Отдельные вариабельные домены антител против сывороточного альбумина

ОТДЕЛЬНЫЕ ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ АНТИТЕЛ ПРОТИВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА Согласно изобретению предложен лиганд с двойной специфичностью, содержащий первый вариабельный домен иммуноглобулина, обладающий первой специфичностью связывания, и комплементарный или некомплементарный вариабельный домен иммуноглобулина, обладающий второй специфичностью связывания. Родственные заявки Заявка на данный патент является частичным продолжением заявки на патент США 11/023959,поданной 28 декабря 2004 г., которая является продолжением международной заявки на патентPCT/GB2003/002804, поданной 30 июня 2003 г., которая заявляет приоритет PCT/GB02/03014, поданной 28 июня 2002 г., и заявки на патент Великобритании GB 0230202.4, поданной 27 декабря 2002 г., содержание которых включено сюда посредством ссылки. Заявка на данный патент также является частичным продолжением WO 2005118642, поданной 31 мая 2005 г., которая заявляет приоритет US 60/576271, поданной 1 июня 2004 г., и US 60/632361, поданной 2 декабря 2004 г., содержание которых включено сюда посредством ссылки. Заявка также заявляет приоритет US 11/704832, поданной 8 февраля 2007 г. Настоящее изобретение относится к лигандам с двойной специфичностью. В частности, согласно изобретению предложен способ получения лигандов с двойной специфичностью, содержащих первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, связывающий первый антиген или эпитоп, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, связывающий второй антиген или эпитоп. Более конкретно, изобретение относится к лигандам с двойной специфичностью, где связывание по меньшей мере с одним из первого или второго антигенов или эпитопов увеличивает период полувыведения лиганда invivo. Описаны лиганды с открытой и закрытой конформацией, включающие более чем одну специфичность связывания. Введение Антигенсвязывающий домен антитела содержит две отдельные области: вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL, который может представлять собой либо V, либоV). Собственно антигенсвязывающая область образована шестью полипептидными петлями: три из домена VH (H1, H2 и H3) и три из домена VL (L1, L2 и L3). Разнородный первичный репертуар генов вариабельных доменов (V-генов), кодирующих домены VH и VL, образован комбинационной перестройкой сегментов генов. Ген VH образован рекомбинацией трех сегментов генов, VH, D и JH. У людей существует приблизительно 51 функциональный сегмент VH (Cook and Tomlinson (1995), Immunol Today, 16: 237), 25 функциональных сегментов D (Corbett et al. (1997), J. Mol. Biol., 268: 69) и 6 функциональных сегментовJH (Ravetch et al. (1981), Cell, 27: 583), в зависимости от гаплотипа. Сегмент VH кодирует область полипептидной цепи, образующую первую и вторую антигенсвязывающие петли домена VH (Н 1 и Н 2), в то время как третья антигенсвязывающая петля домена VH (H3) образована комбинацией сегментов VH, D иJH. Ген VL образован рекомбинацией только двух сегментов генов, VL и JL. У людей существует приблизительно 40 функциональных сегментов V (Schble and Zachau (1993), Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001), 31 функциональный сегмент V (Williams et al. (1996), J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al. (1997),Genome Res., 7: 250), 5 функциональных сегментов J (Hieter et al. (1982), J. Biol. Chem., 257: 1516) и 4 функциональных сегмента J (Vasicek and Leder (1990), J. Exp. Med., 172: 609), в зависимости от гаплотипа. Сегмент VL кодирует область полипептидной цепи, образующую первую и вторую антигенсвязывающие петли домена VL (L1 и L2), в то время как третья антигенсвязывающая петля домена VL (L3) образована комбинацией сегментов VL и JL. Полагают, что антитела, выбранные из этого первичного репертуара, обладают достаточным разнообразием для связывания почти всех антигенов, по меньшей мере,с умеренной аффинностью. Высокоаффинные антитела образуются при "созревании аффинности" перестроенных генов, в которых появляются точковые мутации, и в иммунной системе происходит их селекция на основании улучшенного связывания. Анализ структур и последовательностей антител показал, что пять из шести антигенсвязывающих петель (Н 1, Н 2, L1, L2, L3) обладают ограниченным числом конформаций главной цепи или канонических структур (Chothia and Lesk (1987), J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989), Nature, 342: 877). Конформаций главной цепи определяются (1) длиной антигенсвязывающей петли и (2) определенными остатками или типами остатков в определенных ключевых положениях антигенсвязывающей петли и каркасной области антитела. Анализ длин петель и ключевых остатков позволил авторам изобретения предсказать конформации главной цепи Н 1, Н 2, L1, L2 и L3, кодируемые большинством последовательностей человеческих антител (Chothia et al. (1992), J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995), EMBOJ., 14: 4628; Williams et al. (1996), J. Mol. Biol., 264: 220). Хотя область H3 значительно более разнообразна в отношении последовательности, длины и структуры (благодаря использованию сегментов D), она также образует ограниченное число конформаций главной цепи для петель короткой длины, что зависит от длины и присутствия определенных остатков, типов остатков в ключевых положениях петли и каркасной области антитела (Martin et al. (1996), J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996), FEBS Letters, 399: 1). Биспецифичные антитела, содержащие комплементарные пары областей VH и VL, известны в данной области техники. Эти биспецифичные антитела должны содержать две пары VH и VL, из которых каждая пара VH/VL связывает один антиген или эпитоп. Описанные способы включают гибридные гибридомы (MilsteinCuello AC, Nature 305:537-40), мини-тела (Hu et al. (1996), Cancer Res 56:3055-3061),диатела (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448; WO 94/13804), хелатообразующие рекомбинантные антитела (CRAbs; Neri et al. (1995), J. Mol. Biol. 246, 367-373), biscFv (например, Atwellet al. (1996), Mol. Immunol. 33, 1301-1312), антитела, стабилизированные по механизму "knobs in holes"("выступы в углубления") (Carter et al. (1997), Protein Sci. 6, 781-788). В каждом случае каждый вид антитела содержит две антигенсвязывающие области, каждая из которых образована комплементарной парой доменов VH и VL. Каждое антитело, таким образом, способно связывать два различных антигена или эпитопа одновременно, причем связывание каждого антигена или эпитопа опосредовано VH и комплементарным ему доменом VL. Каждая из этих методик обладает определенными недостатками; например, в случае гибридных гибридом неактивные пары VH/VL могут значительно уменьшать фракцию биспецифичных IgG. Более того, большая часть способов получения биспецифичных антител основана на объединении различных пар VH/VL или объединении цепей VH и VL для реконструкции двух различных связывающих областей VH/VL. Следовательно, соотношение связывающих областей для каждого антигена или эпитопа в объединенной молекуле невозможно проконтролировать, и, таким образом, многие из объединенных молекул будут связывать только один антиген или эпитоп. В некоторых случаях было возможным конструировать тяжелые или легкие цепи на границах субъединиц (Carter et al., 1997) с целью увеличения числа молекул, имеющих связывающие области для обоих антигенов или эпитопов, но это никогда не приводит к тому, что все молекулы обладают связыванием с обоими антигенами или эпитопами. Существуют некоторые данные о том, что две различные специфичности связывания антител могут быть включены в одну и ту же связывающую область, но это обычно относится к двум или более специфичностям, соответствующим структурно родственным антигенам или эпитопам, или к антителам, обладающим широкой перекрестной реактивностью. Например, были описаны перекрестно реактивные антитела, где два антигена обычно являются родственными по последовательности и структуре, как, например, лизоцим белка куриного яйца и лизоцим индейки (McCafferty et al., WO 92/01047), или к свободному гаптену и гаптену, конъюгированному с носителем (Griffiths A.D. et al. EMBO J. 1994 13:14 3245-60). В другом примере в WO 02/02773 (Abbott Laboratories) описаны молекулы антител с "двойной специфичностью". Названные молекулы антител представляют собой антитела, выработанные или выбранные против нескольких антигенов таким образом, что их специфичность охватывает более чем один антиген. Каждая комплементарная пара VH/VL в антителах по WO 02/02773 характеризует одну специфичность связывания в отношении двух или более структурно родственных антигенов; домены VH и VL таких комплементарных пар не обладают отдельной специфичностью. Антитела, таким образом, имеют одну широкую специфичность, охватывающую два антигена, являющиеся структурно родственными. Кроме того, были описаны природные аутоантитела, являющиеся полиреактивными (CasaliNotkins, Ann. Rev.Immunol. 7, 515-531), взаимодействующие с по меньшей мере двумя (обычно более) различными антигенами или эпитопами, не являющимися структурно родственными. Также было показано, что селекции случайных пептидных репертуаров с применением технологии фагового дисплея на моноклональное антитело идентифицирует ряд пептидных последовательностей, соответствующих антигенсвязывающей области. Некоторые из последовательностей являются высокородственными, соответствуя консенсусной последовательности, в то время как другие сильно различаются и были названы мимотопами (LaneStephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271). Таким образом, ясно, что природное четырехцепочечное антитело, содержащее связанные и комплементарные домены VH и VL, обладает потенциалом связывания со многими различными антигенами из обширной совокупности известных антигенов. Менее понятно, как создать связывающую область для двух данных антигенов в одном и том же антителе, особенно таких антигенов, которые не обязательно являются структурно родственными. Были предложены способы конструирования белков, имеющие к этому отношение. Например, было также предложено, что может быть создано каталитическое антитело со связывающей активностью в отношении иона металла через один вариабельный домен и в отношении гаптена (субстрата) через контакты с ионом металла и комплементарный вариабельный домен (Barbas et al. 1993, Proc. Natl. Acad. SciUSA 90, 6385-6389). Тем не менее, в этом случае предлагают, что связывание и катализ субстрата (первого антигена) требует связывания иона металла (второго антигена). Таким образом, связывание с паройVH/VL относится к одному, но многокомпонентному антигену. Были описаны способы получения биспецифичных антител из отдельных доменов тяжелых цепей антител верблюда, где связывающие контакты для одного антигена создают в одном вариабельном домене, а для второго антигена - в другом вариабельном домене. Тем не менее, вариабельные домены не были комплементарны. Таким образом, первый вариабельный домен тяжелой цепи выбирают против первого антигена, а второй вариабельный домен тяжелой цепи - против второго антигена, затем оба домена связывают друг с другом на одной цепи с образованием фрагмента биспецифичного антитела (Conrath et al.,J. Biol. Chem. 270, 27589-27594). Тем не менее, верблюжьи отдельные домены тяжелой цепи необычны в том смысле, что они имеют происхождение от природных верблюжьих антител, у которых нет легких цепей, и в действительности отдельные домены тяжелой цепи неспособны к объединению с верблюжьими легкими цепями с образованием комплементарных пар VH и VL. Также были описаны отдельные вариабельные домены тяжелой цепи, которые обычно объединены с легкими цепями, имеющие происхождение от природных антител (из моноклональных антител или из репертуаров доменов; см. ЕР-А-0368684). Было показано, что эти вариабельные домены тяжелой цепи специфично взаимодействуют с одним или более родственными антигенами, но их не комбинировали с другими вариабельными доменами тяжелой или легкой цепи для образования лиганда со специфичностью в отношении двух или более антигенов. Кроме того, было показано, что эти отдельные домены имеют очень короткий период полувыведения in vivo. Таким образом, такие домены имеют ограниченную терапевтическую ценность. Было предложено получение биспецифичных фрагментов антител связыванием вместе вариабельных доменов тяжелой цепи с разной специфичностью (как описано выше). Недостатком этого способа является то, что выделенные вариабельные домены антител могут иметь гидрофобную внутреннюю поверхность, которая обычно взаимодействует с легкой цепью, обычно контактирует с растворителем и может быть "липкой", позволяя отдельному домену связывать гидрофобные поверхности. Кроме того, в отсутствие легкой цепи-партнера комбинация двух или более различных вариабельных доменов тяжелой цепи и их объединение, возможно, через их гидрофобные внутренние поверхности, может предотвратить их связывание с одним лигандом, если не с обоими лигандами, которые они способны связывать по отдельности. Более того, в этом случае вариабельные домены тяжелой цепи могут объединяться с комплементарными вариабельными доменами