Пептиды трав для вакцины

ПЕПТИДЫ ТРАВ ДЛЯ ВАКЦИНЫ Настоящее изобретение относится к композициям, включающим пептиды для профилактики или лечения аллергии на клещей домашней пыли, в особенности к оптимальным комбинациям пептидов для профилактики или лечения указанной аллергии. Ссылки Содержание следующих приоритетных заявок включено посредством ссылки: патентная заявка Великобритании 0901928.2, поданная 5 февраля 2009 г., патентная заявка Великобритании 0901927.4,поданная 5 февраля 2009 г., патентная заявка Великобритании 0912578.2, поданная 20 июля 2009 г.,международная патентная заявкаPCT/GB09/01995, поданная 14 августа 2009 г., и патентная заявка Великобритании 0917871.6, поданная 12 октября 2009 г. Область техники Настоящее изобретение относится к композициям для профилактики или лечения аллергии на травы. Уровень техники Для распознавания Т-клеточных антигенов требуются антиген-презентирующие клетки (АРС) для презентации на их клеточной поверхности антигенных фрагментов (пептидов) совместно с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Т-клетки используют свои антиген-специфичные Тклеточные рецепторы (TCR) для распознавания антигенных фрагментов, презентированных с помощью АРС. Такое распознавание действует в качестве запуска иммунной системы с генерированием ряда реакций для ликвидации антигена, который был распознан. Распознавание внешних антигенов с помощью иммунной системы организма, такого как человек,может в некоторых случаях приводить в результате к заболеваниям, известным как атопические заболевания. Примеры последних представляют собой аллергические заболевания, включающие астму, атопический дерматит и аллергический ринит. При заболеваниях этой группы В-лимфоциты генерируют антитела класса IgE (у людей), которые связываются с антигенами чужеродного происхождения, которые обозначены в данном контексте как аллергены, поскольку эти молекулы вызывают аллергическую реакцию. Продуцирование аллерген-специфичных IgE зависит от Т-лимфоцитов, которые также активируются с помощью аллергена (являются специфичными для него). Аллерген-специфичные антитела IgE связываются с поверхностью клеток, таких как базофилы и тучные клетки, в силу того, что эти клетки экспрессируют поверхностные рецепторы для IgE. Перекрестное связывание с помощью аллергенов молекул IgE, связанных с поверхностью, приводит в результате к дегрануляции этих эффекторных клеток, вызывающей высвобождение медиаторов воспаления, таких как гистамин, 5-гидрокситриптамин и липидные медиаторы, такие как сульфидолейкотриены. Дополнительно к IgE-зависимым событиям определенные аллергические заболевания, такие как астма, характеризуются IgE-независимыми событиями. Аллергические IgE-опосредованные заболевания в настоящее время подвергают лечению с помощью агентов, которые обеспечивают симптоматическое ослабление или предотвращение. Примеры таких агентов представляют собой антигистамины, -агонисты и глюкокортикостероиды. Кроме того, некоторые IgE-опосредованные заболевания подвергают лечению с помощью процедур десенсибилизации,которые включают периодическую инъекцию компонентов или экстрактов аллергенов. Методы лечения с использованием десенсибилизации могут индуцировать ответ IgG, которые конкурируют с IgE за аллерген, или они могут индуцировать специфичные супрессорные Т-клетки, которые блокируют синтезIgE, направленного против аллергена. Эта форма лечения не всегда эффективна и обладает риском провоцирования серьезных побочных эффектов, особенно общего анафилактического шока, который может быть фатальным, если его немедленно не распознать и не подвергнуть лечению с помощью адреналина. Терапевтическое лечение, которое бы уменьшило или исключило нежелательные аллергические иммунные реакции на конкретный аллерген без изменения иммунной реактивности с другими чужеродными антигенами или без запуска самой аллергической реакции, было бы очень полезно для индивидуумов,страдающих аллергией. Аллергены трав для людей и животных везде признаны главной причиной аллергических заболеваний, включающих астму, аллергический ринит и аллергический дерматит. Особенно важны белки, присутствующие в пыльце трав. Например, приблизительно 90% страдающих сенной лихорадкой страдают аллергией на пыльцу трав. "Сенная лихорадка" является распространенным термином для формы сезонной аллергии, характеризующейся чиханием, насморком и зудом в глазах. Термин "сенная лихорадка" возник из-за того, что эта форма аллергического заболевания наиболее доминирует во время "сезона сенокоса", который соответствует сезону цветения многих трав, когда травянистые растения высвобождают наибольшее количество пыльцы. Этот процесс особенно доминирует летом, как правило, с конца мая до конца августа (в северном полушарии). Было подсчитано, что для взрослых в Соединенных Штатах сенная лихорадка является пятым лидирующим хроническим заболеванием и главной причиной невыходов на работу, приводящей в результате к почти 4 млн пропущенных или потерянных рабочих дней в году, что приводит в результате к общим затратам, составляющим в общей сложности более чем 700 млнв результате потери продуктивности. Аллергии также представляют собой наиболее часто встречающиеся хронические заболевания у детей, ограничивая их активность более чем на 40%. Каждый год в Соединенных Штатах аллергии отвечают за более чем 17 миллионов визитов в поликлиники; сезонные аллергии, такие как сенная лихорадка,отвечают за более чем половину этих визитов, связанных с аллергией. Терапевтическое или профилактическое лечение, таким образом, было бы очень полезно для людей,страдающих аллергией на травы или подверженных риску развития этой аллергии. Сущность изобретения Аллергены пыльцы трав, как правило, классифицируют по группам, где большая часть видов экспрессирует по меньшей мере один пыльцевой аллерген в каждой группе. Примеры групп включают аллергены пыльцы трав группы 1, которые включают, например, белки Lol p 1 из райграса многолетнего (Lolium perenne) и Phl р 1 из тимофеевки луговой (Phleum pratense); и аллергены пыльцы трав группы 5, которые включают, например, белки Lol р 5 а и Lol p 5b из райграса многолетнего, Phl p 5 из тимофеевки луговой и Cyn d 5 из бермудской травы (Cynodon dactylon). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что определенные пептидные фрагменты, выделенные из большинства аллергенов пыльцы различных видов трав, особенно подходят для десенсибилизации индивидуумов к этим аллергенам. Полипептидные комбинации по изобретению выбирали по их способности связываться со многими молекулами МНС класса II и вызывать Т-клеточную пролиферацию с минимальным высвобождением гистамина. Таким образом, композиции, продукты, векторы и составы по изобретению могут предоставляться индивидуумам для профилактики или лечения аллергии на травы посредством толеризации. С помощью компьютерного анализа, предсказывающего взаимодействия пептид-МНС, и посредством анализов связывания с МНС класса II выбирали пептиды по изобретению в виде Т-клеточных эпитопов, связывающихся с молекулами МНС класса II. Дополнительные эпитопы идентифицировали с помощью гомологии. Пептиды и пептидные комбинации по изобретению дополнительно отбирали на основе in vitro-анализов Т-клеточной реакции. Однако пептидные комбинации по изобретению обеспечивают широкий охват эффективности по отношению к человеческой популяции путем охвата множества различных молекул МНС. Таким образом, вакцина, разработанная с использованием пептидов по изобретению, будет иметь широкое применение. В работе авторов изобретения были получены пептидные комбинации, имеющие следующие характеристики: комбинация связывается с множеством различных молекул МНС класса II; комбинация значительно стимулирует высвобождение цитокинов у индивидуумов с аллергией на травы; пептиды комбинаций не стимулируют значительного высвобождения гистамина. Пептидные комбинации отобраны на основании расширенного анализа последовательностей эпитопов из трав с целью идентификации коровых пептидов, обладающих особенно приемлемыми свойствами связывания с молекулами МНС и профилями реакции цитокинов у индивидуумов с аллергией на травы. Комбинации могут включать кор, состоящий из трех таких пептидов, каждый из которых отобран из наиболее распространенных трав, тимофеевки луговой, райграса многолетнего и бермудской травы. Комбинации могут включать кор, состоящий из четырех таких пептидов, причем каждый из этих пептидов отобран из пептидов, которые, как продемонстрировано, являются особенно эффективными в комбинации друг с другом. Таким образом, предложение коровой группы пептидов, включающей коровую группу полипептидов, характеризующих три наиболее распространенные травы, предпочтительно коровую группу из четырех или более различных индивидуальных полипептидов в одной композиции, обеспечивает разнообразие МНС-связывающих эпитопов и, таким образом, обеспечивает внутреннюю избыточность для учета полиморфной природы МНС. Предложение коровой группы по изобретению, предпочтительно четырех или более различных индивидуальных полипептидов, обладающих особенно приемлемыми свойствами связывания с молекулами МНС и профилем реакции цитокинов, также обеспечивает множество Тклеточных эпитопов, позволяющих привлечь широкий спектр Т-клеточных специфичностей для индукции толерантности. Таким образом, композиция по изобретению обладает дополнительными полезными эффектами по отношению к использованию полипептидов индивидуально. Авторы изобретения также продемонстрировали с помощью измерения реакции цитокинов, что композиции по изобретению способны обеспечивать очень высокий охват полиморфной популяции, вошедшей в исследование. Соответственно, в настоящем изобретении предлагается композиция, пригодная для применения в профилактике или лечении аллергии на пыльцу трав посредством толеризации, включающая:(a) по меньшей мере один из полипептидов Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA), Tim10B (KYTVFETALKKAITAMSE), Tim04A (WGAIWRIDTPDKL), Tim07G (FKVAATAANAAPANDK) или вариант любого из них;(b) по меньшей мере один из полипептидов Ber01 (SGKAFGAMAKKGQED), Ber02(FIPMKSSWGA), Ber02 С (KSSWGAIWRIDPKKPLK) и Ber02B (KDSDEFIPMKSSWGAIWR) или вариант любого из них;(с) по меньшей мере один из полипептидов Bio04A (LKKAVTAMSEAEK), Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT), Bio02A (KYDAYVATLTEALR), Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY), Rye05C (NAGFKAAVAAAANAPPK) или вариант любого из них,-2 020792 где указанный вариант представляет собой:I) более длинный полипептид длиной до 30 аминокислот, который включает последовательность соответствующего полипептида, определенного в (а), (b) или (с), илиII) полипептид длиной 9-30 аминокислот, который включает последовательность, имеющую по меньшей мере 65% гомологии с последовательностью соответствующего полипептида, определенного в(а), (b) или (с), и который способен к толеризации по отношению к указанному соответствующему полипептиду, илиIII) полипептид длиной 9-30 аминокислот, который включает последовательность по меньшей мере из 9 последовательно расположенных аминокислот из последовательности соответствующего полипептида, определенного в (а), (b) или (с), или который включает последовательность, имеющую по меньшей мере 65% гомологии с указанными по меньшей мере 9 последовательно расположенными аминокислотами, где последовательность по меньшей мере 9 последовательно расположенных аминокислот или гомологичная последовательность способны к толеризации по отношению к указанному соответствующему полипептиду. В изобретении дополнительно предлагается композиция, пригодная для применения в профилактике или лечении аллергии на пыльцу трав посредством толеризации, включающая по меньшей мере четыре различных полипептида, выбранных из:(g) Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ) или его варианта и(h) Bio02A (KYDAYVATLTEALR) или его варианта; где указанный вариант представляет собой:I) более длинный полипептид длиной до 30 аминокислот, который включает последовательность соответствующего полипептида, определенного в (a)-(h), илиII) полипептид длиной 9-30 аминокислот, который включает последовательность, имеющую по меньшей мере 65% гомологии с последовательностью соответствующего полипептида, определенного в(a)-(h), и который способен к толеризации по отношению к указанному соответствующему полипептиду,илиIII) полипептид длиной 9-30 аминокислот, который включает последовательность из по меньшей мере 9 последовательно расположенных аминокислот из последовательности соответствующего полипептида, определенного в (a)-(h), или который включает последовательность, имеющую по меньшей мере 65% гомологии с указанными по меньшей мере 9 последовательно расположенными аминокислотами,где последовательность по меньшей мере 9 последовательно расположенных аминокислот или гомологичная последовательность способны к толеризации по отношению к указанному соответствующему полипептиду. Композиции по изобретению, как правило, способны к толеризации по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% из совокупности индивидуумов с аллергией на пыльцу трав в популяции и/или включают по меньшей мере один дополнительный полипептид и всего до четырнадцати полипептидов, где дополнительные полипептиды (а) включают последовательность, имеющую по меньшей мере 65% идентичность последовательности по меньшей мере с 9 или более последовательно расположенными аминокислотами в любой из SEQ ID NO: 1-73, не выбранных выше; и (b) имеют длину 9-30 аминокислот. Описание последовательностей, упомянутых в настоящем документе В SEQ ID NO: 1-73 представлены полипептидные последовательности по изобретению, которые представлены в табл. 2-4. SEQ ID NO: 1-27 соответствуют пептидам, выделенным из аллергенов трав группы 1. SEQ ID NO: 28-73 соответствуют пептидам, выделенным из аллергенов группы 5. Подробное описание изобретения Изобретение относится к пептидам, которые могут применяться в толеризации. Такие пептиды могут быть выделены из любого аллергена трав, описанного в настоящем документе, или из его варианта,как описано ниже. Трудности, связанные со способами десенсибилизации на основе пептидной иммунизации, заключаются в том, как выбрать участок аллергена подходящего размера в качестве основы для пептида, используемого для иммунизации. Размер выбранного пептида является критическим. Если пептид слишком маленький, то вакцина не будет эффективна в части индукции иммунологического ответа. Если пептиды слишком большие или если индивидууму вводится целый антиген, то существует риск индукции побочных реакций, таких как анафилаксия, которая может быть фатальной. Полипептиды по изобретению были выбраны так, чтобы они