнатной температуре при перемешивании. Затем суспензию 3D-MPL добавляют к адсорбированному антигену, и препарат инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем держат при 4 С до использования. В другом способе иммуностимулятор и антиген находятся на отдельных частицах металла, как описано в ЕР 1126876. Этот усовершенствованный способ включает адсорбцию иммуностимулятора на частице соли металла с последующей адсорбцией антигена на другой частице соли металла, после чего смешивают дискретные металлические частицы с образованием вакцины. Адъювант для использования в настоящем изобретении может представлять собой адъювантную композицию, содержащую иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла, отличающуюся тем, что эти частицы соли металла,по существу, свободны от другого антигена. Кроме того, в настоящем изобретении предложены вакцины и характеризуются тем, что иммуностимулятор адсорбирован на частицах соли металла, которые, по существу, свободны от другого антигена, и тем, что частицы соли металла, на которых адсорбирован антиген, по существу, свободны от другого иммуностимулятора. Соответственно, в настоящем изобретении описан адъювантный препарат, содержащий иммуностимулятор, который адсорбирован на частице соли металла, отличающийся тем, что композиция, по существу, является свободной от другого антигена. Кроме того, этот адъювантный препарат может представлять собой промежуточный препарат, который, при использовании такого адъюванта, требуется для получения вакцины. Соответственно, описан способ получения вакцины, включающий смешивание адъювантной композиции, которая представляет собой один или более чем один иммуностимулятор, адсорбированный на частице металла, с антигеном. Возможно антиген предварительно адсорбирован на соли металла. Такая соль металла может быть идентична или подобна соли металла, на которой адсорбирован иммуностимулятор. Возможно соль металла представляет собой соль алюминия, например фосфат алюминия или гидроксид алюминия. Далее в настоящем изобретении описана вакцинная композиция, содержащая иммуностимулятор,адсорбированный на первой частице соли металла, и антиген, адсорбированный на соли металла, отличающаяся тем, что первая и вторая частицы соли металла представляют собой отдельные частицы. Производные ЛПС или ЛОС, либо мутации или производные липида А, описанные в данном изобретении, сконструированы таким образом, что являются менее токсичными (например, 3D-MPL), чем нативные липополисахариды, и являются взаимозаменяемыми эквивалентами в отношении любых применений этих группировок, описанных в данном изобретении. В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, включает липосомный носитель (полученный с помощью известных методик из фосфолипидов (таких как диолеоилфосфатидилхолин [DOPC]) и возможно стерина [такого как холестерин]). Такие липосомные носители могут нести производные липида А [такие как 3D-MPL, см. выше] и/или сапонины (такие как QS21, см. выше). В одном воплощении адъювант содержит (на дозу 0,5 мл) 0,1-10 мг, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2 или 0,5-1 мг(например, QS21). Этот адъювант особенно пригоден для препаратов вакцин для пациентов пожилого возраста. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов,имеющих происхождение, по меньшей мере, от всех перечисленных ниже серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С,19F, 23F, 1, 5, 7F (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6 А, 19 А и 22F), где ГСК титра антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента вакцины 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F, незначительно ниже таковой при индукции вакциной Prevnar у вакцинированных людей. В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, включает эмульсию масло-в-воде, полученную из метаболизируемого масла (такого как сквален), эмульгатора (такого как Твин 80) и возможно токола (такого как альфа-токоферол). В одном воплощении адъювант содержит(на дозу 0,5 мл) 0,5-15, 1-13, 2-11, 4-8 или 5-6 мг (например, 2-3, 5-6 или 10-11 мг) метаболизируемого масла (такого как сквален), 0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4 или 2-3 мг (например, 0,9-1,1, 2-3 или 4-5 мг) эмульгатора (такого как Твин 80) и возможно 0,5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 мг (например, 11-13, 5-6 или 2-3 мг) токола (такого как альфа-токоферол). Этот адъювант может возможно дополнительно содержать 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 515, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3D-MPL). Эти адъюванты особенно пригодны для вакцинных препаратов для детей младшего возраста или пожилых. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, имеющих происхождение, по меньшей мере, от всех перечисленных ниже серотипов: 4, 6 В,9V, 14, 18 С, 19F, 23F, 1, 5, 7F (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6 А,19 А и 22F), где ГСК титра антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента вакцины 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F, незначительно ниже таковой при индукции вакцинойPrevnar у вакцинированных людей. Этот адъювант может возможно содержать 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг(например, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина), 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3D-MPL) и 5-60,10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, QS21). Этот адъювант особенно пригоден для вакцинных препаратов для пациентов пожилого возраста. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов,имеющих происхождение, по меньшей мере, от всех перечисленных ниже серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С,19F, 23F, 1, 5, 7F (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6 А, 19 А и 22F), где ГСК титра антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента вакцины 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F, незначительно ниже таковой при индукции вакциной Prevnar у вакцинированных людей. В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, содержит фосфат алюминия и производное липида А (такое как 3D-MPL). Этот адъювант может содержать (на дозу 0,5 мл) 100-750, 200-500, 400-500 или 300-400 мкг Al в виде фосфата алюминия и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3D-MPL). Этот адъювант особенно пригоден для вакцинных препаратов для детей младшего возраста или пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, имеющих происхождение, по меньшей мере, от всех перечисленных ниже серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F, 23F, 1, 5, 7F (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3,6 А, 19 А и 22F), где ГСК титра антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента вакцины 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F, незначительно ниже таковой при индукции вакцинойPrevnar у вакцинированных людей. Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, можно применять для защиты или лечения млекопитающего, чувствительного к инфекции, путем введения указанной вакцины посредством системного пути или введения в слизистую оболочку. Эти введения могут включать инъекцию посредством внутримышечного (IM), внутрибрюшинного (IP), внутрикожного(ID) или подкожного (SC) путей; или посредством введения в слизистую оболочку пероральных/пищеварительных, дыхательных, мочеполовых путей. Возможно интраназальное (IN) введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку носоглоточное носительство пневмококков может быть более эффективно предупреждено, таким образом, ослабляя инфекцию на ее самой ранней стадии). Хотя вакцину по изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты можно также совместно вводить вместе, одновременно или в различные моменты времени (например, конъюгаты пневмококковых сахаридов можно вводить по отдельности, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимального координирования иммунных ответов по отношению друг к другу). Для совместного введения возможный адъювант Th1 может присутствовать при любом или при всех из различных введений. Кроме единого пути введения,можно применять два различных пути введения. Например, сахариды или сахаридные конъюгаты можно вводить IM (или ID), а бактериальные белки можно вводить IN (или ID). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить IM для примирующих доз и IN для бустер-доз. Содержание белковых антигенов в вакцине типично будет находиться в интервале 1-100 мкг, возможно 5-50 мкг, например в интервале 5-25 мкг. После первичной вакцинации субъекты могут получить одну или несколько бустер-иммунизаций, адекватно разделенных. Вакцинный препарат в общем описан в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (edsPowell M.F.Newman M.J.) (1995), Plenum Press New York). Инкапсулирование внутри липосом описано у Fullerton, патент США 4235877. Вакцины или иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизированными. В одном воплощении раствор лиофилизируют в присутствии сахара, действующего в качестве аморфного лиопротектора, такого как сахароза, трегалоза, глюкоза, манноза, мальтоза или лактоза. В одном воплощении раствор лиофилизируют в присутствии сахара, действующего в качестве аморфного лиопротектора, и наполнителя, обеспечивающего улучшенную структуру кека, такого как глицин или маннит. Присутствие кристаллического наполнителя позволяет укоротить циклы вымораживания-сушки в присутствии высокой концентрации соли. Примеры таких смесей для использования при лиофилизации иммуногенных композиций или вакцин по изобретению включают смеси сахароза/глицин, трегалоза/глицин, глюкоза/глицин, манноза/глицин, мальтоза/глицин, сахароза/маннит, трегалоза/маннит, глюкоза/маннит, манноза/маннит и мальтоза/маннит. Типично молярное отношение двух компонентов возможно составляет 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 или 1:6. Иммуногенные композиции по изобретению возможно содержат вышеописанные реагенты лиофилизации. Вышеописанные стабилизирующие агенты и смеси стабилизирующих агентов могут дополнительно включать полимер, способный увеличивать температуру стеклоперехода (Tg') препарата, такой как поливинилпирролидон (ПВП), гидроксиэтилкрахмал или декстран, или полимер, действующий в качестве кристаллического наполнителя, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), например, имеющий молекулярную массу между 1500 и 6000, и декстран. Иммуногенные композиции по изобретению возможно лиофилизируют и восстанавливают непосредственно перед применением. Результатом лиофилизации может быть более стабильная композиция(вакцина), и она может, возможно, приводить к более высоким титрам антител в присутствии 3D-MPL и в отсутствие адъюванта на основе алюминия. В одном аспекте изобретения описан вакцинный набор, включающий флакон, содержащий иммуногенную композицию по изобретению, возможно в лиофилизированной форме, и дополнительно включающий флакон, содержащий адъювант, как описано в данном изобретении. Рассматривают, что в данном аспекте изобретения адъювант следует использовать для восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции. Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описанных вакцин в кожу (ID) составляет одно воплощение настоящего изобретения. Кожа человека содержит наружную "роговую" кутикулу, называемую роговым слоем, под которым лежит эпидермис. Под эпидермисом находится слой, называемый дермой, под которым, в свою очередь, лежит подкожная ткань. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, который может быть также связан с рядом дополнительных преимуществ. Внутрикожная вакцинация вакцинами, описанными здесь, образует возможный признак настоящего изобретения. Общепринятая методика внутрикожной инъекции, "метод Манту", включает стадии очистки кожи,а затем, вытягивая одной рукой и располагая скошенный конец иглы узкого калибра (калибра 26-31) кверху, иглу вводят под углом между 10-15. Как только скошенный конец иглы введен, цилиндр иглы опускают и продвигают дальше, прилагая при этом легкое давление, чтобы поднять ее под кожу. Затем жидкость инъецируют очень медленно, образуя посредством этого пузырек или папулу на поверхности кожи, после чего медленно вытягивают иглу. Более недавно описаны устройства, которые специально сконструированы для введения жидких агентов в кожу или через кожу, например устройства, описанные в WO 99/34850 и ЕР 1092444, а также устройства для безыгольного впрыскивания, описанные, например, в WO 01/13977; US 5480381, US 5599302, US 5334144, US 5993412, US 5649912, US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US 5466220, US 5339163, US 5312335, US 5503627, US 5064413, US 5520639, US 4596556, US 4790824, US 4941880, US 4940460, WO 97/37705 и WO 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных препаратов могут включать общепринятые шприцы и иглы, либо устройства, сконструированные для баллистической доставки твердых вакцин (WO 99/27961), или чрескожные пластыри (WO 97/48440; WO 98/28037); или нанесенные на поверхность кожи (чрескожная доставка WO 98/20734; WO 98/28037). Когда вакцины по настоящему изобретению нужно вводить в кожу, или более конкретно в дерму,вакцина находится в небольшом объеме жидкости, в частности в объеме от примерно 0,05 до 0,2 мл. Содержание антигенов в кожных или внутрикожных вакцинах по настоящему изобретению может быть подобно общепринятым дозам, которые находятся во внутримышечных вакцинах (см. выше). Однако признаком кожных или внутрикожных вакцин является то, что препараты могут представлять собой препараты "низкой дозы". Соответственно, белковые антигены в вакцинах "низкой дозы" возможно присутствуют в столь малом количестве, как от 0,1 до 10 мкг или от 0,1 до 5 мкг на дозу; и сахаридные (возможно конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 мкг или между 0,01 и 0,5 мкг сахарида на дозу. При использовании здесь, термин "внутрикожная доставка" означает доставку вакцины в область дермы в коже. Однако вакцина не обязательно должна быть локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, локализованный между примерно 1,0 и примерно 2,0 мм от поверхности в коже человека, но существует некоторое количественное варьирование между индивидуумами и в различных частях тела. Как правило, можно ожидать достижения дермы путем вхождения на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма локализована между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем ниже. В зависимости от способа доставки вакцина может быть, в конечном счете, локализована исключительно или, в основном, внутри дермы, либо она может быть, в конечном счете, распределена внутри эпидермиса и дермы. Далее в настоящем изобретении описана усовершенствованная вакцина для предупреждения или облегчения течения среднего отита, вызванного Haemophilus influenzae, в результате добавления белковHaemophilus influenzae, например белка D, в конъюгированной форме. Кроме того, далее в настоящем изобретении описана усовершенствованная вакцина для предупреждения или облегчения течения пневмококковой инфекции у детей младшего возраста (например, среднего отита) за счет того, что она основана на добавлении одного или двух пневмококковых белков в виде свободного или конъюгированного белка к конъюгатным композициям S. pneumoniae по изобретению. Указанные пневмококковые свободные белки могут представлять собой те же или другие белки, чем белки S. pneumoniae, используемые в качестве белков-носителей. Один или более чем один белковый антиген Moraxella catarrhalis может быть также включен в комбинированную вакцину в свободной или конъюгированной форме. Таким образом, в настоящем изобретении описан усовершенствованный способ индукции (защитного) иммунного ответа против среднего отита у детей младшего возраста. В другом воплощении настоящего изобретения описан усовершенствованный способ индукции(защитного) иммунного ответа у детей младшего возраста (определенного как возраст 0-2 года в контексте настоящего изобретения) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению [педиатрической вакцины]. Следующие воплощения настоящего изобретения включают разработку антигенных конъюгатных композиций S. pneumoniae по изобретению для применения в медицине и применение конъюгатов S. pneumoniae по изобретению при изготовлении лекарственного средства для предупреждения (или лечения) пневмококкового заболевания. В другом воплощении настоящего изобретения описан усовершенствованный способ индукции(защитного) иммунного ответа у пожилого населения (в контексте настоящего изобретения пациента считают пожилым, если он находится в возрасте 50 лет или старше, типично старше 55 лет и чаще всего старше 60 лет) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению, возможно в сочетании с одним или