легкой цепи и, таким образом, могут быть менее стабильны и легко подвержены анфолдингу (WornPluckthun, 1998, Biochemistry 37, 13120-7). Краткое изложение сущности изобретения Авторы настоящего изобретения описали в их находящейся в процессе одновременного рассмотрения международной заявке на патент WO 03/002609, а также в находящейся в процессе одновременного рассмотрения неопубликованной заявке на патент Великобритании 0230203.2, иммуноглобулиновые лиганды с двойной специфичностью, содержащие отдельные вариабельные домены иммуноглобулинов,специфичность которых различна. Домены могут действовать конкурентно в отношении друг друга или независимо со связыванием антигенов или эпитопов на молекулах-мишенях. В первой форме согласно настоящему изобретению предложено дополнительное усовершенствование лигандов с двойной специфичностью, разработанных авторами настоящего изобретения, где одну специфичность лиганда направляют на белок или полипептид, присутствующий в организме in vivo, связывание с которым может увеличивать период полувыведения лиганда. Соответственно, в первом аспекте предложен лиганд с двойной специфичностью, содержащий первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий специфичность связывания в отношении первого антигена или эпитопа, и второй комплементарный отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий связывающую активность в отношении второго антигена или эпитопа, где один или оба указанных антигена или эпитопа действуют для увеличения период полувыведения лиганда invivo и где в указанных первом и втором доменах нет взаимно комплементарных доменов с той же специфичностью, при условии, что указанный лиганд с войной специфичностью не состоит из домена VH против HSA и домена V против -галактозидазы. Предпочтительно ни один из первого или второго вариабельных доменов не связывает человеческий сывороточный альбумин (HSA). Антигены или эпитопы, увеличивающие период полувыведения лиганда, как описано здесь, преимущественно присутствуют на белках или полипептидах, обнаруживаемых в организме in vivo. Примеры включают белки внеклеточного матрикса, белки крови и белки, присутствующие в различных тканях в организме. Белки снижают скорость клиренса лиганда из крови, например, действуя как наполнители,или фиксируя лиганд к желаемому месту действия. Примеры антигенов/эпитопов, действующих для увеличения периода полувыведения in vivo, даны в приложении 1 ниже. Увеличенный период полувыведения полезен при in vivo применениях иммуноглобулинов, конкретно антител и наиболее конкретно фрагментов антител малого размера. Такие фрагменты (Fv, связанные дисульфидными связями Fv, Fab, scFv, доменные антитела (dAb подвержены быстрому удалению из организма; таким образом, в то время как они способны быстро достигать большинства частей тела,их производство занимает незначительное время и они более просты в использовании, их применения invivo были ограничены лишь их коротким сохранением in vivo. Согласно изобретению эту проблему решают, обеспечивая увеличенный период полувыведения лигандов in vivo и, вследствие этого, более длительное время сохранения функциональной активности лиганда в организме. Способы фармакокинетического анализа и определения периода полувыведения лиганда будут знакомы специалистам в данной области техники. Подробности могут быть обнаружены в Kenneth, A. et al.:Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). Также сделана ссылка на "Pharmacokinetics", M GibaldiD Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982), где описаны такие фармакокинетические параметры,как периоды полувыведения t-альфа (t) и t-бета (t) и площадь под кривой (AUC). Периоды полувыведения (t1/2 альфа и t1/2 бета) и AUC могут быть определены по кривой зависимости концентрации лиганда в сыворотке от времени. Пакет программ для расчтов WinNonlin (доступный от Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA) может быть использован, например, для моделирования кривой. В первой фазе (альфа-фазе) лиганд проходит главным образом распределение в организме пациента с незначительным выведением. Вторая фаза (бета-фаза) является конечной фазой, когда лиганд был распределен и концентрация в сыворотке снижается по мере того, как лиганд выводится из организма пациента. Период полувыведения t-альфа является периодом полувыведения первой фазы, а период полувыведения t-бета является периодом полувыведения второй фазы. Таким образом, преимущественно согласно настоящему изобретению предложен лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, имеющий период полувыведения t в диапазоне 15 мин или более. В одном воплощении нижняя граница диапазона составляет 30, 45 мин, 1 ч, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. В дополнение или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению будут иметь период полувыведения t в диапазоне до 12 ч включительно. В одном воплощении верхняя граница диапазона составляет 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 ч. Пример подходящего диапазона составляет от 1 до 6 ч, от 2 до 5 ч или от 3 до 4 ч. Преимущественно согласно настоящему изобретению предложен лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, имеющий период полувыведения t в диапазоне 2,5 ч или более. В одном воплощении нижняя граница диапазона составляет 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. В дополнение или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеет период полувыведения t в диапазоне до 21 дня включительно. В одном воплощении верхняя граница диапазона составляет 12 ч, 24 ч, 2 дня, 3, 5, 10, 15 или 20 дней. Преимущественно лиганд или композиция по изобретению будет иметь период полувыведения t в диапазоне от 12 до 60 ч. В дополнительном воплощении он будет в диапазоне от 12 до 48 ч. В еще одном дополнительном воплощении он будет в диапазоне от 12 до 26 ч. В дополнение или альтернативно к вышеописанным критериям, согласно настоящему изобретению предложен лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, имеющий значение AUC (площадь под кривой) в диапазоне 1 мг/мин/мл или более. В одном воплощении нижняя граница диапазона составляет 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 или 300 мг/мин/мл. В дополнение или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеет AUC в диапазоне до 600 мг/мин/мл. В одном воплощении верхняя граница диапазона составляет 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 или 50 мг/мин/мл. Преимущественно лиганд по изобретению будет иметь AUC в диапазоне, выбранном, предпочтительно без ограничения, из группы, состоящей из следующего: от 15 до 150, от 15 до 100, от 15 до 75 и от 15 до 50 мг/мин/мл. В первом воплощении лиганд с двойной специфичностью содержит два комплементарных вариабельных домена, т.е. два вариабельных домена, которые в их природной среде способны действовать совместно как когнатная пара или группа, даже если в контексте настоящего изобретения они связывают их когнатные эпитопы по отдельности. Например, комплементарные вариабельные домены могут представлять собой вариабельные домены тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина (VH и VL). Домены VH и VL преимущественно представлены фрагментами антител scFv или Fab. Вариабельные домены могут быть связаны друг с другом с образованием мультивалентных лигандов посредством, например,обеспечения присутствия шарнирной области на С-конце каждого вариабельного домена (V-домена) и дисульфидным связыванием цистеинов в шарнирных областях; или обеспечением присутствия в каждомdAb цистеина на С-конце домена, где цистеины связаны друг с другом дисульфидной связью; или образованием V-СН и V-CL с образованием Fab-формата; или применением пептидных линкеров (например,линкеров Gly4Ser, обсуждаемых в данном изобретении ниже) с образованием димеров, тримеров и других мультимеров. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что применение комплементарных вариабельных доменов делает возможной совместную упаковку поверхностей доменов и их отделение от растворителя. Кроме того, комплементарные домены способны стабилизировать друг друга. Более того, это делает возможным создание IgG-антител с двойной специфичностью без недостатков, связанных с гибридными гибридомами, которые применяли в предшествующем уровне техники, или необходимости конструирования тяжелых или легких цепей на внутренних поверхностях субъединиц. Лиганды с двойной специфичностью по первому аспекту настоящего изобретения имеют по меньшей мере одну пару VH/VL. Биспецифичный IgG по данному изобретению будет, таким образом, содержать две такие пары, по одной паре на каждом плече Y-образной молекулы. Таким образом, в отличие от обычных биспецифичных антител или диател, где соотношение используемых цепей является определяющим для успешного их получения и приводит к практическим трудностям, лиганды с двойной специфичностью по изобретению свободны от проблем баланса цепей. Дисбаланс цепей в обычных биспецифичных антителах является результатом объединения двух различных цепей VL с двумя различными цепями VH, где 1 цепь VL совместно с 1 цепью VH способна связывать 1 антиген или эпитоп, и 2 цепь VL совместно со 2 цепью VH способна связывать 2 антиген или эпитоп, и две правильные пары некоторым образом связаны друг с другом. Таким образом, биспецифичность появляется только тогда, когда 1 цепь VL образует пару с 1 цепью VH и 2 цепь VL образует пару со 2 цепью VH в одной молекуле. Такие биспецифичные молекулы могут быть созданы двумя разными способами. Во-первых, они могут быть созданы объединением двух существующих пар VH/VL, каждая из которых связывает различный антиген или эпитоп (например, в биспецифичном IgG). В этом случае пары VH/VL должны быть объединены в соотношении 1:1 для образования популяции молекул, каждая из которых является биспецифичной. Этого никогда не происходит(даже когда комплементарный домен СН усилен "knobs into holes"-конструированием), что приводит к образованию смеси биспецифичных молекул и молекул, способных связывать лишь один антиген или эпитоп. Второй способ создания биспецифичного антитела заключается в одновременном объединении двух различных цепей VH с двумя различными цепями VL (например, в биспецифичном диателе). В этом случае, хотя и существует тенденция к преимущественному образованию пар 1 цепи VL с 1 цепью VH и 2 цепи VL со 2 цепью VH (которые могут быть усилены "knobs into holes"-конструированием доменов VH иVL), никогда не удается достичь такого образования пар во всех молекулах, что ведет к образованию смешанной композиции, где имеют место неправильные пары, неспособные связывать какой-либо из антигенов или эпитопов. В биспецифичных антителах, полученных способом лиганда с двойной специфичностью по первому аспекту настоящего изобретения, все эти проблемы преодолены, поскольку связывание 1 антигена или эпитопа присуще домену VH или VL и связывание 2 антигена или эпитопа присуще комплементарному домену VH или VL соответственно. Поскольку домены VH и VL образуют пары в соотношении 1:1,все пары VH/VL будут биспецифичными, и, таким образом, все форматы, конструированные с применением этих пар VH/VL (Fv, scFv, Fab, мини-тела, IgG и т.п.), будут иметь 100% биспецифичную активность. В контексте настоящего изобретения первый и второй "эпитопы" следует понимать как эпитопы, не являющиеся одинаковыми и не связываемые одним моноспецифичным лигандом. В первой форме изобретения они преимущественно расположены на разных антигенах, один из которых увеличивает период полувыведения лиганда in vivo. Подобным образом, первый и второй антигены преимущественно не являются одинаковыми. Лиганды с двойной специфичностью по изобретению не включают лиганды, как описано в WO 02/02773. Таким образом, лиганды по настоящему изобретению не включают комплементарные парыVH/VL, связывающие один или более антигены или эпитопы кооперативно. Взамен этого, лиганды по первому аспекту изобретения включают комплементарную пару VH/VL, где V-домены имеют разные специфичности. Более того, лиганды по первому аспекту изобретения включают комплементарные пары VH/VL,имеющие различные специфичности в отношении эпитопов или антигенов, не являющихся структурно родственными. Структурно родственные эпитопы или антигены являются эпитопами или антигенами,обладающими достаточным структурным сходством для того, чтобы быть связанными обычной комплементарной парой VH/VL, действующей кооперативным образом для связывания антигена или эпитопа; в случае структурно родственных эпитопов эпитопы достаточно сходны по структуре, так что они "подходят" к одному и тому же связывающему карману, образованному в антигенсвязывающей области димераVH/VL. Во втором аспекте согласно настоящему изобретению предложен лиганд, содержащий первый вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания в отношении антигена или эпитопа, и второй вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания в отношении антигена или эпитопа, где один или оба из указанных первого и второго вариабельных доменов связывают антиген, увеличивающий период полувыведения лиганда in vivo, и вариабельные домены не являются комплементарными по отношению друг к другу. В одном воплощении связывание с одним