Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae

ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ КОНЪЮГАТЫ КАПСУЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ Бьеман Ральф Леон, Гаркон Натали МариЖозеф, Эрман Филипп Винсент, Пулман Ян, Ван Мешлен Марсель Полетт (BE) В настоящем изобретении раскрыта иммуногенная композиция, содержащая конъюгаты капсульных сахаридов Streptococcus pneumoniae серотипов 19 А и 19F, где 19 А конъюгирован с первым бактериальным анатоксином, a 19F конъюгирован со вторым бактериальным анатоксином. Также описаны вакцины, способы изготовления вакцин и применения этих вакцин. 014107 Область изобретения Настоящее изобретение относится к улучшенной вакцине на основе Streptococcus pneumoniae. Предшествующий изобретению уровень техники Дети в возрасте менее 2 лет не генерируют иммунный ответ на большинство полисахаридных вакцин, поэтому требовалось сделать эти полисахариды иммуногенными путем химического конъюгирования с белком-носителем. Связывание полисахарида, Т-независимого антигена, с белком, Т-зависимым антигеном, придает этому полисахариду свойства Т-зависимости, включая переключение изотипов, созревание аффинности и индуцирование памяти. Однако могут возникать проблемы с повторным введением конъюгатов полисахарид-белок или комбинации конъюгатов полисахарид-белок с образованием поливалентных вакцин. Например, сообщалось, что вакцину на основе полисахаридов Haemophilus influenzae типа b (PRP (полирибозил-рибитолфосфатный капсульный полисахарид, в которой в качестве белка-носителя использован столбнячный анатоксин (ТТ), тестировали в диапазоне доз с одновременной иммунизацией (свободным) ТТ и вакциной на основе конъюгата пневмококковый полисахарид-ТТ, следуя стандартной схеме для детей. По мере увеличения дозы пневмококковой вакцины иммунный ответ на PRP полисахаридную часть Hib конъюгатной вакцины снижался, что указывает на иммунное вмешательство полисахарида, возможно через использование одного и того же белка-носителя (Dagan et al., Infect. Immun. (1998), 66: 2093-2098). Было также доказано, что влияние дозы белка-носителя на гуморальный ответ на сам белок является разносторонним. Как сообщалось, у маленьких детей увеличение дозы тетравалентного конъюгата на основе столбнячного анатоксина приводило к снижению ответа на столбнячный носитель (Dagan et al.,см. выше). Классический анализ таких эффектов комбинированных вакцин был описан как индуцированная носителем супрессия эпитопов, что не совсем понятно, но представляется результатом избыточного количества белка-носителя (Fattom, Vaccine 17: 126 (1999. По всей вероятности, это приводит к конкуренции за Th-клетки между В-клетками к белку-носителю и В-клетками к полисахариду. Если преобладают В-клетки к белку-носителю, то Th-клеток, способных обеспечить необходимую помощь специфичным к данному полисахариду В-клеткам, оказывается недостаточно. Однако наблюдаемые иммунологические эффекты оказались противоречивы, так как в некоторых случаях общее количество белканосителя увеличивало иммунный ответ, а в других случаях снижало иммунный ответ. Таким образом, остаются технические трудности при комбинировании множества полисахаридных конъюгатов в едином эффективном вакцинном препарате.Streptococcus pneumoniae является грамположительной бактерией, ответственной за значительную заболеваемость и смертность (особенно среди детей и пожилых людей), вызывающей инвазивные заболевания, такие как пневмония, бактериемия и менингит, и заболевания, ассоциированные с колонизацией, такие как острый средний отит. Установлено, что частота заболеваемости пневмококковой пневмонией в США для людей в возрасте старше 60 лет составляет 3-8 на 100000. В 20% случаев это приводит к бактериемии и другим проявлениям, таким как менингит, с процентом смертности, близким 30% даже при лечении антибиотиками. Пневмококк окружен капсулой из связанного химическими связями полисахарида, который придает ему серотипическую специфичность. Существует 90 известных серотипов пневмококков, и такая капсула представляет собой ключевую детерминанту вирулентности для пневмококков, поскольку капсула не только защищает внутреннюю поверхность бактерии от комплемента, но и сама проявляет слабые иммуногенные свойства. Полисахариды являются Т-независимыми антигенами и не могут процессироваться или быть представленными на молекулах МНС (главного комплекса гистосовместимости) для взаимодействия с Т-клетками. Однако они могут стимулировать иммунную систему посредством альтернативного механизма, включающего перекрестное связывание поверхностных рецепторов на В-клетках. В некоторых экспериментах было показано, что защита от инвазивного пневмококкового заболевания коррелирует наиболее сильно с антителом, специфичным к данной капсуле, и такая защита является серотипически специфичной.Streptococcus pneumoniae представляет собой самую распространенную причину инвазивного бактериального заболевания и среднего отита у младенцев и маленьких детей. Аналогично пожилые люди генерируют слабые ответы на пневмококковые вакцины [Roghmann et al. (1987), J. Gerontol. 42: 265-270],отсюда - возрастающая частота заболеваемости бактериальной пневмонией в этой популяции [Vergheseand Berk (1983), Medicine (Baltimore) 62: 271-285]. Поэтому задача настоящего изобретения - разработать улучшенную композицию вакцины на основе конъюгатов полисахаридов Streptococcus pneumoniae многих серотипов.-1 014107 Краткое описание графических материалов Фиг. 1. Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (уровни анти-PS IgG после двух инокуляций (post-II. Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность 11-валентного конъюгата у пожилых макак-резус. Более светлые столбцы представляют собой GMC (средние геометрические концентрации) после двух инокуляций 11-валентного конъюгата в алюминий-фосфатном адъюванте. Более темные столбцы представляют собой GMC после двух инокуляций 11-валентного конъюгата в адъюванте С. Фиг. 2. Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (частота встречаемости анти-PS3 В-клеток памяти post-II). Гистограмма, на которой продемонстрированы В-клетки памяти в отношенииPS3 после инокуляции 11-валентного конъюгата в адъюванте С или алюминий-фосфатном адъюванте. Фиг. 3. PS19F-иммуногенность у Balb/c мышей (post-III уровни IgG). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность в отношении полисахарида 19F у Balb/c мышей для 4-валентных простых полисахаридов и 4-валентных dPly конъюгатов. Фиг. 4. PS22F-иммуногенность у Balb/c мышей (post-III уровни IgG). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность в отношении полисахарида 22F у Balb/c мышей для 4-валентных простых полисахаридов и 4-валентных PthD конъюгатов. Фиг. 5. Уровни сывороточных анти-PS IgG антител. Гистограмма, на которой продемонстрирован анти-22F IgG-ответ у Balb/c мышей. Фиг. 6. Опсонофагоцитарные титры. Гистограмма, на которой продемонстрированы анти-22F опсонофагоцитарные титры у Balb/c мышей. Фиг. 7. Сравнение IgG-ответов, индуцированных при использовании новых адъювантов, по сравнению с ответом, вызываемым при использовании AlPO4. Гистограмма для сравнения IgG-ответов, индуцированных у молодых C57Bl мышей после иммунизации 13-валентной конъюгатной вакциной, приготовленной в разных адъювантах. Фиг. 8. Защитная эффективность комбинации белков PhtD+dPly против легочной колонизации типом 19F у макак-резус. Гистограмма, на которой продемонстрирована защитная эффективность разных вакцинных комбинаций в модели пневмонии у обезьян. Фиг. 9. Сывороточный анти-PhtD IgG-ответ. Гистограмма, на которой продемонстрированы антиPhtD IgG-ответы у Balb/c мышей после иммунизации конъюгатами 22F-PhtD или 22F-AH-PhtD. Фиг. 10. Защита против контрольного заражения пневмококками типа 4 у мышей после иммунизации 22F-PhtD или 22F-AH-PhtD. Описание изобретения Согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая конъюгаты капсульных сахаридов Streptococcus pneumoniae серотипов 19 А и 19F, где 19 А конъюгирован с белкомносителем, представляющим собой первый бактериальный анатоксин, a 19F конъюгирован с белкомносителем, представляющим собой второй бактериальный анатоксин. Термин "капсульный сахарид" включает капсульные полисахариды и олигосахариды, производные от этого капсульного полисахарида. Олигосахарид содержит по меньшей мере 4 остатка сахара. Термины "конъюгат" и "конъюгированный" относятся к капсульному сахариду, ковалентно соединенному с белком-носителем. Для целей данного изобретения "иммунизация человека-реципиента против обострений COPD",или "лечение или предупреждение обострений COPD", или "уменьшение тяжести обострений COPD" относятся к уменьшению возникновения обострений или частоты заболеваемости обострениями COPD(например, уменьшение частоты заболеваемости на 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20% или более), например, в группе пациентов, иммунизированных композициями или вакцинами по изобретению. Термин "бактериальный анатоксин" включает в себя бактериальные токсины, которые инактивированы в результате либо генетической мутации, либо химической обработки, либо конъюгирования. Подходящие бактериальные анатоксины включают столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин (DT),коклюшный анатоксин, бактериальные цитолизины или пневмолизин. Описаны мутации пневмолизина(Ply), снижающие токсичность пневмолизина (WO 90/06951, WO 99/03884). Аналогично, известны генетические мутации дифтерийного токсина, снижающие его токсичность (см. ниже). Генетически детоксифицированные аналоги дифтерийного токсина включают CRM197 и другие мутанты, описанные вUS 4709017, US 5843711, US 5601827 и US 5917017. CRM197 представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но иммунологически не отличим от дифтерийного токсина. CRM197 продуцируется С.diphtheriae, инфицированным нетоксикогенным фагом 197tox, созданным мутагенезом в результате действия нитрозогуанидина на токсикогенный коринефаг b (Uchida et al., Nature New Biology (1971),233, 8-11). Белок CRM197 имеет ту же молекулярную массу, что и дифтерийный токсин, но отличается от него изменением единственного основания в структурном гене. Это приводит к замене аминокислоты глицина на глутамин в положении 52, что делает фрагмент А не способным к связыванию с NAD (никотинамидадениндинуклеотид) и, следовательно, не токсичным (Pappenheimer 1977, Ann. Rev. Biochem. 46,69-94; Rappuoli, Applied and Enviromental Microbiology, Sept. 1983, p. 560-564).-2 014107 Первый и второй бактериальные анатоксины могут быть одинаковыми или разными. Если первый и второй бактериальные анатоксины разные, это означает, что они имеют разную аминокислотную последовательность. Например, 19 А и 19F могут быть конъюгированы со столбнячным анатоксином и столбнячным анатоксином; дифтерийным анатоксином и дифтерийным анатоксином; CRM197 и CRM197; пневмолизином и пневмолизином; столбнячным анатоксином и дифтерийным анатоксином; столбнячным анатоксином и CRM197; столбнячным анатоксином и пневмолизином; дифтерийным анатоксином и столбнячным анатоксином; дифтерийным анатоксином и CRM197; дифтерийным анатоксином и пневмолизином;CRM197 и столбнячным анатоксином; CRM197 и дифтерийным анатоксином; CRM197 и пневмолизином; пневмолизином и столбнячным анатоксином; пневмолизином и дифтерийным анатоксином или пневмолизином и CRM197 соответственно. В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов Streptococcus pneumoniae 19A и 19F иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды S.pneumoniae 4, 6 В, 9V,14, 18 С и 23F. В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов Streptococcus pneumoniae 19A и 19F иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды S.pneumoniae 1, 4, 5, 6 В,7F, 9V, 14, 18 С и 23F. В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов Streptococcus pneumoniae 19A и 19F иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды S.pneumoniae 1, 4, 5, 6 В,7F, 9V, 14, 18 С, 22F и 23F. В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов Streptococcus pneumoniae 19A и 19F иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды S.pneumoniae 1, 3, 4, 5,6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 22F и 23F. В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов Streptococcus pneumoniae 19A и 19F иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды S.pneumoniae 1, 3, 4, 5,6 А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 22F и 23F. Обычно вакцины на основе Streptococcus pneumoniae по настоящему изобретению будут содержать капсульные сахаридные антигены (возможно, конъюгированные), при этом сахариды происходят по меньшей мере из десяти серотипов S.pneumoniae. Количество капсульных сахаридов S.pneumoniae может меняться от 10 разных серотипов (или "V", валентностей) до 23 разных серотипов (23V). В одном воплощении имеется 10, 11, 12, 13, 14 или 15 разных серотипов. В другом воплощении изобретения вакцина может содержать конъюгированные сахариды S.pneumoniae и неконъюгированные сахаридыS.pneumoniae. Возможно, общее количество сахаридных серотипов меньше или равно 23. Например, данное изобретение может включать 10 конъюгированных серотипов и 13 неконъюгированных сахаридов. Аналогично, вакцина может содержать 11, 12, 13, 14 или 16 конъюгированных сахаридов и 12, 11, 10, 9 или 7 соответственно неконъюгированных сахаридов. В одном из воплощений поливалентная пневмококковая вакцина по изобретению будет выбрана из следующих серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20,22F, 23F и 33F, хотя очевидно, что один или два других серотипа могли бы быть заменены в зависимости от возраста реципиента, в зависимости от возраста реципиента, получающего вакцину, и географического места, где эту вакцину будут вводить. Например 10-валентная вакцина может содержать полисахариды из серотипов 1, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F; 11-валентная вакцина также может включать в себя сахариды из серотипа 3; 12- или 13-валентная педиатрическая (детская) вакцина также может включать в себя 11-валентную композицию, дополненную серотипами 6 А и 19 А, или 6 А и 22F, или 19 А и 22F, или 6 А и 15 В, или 19 А и 15 В, или 22F и 15 В, в то время как 13-валентная вакцина для пожилых людей может включать в себя 10- или 11-валентную композицию, дополненную серотипами 19 А и 22F, 8 и 12 F, или 8 и 15 В, или 8 и 19 А, или 8 и 22F, или 12F и 15 В, или 12F и 19 А, или 12F и 22F, или 15 В и 19 А, или 15 В и 22F; 14-валентная педиатрическая вакцина может включать описанную выше 10-валентную композицию, дополненную серотипами 3, 6 А, 19 А и 22F; серотипами 6 А, 8, 19 А и 22F; серотипами 6 А, 12F, 19 А и 22F; серотипами 6 А, 15 В, 19 А и 22F; серотипами 3, 8, 19 А и 22F; серотипами 3, 12F, 19 А и 22F; серотипами 3, 15 В, 19 А и 22F; серотипами 3, 6 А, 8 и 22F; серотипами 3, 6 А, 12F и 22F; или серотипами 3, 6 А,15 В и 22F. В одном воплощении композиция включает капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 4,5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F (предпочтительно конъюгированные). В другом воплощении изобретения включены по меньшей мере 11 сахаридных антигенов (предпочтительно конъюгированных), например капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6 В,7F, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F. В другом воплощении изобретения включены по меньшей мере 12 или 13 сахаридных антигенов,например вакцина может содержать капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6 А, 6 В,7F, 9V, 14, 18 С, 19 А, 19F и 23F, или капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6 В, 7F,-3 014107 9V, 14, 18 С, 19 А, 19F, 22F и 23F, хотя и другие сахаридные антигены, например 23-валентной вакцины(такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11A, 12F, 14, 15 В, 17 С, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F,23F и 33F), также охвачены изобретением. Вакцина по настоящему изобретению может содержать белок D (PD) из Haemophilus influenzae (см.,например, ЕР 0594610). Haemophilus influenzae представляет собой главный организм-возбудитель среднего отита, и авторы настоящего изобретения показали, что включение этого белка в вакцину на основеStreptococcus pneumoniae будет обеспечивать уровень защиты в отношении среднего отита, связанного сHaemophilus influenzae (ссылка на публикацию РОЕТ). В одном из воплощений вакцинная композиция содержит белок D (PD). В