сохраняли Т-клеточную специфичность, будучи при этом достаточно небольшими по размеру, так чтобы не обладать значительной третичной структурой, что позволит им сохранить конформацию IgE-связывающего эпитопа цельной молекулы. Таким образом, полипептиды по изобретению не индуцируют существенного перекрестного свя-3 020792 зывания соседних специфичных молекул IgE на клетках, таких как тучные клетки и базофилы, и, следовательно, не вызывают существенного высвобождения гистамина. Преимущество изобретения состоит в способности пептидов к широкому охвату молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC). Т-клеточные рецепторы (TCR) высоковариабельны по своей специфичности. Вариабельность генерируется как с помощью молекул антител, так и посредством событий рекомбинации генов внутри клетки. TCR распознают антиген в форме коротких пептидов, связанных с молекулами, кодируемыми генами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Эти продукты генов представляют собой такие же молекулы, которые дают начало "тканевым типам", используемым в трансплантации, а также обозначаются как молекулы лейкоцитарного антигена человека (HLA), это термин, который может использоваться взаимозаменяемо с MHC. Индивидуальные молекулы МНС имеют пептидсвязывающие бороздки, которые благодаря их форме и заряду способны связываться только с ограниченной группой пептидов. Пептиды, связанные одной молекулой МНС, необязательно связаны другими молекулами МНС. Когда молекула белка, такая как антиген или аллерген, захватывается антиген-презентирующими клетками, такими как В-лимфоциты, дендритные клетки, моноциты и макрофаги, то молекула ферментативно деградирует внутри клетки. Процесс деградации дает начало получению пептидных фрагментов молекулы, которые, если они подходящего размера, заряда и формы, могут затем связываться внутри пептидсвязывающей бороздки определенных молекул МНС и затем презентироваться на поверхности антиген-презентирующих клеток. Если комплексы пептид/МНС презентируются на поверхности антиген-презентирующих клеток в достаточном количестве, то они могут затем активировать Т-клетки, которые несут подходящие пептид/МНС-специфичные Т-клеточные рецепторы. Благодаря полиморфной природе МНС, индивидуумы в аутбредной популяции, такой как люди,будут экспрессировать различные комбинации молекул МНС на поверхности своих клеток. Так как различные молекулы МНС могут связываться с различными пептидами из одной и той же молекулы на основе размера, заряда и формы пептида, то различные индивидуумы будут демонстрировать различный набор пептидов, связанных с их молекулами МНС. Идентификация универсальных МНС-связывающих пептидных эпитопов в аутбредной популяции, такой как люди, является более трудной, чем у инбредных животных (таких как определенные штаммы лабораторных мышей). На основе дифференциальной экспрессии МНС между индивидуумами и существенными различиями в пептидном связывании и презентации, которая это несет, невероятно, чтобы мог быть идентифицирован один пептид, который будет применяться для терапии с целью гипосенсибилизирующей терапии у людей. Как описано ниже, изобретение относится к задаче предложения композиций на основе более чем одного пептида, т.е. пептидных комбинаций. Эти комбинации основаны на коровых группах пептидов,идентифицированных экспериментально, как демонстрирующих удивительно сильные реакции у пациентов с аллергией на травы при тестировании индивидуально и особенно при их использовании в комбинации. Эти коровые группы пептидов обладали преимущественными свойствами при их включении в вакцины пептидов трав. Коровые группы могут включать по меньшей мере один пептид, выделенный из тимофеевки луговой, по меньшей мере один пептид, выделенный из райграса многолетнего, и по меньшей мере один пептид, выделенный из бермудской травы, причем каждый пептид демонстрирует особенно удовлетворительные индивидуальные ответные реакции. Включение таких пептидов в комбинацию дает возможность охвата трех наиболее распространенных трав и дополнительно расширяет охват других трав с помощью гомологии, как будет далее обсуждаться ниже. Дополнительно, коровая группа может включать по меньшей мере четыре пептида, выбранных из пептидов, имеющих в тестируемой группе наиболее высокоупорядоченные индивидуальные ответные реакции, и которые, как дополнительно продемонстрировано, обеспечивают оптимальные ответные реакции для вакцины трав при их предоставлении в совместной комбинации. Такие пептидные комбинации предпочтительно включают по меньшей мере один пептид, выделенный из аллергенов трав группы I, или его вариант, и по меньшей мере один пептид, выделенный из аллергенов трав группы V, или его вариант. Классификация аллергенов трав на аллергены трав группы I и аллергены трав группы V хорошо известна специалисту и обсуждается далее в настоящем документе. Предпочтительным аллергеном трав группы I является аллерген бермудской травы, Cyn d 1. Предпочтительным аллергеном трав группы V является аллерген райграса многолетнего, Lol p 5. В некоторых воплощениях изобретение относится к композиции, включающей по меньшей мере один пептид, выделенный из Cyn d 1, или его вариант, и по меньшей мере один пептид, выделенный из Lol p 5, или его вариант. Композиции на основе комбинаций пептидов Cyn d 1 и Lol p 5 или их вариантов далее будут обсуждаться ниже. Предпочтительные пептиды по изобретению могут включать, состоять из или по существу состоять из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 1-73. Также могут использоваться варианты этих специфических пептидов. Варианты могут включать, состоять из или по существу состоять из последовательностей, которые представляют собой фрагменты или любую из SEQ ID NO: 1-73 или гомологи любой из SEQ ID NO: 1-73. Таким образом, в изобретении предлагается композиция, пригодная для применения в профилактике или лечении аллергии на пыльцу трав посредством толеризации, включающая:(a) по меньшей мере один из полипептидов Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA), Tim10B (KYTVFETALKKAITAMSE), Tim04A (WGAIWRIDTPDKL), Tim07G (FKVAATAANAAPANDK) или вариант любого из них;(b) по меньшей мере один из полипептидов Ber01 (SGKAFGAMAKKGQED), Ber02(FIPMKSSWGA), Ber02 С (KSSWGAIWRIDPKKPLK) и Ber02B (KDSDEFIPMKSSWGAIWR) или вариант любого из них;(c) по меньшей мере один из полипептидов Bio04A (LKKAVTAMSEAEK), Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT), Bio02A (KYDAYVATLTEALR), Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY), Rye05C (NAGFKAAVAAAANAPPK) или вариант любого из них,где указанный вариант представляет собой:I) более длинный полипептид длиной до 30 аминокислот, который включает последовательность соответствующего полипептида, определенного в (а), (b) или (с), илиII) полипептид длиной 9-30 аминокислот, который включает последовательность, имеющую по меньшей мере 65% гомологии с последовательностью соответствующего полипептида, определенного в(а), (b) или (с), и который способен к толеризации по отношению к указанному соответствующему полипептиду; илиIII) полипептид длиной 9-30 аминокислот, который включает последовательность из по меньшей мере 9 последовательно расположенных аминокислот из последовательности соответствующего полипептида, определенного в (а), (b) или (с), или который включает последовательность, имеющую по меньшей мере 65% гомологии с указанными по меньшей мере 9 последовательно расположенными аминокислотами, где последовательность по меньшей мере 9 последовательно расположенных аминокислот или гомологичная последовательность способны к толеризации по отношению к указанному соответствующему полипептиду. Другие предпочтительные варианты а)-с) представляют собой:i) полипептиды длиной 9-30 аминокислот и включающие участок, состоящий из любой из соответствующих последовательностей а)-с), или последовательности, которая имеет по меньшей мере 65% гомологии с любой из соответствующих последовательностей а)-с) и которая способна к толеризации индивидуума по отношению к любой из последовательностей а)-с), илиii) полипептиды длиной 9-30 аминокислот и включающие участок, состоящий из последовательности, которая представляет собой или фрагмент любой из последовательностей а)-с),или гомолог фрагмента любой из последовательностей а)-с),и причем это последовательности, которые способны к толеризации индивидуума по отношению к любой из последовательностей а)-с) и имеют длину по меньшей мере 9 аминокислот, где указанный гомолог имеет по меньшей мере 65% гомологии с любыми 9 последовательно расположенными аминокислотами в любой из последовательностей а)-с); где необязательно ни один из четырех полипептидов не является вариантом одной и той же исходной последовательности, определенной с помощью любой из а)-с). Таким образом, композиция включает минимум три полипептида, причем первый представляет собой полипептид а) или его вариант, второй представляет собой полипептид b) или его вариант и третий представляет собой полипептид с) или его вариант. Таким образом, например, композиция может включать вариант Tim07B, Ber01 и вариант Rye09B. Предпочтительно вышеописанная композиция включает дополнительно к трем коровым пептидам четвертый полипептид а), b) или с) или вариант любого из них. Композиция может включать четыре, пять, шесть, семь, восемь или более полипептидов а), b), с) или их варианты. В некоторых аспектах композиция может включать два, три, четыре или более полипептидов а) или их варианты. В дополнительных аспектах композиция может включать два, три, четыре или более полипептидов b) или их варианты. В следующих аспектах композиция может включать два, три, четыре, пять,шесть или более полипептидов с) или их варианты. Эти наборы являются субъектом композиции, включающей по меньшей мере один полипептид а) или его вариант, по меньшей мере один полипептид b) или его вариант. Предпочтительная комбинация трех полипептидов, выбранных из групп а), b) и с), представляет собой полипептид Tim07B или его вариант, полипептид Ber01 или его вариант, и полипептидBio04A или его вариант. Композиция может включать по меньшей мере два полипептида, выбранных из группы а), или их варианты, по меньшей мере два полипептида, выбранных из группы b), или их варианты, и по меньшей мере два полипептида, выбранных из группы с), или их варианты. Предпочтительная композиция может включать полипептид Tim07B или его вариант, и по меньшей мере два, три или четыре полипептида, выбранных из группы b), или их варианты. Эта предпочтительная композиция может включать два или три полипептида, выбранных из группы с), или их варианты, пред-5 020792 почтительно включая Bio04A или его вариант. Другая предпочтительная композиция может включать полипептид Tim07B или его вариант и по меньшей мере два, три или четыре полипептида, выбранных из группы с), или их варианты. Эта предпочтительная композиция может включать два или три полипептида, выбранных из группы b), или их варианты, предпочтительно включая Ber01 или его вариант. Все вышеописанные композиции на основе а)-с) могут включать дополнительные полипептиды,выбранные из любой из SEQ ID NO: 1-74, или их варианты, не выбранные ранее соответственно а)-с). В изобретении также предлагается композиция, пригодная для применения в профилактике или лечении аллергии на пыльцу трав посредством толеризации, включающая по меньшей мере четыре различных полипептида, выбранных из:(g) Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ) или его варианта и(h) Bio02A (KYDAYVATLTEALR) или его варианта; где указанный вариант представляет собой:I) более длинный полипептид длиной до 30 аминокислот, который включает последовательность соответствующего полипептида, определенного в (a)-(h), илиII) полипептид длиной 9-30 аминокислот, который включает последовательность, имеющую по меньшей мере 65% гомологии с последовательностью соответствующего полипептида, определенного в(a)-(h), и который способен к толеризации по отношению к указанному соответствующему полипептиду; илиIII) полипептид длиной 9-30 аминокислот, который включает последовательность по меньшей мере из 9 последовательно расположенных аминокислот из последовательности соответствующего полипептида, определенного в (a)-(h), или который включает последовательность, имеющую по меньшей мере 65% гомологии с указанными по меньшей мере 9 последовательно расположенными аминокислотами,где последовательность по меньшей мере 9 последовательно расположенных аминокислот или гомологичная последовательность способны к толеризации по отношению к указанному соответствующему полипептиду. Другие предпочтительные варианты a)-h) представляют собой:i) полипептид длиной 9-30 аминокислот и включающий участок, состоящий из любой из соответствующих последовательностей а)-h), или последовательности, которая имеет по меньшей мере 65% гомологии с любой из соответствующих последовательностей a)-h), которая способна к толеризации индивидуума по отношению к любой из последовательностей a)-h), илиii) полипептиды длиной 9-30 аминокислот и включающие участок, состоящий из последовательности, которая представляет собой или фрагмент любой из последовательностей a)-h),или гомолог фрагмента любой из последовательностей a)-h), которая способна к толеризации индивидуума по отношению к любой из последовательностей a)-h) и имеет длину по меньшей мере 9 аминокислот и где указанный гомолог имеет по меньшей мере 65% гомологии с любыми 9 последовательно расположенными аминокислотами в любой из последовательностей a)-h); где, необязательно, ни один из четырех полипептидов не является вариантом одной и той же исходной последовательности, определенной с помощью любой из a)-h). Таким образом, композиция включает минимум четыре полипептида, где каждый из указанных четырех полипептидов выбран из полипептидов a)-h) или их вариантов. Вышеописанная композиция может включать дополнительные полипептиды a)-h) или вариант любого из них, как, например, пять,шесть, семь, восемь или более полипептидов a)-h) или их варианты. В некоторых аспектах композиция может включать полипептид а) или его вариант, по меньшей мере один полипептид, выбранный из b), е) или f) или варианта любого из них, и по меньшей мере один полипептид, выбранный из с), d), g) или h) или их варианта. Альтернативно, композиция может предпочтительно включать полипептид а) или его вариант и по меньшей мере два или три полипептида, выбранных из b), е) или f) или варианта любого из них. Эта композиция может предпочтительно включать полипептид Ber01 или его вариант. В другом воплощении композиция может включать полипептид а) или его вариант и по меньшей мере два, три или четыре полипептида, выбранных из с), d), g) или h) или варианта любого из них. Эта композиция предпочтительно может включать полипептид Bio04A или его вариант. Все такие композиции предпочтительно могут включать полипептид Tim07B или его вариант, полипептид Ber01 или его вариант и полипептид Bio04A или его вариант. Вышеописанные композиции, выбранные из a)-h), предпочтительно включают по меньшей мере че-6 020792 тыре различных полипептида a)-h) или включают по меньшей мере четыре варианта, каждый из которых соответствует различным исходным или базовым последовательностям a)-h). Таким образом, композиции, как правило, выбирают на основе четырех исходных различных эпитопных последовательностей. Предпочтительно композиция включает по меньшей мере одну эпитопную последовательность, происходящую из бермудской травы, по меньшей мере одну эпитопную последовательность, происходящую из райграса многолетнего, и по меньшей мере одну эпитопную последовательность, происходящую из тимофеевки луговой. Соответствующие эпитопные последовательности могут быть выбраны из любой из SEQ ID NO: 1-74 или их вариантов. Таким образом, все из вышеописанных композиций на основе a)-h) могут включать дополнительные полипептиды, выбранные из любой из SEQ ID NO: 1-74 или их вариантов, не выбранных ранее, соответственно a)-h). Все наборы являются объектом композиции, включающей по меньшей мере четыре полипептида, выбранных из а)-h) или их вариантов. Необязательно, любая композиция специфичных полипептидов, описанных в настоящем документе, может включать дополнительные полипептиды, в общем количестве до четырнадцати уникальных полипептидов. Дополнительные полипептиды будут, как правило, относиться к другим последовательностям (т.