вариабельным доменом модулирует связывание лиганда со вторым вариабельным доменом. В этом воплощении вариабельный домен может представлять собой, например, пары доменов VH или пары доменов VL. Связывание антигена в первой области может модулировать, как, например, усиливать или ингибировать, связывание антигена во второй области. Например, связывание в первой области, по меньшей мере, частично ингибирует связывание антигена во второй области. В таком воплощении лиганд может, например, быть сохранен в организме-субъекте in vivo посредством связывания с белком, увеличивающим период полувыведения лиганда, до того времени, пока он не будет связан со вторым антигеном-мишенью и отсоединен от белка, увеличивающего период полувыведения. Модулирования связывания в изложенном выше контексте достигают вследствие структурной близости антигенсвязывающих областей по отношению друг к другу. Такая структурная близость может быть достигнута ввиду природы структурных компонентов, связывающих две или более антигенсвязывающих области, например, обеспечением лиганда с относительно ригидной структурой, удерживающей антигенсвязывающие области в тесной близости. Преимущественно две или более антигенсвязывающих области находятся в физически тесной близости друг от друга таким образом, что одна область модулирует связывание антигена в другой области в результате процесса, включающего стерическое затруднение и/или конформационные изменения в молекуле иммуноглобулина. Первый и второй антигенсвязывающие домены могут быть связаны либо ковалентно, либо нековалентно. В случае, когда домены связаны ковалентно, связывание может быть опосредовано, например,дисульфидными связями или полипептидным линкером, таким как (Gly4Ser)n, где n=от 1 до 8, например 2, 3, 4, 5 или 7. Лиганды по изобретению могут быть комбинированы с образованием неиммуноглобулиновых мультилигандных структур для образования мультивалентных комплексов, связывающих молекулымишени с одним и тем же антигеном, обеспечивая посредством этого повышенную авидность, в то время как по меньшей мере один вариабельный домен связывает антиген для увеличения периода полувыведения мультимера. Например, природные бактериальные рецепторы, такие как SpA, были использованы как каркасы для переноса гипервариабельных участков (CDR) с образованием лигандов, специфично связывающих один или более чем один эпитоп. Подробности этого способа описаны в US 5831012. Другие подходящие каркасы включают каркасы на основе фибронектина и Affibodies. Подробности подходящих способов описаны в WO 98/58965. Другие подходящие каркасы включают липокалин и CTLA4,как описано в van den Beuken et al., J. Mol. Biol. (2001), 310, 591-601, и такие каркасы, как описанные вWO 0069907 (Medical Research Council), основанные, например, на кольцевой структуре бактериальногоGroEl или других полипептидов-шаперонов. Белковые каркасы можно комбинировать; например, CDR могут быть перенесены на каркас CTLA4 и использованы совместно с доменами иммуноглобулинов VH или VL с образованием лиганда. Подобным образом можно комбинировать фибронектиновые, липокалиновые и другие каркасы. В случае, когда вариабельные домены выбраны из репертуаров V-генов, селектрированных, например, с применением технологии фагового дисплея, как описано здесь, эти вариабельные домены могут содержать универсальную каркасную область таким образом, что они могут быть распознаны специфичным лигандом общего типа, как определено здесь. Применение универсальных каркасных областей, лигандов общего типа и т.п. описано в WO 99/20749. В настоящем изобретении ссылка на фаговый дисплей включает применение фагов и/или фагмид. Там, где используют репертуары V-генов, разнообразие полипептидной последовательности предпочтительно заключено в структурных петлях вариабельных доменов. Полипептидные последовательности каждого вариабельного домена могут быть изменены перетасовкой ДНК или мутацией с целью усиления взаимодействия каждого вариабельного домена с его комплементарной парой. В предпочтительном воплощении изобретения "лиганд с двойной специфичностью" представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент. В альтернативном воплощении изобретения "лиганд с двойной специфичностью" состоит из Fab-области антитела. Термин "Fab-область" включает Fab-подобную область, где использованы два домена VH или два домена VL. Вариабельные домены могут иметь происхождение от антител, направленных против антигеновмишеней или эпитопов-мишеней. Альтернативно, они могут иметь происхождение от репертуара отдельных доменов антител, как, например, экспрессированных на поверхности нитчатого бактериофага. Селекцию можно проводить, как описано ниже. В третьем аспекте согласно изобретению предложен способ получения лиганда, содержащего первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую (другую) специфичность связывания, где одна или обе специфичности связывания специфичны в отношении антигена, увеличивающего период полувыведения лиганда in vivo, включающий стадии: а) селекции первого вариабельного домена по его способности связывать первый эпитоп; б) селекции второго вариабельного домена по его способности связывать второй эпитоп; в) комбинирования вариабельных доменов; г) селекции лиганда по его способности связывать указанный первый эпитоп и указанный второй эпитоп. Лиганд может связывать первый и второй эпитопы либо одновременно, либо там, где связывающие домены связывают эпитопы конкурентно, связывание одного домена может предотвращать связывание другого домена с его штатным эпитопом. В одном воплощении, таким образом, указанная выше стадия(г) требует одновременного связывания как первого, так и второго эпитопа (и, возможно, дополнительных эпитопов); в другом воплощении связывание первого и второго эпитопов не является одновременным. Эпитопы предпочтительно расположены на отдельных антигенах. Лиганды преимущественно содержат комбинации вариабельных доменов иммуноглобулинов VH/VL или комбинации VH/VH или VL/VL, как описано выше. Более того, лиганды могут содержать домены VHH представителей семейства верблюдовых, при условии, что домен VHH, специфичный в отношении антигена, увеличивающего период полувыведения лиганда in vivo, не связывает лизоцим белка куриного яйца(HEL), альфа-амилазу поджелудочной железы свиньи или NmC-A; hcg, азокраситель RR6, связанный с бычьим сывороточным альбумином (BSA), или клетки HG982 S. mutans, как описано в Conrath et al.(2001), JBC 276:7346-7350 и WO 99/23221, ни в одной из которых не описано применение специфичности в отношении антигена, увеличивающего период полувыведения, для увеличения периода полувыведения лиганда in vivo. В одном воплощении указанный первый вариабельный домен выбран для связывания указанного первого эпитопа в отсутствие комплементарного вариабельного домена. В другом воплощении указанный первый вариабельный домен связывания указанного первого эпитопа/антигена в присутствии третьего вариабельного домена, где указанный третий вариабельный домен отличается от указанного второго вариабельного домена и комплементарен первому домену. Сходным образом, второй домен может быть выбран в отсутствие или в присутствии комплементарного вариабельного домена. Антигены или эпитопы, являющиеся мишенями для лигандов по изобретению, увеличивающие период полувыведения лиганда, не ограничены мишенями на сывороточном альбумине. Другие воплощения антигенов или эпитопов, являющихся мишенями для лигандов по изобретению, увеличивающие период полувыведения лиганда in vivo, включают, предпочтительно без ограничения, те антигены и эпитопы, которые перечислены в приложении 1 ниже. Антигены или эпитопы, являющиеся мишенями для лигандов по изобретению, в дополнение к увеличивающему период полувыведения белку, могут представлять собой любой антиген или эпитоп, но преимущественно представляют собой антиген или эпитоп, направленное воздействие на который сопряжено с терапевтическим эффектом. Согласно изобретению предложены лиганды, включая лиганды с открытой конформацией, закрытой конформацией и лиганды, представляющие собой выделенные мономеры dAb, специфичные в отношении любой такой мишени, в частности, тех мишеней, которые дополнительно обозначены здесь. Такие мишени могут представлять собой полипептиды, белки или нуклеиновые кислоты, которые могут быть встречающимися в природе или синтетическими, или быть их частью. В этом отношении, лиганд по изобретению может связывать эпитоп или антиген и действовать как антагонист или агонист (например, агонист рецептора эритропоэтина (ЕРО. Специалисту в данной области техники будет ясно, что выбор широк и разнообразен. Они могут представлять собой, например, белки человека или животных, цитокины, рецепторы цитокинов, где рецепторы цитокинов включают рецепторы цитокинов, ферментов, кофакторов ферментов или ДНК-связывающих белков. Подходящие цитокины и факторы роста включают, предпочтительно без ограничения, аполипопротеин Е (АроЕ), аполипопротеин SAA (Apo-SAA), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), кардиотрофин-1, эпидермальный фактор роста (EGF), рецептор EGF, ENA-78, эотаксин, эотаксин-2, Exodus-2, EpoR, кислый фактор роста фибробластов (FGF), основной FGF, фактор роста фибробластов-10, лиганд FLT3, фракталкин(СХ 3 С), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), GF-1, инсулин, -интерферон (IFN-), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-I), инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF-II), интерлейкин-1 (IL-1), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 аминокислоты (а.а.,IL-8 (77 а.а.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IFN-индуцирующий фактор(IGIF, ингибин , ингибин , IP-10, фактор роста кератиноцитов-2 (KGF-2), KGF, лептин, лейкемический ингибиторный фактор (LIF), лимфотактин, мюллерову ингибирующую субстанцию, фактор, ингибирующий колонии моноцитов, моноцитарный атрактантный белок, моноцитарный колониеингибирующий фактор M-CSF, MDC (67 а.а.), MDC (69 а.а.), моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор (MCAF, МСР-2, МСР-3, МСР-4, MDC (67 а.а.),MDC (69 а.а.), MIG, макрофагальный воспалительный белок-1 (MIP-1), MIP-1, MIP-3, MIP-3, MIP4, фактор, ингибирующий миелоидных предшественников, 1 типа (MPIF-1), нейтрофил-активирующий белок-2 (NAP-2), неуртурин, фактор роста нервов, фактор роста нервов- (-NGF), нейротрофин-3 (NT3), NT-4, онкостатин М, тромбоцитарный фактор роста АА (PDGF-AA), PDGF-AB, PDGF-BB, тромбоцитарный фактор-4 (PF-4), RANTES, фактор стромальных клеток-1 (SDF1), SDF1, фактор стволовых клеток (SCF), фактор роста стволовых клеток (SCGF), фактор стволовых клеток (SCF), тимусассоциированные регуляторные хемокины (TARC), трансформирующий фактор роста- (TGF-), TGF-,TGF-2, TGF-3, фактор некроза опухоли (TNF), TNF-, TNF-, рецептор TNF I типа, рецептор TNF II типа, TNIL-1, ТРО, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), рецептор VEGF 1 типа, рецепторVEGF 2 типа, рецептор VEGF 3 типа, гранулоцитарный хемотактический белок-2 (GCP-2), GRO/MGSA,GRO-, GRO-, HCC1, I-309, рецептор человеческого эпидермального фактора роста-1 (HER 1), HER 2,HER 3 и HER 4, CD4, человеческие рецепторы хемокинов CXCR4 или CCR5, неструктурный белок 3 типа (NS3) вируса гепатита С, TNF-альфа, IgE, IFN-гамма, матриксную металлопротеиназу-12 (ММР-12),раковоэмбриональный антиген (СЕА), Н. pylori, ТВ, вирус гриппа, вирус гепатита Е, ММР-12, интернализуемые рецепторы, сверхэкспрессируемые на определенных клетках, такие как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор ErBb2 на опухолевых клетках, интернализуемый клеточный рецептор, рецептор липопротеинов низкой плотности (LDL), рецептор FGF2, рецептор ErBb2, рецептор трансферрина, рецептор PDGF, рецептор VEGF, PsmAr, белок внеклеточного матрикса, эластин, фибронектин,ламинин, 1-антитрипсин, тканевой фактор, ингибирующий протеазы, PDK1, GSK1, Bad, каспазу-9,Forkhead, антиген Helicobacter pylori, антиген Mycobacterium tuberculosis и антиген вируса гриппа. Следует понимать, что этот список ни в коем случае не является исчерпывающим. В одном воплощении изобретения вариабельные домены имеют происхождение от соответствующего антитела, направленного против антигена или эпитопа. В предпочтительном воплощении вариабельные домены имеют происхождение от репертуара отдельных вариабельных доменов антител. В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена одна молекула нуклеиновых кислот или более, кодирующая, по меньшей мере, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь. Лиганд с двойной специфичностью может быть кодирован на одной молекуле нуклеиновой кислоты; альтернативно, каждый домен может быть кодирован отдельной молекулой нуклеиновой кислоты. Там, где лиганд кодирован одной молекулой нуклеиновой кислоты, домены могут быть экспрессированы в виде слитого полипептида, в форме молекулы scFv, или могут быть экспрессированы по отдельности и впоследствии соединены друг с другом, например, с использованием химических линкеров. Лиганды,экспрессированные с отдельных нуклеиновых кислот, будут связаны друг с другом подходящими способами. Нуклеиновая кислота может также кодировать сигнальную последовательность для экспорта полипептидов из клетки-хозяина при экспрессии