одном аспекте PD присутствует в качестве белка-носителя одного или более сахаридов. В другом аспекте PD может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. В следующем аспекте белок D присутствует как в качестве белка-носителя, так и в виде свободного белка. Белок D может быть использован в виде полноразмерного белка или в виде фрагмента (WO 0056360). В следующем аспекте белок D представлен в качестве белка-носителя для большинства сахаридов, например 6, 7, 8, 9 или более сахаридов могут быть конъюгированы с белком D. В этом аспекте белок D также может быть представлен в виде свободного белка. Вакцина по настоящему изобретению содержит два или более разных типов белка-носителя. Каждый тип белка-носителя может выступать в качестве носителя более чем для одного сахарида, причем сахариды могут быть одинаковыми или разными. Например, серотипы 3 и 4 могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя. В одном из воплощений два или более разных сахаридов могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя. Каждый капсульный сахарид Streptococcus pneumoniae может быть конъюгирован с белкомносителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ, PhtD,слитых конструкций PhtBE или PhtDE (в частности, описанных в WO 01/98334 и WO 03/54007), детоксифицированного пневмолизина и белка D. Более полный перечень белковых носителей, которые могут быть использованы в конъюгатах по изобретению, представлен ниже. Белок-носитель, конъюгированный с одним или более капсульным сахаридом S.pneumoniae в конъюгатах, представленных в иммуногенных композициях по изобретению, возможно является членом белков полигистидинового триадного семейства (Pht), их фрагментами или слитыми белками. БелкиPhtA, PhtB, PhtD или PhtE могут иметь аминокислотную последовательность, идентичную на 80, 85, 90,95, 98, 99 или 100% с последовательностью, раскрытой в WO 00/37105 или WO 00/39299 (например, с аминокислотной последовательностью 1-838 или 21-838 в SEQ ID NO: 4 из WO 00/37105 для PhtD). Например, слитые белки состоят из полноразмерных 2-, 3- или 4-х PhtA, PhtB, PhtD, PhtE или их фрагментов. Примерами слитых белков являются PhtA/B, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/E, PhtD/A,PhtD/B, PhtD/E, PhtE/A, PhtE/B и PhtE/D, при этом белки связаны с белком, упомянутым, первым поN-концу (см., например, WO 01/98334). Там, где используются фрагменты Pht белков (по отдельности или в виде части слитого белка), каждый фрагмент возможно содержит один или более гистидиновый триадный мотив и/или участок двойной спирали таких полипептидов. Гистидиновый триадный мотив представляет собой часть полипептида, имеющего последовательность HxxHxH, где H является гистидином, а x является аминокислотой,отличной от гистидина. Участок двойной спирали представляет собой участок, спрогнозированный на основании алгоритма "Coils" (Lupus, A. et al. (1991), Science 252: 1162-1164). В одном из воплощений этот или каждый фрагмент включает один или более гистидиновый триадный мотив, а также по меньшей мере один участок двойной спирали. В одном из воплощений этот или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 гистидиновых триадных мотивов (возможно, с нативнойPht-последовательностью между 2 или более триадами либо внутритриадной последовательностью, более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100% идентичной нативной внутритриадной Pht-последовательности пневмококков - например, внутритриадной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4 изWO 00/37105 для PhtD). В одном из воплощений этот или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3 или 4 участка двойной спирали. В одном из воплощений Pht-белок, раскрытый в данном описании, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью,зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот наN-конце), существующие в природе варианты Pht-белка и иммуногенные фрагменты Pht-белка (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в WO 00/37105 или WO 00/39299, где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфический для аминокислотной последовательности, указанной в WO 00/37105 или WO 00/39299). В частности, термин "PhtD", как он использован в данном описании, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на N-конце), существующие в природе варианты PhtD и иммуногенные фрагменты PhtD (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, со-4 014107 держащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательностиPhtD в WO 00/37105 или WO 00/39299, где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ,специфичный для PhtD аминокислотной последовательности, указанной в WO 00/37105 илиWO 00/39299 (например, SEQ ID NO: 4 из WO 00/37105 для PhtD). Если белковый носитель является одинаковым для 2 или более сахаридов в композиции, эти сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белкового носителя (при этом молекулы носителя будут иметь еще 2 разных сахарида, конъюгированных с ним) [см., например WO 04/083251]. Альтернативно, каждый из сахаридов по отдельности может быть конъюгирован с разными молекулами белкового носителя (при этом с каждой молекулой белкового носителя конъюгирован только один тип сахарида). Примерами белков-носителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются DT (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин) или фрагмент С из ТТ, DT CRM197(мутант DT), другие точечные мутанты DT, такие как CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al. J. Biol.Chem. 218: 3838-3844, 1973); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 и CRM107, и другие мутации, описанные в Nicholls and Youle, Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc., 1992; делеция или мутация Glu-148 на Asp, Gln или Ser и/или Ala 158 на Gly и другие мутации, раскрытые в US 4709017 или US 4950740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/илиdPLY-формол, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, и слитые конструкции Pht белков, например слитые конструкции PhtDE, слитые конструкции PhtBE (WO 01/98334 и WO 03/54007) (Pht A-E описаны более подробно ниже), ОМРС (менингококковый белок наружной мембраны - обычно экстрагируемый изN.meningitidis), PD (белок D Haemophilus influenzae - см., например, ЕР 0594610 В) или их иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), коклюшные белки (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, ростовые факторы или гормоны (WO 91/01146), искусственные белки, содержащие многочисленные человеческие CD4+ Т-клеточные эпитопы из различных антигенов, происходящих из патогенов (Falugi etal. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 3816-3824), такие как белок N19 (Baraldoi et al. (2004), Infect. Immun. 72: 4884-7), пневмококковый поверхностный белок PspA (WO 02/091998), железосвязывающие белкиJournal, 23(11): 1008-14, 2004 Nov. описана 11-валентная пневмококковая вакцина со всеми серотипами,конъюгированными с PD. Однако авторы настоящего изобретения показали, что опсонофагоцитарная активность была улучшенной в отношении антител, индуцированных конъюгатами, имеющими 19F,конъюгированный с DT, по сравнению с 19F, конъюгированным с PD. Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что более высокая перекрестная реактивность в отношении 19 А наблюдается при использовании 19F, конъюгированного с DT. Следовательно, особенностью композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19F конъюгирован с бактериальным анатоксином, например ТТ,пневмолизином, DT или CRM197. В одном аспекте серотип 19F конъюгирован с DT. Также особенностью композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19 А конъюгирован с бактериальным анатоксином, например ТТ,пневмолизином, DT или CRM197. Все остальные сахаридные серотипы иммуногенной композиции могут быть конъюгированы с одним или более белками-носителями, не являющимися DT (т.е. только 19F конъюгирован с DT), или могут быть распределены между одним или более белками-носителями, не являющимися DT, и самим DT. В одном воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а все остальные серотипы конъюгированы с PD. В другом воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD и ТТ, или DT, или CRM197. В другом воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197 и не более чем один сахарид конъюгирован с ТТ. В одном аспекте этого воплощения одним указанным сахаридом является 18 С или 12F. В другом воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197 и не более чем два сахарида конъюгированы с ТТ. В другом воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ и DT или CRM197. В другом воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ и пневмолизином. В еще одном воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ и CRM197.-5 014107 В другом воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ, пневмолизином и возможно PhtD или слитым белком PhtD/E. В другом воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, 19 А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, а остальные серотипы распределены между PD, ТТ, пневмолизином и возможно PhtD или слитым белком PhtD/E. В другом воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, 19 А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, еще один сахарид конъюгирован с ТТ, еще один сахарид конъюгирован с PhtD или PhtD/E, а все остальные сахариды конъюгированы с PD. В другом воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, 19 А конъюгирован с пневмолизином,еще один сахарид конъюгирован с ТТ, еще один сахарид конъюгирован с пневмолизином, еще 2 других сахарида конъюгированы с PhtD или PhtD/E, a все остальные сахариды конъюгированы с PD. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит белок D из Haemophilusinfluenzae. В этом воплощении, если PD не является одним из белков-носителей, используемых для конъюгирования с любыми сахаридами, отличными от 19F, например 19F конъюгирован с DT, в то время как другие серотипы конъюгированы с одним или более другими белками-носителями, не являющимися PD, тогда PD будет присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. Если PD является одним из белков-носителей, используемых для конъюгирования сахаридов, отличных от 19F, тогда PD возможно, может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. Термин "сахарид" в данном описании может указывать на полисахарид или олигосахарид и включает в себя их оба. Полисахариды выделяют из бактерий, и они могут быть до некоторой степени доведены до определенного размера известными способами (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525), и возможно микрофлюидизацией. Полисахариды могут быть доведены до определенного размера с целью снижения вязкости полисахаридных образцов и/или для улучшения фильтруемости конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют небольшое количество повторяющихся единиц (обычно 5-30 повторяющихся единиц) и обычно представляют собой гидролизованные полисахариды. Капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae содержат повторяющиеся олигосахаридные единицы, которые могут содержать вплоть до 8 сахарных остатков. Обзора по олигосахаридным единицам ключевых серотипов Streptococcus pneumoniae см. в JONES, Christopher, Vaccines based on the cellsurface carbohydrates of patogenic bacteria. An. Acad. Bras. Cienc, June 2005, vol. 77,2, p. 293-324. ISSN 0001-3765. В одном воплощении капсульный сахаридный антиген может представлять собой полноразмерный полисахарид, однако в других воплощениях это может быть одна олигосахаридная единица или более короткая, чем длина нативной цепи, сахаридная цепь из повторяющихся олигосахаридных единиц. В одном воплощении все сахариды, присутствующие в вакцине, являются полисахаридами. Полноразмерные полисахариды могут быть "доведены до определенного размера", т.е. их размер может быть уменьшен различными способами, такими как обработка посредством кислотного гидролиза, обработка перекисью водорода, уменьшение размера с помощью emulsiflex с последующей обработкой перекисью водорода для образования олигосахаридных фрагментов или микрофлюидизация. Авторы изобретения также отмечают, что в данной области техники внимание было сфокусировано на применении олигосахаридов для облегчения получения конъюгатов. Авторы изобретения обнаружили, что в результате использования нативных или слегка уменьшенных в размере полисахаридных конъюгатов может быть реализовано одно или более из следующих преимуществ: 1) конъюгат с высокой иммуногенностью, являющийся фильтруемым; 2) соотношение полисахарида и белка в конъюгате может быть изменено таким образом, чтобы увеличить отношение полисахарида к белку (мас./мас.) в конъюгате (что может влиять на эффект супрессии носителем); 3) иммуногенные конъюгаты, имеющие склонность к гидролизу, могут быть стабилизированы посредством применения больших по размеру сахаридов для конъюгирования. Применение больших по размеру полисахаридов может приводить к большему сшиванию с носителем конъюгата и может уменьшать высвобождение свободного сахарида из конъюгата. В конъюгатных вакцинах, описанных в предшествующем уровне техники, имеется тенденция к деполимеризации полисахаридов перед конъюгированием для улучшения конъюгирования. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что сахаридные конъюгатные вакцины, сохраняющие больший размер сахарида, могут вызывать хороший иммунный ответ против пневмококкового заболевания. Таким образом, иммуногенная композиция по изобретению может содержать один или более чем один сахаридный конъюгат, где средний размер (например, средневзвешенная молекулярная масса Mw) каждого сахарида перед конъюгированием составляет более 80, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 кДа. В одном воплощении конъюгат после конъюгирования должен легко фильтроваться через фильтр 0,2 мкм,так чтобы после фильтрации получался выход более 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с образцом до фильтрации.-6 014107 Для целей данного изобретения "нативный полисахарид" относится к сахариду, который не был подвергнут обработке, целью которой является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может стать немного меньшим по размеру в ходе обычных процедур очистки. Такой сахарид все еще является нативным. Только если полисахарид был подвергнут процедурам уменьшения размера, такой полисахарид не считается нативным. Для целей данного изобретения "уменьшенный в размере вплоть до 2 раз" означает, что сахарид подвергается обработке, предназначенной для уменьшения размера этого сахарида, но с сохранением размера, равного более чем половине размера нативного полисахарида. 3, 4 и т.д. следует интерпретировать таким же образом, т.е. сахарид подвергается обработке, предназначенной для уменьшения размера этого полисахарида, но с сохранением размера, равного более чем трети, четверти и т.