е. будут, как правило, представлять собой гомологи и/или фрагменты), т.е. SEQ ID NO: 1-73,которых нет среди уже выбранных полипептидов. Дополнительные полипептиды, как правило, представляют собой функциональные варианты одного из пептидов SEQ ID NO: 1-73. Дополнительные полипептиды могут быть идентичны любой из SEQ ID NO: 1-73. Композиция, таким образом, может включать до четырнадцати различных полипептидов, представленных в любой из SEQ ID NO: 1-73, с учетом того, что по меньшей мере один полипептид выбран из каждой последовательности (а) и (b), как определено выше. Однако необязательные дополнительные полипептиды не нуждаются в том, чтобы быть на 100% гомологичными любой из SEQ ID NO: 1-73. Они предпочтительно по меньшей мере на 65% идентичны по меньшей мере 9 (например, по меньшей мере 10, 11, 12 или 13) или более последовательно расположенным аминокислотам в любой из SEQ ID NO: 1-73, которые еще не выбраны среди по меньшей мере одного полипептида, выбранного из каждой из последовательностей (а) и (b). Эти последовательно расположенные аминокислоты могут включать эпитоп МНС класса II, который, например, связывается с любой из молекул МНС, упомянутых в настоящем документе. В изобретении также предлагаются продукты и составы, включающие полипептиды по изобретению, и композиции, продукты и векторы, включающие полинуклеотиды, способные экспрессировать полипептиды по изобретению для применения в профилактике или лечении аллергии на травы посредством толеризации. Такая толеризация будет, как правило, по отношению к эпитопу (например, Тклеточному эпитопу связывания с молекулой МНС класса II), присутствующему в любой из SEQ ID NO: 1-74. Виды трав. Виды трав, райграс многолетний (Lolium perenne), тимофеевка луговая (Phleum pratense) и бермудская трава (Cynodon dactylon), отвечают за высокую долю аллергии на травы во всем мире, особенно за аллергии, ассоциированные с пыльцой трав, такие как сенная лихорадка. Другие важные виды трав включают бухарник шерстистый (Holcus lanatus), ежу сборную (Dactylis glomerata), канареечник Канарский (Phalaris canariensis) и мятлик луговой/кентукская голубая трава (Poa pratensis). Райграс многолетний представляет собой одну из наиболее распространенных трав в мире и широко используется в качестве источника животного корма. Его родиной является Европа, но затем он распространился на всех континентах по всему миру и теперь является типичным для всех зон умеренного климата. Он может цвести на протяжении всего лета, но, как правило, в северном полушарии он цветет с мая по июль. Райграс многолетний хорошо адаптирован к умеренному влажному климату и лучше всего растет на более тяжелых, плодородных, влажных почвах. Он также хорошо растет на хорошо удобренных более легких почвах с достаточным количеством влаги. Он не любит тень и ему требуется хорошо дренированная почва. Райграс многолетний, как правило, растет в местах, где рН почвы находится в диапазоне от примерно 6 до примерно 7, хотя он может переносить интервал от примерно 4,5 до примерно 8,5, предпочтительно с годовым количеством осадков от примерно 21 до примерно 180 см. Тимофеевка луговая представляет собой другую наиболее широко распространенную траву в мире и является главным источником животного корма. Ее родиной и областью широкого распространения является большая часть Европы, Северная Африка и северная Азия. Она была привезена и получила широкое распространение в Северной и Южной Америке, Южной Африке и в Австралии. Тимофеевка луговая, как правило, растет в местах с годовым количеством осадков в диапазоне от примерно 35 до примерно 180 см, при годовом температурном интервале от примерно 4 до примерно 22 С, и при рН почвы от примерно 4,5 до примерно 8. Она лучше всего адаптирована к прохладному, влажному, умеренному климату, с наилучшим ростом в тяжелых, глубоких и увлажненных или даже во влажных почвах. Оптимальная температура роста составляет 18-21 С, с вариациями дневных/ночных температур от 15/10 С и до 21/15 С. Сезон цветения тимофеевки луговой, как правило, ограничивается ранним летом, и пыльца тимофеевки луговой является главной причиной аллергии на травы в течение этого сезона. В исследованиях было обнаружено, что до 21% пациентов с аллергическим ринитом или другими симптомами чув-7 020792 ствительны к пыльце тимофеевки луговой. Бермудская трава, как правило, растет в местах с годовым количеством осадков от примерно 9 до примерно 429 см, с годовым температурным интервалом от примерно 5 до примерно 28 С, и при рН почвы в диапазоне от примерно 4 до примерно 8,5, предпочтительно от примерно 6 до примерно 7. Сезон цветения бермудской травы, как правило, приходится на позднее лето (с августа по октябрь в северном полушарии). Бермудская трава производит большие количества пыльцы и, таким образом, является главной причиной сенной лихорадки. Также сообщалось, что бермудская трава вызывает контактный дерматит. Бермудская трава широко распространена в мире, в основном в теплом климате, и, как правило,встречается в широтах от примерно 30 северной широты и до примерно 30 южной. Пептидные фрагменты аллергенов пыльцы трав группы 1 и группы 5. Основные аллергены трав включают аллергены пыльцы трав группы 1 и аллергены пыльцы трав группы 5. Белки из различных видов относили к группам на основе гомологии аминокислотной последовательности. Например, основные аллергены пыльцы трав группы 1 включают белок Phl p 1 из тимофеевки луговой и белок Lol p 1 из райграса многолетнего, а основные аллергены пыльцы трав группы 5 включают белок Phl p 5 из тимофеевки луговой и белок Lol p 5 из райграса многолетнего. Авторы настоящего изобретения идентифицировали участки в определенных белках аллергенов пыльцы трав, которые включают Т-клеточные эпитопы связывания с молекулами МНС класса II. Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что участки внутри основных аллергенов пыльцы трав, соответствующие Т-клеточным эпитопам связывания с молекулами МНС класса II, высококонсервативны среди представителей в данной группе, см., например, пример 2. На основе этой информации,пептиды, выделенные из соответствующих участков белка в данной группе, являются подходящими для профилактики или лечения аллергии на травы посредством толеризации по отношению к аллергенам трав в этой группе. Например, соответствующий участок, например, из Phl p 1 тимофеевки луговой или из Lol p 1 райграса многолетнего пригодны для применения в профилактике или лечении аллергии на травы посредством толеризации по отношению к аллергенам трав группы 1. Пептиды по изобретению выделяют из аллергенов трав группы 1 (SEQ ID NO: 1-27) и группы 5(SEQ ID NO: 28-73). Термины "пептид" и "полипептид" используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Вышеописанные белки также обозначаются в настоящем документе как "аллергены". В табл. 2-4 представлены последовательности пептидов по изобретению с указанием родительского белка, из которого произошел каждый пептид. В случае, где композиция по изобретению включает четыре или более полипептидов, выбранных из полипептидов a)-h) или их вариантов, композиция, как правило, будет включать по меньшей мере один полипептид или его вариант (например, функциональный вариант), выбранный из каждой из a) SEQ IDNO: 1-27 и b) SEQ ID NO: 28-73. Композиция может включать по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или по меньшей мере семь полипептидов или их варианты (например, функциональные варианты), выбранные из каждой из a) SEQID NO: 1-27 и b) SEQ ID NO: 28-73. В некоторых воплощениях композиция может включать по меньшей мере один полипептид или его вариант (например, функциональный вариант), выбранный из каждой изa) SEQ ID NO: 1-10 и b) SEQ ID NO: 28-52. Композиция может включать по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или по меньшей мере семь полипептидов или их варианты (например, функциональные варианты), выбранные из каждой из a) SEQ ID NO: 1-10 и b) SEQ ID NO: 28-52. Как отмечено выше, предпочтительные композиции на основе полипептидов a)-h) или их вариантов, таким образом, включают те, которые включают по меньшей мере один пептид, произошедший изCyn d 1, или его вариант, и по меньшей мере один пептид, произошедший из Lol p 5, или его вариант. Особенно предпочтительными композициями будут те, которые включают по меньшей мере один пептид, произошедший из Cyn d 1, или его вариант, по меньшей мере один пептид, произошедший из Lol p 5, или его вариант, и по меньшей мере один пептид, произошедший из Phl p 5. В некоторых воплощениях композиции a)-h) могут включать два, три, четыре или более пептидов, произошедших из Cyn d 1, или их варианты, и/или два, три, четыре или более пептидов, произошедших из Lol p 5, или их варианты. В некоторых воплощениях композиции могут состоять из или по существу состоять из пептидов, произошедших из Cyn d 1 и Lol p 5, или их вариантов. В других воплощениях композиция, необязательно, не включает пептид, произошедший из Lol p 1, или его вариант. Как обсуждается ниже, композиции на основе пептидов Cyn d 1 и Lol p 5 имеют исключительное применение в лечении аллергии на травы. Особенно предпочтительные композиции по изобретению включают те, которые включают, состоят из или по существу состоят из:a) по меньшей мере одного из полипептидов SEQ ID NO: 1, 2 и 5 или их вариантов, определенных в настоящем документе;b) по меньшей мере одного из полипептидов SEQ ID NO: 28, 29, 31 и 46 или их вариантов, определенных в настоящем документе; и, необязательно,c) полипептида SEQ ID NO: 69 или его варианта, определенного в настоящем документе. В этих композициях предлагается особенно предпочтительный пептид Cyn d 1, особенно предпочтительный пептид Lol p 5 и, необязательно, особенно предпочтительный пептид Phl p 5. Более предпочтительно композиции включают по меньшей мере два или все три полипептида, определенных в а), и по меньшей мере два или по меньшей мере три полипептида, определенных в b). Также предпочтительная композиция включает полипептид, определенный в с). Особенно предпочтительно, если композиция включает i) SEQ ID NO: 1, ii) одну из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5; iii) SEQ ID NO: 46. Специфические предпочтительные композиции включают комбинации 1-10, представленные в табл. 7. В таких композициях необязательно одним или несколькими из индивидуальных полипептидовSEQ ID NO: 1, 2, 5, 28, 29, 31, 46 и 69 могут заменять их варианты. В некоторых воплощениях двумя,тремя, четырьмя, пятью или более из полипептидов SEQ ID NO: 1, 2, 5, 28, 29, 31, 46 и 69, присутствующих в комбинациях 1-10, можно заменить их варианты. Количество полипептидов, заменяющих их варианты, будет зависеть от общего количества полипептидов, включенных в композицию. Например, в комбинациях на основе четырех полипептидов (т.е. комбинации 6, 8, 10), предпочтительно, если только одним или двумя полипептидами заменены их варианты. Альтернативно, любая композиция, включающая четыре или более полипептидов, выбранных из любой из SEQ ID NO: 1, 69, 31, 46, 2, 5, 29, 28, 43, 53, 35,27, 4 и 70, или их варианты, также является предпочтительной. Еще более предпочтительная композиция включает, состоит из или по существу состоит из полипептидов SEQ ID NO: 1, 2, 5, 28, 31, 91 и 93 или их вариантов. Другие предпочтительные композиции включают SEQ ID NO: 1, 2, 5, 28, 31, 91 и 93, или вместо одного, двух или трех, четырех или более из этих полипептидов включают их варианты. В некоторых воплощениях вышеописанные семь пептидных композиций не включают каких-либо дополнительных полипептидов, выделенных их аллергенов трав. В предпочтительных воплощениях композиции включают SEQ ID NO: 1, 2, 5, 28, 31, 91 и 93 или их варианты и не содержат каких-либо дополнительных белков, имеющих более чем 20% гомологии с белком любого вида трав, упомянутых в настоящем документе. Вышеописанные композиции могут включать дополнительные составляющие непептидного происхождения, такие как носители или адъюванты. В изобретении также предлагается продукт, включающий:(WGAIWRIDTPDKL), Tim07G (FKVAATAANAAPANDK) или вариант любого из них, как описано в настоящем документе;(b) по меньшей мере один из полипептидов Ber01 (SGKAFGAMAKKGQED), Ber02(FIPMKSSWGA), Ber02 С (KSSWGAIWRIDPKKPLK) и Ber02B (KDSDEFIPMKSSWGAIWR) или вариант любого из них, как описано в настоящем документе;(c) по меньшей мере один из полипептидов Bio04A (LKKAVTAMSEAEK), Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT) и Bio02A (KYDAYVATLTEALR), Bio03 А (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY), Rye05C (NAGFKAAVAAAANAPPK) или вариант любого из них, как описано в настоящем документе,где каждый отличный полипептид предназначен для одновременного, отдельного или последовательного применения в профилактике или лечении аллергии на пыльцу трав посредством толеризации. Четыре или более полипептидов в продукте по изобретению могут быть выбраны согласно тем же критериям, отмеченным выше, по отношению к композиции по изобретению для применения в профилактике или лечении аллергии на травы посредством толеризации. Варианты. Композиция или продукты по изобретению, таким образом, могут включать варианты любой изSEQ ID NO: 1-73. Вариант, как правило, включает 1, 2, 3 или более эпитопов для молекул МНС класса II,присутствующих в соответствующем пептиде SEQ ID NO: 1-73. В настоящем документе упомянуты функциональные варианты. Такой вариант может быть способен к толеризации индивидуума по отношению к эпитопу для молекулы МНС класса II, который присутствует в соответствующем пептиде SEQ ID NO: 1-59 и, таким образом, будет, как правило, включать последовательность, которая связывается с той же молекулой МНС класса II и/или которая распознается Тклеткой, которая распознает соответствующий эпитоп в полипептиде SEQ ID NO: 1-73. Последовательность, таким образом, способна к толеризации по отношению к соответствующей последовательности в нативном полипептиде. Вариант полипептида, таким образом, способен к толеризации по отношению к соответствующему нативному полипептиду. Варианты SEQ ID NO: 1-73 могут представлять собой фрагменты, полученные с помощью укорачивания, например, удаления одной или более аминокислот из N- и/или С-конца полипептида. Фрагменты могут также генерироваться с помощью одной или более внутренних делеций при условии, что 9 коровых аминокислот, которые составляют Т-клеточный эпитоп, по существу, не нарушаются. Например, вариант SEQ ID NO: 1 может включать фрагмент SEQ ID NO: 1, т.