и может быть слита с поверхностным компонентом частицы нитчатого бактериофага (или другим компонентом дисплейной системы для селекции) при экспрессии. В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд с двойной специфичностью по настоящему изобретению. В еще одном другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена клетка-хозяин, трансфицированная вектором, кодирующим лиганд с двойной специфичностью по настоящему изобретению. Экспрессия с такого вектора может быть изменена для образования, например, на поверхности частицы бактериофага, вариабельных доменов для селекции. Это делает возможным селекцию представленных вариабельных доменов и, таким образом, селекцию "лигандов с двойной специфичностью" с применением способа по настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению также предложен набор, содержащий, по меньшей мере, лиганд с двойной специфичностью по настоящему изобретению. Лиганды с двойной специфичностью по настоящему изобретению предпочтительно содержат комбинации доменов тяжелой и легкой цепи. Например, лиганд с двойной специфичностью может содержать домен VH и домен VL, которые могут быть связаны друг с другом в форме scFv. В дополнение, лиганды могут содержать один или более чем один домен CH или CL. Например, лиганды могут содержать домен CH1, CH2 или домен CH3, и/или домен CL, домены C1, C2, C3 или C4, или любую их комбинацию. Также может быть включена шарнирная область. Такие комбинации доменов могут, например,имитировать природные антитела, такие как IgG или IgM, или их фрагменты, такие как молекулы Fv,scFv, Fab или F(ab')2. Предусмотрены другие структуры, такие как отдельное плечо молекулы IgG, содержащее домены VH, VL, CH1 и CL. В предпочтительном воплощении изобретения вариабельные области выбраны из репертуаров Vгенов отдельных доменов. В большинстве случаев репертуар отдельных доменов антител представляют на поверхности нитчатого бактериофага. В предпочтительном воплощении каждый отдельный домен антитела селектируют связыванием фагового репертуара с антигеном. В предпочтительном воплощении изобретения каждый отдельный вариабельный домен может быть селектирован для связывания его антигена-мишени или эпитопа-мишени в отсутствие комплементарной вариабельной области. В альтернативном воплощении отдельные вариабельные домены могут быть селектированы для связывания их антигена-мишени или эпитопа-мишени в присутствии комплементарной вариабельной области. Таким образом, первый отдельный вариабельный домен может быть селектирован в присутствии третьего комплементарного вариабельного домена, и второй вариабельный домен может быть селектирован в присутствии четвертого комплементарного вариабельного домена. Комплементарный третий или четвертый вариабельный домен может быть естественным когнатным вариабельным доменом, имеющим ту же специфичность, как и исследуемый отдельный домен, или некогнатным комплементарным доменом, таким как "модельный" вариабельный домен. Предпочтительно лиганд с двойной специфичностью по изобретению содержит только два вариабельных домена, хотя несколько таких лигандов могут быть включены совместно в один тот же белок,например, два таких лиганда могут быть включены в IgG или мультимерный иммуноглобулин, как, например, IgM. Альтернативно, в другом воплощении множество лигандов с двойной специфичностью комбинируют с образованием мультимера. Например, два различных лиганда с двойной специфичностью комбинируют для создания тетраспецифичной молекулы. Специалисту в данной области техники будет ясно, что вариабельные домены легкой и тяжелой цепи лиганда с двойной специфичностью, полученного способом по настоящему изобретению, могут быть расположены на одной полипептидной цепи или, альтернативно, на разных полипептидных цепях. В случае, когда вариабельные домены расположены на разных полипептидных цепях, они могут быть связаны линкером, в большинстве случаев гибким линкером (таким как полипептидная цепь), химической связывающей группой или любым другим способом, известным в данной области техники. В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая лиганд с двойной специфичностью, который можно получить способом по настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Более того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения и/или предотвращения заболевания с применением "лиганда с двойной специфичностью" или композиции по настоящему изобретению. Во второй форме согласно настоящему изобретению предложены мультиспецифичные лиганды,содержащие по меньшей мере два некомплементарных вариабельных домена. Например, лиганды могут содержать пару доменов VH или пару доменов VL. Преимущественно домены имеют происхождение от источника, не являющегося представителем семейства верблюдовых; предпочтительно они являются человеческими доменами или содержат человеческие каркасные области (FW) и одну или более гетерологичные CDR. CDR и каркасные области представляют собой области вариабельных доменов иммуноглобулинов, определенные в базе данных Kabat database of Sequences of Proteins of Immunological Interest. Предпочтительные человеческие каркасные области представляют собой области, кодируемые сегментами генов DP47 и DPK9 эмбрионального типа. Преимущественно FW1, FW2 и FW3 домена VH илиVL имеют последовательность FW1, FW2 или FW3 из DP47 или DPK9. Человеческие каркасные области могут, возможно, содержать мутации, например, в общей сложности до приблизительно 5 аминокислотных замен или до приблизительно 10 аминокислотных замен в человеческих каркасных областях, используемых в лигандах по изобретению. Вариабельные домены в мультиспецифичных лигандах по второй форме изобретения могут быть расположены в открытой или закрытой конформации; т.е. они могут быть расположены таким образом,что вариабельные домены могут связывать их когнатные лиганды независимо и одновременно, или таким образом, что только один из вариабельных доменов может связывать его когнатный лиганд в определенный момент времени. Авторам настоящего изобретения было ясно, что при определенных структурных условиях некомплементарные вариабельные домены (например, два вариабельных домена легкой цепи и два вариабельных домена тяжелой цепи) могут присутствовать в лиганде таким образом, что связывание первого эпитопа с первым вариабельным доменом ингибирует связывание второго эпитопа со вторым вариабельным доменом, даже если такие некомплементарные домены не действуют совместно как когнатная пара. Преимущественно лиганд содержит две или более пары вариабельных доменов; тот есть он содержит по меньшей мере четыре вариабельных домена. Преимущественно четыре вариабельных домена содержат каркасные области человеческого происхождения. В предпочтительном воплощении человеческие каркасные области идентичны каркасным областям человеческих последовательностей зародышевого типа. Авторы настоящего изобретения полагают, что такие антитела будут особенно применимы в исследованиях связывания лигандов для терапевтических и других применений. Таким образом, в первом аспекте второй формы согласно настоящему изобретению предложен способ получения мультиспецифичного лиганда, включающий стадии: а) селекции первого эпитопсвязывающего домена по его способности связывать первый эпитоп; б) селекции второго эпитопсвязывающего домена по его способности связывать второй эпитоп; в) комбинирования эпитопсвязывающих доменов и г) селекции мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией по его способности связывать указанный первый эпитоп и указанный второй эпитоп. В другом аспекте второй формы согласно изобретению предложен способ получения мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией, содержащего первый эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и некомплементарный второй эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении второго эпитопа, где первая и вторая специфичности связывания конкурируют за связывание эпитопа таким образом, что мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией не может связывать оба эпитопа одновременно, включающий стадии: а) селекции первого эпитопсвязывающего домена по его способности связывать первый эпитоп; б) селекции второго эпитопсвязывающего домена по его способности связывать второй эпитоп; в) комбинирования эпитопсвязывающих доменов таким образом, что домены расположены в закрытой конформации; г) селекции мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией по его способности связывать указанный первый эпитоп и указанный второй эпитоп, но не оба указанных первый и второй эпитопы одновременно. Более того, согласно изобретению предложен мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией, содержащий первый эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и некомплементарный второй эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении второго эпитопа, где первая и вторая специфичности связывания конкурируют за связывание эпитопа таким образом, что мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией не может связывать оба эпитопа одновременно. Альтернативное воплощение вышеизложенного аспекта второй формы изобретения, возможно,включает стадию (б 1), включающую выбор третьего или дополнительного эпитопсвязывающего домена. Получаемый этим способом мультиспецифичный лиганд с открытой или закрытой конформацией включает специфичность связывания в отношении более чем двух эпитопов. В предпочтительном аспекте второй формы изобретения, где мультиспецифичный лиганд содержит более чем два эпитопсвязывающих домена, по меньшей мере два из указанных доменов расположены в закрытой конформации и конкурируют за связывание; другие домены могут конкурировать за связывание или могут быть способны к независимому объединению с их когнатным эпитопом (эпитопами). Согласно настоящему изобретению термин "мультиспецифичный лиганд" относится к лиганду, обладающему специфичностью связывания в отношении более чем одного эпитопа, как определено здесь. Как определено здесь, термин "закрытая конформация" (мультиспецифичного лиганда) означает,что эпитопсвязывающие домены лиганда присоединены или объединены друг с другом, возможно, посредством белкового скелета таким образом, что связывание эпитопа одним эпитопсвязывающим доменом конкурирует со связыванием эпитопа другим эпитопсвязывающим доменом. Т.е. когнатные эпитопы могут быть связаны каждым эпитопсвязывающим доменом по отдельности, но не одновременно. Закрытая конформация лиганда может быть получена с применением способов, описанных здесь."Открытая конформация" обозначает, что эпитопсвязывающие домены лиганда присоединены или объединены друг с другом, возможно, посредством белкового скелета таким образом, что связывание эпитопа одним эпитопсвязывающим доменом не конкурирует со связыванием эпитопа другим эпитопсвязывающим доменом. Термин "конкурирует", как он назван здесь, обозначает, что связывание первого эпитопа с его когнатным эпитопсвязывающим доменом ингибировано, когда второй эпитоп связан с его когнатным эпитопсвязывающим доменом. Например, связывание может быть ингибировано стерически, например, физическим блокированием связывающего домена или изменением структуры или окружения связывающего домена таким образом, что его аффинность или авидность в отношении эпитопа уменьшается. В другом аспекте второй формы изобретения эпитопы могут вытеснять друг друга при связывании. Например, первый эпитоп может присутствовать на антигене, который, при связывании с его когнатным первым связывающим доменом, вызывает стерическое несоответствие второго связывающего домена или его конформационное изменение, которое вытесняет эпитоп, связанный со вторым связывающим доменом. Преимущественно связывание уменьшено на 25% или более, преимущественно 40, 50, 60, 70, 80,90% или более и предпочтительно до 100% или около того таким образом, что связывание полностью ингибировано. Связывание эпитопов может быть измерено обычными исследованиями связывания антигенов, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), методиками, основанными на флюоресценции, включая резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), или такими методиками, как поверхностный плазмонный резонанс, посредством которого измеряют массу молекул. Специфичное связывание антигенсвязывающего белка с антигеном или эпитопом может быть определено подходящим исследованием, включая, например, анализ Скэтчарда и/или исследования конкурентного связывания, такие как радиоиммуноанализы (RIA), иммуноферментные анализы, такие как ELISA и конкурентные "сэндвич-анализы", и их различные варианты. Аффинность связывания предпочтительно определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и Biacore (Karlsson et al., 1991), с использованием системы Biacore (Uppsala, Sweden). В системе Biacore поверхностный плазмонный резонанс (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) использован для наблюдения биомолекулярных взаимодействий в реальном времени, и использован поверхностный плазмонный резонанс, посредством которого можно выявлять изменения угла резонанса света на поверхности тонкой золотой пленки на стеклянной основе в результате изменений коэффициента преломления поверхности в радиусе до 300 нм. При анализе Biacore легко генерируют константы скорости ассоциации, константы скорости диссоциации, равновесные константы диссоциации и константы аффинности. Аффинность связывания получают посредством оценки констант скорости ассоциации и диссоциации с применением системы поверхностного плазмонного резонанса Biacore (Biacore, Inc.). Биосенсорный чип активируют для ковалентного связывания мишени в соответствии с инструкциями изготовителя (Biacore). Мишень затем разбавляют и вводят на чип для получения сигнала в единицах ответа иммобилизированного вещества. Поскольку сигнал в резонансных единицах (RU) пропорционален массе иммобилизированного вещества, он отражает диапазон плотностей иммобилизированной мишени на матрице. Данные о диссоциации согласуют с односайтовой моделью для получения Koff +/- s.d. (стандартное отклонение измерений). Константу скорости псевдопервого порядка (Kd) вычисляют для каждой кривой ассоциации и наносят на график как функцию концентрации белка для получения Kon +/- s.e. (стандартная ошибка выравнивания). Равновесные константы диссоциации для связывания, Kd, вычисляют на основе измерений SPR как Koff/Kon. Как описано Phizicky and Field в Microb. Rev. (1995), 59:114-115, подходящий антиген, такой какHSA, иммобилизируют на декстрановом полимере и раствор, содержащий лиганд для HSA, такой как отдельный вариабельный домен, проходит через камеру, контактируя с иммобилизированным HSA. Отдельный вариабельный домен, задержанный иммобилизированным HSA, изменяет угол резонанса падающего света, приводя к изменению коэффициента преломления, вызванному увеличенными количествами белка, т.