д. размера нативного полисахарида. В одном из аспектов изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды Streptococcuspneumoniae по меньшей мере из 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или каждый сахарид S.pneumoniae представляет собой нативный полисахарид. В одном из аспектов изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды Streptococcuspneumoniae по меньшей мере из 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или все сахариды S.pneumoniae уменьшены в размере вплоть до 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 или 10 раз. В одном воплощении этого аспекта большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или более сахаридов, уменьшены в размере вплоть до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз. Молекулярная масса или средняя молекулярная масса сахарида в данном описании относится к средневзвешенной молекулярной массе (Mw) сахарида, измеренной до конъюгирования, и ее измеряют с помощью MALLS (многоуглового рассеяния лазерного света). Методика MALLS хорошо известна в данной области техники, и ее обычно выполняют, как описано в примере 2. Для MALLS-анализа пневмококковых сахаридов можно использовать в комбинации две колонки (TSKG6000 и 5000PWxl), и сахариды элюируют в воде. Сахариды детектируют, используя детектор рассеяния света (например, Wyatt Dawn DSP, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и инферометрический рефрактометр (например, Wyatt Otilab DSP, оборудованный ячейкой Р 100 и красным фильтром на 498 нм). В одном из воплощений сахариды S.pneumoniae представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, размер которых был уменьшен в процессе обычного процесса экстракции. В одном из воплощений сахариды S.pneumoniae уменьшены в размере посредством механического расщепления, например микрофлюидизацией или обработкой ультразвуком. Микрофлюидизация и воздействие ультразвука имеют преимущество, уменьшая размер более крупных нативных полисахаридов в степени, достаточной для получения фильтруемого конъюгата. Уменьшение в размере осуществляют не более чем в 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3 или 2 раза. В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит конъюгаты S.pneumoniae, которые приготовлены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, которые уменьшены в размере не более чем в 20 раз. В одном аспекте этого воплощения большая часть сахаридов, например 6, 7, 8 или более сахаридов, уменьшены в размере вплоть до 2, 3, 4, 5 или 6 раз. В одном из воплощений сахарид Streptococcus pneumoniae конъюгирован с белком-носителем через линкер, например бифункциональный линкер. Линкер, возможно, является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имеющим, например, реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную карбоновокислотную группу, 2 реакционноспособные аминогруппы или две реакционноспособные карбоновокислотные группы. Линкер имеет, например, 4-20, 4-12, 5-10 атомов углерода. Возможным линкером является ADH (дигидразид адипиновой кислоты). Другие линкеры включают В-пропионамидо (WO 00/10599), нитрофенилэтиламин (Gever et al. (1979), Med. Microbiol. Immunol. 165: 171-288), галогеноалкилгалогениды (US 4057685), гликозидные связи (US 4673574, US 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (US 4459286). В одном из воплощений в качестве линкера для конъюгирования сахарида из серотипа 18 С используют ADH. Сахаридные конъюгаты, присутствующие в иммуногенных композициях по изобретению, могут быть получены любым известным методом сочетания. Способ конъюгирования может быть основан на активации сахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием сложного цианатного эфира. Таким образом, активированный сахарид может быть подвергнут сочетанию непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсером может быть цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида,который можно связать с носителем через простую тиоэфирную связь, полученную после взаимодействия с малеимид-активированным белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогеноацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида [например этилйодацетимида HCl], или N-сукцинимидил-бромацетата, или SIAB (N-сукцинимидил-(4-йодацетат)аминобензоат), или SIA (N-сукцинимидил-иодацетат), или SBAP (N-сукцинимидил-3-(бромацетатамидо)пропионат). Возможно, цианатный сложный эфир (возможно, полученный посредством CDAP-7 014107 химии) подвергают сочетанию с гексан-диамином или ADH, и аминопроизводный сахарид конъюгируют с белком-носителем, используя карбодиимидную (например, EDAC или EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид химию, через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны в опубликованной РСТ заявке WO 93/15760 (Uniformed Services University), WO 95/08348 иWO 96/29094. В других подходящих методиках используются карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборнан, паранитробензойная кислота, N-гидроксисукцинимид (NHS), S-NHS (сульфо-NHS),EDC, TSTU (O-(N-сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат). Многие методики описаны в WO 98/42721. В конъюгирование может быть вовлечен карбонильный линкер, который может быть образован путем взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI(1,1'-карбонилдиимидазол) (Bethell et al. J. Biol. Chem. 1979, 254: 2572-4; Hearn et al. J. Chromatogr. 1981,218: 509-18) и последующего взаимодействия с белком с образованием карбаматной связи. Этот способ может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможное введение защиты/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием CDI-карбаматного промежуточного соединения и сочетание CDIкарбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке. Конъюгаты также могут быть получены методами прямого восстановительного аминирования, как описано в US 4365170 (Jennings) и US 4673574 (Anderson). Другие методы описаны в ЕР-0161188,ЕР-208375 и ЕР-0477508. Другой способ включает связывание активированного бромцианом (или CDAP) сахарида, дериватизированного с использованием дигидразида адипиновой кислоты (ADH), с белковым носителем посредством карбодиимидной конденсации (Chu С. et al. Infect. Immunity, 1983, 245-256), например с использованием EDAC. В одном из воплощений гидроксильную группу (возможно, активированную гидроксильную группу, например гидроксильную группу, активированную с целью получения цианатного сложного эфира[например, используя CDAP]) на сахариде связывают с аминогруппой или карбоксильной группой на белке либо непосредственно, либо опосредовано (через линкер). Если присутствует линкер, то гидроксильную группу на сахариде предпочтительно связывают с аминогруппой на линкере, например используя CDAP-конъюгирование. Другая аминогруппа в линкере (например, ADH) может быть конъюгирована с карбоновокислотной группой на белке, например с использованием карбодиимидной химии,например путем использования EDAC. В одном из воплощений пневмококковый(е) капсульный(е) сахарид(ы) конъюгируют с линкером до того, как линкер конъюгируют с белком-носителем. Альтернативно,линкер может быть конъюгирован с носителем до конъюгирования с сахаридом. Также можно применять комбинацию методик, при этом некоторые конъюгаты сахарид-белок получают с использованием CDAP, а некоторые - путем восстановительного аминирования. В общем случае для связывания/конъюгирования могут быть использованы следующие типы химических групп на белковом носителе: а) карбоксильная (например, через аспарагиновую или глутаминовую кислоту). В одном воплощении эту группу связывают с аминогруппами на сахаридах непосредственно или с аминогруппой на линкере, используя карбодиимидную химию, например EDAC; б) аминогруппа (например, через лизин). В одном воплощении эту группу связывают с карбоксильными группами на сахаридах непосредственно или с карбоксильной группой на линкере, используя карбодиимидную химию, например EDAC. В другом воплощении эту группу связывают с гидроксильными группами, активированными CDAP или CNBr на сахаридах непосредственно, или с такими же группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами,имеющими сукцинимидную эфирную группу; в) сульфгидрил (например, через цистеин). В одном воплощении эту группу связывают с бром- или хлор-ацетилированным сахаридом или линкером, используя малеимидную химию. В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином; г) гидроксильная группа (например, через тирозин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином; д) имидазолильная группа (например, через гистидин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином; е) гуанидильная группа (например, через аргинин); ж) индолильная группа (например, через триптофан). В общем случае для связывания на сахариде можно использовать следующие группы: ОН, СООН или NH2. Альдегидные группы могут быть образованы в результате разных обработок, известных в данной области техники, таких как обработка периодатом, кислотный гидролиз, обработка перекисью водорода и т.д.-8 014107 Подходы на основе прямого связывания: сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный эфир + NH2-белокконъюгат; сахарид-альдегид + NH2-белокоснование Шиффа + NaCNBH3 конъюгат; сахарид-СООН + NH2-белок + EDACконъюгат; сахарид-NH2 + СООН-белок + EDACконъюгат. Подходы на основе непрямого связывания через спейсер (линкер): сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный эфир + NH2NH2 сахаридNH2 + СООН-белок+ EDACконъюгат; сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный эфир + NH2SHсахаридSH + SH-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с помощью, например, SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионатсахарид-S-S-белок; сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный эфир + NH2SHсахаридSH + малеимид-белок(модификация аминогрупп)конъюгат; сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный эфир + NH2SHсахарид-SH + галогенацетилированный белокконъюгат; сахарид-СООН + EDAC + NH2NH2 сахаридNH2 + EDAC + СООН-белокконъюгат; сахарид-СООН + EDAC+ NH2SHсахаридSH + SH-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с помощью, например, SPDP)сахарид-S-S-белок; сахарид-СООН + EDAC+ NH2SHсахаридSH + малеимид-белок (модификация аминогрупп)конъюгат; сахарид-СООН + EDAC + NH2SHсахарид-SH + галогенацетилированный белокконъюгат; сахарид-альдегид + NH2NH2 сахаридNH2 + EDAC + СООН-белокконъюгат. Примечание: вместо указанного выше EDAC можно использовать любой подходящий карбодиимид. Таким образом, типами химических групп белкового носителя, которые обычно могут быть использованы для сочетания с сахаридом, являются аминогруппы (например, на остатках лизина), группы СООН (например, на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислоты) и группы SH (если это приемлемо) (например, на остатках цистеина). Возможно, что соотношение белка-носителя и сахарида S.pneumoniae составляет от 1:5 до 5:1; от 1:2 до 2,5:1; от 1:1 до 2:1 (мас./мас.). В одном из воплощений большинство конъюгатов, например 6, 7, 8,9 или более конъюгатов, имеют соотношение белка-носителя к сахариду, превышающее 1:1, например 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 или 1,6:1. В одном из воплощений по меньшей мере один сахарид S.pneumoniae конъюгирован с белкомносителем через линкер с использованием CDAP и EDAC. Например, 18 С может быть конъюгирован с белком через линкер (например, линкер с двумя группами гидразино на концах, такой как ADH) с использованием CDAP и EDAC, как описано выше. При использовании линкера CDAP можно использовать для конъюгирования сахарида с линкером, и EDAC затем можно использовать для конъюгирования линкера с белком или, альтернативно, сначала EDAC может быть использован для конъюгирования линкера с белком, после чего CDAP может быть использован для конъюгирования линкера с сахаридом. В общем случае иммуногенная композиция по изобретению может содержать дозу каждого сахаридного конъюгата от 0,1 до 20 мкг, от 1 до 10 мкг или от 1 до 3 мкг сахарида. В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит каждый капсульный сахарид S.pneumoniae в дозе 0,1-20 мкг; 0,5-10 мкг; 0,5-5 мкг или 1-3 мкг сахарида. В одном из воплощений капсульные сахариды могут быть представлены в разных дозировках, например некоторые капсульные сахариды могут быть представлены в дозе точно 1 мкг или некоторые капсульные сахариды могут быть представлены в дозе точно 3 мкг. В одном из воплощений сахариды из серотипов 3, 18 С и 19F (или 4, 18 С и 19F) представлены в более высокой дозе, чем другие сахариды. В одном аспекте этого воплощения серотипы 3, 18 С и 19F (или 4, 18 С и 19F) представлены в дозе приблизительно или точно 3 мкг, в то время как другие сахариды в иммуногенной композиции представлены в дозе приблизительно или точно 1 мкг."Около" или "приблизительно" определяют как нахождение в пределах больше или меньше 10% от приведенной цифры для целей данного изобретения. В одном из воплощений по меньшей мере один из капсульных сахаридов S.pneumoniae непосредственно конъюгирован с белком-носителем. Возможно по меньшей мере один из капсульных сахаридовS.pneumoniae непосредственно конъюгирован с использованием CDAP. В одном из воплощений большинство капсульных сахаридов, например 5, 6, 7, 8, 9 или более, непосредственно связаны с белкомносителем с использованием CDAP (см. WO 95/08348 и WO 96/29094).-9 014107 Иммуногенная композиция может содержать белки Streptococcus pneumoniae, называемые в данном описании как белки Streptococcus pneumoniae по изобретению. Такие белки могут быть использованы в качестве белков-носителей, или могут быть представлены в виде свободных белков, или могут быть представлены как в качестве белков-носителей, так и в виде свободных белков. Белки Streptococcuspneumoniae по изобретению либо экспонированы на поверхности, по меньшей мере в течение части жизненного цикла пневмококка, либо являются белками, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Белки по изобретению возможно выбраны из следующих категорий, таких как белки,имеющие мотив сигнальной последовательности II типа LXXC (где X представляет собой любую аминокислоту, например полигистидиновое триадное семейство (PhtX, холинсвязывающие белки (CbpX),белки, имеющие мотив сигнальной последовательности I типа (например, Sp101), белки, имеющие мотивLPXTG (где X представляет собой любую аминокислоту, например Sp128, Sp130), и токсины (например,Ply). Примерами среди этих категорий (или мотивов) являются следующие белки или их иммунологически функциональные эквиваленты. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере 1 белок, выбранный из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (PhtX), семейства холинсвязывающих белков (CbpX), укороченных CbpX, LytX-семейства, укороченных LytX, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный CbpX-укороченный LytX, пневмолизина (Ply), PspA,PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 и Sp133. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более белка, выбранных из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства(PhtX), семейства холинсвязывающих белков (CbpX), укороченных CbpX, LytX-семейства, укороченных(Ply), PspA, PsaA и Sp128. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более чем два белка, выбранных из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (PhtX), семейства холинсвязывающих белков (CbpX), укороченных CbpX, LytX-семейства, укороченных LytX,химерных белков (или слитых конструкций) укороченный CbpX-укороченный LytX, пневмолизина (Ply) и Sp128.Pht (полигистидиновое триадное)-семейство включает белки PhtA, PhtB, PhtD и PhtE. Это семейство характеризуется липидированной последовательностью, двумя доменами, разделенными пролинобогащенным участком, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно вовлеченными в связывание металлов или нуклеозидов или ферментативную активность, (3-5)-участками двойной спирали, консервативным N-концом и гетерогенным С-концом. Оно присутствует во всех тестируемых штаммах пневмококков. Гомологичные белки также были обнаружены у других стрептококков и нейсеррий. В одном из воплощений изобретения Pht-белок по изобретению представляет собой PhtD. Однако понятно, что термины Pht А, В, D и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных ниже ссылках, а также к их существующим в природе (и искусственным) вариантам, имеющим гомологию последовательностей, которая по меньшей мере на 90% идентична белкам из ссылок. Предпочтительно она идентична по меньшей мере на 95% или идентична по меньшей мере на 97%. Что касается белков PhtX, то PhtA раскрыт в WO 98/18930 и также упоминается как Sp36. Как указано выше, он является белком полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив II типа LXXC. PhtD раскрыт в WO 00/37105 и также упоминается как Sp036D. Как указано выше, он также является белком полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив II типа LXXC. PhtB раскрыт в WO 00/37105 и также упоминается как Sp036B. Другим членом PhtB-семейства является С 3-деградированный полипептид, как раскрыто в WO 00/17370. Этот белок также принадлежит полигистидиновому триадному семейству, и он имеет сигнальный мотив II типа LXXC. Например, иммунологически функциональным эквивалентом является белок Sp42, раскрытый в WO 98/18930. УкороченныйPhtB (приблизительно 79 кДа) раскрыт в WO 99/15675 и также считается членом PhtX-семейства. PhtE раскрыт в WO 00/30299 и упоминается как BVH-3. Когда в данном описании упоминается Pht-белок, это означает, что могут быть использованы иммуногенные фрагменты или слитые конструкции этогоPht-белка. Например, ссылка на PhtX включает в себя иммуногенные фрагменты или слитые конструкции любого Pht-белка. Ссылка на PhtD или PhtB также является ссылкой на слитые конструкции PhtDE или PhtBE, которые можно обнаружить, например, в WO 0198334. Пневмолизин представляет собой многофункциональный токсин с явно выраженными цитолитической (гемолитической) активностью и активностью активации комплемента (Rubins et al., Am. Respi. Cit.Care Med., 153: 1339-1346 (1996. Этот токсин не секретируется пневмококками, но он высвобождается при лизисе пневмококков под действием аутолизина. Его эффекты включают, например, стимуляцию продуцирования воспалительных цитокинов человеческими моноцитами, ингибирование пульсации ресничек на эпителии дыхательных путей человека и уменьшение бактерицидной активности и миграции нейтрофилов. Наиболее явным эффектом пневмолизина является лизис эритроцитов, который включает связывание с холестерином. Поскольку он является токсином, его необходимо детоксифицировать (т.