е. более короткую последовательность. Он может включать делецию одной, двух, трех или четырех аминокислот из Nконцевой области SEQ ID NO: 1 или из С-концевой области SEQ ID NO: 1. Такие делеции могут быть произведены на обоих концах SEQ ID NO: 1. Вариант SEQ ID NO: 1 может включать дополнительные аминокислоты (например, из последовательности родительского белка, из которого произошел пептид),-9 020792 удлиняющие конец(концы) SEQ ID NO: 1. Вариант может включать комбинацию делеций и вставок, обсуждаемых выше. Например, аминокислоты могут быть делетированы на одном конце SEQ ID NO: 1, но дополнительные аминокислоты из полноразмерной родительской белковой последовательности могут быть вставлены в другой конец SEQ ID NO: 1. Аналогичное обсуждение вариантов, рассмотренное выше, также применяется к SEQ ID NO: 2-73. Вариант пептида может включать одну или более аминокислотных замен из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1-73 или их фрагментов. Вариант пептида может включать последовательность, имеющую по меньшей мере 65% идентичность по последовательности с по меньшей мере 9 или более последовательно расположенными аминокислотами в любой из SEQ ID NO: 1-73. Более предпочтительно подходящий вариант может включать по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% аминокислотной идентичности с по меньшей мере 9 последовательно расположенными аминокислотами в любой из SEQ ID NO: 1-73. Этот уровень аминокислотной идентичности можно наблюдать в любой области пептида, хотя предпочтительно в коровом участке. Уровень аминокислотной идентичности составляет по меньшей мере около 9 последовательно расположенных аминокислот, но он может составлять по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15 или по меньшей мере 16 или 17 аминокислот в зависимости от размера сравниваемых пептидов. Соответственно, любой вышеописанный уровень идентичности может иметь место на протяжении всей длины последовательности. Примеры предпочтительных вариантов, выбранных на основе идентичности последовательности с особенно предпочтительными пептидами по изобретению, представляют собой следующее. Таким образом, SEQ ID NO: 74-90 представляют собой предпочтительные варианты, которые могут использоваться в качестве заместителей для вышеописанных нативных пептидов в композиции по изобретению. Другие рассматриваемые варианты нативных пептидов по изобретению получены из аллергенов маиса. Аллергены маиса имеют высокую гомологию с аллергенами пыльцы трав, и, таким образом,последовательности, полученные из маиса, могут содержать перекрестно-реактивные эпитопы для применения в толеризации по отношению к аллергии на пыльцу трав. По отношению к аминокислотным последовательностям "идентичность последовательности" обозначает последовательности, которые имеют установленные значения при оценке с использованием программы ClustalW (Thompson et al., 1994, выше) со следующими параметрами: параметры попарного выравнивания - метод: точный; матрица: РАМ, штраф на внесение делеции в выравнивание: 10,00; штраф на продолжение делеции: 0,10; параметры множественного выравнивания - матрица: РАМ; штраф на внесение делеции в выравнивание: 10,00; % идентичности для задержки: 30; штраф за конец делеции: on; расстояние, разделяющее делеции: 0; отрицательная матрица: no; штраф на продолжение делеции: 0,20; штраф за делецию специфичных остатков: on; штраф за делецию гидрофильного остатка: on; гидрофильные остатки: GPSNDQEKR. Подразумевается, что идентичность последовательности в конкретном остатке включает идентичные остатки, которые просто были модифицированы. Вариант пептида может включать 1, 2, 3, 4, 5 или более или до 10 аминокислотных замен в любой из SEQ ID NO: 1-73. Варианты замен предпочтительно включают замену одной или более аминокислот на такое же количество аминокислот, а также включают осуществление консервативных аминокислотных замен. Например, аминокислота может быть заменена на альтернативную аминокислоту, обладающую похожими свойствами, например на другую основную аминокислоту, другую кислую аминокислоту, другую нейтральную аминокислоту, другую заряженную аминокислоту, другую гидрофильную аминокислоту, другую гидрофобную аминокислоту, другую полярную аминокислоту, другую ароматическую аминокислоту или другую алифатическую аминокислоту. Некоторые свойства 20 основных аминокислот, которые могут использоваться для выбора подходящих заместителей, представлены ниже. Следующие варианты включают те, в которых в последовательности вместо природной аминокислоты появляется аминокислота, которая является ее структурным аналогом. Аминокислоты, используемые в последовательностях, также могут быть модифицированными, например, мечеными при условии,что это не окажет негативного воздействия на функцию пептида. Там, где пептид имеет последовательность, которая отличается от последовательности любой из SEQ ID NO: 1-73 или их фрагмента, замены могут встречаться на протяжении всей длины последовательности, внутри последовательности любой изSEQ ID NO: 1-73 или за пределами последовательности любой из SEQ ID NO: 1-73. Например, вариации,описанные в настоящем документе, такие как вставки, делеции, замены и модификации, могут встречаться внутри последовательности любой из SEQ ID NO: 1-73. Вариант пептида может включать или состоять из или по существу состоять из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 173, в которой произведены одна, две, три, четыре или более аминокислотных замен. Вариант пептида может включать фрагмент родительского белка, который по длине больше, чем любая из SEQ ID NO: 173. В этом воплощении вариации, описанные в настоящем документе, такие как замены и модификации,могут встречаться внутри и/или за пределами последовательности любой из SEQ ID NO: 1-73. Варианты пептидов по изобретению составляют по длине 9-30 аминокислот включительно. Предпочтительно они могут составлять по длине от 9 до 20 или более предпочтительно 13-17 аминокислот. Пептиды могут быть той же длины, что и пептидные последовательности в любой из SEQ ID NO: 1-73. Пептиды могут быть получены химическими методами из полипептида аллергена, например, с помощью протеолитического расщепления, или они могут быть получены виртуально из полипептида ал- 11020792 лергена, например, путем применения аминокислотной последовательности полипептида аллергена и путем синтеза пептидов на основе этой последовательности. Пептиды могут быть синтезированы с использованием методов, хорошо известных из уровня техники. Термин "пептид" включает не только молекулы, в которых аминокислотные остатки соединены с помощью пептидных связей (-CO-NH-), но и молекулы, в которых пептидная связь является обратной. Такие ретроинверсные пептидомиметики могут быть получены с использованием методов, известных из уровня техники, например, таких как те, что описаны у Meziere et al. (1997), J. Immunol. 159, 3230-3237. Этот способ включает получение псевдопептидов, содержащих изменения, в которые вовлечен остов, но не ориентация боковых цепей. Meziere et al. (1997) продемонстрировали, что эти псевдопептиды применяются, по меньшей мере, для молекул МНС класса II и реакций Т-хелперных клеток. Ретроинверсные пептиды, которые содержат связи NH-CO вместо пептидных связей CO-NH, гораздо более устойчивы к протеолизу. Аналогично, можно обойтись совсем без пептидной связи при условии, что используется подходящий линкерный компонент, который сохраняет пространство между атомами углерода аминокислотных остатков; особенно предпочтительно, если линкерный компонент имеет, по существу, такое же распределение заряда и, по существу, такую же плоскостность, как у пептидной связи. Также понятно, что пептид может блокироваться соответствующим образом на его N- или С-конце так, чтобы помочь уменьшить чувствительность к экзопротеолитическому расщеплению. Например, N-концевая аминогруппа пептидов может быть защищена путем реакции с карбоновой кислотой, и С-концевая карбоксильная группа пептида может быть защищена путем реакции с амином. Другие примеры модификаций включают гликозилирование и фосфорилирование. Другая потенциальная модификация состоит в том, что атомы водорода на аминогруппах боковой цепи R или K могут быть заменены на метиленовые группы (NH2-NH(Me) или -N(Me)2). Аналоги пептидов согласно изобретению также могут включать варианты пептидов, которые увеличивают или уменьшают период полужизни пептида in vivo. Примеры аналогов, способных к увеличению периода полужизни пептидов, используемых согласно изобретению, включают пептоидные аналоги пептидов, производные пептидов, содержащие D-аминокислоты, и гибриды пептид-пептоид. Следующее воплощение вариантов полипептидов, используемых согласно изобретению, включает формы полипептида, содержащие D-аминокислоты. Получение полипептидов с использованием D-аминокислот, а не Lаминокислот, существенно уменьшает любой нежелательный распад такого агента с помощью обычных метаболических процессов с уменьшением количества агента, который необходимо вводить наряду с уменьшением частоты его введения. Пептиды, предлагаемые настоящим изобретением, могут быть получены из вариантов сплайсинга родительских белков, кодируемых с помощью мРНК, генерированной с помощью альтернативного сплайсинга первичных транскриптов, кодирующих цепи родительских белков. Пептиды также могут быть получены из аминокислотных мутантов, вариантов гликозилирования и других ковалентных производных родительских белков, которые сохраняют, по меньшей мере, свойство аллергенов связываться с молекулами МНС. Типичные производные включают молекулы, где пептиды по изобретению являются ковалентно модифицированными с помощью химического, ферментативного или осуществленного другим подходящим способом замещения на компонент, отличный от природной аминокислоты. Кроме того, сюда включены природные варианты родительских белков, обнаруженных в различных клещах. Такие варианты могут кодироваться аллельным вариантом или представляют собой вариант альтернативного сплайсинга. Варианты, описанные выше, могут быть получены в процессе синтеза пептида или с помощью последующей модификации, или когда пептид имеется в рекомбинантном виде, с использованием известных методов сайт-направленного мутагенеза, случайного мутагенеза или ферментативного расщепления и/или лигирования нуклеиновых кислот. Согласно изобретению еще один или более пептидов, которые могут быть включены в композицию,предпочтительно представляют собой функциональные варианты любой из SEQ ID NO: 1-73, т.е. пептиды, предпочтительно способные индуцировать иммунный ответ. Конкретно они могут быть способны индуцировать позднюю фазу иммунного ответа у индивидуума с аллергией на травы. Это может быть протестировано с помощью способности пептида индуцировать Т-клеточную пролиферацию в образце Т-клеток. Методы тестирования индукции Т-клеточной пролиферации хорошо известны из уровня техники, и один из таких методов представлен в примере 4. Предпочтительно еще один или более пептидов способны вызывать Т-клеточную пролиферацию по меньшей мере в 20% образцов Т-клеток, где каждый образец получают от различных индивидуумов в популяции с аллергией на травы. Композиции по изобретению предпочтительно способны индуцировать Т-клеточную пролиферацию в 30% или более образцов Т-клеток, полученных из совокупности индивидуумов с аллергией на травы. Более предпочтительно композиции способны индуцировать Т-клеточную пролиферацию в 35% или более, 40% или более, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или в 90% или более образцов, полученных от сенсибилизированных индивидуумов из совокупности. Композиции также могут быть способны индуцировать значительное высвобождение одного или более цитокинов, предпочтительно включающих один или более из интерферона-гамма, интерлейкина 10 и интерлейкина-13, в образцах Т-клеток, полученных от сенсибилизированных индивидуумов из совокупности. "Значительное" высвобождение может определяться с помощью критериев, аналогичных тем, что описаны ниже в примере 5. Таким образом, композиции могут быть способны индуцировать высвобождение одного или более цитокинов в 35% или более, 40% или более, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85 или в 90% или более образцов, полученных от сенсибилизированных индивидуумов из совокупности. Количество индивидуумов в совокупности индивидуумов с аллергией на травы может быть любым количеством, выше, чем один, например, по меньшей мере 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 80 или по меньшей мере 100 индивидуумов. Предпочтительно, если пептиды вызывают Т-клеточную пролиферацию, но не приводят к высвобождению гистамина из базофилов препаратов тучных клеток, полученных от сенсибилизированных индивидуумов. Может происходить некоторое высвобождение гистамина, но предпочтительно композиция не вызывает высвобождения гистамина в значительных количествах. Можно предположить, что значительное высвобождение гистамина представляет собой высвобождение 20% или более от суммарного доступного лейкоцитарного гистамина, когда образец лейкоцитов от индивидуума стимулируют с помощью композиции in vitro. Здоровый индивидуум, как правило, имеет приблизительное содержание лейкоцитарного гистамина 150 нг/107 клеток. Подходящие варианты, способные к связыванию с TCR, могут быть получены эмпирически или могут быть выбраны соответственно известным критериям. Внутри одного пептида есть определенные остатки, которые способствуют связыванию внутри бороздки связывания с антигеном МНС, и другие остатки, которые взаимодействуют с гипервариабельными участками Т-клеточного рецептора (Allen et al.