е. отдельного вариабельного домена, вблизи декстранового полимера. Поскольку все белки имеют одинаковый коэффициент преломления и поскольку существует линейная зависимость между изменением угла резонанса и концентрацией белка у поверхности, может быть измерено изменение концентрации белка на поверхности, обусловленное связыванием белок/белок, см. Phizicky and Field, supra. Для определения константы связывания увеличение в резонансных единицах (RU) измеряют как функцию времени, пропуская раствор белка отдельного вариабельного домена мимо иммобилизированного лиганда (HSA) до стабилизации значений RU, затем уменьшение в RU измеряют как функцию времени с использованием буфера без отдельного вариабельного домена. Эту процедуру повторяют при нескольких различных концентрациях белка отдельного вариабельного домена. Подробный теоретический предшествующий уровень техники и способы описаны R. Karlsson, et al. (1991), J. Immunol Methods, 145, 229. Программное обеспечение прибора вычисляет равновесную константу диссоциации (Kd), как описано выше. Равновесную константу диссоциации определяют посредством применения поверхностного плазмонного резонанса, как описано в патенте США 5573957, на основании таблицы значений dRA/dt и RA, где R в этом примере представляет собой комплекс HSA/отдельный вариабельный домен, как измерено Biacore в резонансных единицах, и где dR/dt представляет собой скорость образования комплексов HSA/отдельный вариабельный домен, т.е. производную кривой связывания; нанесением на графикdRA/dt против RA для нескольких различных концентраций отдельного вариабельного домена, и затем нанесением на график угловых коэффициентов этих линий против концентрации отдельного вариабельного домена, угловой коэффициент этого второго графика представляет собой константу скорости ассоциации (М-1, с-1). Константа скорости диссоциации или скорость, с которой HSA и отдельный вариабельный домен отсоединяются друг от друга, может быть определена с использованием кривой диссоциации,построенной на Biacore. Константа скорости диссоциации может быть измерена нанесением на график логарифма уменьшения ответа против времени и определением углового коэффициента. Равновесная константа диссоциации Kd=константа скорости диссоциации/константа скорости ассоциации. В соответствии со способом по настоящему изобретению преимущественно каждый отдельный вариабельный эпитопсвязывающий домен имеет специфичность связывания в отношении эпитопа, отличного от связываемого другими доменами. В контексте настоящего изобретения под первым и вторым "эпитопами" понимают эпитопы, не являющиеся одинаковыми и не связываемые одним моноспецифичным лигандом. Они могут быть расположены на разных антигенах или на одном и том же антигене, но разделены расстоянием, достаточным для того, чтобы они не образовывали единого целого, которое может быть связано одной моноспецифичной парой VH/VL обычного антитела. Экспериментально, если оба отдельных вариабельных домена в форме одноцепочечных антител (доменных антител или dAb) по отдельности конкурируют с моноспецифичным VH/VL-лигандом против двух эпитопов, то эти два эпитопа расположены недостаточно далеко друг от друга, для того чтобы рассматривать их как отдельные эпитопы согласно настоящему изобретению. Мультиспецифичные лиганды с закрытой конформацией по изобретению не включают лиганды,как описано в WO 02/02773. Таким образом лиганды по настоящему изобретению не включают комплементарные пары VH/VL, связывающие один или более антигены или эпитопы кооперативно. Взамен этого, лиганды по изобретению предпочтительно включают некомплементарные пары VH-VH или VL-VL. Преимущественно каждый домен VH или VL в каждой паре VH-VH или VL-VL имеет специфичность связывания в отношении эпитопа, отличного от связываемого другими доменами, и эпитопсвязывающие области расположены таким образом, что связывание эпитопа в одной области конкурирует со связыванием эпитопа в другой области. В соответствии с настоящим изобретением преимущественно каждый эпитопсвязывающий домен содержит вариабельный домен иммуноглобулина. Более преимущественно каждый эпитопсвязывающий домен будет представлять собой либо вариабельный домен легкой цепи (VL), либо вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела. Во второй форме настоящего изобретения домены иммуноглобулинов, когда они присутствуют на лиганде по настоящему изобретению, являются некомплементарными, т.е. они не объединяются с образованием антигенсвязывающей области VH/VL. Таким образом, мультиспецифичные лиганды, как определено во второй форме изобретения, содержат домены иммуноглобулинов одного и того же подтипа, т.е. либо вариабельные домены легкой цепи (VL), либо вариабельные домены тяжелой цепи (VH). Более того, там, где лиганд по изобретению имеет закрытую конформацию, домены иммуноглобулинов могут представлять собой домены типа VHH представителей семейства верблюдовых. В альтернативном воплощении лиганд (лиганды) по изобретению не содержит домен VHH представителей семейства верблюдовых. Более конкретно, лиганд (лиганды) по изобретению не содержит один или более аминокислотных остатков, специфичных для доменов VHH представителей семейства верблюдовых, по сравнению с человеческими доменами VH. Преимущественно отдельные вариабельные домены имеют происхождение от антител, выбранных по активности связывания против различных антигенов или эпитопов. Например, вариабельные домены могут быть выделены, по меньшей мере частично, иммунизацией человека. В данной области техники известны альтернативные способы, включая выделение из библиотек человеческих антител и синтез искусственных генов антител. В выбранных воплощениях отдельный вариабельный домен является встречающимся в природе отдельным вариабельным доменом. В других выбранных воплощениях отдельный вариабельный домен не является встречающимся в природе. Термин "встречающийся в природе" использован здесь для указания на то, что объект, например белковый домен, например отдельный вариабельный домен или отдельный вариабельный домен антитела, может быть обнаружен в природе. Таким образом, встречающийся в природе белковый домен, такой как вариабельная область (V-область) антитела, существует в белке, например в белке цепи антитела, экспрессируемом в природе, например, у нерекомбинантных видов, например млекопитающих, приматов, грызунов, рыб, птиц, рептилий и т.п. Во избежание сомнений, отдельный вариабельный домен, выделенный из репертуара полипептидов, экспрессированных с нуклеиновых кислот, чье разнообразие было внесено in vitro, не является встречающимся в природе отдельным вариабельным доменом. Во избежание сомнений в будущем, отдельный вариабельный домен антитела, имеющий происхождение от антитела, являющегося результатом иммунизации животного, является встречающимся в природе отдельным вариабельным доменом. Вариабельные домены преимущественно связывают суперантигены, такие как белок А или белок L. Связывание суперантигенов является свойством вариабельных доменов антител, прошедших правильный фолдинг, и делает возможным выделение таких доменов из, например, библиотек рекомбинантных или мутантных доменов. Эпитопсвязывающие домены по настоящему изобретению содержат белковый каркас и области,взаимодействующие с эпитопами (расположенные преимущественно на поверхности белкового каркаса). Эпитопсвязывающие домены могут также быть основаны на белковых каркасах или скелетах, отличных от доменов иммуноглобулинов. Например, природные бактериальные рецепторы, такие как SpA,были использованы в качестве каркасов для переноса CDR с образованием лигандов, специфично связывающих один или более эпитопы. Подробности этого способа описаны в US 5831012. Другие подходящие каркасы включают основанные на фибронектине и аффителах (affibody). Подробности подходящих способов описаны в WO 98/58965. Другие подходящие каркасы включают липокалин и CTLA4, как описано в van den Beuken et al., J. Mol. Biol. (2001), 310, 591-601, и такие каркасы, как описанные в WO 0069907 (Medical Research Council), основанные, например, на кольцевой структуре бактериального GroEl или других полипептидов-шаперонов. Белковые каркасы можно комбинировать; например, CDR могут быть перенесены на каркас CTLA4 и использованы совместно с доменами иммуноглобулинов VH или VL с образованием мультивалентного лиганда. Подобным образом можно комбинировать фибронектиновые, липокалиновые и другие каркасы. Специалисту в данной области техники будет ясно, что эпитопсвязывающие домены мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией, полученного способом по настоящему изобретению, могут быть расположены на одной полипептидной цепи или, альтернативно, на разных полипептидных цепях. В случае, когда вариабельные домены расположены на разных полипептидных цепях, они могут быть связаны линкером, преимущественно гибким линкером (таким как полипептидная цепь), химической связывающей группой или любым другим способом, известным в данной области техники. Первый и второй эпитопсвязывающие домены могут быть связаны либо ковалентно, либо нековалентно. В случае, когда домены связаны ковалентно, связывание может быть опосредовано, например,дисульфидными связями. Во второй форме изобретения первый и второй эпитопы являются предпочтительно различными. Они могут представлять собой полипептиды, белки или нуклеиновые кислоты, которые могут быть встречающимися в природе или синтетическими, или являться их частью. В этом отношении, лиганд по изобретению может связывать эпитоп или антиген и действовать как антагонист или агонист (например,агонист рецептора ЕРО). В одном воплощении эпитопсвязывающие домены лиганда имеют специфичность в отношении одного и того же эпитопа и могут, например, одновременно связывать свои эпитопы,когда на одном и том же антигене присутствуют несколько копий эпитопа. В другом воплощении, эти эпитопы представлены на разных антигенах таким образом, что лиганд может связывать эпитопы и соединять антигены. Специалисту в данной области техники будет ясно, что выбор эпитопов и антигенов широк и разнообразен. Они могут представлять собой, например, белки человека или животных, цитокины, рецепторы цитокинов, ферменты, кофакторы ферментов или ДНК-связывающие белки. Подходящие цитокины и факторы роста включают, предпочтительно без ограничения: АроЕ, Apo-SAA, BDNF, кардиотрофин-1, EGF, рецептор EGF, ENA-78, эотаксин, эотаксин-2, Exodus-2, EpoR, кислый FGF, основной, ингибин , IP-10, фактор роста кератиноцитов-2 (KGF-2), KGF, лептин, LIF, лимфотактин, мюллерову ингибирующую субстанцию, моноцитарный колониеингибирующий фактор, моноцитарный атрактантный белок, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 а.