двумя белками S. pneumoniae, присутствующими в виде свободного или конъюгированного белка, где свободные белки S. pneumoniae могут представлять собой те же или другие белки, чем любые белки S. pneumoniae, используемые в качестве белков-носителей. В изобретении также описан способ иммунизации человека-хозяина против заболевания, вызванного инфекцией S. pneumoniae, и возможно Haemophilus influenzae, при котором хозяину вводят иммунопротективную дозу иммуногенной композиции или вакцины по изобретению. В изобретении также описана иммуногенная композиция по изобретению для использования при лечении или предупреждении заболевания, вызванного инфекцией S. pneumoniae и возможно Haemophilus influenzae. В изобретении также описано применение иммуногенной композиции или вакцины по изобретению при изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызванных инфекцией S. pneumoniae и возможно Haemophilus influenzae. Термины "содержащий", "содержат" и "содержит" здесь подразумеваются авторами изобретения как возможно заменяемые терминами "состоящий из", "состоят из" и "состоит из", соответственно, в каждом случае. Воплощения в данном изобретении, относящиеся к "вакцинным композициям" по изобретению,также применимы к воплощениям, относящимся к "иммуногенным композициям" по изобретению, и наоборот. Все ссылки или патентные заявки, цитируемые в описании данного патента, включены в данную заявку посредством ссылки. В целях лучшего понимания изобретения приведены следующие примеры. Эти примеры предназначены только в целях иллюстрации и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Примеры Пример 1. Экспрессия белка D. Белок D Haemophilus influenzae. Генетическая конструкция для экспрессии белка D. Исходные материалы. ДНК, кодирующая белок D. Белок D является высококонсервативным среди всех серотипов и нетипируемых штаммов Н. influenzae. Вектор pHIC348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую ген полноразмерного белкаD, получен от Dr. A. Forsgren, кафедра медицинской микробиологии, Университет г. Лунд, больница общего профиля г. Мальме, Мальме, Швеция. Последовательность ДНК белка D опубликована Janson et al.(1991) Infect. Immun. 59: 119-125. Экспрессионный вектор pMG 1. Экспрессионный вектор pMG 1 представляет собой производное pBR322 (Gross et al., 1985), в который были введены регуляторные элементы для транскрипции и трансляции чужеродных генов, имеющие происхождение от бактериофага(Shatzman et al., 1983). Кроме того, ген устойчивости к ампициллину был заменен геном устойчивости к канамицину. Штамм Е.coli AR58. Штамм Е.coli AR58 был получен путем трансдукции N99 штаммом фага Р 1, предварительно выращенным на производном SA500 (galETN10, lambdaKil- cl857 Н 1). N99 и SA500 представляют собой штаммы Е.coli K12, полученные из лаборатории Dr. Martin Rosenberg's в Национальном институте здравоохранения. Экспрессионный вектор pMG 1. Для продуцирования белка D ДНК, кодирующая этот белок, клонирована в экспрессионном вектореpMG 1. Эта плазмида использует сигналы от ДНК фага лямбда для направления транскрипции и трансляции встроенных чужеродных генов. Этот вектор содержит промотор PL, оператор OL и два сайта утилизации (NutL и NutR) для ослабления эффектов полярности транскрипции при обеспечении белка N(Gross et al., 1985). Векторы, содержащие промотор PL, вводят в лизогенного хозяина Е.coli для стабилизации плазмидной ДНК. Лизогенные штаммы-хозяева содержат репликационно-дефектную ДНК фага лямбда, интегрированную в геноме (Shatzman et al., 1983). Хромосомная ДНК фага лямбда направляет синтез репрессорного белка cl, который связывается с репрессором OL вектора и предотвращает связывание РНК полимеразы с промотором PL и посредством этого транскрипцию встроенного гена. Ген cl экспрессионного штамма AR58 содержит температурно-чувствительный мутант, так что транскрипцию,направляемую PL, можно регулировать температурным сдвигом, т.е. повышение температуры в культуре инактивирует репрессор, и синтез чужеродного белка инициируется. Эта экспрессионная система дает возможность регулируемого синтеза чужеродных белков, в частности тех, которые могут быть токсичными для клетки (ShimatakaRosenberg, 1981). Штамм Е.coli AR58. Лизогенный штамм AR58 Е.coli, используемый для продуцирования белка-носителя D, является производным стандартного штамма NIH E.coli K12 N99 (F- su- galK2, lacZ- thr-). Он содержит дефектный лизогенный фаг лямбда (galETN10, lambdaKil- cl857 H1). Фенотип Kil- предотвращает остановку синтеза макромолекул хозяина. Мутация cl857 придает температурно-чувствительное повреждение репрессору cl. Делеция Н 1 удаляет правый оперон фага лямбда и локусы хозяина bio, uvr3 и chlA. ШтаммAR58 был получен путем трансдукции N99 штаммом фага Р 1, предварительно выращенным на производном SA500 (galETN10, lambdaKil- cl857 H1). Введение дефектного лизогена в N99 было выбрано с тетрациклином вследствие присутствия транспозона TN10, кодирующего устойчивость к тетрациклину,в соседнем гене galE. Конструирование вектора pMGMDPPrD. Вектор pMG 1, который содержит ген, кодирующий неструктурный белок S1 вируса гриппа(pMGNSI), был использован для конструирования pMGMDPPrD. Ген белка D амплифицировали с помощью ПЦР из вектора pHIC348 (Janson et al. 1991, Infect. Immun. 