(1987), Nature 327: 713-5). Что касается остатков, способствующих взаимодействию с Т-клеточным рецептором, то был продемонстрирован механизм, который относится к зависимости Т-клеточной активации от замены данного остатка пептида. Используя пептиды, которые содержали один или более остатков контакта с Тклеточным рецептором, которые были заменены на другую аминокислоту, некоторые группы продемонстрировали сильные эффекты в отношении процесса Т-клеточной активации. EvavoldAllen (1991, Nature 252: 1308-10) продемонстрировали нарушение взаимосвязи Т-клеточной пролиферации и продуцирования цитокинов. В этой in vitro-модели клон Т-клетки, специфичный к остаткам 64-76 гемоглобина (в контексте I-Ek), сенсибилизировали с помощью аналога пептида, в котором была произведена консервативная замена аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту. Эта замена не препятствовала в значительной степени способности аналога связываться с I-Ek. После in vitro-сенсибилизации клона Т-клетки с помощью этого аналога не детектировали никакой пролиферации, хотя секреция IL-4 поддерживалась как способность клона помогать В-клеточному ответу. В следующем исследовании та же группа продемонстрировала разделение опосредованного Тклетками цитолиза и продуцирования цитокинов. В этом случае первый остается неизмененным, в то время как последний процесс ослабевает. Эффективность измененных пептидных лигандов in vivo исходно продемонстрировали McDevitt и сотр. (Smilek et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 96339637) на мышиной модели ЕАЕ (экспериментальный аллергический энцефаломиелит). В этой модели ЕАЕ индуцируют путем иммунизации с помощью энцефалитогенного пептида Ас 1-11 из МВР (основной миелиновый белок). В результате замены в положении четыре (лизин) на остаток аланина генерировали пептид, который хорошо связывался со своим ограничивающим элементом (AuAu), но который при этом не являлся иммуногенным в сенсибилизированном штамме PL/JxSJLF1 и который, кроме того, предотвращал возникновение ЕАЕ при введении или перед или после иммунизации с помощью энцефалитогенного пептида. Таким образом, остатки могут быть идентифицированы в пептидах, которые влияют на способность пептидов индуцировать различные функции Т-клеток. Предпочтительно пептиды могут быть сконструированы так, чтобы благоприятствовать Тклеточной пролиферации и индукции десенсибилизации. Metzler и Wraith продемонстрировали улучшенную толерогенную способность пептидов, в которых были произведены замены, увеличивающие аффинность пептида к молекулам МНС (MetzlerWraith (1993), Int. Immunol.: 1159-65). To, что измененный пептидный лиганд может вызывать продолжительную и глубокую толерантность в клонированных Т-клетках, было продемонстрировано у Sloan-Lancaster et al. (1993), Nature 363: 156-9. Композиции по изобретению могут быть способны индуцировать позднюю фазу реакции у индивидуума, т.е. могут сенсибилизировать к аллергенам. Термин "реакция поздней фазы" включает значение,представленное в Allergy and Allergic Diseases (1997), А.В. Kay (Ed.), Blackwell Science, p. 1113-1130. Реакция поздней фазы может представлять собой любую реакцию поздней фазы (LPR). Предпочтительно пептиды могут быть способны индуцировать позднюю астматическую реакцию (LAR) или позднюю ринитическую реакцию, или позднюю кожную реакцию, или позднюю глазную реакцию. Может или нет конкретный пептид вызывать LPR, может быть определено с использованием методов, хорошо известных из уровня техники; особенно предпочтительный метод описан в публикации Cromwell О., DurhamWeir D.M., Blackwell Scientific Publications, 1986. Таким образом, предпочтительно индивидуальные пептиды по изобретению способны индуцировать LPR у индивидуума, который сенсибилизирован к аллергенам. Сенсибилизирован ли индивидуум к аллергенам или нет, может быть определено с помощью хорошо известных процедур, таких как кожная скарификационная проба с использованием растворов экстрактов аллергенов, индукция кожных LPR,история болезни, сенсибилизация аллергеном и радиоаллергосорбентный тест (RAST) для измерения аллерген-специфичного IgE. Будет или нет ожидаться полезный эффект от лечения для индивидуума,может определить врач на основании, например, таких тестов. Десенсибилизация или толеризация индивидуума по отношению к аллергенам обозначает ингибирование или ослабевание аллергической реакции ткани, индуцированной аллергенами у соответствующе сенсибилизированных индивидуумов. Было продемонстрировано, что Т-клетки могут селективно активироваться и затем приходить в нечувствительное состояние. Кроме того, иммунологическая толерантность или исключение этих Т-клеток приводит к десенсибилизации пациента к конкретному аллергену. Десенсибилизация проявляется в виде уменьшения реакции на аллерген или на пептид, полученный на основе аллергена, или предпочтительно в виде исключения такого ответа при втором и следующих введениях аллергена или пептида, полученного на основе аллергена. Второе введение может быть осуществлено по прошествии подходящего интервала времени, чтобы дать десенсибилизации возможность проявиться; это предпочтительно любой интервал времени от одного дня до нескольких недель. Интервал около двух недель является предпочтительным. Хотя композиции по изобретению могут быть способны индуцировать LPR у индивидуума с аллергией на травы, следует понимать, что при использовании композиции для лечения пациента предпочтительно использование достаточно низкой концентрации композиции, так чтобы не проявлялась видимаяLPR, но реакция была бы достаточной для частичной десенсибилизации Т-клеток, так чтобы можно было вводить следующую дозу (предпочтительно, более высокую) и т.д. Таким образом, дозу наращивают до получения полной десенсибилизации, но часто без индукции какой-либо LPR у пациента. Хотя композиция или пептид способны к получению такого эффекта при более высоких концентрациях, чем вводимые. Композиции по изобретению могут быть способны к индукции реакции поздней фазы у 50% или более из совокупности индивидуумов в популяции с аллергией на травы. Более предпочтительно композиции способны индуцировать LPR у 55% или более, 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более или у 90% или более сенсибилизированных индивидуумов из совокупности. Способны или нет композиции индуцировать LPR у определенного процента субъектов из совокупности, можно определить с помощью методов, которые хорошо известны из уровня техники. Понятно, что пептиды по изобретению включают Т-клеточный эпитоп, который состоит из 9 коровых аминокислот, которые представляют собой минимальную необходимую последовательность, требуемую для связывания с молекулами МНС класса II. Однако пептиды также могут включать дополнительные остатки, фланкирующие коровые 9 аминокислот. Пептиды, таким образом, могут включать участок, содержащий Т-клеточный эпитоп, в котором некоторые остатки могут быть модифицированы без влияния на функцию эпитопа. Соответственно, функциональные варианты пептидов, определенные выше, включают пептиды, которые изменены для улучшения их растворимости относительно нативной последовательности пептидов. Улучшенная растворимость является предпочтительной для толеризации субъектов по отношению к аллергенам, из которых были получены пептиды по изобретению, так как введение субъектам плохо растворимых агентов вызывает нежелательные, не связанные с толеризацией воспалительные реакции. Растворимость пептидов может быть улучшена путем изменения остатков, которые фланкируют участок, содержащий Т-клеточный эпитоп. Пептид по изобретению может быть сконструирован так, чтобы он был более растворимым, так, что он включает:(i) в N-концевой области по отношению к остаткам пептида, который фланкирует Т-клеточный эпитоп: 1-6 последовательно расположенных аминокислот, соответствующих 2-6 последовательно расположенным аминокислотам в N-концевой области, непосредственно прилегающей к указанным остаткам в последовательности белка, из которого получен пептид; и/или(ii) в С-концевой области по отношению к остаткам пептида, который фланкирует Т-клеточный эпитоп: 1-6 последовательно расположенных аминокислот, соответствующих 1-6 последовательно расположенным аминокислотам в С-концевой области, непосредственно прилегающей к указанным остаткам в последовательности белка, из которого получен пептид; или(iii) и в N-, и в С-концевой области по отношению к остаткам пептида, которые фланкируют Тклеточный эпитоп, по меньшей мере одна аминокислота выбрана из аргинина, лизина, гистидина, глутамата и аспартата. Необязательно, пептиды могут быть дополнительно сконструированы так, чтобы быть более растворимыми, так что:(i) любые цистеиновые остатки в нативной последовательности пептида заменены на серин или на 2-аминомасляную кислоту; и/или(ii) делетированы любые гидрофобные остатки аминокислот, в количестве до трех, на N- или С- 14020792 конце нативной последовательности пептида, которые не включены в Т-клеточный эпитоп; и/или(iii) делетированы любые две последовательно расположенные аминокислоты, включающие последовательность Asp-Gly, в последовательности аминокислот, в количестве до четырех, на N- или С-конце нативной последовательности пептида, которые не включены в Т-клеточный эпитоп; и/или(iv) добавлены один или более положительно заряженных остатков на N- и/или С-конце. Примеры пептидов, сконструированных для улучшения растворимости, представляют собойRye09B и Tim07B, описанные в примере 8. Варианты с улучшенной растворимостью представлены в табл. 8. Таким образом, пептиды Rye 09B1 (SEQ ID NO: 91), KPEVKYAVFEAALTKAIT; Rye 09B2 (SEQ(SEQ ID NO: 94), KKIPAGELQIIDKIDAK представляют собой предпочтительные примеры вариантов с улучшенной растворимостью. Таким образом, SEQ ID NO: 91-94 могут предпочтительно применяться в качестве замен для вышеописанных нативных пептидов в композиции по изобретению. Нуклеиновые кислоты и векторы Индивидуальные пептиды, которые составляют композиции и продукты по изобретению, могут вводиться опосредованно с помощью экспрессии кодирующей последовательности. Например, может быть представлен полинуклеотид при условии, что он кодирует пептидную комбинацию по изобретению, такую как любая комбинация пептидов, описанных выше. Пептидная комбинация по изобретению,таким образом, может быть получена или доставлена в форме полинуклеотида, который ее кодирует и способен экспрессировать. Подразумевается, что любая ссылка в настоящем документе на применение,доставку или введение пептидной комбинации по изобретению включает косвенное применение, доставку или введение такой пептидной комбинации посредством экспрессии из полинуклеотида, который ее кодирует. Соответственно в изобретении предлагается композиция для применения в профилактике или лечении аллергии на травы посредством толеризации, включающая по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, которая при экспрессии вызывает продуцирование композиции, подходящей для применения в профилактике или лечении аллергии на травы посредством толеризации, как описано выше. В изобретении также предлагается продукт, включающий четыре или более различных полинуклеотида, кодирующих полипептиды a)-h) или их варианты, как описано выше; и где каждый отличный кодируемый полипептид предназначен для одновременного, отдельного или последовательного применения в профилактике или лечении аллергии на травы у людей. Термины "молекула нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотид" используются взаимозаменяемо в настоящем документе и обозначают полимерную форму нуклеотидов любой длины, или дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды, или их аналоги. Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают ген, фрагмент гена, матричную РНК (мРНК), кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, плазмиды,векторы, изолированную ДНК любой последовательности, изолированную РНК любой последовательности, зонды нуклеиновой кислоты и праймеры. Полинуклеотид по изобретению может быть представлен в изолированной или очищенной форме. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая "кодирует" выбранный полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется(в случае мРНК) в полипептид in vivo при ее помещении под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются старт-кодоном на 5'(амино)-конце и стоп-кодоном трансляции на 3' (карбокси)-конце. Для целей изобретения такие последовательности нуклеиновой кислоты могут включать, но без ограничения, кДНК из вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномных последовательностей из вирусной или прокариотической ДНК или РНК и даже синтетические ДНК-последовательности. Последовательность терминации транскрипции может быть расположена в 3'-направлении по отношению к кодирующей последовательности. Полинуклеотиды по изобретению могут быть синтезированы согласно методам, хорошо известным из уровня техники, как описано в качестве примера в Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press). Полинуклеотидные молекулы по настоящему изобретению могут быть представлены в форме экспрессирующей кассеты, которая включает контрольные последовательности, функционально связанные с вставленной последовательностью, давая, таким образом, возможность in vivo-экспрессии пептида по изобретению у целевого субъекта. Эти экспрессирующие кассеты, в свою очередь, как правило, представлены внутри векторов (например, плазмид или рекомбинантных вирусных векторов), которые подходят для использования в качестве реагентов для иммунизации нуклеиновыми кислотами. Такая экспрессирующая кассета может вводиться непосредственно хозяину. Альтернативно, хозяину может вводиться вектор, включающий полинуклеотид по изобретению. Предпочтительно полинуклеотид получают и/или вводят с использованием генетического вектора. Подходящий вектор может представлять собой любой вектор, который способен нести подходящее количество генетической информации и дающий возможность экспрессии пептида по изобретению. Таким образом, настоящее изобретение включает экспрессирующие векторы, которые включают такие полинуклеотидные последовательности. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается вектор для применения в профилактике или лечении аллергии на травы посредством толеризации, включающий четыре или более полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют различные полипептиды по изобретению, и необязательно включающий одну или более дополнительных полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют различные полипептиды, определенные в настоящем документе. Вектор может включать 4, 5, 6 или 7 полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют различные полипептиды по изобретению. Вектор предпочтительно включает первую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, выбранный из SEQ ID NO: 1-27, или его вариант, как описано выше, и вторую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, выбранный из SEQ ID NO: 28-73, или его вариант, как описано выше. Этот (первый) вектор может использоваться в комбинации с одним или более другими векторами, обеспечивающими кодирующие последовательности для различных полипептидов по изобретению, не кодируемых первым вектором. Кроме того, понятно, что композиции и продукты по изобретению могут включать смесь полипептидов и полинуклеотидов. Соответственно, в изобретении предлагается композиция или продукт, определенные в настоящем документе, где вместо любого из полипептидов присутствует полинуклеотид,способный экспрессировать указанный полипептид. Экспрессирующие векторы могут быть сконструированы с помощью стандартных методов молекулярной биологии и могут, например, включать использование плазмидной ДНК и соответствующих инициаторов, промоторов, энхансеров и других элементов, таких как сигналы полиаденилирования, которые могут быть необходимы, и которые расположены в правильной ориентации, чтобы была возможность экспрессии пептида по изобретению. Другие подходящие векторы будут очевидны специалистам в данной области. В качестве дополнительного примера в этой связи заявители делают ссылку на Sambrook etal. Таким образом, полипептид по изобретению может быть получен с помощью доставки такого вектора в клетку и с помощью возможного осуществления транскрипции из вектора. Предпочтительно полинуклеотид по изобретению в векторе функционально связан с контрольной последовательностью, которая способна обеспечивать экспрессию кодирующей последовательности клеткой-хозяином, т.е. вектор является экспрессирующим вектором."Функционально связанный" обозначает такое расположение элементов, где описанные таким образом компоненты структурированы так, чтобы осуществлялась их обычная функция. Таким образом, данная регуляторная последовательность, такая как промотор, функционально связанная с последовательностью нуклеиновой кислоты, способна влиять на экспрессию такой последовательности в присутствии соответствующих ферментов. Промотор необязательно должен располагаться последовательно по отношению к последовательности при условии, что он функционирует для управления ее экспрессии. Таким образом, например, между промоторной последовательностью и последовательностью нуклеиновой кислоты могут присутствовать промежуточные еще не транслированные транскрибируемые последовательности, и при этом промоторная последовательность все равно может рассматриваться как"функционально связанная" по отношению к кодирующей последовательности. Ряд экспрессирующих систем был описан и известен из уровня техники, каждая из которых, как правило, состоит из вектора, содержащего представляющие интерес ген или нуклеотидную последовательность, функционально связанные с последовательностями контроля экспрессии. Эти контрольные последовательности включают последовательности промотора транскрипции и последовательности старта и терминации транскрипции. Векторы по изобретению могут быть, например, плазмидными, вирусными или фаговыми векторами, обеспеченными последовательностью начала репликации, необязательно промотором для экспрессии указанного полинуклеотида и необязательно регулятором промотора."Плазмида" представляет собой вектор в форме экстрахромосомного генетического элемента. Векторы могут содержать один или более генов маркеров селекции, например, ген устойчивости к ампициллину в случае бактериальной плазмиды, или ген устойчивости для грибного вектора. Векторы могут использоваться in vitro, например, для продуцирования ДНК или РНК, или могут использоваться для трансфекции или трансформации клетки-хозяина, например клетки-хозяина млекопитающего. Векторы также могут быть адаптированы для использования in vivo, например, для возможности in vivo-экспрессии полипептида."Промотор" представляет собой нуклеотидную последовательность, которая инициирует или регулирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего полипептид. Промоторы могут включать индуцируемые промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанная с промотором, индуцируется с помощью аналита, кофактора, регуляторного белка и т.д.), ингибируемые промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, ингибируется с помощью аналита, кофактора, регуляторного белка и т.д.), и конститутивные промоторы. Подразумевается, что термины "промотор" или "контрольный элемент" включают полноразмерные промоторные участки и функциональные (например, контроли транскрипции или трансляции) сегменты этих участков. Полинуклеотид, экспрессирующая кассета или вектор согласно настоящему изобретению могут до- 16020792 полнительно включать последовательность сигнального пептида. Последовательность сигнального пептида, как правило, вставляют в область, функционально связанную с промотором, так чтобы сигнальный пептид экспрессировался и облегчал секрецию полипептида, кодируемого кодирующей последовательностью, которая также функционально связана с промотором. Как правило, последовательность сигнального пептида кодирует пептид длиной 10-30 аминокислот,например 15-20 аминокислот. Часто аминокислоты преимущественно гидрофобны. В типичной ситуации сигнальный пептид направляет растущую полипептидную цепь, несущую сигнальный пептид, к эндоплазматическому ретикулуму экспрессирующей клетки. Сигнальный пептид отщепляется в эндоплазматическом ретикулуме, давая возможность секреции полипептида через аппарат Гольджи. Таким образом,пептид по изобретению может быть доставлен индивидууму с помощью экспрессии из клеток в организме индивидуума и секреции из этих клеток. Альтернативно, полинуклеотиды по изобретению могут экспрессироваться подходящим образом так, чтобы была возможность презентации пептида по изобретению молекулой МНС класса II на поверхности антиген-презентирующей клетки. Например, полинуклеотид, экспрессирующая кассета или вектор по изобретению могут направляться к антиген-презентирующим клеткам, или экспрессия кодируемого пептида может предпочтительно стимулироваться или индуцироваться в таких клетках. В некоторых воплощениях полинуклеотид, экспрессирующая кассета или вектор будут кодировать адъювант, или адъювант может обеспечиваться иным способом. При использовании в настоящем документе термин "адъювант" обозначает любое вещество или композицию, способную специфично или неспецифично изменять, усиливать, направлять, менять направление, потенцировать или инициировать антиген-специфичный иммунный ответ. Представляющие интерес полинуклеотиды могут использоваться in vitro, ex vivo или in vivo при получении пептида по изобретению. Такие полинуклеотиды могут вводиться или использоваться в профилактике или лечении аллергии посредством толеризации. Методы доставки генов известны из уровня техники. См., например, патенты США 5399346,5580859 и 5589466. Молекула нуклеиновой кислоты может вводиться непосредственно субъектуреципиенту, как, например, с помощью стандартной внутримышечной или внутрикожной инъекции; с помощью трансдермальной системы доставки; ингаляции; с помощью местного, перорального, внутриносового или чресслизистого введения. Альтернативно, молекула может вводиться ex vivo в клетки, отбор которых производится у субъекта. Например, полинуклеотид, экспрессирующая кассета или вектор по изобретению может вводиться в АРС индивидуума ex vivo. Клетки, содержащие представляющую интерес молекулу нуклеиновой кислоты, повторно вводят субъекту так, что иммунный ответ против пептида, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты, может возрасти. Молекулы нуклеиновой кислоты,используемые в такой иммунизации, обозначают в настоящем документе как "вакцины нуклеиновых кислот". Полипептиды, полинуклеотиды, векторы или клетки по изобретению могут быть представлены, по существу, в изолированной форме. Они могут смешиваться с носителями или разбавителями, которые не мешают их назначенному применению и будут рассматриваться как, по существу, изолированные. Они могут также быть представлены, по существу, в очищенной форме, в этом случае они, как правило,включают по меньшей мере 90%, например по меньшей мере 95, 98 или 99%, белков, полинуклеотидов,клеток или сухой массы препарата. Антиген-презентирующие клетки (АРС). Изобретение охватывает применение in vitro способа получения популяции АРС, которые презентируют пептиды по изобретению на своей поверхности и которые могут затем использоваться в терапии. Такой способ может осуществляться ех vivo на образце клеток, которые были получены от пациента. АРС, полученные таким способом, образуют, таким образом, фармацевтический агент, который может использоваться в лечении или предотвращении аллергии на травы посредством толеризации. Клетки должны быть приняты иммунной системой индивидуума, так как они получены из образцов тканей индивидуума. Доставка клеток, которые были получены таким способом, индивидууму, из образцов которого они были исходно получены, образует, таким образом, терапевтическое воплощение изобретения. Составы и композиции. Пептиды, полинуклеотиды, векторы и клетки по изобретению могут быть предоставлены индивидууму или по отдельности или в комбинации. Каждая молекула или клетка по изобретению может быть предоставлена индивидууму в изолированной, по существу изолированной, очищенной или по существу очищенной форме. Например, пептид по изобретению может быть предоставлен индивидууму в форме,по существу, свободной от других пептидов. Альтернативно, четыре или более пептидов в композиции могут быть сконденсированы вместе с помощью химических методов с использованием стандартных реагентов пептидной конденсации с получением отдельного пептида, содержащего предпочтительные эпитопы. Такие пептиды необходимо проверить на предмет высвобождения гистамина базофилами для подтверждения отсутствия высвобождения гистамина, так же как для индивидуальных пептидов. В следующем воплощении четыре или более пептидов в композиции могут быть предоставлены в виде части отдельной пептидной цепи, т.е. могут быть получены с помощью рекомбинантных методов из кодирую- 17020792 щего полинуклеотида. Четыре или более пептидов могут быть сшиты последовательно друг за другом или альтернативно могут быть разделены с помощью подходящих линкеров. В то время как для пептидов, полинуклеотидов или композиций по изобретению возможно, чтобы они были представлены в необработанном виде, предпочтительно чтобы они были представлены в виде фармацевтических составов. Таким образом, согласно следующему аспекту изобретения в настоящем изобретении предлагается фармацевтический состав для профилактики или лечения аллергии на травы посредством толеризации, включающий композицию, вектор или продукт согласно изобретению вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями и, необязательно, с одним или более другими терапевтическими ингредиентами. Носитель(и) должен быть "приемлемым" в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не должен быть вредным для их реципиента. Как правило, носители для инъекции, а также конечный состав стерильны и апирогенны. Предпочтительно носитель или разбавитель представляет собой тиоглицерин. Состав композиции, включающей пептид, полинуклеотид или клетки по изобретению, может быть выполнен с использованием стандартных для фармацевтического состава химических процедур и методов, каждый из которых легкодоступен квалифицированному специалисту в данной области. Например, композиции, содержащие одну или более молекул или клеток по изобретению, могут быть объединены с одним или более фармацевтически приемлемыми наполнителями или носителями. Вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, рН-буферирующие вещества и тому подобные, могут присутствовать в наполнителе или носителе. Эти наполнители, носители и вспомогательные вещества, как правило, представляют собой фармацевтические агенты, которые не индуцируют иммунного ответа у индивидуума, получающего композицию, и которые могут вводиться без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые наполнители включают, но без ограничения, жидкости, такие как вода, физиологический раствор, полиэтиленгликоль, гиалуроновая кислота, глицерин, тиоглицерин и этанол. Фармацевтически приемлемые соли также могут быть сюда включены, например,соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Детальное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей, носителей и вспомогательных веществ доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991). Такие композиции можно получать, упаковывать или продавать в форме, подходящей для болюсного или продолжительного введения. Инъецируемые композиции можно получать, упаковывать или продавать в стандартной лекарственной форме, такой как ампулы или упаковки лекарственных средств для многократного приема, содержащие консервант. Композиции включают, но без ограничения, суспензии,растворы, эмульсии в носителях на основе масла или воды, пасты и имплантируемые составы с замедленным высвобождением или биодеградируемые составы. Такие композиции могут дополнительно содержать, один или более, дополнительных ингредиентов, включающих, но без ограничения, суспендирующий, стабилизирующий или диспергирующий агенты. В одном воплощении композиции для парентерального введения активный ингредиент предлагается в сухой форме (например, порошок или гранулы) для восстановления с помощью подходящего носителя (например, стерильной апирогенной воды) перед парентеральным введением восстановленной композиции. Фармацевтические композиции можно получать, упаковывать или продавать в форме стерильной инъецируемой водной или масляной суспензии или в форме раствора. Эти суспензия или раствор могут быть созданы согласно известному уровню техники и могут включать дополнительно к активному ингредиенту дополнительные ингредиенты, такие как диспергирующие агенты, увлажняющие агенты или суспендирующие агенты, описанные в настоящем документе. Такие стерильные инъецируемые составы могут быть получены с использованием нетоксичного парентерально-приемлемого разбавителя или растворителя, например, такого как вода или 1,3-бутандиол. Другие приемлемые разбавители и растворители включают, но без