е. сделать нетоксичным для человека, получающего его в дозе, пригодной для защиты), до того как его можно будет вводить in vivo. Экспрессия и клонирование пневмолизина дикого типа или нативного пневмолизина известны в данной области техники. См., например, Walker et al. (Infect. Immun., 55: 1184- 10014107 1189 (1987, Mitchell et al. (Biochim. Biophys. Acta, 1007: 67-72 (1989 и Mitchell et al. (NAR, 18: 4010(1990. Детоксификация Ply может быть проведена химическим образом, например обработкой формалином или обработкой глутаровым альдегидом или комбинацией обоих (WO 04081515,РСТ/ЕР 2005/010258). Такие способы хорошо известны в данной области для различных токсинов. Альтернативно, Ply может быть генетически детоксифицирован. Таким образом, данное изобретение охватывает производные пневмококковых белков, которые могут быть, например, мутантными белками. Термин "мутантный" использован в данном описании для обозначения молекулы, подвергнутой делеции,вставке или замене одной или более аминокислоты с использованием хорошо известных методик сайтнаправленного мутагенеза или любого другого традиционного метода. Например, как описано выше,мутантный белок Ply может быть изменен таким образом, что он будет биологически неактивен, в то же время сохраняя свои иммуногенные эпитопы (см., например, WO 90/06951, Berry et al. (Infect. Immun.,67: 981-985 (1999 и WO 99/03884). Очевидно, что используемый в данном описании термин "Ply" относится к мутантному или детоксифицированному пневмолизину, подходящему для медицинского применения (т.е. нетоксичному). Что касается семейства холинсвязывающих белков (CbpX), то члены этого семейства первоначально были идентифицированы как пневмококковые белки, которые можно было очистить холин-аффинной хроматографией. Все холинсвязывающие белки связаны нековалентными связями с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты из клеточной стенки и мембран-ассоциированной липотейхоевой кислоты. Структурно они имеют несколько участков, общих для всего семейства, хотя точная природа белков (аминокислотная последовательность, длина и т.д.) может варьироваться. В общем случае холинсвязывающие белки содержат N-концевой участок (N), консервативные повторяющиеся участки (R1 и/или R2), пролинобогащенный участок (Р) и консервативный холинсвязывающий участок (С),составленный из множественных повторов, который составляет приблизительно половину белка. При использовании в данном описании термин "семейство холинсвязывающих белков (CbpX)" выбран из группы, состоящей из холинсвязывающих белков, которые идентифицированы в WO 97/41151, PbcA,SpsA, PspC, CbpA, CbpD и CbpG; CbpA раскрыт в WO 97/41151. CbpD и CbpG раскрыты в WO 00/29434;PspC раскрыт в WO 97/09994; PbcA раскрыт в WO 98/21337. SpsA представляет собой холинсвязывающий белок, раскрытый в WO 98/39450. Возможно холинсвязывающие белки выбраны из группы, состоящей из CbpA, PbcA, SpsA и PspC. Одним воплощением изобретения являются укороченные CbpX, где "CbpX" определен выше, а термин "укороченные " относится к CbpX белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка (С) или более. Возможно, что у таких белков отсутствует весь холинсвязывающий участок. Возможно, что у таких укороченных белков отсутствует (1) холинсвязывающий участок и (2) частьN-концевой половины данного белка, при этом остается по меньшей мере один повторяющийся участок(R1 или R2). Возможно, что укороченная структура имеет 2 повторяющихся участка (R1 и R2). Примерами таких предпочтительных воплощений являются NR1R2 и R1R2, как проиллюстрировано вWO 99/51266 или WO 99/51188, однако другие холинсвязывающие белки, у которых отсутствует аналогичный холинсвязывающий участок, также считаются входящими в объем данного изобретения.N-концевой домен содержит холинсвязывающий(е) домен(ы), однако LytX-семейство не имеет всех признаков, обнаруженных у CbpA-семейства, как указано выше, и, таким образом, для настоящего изобретения LytX-семейство считается отличающимся от CbpX-семейства. В противоположность CbpXсемейству, С-концевой домен содержит каталитический домен LytX белкового семейства. Это семейство включает в себя LytA, В и С. Что касается LytX-семейства, то LytA раскрыт в Ronda et al., Eur. J.Biochem., 164: 621-624 (1987). LytB раскрыт в WO 98/18930, где он также обозначен как Sp46. LytC также раскрыт в WO 98/18930 и также упоминается как Sp91. Предпочтительным членом этого семейства является LytC. Другим воплощением являются укороченные LytX, где "LytX" определен выше, и термин "укороченные" относится к LytX-белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка или более. Возможно, что у таких белков отсутствует весь холинсвязывающий участок. Еще одним воплощением данного изобретения являются химерные белки (или слитые конструкции) - укороченные CbpXукороченные LytX. Предпочтительно, чтобы они содержали NR1R2 (или R1R2) от CbpX и С-концевую часть (Cterm, т.е., чтобы отсутствовали холинсвязывающие домены) от LytX (например, LytCCterm илиSp91Cterm). Более предпочтительно CbpX выбран из группы, состоящей из CbpA, PbcA, SpsA и PspC. Возможно, он представляет собой CbpA. Возможно, LytX представляет собой LytC (также упоминаемый как Sp91). Другим воплощением настоящего изобретения является укороченный PspA или PsaA, у которого отсутствует холинсвязывающий домен (С) и который экспрессируется в виде слитого белка с LytX. Возможно, LytX представляет собой LytC.- 11014107 Что касается PsaA и PspA, то оба известны в данной области. Например, PsaA и его варианты с трансмембранной делецией описаны в BerryPaton, Infect. Immun., 1996, Dec, 64(12): 5255-62; PspA и его варианты с трансмембранной делецией раскрыты, например, в US 5804193, WO 92/14488 иSp128 и Sp130 раскрыты в WO 00/76540; Sp125 является примером пневмококкового поверхностного белка с заякоренным в клеточной стенке мотивом LPXTG (где X представляет собой любую аминокислоту). Обнаружено, что любой белок из этого класса пневмококковых поверхностных белков с таким мотивом полезен в контексте данного изобретения и, следовательно, считается дополнительным белком по изобретению. Сам Sp125 раскрыт в WO 98/18930 и также известен как ZmpB - цинковая металлопротеиназа. Sp101 раскрыт в WO 98/06734 (где он упоминается как у 85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью I типа. Sp133 раскрыт в WO 98/06734 (где он упоминается как у 85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью I типа. Примерами белковых антигенов Moraxella catarrhalis, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита), являются следующие: ОМР 106 [WO 97/41731 (Antex) и WO 96/34960 (PMC)];OMP21 или его фрагменты (WO 0018910);OmpE. Примеры антигенов нетипируемых штаммов Haemophilus influenzae или их фрагментов, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита),включают в себя белок фимбрин [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] и слитые конструкции, содержащие его пептиды [например LB1(f)-пептидные слитые конструкции; US 5843464 (OSU) или WO 99/64067]; ОМР 26 [WO 97/01638 (Cortecs)];P2 и Р 5 (WO 94/26304). Кроме того, белки по изобретению могут быть с пользой скомбинированы. Под комбинированием понимается, что иммуногенная композиция включает в себя все белки из следующих комбинаций либо в качестве белков-носителей, либо в виде свободных белков, либо смесей двух белков. Например, в комбинации двух белков, как изложено ниже, оба белка могут быть использованы в качестве белковносителей, или оба белка могут быть представлены в виде свободных белков, или оба могут быть представлены в качестве носителя и в виде свободного белка, или один может быть представлен в качестве белка-носителя и свободного белка, в то время как другой представлен только в качестве белка-носителя или только в виде свободного белка, или один может быть представлен в качестве белка-носителя, а другой в виде свободного белка. Когда приведена комбинации трех белков, то существуют аналогичные возможности. Комбинации включаютPhtD + NR1R2,химерные или слитые белки PhtD + NR1R2-Sp91Cterm,PhtD + Ply,PhtD + Sp128,PhtD + PsaA,PhtD + PspA,PhtA + NR1R2,химерные или слитые белки PhtA + NR1R2-Sp91Cterm,- 12014107PhtA + Ply,PhtA + Sp128,PhtA + PsaA,PhtA + PspA,NR1R2 + LytC,NR1R2 + PspA,NR1R2 + PsaA,NR1R2 + Sp128,R1R2 + LytC,R1R2 + PspA,R1R2 + PsaA,R1R2 + Sp128,R1R2 + PhtD,R1R2 + PhtA,но не ограничиваются ими. Предпочтительно NR1R2 (или R1R2) происходит из CbpA или PspC. Более предпочтительно он происходит из CbpA. Другие комбинации включают комбинации 3 белков, такие как PhtD + NR1R2 +Ply и PhtA + NR1R2 + PhtD. В одном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и PhtD или PhtE в качестве белков-носителей. В другом воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и PhtD или PhtE в виде свободных белков. В независимом аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере четыре капсульных сахаридных конъюгата S.pneumoniae, содержащих сахариды из разных серотипов S.pneumoniae, где по меньшей мере один сахарид конъюгирован с PhtD или его слитым белком, а иммуногенная композиция способна вызывать эффективный иммунный ответ противPhtD. Эффективный иммунный ответ против PhtD или его слитого белка измеряют, например, согласно анализу иммунитета, например, описанному в примере 15. Эффективный иммунный ответ обеспечивает выживаемость по меньшей мере до 40, 50, 60, 70, 80 или 90% в течение 7 суток после контрольного заражения гетерологичным штаммом. При условии, что штамм для контрольного заражения является гетерологичным, полученная защита обусловлена иммунным ответом против PhtD или его слитого белка. Альтернативно, эффективный иммунный ответ против PhtD измеряют с помощью ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ), как описано в примере 14. Эффективный иммунный ответ дает антиPhtD IgG-ответ, составляющий по меньшей мере 250, 300, 350, 400, 500, 550 или 600 мкг/мл GMC. Например, иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 капсульных сахаридов S.pneumoniae разных серотипов, конъюгированных с PhtD или его слитым белком. Например, серотип 22F и 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 серотипов, дополнительно выбранных из серотипов 1, 2, 3,4, 5, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 23F и 33F, конъюгированы с PhtD. В одном из воплощений два или три серотипа 3, 6 А и 22F конъюгированы с PhtD или его слитым белком. В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один капсульный сахарид S.pneumoniae, конъюгированный с PhtD или его слитым белком через линкер,например ADH. В одном из воплощений используют один из вариантов химии конъюгирования, приведенный ниже. В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один капсульный сахарид S.pneumoniae, конъюгированный с PhtD или его слитым белком, где отношение PhtD к сахариду в конъюгате составляет от 6:1 до 1:5, от 6:1 до 2:1, от 6:1 до 2,5:1, от 6:1 до 3:1, от 6:1 до 3,5:1 (мас./мас.) или более чем (т.е. содержит большую часть PhtD) 2,0:1, 2,5:1, 3,0:1, 3,5:1 или 4,0:1 (мас./мас.). В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит пневмолизин. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена вакцина, содержащая иммуногенные композиции по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Вакцины по настоящему изобретению могут быть адъювантными, в частности, когда они предназначены для применения на пожилом населении, а также для применения в детских популяциях. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия, или фосфат алюминия, или квасцы, но они также могут представлять собой соль кальция, магния, железа или цинка или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированные сахара, катионно или анионно дериватизированные сахариды или полифосфазены. Адъювант, возможно, выбирают так, чтобы он преимущественно индуцировал Th1-тип ответа. Такие высокие уровни цитокинов Th1-типа способствуют индуцированию клеточно-опосредованных иммунных ответов на данный антиген, тогда как высокие уровни цитокинов Th2-типа способствуют индуцированию гуморальных иммунных ответов на этот антиген.- 13014107 Разница между иммунными ответами Th1- и Th2-типа не является абсолютной. В действительности индивидуум будет поддерживать иммунный ответ, который описывается как преимущественно Th1 или преимущественно Th2. Тем не менее часто бывает удобно рассматривать семейства цитокинов в терминах, используемых в описании мышиных CD4+ve Т-клеточных клонов Мосманном и Коффманом(интерлейкин-2). Другие цитокины, часто напрямую ассоциированные с индуцированием иммунных ответов Th1-типа, не продуцируются Т-клетками, как, например IL-12. Напротив, ответы Th2-типа ассоциированы с секрецией IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Подходящие системы адъювантов, которые стимулируют преимущественно Th1-ответ, включают монофосфориллипид А или его производное (или в общем случае детоксифицированный липид А - см., например, WO 2005107798), в частности 3-де-Оацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) (его получение см. в GB 2220211 А); и комбинацию монофосфориллипида А, возможно 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А, вместе либо с солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия), либо с эмульсией масло-вводе. В таких комбинациях антиген и 3D-MPL содержатся в структурах одних и тех же частиц, что позволяет осуществлять более эффективную доставку антигенных и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3D-MPL способен дополнительно усиливать иммуногенность адсорбированного на квасцах антигена [Thoelen et al. Vaccine (1998), 16: 708-14; ЕР 689454-В 1]. Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию QS21 и 3D-MPL, которая раскрыта в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, в которой QS21 погашен холестерином, как описано в WO 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описана вWO 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой QS21. Эта композиция также может содержать эмульсию масло-в-воде и токоферол (WO 95/17210). Неметилированные CpG-содержащие олигонуклеотиды (WO 96/02555) и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (WO 0226757 и WO 03507822) также являются преимущественными индукторами Th1-ответа и подходят для использования в настоящем изобретении. Конкретными адъювантами являются адъюванты, выбранные из группы солей металлов, эмульсий масло-в-воде, агониста Toll-подобных рецепторов (в частности, агониста Toll-подобного рецептора 2,агониста Toll-подобного рецептора 3, агониста Toll-подобного рецептора 4, агониста Toll-подобного рецептора 7, агониста Toll-подобного рецептора 8 и агониста Toll-подобного рецептора 9), сапонинов или их комбинаций. Адъювантом, который может быть использован с вакцинными композициями по изобретению, являются пузырьковые препараты или препараты везикул наружной мембраны грамотрицательных бактериальных штаммов, например, описанные в WO 02/09746, в частности везикулы N.meningitidis. Адъювантные свойства везикул можно усилить путем сохранения LOS (липоолигосахарида) на их поверхности (например, посредством экстракции низкими концентрациями детергентов [например, 0-0,1%-ным дезоксихолатом]). LOS могут быть детоксифицированы посредством msbB(-) или htrB(-) мутаций, рассмотренных в WO 02/09746. Адъювантные свойства также можно усилить путем сохранения PorB (и,возможно, удаления PorA) из менингококковых везикул. Адъювантные свойства также можно усилить путем укорочения сахаридной структуры внешнего ядра LOS на менингококковых везикулах, например посредством мутации IgtB(-), рассмотренной в WO 2004/014417. Альтернативно, вышеупомянутые LOS(например, выделенные из msbB(-)- и/или IgtB(-)-штамма) можно очистить и использовать в качестве адъюванта в композициях по изобретению. Другой адъювант, который может быть использован с композициями по изобретению, может быть выбран из группы: сапонин, липид А или его производное, иммуностимулирующий олигонуклеотид,алкилглюкозаминидфосфат, эмульсия масло-в-воде или их комбинации. Другим адъювантом, который может быть использован с композициями по изобретению, является соль металла в комбинации с другим адъювантом. В одном воплощении адъювант представляет собой агонист Toll-подобного рецептора 4, в частности агонист Toll-подобного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 или 9, или сапонин, в частности QS21. В одном воплощении адъювантная система содержит два или более адъюванта из приведенного выше перечня. В частности, комбинации предпочтительно содержат сапониновый (например, QS21) адъювант и/или агонист Toll-подобного рецептора 9, такой как CpG-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид. Другие комбинации содержат сапонин (в частности, QS21) и агонист Toll-подобного рецептора 4, такой как монофосфориллипид А или его 3-деацилированное производное, 3D-MPL, или сапонин (в частности,QS21) и лиганд Toll-подобного рецептора 4, такой как алкилглюкозаминидфосфат. В одном из воплощений адъюванты представляют собой комбинации 3D-MPL и QS21 (ЕР 0671948 В 1), эмульсии масло-в-воде, содержащие 3D-MPL и QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), или 3D-MPL,приготовленный в виде препарата с другими носителями (ЕР 0689454 В 1). В одном воплощении адъювантные системы содержат комбинацию 3D-MPL, QS21 и CpG олигонуклеотида, которая описана в- 14014107 В одном воплощении адъювант представляет собой лиганд Toll-подобного рецептора (TLR) 4, возможно агонист, такой как производное липида А, в частности монофосфориллипид А, или более конкретно 3-деацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL). 