59:119-125) с праймерами ПЦР, содержащими сайты рестрикции NcoI и XbaI на 5' и 3' концах соответственно. Затем фрагмент NcoI/XbaI был введен в pMGNSI между NcoI и XbaI, таким образом, создавая слитый белок, содержащий 81 Nконцевую аминокислоту белка NS1, за которыми следует белок PD. Этот вектор был обозначен pMGNS1PrD. На основе вышеописанной конструкции была получена конечная конструкция для экспрессии белкаD. Фрагмент BamHI/BamHI был удален из pMGNS1PrD. Этот гидролиз ДНК удаляет участок, кодирующий NS1, за исключением первых трех N-концевых остатков. При сшивании вектора образуется ген, кодирующий слитый белок с последовательностью, показанной в WO 07/71711, пример 1, с. 44. Белок D не содержит лидерный пептид или N-концевой цистеин, к которому обычно присоединены липидные цепи. Следовательно, белок ни выделяется в периплазму, ни претерпевает липидизацию и остается в цитоплазме в растворимой форме. Конечная конструкция pMG-MDPPrD была введена в штамм-хозяин AR58 с помощью теплового шока при 37 С. Бактерии, содержащие плазмиду, отбирали в присутствии канамицина. Присутствие вставки ДНК, кодирующей белок D, демонстрировали путем расщепления выделенной плазмидной ДНК выбранными эндонуклеазами. Рекомбинантный штамм Е.coli обозначен как ECD4. Экспрессия белка D находится под контролем промотора лямбда PL/оператора OL. Штамм-хозяинAR58 содержит в геноме температурно-чувствительный ген cl, который блокирует экспрессию с лямбдаPL при низкой температуре посредством связывания с OL. Как только температура повышается, cl высвобождается от OL и белок D экспрессируется. Синтез в малом масштабе. По окончании ферментации клетки концентрируют и замораживают. Экстракцию из собранных клеток и очистку белка D проводили, как описано ниже. Замороженный осадок клеточной культуры оттаивают и ресуспендируют в растворе для разрушения клеток (цитратный буфер рН 6,0) до конечной OD650=60. Суспензию дважды пропускают через гомогенизатор высокого давления Р=1000 бар (1000105 Па). Гомогенат клеточной культуры осветляют центрифугированием, и клеточный дебрис удаляют фильтрованием. На первой стадии очистки фильтрованный лизат наносят на колонку для катионообменной хроматографии (SP Sepharose Fast Flow). PD связывается с матриксом геля посредством ионного взаимодействия, и его элюируют путем ступенчатого повышения ионной силы буфера элюирования. На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (Q Sepharose FastFlow). PD не связывается на геле и может быть собран в элюате. На обеих стадиях колоночной хроматографии мониторинг сбора фракций осуществляют на основании OD. Элюат анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок D, концентрируют путем ультрафильтрации. Наконец, ультраконцентрат, содержащий белок D, пропускают через 0,2 мкм мембрану. Крупномасштабный синтез. Экстракцию из собранных клеток и очистку белка D проводили, как описано ниже. Собранную культуру охлаждают и непосредственно пропускают дважды через гомогенизатор высокого давления при давлении примерно 800 бар (800105 Па). На первой стадии очистки гомогенат клеточной культуры разбавляют и наносят на колонку для катионообменной хроматографии (гранулы SP Sepharose Big). PD связывается с матрицей геля посредством ионного взаимодействия, и его элюируют путем ступенчатого повышения ионной силы буфера элюирования и фильтруют. На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (Q Sepharose FastFlow). PD не связывается на геле и может быть собран в элюате. На обеих стадиях колоночной хроматографии мониторинг сбора фракций осуществляют на основании OD. Элюат анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок D, концентрируют и подвергают диафильтрации путем ультрафильтрации. Наконец, ультраконцентрат, содержащий белок D, пропускают через 0,2 мкм мембрану. Пример 1 а. Экспрессия PhtD. Белок PhtD является членом семейства гистидиновых триад (Pht) пневмококковых белков, характеризующегося присутствием гистидиновых триад (мотива НХХНХН). PhtD представляет собой молекулу из 838 аминокислот и несет 5 гистидиновых триад (см. аминокислотную последовательность в Medlmmune WO 00/37105 SEQ ID NO: 4 и последовательность ДНК в SEQ ID NO: 5). PhtD также содержит богатый пролином участок в середине (положение аминокислот 348-380). PhtD имеет 20-аминокислотнуюN-концевую сигнальную последовательность с мотивом LXXC. Генетическая конструкция. Последовательность гена зрелого белка Medlmmune PhtD (с аминокислоты 21 до аминокислоты 838) переносили рекомбинантным путем в Е.coli, используя вектор собственной разработки рТСМР 14,несущий промотор р. Штамм-хозяин Е.coli представляет собой AR58, который несет термочувствительный репрессор cl857, дающий возможность тепловой индукции промотора. Полимеразную цепную реакцию осуществляли для амплификации гена phtD из плазмиды Medlmmune (несущей ген phtD из Streptococcus pneumoniae штамм Norway 4 (серотип 4), SEQ ID NO: 5, как описано в WO 00/37105). Праймеры, специфичные только для гена phtD, использовали для амплификации гена phtD в двух фрагментах. Праймеры несут сайты рестрикции либо NdeI и KpnI, либо KpnI иXbaI. Эти праймеры не гибридизуются ни с одним нуклеотидом из вектора, но только с последовательностями, специфичными для гена phtD. Искусственный стартовый кодон ATG вводили, используя первый праймер, несущий сайт рестрикции NdeI. Затем полученные продукты ПЦР встраивали в клонирующий вектор pGEM-T (Promega) и подтверждали последовательность ДНК. Затем осуществляли субклонирование фрагментов в экспрессионном векторе ТСМР 14, используя стандартные методики, и вектор трансформировали в AR58 Е.coli. Очистка PhtD. Очистку PhtD осуществляют, как описано ниже. Выращивание клеток Е.coli в присутствии канамицина: рост 30 ч при 30 С, затем индукция в течение 18 ч при 39,5 С. Разрушение клеток Е.coli из цельной культуры при OD115 в присутствии ЭДТА 5 мМ и ФМСФ 2 мМ в качестве ингибиторов протеазы: Rannie, 2 пассажа, 1000 бар (1000105 Па). Улавливание антигена и удаление клеточного дебриса на хроматографии в режиме неплотной набивки Streamline Q XL при комнатной температуре (20 С); колонку промывают NaCl 150 мМ + Empigen 0,25% рН 6,5 и элюируют NaCl 400 мМ + Empigen 0,25% в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,4. Фильтрование на картридже Sartobran 150 (0,45 + 0,2 мкм). Связывание антигена на хроматографии с Zn хелатирующей сефарозой FF IMAC при рН 7,4 в присутствии 5 мМ имидазола при 4 С; колонку промывают имидазолом 5 мМ и Empigen 1% и элюируют 50 мМ имидазолом, оба раствора в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 8,0. Слабая анионообменная хроматография в положительном режиме на Fractogel EMD ДЭАЭ при рН 8,0 (25 мМ фосфат калия) при 4 С; колонку промывают 140 мМ NaCl и элюируют при 200 мМ NaCl при этом примеси (белки и ДНК) остаются адсорбированными на ионообменной смоле. Концентрирование и ультрафильтрация с 2 мМ Na/K фосфатом рН 7,15 на мембране 50 кДа. Стерилизующее фильтрование очищенного основного объема на фильтрационном картридже Millipak-20 0,2 мкм. Пример 1 б. Экспрессия пневмолизина. Пневмококковый пневмолизин был получен и детоксифицирован, как описано в WO 2004/081515 иWO 2006/032499. Пример 2. Получение конъюгатов. В данной области техники хорошо известно, как получить очищенные пневмококковые полисахариды. Для целей данных примеров полисахариды были получены, по существу, как описано в ЕР 072513,или с помощью близко подобных способов. Перед конъюгацией полисахариды могут быть отсортированы по размеру с помощью микрофлюидизации, как описано ниже. Условия активации и сочетания специфичны для каждого полисахарида. Они приведены в табл. 1. Полисахарид определенного размера (за исключением PS5, 6 В и 23F) растворяли в NaCl 2 М, NaCl 0,2 М или в воде для инъекций (ВДИ). Оптимальную концентрацию полисахарида оценивали для всех серотипов. Все серотипы, за исключением серотипа 18 С, конъюгировали непосредственно с белком-носителем,как подробно описано ниже. Было получено два альтернативных конъюгата серотипа 22F; один конъюгировали непосредственно, один через линкер ADH. Из исходного раствора 100 мг/мл в ацетонитриле или в растворе ацетонитрил/вода 50%/50% добавляли CDAP (соотношение CDAP/PS 0,5-1,5 мг/мг PS) к раствору полисахарида. Спустя 1,5 мин добавляли 0,2 М-0,3 М NaOH для получения специфичного рН активации. Активацию полисахарида осуществляли при данном значении рН в течение 3 мин при 25 С. Очищенный белок (белок D, PhtD, пневмолизин или DT) (количество зависит от исходного соотношения PS/белок-носитель) добавляли к активированному полисахариду и проводили реакцию сочетания при специфичном рН в течение времени вплоть до 2 ч (в зависимости из серотипа) при регулировании рН. Затем к смеси с целью гашения непрореагировавших групп эфира цианата добавляли 2 М раствор глицина. Доводили рН до рН гашения (рН 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25 С, а затем в течение ночи при 2-8 С при непрерывном медленном перемешивании. Получение 18 С. 18 С сшивали с белком-носителем через линкер, представляющий собой дигидразид адипиновой кислоты (ADH). Полисахарид серотипа 18 С подвергали микрофлюидизации перед конъюгацией. Получение производного столбнячного анатоксина с EDAC. Для получения производного столбнячного анатоксина очищенный ТТ разводили при 25 мг/мл в 0,2 М NaCl и добавляли спейсер ADH до достижения конечной концентрации 0,2 М. Когда растворение спейсера было полным, рН доводили до 6,2. Затем добавляли EDAC (1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимид) до достижения конечной концентрации 0,02 М, и смесь перемешивали в течение 1 ч при регулировании рН. Реакцию конденсации останавливали путем повышения рН вплоть до 9,0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25 С. Затем производное ТТ подвергали диафильтрации (10 кДа мембрана СО) с целью удаления остаточного реагента ADH и EDAC. Наконец, общий объем ТТАН стерильно фильтровали до стадии сочетания и хранили при -70 С. Химическое сочетание ТТАН с PS 18C. Подробности параметров конъюгации можно найти в табл. 1. 2 г микрофлюидизированного PS разводили при определенной концентрации в воде и доводили до 2 М NaCl добавлением порошка NaCl. Раствор CDAP (100 мг/мл свежеприготовленного раствора в ацетонитриле/ВДИ 50/50 об./об.) добавляли до достижения соответствующего соотношения CDAP/PS. Значение рН повышали до рН активации 9,0 добавлением 0,3 М NaOH и стабилизировали при данном рН до добавления TTAH. Через 3 мин добавляли производное TTAH (20 мг/мл в 0,2 М NaCl) до достижения соотношенияTTAH/PS 2; рН регулировали до достижения рН сочетания 9,0. Раствор оставляли на один час при регулировании рН. Для гашения к смеси PS/TTAH/CDAP добавляли 2 М раствор глицина. Доводили рН до рН гашения (рН 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25 С, а затем оставляли на ночь при 2-8 С при непрерывном медленном перемешивании. Конъюгат PS22FAH-PhtD. При втором способе конъюгации для данного сахарида (где первый представляет собой прямой способ конъюгации PS22-PhtD, показанный в табл. 1) 22F сшивали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (ADH). Полисахарид серотипа 22F подвергали микрофлюидизации перед конъюгацией. Получение производного PS 22F. Активацию и сочетание проводили при 25 С при непрерывном перемешивании в водяной бане с регулируемой температурой. Микрофлюидизированный PS22F разводили до получения конечной концентрации PS 6 мг/мл в 0,2 М NaCl и раствор доводили до рН 6,050,2 0,1 н. HCl. Раствор CDAP (100 мг/мл