ограничения, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и жирные масла, такие как синтетические моно- или диглицериды. Другие применяемые композиции с парентеральным введением включают те, которые включают активный ингредиент в микрокристаллической форме, в липосомном препарате или в качестве компонента систем с биодеградируемым полимером. Композиции для замедленного высвобождения или имплантации могут включать фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы,такие как эмульсия, ионообменная смола, умеренно растворимый полимер или умеренно растворимая соль. Альтернативно, пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть инкапсулированы, адсорбированы или ассоциированы с твердыми носителями. Подходящие твердые носители включают те, которые получены из полиметил-метакрилатных полимеров, а также включают PLGмикрочастицы, полученные из поли(лактидов) и поли(лактид-ко-гликолидов). См., например, Jeffery etal. (1993), Pharm. Res. 10:362-368. Также могут использоваться другие твердые системы и полимеры, например полимеры, такие как полилизин, полиаргинин, полиорнитин, спермин, спермидин, а также конъюгаты этих молекул. Состав любого из пептидов, полинуклеотидов или клеток, упомянутых в настоящем документе, бу- 18020792 дет зависеть от факторов, таких как природа вещества и способ доставки. Любое такое вещество может вводиться в разнообразных лекарственных формах. Оно может вводиться перорально (например, в виде таблеток, лепешек, пастилок, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул),местно, парентерально, подкожно, путем ингаляции, внутривенно, внутримышечно, надчревно, чрескожно, интрадермально, подъязычно, внутрь носа, буккально или с помощью инфузионных методов. Вещество также может вводиться в виде суппозиториев. Врач способен определить требуемый путь введения для каждого конкретного индивидуума. Композиции или составы по изобретению будут включать подходящие концентрации каждого пептида/нуклеотида/клетки, которые являются эффективными и не вызывают побочных реакций. Как правило, концентрации каждого пептида в композиции будут находиться в диапазоне 0,03-200 нмоль/мл. Более предпочтительно в диапазоне 0,3-200, 3-180, 10-150, 5-200 или 30-120 нмоль/мл. Композиция или составы имеют чистоту выше чем 95% или 98%, или чистоту, составляющую по меньшей мере 99%. В одном аспекте изобретения адъювант может использоваться в комбинации с полипептидом/полинуклеотидами/клетками по изобретению. Адъювант предпочтительно вводят в количестве, которого достаточно для возрастания эффекта полипептида/полинуклеотидов/клеток по изобретению или наоборот. Адъювант или другой терапевтический агент может представлять собой агент, который потенцирует эффекты молекулы по изобретению. Например, другой агент может представлять собой иммуномодулирующую молекулу или адъювант, который усиливает реакцию пептида или клетки по изобретению. Таким образом, в одном воплощении пептиды, полинуклеотиды, клетки или композиции по изобретению применяются для терапии в комбинации с одним или более другими терапевтическими агентами. Агенты могут вводиться по отдельности, одновременно или последовательно. Они могут вводиться в составе одной или различных композиций. Соответственно, в способе по изобретению субъект также может подвергаться лечению с помощью дополнительного терапевтического агента. Таким образом, может быть создана композиция, которая включает молекулу и/или клетку по изобретению, а также другие терапевтические молекулы, одну или более. Композиция по изобретению альтернативно может использоваться одновременно, последовательно или по отдельности с терапевтическими композициями, одной или более, в виде части комбинированного лечения. Неограничивающие примеры адъювантов включают витамин D, рапамицин и глюкокортикоидные стероиды, такие как дексаметазон, флутиказон, будезонид, мометазон, беклометазон, гидрокортизон,кортизон ацетат, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон и триамцинолон. Предпочтительным глюкокортикоидом является дексаметазон. Терапевтические методы и индивидуумы, подвергаемые лечению. Настоящее изобретение относится к пептидам, полинуклеотидам, векторам и клеткам, которые способны к десенсибилизации или толеризации человеческих индивидуумов по отношению к аллергенам,описанным выше, и, таким образом, применяются в профилактике или лечении аллергии на травы. В изобретении предлагаются композиции, продукты, векторы и составы для применения в профилактике или лечении аллергии на травы посредством толеризации. Композиции по изобретению могут использоваться для уменьшения аллергических симптомов или для улучшения состояния индивидуума с аллергией. В изобретении также предлагается способ толеризации или десенсибилизации индивидуума с аллергией на травы, включающий введение или индивидуальное, или в комбинации полипептидов/полинуклеотидов/клеток по изобретению, как описано выше. Индивидуум, подвергаемый лечению, или тот, кому предоставляется композиция или состав по изобретению, предпочтительно является человеком. Понятно, что может быть известно, что индивидуум,подвергаемый лечению, сенсибилизирован к аллергенам, имеет риск сенсибилизации или у которого подозревают сенсибилизацию. Индивидуум может быть протестирован на сенсибилизацию с использованием методов, хорошо известных из уровня техники, как описано в настоящем документе. Альтернативно, индивидуум может иметь в семейном анамнезе аллергию на травы. Необязательно тестировать индивидуума на сенсибилизацию к травам, так как индивидуум может проявлять симптомы аллергии при воздействии трав. Под воздействием понимают, близость, например, к травянистому растению, или к веществу или продукту, полученному из травянистого растения, или к веществу или продукту, содержащему или включающему каждый из вышеуказанных элементов. Вещество или продукт, полученные из травянистого растения, как правило, представляют собой пыльцу трав. Под близостью понимают 10 м или менее, 5 м или менее, 2 м или менее, 1 м или менее, или 0 м от элементов, описанных выше. Симптомы аллергии могут включать зуд глаз, насморк, затруднение дыхания, покраснение кожи с зудом или сыпь. Индивидуум, подвергаемый лечению, может быть любого возраста. Однако предпочтительно индивидуум может принадлежать к возрастной группе от 1 до 90, от 5 до 60, от 10 до 40 или более предпочтительно от 18 до 35. Предпочтительно индивидуум, подвергаемый лечению, относится к популяции, которая имеет аллельную частоту для МНС в диапазоне, который характерен для европейской популяции. Эталонные аллельные частоты для 11 распространенных семейств DRB1-аллелей представлены в табл. А (данные из Эталонные частоты были получены с помощью анализа множества исследований, где сообщалось о частотах, и в виде количественных данных продемонстрированы средние значения. Таким образом,предпочтительно, если индивидуум, подвергаемый лечению, будет относиться к популяции, которая содержит эквивалентные аллельные частоты для МНС, как и эталонная популяция для аллелей, представленных в табл. А (как например, по меньшей мере для 1, 2, 3, 4, 5 или для всех аллелей), например, в интервалах этих количественных данных плюс или минус 1, 2, 3, 5, 10, 15 или 20%. Предпочтительно индивидуум относится к популяции, где аллельные частоты следующих DRB1 аллелей составляют: 4 - по меньшей мере 9%; 7 - по меньшей мере 10%; 11 - по меньшей мере 8%. Индивидуум может иметь аллергию на травы в течение по меньшей мере 2 недель, 1 месяца, 6 месяцев, 1 года или 5 лет. Индивидуум может страдать от сыпи, заложенности носа, выделений из носа и/или кашля, вызванных аллергией. Индивидууму могут вводиться или нет другие композиции/соединения, которые предназначены для лечения аллергии на травы. Индивидуум может проживать в географическом регионе, который имеет умеренный климат; и/или типичное рН почвы в диапазоне от примерно 3,5, 4 или 4,5 до примерно 5,5, 6, 7 или 8; и/или среднегодовые осадки не менее чем примерно 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 см в год и не более чем примерно 180, 250, 300, 400 или 500 см в год; и/или годовую минимальную температуру не менее чем примерно -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4 или 5 С; и/или годовую максимальную температуру не более чем примерно 35, примерно 30, примерно 29, примерно 28, примерно 27, примерно 26, примерно 25, примерно 24, примерно 23 или примерно 22 С; и/или располагается между широтами примерно 30 северной широты и примерно 30 южной. Индивидуум, как правило, страдает от аллергии на травы в конкретный сезон. Сезон, как правило,соответствует сезону цветения трав, который, как правило, приходится на лето, предпочтительно раннее лето (например, с мая по июнь в северном полушарии) или позднее лето (например, с августа по октябрь в северном полушарии). Индивидуум с аллергией на травы, как правило, имеет аллергию на пыльцу трав. Комбинированная иммунотерапия. Так как многие индивидуумы страдают аллергией или многим требуется десенсибилизация по отношению к нескольким полипептидным антигенам, в настоящем изобретении также предлагаются способы десенсибилизации индивидуумов, которые страдают аллергией ко множеству антигенов. "Толерантность", индуцированная у индивидуума по отношению к первому полипептидному антигену или аллергену, может создавать у индивидуума "толерогенные условия", где неподходящие иммунные реакции по отношению к другим антигенам могут подвергаться отрицательной регуляции с целью обеспечения толерантности по отношению к другим антигенам. Это открытие обозначает, что индивидуумы, страдающие аллергией ко множеству аллергенов, могут подвергаться лечению в течение гораздо меньшего периода времени и что индивидуумы с тяжелой формой аллергии к некоторым аллергенам (например, к арахису), но с более умеренной формой аллергии к другим аллергенам (например, к кошачьей перхоти) могут получить пользу от терапии, где устанавливается толерантность к более умеренному аллергену и затем эти толерогенные условия используются для обеспечения толерантности к другому, более сильному аллергену. Кроме того, индивидуумы, страдающие аутоиммунным расстройством, кто дополнительно сенсибилизирован (или иммунизирован другим способом) к другому антигену или аллергену, могут получить пользу от графика лечения, где сначала устанавливается толерантность к другому антигену или аллергену, и затем эти толерогенные условия используются для обеспечения толерантности к аутоантигену, ассоциированному с аутоиммунным расстройством. Таким образом, предлагается способ для десенсибилизации индивидуума с аллергией на травы по отношению к аллергену трав, как описано выше, и по отношению к одному или более дополнительным различным полипептидным антигенам. Способ включает в первой стадии введение индивидууму композиции/продукта/состава (первичной композиции) согласно изобретению, как описано в настоящем документе, и где введение осуществляют способом, достаточным для генерации состояния низкой отвечаемо- 20020792 сти по отношению к аллергену трав. После того как установлено состояние низкой отвечаемости по отношению к аллергену трав, или по меньшей мере после того как наблюдается сдвиг в сторону десенсибилизации, способ включает введение вторичной композиции, включающей второй отличный полипептидный антиген, к которому индивидуум должен быть сенсибилизирован. Введение вторичной композиции осуществляется таким способом, чтобы приобрести преимущество толерогенных условий, установленных с помощью применения первичной композиции, где теперь возможно установление толерантности ко второму отличному полипептидному антигену. Вторичную композицию вводят совместно или с первой первичной композицией или с более крупным фрагментом аллергена(ов) трав. Под термином"вводят совместно" понимают или одновременное, или параллельное введение, например, когда два компонента присутствуют в составе одной композиции или когда вводятся в составе отдельных композиций почти в одно и то же время, а также под этим термином понимают доставку полипептидных антигенов в отдельных композициях в различные моменты времени. Например, вторичная композиция может доставляться перед или после доставки первой композиции в то же самое или в другое место. Интервал времени между доставками может колебаться от примерно нескольких секунд и до примерно нескольких минут, нескольких часов или нескольких дней. Кроме того, могут применяться различные методы доставки. Классы подходящих аллергенов включают, но без ограничения, аллергены клещей домашней пыли,пыльцы, перхоти животных (особенно кошачьей перхоти), трав, плесени, домашней пыли, антибиотиков,яда жалящих насекомых и различные аллергены окружающей среды (включающие химические вещества и металлы), аллергены лекарственных средств и пищевые аллергены. Распространенные аллергены деревьев включают пыльцу от распространенных тополя, ясеня, березы, клена, дуба, вяза, гикори и кария пекана; распространенные аллергены растений включают аллергены из полыни, амброзии, подорожника ланцетолистного, щавеля и кипрея узколистного; аллергены от контакта с растениями включают аллергены из сумаха ядоносного, сумаха укореняющегося и из крапивы; распространенные аллергены трав включают аллергены райграса многолетнего, тимофеевки луговой, джонсоновой травы, бермудской травы, овсяницы и мятлика; распространенные аллергены также могут быть получены из плесеней грибов,таких как Alternaria, Fusarium, Hormodendrum, Aspergillus, Micropolyspora, Mucor и thermophilic actinomycetes; эпидермальные аллергены могут быть получены из домашней или органической пыли (как правило, грибного происхождения), или из животных источников, таких как перья и собачья перхоть; распространенные пищевые аллергены включают молоко и сыр (молочного происхождения), яйца, пшеницу,орехи (например, арахис), морепродукты (например, моллюски), аллергены гороха, фасоли и глютена; распространенные аллергены окружающей среды включают металлы (никель и золото), химические вещества (формальдегид, тринитрофенол и скипидар), латекс, резину, волокно (хлопок или шерсть), ткань,краску для волос, косметику, детергент и парфюмерию; распространенные аллергены лекарственных средств включают местные анестетики и салицилаты; аллергены антибиотиков включают пенициллин,тетрациклин и сульфонамид; и распространенные аллергены насекомых включают яд пчел, ос и муравьев, а также чешуйку тараканов. Особенно хорошо охарактеризованные аллергены включают, но без ограничения, основной кошачий аллерген Fel d 1, фосфолипазу А 2 (PLA) яда пчел (Akdis et al. (1996), J.Clin. Invest. 98:1676-1683), аллерген пыльцы березы Bet v 1 (Bauer et al. (1997), Clin. Exp. Immunol. 