3D-MPL может быть приобретен у GlaxoSmithKline Biologicals North America и стимулирует,главным образом, CD4+ Т-клеточные ответы с фенотипом IFN- (Th1). Он может быть получен способами, раскрытыми в GB 2220211 А. С химической точки зрения он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В одном воплощении в композициях по настоящему изобретению используют небольшие частицы 3D-MPL. Небольшие частицы 3D-MPL имеют такой размер частиц, что их можно подвергать стерильной фильтрации через фильтр 0,22 мкм. Такие препараты описаны в международной заявке на патент WO 94/21292. Синтетические производные липида А известны и, по-видимому, являются антагонистами TLR 4. Они включают,без ограничения ими: ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоноDглюкопиранозил]-2-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]- -D-глюкопиранозилдигидрофосфат)(WO 95/14026); ОМ 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(R)-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1,10-бис-(дигидрофосфат) (WO 99/64301 и WO 00/0462); ОМ 197 МР-Ас DP (3S,9R)-3-[(R)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3 гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат) (WO 01/46127). Другими лигандами TLR4, которые могут быть использованы, являются алкилглюкозаминидфосфаты (AGP), например, раскрытые в WO 9850399 или US 6303347 (также раскрыты способы полученияAGP), или фармацевтически приемлемые соли AGP, которые раскрыты в US 6764840. Некоторые AGP являются агонистами TLR4, а некоторые являются антагонистами TLR4. Полагают, что и те, и другие полезны в качестве адъювантов. Другим иммуностимулятором для применения в настоящем изобретении является Quil А и его производные. Quil А представляет собой препарат сапонина, выделенный из южно-американского дереваQuillaja saponaria molina, и впервые был описан как обладающий адъювантной активностью Dalsgaard и др. в 1974 г. ("Saponin adjuvants", Archiv. fr die gesamte Virusforschung. Vol. 44, Springer Verlag, Berlin,p. 243-254). Очищенные фрагменты Quil А были выделены с помощью HPLC, что сохраняет адъювантную активность без токсичности, ассоциированной с Quil А (ЕР 0362278), например QS7 и QS21 (также известными как QA7 и QA21). QS21 является природным сапонином, выделенным из коры Quillajasaponaria molina, который индуцирует CD8+ цитотоксические Т-клетки (CTL), Th1-клетки и преимущественный IgG2a-антительный ответ, и является сапонином в контексте настоящего изобретения. Были описаны конкретные композиции QS21, которые являются воплощением данного изобретения, эти композиции дополнительно содержат стерин (WO 96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть отделены в форме мицелл, смешанных мицелл (возможно, с солями желчных кислот) или могут находиться в форме ISCOM (иммуностимулирующий комплекс)-матриц(ЕР 0109942 B1), липосом или родственных коллоидных структур, таких как червеобразные или кольцеобразные мультимерные комплексы либо липидные/слоевые структуры и ламеллы, когда их приготавливают вместе с холестерином или липидом, или в форме эмульсии масло-в-воде (например, как вWO 95/17210). Сапонины могут быть ассоциированы с солью металла, например гидроксидом алюминия или фосфатом алюминия (WO 98/15287). Возможно, сапонин представлен в форме липосомы, ISCOM или эмульсии масло-в-воде. Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина, в частности комбинацию QS21 и 3D-MPL, которая раскрыта вWO 94/00153, или менее реактогенную композицию, в которой QS21 погашен холестерином, как описано в WO 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая в себя токоферол сQS21 и/или 3D-MPL в эмульсии типа масло-в-воде или без них, описана в WO 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собойQS21. Кроме того, могут быть использованы иммуностимулирующие олигонуклеотиды или любой другой агонист Toll-подобного рецептора (TLR) 9. Оолигонуклеотиды для применения в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению возможно представляют собой CpG-содержащие олигонуклеотиды,возможно содержащие два или более динуклеотидных CpG мотивов, отделенных по меньшей мере тремя, более предпочтительно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив CpG представляет собой нуклеотид цитозин, за которым следует нуклеотид гуанин. CpG-олигонуклеотиды по настоящему изобретению обычно являются дезоксинуклеотидами. В одном воплощении межнуклеотидной структурой в олигонуклеотиде является фосфородитиоат или фосфоротиоатная связь, хотя в объем данного изобретения включены фосфодисложноэфирная и другие межнуклеотидные связи. Также в объем изобретения включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в US 5666153,- 15014107US 5278302 и WO 95/26204. Примеры олигонуклеотидов имеют следующие далее последовательности. Эти последовательности предпочтительно возможно содержат фосфоротиоат-модифицированные межнуклеотидные связи. ОЛИГО 1 (SEQ ID NO: 1): ТСС ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826); ОЛИГО 2 (SEQ ID NO: 2): ТСТ ССС AGC GTG CGC CAT (CpG 1758); ОЛИГО 3 (SEQ ID NO: 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG; ОЛИГО 4 (SEQ ID NO: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006); ОЛИГО 5 (SEQ ID NO: 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668); ОЛИГО 6 (SEQ ID NO: 6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456). Альтернативные CpG-содержащие олигонуклеотиды могут содержать приведенные выше последовательности, в которых имеются незначительные делеции или вставки.CpG-олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники (например, см. ЕР 468520). Удобно, что такие олигонуклеотиды можно синтезировать, используя автоматизированный синтезатор. Адъювант может представлять собой эмульсию масло-в-воде или может содержать эмульсию масло-в-воде в комбинации с другими адъювантами. Масляная фаза эмульсионной системы, возможно, содержит метаболизируемое масло. Значение термина "метаболизируемое масло" хорошо известно в данной области техники. "Метаболизируемый" можно определить как "который может быть превращен посредством метаболизма" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25-е изд. (1974. Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животный жир или синтетическое масло, которое не токсично для реципиента и может быть превращено посредством метаболизма. Орехи, зерна и крупа являются традиционными источниками растительных масел. Синтетические масла также составляют часть этого изобретения и могут включать имеющиеся в продаже масла, такие какNEOBEE и др. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаружено в больших количествах в масле печени акулы и в меньших количествах в оливковом масле, масле из семян пшеницы, масле из рисовых отрубей и в дрожжах, и является особенно предпочтительным маслом для применения в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло ввиду того, что является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Merck Index, 10-е изд., вх.8619). Токолы (например, витамин Е) также часто используют в масляных эмульсионных адъювантах(ЕР 0382271 В 1; US 5667784; WO 95/17210). Токолы, используемые в масляных эмульсиях (возможно, в эмульсиях масло-в-воде) по изобретению, могут быть приготовлены в виде препарата, как описано в ЕР 0382271 В 1, где токолы могут представлять собой дисперсии токоловых капелек, возможно содержащие эмульгатор, возможно менее 1 мкм диаметром. Альтернативно, токолы можно использовать в комбинации с другим маслом с образованием масляной фазы масляной эмульсии. Примеры масляных эмульсий, которые можно использовать в комбинации с токолом, описаны в данном изобретении, например описанные выше метаболизируемые масла. Полагают, что адъюванты в виде эмульсии масло-в-воде сами по себе полезны в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843 В), кроме того, комбинации эмульсий масло-в-воде и других активных агентов описаны в качестве адъювантов для вакцин (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565;WO 99/11241). Описаны другие адъюванты в виде масляных эмульсий, такие как эмульсии вода-в-масле(US 5422109; ЕР 0480982 В 2) и эмульсии вода-в-масле-в-воде (US 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют масляные эмульсионные системы (в частности, при включении токолов) с образованием адъювантов и композиций по настоящему изобретению. В одном из воплощений масляная эмульсия (например, эмульсии масло-в-воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как Твин 80, и/или стерин, например холестерин. В одном из воплощений масляная эмульсия (возможно, эмульсия масло-в-воде) содержит метаболизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален, или токоферол, такой как -токоферол (и предпочтительно и сквален, и -токоферол), и, возможно, эмульгатор (или поверхностно-активное вещество), такой как Твин 80. Также может быть включен стерин (например, холестерин). Способ приготовления эмульсии масло-в-воде хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно этот способ включает смешивание токолсодержащей масляной фазы с поверхностноактивным веществом, таким как раствор PBS/TWEEN80, с последующей гомогенизацией с использованием гомогенизатора; специалисту в данной области техники очевидно, что способ, включающий прохождение смеси дважды через иглу шприца, будет пригодным для гомогенизации небольших объемов жидкости. В равной степени процесс эмульгирования в микрофлюидизаторе (установка M110SMicrofluidics, максимум 50 прогонов, в течение периода времени 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (0,6 МПа) (давление на выходе приблизительно 850 бар (85 МПа может быть адаптирован специалистом в данной области техники для приготовления меньших или больших объемов эмульсии. Адаптация может быть проведена путем осуществления рутинных экспериментов, включающих определение параметров получаемой эмульсии, до тех пор, пока не будет получен препарат с необходимым- 16014107 диаметром капелек масла. В эмульсии масло-в-воде масло и эмульгатор должны находиться в водном носителе. Водным носителем может быть, например, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Размер капелек масла, обнаруживаемых в стабильной эмульсии масло-вводе, возможно, составляет менее 1 мкм, может находиться в основном в диапазоне 30-600 нм, предпочтительно в основном составлять приблизительно 30-500 нм в диаметре и наиболее предпочтительно в основном 150-500 нм в диаметре, и в частности, приблизительно 150 нм в диаметре, как измерено с помощью фотоннокорреляционной спектроскопии (PCS). В этом отношении 80% капелек масла по количеству должны находиться в указанных диапазонах, возможно более 90% и возможно более 95% капелек масла по количеству находятся в диапазонах указанных размеров. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, обычно находятся в диапазоне 0,5-20% или 2-10% масла (от общего объема дозы), такого как сквален; и, если он присутствует, 2-10% -токоферола; и 0,3-3% поверхностно-активного вещества, такого как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Возможно, соотношение масло (например, сквален):токол (например, -токоферол) равно или меньше 1, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Эмульгатор, такой как Твин 80 или Span 85, также может присутствовать, например, на уровне приблизительно 1%. В некоторых случаях полезно, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор. Примеры эмульсионных систем описаны в WO 95/17210, WO 99/11241 и WO 99/12565, где раскрыты эмульсионные адъюванты на основе сквалена, -токоферола и Твина 80, возможно приготовленные с иммуностимуляторами QS21 и/или 3D-MPL. Таким образом, в одном из воплощений по настоящему изобретению адъювант по изобретению может дополнительно содержать другие иммуностимуляторы, такие как LPS (липополисахарид) или его производные и/или сапонины. Примеры других иммуностимуляторов приведены в данном описании и вPowell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X. В одном из воплощений адъювант и иммуногенные композиции по изобретению содержат сапонин(предпочтительно QS21) и/или производное LPS (предпочтительно 3D-MPL) в масляной эмульсии, описанной выше, возможно со стерином (предпочтительно холестерином). В дополнение к этому масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло-в-воде) может содержать span 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин. Адъюванты, содержащие эмульсию масло-в-воде, стерин и сапонин, описаны в WO 99/12565. Обычно для введения людям сапонин (предпочтительно QS21) и/или LPS-производное (предпочтительно 3D-MPL) будут присутствовать в предназначенной для человека дозе иммуногенной композиции 1-200 мкг, например 10-100 мкг, предпочтительно 10-50 мкг на дозу. Обычно масляная эмульсия (возможно, эмульсия масло-в-воде) будет содержать 2-10% метаболизируемого масла. Возможно, она будет содержать 2-10% сквалена, 2-10% -токоферола и 0,3-3% (предпочтительно 0,4-2%) эмульгатора (предпочтительно Твина 80 [полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат]). Если присутствуют и сквален и-токоферол, то предпочтительно, чтобы соотношение сквален:-токоферол было равно 1 или менее, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Span 85 (сорбитантриолеат) также может присутствовать на уровне 0,5-1,0% в эмульсиях, используемых в данном изобретении. В некоторых случаях может быть полезно, чтобы иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор, например другие эмульгаторы/поверхностно-активные вещества,включая каприловую кислоту (Merck index, 10-е изд., номер по списку 1739), из которых особенно предпочтителным является трикаприлин. Когда включены сквален и сапонин (возможно, QS21), также полезно включать в композицию стерин (возможно, холестерин), так как это позволяет уменьшить суммарный уровень масла в эмульсии. Это приводит к снижению стоимости изготовления, улучшению общего комфорта при вакцинации, а также качественным и количественным улучшениям получаемых иммунных ответов, таких как усиленное продуцирование IFN-. Соответственно адъювантная система по настоящему изобретению обычно имеет соотношение метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в диапазоне от 200:1 до 300:1, кроме того,настоящее изобретение может быть применено в форме "с низким содержанием масла", с возможным диапазоном 1:1-200:1, возможно 20:1-100:1 или главным образом 48:1; эта вакцина сохраняет полезные адъювантные свойства всех компонентов со значительно сниженным профилем реактогенности. Соответственно некоторые воплощения имеют соотношение сквален:QS21 (мас./мас.) в диапазоне 1:1-250:1,или 20:1-200:1, или 20:1-100:1, или главным образом 48:1. Возможно также включен стерин (например,холестерин), присутствующий в соотношении сапонин:стерин, приведенном в данном описании. Эмульсионные системы по настоящему изобретению, возможно, имеют капельки масла небольшого размера в субмикронном диапазоне. Возможно, размеры капелек масла составляют 120-750 нм или 120-600 нм в диаметре.