а.), МСР-1 (MCAF), МСР-2, МСР-3, МСР-4, MDC (67 a.a.),MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1, MIP-1, MIP-3, MIP-3, MIP-4, фактор, ингибирующий миелоидные предшественники, 1 типа (MPIF-1), NAP-2, неуртурин, фактор роста нервов, -NGF, NT-3, NT-4, онкостатин М, тромбоцитарный фактор роста АА (PDGF-AA), PDGF-AB, PDGF-BB, тромбоцитарный фактор-4 (PF-4), RANTES, SDF1, SDF1, SCF, фактор роста стволовых клеток (SCGF), фактор стволовых клеток (SCF), TARC, TGF-, TGF-, TGF-2, TGF-3, фактор некроза опухоли (TNF), TNF-, TNF-,рецептор TNF 1 типа, рецептор TNF 2 типа, TNIL-1, TPO, VEGF, рецептор VEGF 1 типа, рецептор VEGF 2 типа, рецептор VEGF 3 типа, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-, GRO-, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 и ММР-12, СЕА, Н. pylori, ТВ, вирус гриппа, гепатита Е, ММР-12, интернализуемые рецепторы, сверхэкспрессируемые на определенных клетках, такие как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор ErBb2 на опухолевых клетках, интернализуемый клеточный рецептор, рецептор LDL, рецепторFGF2, рецептор ErBb2, рецептор трансферрина, рецептор PDGF, рецептор VEGF, PsmAr, белок внеклеточного матрикса, эластин, фибронектин, ламинин, 1-антитрипсин, тканевой фактор, ингибирующий протеазы, PDK1, GSK1, Bad, каспазу-9, Forkhead, антиген Helicobacter pylori, антиген Mycobacterium tuberculosis и антиген вируса гриппа, а также любую мишень, раскрытую в приложении 2 или приложении 3 к этому документу, либо в комбинации, как изложено в приложениях, либо в другой комбинации, либо по отдельности. Рецепторы цитокинов включают рецепторы вышеизложенных цитокинов, например,рецептор IL-1 1 типа (IL-1 R1); рецептор IL-6 (IL-6R); рецептор IL-10 (IL-10R); рецептор IL-18 (IL-18R),а также рецепторы цитокинов, изложенных в приложении 2 или приложении 3, и также рецепторы, раскрытые в приложении 2 и приложении 3. Следует понимать, что этот список ни в коем случае не является исчерпывающим. Там, где мультиспецифичный лиганд связывает два эпитопа (на одном или разных антигенах), антиген (антигены) может быть выбран из этого списка. Преимущественно лиганды с двойной специфичностью могут быть использованы для направленного воздействия на цитокины и другие молекулы, синергично взаимодействующие в организме в терапевтических ситуациях. Таким образом, согласно изобретению предложен способ синергичного воздействия на активность двух или более цитокинов, включающий введение лиганда с двойной специфичностью,способного связывать указанные два или более цитокина. В данном аспекте изобретения лиганд с двойной специфичностью представлять собой любой лиганд с двойной специфичностью, включая лиганд,состоящий из комплементарных и/или некомплементарных доменов, лиганд с открытой конформацией и лиганд с закрытой конформацией. Например, данный аспект изобретения относится к комбинациям доменов VH и доменов VL, только доменов VH или только доменов VL. Синергизм в терапевтическом аспекте может быть достигнут несколькими способами. Например,комбинации для направленного воздействия могут быть терапевтически активны, только если обе мишени подвергаются направленному воздействию лигандом, в то время как направленное воздействие на одну мишень саму по себе не является терапевтически эффективным. В другом воплощении одна мишень сама по себе может обеспечить некоторый малый или минимальный терапевтический эффект, но совместно со второй мишенью комбинация обеспечивает синергическое увеличение терапевтического эффекта. Предпочтительно цитокины, связываемые лигандами с двойной специфичностью по данному аспекту изобретения, выбраны из списка, показанного в приложении 2. Более того, лиганды с двойной специфичностью могут быть использованы в онкологических применениях, где одна специфичность направлена на CD89, экспрессируемый цитотоксичными клетками, и другая специфична в отногшении опухоли. Примеры опухолевых антигенов, которые могут быть мишенями, приведены в приложении 3. В одном воплощении второй формы изобретения вариабельные домены имеют происхождение от антитела, направленного против первого и/или второго антитела или эпитопа. В предпочтительном воплощении вариабельные домены имеют происхождение от репертуара отдельных вариабельных доменов антител. В одном примере репертуар представляет собой репертуар, не созданный в животном, или синтетический репертуар. В другом примере отдельные вариабельные домены не являются выделенными(по меньшей мере частично) иммунизацией животных. Таким образом, отдельные домены могут быть выделены из интактной библиотеки. В другом аспекте согласно второй форме изобретения предложен мультиспецифичный лиганд, содержащий первый эпитопсвязывающий домен, имеющий первую специфичность связывания эпитопа, и некомплементраный второй эпитопсвязывающий домен, имеющий вторую специфичность связывания эпитопа. Первая и вторая специфичности связывания могут быть одинаковыми или разными. В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией, содержащий первый эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и некомплементарный второй эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении второго эпитопа, где первая и вторая специфичности связывания способны конкурировать за связывание эпитопа, таким образом, что мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией не может связывать оба эпитопа одновременно. В еще одном другом аспекте согласно изобретению предложены лиганды с открытой конформацией, содержащие некомплементарные связывающие домены, где домены специфичны в отношении различных эпитопов на одной и той же мишени. Такие лиганды связывают мишени с увеличенной авидностью. Сходным образом, согласно изобретению предложены мультивалентные лиганды, содержащие некомплементарные связывающие домены, специфичные в отношении одного и того же эпитопа и направленные на мишени, содержащие несколько копий указанного эпитопа, такие как, например, IL-5,PDGF-AA, PDGF-BB, TGF-, TGF-2, TGF-3 и TNF, а также человеческий рецептор TNF 1 типа и человеческий TNF. В сходном аспекте лиганды по изобретению могут быть изменены для связывания отдельных эпитопов с низкой аффинностью таким образом, что связывание отдельных эпитопов не является терапевтически значимым; но увеличенная авидность, являющаяся результатом связывания двух эпитопов, обеспечивает терапевтический эффект. В конкретном примере мишени могут представлять собой эпитопы,присутствующие по отдельности на нормальных типах клеток, но присутствующие совместно только на аномальных или болезненных клетках, таких как опухолевые клетки. В такой ситуации эффективному направленному воздействию биспецифичными лигандами по изобретению подвержены только аномальные или болезненные клетки. Лиганды, специфичные в отношении нескольких копий одного и того же эпитопа или расположенных рядом эпитопов на одной и той же мишени (известные как хелатообразующие dAb), могут также представлять собой тримерные или полимерные (тетрамерные или более) лиганды, содержащие три, четыре или более некомплементарных связывающих домена. Например, могут быть конструированы лиганды, содержащие три или четыре домена VH или домена VL. Более того, предложены лиганды, связывающие мишени из нескольких субъединиц, где каждый связывающий домен специфичен в отношении субъединицы указанной мишени. Лиганд может быть димерным, тримерным или полимерным. Предпочтительно мультиспецифичные лиганды по вышеизложенным аспектам изобретения можно получить способом по первому аспекту изобретения. Преимущественно по вышеизложенному аспекту второй формы изобретения первый эпитопсвязывающий домен и вторые эпитопсвязывающие домены являются некомплементарными вариабельными доменами иммуноглобулинов, как определено здесь. Т.е. либо вариабельными доменами VH-VH, либо вариабельными доменами VL-VL. Хелатообразующие dAb, в частности, могут быть получены по предпочтительному аспекту изобретения, конкретно, с применением якорных dAb, где библиотеку димерных, тримерных или мультимерных dAb конструируют с использованием вектора, содержащего константное dAb у 5'- или 3'-конца линкерной последовательности, и вводя репертуар вторых, третьих и дополнительных dAb с другой стороны линкера. Например, якорное или ведущее dAb может представлять собой TAR1-5(V), TAR1-27(V),TAR2h-5(VH) или TAR2h-6(V). В альтернативных методиках применения линкера можно избежать, например, применением нековалентного связывания или природной аффинности между связывающими доменами, такими как VH иV. Соответственно, согласно изобретению предложен способ получения хелатообразующего мультимерного лиганда, включающий стадии: а) предоставления вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую отдельный связывающий домен, специфичный в отношении первого эпитопа на мишени; б) предоставления вектора, кодирующего репертуар, содержащий вторые связывающие домены,специфичные в отношении второго эпитопа на указанной мишени, который может быть таким же, как первый эпитоп, или отличаться от него и который расположен рядом с указанным первым эпитопом; в) экспрессии указанных первого и второго связывающих доменов; г) выделения этих комбинаций первого и второго связывающих доменов, образующих комбинации друг с другом с образованием димера, связывающего мишень. Первый и второй эпитопы расположены рядом друг с другом таким образом, что мультимерный лиганд способен связывать оба эпитопа одновременно. Это обеспечивает лиганд с преимуществами увеличенной авидности связывания. Там, где эпитопы являются одинаковыми, увеличенную авидность получают присутствием нескольких копий эпитопа на мишени, что делает возможным одновременное связывание по меньшей мере двух копий для получения эффекта увеличенной авидности. Связывающие домены могут быть объединены несколькими способами, а также с использованием линкеров. Например, связывающие домены могут содержать остатки цистеина, авидиновые или стрептавидиновые группы или другие средства нековалентного соединения после синтеза; будут выделять те комбинации, которые эффективно связывают мишень. Альтернативно, линкер может присутствовать между первым и вторым связывающими доменами, экспрессируемыми в виде одного полипептида с одного вектора, содержащего первый связывающий домен, линкер и репертуар вторых связывающих доменов, например, как описано выше. В предпочтительном аспекте первый и второй связывающие домены объединяются естественным образом при связывании антигена; например, домены VH и VL (например, V) при связывании расположенных рядом эпитопов будут естественным образом объединяться при трехмерном взаимодействии с образованием стабильного димера. Такие объединенные белки могут быть выделены при исследовании связывания мишени. Преимущество данного способа состоит в том, что будут объединяться и, таким образом, будут выделены в результате их увеличенной авидности к мишени только те связывающие домены, которые связывают расположенные в непосредственной близости друг от друга эпитопы в правильной конформации. В альтернативном воплощении вышеизложенного аспекта второй формы изобретения по меньшей мере один эпитопсвязывающий домен содержит неиммуноглобулиновый "белковый каркас" или "белковый скелет", как определено здесь. Подходящие неиммуноглобулиновые белковые каркасы включают,предпочтительно без ограничения, любые из выбранных из группы, состоящей из SpA, фибронектина,GroEl и других шаперонов, липокалина, CCTLA4 и аффител, как изложено выше. Преимущественно по вышеизложенному аспекту второй формы изобретения эпитопсвязывающие домены прикреплены к "белковому скелету". Преимущественно белковый скелет по изобретению представляет собой иммуноглобулиновый скелет. Согласно настоящему изобретению термин "иммуноглобулиновый скелет" относится к белку,включающему по меньшей мере одну характерную для иммуноглобулинов конформацию и действующему в качестве ядра для одного или более эпитопсвязывающих доменов, как определено здесь. Предпочтительные иммуноглобулиновые скелеты, как определено здесь, включают любой один или более из выбранных из следующего: молекулы иммуноглобулина, содержащей, по меньшей мере, (1) домен CL антитела (подкласса каппа или лямбда); или (2) домен СН 1 тяжелой цепи антитела; молекулы иммуноглобулина, содержащей домены СН 1 и СН 2 тяжелой цепи антитела; молекулы иммуноглобулина,содержащей домены СН 1, СН 2 и CH3 тяжелой цепи антитела; или любого набора (2) в сочетании с доменом CL (подкласса каппа или лямбда) антитела. Также может быть включена шарнирная область. Такие комбинации доменов могут, например, имитировать природные антитела, такие как IgG или IgM, или их фрагменты, такие как молекулы Fv, scFv, Fab или F(ab')2. Специалистам в данной области техники будет ясно, что этот список не является исчерпывающим. Связывание скелета с эпитопсвязывающими доменами, как определено здесь, может быть достигнуто на полипептидном уровне, т.е. после экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей скелет и/или эпитопсвязывающие домены. Альтернативно, стадия связывания может быть проведена на уровне нуклеиновых кислот. Способы связывания белкового скелета по настоящему изобретению с одним или более эпитопсвязывающими доменами включают применение методик химии белков и/или молекулярной биологии, которые будут знакомы специалистам в данной области техники и описаны здесь. Преимущественно мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией может содержать первый домен, способный связывать молекулу-мишень, и второй домен, способный связывать молекулу или группу, увеличивающую период полувыведения лиганда. Например, молекула или группа может представлять собой крупный агент, такой как HSA или белок клеточного матрикса. При использовании здесь фраза "молекула или группа, увеличивающая период полувыведения лиганда" относится к молекуле или химической группе, которая, при связывании лигандом с двойной специфичностью, как описано здесь,увеличивает период полувыведения такого лиганда с двойной специфичностью in vivo при его введении животному относительно лиганда, не связывающего такую молекулу или группу. Примеры молекул или групп, увеличивающих период полувыведения лиганда, описаны в данном патенте ниже. В предпочтительном воплощении мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией может быть способен связывать молекулу-мишень только при вытеснении молекулы или группы, увеличивающей период полувыведения. Таким образом, например, мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией сохраняют в циркулирующей крови субъекта с использованием крупной молекулы, такой как HSA. При встрече с молекулой-мишенью конкуренция между связывающими доменами мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией приводит к вытеснению HSA и связыванию мишени. Лиганд по любому аспекту настоящего изобретения включает лиганд, имеющий или состоящий из по меньшей мере одного отдельного вариабельного домена в форме отдельного вариабельного доменамономера или в форме нескольких отдельных вариабельных доменов, т.