107:536-541) и мультиэпитопный рекомбинантный аллерген трав rKBG8.3 (Cao et al. (1997), Immunology 90:46-51). Особенно предпочтительные Т-клеточные эпитопы получены из аллергенов: белок Fel d 1 кошачьей перхоти; белки Der p 1, Der р 2 и Der р 7 клещей домашней пыли; белок amb a 1.1, а 1.2, а 1.3 или а 1.4 амброзии; белки Lol p 1 и Lol p 5 райграса; белки Phl р 1 и Phl p 5 тимофеевки; белок Cyn d 1 бермудской травы; белки Alternaria alternate Alt a 1, Alt a 2 и энолаза (Alt a 6); белки березы Bet v 1 и Р 14; белки прусаков Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 и Bla g 6; белок полыни Art v 1; белок солянки русской Sal k 1 и Sal k 2; белки арахиса Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, растительные профилины и белки липидного транспорта или человеческий лейкоцитарный антиген. Эти и другие подходящие аллергены коммерчески доступны и/или могут быть легко получены в виде экстрактов с помощью известных методов. Предпочтительно второй полипептидный аллерген представляет собой аллерген трав или фрагмент аллергена трав, более конкретно, аллерген трав или фрагмент аллергена трав, выбранный из списка последовательностей аллергенов трав, пронумерованных с помощью регистрационных номеров в базе данных (регистрационные номера NCBI Entrez), представленного ниже. NCBI представляет собой Национальный Центр Биотехнологической информации и является отделением Национального Института Здравоохранения США. Интернет-сайт NCBI, из которого может быть получен доступ к базе данных, этоwww.ncbi.nlm.nih.gov/. Последовательности аллергенов, пронумерованные с помощью регистрационных номеров базы данных. Методы доставки. После создания композиций по изобретению они могут быть доставлены субъекту in vivo с использованием большого разнообразия известных путей и методов. Например, композиция может предоставляться в виде раствора для инъекций, суспензии или эмульсии, которые вводятся посредством парентеральной, подкожной, эпидермальной, внутрикожной, внутримышечной, внутриартериальной, внутрибрюшинной, внутривенной инъекции с использованием подходящей иглы и шприца или с использованием безыгольной системы инъекции жидкости. Композиции также могут вводиться местно на ткань кожи или слизистой оболочки, как, например, назально, внутритрахейно, в кишечник, ректально или вагинально, или могут предоставляться с помощью высокодисперсного распыления, подходящего для введения в дыхательные пути или в легкие. Другие способы введения включают пероральное введение, введение с помощью суппозиториев, подъязычное введение и методы активной или пассивной чрескожной доставки. В случае введения пептида по изобретению предпочтительно вводить пептид в место организма,где он будет иметь способность контактировать с подходящими антиген-презентирующими клетками и где он или они будут иметь возможность контактировать с Т-клетками индивидуума. В случае необходимости введения АРС, предпочтительно их вводить в место организма, где они будут иметь возможность контактирования с подходящими Т-клетками индивидуума и их активации. Режимы доставки. Введение пептидов/полинуклеотидов/клеток (таких как композиция, содержащая множество пептидов) может осуществляться с помощью любого подходящего метода, описанного выше. Подходящие количества пептида могут определяться эмпирически, но, как правило, находятся в диапазоне, приведенном ниже. Однократного введения каждого пептида может быть достаточно для получения полезного эффекта для пациента, но при этом понятно, что может быть полезным, если пептид вводится более чем один раз, в этом случае типичные режимы введения будут, например, такими: один или два раза в неделю в течение 2-4 недель каждые 6 месяцев, или один раз в день в течение недели каждые четыре-шесть месяцев. Понятно, что каждый пептид или полинуклеотид или комбинация пептидов и/или полинуклеотидов может вводиться пациенту однократно или в комбинации. Дозировки для введения будут зависеть от ряда факторов, включающих природу композиции, путь введения и схему и хронометраж графика введения. Подходящие дозы молекулы по изобретению могут иметь порядок до 15, до 20, до 25, до 30, до 50, до 100, до 500 мкг или более на одно введение. Подходящие дозы могут составлять менее чем 15 мкг, но по меньшей мере 1 нг, или по меньшей мере 2 нг, или по меньшей мере 5 нг, или по меньшей мере 50 нг, или по меньшей мере 100 нг, или по меньшей мере 500 нг, или по меньшей мере 1 мкг, или по меньшей мере 10 мкг. Для некоторых молекул по изобретению используемая доза может быть выше, например, может достигать до 1, до 2, до 3, до 4, до 5 мг или выше. Такие дозы могут быть представлены в жидком составе в концентрации, подходящей для введения в подходящем объеме с помощью выбранного пути введения. Наборы реагентов. Изобретение также относится к комбинации компонентов, описанных в настоящем документе, подходящих для применения в лечении по изобретению, и которые упакованы в форме набора реагентов в упаковку. Такие наборы реагентов могут включать наборы компонентов для возможности лечения согласно изобретению. Например, набор реагентов может включать один или более различных пептидов,полинуклеотидов и/или клеток по изобретению, или один или более пептидов, полинуклеотидов или клеток по изобретению и один или более дополнительных терапевтических агентов, подходящих для одновременного, последовательного или отдельного введения. Набор реагентов необязательно может содержать другие подходящие реагенты или инструкции и тому подобное. Изобретение иллюстрируется с помощью следующих примеров. Пример 1. Поиск на предмет связывания с молекулами МНС класса II. Целью данного исследования была идентификация четкой панели пептидов, имеющих сильную аффинность по отношению к восьми наиболее распространенным человеческим аллотипам МНС классаII HLA-DRB1. С целью идентификации связывающихся пептидов среди основных аллергенов трав RyeLol p 1, Rye Lol p Va, р Vb, р 5 а и р 5b, Bermuda Cyn d 1 и Timothy Phl p 5, применяли компьютерный метод, известный как "peptide threading", с использованием коммерчески доступного алгоритма EpiMatrix(EpiVax Inc.). Это биоинформативный анализ пептидной последовательности на предмет ее потенциала приспособления внутри бороздки связывания молекул МНС класса II, HLA-DR. EpiMatrix это алгоритм на основе матриц, который упорядочивает сегменты длиной 9 аминокислот, с перекрыванием 8 аминокислот, из любой пептидной последовательности, с помощью оценки вероятности связывания с каждой из выбранных молекул МНС (De Groot et al., AIDS Research and Human Retroviruses 13:539-41 (1997. Процедура разработки матричных мотивов опубликована в публикации Schafer et al., 16 Vaccine 1998(1998). В этом примере оценивали потенциал связывания для HLA DR1, DR3, DR4, DR7, DR8, DR11,DR13 и DR15. Предполагаемые МНС-лиганды выбирают путем оценки каждой 9-мерной рамки в белковой последовательности. Эту оценку получают путем сравнения последовательности 9-мера с матрицей аминокислотных последовательностей, которые, как известно, связываются с каждым аллелем МНС. Ретроспективные исследования продемонстрировали, что EpiMatrix точно предсказывает опубликованные МНС-лиганды (Jesdale et al., in Vaccines '97 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1997. Также было подтверждено успешное предсказание пептидов, которые связываются со множеством молекул МНС. Оценка вероятности связывания с выбранной молекулой МНС рассчитывается с помощью алгоритма EpiMatrix, как указано далее. Пептиды оценивали путем определения относительного стимулирования или ингибирования связывания для каждой аминокислоты по сравнению с известными партнерами по связыванию с МНС для данного аллеля МНС. Эту информацию суммировали для всего пептида и осуществляли суммарную оценку (балльная оценка ЕМХ) для полной последовательности пептида. После сравнения балльной оценки ЕМХ с балльными оценками известных МНС-лигандов с помощью EpiMatrix получили "оценку вероятности связывания" (сокращенно ЕВР, но не точная вероятность). ЕВР описывает долю пептидов с помощью балльных оценок EpiMatrix как высокую или выше, чем доля тех, которые связываются с данной молекулой МНС. EBP колеблется от 100% (высокая вероятность связывания) до менее чем 1% (очень низкая вероятность связывания). Полипептидные последовательности, анализированные с помощью EpiMatrix, представлены в табл. 1. На основе результатов анализа EpiMatrix этих последовательностей идентифицировали коровые пептиды, которые, как было предсказано, обладают приемлемыми свойствами связывания с молекулами МНС. Выбранные пептиды представлены в табл. 2. Пептиды, выделенные серым и отмеченные , это пептиды, которые не выбирали. Они соответствуют исходным последовательностям, анализированным с помощью EpiMatrix, из которых затем были получены выбранные пептиды. Например, Ber01 получают из Ber01 ori. Таблица 2 Пептиды группы 1Cyn = бермудская трава. Любые пептиды, указанные выше, которые содержат N-концевой остаток в виде глутамата (Е) или глутамина (Q), например, Rye08A могут иметь замещение этого остатка на пироглутамат для улучшения стабильности при производстве и без влияния на функцию пептидов. Данные, полученные из дальнейшего тестирования этих пептидов, как правило, получают с использованием пептидов, где имеет место такая замена. Дальнейший анализ EpiMatrix осуществляли на полноразмерных последовательностях трех известных последовательностей белков тимофеевки луговой: Timothy Grass Phl p 1 (NCBI регистрационный 1N10A), Timothy Grass Phl p Va (NCBI регистрационныйQ40962) и Timothy Grass Phl p Vb (регистрационныйQ40963). С помощью этого анализа идентифицировали дополнительные коровые пептиды (и их фланкирующие последовательности), которые, как было предсказано, обладают приемлемым связыванием с молекулами МНС класса-II. Эти последовательности представлены ниже в табл. 3 А-С. В каждой таблице: "Остатки в основной последовательности" соответствуют положению пептида внутри последовательностей, которые анализировали. Коровый пептид (подчеркнутые средние аминокислоты, выделенные жирным шрифтом) определяет фактическую последовательность связывания, которую идентифицировали во время анализа. Стабилизирующие концы (N-конец и С-конец, не выделены жирным шрифтом) были включены для использования вместе с коровой последовательностью, и, как правило,требуются для содействия в получении пептидов. "Количество совпадений" обозначает количество высоковероятных аффинностей связывания, тестированных внутри последовательности, для всех типов МНС. "Кластерная балльная оценка EpiMatrix" получена из количества совпадений, нормализованного по длине кластера. Кластерная балльная оценка, таким образом, представляет собой избыток или дефи- 26020792 цит свойств связывания с молекулами МНС у предсказанных агрегатов по отношению к случайному пептидному стандарту. Балльная оценка выше 10 рассматривается как указание на ярко выраженные свойства связывания с молекулами МНС. Таблица 3 Пример 2. Поиск гомологии. Последовательности каждого из пептидов, идентифицированные выше как последовательности связывания с молекулами МНС класса II, использовали для зондирования последовательности альтернативных белков в группе аллергенов трав, из которой была получена родительская последовательность. Например, пептид Rye01 произошел из Lol p 1, таким образом, последовательность Rye01 использовали для зондирования консервативных последовательностей в группе 1 из других видов трав, особенно из тимофеевки луговой. Результаты этого анализа представлены ниже для указанных остатков Rye Lol p 1 по сравнению с соответствующими последовательностями из Timothy Phl p 1 и Bermuda Cyn d 1: Аналогично, ниже представлены результаты для указанных остатков Rye Lol p 5 по сравнению с соответствующими последовательностями из указанных вариантов Timothy Phl p 5: На основе последовательностей из белков тимофеевки луговой, которые высококонсервативны по отношению к последовательностям райграса многолетнего, выбранным в примере 1, были предсказаны дополнительные последовательности, обладающие приемлемыми свойствами связывания с молекуламиMHC. Эти дополнительные пептиды представлены в табл. 4.In vitro-анализ связывания. Пептиды, идентифицированные в качестве потенциальных партнеров по связыванию с молекулами МНС класса II, предварительно тестировали на растворимость в водной и кислой среде, а также пептиды тестировали с помощью in vitro-анализ связывания с молекулами МНС класса II. Методы. Применяемый анализ представляет собой конкурентный анализ связывания с молекулами МНС класса II, где каждый пептид анализируют на его способность заменять известный контрольный партнер по связыванию из каждого из исследуемых аллотипов МНС класса II человека. Аллотипы и контрольные пептиды, использованные в данном исследовании, как правило, те, что представлены ниже: Контрольные пептиды, использованные в in vitro-анализах связывания. Каждый из пептидов из табл. 2-4 (за исключением тех, что отмечены ) анализировали в конкурентном анализе и тестировали на предмет относительного связывания по сравнению с контрольными пептидами. Благодаря природе конкурентного анализа данные для каждого пептида определяют как соотношение его собственной IC50 к соответствующему значению для контрольного пептида. Таким образом, пептид, который имеет значение IC50, которое равно соответствующему значению для контрольного пептида, обладает идентичной аффинностью связывания, в то время как пептиды с соотношением менее единицы обладают более высокой аффинностью связывания и пептиды с соотношением выше единицы,обладают меньшей аффинностью связывания. Растворимость в водном растворе является существенным критерием для того, чтобы пептид был эффективным терапевтическим агентом. Поэтому после тестирования на растворимость исключали очень гидрофобные пептиды с высокой частотой встречаемости крупных гидрофобных аминокислотных остатков во множестве участков связывания. Это характеризует случайных партнеров по связыванию сHLA-DRB1. Идентифицировали пептиды, которые связываются с одним или более из аллотипов МНС класса II. Ожидается, что такие пептиды будут обладать способностью связывания с похожими аллотипами, которые не тестировали на гомологию МНС-структур. Пример 4. Следующий метод применяют к тем же пептидам, что и в примере 3. Анализ пролиферации клеток. Анализ пролиферации клеток осуществляли на клетках РВМС (140106 клеток требовалось для тестирования всех параметров). Пролиферацию измеряли с помощью включения радиоактивно меченного соединения 3 Н-тимидина. Более подробно, 100 мкл антигена или пептида соответствующей концентрации распределяли в соответствующие лунки 96-луночного планшета. Планшеты затем помещали в инку- 29