свежеприготовленного раствора в ацетонитриле/ВДИ 50/50 об./об.) добавляли до достижения соответствующего соотношения CDAP/PS (1,5/1 мас./мас.). Значение рН повышали до рН активации рН 9,000,05 добавлением 0,5 М NaOH и стабилизировали при данном рН до добавления ADH. Через 3 мин добавляли ADH до достижения соответствующего соотношения ADH/PS (8,9/1 мас./мас.); рН регулировали до рН сочетания 9,0. Раствор оставляли на 1 ч при регулировании рН. Производное PSAH концентрировали и подвергали диафильтрации. Сочетание.PhtD/PS22FAH 4/1 (мас./мас.). рН доводили до 5,00,05 HCl. Раствор EDAC (20 мг/мл в 0,1 М Трис-HCl рН 7,5) добавляли вручную за 10 мин (250 мкл/мин) до достижения 1 мг EDAC/мг PS22FAH. Полученный в результате раствор инкубировали в течение 150 мин (хотя также использовали 60 мин) при 25 С при перемешивании и регулировании рН. Раствор нейтрализовали добавлением 1 М Трис-HCl рН 7,5 (1/10 конечного объема) и оставляли на 30 мин при 25 С. Перед элюированием на Sephacryl S400HR конъюгат осветляли, используя 5 мкм фильтр Minisart. Полученный в результате конъюгат имел конечное соотношение PhtD/PS 4:1 (мас./мас.), содержание свободного PS ниже 1% и антигенность (-PS/-PS) 36,3% и антигенность анти-PhtD 7,4%. Соотношение белка и полисахарида измеряли, используя метод Лоури и резорциновый метод, и антигенность определяли, используя сэндвич-ELISA. Очистка конъюгатов. Конъюгаты очищали с помощью гель-фильтрации, используя колонку для гель-фильтрации Sephacryl S400HR, уравновешенную 0,15 М NaCl (S500HR для 18 С) для удаления небольших молекул (включаяDMAP) и неконъюгированного PS и белка. На основе различных молекулярных размеров компонентов реакции конъюгаты PS-PD, PS-TT, PS-PhtD, PS-пневмолизин или PS-DT элюируют первыми, затем элюируют свободные PS, затем свободный PD или свободный DT и, наконец, DMAP и другие соли (NaCl,глицин). Фракции, содержащие конъюгаты, обнаруживают с помощью УФ 280 нм. Фракции объединяют в со- 25020817D/TT/DT/PhtD/Ply. Где в ряду заголовка встречается "флюид", это указывает на то, что сахарид был отсортирован по размеру с помощью микрофлюидизации перед конъюгацией. Размеры сахаридов после микрофлюидизации приведены в табл. 2. Таблица 1 Специфичные условия активации/сочетания/гашения конъюгатов PS S. pneumoniae-белок Примечание: рН а, с, r соответствует рН для активации, сочетания и гашения соответственно. Характеристика. Каждый конъюгат был охарактеризован и соответствовал параметрам, описанным в табл. 2. Содержание полисахарида (мкг/мл) измеряли с помощью резорцинового теста, а содержание белка (мкг/мл) методом Лоури. Конечное соотношение PS/PD (мас./мас.) определено на основании соотношения концентраций. Содержание свободного полисахарида (%). Содержание свободного полисахарида конъюгатов, которые держали при 4 С или хранили в течение 7 суток при 37 С, определяли на надосадочной жидкости, полученной после инкубации с антителами к белку-носителю и насыщенным сульфатом аммония с последующим центрифугированием. Метод ELISA -PS/-PS использовали для количественного определения свободного полисахарида в надосадочной жидкости. Отсутствие конъюгата также контролировали с помощью ELISA -белокноситель/-PS. Антигенность. Антигенность на тех же конъюгатах анализировали в ELISA сэндвич-типа, где иммобилизованное и определяющее антитела представляли собой -PS и -белок соответственно. Содержание свободного белка (%). Неконъюгированный белок-носитель может быть отделен от конъюгата во время стадии очистки. Содержание свободного остаточного белка определяли, используя эксклюзионную хроматографию размеров (TSK 5000-PWXL) с последующим УФ-обнаружением (214 нм). Условия элюирования давали возможность разделения свободного белка-носителя и конъюгата. Затем определяли содержание свободного белка в общих объемах конъюгатов против калибровочной кривой (от 0 до 50 мкг/мл белканосителя). Свободный белок-носитель в % был получен, как описано ниже:% свободного носителя = (свободный носитель (мкг/мл)/(суммарная концентрация соответствующего белка-носителя, измеренная по Лоури (мкг/мл)100%). Стабильность. Распределение молекулярной массы (Kav) и стабильность определяли на гель-фильтрации ВЭЖХЭХР (TSK 5000-PWXL) для конъюгатов, которые держали при 4 С или хранили в течение 7 суток при 37 С. 10/11/13/14-Валентная характеристика приведена в табл. 2 (см. примечание под таблицей). Белковые конъюгаты можно адсорбировать на фосфате алюминия и объединять с получением конечной вакцины. Таблица 2 Характеристики конъюгатов Размер PS после микрофлюидизации нативного PS.полисахарид, не отсортированный по размеру. н/о - не определяли. 10-Валентная вакцина была получена путем смешивания конъюгатов серотипа 1, 4, 5, 6 В, 7F, 9V,14, 18 С, 19F и 23F (например, при дозе 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 мкг сахарида, соответственно, на дозу для человека). 11-Валентная вакцина была получена путем дополнительного добавления конъюгата серотипа 3 из табл. 5 (например, при 1 мкг сахарида на дозу для человека). 13-Валентная вакцина была получена путем дополнительного добавления вышеописанных конъюгатов серотипов 19 А и 22F (где 22F либо непосредственно сшит с PhtD, либо альтернативно через линкер ADH) [например, при дозе 3 мкг каждого из сахаридов на дозу для человека]. 