- 17014107 Особенно эффективная адъювантная композиция (для окончательной комбинации с AlPO4 в иммуногенных композициях по изобретению) включает сапонин (например, QS21), производное LPS (например, 3D-MPL) и масляную эмульсию (например, сквален и -токоферол в эмульсии масло-в-воде), как описано в WO 95/17210 или в WO 99/12565 (в частности, адъювантная композиция 11 в примере 2,табл. 1). Примеры агониста TLR 2 включают пептидогликан или липопротеин. Известными агонистамиTLR7 являются имидазохинолины, такие как имиквимод или резиквимод. Одноцепочечная РНК также является известным агонистом TLR (TLR8 у людей и TLR7 у мышей), в то время как двухцепочечная РНК и поли-IC (полиинозиновая-полицитидиловая кислота - имеющийся в продаже синтетический миметик вирусной РНК) являются примерами агонистов TLR3; 3D-MPL является примером агониста TLR4,тогда как CpG является примером агониста TLR9. Иммуногенная композиция может содержать антиген и иммуностимулятор, адсорбированные на соль металла. Вакцинные композиции на основе алюминия, в которых антиген и иммуностимулятор 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) адсорбированы на одной и той же частице,описаны в ЕР 0576478 В 1, ЕР 0689454 В 1 и ЕР 0633784 В 1. Тогда в этих случаях сначала адсорбируют антиген на соль алюминия с последующей адсорбцией иммуностимулятора 3D-MPL на тех же частицах соли алюминия. В таких процессах сначала суспензию 3D-MPL подвергают воздействию ультразвука на водяной бане до тех пор, пока частицы не достигнут размера 80-500 нм. Обычно антиген адсорбируют на соль алюминия в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. Затем к адсорбированному антигену добавляют суспензию 3D-MPL и композицию инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч и затем хранят при 4 С до использования. В другом способе иммуностимулятор и антиген находятся на отдельных частицах соли металла, как описано в ЕР 1126876. Улучшенный способ включает абсорбцию иммуностимулятора на частицах соли металла с последующей абсорбцией антигена на другую частицу соли металла, затем смешивание отдельных частиц соли металла с образованием вакцины. Адъювант для использования в настоящем изобретении может представлять собой адъювантную композицию, содержащую иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла, отличающейся тем, что данная частица соли металла, по существу,не содержит другой антиген. Кроме того, вакцины, предложенные согласно настоящему изобретению,отличаются тем, что иммуностимулятор адсорбирован на частицах соли металла, по существу, не содержащих другой антиген, и что частицы соли металла, на которых адсорбируется антиген, по существу, не содержат другой иммуностимулятор. Соответственно согласно настоящему изобретению предложена адъювантная композиция, содержащая иммуностимулятор, который адсорбирован на частице соли металла, характеризующейся в композиции как, по существу, не содержащей другой антиген. Кроме того, эта адъювантная композиция может представлять собой промежуточный продукт, который, если используют такой адъювант, требуется для изготовления вакцины. Соответственно предложен способ изготовления вакцины, включающий смешивание адъювантной композиции, представляющей собой один или более иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла с антигеном. Возможно, антиген предварительно адсорбирован на соли металла. Указанная соль металла может быть идентичной или аналогичной соли металла, на которой адсорбирован иммуностимулятор. Возможно, соль металла представляет собой соль алюминия,например фосфат алюминия или гидроксид алюминия. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена вакцинная композиция, содержащая иммуностимулятор, адсорбированный на первой частице соли металла, и антиген, адсорбированный на соли металла, отличающаяся тем, что первые и вторые частицы соли металла являются отдельными частицами.LPS или LOS производные или мутации или производные липида А, описанные в данном изобретении, сконструированы с меньшей токсичностью (например, 3D-MPL), чем нативные липополисахариды,и представляют собой взаимозаменяемые эквиваленты в отношении любых применений этих групировок, описанных в данном изобретении. В одном воплощении адъювант, используемый в композициях по изобретению, содержит липосомный носитель (приготовленный известными методами из фосфолипидов, таких как диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) и, возможно, стерина, такого как холестерин). Такие липосомные носители могут нести производные липида А (такие как 3D-MPL - см. выше) и/или сапонины (такие как QS21 - см. выше). В одном воплощении адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,1-10,0 мг, 0,2-7,0 мг, 0,3-5,0 мг 0,4-2,0 мг или 0,5-1,0 мг (например, 0,4-0,6; 0,9-1,1; 0,5 или 1 мг) фосфолипида (например, DOPC); 0,025-2,5 мг, 0,05-1,5 мг, 0,075-0,75 мг, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3; 0,1-0,15; 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина); 5-60 мкг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15; 40-50; 10; 20; 30; 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3D-MPL) и 5-60 мкг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15; 4050; 10; 20; 30; 40 или 50 мкг) сапонина (например, QS21).- 18014107 Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, включает в себя сахаридные конъюгаты, происходящие, по меньшей мере, из всех следующих серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F, 23F, 1, 5, 7F(и также может содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19 А и 22F), при этом GMC титра антител,индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной Prevnar у вакцинированных людей. В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, содержит эмульсию масло-в-воде, приготовленную из метаболизируемого масла (такого как сквален), эмульгатора (такого как Твин 80) и, возможно, токола (такого как -токоферол). В одном воплощении адъювант содержит(на 0,5 мл дозы) 0,5-15,0 мг, 1-13 мг, 2-11 мг, 4-8 или 5-6 мг (например, 2-3, 5-6 или 10-11 мг) метаболизируемого масла (такого как сквален); 0,1-10,0 мг, 0,3-8,0 мг, 0,6-6,0 мг, 0,9-5,0 мг, 1-4 или 2-3 мг (например, 0,9-1,1; 2-3 или 4-5 мг) эмульгатора (такого как Твин 80) и, возможно, 0,5-20,0 мг, 1-15 мг,2-12 мг, 4-10 мг, 5-7 мг (например, 11-13; 5-6 или 2-3 мг) токола (такого как -токоферол). Этот адъювант, возможно, может дополнительно содержать 5-60 мг, 10-50 мг или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3D-MPL). Такие адъюванты, в частности, подходят для вакцинных композиций, предназначенных для маленьких детей или пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит сахаридные конъюгаты, происходящие по меньшей мере из всех следующих серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F, 23F, 1, 5, 7F (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19 А и 22F), где GMC титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной Prevnar у вакцинированных людей. Этот адъювант, возможно, может содержать 0,025-2,5 мг, 0,05-1,5 мг, 0,075-0,75 мг, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3; 0,1-0,15; 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина); 5-60 мкг,10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например,3D-MPL) и 5-60 мкг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, QS21). Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, включает сахаридные конъюгаты, происходящие, по меньшей мере, из всех следующих серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F, 23F, 1, 5, 7F (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19 А и 22F), при этом GMC титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F,не является значительно более низкой чем индуцированная вакциной Prevnar у вакцинированных людей. В одном воплощении адъювант, используемый в композициях по изобретению, содержит фосфат алюминия и производное липида А (такое как 3D-MPL). Этот адъювант может содержать (на 0,5 мл дозы) 100-750, 200-500 или 300-400 мкг Al в виде фосфата алюминия и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3D-MPL). Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей или маленьких детей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит сахаридные конъюгаты, происходящие, по меньшей мере, из всех следующих серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F,23F, 1, 5, 7F (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19 А и 22F), при этом GMC титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6 В, 9V,14, 18 С, 19F и 23F, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной Prevnar у вакцинированных людей. Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, могут быть использованы для защиты или лечения восприимчивого к инфекции млекопитающего путем введения указанной вакцины системным или мукозальным путем. Такие способы введения могут включать введение посредством внутримышечной (в/м), внутрибрюшинной, внутрикожной (в/к) или подкожной инъекции или введение на слизистую оболочку в пероральный/пищеварительный, респираторный, мочеполовой тракты. Для лечения пневмонии или среднего отита возможно интраназальное (и/н) введение вакцин (так как носоглоточный перенос пневмококков может быть предупрежден с большей эффективностью, тем самым инфекция ослабляется на самой ранней ее стадии). Хотя вакцину по изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты также можно совместно вводить одновременно или в разные моменты времени (например, пневмококковые сахаридные конъюгаты можно вводить по отдельности, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимальной координации иммунных ответов по отношению друг к другу). Для совместного введения возможный Th1-адъювант может присутствовать в любом или во всех разных способах введения. В дополнение к одному способу введения можно использовать 2 разных способа введения. Например, сахариды или сахаридные конъюгаты можно вводить в/м (или в/к), а бактериальные бел- 19014107 ки можно вводить и/н (или в/к). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить в/м для примирующих доз и и/н для бустерных доз. Содержание белковых антигенов в вакцине обычно будет находиться в диапазоне 1-100 мкг, возможно 5-50 мкг, наиболее типично вдиапазоне 5-25 мкг. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустерных иммунизаций через адекватные промежутки времени. Изготовление вакцин в общем описано в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (edsFullerton в патенте США 4235877. Вакцины или иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизованными. В одном из воплощений раствор лиофилизуют в присутствии сахара, действующего в качестве аморфного лиопротективного средства, такого как сахароза, трегалоза, глюкоза,манноза, мальтоза или лактоза. В одном из воплощений раствор лиофилизуют в присутствии сахара, действующего в качестве аморфного лиопротективного вещества и придающего объем агента, обеспечивающего улучшенную структуру таблетки, такого как глицин или маннит. Присутствие кристаллического придающего объем агента позволяет уменьшить продолжительность циклов лиофильной сушки в присутствии высокой концентрации соли. Примеры таких смесей для использования в лиофилизации иммуногенных композиций или вакцин по изобретению включают сахароза/глицин, трегалоза/глицин, глюкоза/глицин, манноза/глицин, мальтоза/глицин, сахароза/маннит, трегалоза/маннит, глюкоза/маннит, манноза/маннит и мальтоза/маннит. Обычно молярное соотношение двух составляющих возможно равно 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 или 1:6. Иммуногенные композиции по изобретению, возможно, содержат реагенты для лиофилизации, описанные выше. Вышеупомянутые стабилизирующие агенты и смеси стабилизирующих агентов могут дополнительно включать полимер, способный увеличивать температуру стеклования (Tg') композиции, такой как поли(винилпирролидон) (PVP), гидроксиэтилкрахмал, или декстран, или полимер, действующий в качестве кристаллического придающего объем агента, такой как полиэтиленгликоль (PEG), например,имеющий молекулярную массу 1500-6000, и декстран. Иммуногенные композиции по изобретению возможно лиофилизуют и разводят непосредственно перед использованием. В результате лиофилизации можно получить более стабильную композицию(вакцину) и, возможно, можно придти к более высоким титрам антител в присутствии 3D-MPL и в отсутствие адъюванта на основе алюминия. В одном аспекте данного изобретения предложен вакцинный набор, содержащий флакон, содержащий иммуногенную композицию по изобретению, возможно в лиофилизованной форме, и дополнительно содержащий флакон, содержащий адъювант, который описан в данном изобретении. Очевидно, что в этом аспекте изобретения адъювант будет использован для разведения лиофилизованной иммуногенной композиции. Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описываемых вакцин в кожу (в/к) составляет одно из воплощений настоящего изобретения. Человеческая кожа содержит наружную "ороговевшую" кутикулу, называемую роговым слоем, которая лежит поверх эпидермиса. Под эпидермисом лежит слой, называемый дермой, который, в свою очередь, лежит поверх подкожной ткани. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, и в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, что также может быть связано с рядом дополнительных преимуществ. Внутрикожная вакцинация описанной в данном изобретении вакциной образует возможный аспект настоящего изобретения. Традиционная методика внутрикожной инъекции, "процедура манту", включает стадии, на которых очищают кожу, затем натягивают ее одной рукой и фаской иглы малого размера (размер 26-31), направленной вверх, вводят иглу под углом 10-15. Как только фаска иглы введена, цилиндрическую часть иглы углубляют и продвигают дальше, одновременно осуществляя легкое надавливание, чтобы поднять иглу под кожей. Затем очень медленно вводят жидкость, получая, таким образом, пузырь или выпуклость на поверхности кожи, после чего медленно извлекают иглу. Совсем недавно были рассмотрены устройства, специально разработанные для введения жидких агентов в кожу или через нее, например устройства, описанные в WO 99/34850 и ЕР 1092444, а также безыгольные инъекционные устройства, описанные, например, в WO 01/13977, US 5480381, US 5599302,US 5334144, US 5993412, US 5649912, US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US 5466220,US 5339163, US 5312335, US 5503627, US 5064413, US 5520639, US 4596556, US 4790824, US 4941880,US 4940460, WO 97/37705 и WO 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных композиций могут включать традиционные шприцы и иглы или устройства, сконструированные для баллистической доставки твердых вакцин (WO 99/27961), или трансдермальные пластыри (WO 97/48440;WO 98/28037); или накладываемые на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка,WO 98/20734, WO 98/28037). Когда вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу или более конкретно в дерму, вакцина представлена в малом объеме жидкости, в частности в объеме от приблизительно 0,05 до 0,2 мл.- 20014107 Содержание антигенов в кожных или внутрикожных вакцинах по настоящему изобретению может быть аналогично обычным дозам, установленным для внутримышечных вакцин (см. выше). Однако особенностью кожных или внутрикожных вакцин является то, что эти композиции могут быть "низкодозовыми". Соответственно белковые антигены в "низкодозовых" вакцинах возможно присутствуют в таких небольших количествах, как 0,1-10 мкг, предпочтительно 0,1-5 мкг на дозу; а сахаридные (возможно,конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 мкг и предпочтительно 0,01-0,5 мкг сахарида на дозу. При использовании в данном описании термин "внутрикожная доставка" означает доставку вакцины в область дермы в коже. Однако вакцина не обязательно будет локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, расположенный на расстоянии приблизительно от 1,0 до приблизительно 2,0 мм от поверхности кожи человека, однако существует определенное количество вариаций между индивидуумами и в разных частях тела. В общем случае можно ожидать достижения дермы,пройдя на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма расположена между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем, лежащим ниже. В зависимости от способа доставки вакцина может окончательно локализоваться исключительно или в основном в дерме или она может окончательно распределиться в эпидермисе и дерме. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена улучшенная вакцина для предупреждения или ослабления среднего отита, вызываемого Haemophilus influenzae, путем добавления белковHaemophilus influenzae, например белка D, в свободной или конъюгированной форме. В дополнение к этому, согласно настоящему изобретению также предложена улучшенная вакцина для предупреждения или ослабления пневмококковой инфекции у маленьких детей (например, среднего отита), основанная на добавлении одного или двух пневмококковых белков в виде свободного или конъюгированного белка к конъюгатным композициям S.pneumoniae по изобретению. Указанные пневмококковые свободные белки могут быть одинаковыми или разными по сравнению с любыми белками S.pneumoniae, используемыми в качестве белков-носителей. Кроме того, в комбинированную вакцину могут быть включен один или более белковый антиген Moraxella catarrhalis в свободной или конъюгированной форме. Таким образом,согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа против среднего отита у маленьких детей. В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа у маленьких детей (определенных как дети в возрасте 0-2 лет в контексте настоящего изобретения) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению (педиатрической вакцины). Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предложены антигенные конъюгатные композиции S.pneumoniae по изобретению для применения в медицине и применение конъюгатов S.pneumoniae по изобретению в изготовлении лекарственного средства для предупреждения (или лечения) пневмококкового заболевания. В еще одном другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ вызывания (защитного) иммунного ответа у пожилого населения (в контексте настоящего изобретения пациент считается пожилым, если его возраст составляет 50 лет или старше, обычно старше 55 лет и в более общем случае старше 60 лет) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению, возможно вместе с одним или двумя белками S.pneumoniae, присутствующими в виде свободного или конъюгированного белка, при этом свободные белки S.pneumoniae могут быть одинаковыми или разными по сравнению с любыми белками S.pneumoniae, используемыми в качестве белковносителей. Другим аспектом данного изобретения является способ иммунизации человека-реципиента против заболевания, вызываемого инфекцией S.pneumoniae и, возможно, Haemophilus influenzae, включающий введение реципиенту иммунологически защитной дозы иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению. Другим аспектом данного изобретения является иммуногенная композиция по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого инфекцией S.pneumoniae и, возможно, Haemophilus influenzae. Другой аспект данного изобретения заключается в применении иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией S.pneumoniae и, возможно, Haemophilus influenzae. Авторами изобретения подразумевается, что термины "содержащий", "содержат" и "содержит" в данном описании можно заменять в каждом случае соответственно на термины "состоящий из", "состоят из" и "состоит из". В данном описании изобретения воплощения, относящиеся к "вакцинным композициям" по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к "иммуногенным композициям" по изобретению, и наоборот. Все ссылки и патентные заявки, приведенные в данном изобретении, включены в описание посредством ссылки.- 21014107 Для лучшего понимания изобретения приведены примеры. Эти примеры приведены только в целях иллюстрации, и их никоим образом не следует истолковывать как каким-либо образом ограничивающие объем данного изобретения. Примеры Пример 1 а. Экспрессия белка D. Белок D Haemophilus influenzae. Генетическая конструкция для экспрессии белка D. Исходные материалы. ДНК, кодирующая белок D. Белок D является высококонсервативным среди всех серотипов и нетипируемых штаммов Н.Influenzae. Вектор pHIC348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую весь ген белка D,был получен от доктора A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, MalmoGeneral Hospital, Malmo, Sweden. Последовательность ДНК белка D была опубликована в Janson et al.(1991), Infect. Immun. 59: 119-125. Экспрессирующий вектор pMG1. Экспрессирующий вектор pMG1 представляет собой производное pBR322 (Gross et al., 1985), куда были введены элементы контроля транскрипции и трансляции чужеродных встроенных генов бактериофага(Shatzman et al., 1983). В дополнение к этому, ген устойчивости к ампициллину был заменен на ген устойчивости к канамицину. Штамм Е.coli AR58. Был сконструирован штамм E.coli AR58 посредством трансдукции N99 фагом линии Р 1, предварительно выращенным на производном SA500 (galETN10, lambdaKil- cl857 Н 1). N99 и SA500 представляют собой штаммы E.coli K12 из лаборатории доктора Martin Rosenberg, National Institute of Health. Экспрессирующий вектор pMG1. Для продуцирования белка D ДНК, кодирующую этот белок, клонировали в экспрессирующий вектор pMG1. Эта плазмида использует сигналы от ДНК фага лямбда для управления транскрипцией и трансляцией встроенных чужеродных генов. Вектор содержит промотор PL, оператор OL и два сайта утилизации (NutL и NutR) для ослабления эффектов транскрипционной полярности при получении белкаN (Gross et al., 1985). Для стабилизации плазмидной ДНК в лизогенный штамм хозяина Е.coli введены векторы, содержащие промотор PL. Лизогенные штаммы хозяина содержат репликон-дефектную ДНК фага лямбда, интегрированную в геном (Shatzman et al., 1983). Хромосомальная ДНК фага лямбда направляет синтез белка-репрессора cl, который связывается с OL репрессором вектора и препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором PL и тем самым транскрипции встроенного гена. Экспрессирующий штамм AR58 представляет собой температурочувствительный мутант по гену cl, так чтоPL-направляемую транскрипцию можно регулировать путем изменения температуры, т.е. повышение температуры в культуре инактивирует репрессор, и инициируется синтез чужеродного белка. Эта система экспрессии позволяет регулировать синтез чужеродных белков, особенно таких, которые могут быть токсичными для клетки (ShimatakaRosenberg, 1981). Штамм Е.coli AR58. Лизогенный штамм E.coli AR58, используемый для продуцирования носителя - белка D, представляет собой производное стандартного штамма NIH E.coli K12 N99 (F- su- galK2, lacZ- thr-). Он содержит дефектный лизогенный фаг лямбда (galETN10, lambdaKil- cl857 H1). Фенотип Kil- препятствует выключению синтеза макромолекул хозяина. Мутация cl857 обусловливает температурочувствительное повреждение репрессора cl. Делеция H1 удаляет правый оперон фага лямбда и локусы хозяина bio, uvr3 и chlA. Штамм AR58 был сконструирован посредством трансдукции N99 фагом линии Р 1, предварительно выращенным на производном SA500 (galETN10, lambdaKil- cl857 Н 1). Введение дефектного лизогена в N99 отбирали с использованием тетрациклина на основании присутствия в соседнем гене galE транспозона TN10, кодирующего устойчивость к тетрациклину. Конструирование вектора pMGMDPPrD. Вектор pMG1, содержащий ген, кодирующий неструктурный белок S1 вируса гриппа (pMGNS1),использовали для конструирования pMGMDPPrD. Ген белка D (PrD) амплифицировали посредством ПЦР из вектора pHIC348 (Janson et al. 1991, Infect. Immun. 59: 119-125) с использованием ПЦР-праймеров, содержащих сайты рестрикции Ncol и Xbal на 5'- и 3'-концах соответственно. Затем фрагмент Ncol/Xbal вводили в pMGNS1 между Ncol и Xbal, создавая таким образом слитый белок, содержащий N-концевую 81 аминокислоту белка NS1, потом белок D (PD). Этот вектор помечали как- 22014107 На основе описанной выше конструкции создавали конечную конструкцию для экспрессии белка D. Фрагмент BamHI/BamHI удаляли из pMGNS1PrD. В результате такого ДНК гидролиза удаляетсяNS1-кодирующий участок за исключением первых трех N-концевых остатков. После повторного лигирования вектора был создан ген, кодирующий слитый белок со следующей N-концевой аминокислотной последовательностью: Белок D не содержит лидерного пептида или N-концевого цистеина, к которому обычно присоединяются липидные цепи. Следовательно, этот белок не выделяется в периплазму и не липидируется и остается в цитоплазме в растворимой форме. Конечную конструкцию pMG-MDPPrD вводили в штамм хозяина AR58 путем теплового шока при 37 С. Плазмидсодержащие бактерии отбирали в присутствии канамицина. Наличие вставки ДНК, кодирующей белок D, демонстрировали посредством расщепления выделенной плазмидной ДНК выбранными эндонуклеазами. Рекомбинантный штамм E.coli обозначают как ECD4. Экспрессия белка D находится под контролем промотора PL/оператора OL лямбда. Штамм хозяинаAR58 содержит в геноме температурочувствительный ген cl, который блокирует экспрессию PL лямбда при низкой температуре посредством связывания с OL. Как только температура повышается, cl высвобождается от OL и белок D экспрессируется. Мелкомасштабное получение. По окончании ферментации клетки концентрируют и замораживают. Экстракцию из собранных клеток и очистку белка D осуществляли следующим образом. Замороженной осадок клеточной культуры оттаивают и ресуспендируют в растворе для разрушения клеток(цитратный буфер рН 6,0) до конечной оптической плотности OD650=60. Суспензию дважды пропускают через гомогенизатор высокого давления при Р=1000 бар (100 МПа). Гомогенат клеточной культуры осветляют центрифугированием, и клеточный дебрис удаляют фильтрацией. На первой стадии очистки отфильтрованный лизат наносят на катионообменную хроматографическую колонку (SP Sepharose FastFlow). PD связывается с матрицей геля посредством ионных взаимодействий, и его элюируют с использованием ступенчатого повышения ионной силы элюирующего буфера. На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (Q Sepharose FastFlow). PD не связывается с гелем и может быть собран в проходящем потоке. Сбор фракций на обеих стадиях колоночной хроматографии регистрируют по OD. Проходящий проток с анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок D, концентрируют ультрафильтрацией. В конце ультрафильтрационный ретентат, содержащий белок D, пропускают через мембрану 0,2 мкм. Крупномасштабное получение. Экстракцию из собранных клеток и очистку белка D осуществляли следующим образом. Собранный бульон охлаждают и немедленно пропускают дважды через гомогенизатор высокого давления при давлении приблизительно 800 бар (80 МПа). На первой стадии очистки гомогенат клеточной культуры разбавляют и наносят на катионообменную хроматографическую колонку (большие гранулы SP Sepharose). PD связывается с гелевой матрицей посредством ионных взаимодействий, и его элюируют с использованием ступенчатого повышения ионной силы элюирующего буфера и фильтруют. На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (Q Sepharose FastFlow). PD не связывается с гелем и может быть собран в проходящем потоке. Сбор фракций на обеих стадиях колоночной хроматографии регистрируют по OD. Проходящий проток с анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок D, концентрируют и подвергают диафильтрации посредством ультрафильтрации. Наконец удержанный при ультрафильтрации ретентат, содержащий белок D, пропускают через мембрану 0,2 мкм. Пример 1 б. Экспрессия PhtD. Белок PhtD является членом пневмококкового гистидин-триадного (Pht) белкового семейства, характеризующегося присутствием гистидин-триад (мотив НХХНХН). PhtD представляет собой молекулу из 838 аминокислотных (ак) остатков и несет 5 гистидиновых триад (см. Medlmmune WO 00/37105 SEQID NO: 4 для аминокислотной последовательности и SEQ ID NO:5 для последовательности ДНК). PhtD также содержит пролин-обогащенный участок в середине (положение аминокислот 348-380). PhtD имеет состоящую из 20 аминокислотных остатков N-концевую сигнальную последовательность с мотивом- 23014107 Генетическая конструкция. Генную последовательность зрелого белка PhtD от Medlmmune (от ак 21 до ак 838) переносили рекомбинантным способом в Е.coli, используя собственный вектор рТСМР 14, несущий промотор р. Штаммом хозяина E.coli является AR58, который несет термочувствительный репрессор cl857, позволяющий осуществлять тепловую индукцию промотора. Для амплификации гена phtD из плазмиды Medlmmune (несущей ген phtD из штамма Streptococcuspneumoniae Norway 4 (серотип 4) - SEQ ID NO: 5, как описано в WO 00/37105) осуществляли полимеразную цепную реакцию. Праймеры, специфические только для гена phtD, использовали для амплификации гена phtD в двух фрагментах. Праймеры несут либо Ndel и Kpnl, либо Kpnl и Xbal сайты рестрикции. Эти праймеры не гибридизуются ни с каким нуклеотидом из данного вектора, кроме специфических phtD генных последовательностей. Вставляли искусственный стартовый кодон ATG, используя первый праймер, несущий сайт рестрикции Ndel. Образованные ПЦР-продукты затем вставляли в клонирующий вектор pGEM-T (Promega) и подтверждали последовательность ДНК. Затем осуществляли субклонирование фрагментов в экспрессирующий вектор ТСМР 14, используя стандартные методики, и этим вектором трансформировали Е.coli AR58. Очистка PhtD. Очистку PhtD осуществляли следующим образом. Рост клеток E.coli в присутствии канамицина: рост в течение 30 ч при 30 С, затем индукция в течение 18 ч при 39,5 С. Разрушение клеток E.coli из целой культуры при OD115 в присутствии EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (5 мМ) и PMSF (фенилметилсульфонилфторид) (2 мМ) в качестве ингибиторов протеаз: Rannie, 2 прохода, 1000 бар (100 МПа). Захват антигена и удаление клеточного дебриса при Streamline Q XL хроматографии в рыхлом слое при комнатной температуре (20 С): колонку промывают NaCl (150 мМ) + Empigen (0,25%; рН 6,5) и элюируют NaCl (400 мМ) + Empigen (0,25%) в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,4. Фильтрация на картридже Sartobran 150 (0,45+0,2 мкм). Связывание антигена с использованием хроматографии IMAC (аффинная хроматография на иммобилизованном металле) на Zn-хелатирующей Sepharose FF при рН 7,4 в присутствии 5 мМ имидазола при 4 С; колонку промывают 5 мМ имидазоломом и 1% Empigen и элюируют 50 мМ имидазолом, все в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 8,0. Хроматография на слабом анионообменнике в режиме с положительным зарядом с использованиемFractogel EMD DEAE при рН 8,0 (25 мМ фосфат калия) при 4 С; колонку промывают 140 мМ NaCl и элюируют при 200 мМ NaCl, при этом примеси (белки и ДНК) остаются адсорбированными на ионообменнике. Концентрирование и ультрафильтрация с использованием 2 мМ Na/K-фосфата рН 7,15 на мембране 50 кДа. Стерильная фильтрация очищенной нерасфасованной формы на фильтровальном картридже 0,2 мкм Millipak-20. Пример 1 в. Экспрессия пневмолизина. Пневмококковый пневмолизин получали и детоксифицировали, как описано в WO 2004/081515 иWO 2006/032499. Пример 2. Получение конъюгатов. В данной области хорошо известно, как приготовить очищенные пневмококковые полисахариды. Для целей данных примеров полисахариды приготавливали, по существу, как описано в ЕР 072513 или с использованием близких способов. Перед конъюгированием полисахариды могут быть уменьшены в размере посредством микрофлюидизации, как описано ниже. Условия активации и связывания специфичны для каждого полисахарида и приведены в табл. 1. Уменьшенный в размере полисахарид (исключение для PS5, 6 В и 23F) растворяли в 2 М NaCl, 0,2 МNaCl или в воде для инъекций (WFI). Для всех серотипов оценивали оптимальную концентрацию полисахарида. Все серотипы, за исключением серотипа 18 С, были конъюгированы непосредственно с белкомносителем, как подробно описано ниже. Были получены два альтернативных конъюгата серотипа 22F; один конъюгированный непосредственно, один - через линкер ADH. К раствору полисахарида добавляли CDAP (соотношение CDAP/PS 0,5-1,5 мг/мг PS) из концентрированного раствора (100 мг/мл) в ацетонитриле или раствора в смеси ацетонитрил/вода (50%/50%). Через 1,5 мин добавляли 0,2-0,3 М NaOH для получения конкретного рН активации. Активацию полисахарида проводили при этом рН в течение 3 мин при 25 С. К активированному полисахариду добавляли очищенный белок (белок D, PhtD, пневмолизин или DT) (количество зависит от начального соотношенияPS/белок-носитель) и реакцию сочетания проводили при конкретном рН в течение вплоть до 2 ч (в зависимости от серотипа), регулируя рН. Для гашения непрореагировавших групп цианатного эфира затем к смеси добавляли 2 М раствор глицина; рН подводили до рН гашения (рН 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25 С и затем в течение ночи при 2-8 С при постоянном медленном перемешивании.- 24014107 Подготовка 18 С. 18 С связывали с белком-носителем через линкер - дигидразид адипиновой кислоты (ADH). Перед конъюгированием полисахарид серотипа 18 С подвергали микрофлюидизации. Получение производных столбнячного анатоксина с использованием EDAC. Для получения производных столбнячного анатоксина очищенный ТТ разбавляли до 25 мг/мл в 0,2 М NaCl и добавляли спейсер ADH для достижения конечной концентрации 0,2 М. После полного растворения спейсер, рН подводили до 6,2. Затем добавляли EDAC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) для достижения конечной концентрации 0,02 М и смесь перемешивали в течение 1 ч, регулируя рН. Реакцию конденсации останавливали путем увеличения рН включительно до 9,0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25 С. Затем дериватизированный ТТ подвергали диафильтрации (мембрана с СО (отсечением) 10 кДа) для удаления оставшихся ADH и реагента EDAC. Наконец, весь объем TTAH подвергали стерильной фильтрации до проведения стадии связывания и хранили при -70 С. Химическое связывание TTAH с PS 18C. Подробное указание параметров конъюгирования можно найти в табл. 1. 2 г подвергнутого микрофлюидизации PS разбавляли в определенной концентрации водой и доводили до 2 М NaCl путем добавления порошка NaCl. Добавляли раствор CDAP (100 мг/мл, свежеприготовленный в смеси 50/50 (об./об.) ацетонитрил/WFI) для достижения подходящего соотношения CDAP/PS. рН повышали вплоть до рН активации 9,0 путем добавления 0,3 М NaOH и стабилизировали при этом рН до добавления TTAH. Через 3 мин добавляли дериватизированный TTAH (20 мг/мл в 0,2 М NaCl) для достижения соотношения TTAH/PS, равного 2, рН регулировали до рН связывания (рНс) 9,0. Раствор оставляли на 1 ч, регулируя рН. Для гашения к смеси PS/TTAH/CDAP добавляли 2 М раствор глицина. рН подводили до рН гашения (pHq) (рН 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25 С и затем оставляли на ночь при 2-8 С при постоянном медленном перемешивании. Конъюгат PS22FAH-PhtD. Во втором способе конъюгирования этого сахарида (первый представляет собой способ прямого конъюгирования PS22F-PhtD, показанный в табл. 1) 22F связывали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (ADH). Перед конъюгированием полисахарид серотипа 22F подвергали микрофлюидизации. Получение производных PS 22F. Активацию и связывание выполняли при 25 С при постоянном перемешивании в водяной бане с регулируемой температурой. Подвергнутый микрофлюидизации PS 22F разбавляли до получения конечной концентрации PS 6 мг/мл в 0,2 М NaCl и раствор подводили до рН 6,050,2, используя 0,1 н. HCl. Добавляли раствор CDAP (100 мг/мл, свежеприготовленный в смеси ацетонитрил/WFI, 50/50) для достижения подходящего соотношения CDAP/PS (1,5/1 мас./мас.). рН повышали вплоть до рН активации 9,000,05 путем добавления 0,5 М NaOH и стабилизировали при этом рН до добавления ADH. Через 3 мин добавляли ADH для достижения соответствующего соотношения ADH/PS (8,9/1 мас./мас.); рН регулировали до рН связывания 9,0. Раствор оставляли на 1 ч, регулируя рН. Производное PSAH концентрировали и подвергали диафильтрации. Связывание.PhtD в концентрации 10 мг/мл в 0,2 М NaCl добавляли к производному PS22FAH для достижения соотношения PhtD/PS22FAH 4/1 (мас./мас.); рН доводили до 5,00,05, используя HCl. Добавляли растворEDAC/1 мг PS22FAH. Полученный раствор инкубировали в течение 150 мин (хотя также использовали 60 мин) при 25 С при перемешивании и регулировании рН. Раствор нейтрализовали путем добавления 1 М Трис-HCl, рН 7,5 (1/10 конечного объема) и оставляли на 30 мин при 25 С. Перед элюированием на Sephacryl S400HR конъюгат осветляли с использованием фильтра 5 мкмMinisart. Полученный конъюгат имеет конечное соотношение PhtD/PS 4,1 (мас./мас.), содержание свободного PS ниже 1% и антигенность (-PS/-PS) 36,3% и анти-PhtD антигенность 7,4%.- 25014107 Очистка конъюгатов. Конъюгаты очищали гель-фильтрацией, используя колонку для гель-фильтрации Sephacryl S400HR,уравновешенную 0,15 М NaCl (S500HR для 18 С) для удаления небольших молекул (включая DMAP) и неконъюгированных PS и белка. Из-за разных молекулярных размеров компонентов реакционной смеси конъюгаты PS-PD, PS-TT, PS-PhtD, PS-пневмолизин или PS-DT элюируются первыми, затем свободныйPS, затем свободный PD или свободный DT и, наконец, DMAP и другие соли (NaCl, глицин). Фракции, содержащие конъюгаты, определяли по УФ 280 нм. Фракции собирали в соответствии с ихKd, подвергали стерильной фильтрации (0,22 мкм) и хранили при 2-8 С. В препаратах конъюгатов определяли соотношения PS/белок. Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов PS S.pneumoniae-белокD/TT/DT/PhtD/Ply. Если в заголовке колонки появляется "микрофлюид.", это указывает на то, что перед конъюгированием сахарид уменьшали в размере посредством микрофлюидизации. Размеры сахаридов после микрофлюидизации приведены в табл. 2. Таблица 1 Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов PS- 26014107 Определение характеристик. Каждый конъюгат был охарактеризован и соответствовал характеристикам, описанным в табл. 2. Содержание полисахарида (мкг/мл) измеряли резорциновым методом, а содержание белка (мкг/мл) - тестированием по Лоури. Конечное соотношение PS/PD (мас./мас.) определяют по соотношению этих концентраций. Содержание свободного полисахарида (%). Содержание свободного полисахарида в конъюгатах, выдерживаемых при 4 С или хранимых в течение 7 суток при 37 С, определяли на супернатанте, полученном после инкубации с антителами на-белок-носитель и насыщенным сульфатом аммония с последующим центрифугированием. Для количественного определения свободного полисахарида в супернатанте использовали ELISA-PS/-PS.Отсутствие конъюгата также контролировали с использованием ELISA для -белокноситель/-PS. Антигенность. Антигенность вышеупомянутых конъюгатов анализировали в ELISA сэндвич-типа, где антителами захвата и детекции были -PS и -белок соответственно. Содержание свободного белка (%). Неконъюгированный белок-носитель может быть отделен от конъюгата во время стадии очистки. Содержание свободного остаточного белка определяли, используя эксклюзионную (гельпроникающую) хроматографию (SEC) (TSK 5000-PWXL) с последующим УФ-детектированием (214 нм). Условия элюирования позволяли разделять свободный белок-носитель и конъюгат. Затем определяли содержание свободного белка в нерасфасованном конъюгате по калибровочной кривой (от 0 до 50 мкг белка-носителя в мл). Свободный белок-носитель в % выражали следующим образом:% свободного носителя = (свободный носитель (мкг/мл)/(общая концентрация соответствующего белка-носителя, измеренная по Лоури (мкг/мл 100%. Стабильность. Молекулярно-массовое распределение (Kav) и стабильность определяли по результатам HPLC-SEC гель-фильтрации (TSK 5000-PWXL) для конъюгатов, выдерживаемых при 4 С или хранимых в течение 7 суток при 37 С. Определение характеристик 10/11/13/14-валентных конъюгатов приведено в табл. 2 (см. примечание к таблице). Белковые конъюгаты могут быть адсорбированы на фосфате алюминия и объединены с образованием конечной вакцины. Вывод. Получены иммуногенные конъюгаты, которые, как затем было показано, являются компонентами многообещающей вакцины. Таблица 2 Характеристики конъюгатов Размер PS после микрофлюидизации нативного PS.- 27014107 Приготавливали 10-валентную вакцину путем смешивания конъюгатов серотипов 1, 4, 5, 6 В, 7F,9V, 14, 18 С, 19F и 23F (например, в дозе 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 мкг сахарида соответственно на дозу,предназначенную для человека). Приготавливали 11-валентную вакцину, дополнительно добавляя конъюгат серотипа 3 из табл. 5 (например, 1 мкг сахарида на дозу, предназначенную для человека). Приготавливали 13-валентную вакцину, дополнительно добавляя конъюгаты серотипов 19 А и 22F, упомянутые выше (где 22F либо непосредственно связан с PhtD, либо, альтернативно, через линкер ADH) [например,в дозе 3 мкг каждого сахарида на дозу, предназначенную для человека]. 14-валентная вакцина может быть приготовлена путем дополнительного добавления конъюгата серотипа 6 А, упомянутого выше [например, в дозе 1 мкг сахарида на дозу для человека]. Пример 3. Подтверждение того, что включение белка D Haemophilus influenzae в иммуногенную композицию по изобретению может обеспечить улучшенную защиту против острого среднего отита(АОМ). Дизайн исследования. В данном исследовании использовали вакцину 11Pn-PD, содержащую серотипы 1, 3, 4, 5, 6 В, 7F,9V, 14, 18 С, 19F и 23F, каждый из которых конъюгирован с белком D из Н. influenzae (ссылка на табл. 5 в примере 4). Субъектов рандомизировали на две группы, получающие четыре дозы либо вакцины 11Pn-PD, либо Havrix, в возрасте приблизительно 3, 4, 5 и 12-15 месяцев. Все субъекты получали вакцину Infanrix-hexa (DTPa-HBV-IPV/Hib) фирмы GSK Biologicals одновременно в возрасте 3, 4 и 5 месяцев.Infanrix-hexa представляет собой комбинацию Pediarix и Hib, смешанных перед введением. Контрольное наблюдение эффективности для анализа "согласно протоколу" ("АТР") начинали через 2 недели после введения третьей дозы вакцины и продолжали до достижения возраста 24-27 месяцев. В выбранной подгруппе субъектов оценивали носоглоточный перенос S.pneumoniae и Н.influenzae. Родителей приглашали на консультацию к исследователю, если их ребенок испытывал тошноту,имел боль в ушах, самопроизвольную перфорацию барабанной перепонки или самопроизвольные выделения из уха. Если у исследователя было подозрение на эпизод АОМ, ребенка немедленно отсылали к специалисту отоларингологу (ухо, нос, горло (Ear, Nose и Throat (ENT для подтверждения диагноза. Клинический диагноз АОМ был основан либо на визуальной картине барабанной перепонки (т.е. покраснение, вздутие, потеря отражения света), либо на наличии выделения жидкости из среднего уха(как продемонстрировано с помощью простой или пневматической отоскопии или с помощью микроскопа). К тому же, должны были присутствовать по меньшей мере два из следующих признаков или симптомов: боль в ушах, выделения из уха, тугоухость, жар, вялость, возбудимость, анорексия, тошнота или диарея. Если специалист ENT подтверждал клинический диагноз, отбирали посредством тимпаноцентеза пробу жидкости среднего уха для бактериологического тестирования. Для субъектов с повторными приступами тошноты устанавливали начало нового эпизода АОМ, если от начала предыдущего эпизода проходило более 30 суток. К тому же эпизод АОМ считался новым бактериальным эпизодом, если выделенные бактерия/серотип отличались от предыдущего изолята, какой бы ни был интервал между двумя последовательными эпизодами. Результаты испытания. Суммарно было охвачено 4968 маленьких детей, 2489 в группе 11Pn-PD и 2479 в контрольной группе. Никаких больших различий в демографических характеристиках или факторах риска среди этих двух групп не имелось. Клинические эпизоды и определение случаев АОМ. В период контрольного наблюдения по протоколу суммарно было зарегистрировано 333 эпизода клинического АОМ в группе 11Pn-PD и 499 в контрольной группе. В табл. 3 представлена защитная эффективность вакцины 11Pn-PD и обеих 7-валентных (7-v) вакцин, ранее протестированных в Финляндии (Eskola et al. N. Engl. J. Med. 2001, 344: 403-409 и Kilpi et al.Clin. Infect. Dis. 2003, 37: 1155-64) в отношении любого эпизода АОМ и АОМ, вызываемого разными пневмококковыми серотипами, Н.influenzae, NTHi и М.catarrhalis. Статистически значимое и клинически релевантное уменьшение на 33,6% общей тяжести заболевания АОМ было достигнуто при использовании 11Pn-PD, независимо от этиологии (табл. 3). Общая эффективность в отношении эпизодов АОМ вследствие присутствия любых 11 пневмококковых серотипов, содержащихся в вакцине 11Pn-PD, составляла 57,6% (табл. 3). Другим важным результатом в настоящем исследовании является 35,6%-ная защита, обеспечиваемая 11Pn-PD вакциной против АОМ, вызываемого Н.influenzae (и конкретно 35,3%-ная защита, обеспечиваемая NTHi). Этот результат имеет большую клиническую значимость, предполагая повышенную значимость Н.influenzae в качестве основной причины АОМ в эпоху пневмококковых конъюгатных вакцин. Параллельно с защитой, которую вакцина 11Pn-PD обеспечивала против АОМ, она также уменьшала носоглоточный перенос Н.influenzae после бустерной дозы на втором году жизни. Эти результаты противоречат предыдущим наблюдениям, полученным в Финляндии, где для обеих 7-валентных пневмококковых конъюгатных вакцин наблюдалось увеличение количества эпизодов АОМ, обусловленных Н.influenzae (Eskola et al. и Kilpi et al.), как свидетельство этиологического замещения. Четкой корреляции между защитой против эпизодов АОМ, обусловленных Hi, и уровнями антител- 28014107 против носителя белка D установить не удалось, поскольку концентрации анти-PD IgG-антител после первичной вакцинации у вакцинированных 11Pn-Pd, у которых не было Hi АОМ эпизодов, по существу,были аналогичны уровням анти-PD IgG антител после первичной вакцинации, измеренным у вакцинированных с примененим 11Pn-Pd, у которых развивался по меньшей мере один Hi АОМ эпизод в течение периода контрольного наблюдения эффективности. Однако, несмотря на то что не удалось установить никакой корреляции между биологическим воздействием вакцины и IgG анти-PD иммуногенностью после первичной вакцинации, разумно предположить, что белок-носитель PD, который является высоко консервативным среди штаммов Н.influenzae, внес большой вклад в индукцию защиты против Hi. Влияние на заболевание АОМ сопровождалось влиянием на носоглоточный перенос, которое имело аналогичную величину для пневмококков и Н.influenzae вакцинных серотипов (фиг. 1). Это уменьшение носоглоточного переноса Н.influenzae у вакцинируемых PD-конъюгатами поддерживает гипотезу прямого защитного эффекта PD-конъюгатной вакцины против Н.influenzae, даже если защитная эффективность не могла коррелировать с анти-PD IgG-иммунными ответами при измерении посредством ELISA. В следующем эксперименте использовали модель среднего отита на шиншиллах с использованием сывороточных пулов от маленьких детей, иммунизированных 11-валентной композицией из этого примера или 10-валентной вакциной из примера 2 (см. также табл. 1 и 2 и комментарии под ними). Оба пула вызывают значительное уменьшение процента животных со средним отитом по сравнению с сывороточным пулом до иммунизации. Нет никакого значимого различия между 10- и 11-валентными иммунными пулами. Это показывает, что обе вакцины имеют одинаковую эффективность в индуцированию защиты против среднего отита, вызываемого нетипируемым Н.influenzae в данной модели. Таблица 3NP = не опубликовано; N = количество субъектов в группе АТР определения эффективности; n = количество эпизодов.Вакцинные пневмококковые серотипы для 11Pn-PD = 11 серотипов, для Prevnar и 7v-OMP = 7 серотипов.Concepcion и Frasch, и о котором сообщалось в Henckaerts et al., 2006, Clinical and Vaccine Immunology,13: 356-360. В кратком изложении, очищенные пневмококковые полисахариды смешивали с метилированным сывороточным альбумином человека и адсорбировали на микротитрационных планшетах для сильного связывания Nunc Maxisorp (Roskilde, DK) в течение ночи при 4 С. Планшеты блокировали 10%-ной фетальной сывороткой теленка (FBS) в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Образцы сыворотки разбавляли PBS, содержащим 10% FBS, 10 мкг/мл полисахарида клеточной стенки (SSI) и 2 мкг/мл пневмококкового полисахарида серотипа 22F (АТСС (Американская коллекция типовых культур и потом разбавляли в микротитрационных планшетах, используя тот же буфер. Внутренний стандарт, откалиброванный относительно стандартной сыворотки 89-SF с использованием серотип-специфических концентраций IgG в 89-SF, был обработан тем же способом и включен в каждый планшет. После промывки связавшиеся антитела детектировали с использованием конъюгиро- 29