14-Валентную вакцину можно было получить путем дополнительного добавления вышеописанного конъюгата серотипа 6 А [например, при дозе 1 мкг сахарида на дозу для человека]. Пример 3. Данные, свидетельствующие о том, что включение белка D Haemophilus influenzae в иммуногенную композицию по изобретению может обеспечить улучшенную защиту против острого среднего отита (ОСО). Схема исследования. В исследовании использовали вакцину 11Pn-PD, содержащую серотипы 1, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14,18 С, 19F и 23F, каждый конъюгированный с белком D от Н. influenzae (ссылка на табл. 5 в примере 4). Субъектов рандомизировали на две группы для получения вакцины 11 Pn-PD или Havrix в возрасте при- 28020817 мерно 3, 4, 5 и 12-15 месяцев. Все субъекты получали сопутствующую вакцину GSK Biologicals' Infanrixhexa (DTPa-HBV-IPV/Hib) в возрасте 3, 4 и 5 месяцев. Infanrix-hexa представляет собой комбинацию Pediarix и Hib, смешанных перед введением. Наблюдение для анализа эффективности "в соответствии с протоколом" начинали через 2 недели после введения третьей дозы вакцины и продолжали до возраста 24-27 месяцев. Носоглоточное носительство S. pneumoniae и Н. influenzae оценивали в выбранной подгруппе субъектов. Родителям советовали проконсультироваться с исследователем, если их ребенок был болен, страдал ушной болью, спонтанной перфорацией барабанной перепонки или спонтанными выделениями из уха. Если исследователь подозревал эпизод ОСО, ребенка немедленно посылали к специалисту ухо-горло-нос(ЛОР) для подтверждения диагноза. Клинический диагноз ОСО был основан либо на внешнем виде барабанной перепонки (т.е. покраснения, вздутия, потери зрачковой реакции), либо на присутствии экссудата среднего уха (которое продемонстрировано с помощью простой или пневматической отоскопии или с помощью микроскопии). Кроме того, должны были присутствовать по меньшей мере два из приведенных ниже признаков или симптомов: ушная боль, выделения из уха, потеря слуха, лихорадка, вялость, раздражительность, анорексия,рвота или диарея. Если ЛОР специалист подтверждал клинический диагноз, образец жидкости среднего уха собирали с помощью тимпаноцентеза для бактериологического исследования. Для субъектов с повторяющимися заболеваниями новый эпизод ОСО считали начавшимся, если прошло более чем 30 суток от начала предыдущего эпизода. Кроме того, эпизод ОСО считали новым бактериальным эпизодом, если изолированная бактерия/серотип отличались от предыдущего изолята,каким бы ни был интервал между двумя последовательными эпизодами. Результаты испытания. Было зачислено всего 4968 детей младшего возраста, 2489 в группу 11Pn-PD и 2479 в контрольную группу. Между двумя группами отсутствовали значительные различия в демографических характеристиках или факторах риска. Клинические эпизоды и определение случая ОСО. В течение протоколируемого периода наблюдения было зарегистрировано суммарно 333 эпизода клинического ОСО в группе 11Pn-PD и 499 в контрольной группе. В табл. 3 представлена протективная эффективность вакцины 11Pn-PD и обеих 7-валентных вакцин,прежде испытанных в Финляндии (Eskola et al. N Engl J. Med 2001; 344: 403-409, и Kilpi et al. Clin InfectDis 2003 37:1155-64), против какого-либо эпизода ОСО и ОСО, вызванного различными серотипами пневмококка, Н. influenzae, NTHi и М. catarrhalis. Статистически значимое и клинически релевантное снижение на 33,6% общего бремени болезни ОСО было достигнуто при 11Pn-PD, независимо от этиологии (табл. 3). Общая эффективность против эпизодов ОСО вследствие любого из 11 серотипов пневмококка, содержащегося в вакцине 11Pn-PD, составляла 57,6% (табл. 3). Другим важным открытием в настоящем исследовании является 35,6% защита, обеспечиваемая вакциной 11Pn-PD против ОСО, вызванного Н. influenzae (и конкретно 35,3% защиты, обеспечиваемойNTHi). Это открытие имеет большое клиническое значение с учетом возросшей значимости Н. influenzae как основного возбудителя ОСО в эру пневмококковых конъюгатных вакцин. Параллельно с защитой,обеспечиваемой против ОСО, вакцина 11Pn-PD также снижала носоглоточное носительство Н. influenzae после бустер-дозы на втором году жизни. Эти открытия противоречат предшествующим наблюдениям в Финляндии, где для обеих 7-валентных пневмококковых конъюгатных вакцин наблюдали увеличение числа эпизодов ОСО вследствие Н. influenzae (Eskola et al. и Kilpi et al.) как свидетельство этиологического замещения. Четкую корреляцию между защитой против эпизодов ОСО вследствие Hi и уровнями антител против белка-носителя D невозможно было установить, поскольку концентрации антител анти-PD IgG после примирования у вакцинированных 11Pn-PD, у которых не было эпизодов Hi ОСО, были, по существу,такими же, как уровни антител анти-PD IgG после примирования, измеренные у вакцинированных 11PnPD, у которых развивался по меньшей мере один эпизод Hi ОСО в течение периода наблюдения эффективности. Однако, хотя невозможно было установить корреляцию между биологическим воздействием вакцины и иммуногенностью IgG анти-PD после примирования, разумно предположить, что белокноситель PD, который является высококонсервативным среди штаммов Н. influenzae, в значительной степени внес вклад в индукцию защиты против Hi. Эффект на заболевание ОСО сопровождался эффектом на носоглоточное носительство, который имел сходную величину для вакцины серотипов пневмококка и Н. influenzae (фиг. 1). Это снижение носоглоточного носительства Н. influenzae у вакцинированных PD-конъюгатами подтверждает гипотезу о прямом протективном эффекте PD-конъюгатной вакцины против Н. influenzae, даже если отсутствует корреляция протективной эффективности и иммунных ответов анти-PD IgG, которые измерены с помощью ELISA. В следующем эксперименте была использована модель среднего отита шиншилл с сывороточными пулами от детей младшего возраста, иммунизированных 11-валентным препаратом данного примера или