е. мультимера. Лиганд может быть модифицирован для того, чтобы содержать дополнительные группировки, как, например, слитый белок или конъюгат. Такой мультимерный лиганд, например, в форме лиганда с двойной специфичностью, и/или такой лиганд, содержащий или состоящий из отдельного вариабельного домена, т.е. мономера dAb, применимый в конструировании такого мультимерного лиганда, может преимущественно диссоциировать от его когнатной мишени (мишеней) с Kd 300 нМ или менее, от 300 нМ до 5 пМ (т.е. от 310-7 до 510-12 М), предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ, или от 5 нМ до 200 пМ, или от 1 нМ до 100 пМ,110-7 М или менее, 110-8 М или менее, 110-9 М или менее, 110-10 М или менее, 110-11 М или менее; и/или константой скорости Koff от 510-1 до 110-7 с-1, предпочтительно от 110-2 до 110-6 с-1, или от 510-3 до 110-5 с-1, или 510-1 с-1 или менее, или 110-2 с-1 или менее, или 110-3 с-1 или менее, или 110-4 с-1 или менее, или 110-5 с-1 или менее, или 110-6 с-1 или менее, как определено, например, поверхностным плазмонным резонансом. Константу скорости Kd определяют как Koff/Kon. Значение Kd более чем 1 М обычно рассматривают как указание на неспецифичное связывание. Предпочтительно отдельный вариабельный домен будет связывать антиген-мишень или эпитоп-мишень с аффинностью менее чем 500 нМ, предпочтительно менее чем 200 нМ и более предпочтительно менее чем 10 нМ, как, например, менее чем 500 пМ. В частности, согласно изобретению предложен мономер dAb против TNF (или лиганд с двойной специфичностью, содержащий такое dAb), гомодимерный, гетеродимерный или гомотримерный лиганд,где каждое dAb связывает TNF. Лиганд связывает TNF с Kd от 300 нМ до 5 пМ (т.е. от 310-7 до- 15020464 510-12 М), предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ, более предпочтительно от 5 нМ до 200 пМ и наиболее предпочтительно от 1 нМ до 100 пМ; выражая альтернативным образом, Kd составляет 110-7 М или менее, предпочтительно 110-8 М или менее, более предпочтительно 110-9 М или менее, преимущественно 110-10 М или менее и наиболее предпочтительно 110-11 М или менее; и/или константой скорости Koff от 510-1 до 110-7 с-1, предпочтительно от 110-2 до 110-6 с-1, более предпочтительно от 510-3 до 110-5 с-1,например, 510-1 с-1 или менее, предпочтительно 110-2 с-1 или менее, более предпочтительно 110-3 с-1 или менее, преимущественно 110-4 с-1 или менее, более преимущественно 110-5 с-1 или менее и наиболее предпочтительно 110-6 с-1 или менее, как определено поверхностным плазмонным резонансом. Предпочтительно лиганд нейтрализует TNF в стандартном исследовании L929 с ND50 от 500 нМ до 50 пМ, предпочтительно от 100 нМ до 50 пМ, преимущественно от 10 нМ до 100 пМ, более предпочтительно от 1 нМ до 100 пМ; например, 50 нМ или менее, предпочтительно 5 нМ или менее, преимущественно 500 пМ или менее, более предпочтительно 200 пМ или менее и наиболее предпочтительно 100 пМ или менее. Предпочтительно лиганд ингибирует связывание TNF-альфа с рецептором TNF-альфа 1 типа (рецептором р 55) с IC50 от 500 нМ до 50 пМ, предпочтительно от 100 нМ до 50 пМ, более предпочтительно от 10 нМ до 100 пМ, преимущественно от 1 нМ до 100 пМ; например, 50 нМ или менее, предпочтительно 5 нМ или менее, более предпочтительно 500 пМ или менее, преимущественно 200 пМ или менее и наиболее предпочтительно 100 пМ или менее. Предпочтительно TNF представляет собой человеческийTNF. Кроме того, согласно изобретению предложен мономер dAb против рецептора TNF 1 типа или лиганд с двойной специфичностью, содержащий такое dAb, связывающее рецептор TNF 1 типа с Kd от 300 нМ до 5 пМ (т.е. от 310-7 до 510-12 М), предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ, более предпочтительно от 5 нМ до 200 пМ и наиболее предпочтительно от 1 нМ до 100 пМ, например, 110-7 М или менее, предпочтительно 110-8 М или менее, более предпочтительно 110-9 М или менее, преимущественно 110-10 М или менее и наиболее предпочтительно 110-11 М или менее; и/или константой скорости Koff от 510-1 до 110-7 с-1, предпочтительно от 110-2 до 110-6 с-1, более предпочтительно от 510-3 до 110-5 с-1, например, 510-1 с-1 или менее, предпочтительно 110-2 с-1 или менее, преимущественно 110-3 с-1 или менее, более предпочтительно 110-4 с-1 или менее, еще более предпочтительно 110-5 с-1 или менее и наиболее предпочтительно 110-6 с-1 или менее, предпочтительно как определено поверхностным плазмонным резонансом. Предпочтительно лиганд, содержащий мономер dAb, нейтрализует TNF в стандартном исследовании (например, исследованиях L929 или HeLa, описанных здесь) с ND50 от 500 нМ до 50 пМ, предпочтительно от 100 нМ до 50 пМ, более предпочтительно от 10 нМ до 100 пМ, преимущественно от 1 нМ до 100 пМ; например, 50 нМ или менее, предпочтительно 5 нМ или менее, более предпочтительно 500 пМ или менее, преимущественно 200 пМ или менее и наиболее предпочтительно 100 пМ или менее. Предпочтительно мономер dAb или лиганд ингибирует связывание TNF-альфа с рецептором TNFальфа 1 типа (рецептором р 55) с IC50 от 500 нМ до 50 пМ, предпочтительно от 100 нМ до 50 пМ, более предпочтительно от 10 нМ до 100 пМ, преимущественно от 1 нМ до 100 пМ; например 50 нМ или менее,предпочтительно 5 нМ или менее, более предпочтительно 500 пМ или менее, преимущественно 200 пМ или менее и наиболее предпочтительно 100 пМ или менее. Предпочтительно мишенью для рецептораTNF 1 типа является человеческий TNF. Кроме того, согласно изобретению предложен мономер dAb (или лиганд с двойной специфичностью, содержащий такое dAb), связывающий сывороточный альбумин (SA) с Kd от 1 нМ до 500 мкМ (т.е. от 110-9 до 510-4), предпочтительно от 100 нМ до 10 мкМ. Предпочтительно для лиганда с двойной специфичностью, содержащего первое dAb против SA и второе dAb против другой мишени, аффинность(например, Kd и/или Koff, как измерено поверхностным плазмонным резонансом, например, с использованием Biacore) второго dAb в отношении его мишени превышает афинность первого dAb в отношенииSA в 1-100000 раз (предпочтительно от 100 до 100000, более предпочтительно от 1000 до 100000 или от 10000 до 100000 раз). Например, первое dAb связывает SA с аффинностью приблизительно 10 мкМ, в то время как второе dAb связывает его мишень с аффинностью 100 пМ. Предпочтительно сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA). В одном воплощении первое dAb (или мономер dAb) связывает SA (например, HSA) с Kd приблизительно 50, предпочтительно 70 и наиболее предпочтительно 100, 150 или 200 нМ. Более того, согласно изобретению предложены димеры, тримеры и полимеры вышеупомянутых мономеров dAb по вышеизложенному аспекту настоящего изобретения. Лиганды по изобретению, включая мономеры, димеры и тримеры dAb, могут быть связаны с Fcобластью антитела, содержащей один или оба домена CH2 и CH3, и, возможно, шарнирную область. Например, для получения таких полипептидов могут быть использованы векторы, кодирующие лиганды,связанные в виде одной нуклеотидной последовательности с Fc-областью. В другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложены одна или более молекул нуклеиновых кислот, кодирующих, по меньшей мере, мультиспецифичный лиганд,как определено здесь. В одном воплощении мультиспецифичный лиганд представляет собой лиганд с закрытой конформацией. В другом воплощении он представляет собой лиганд с открытой конформацией. Мультиспецифичный лиганд может быть кодирован одной молекулой нуклеиновой кислоты; альтернативно, каждый эпитопсвязывающий домен может быть кодирован отдельной молекулой нуклеиновой кислоты. Там, где мультиспецифичный лиганд кодирован одной молекулой нуклеиновой кислоты, домены могут быть экспрессированы в виде слитого полипептида или могут быть экспрессированы по отдельности и впоследствии соединены друг с другом, например, с использованием химических линкеров. Лиганды, экспрессированные с отдельных нуклеиновых кислот, будут связаны друг с другом подходящими способами. Нуклеиновая кислота может дополнительно кодировать сигнальную последовательность для экспорта полипептидов из клетки-хозяина при экспрессии и может быть слита с поверхностным компонентом частицы нитчатого бактериофага (или другим компонентом дисплейной системы для селекции) при экспрессии. Лидерные последовательности, которые могут быть использованы при экспрессии у бактерий и/или фаговом или фагмидном дисплее, включают pelB, stII, ompA, phoA, bla и pelA. В другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложен вектор,содержащий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. В еще одном другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена клетка-хозяин, трансфицированная вектором по настоящему изобретению. Экспрессия такого вектора может быть изменена для образования, например, на поверхности частицы бактериофага, эпитопсвязывающих доменов для селекции. Это делает возможным селекцию представленных вариабельных доменов и, таким образом, селекцию "мультиспецифичных лигандов" с применением способа по настоящему изобретению. В предпочтительном воплощении второй формы изобретения эпитопсвязывающие домены представляют собой вариабельные домены иммуноглобулинов и выбраны из репертуаров V-генов отдельных доменов. В большинстве случаев репертуар отдельных доменов антител представлен на поверхности нитчатого бактериофага. В предпочтительном воплощении каждый отдельный домен антитела выбран связыванием фагового репертуара с антигеном. Согласно настоящему изобретению также предложен набор, содержащий, по меньшей мере, мультиспецифичный лиганд по настоящему изобретению, который может представлять собой лиганд с открытой конформацией или с закрытой конформацией. Наборы по настоящему изобретению могут представлять собой, например, диагностические наборы, терапевтические наборы, наборы для выявления химических и биологических видов и т.п. В еще одном другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложен однородный иммунологический анализ с применением лиганда по настоящему изобретению. В еще одном другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией, который можно получить способом по настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Более того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения заболевания с применением "мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией" или композиции по настоящему изобретению. В предпочтительном воплощении заболевание представляет собой рак или воспалительное заболевание, например ревматоидный артрит, астму или болезнь Крона. В другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложен способ диагностики, включающий диагностику заболевания с применением мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией или композиции по настоящему изобретению. Таким образом, в большинстве случаев связывание анализируемого вещества с мультиспецифичным лигандом с закрытой конформацией может быть использовано для вытеснения агента, что приводит к генерированию сигнала на вытеснение. Например, связывание анализируемого вещества (второго антигена) может вытеснять фермент (первый антиген), связанный с антителом, обеспечивая основу для иммунологического анализа, особенно если антитело фиксировало фермент через его активный центр. Таким образом, в конечном аспекте второй формы согласно настоящему изобретению предложен способ выявления присутствия молекулы-мишени, включающий: а) предоставление мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией, связанного с агентом,специфичного в отношении молекулы-мишени и агента, где агент, связываемый лигандом, приводит к генерированию детектируемого сигнала в ответ на вытеснение из лиганда; б) воздействие на мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией молекулой-мишенью; в) детекцию сигнала, генерируемого в результате вытеснения агента. По вышеизложенному аспекту второй формы изобретения преимущественно агент представляет собой фермент, неактивный при связывании с мультиспецифичным лигандом с закрытой конформацией. Альтернативно, агент может представлять собой одно или более, выбранное из группы, состоящей из следующего: субстрата для фермента и флюоресцентной, люминесцентной или хромогенной молекулы,неактивной или блокируемой при связывании с лигандом. Последовательности, сходные или гомологичные (например, по меньшей мере 70% идентичность последовательности) последовательностям, раскрытым здесь, также являются частью изобретения. В некоторых воплощениях идентичность последовательности на аминокислотном уровне может составлять приблизительно 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более. На уровне нуклеиновых кислот идентичность последовательности может составлять приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98, 99% или более. Альтернативно, существенная идентичность присутствует, когда сегменты нуклеиновых кислот будут гибридизоваться в селективных условиях гибридизации (например, очень строгих условиях гибридизации) с комплементарной цепью. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, лизате клеток или в частично очищенной или, по существу, чистой форме. Процент идентичности может относиться к проценту идентичности по всей длине аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Если указано, процент идентичности аминокислотной или нуклеотидной последовательности относится к проценту идентичности последовательности (последовательностям) из одной или более отдельных областей эталонной аминокислотной или нуклеотидной последовательности, например, на протяжении одной или более CDR-областей антитела и/или одной или более вариабельных каркасных областей антитела. Например, идентичность последовательности на аминокислотном уровне одной или более CDR отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела может представлять собой приблизительно 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности соответствующих CDR отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела соответственно. На уровне нуклеиновых кислот последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или более CDR отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела, может иметь по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,97, 98, 99% или большую идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей соответствующие CDR отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела. На уровне нуклеиновых кислот, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей одну CDR отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела, может иметь процент идентичности по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей соответствующую CDR отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела соответственно. В некоторых воплощениях структурная характеристика процента идентичности сочетается с функциональным аспектом. Например, в некоторых воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность с менее чем 100% идентичностью эталонной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности также необходима для отображения по меньшей мере одного функционального аспекта эталонной аминокислотной последовательности или аминокислотной последовательности, кодируемой эталонной нуклеиновой кислотой. В других воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность с менее чем 100% идентичностью эталонной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, соответственно, также необходима для отображения по меньшей мере одного функционального аспекта эталонной аминокислотной последовательности или аминокислотной последовательности, кодируемой эталонной нуклеиновой кислотой, но эта функциональная характеристика может быть незначительно изменена, например, придавать увеличенную аффинность в отношении обозначенного антигена по сравнению с аффинностью эталона. Вычисления "гомологии" или "идентичности последовательности" либо "сходства" двух последовательностей (термины использованы здесь взаимозаменяемо) проводят следующим образом. Последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены разрывы в одну или обе из первой и второй аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания, и негомологичными последовательностями в целях сравнения можно пренебречь). В предпочтительном воплощении длина эталонной последовательности, выравниваемой в целях сравнения, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%,более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере 70, 80, 90, 100% длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как в соответствующем положении второй последовательности,то молекулы являются идентичными в этом положении (при использовании здесь "гомология" аминокислот или нуклеиновых кислот эквивалентна "идентичности" аминокислот или нуклеиновых кислот). Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений в обоих последовательностях, при учете числа разрывов и длины каждого разрыва, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Преимущественно для выравнивания последовательностей используют алгоритм BLAST (версии 2.0) с параметрами, установленными на значения по умолчанию. Алгоритм BLAST подробно описан на веб-сайте ("www") Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotech- 18020464nology Information ("NCBI" Национального института здравоохранения (National Institutes of Health("NIH" правительства США ("gov"), в директории "/Blast/", в файле "blasthelp.html". Параметры поиска определены следующим образом и преимущественно установлены на определенные параметры по умолчанию.BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) представляет собой эвристический поисковый алгоритм,используемый в программах blastp, blastn, blastx, tblastn, and tblastx; в этих программах значимость результатов определяется применением статистических способов Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 87(6):2264-8 (см. файл "blasthelp.html", как описано выше) с некоторыми усовершенствованиями. Программы BLAST были написаны для поиска сходства последовательностей, например, для идентификации гомологов запрашиваемой последовательности. Эти программы в большинстве случаев не пригодны для поиска по мотиву/типу. См. обсуждение основных вопросов поиска по сходству в базах данных последовательностей в Altschul et al. (1994). Пять программ BLAST, доступные на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации, выполняют следующие задачи:"blastp" сравнивает запрашиваемую аминокислотную последовательность с базой данных белковых последовательностей;"blastn" сравнивает запрашиваемую нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей;"blastx" сравнивает умозрительные продукты трансляции в шести рамках считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обоих цепей) с базой данных белковых последовательностей;"tblastn" сравнивает запрашиваемую белковую последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей, динамично транслируемых во всех шести рамках считывания (обоих цепей);"tblastx" сравнивает трансляции в шести рамках считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности с трансляциями в шести рамках считывания базы данных нуклеотидных последовательностей. В BLAST используют следующие параметры поиска.HISTOGRAM отображает гистограмму результатов каждого поиска; по умолчанию "да" (см. параметр Н в руководстве BLAST Manual).DESCRIPTIONS ограничивает число коротких описаний совпадающих последовательностей заданным числом; лимит по умолчанию составляет 100 описаний (см. параметр V на странице руководства). См. также EXPECT и CUTOFF.ALIGNMENTS ограничивает число последовательностей из базы данных с парами сегментов с максимальным сходством (high-scoring segment pairs (HSP заданным числом; лимит по умолчанию составляет 50. Если пороговой статистической значимости соответствует больше последовательностей из базы данных (см. EXPECT и CUTOFF ниже), будет сообщено только о наиболее статистически значимых совпадениях (см. параметр В в руководстве BLAST Manual).EXPECT. Пороговая статистическая значимость для сообщения о совпадениях с последовательностями из базы данных; значение по умолчанию составляет 10 таким образом, что ожидают, что 10 совпадений будут обнаружены только случайно, в соответствии со стохастической моделью Karlin and AltschulEXPECT, о совпадении не будет сообщено. Меньшие пороговые значения EXPECT являются более строгими, что приводит к сообщению меньшего числа случайных совпадений. Приемлемы дробные величины (см. параметр Е в руководстве BLAST Manual).CUTOFF. Пороговое сходство для сообщения о парах сегментов с максимальным сходством. Значение по умолчанию вычисляют на основании значения EXPECT (см. выше). О HSP в последовательности из базы данных сообщается только, если определенная для них статистическая значимость, по меньшей мере, равна той, которая была бы присвоена отдельной HSP со сходством, равным значению CUTOFF. Большие значения CUTOFF являются более строгими, что приводит к сообщению меньшего числа случайных совпадений (см. параметр S в руководстве BLAST Manual). Обычно, пороговыми значениями значимости можно управлять более интуитивно с использованием EXPECT.MATRIX обозначает кососимметрическую матрицу сходства для BLASTP, BLASTX, TBLASTN иTBLASTX. Матрица по умолчанию представляет собой BLOSUM62 (HenikoffHenikoff, 1992, Ргос.Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10915-9). Допустимые альтернативные выборы включают РАМ 40, РАМ 120,РАМ 250 и IDENTITY. Для BLASTN нет доступных кососимметрических матриц сходства; указаниеSTRAND ограничивает поиск TBLASTN только верхней или только нижней цепью последовательностей из базы данных; или ограничивает поиск BLASTN, BLASTX или TBLASTX рамками считывания на только верхней или только нижней цепи запрашиваемой последовательности.FILTER маскирует сегменты запрашиваемой последовательности, имеющие малую структурную сложность, как определено программой SEG WoottonFederhen (1993), Computers and Chemistry 17:149163, или сегменты, состоящие из внутренних повторов короткой периодичности, как определено программой XNU, ClaverieStates, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201, или для BLASTN програм- 19020464 мой DUST, Tatusov and Lipman (см. веб-сайт NCBI). Фильтрацией можно удалить из результатов статистически значимые, но биологически неинтересные сообщения (например, совпадения с распространенными кислыми, основными или богатыми пролином областями), оставляя более биологически интересные области запрашиваемой последовательности доступными для специфичного сопоставления с последовательностями из базы данных. Последовательность малой сложности, обнаруженная программой-фильтром, заменяется буквой"N" в нуклеотидной последовательности (например, "N", повторяемой 13 раз) и буквой "X" в белковых последовательностях (например, "X", повторяемой 9 раз). Фильтрацию применяют только к запрашиваемой последовательности (или ее трансляционным продуктам), не к последовательностям из базы данных. Фильтром по умолчанию является DUST дляBLASTN, SEG для других программ. Нередко SEG, XNU или обе программы не маскируют ровно ничего при применении к последовательностям в SWISS-PROT, поэтому не следует ожидать, что фильтрация всегда эффективна. Кроме того, в некоторых случаях последовательности маскируются полностью, указывая на то, что к статистической достоверности любых совпадений, о которых сообщено для запрашиваемой последовательности без фильтрации, следует относиться с подозрением.NCBI-gi показывает в результатах идентификаторы NCBI gi, в дополнение к зарегистрированному названию и/или названию локуса. Наиболее предпочтительно сравнение последовательностей проводят с применением простого поискового алгоритма BLAST, предоставленного на веб-сайте NCBI, описанном выше, в директории"/BLAST". Краткое описание графических материалов На фиг. 1 показано разнообразие VH/HSA в положениях Н 50, Н 52, Н 52 а, Н 53, Н 55, Н 56, Н 58, Н 95,Н 96, Н 97, Н 98 (кодировка DVT или NNK соответственно), расположенных в антигенсвязывающей области VH HSA. Последовательность V отличается в положениях L50, L53. На фиг. 2 показана библиотека 1: V/DVT VH эмбрионального типа; библиотека 2: V/NNK VH эмбрионального типа; библиотека 3: VH/DVT V эмбрионального типа; библиотека 4: VH/NNK V эмбрионального типа; в формате фагового дисплея/ScFv. Эти библиотеки были подвергнуты предварительной селекции на связывание лигандов общего типа, белка А и белка L, таким образом, что большинство клонов и селектированных библиотек являются функциональными. Библиотеки селектировали на HSA (первый раунд) и -галактозидазу (-gal) (второй раунд), селекция HSA -gal, или на -gal (первый раунд) иHSA (второй раунд), селекция -gal HSA. Растворимые scFv от этих ПЦР (полимеразная цепная реакция)-клонов амплифицируют в последовательности. Для дальнейшей работы был выбран один клон, кодирующий антитело K8 с двойной специфичностью. На фиг. 3 показано выравнивание цепей VH и цепей V. На фиг. 4 показано описание связывающих свойств антитела K8, связывающие свойства антителаK8 охарактеризованы моноклональным фаговым ELISA; было обнаружено, что антитело K8 с двойной специфичностью связывало HSA и -gal и было представлено на поверхности фага с сигналами абсорбции более 1,0. Перекрестной реактивности с другими белками выявлено не было. На фиг. 5 показан ELISA растворимого scFv, проводимый с использованием известных концентраций фрагмента антитела K8. 96-луночный планшет покрывали 100 мкг HSA, BSA и -gal в концентрации 10 мкг/мл и 100 мкг/мл белка А в концентрации 1 мкг/мл. Наносили 50 мкг серийных разведений scFv K8 и связанные фрагменты антител выявляли с использованием белка L с пероксидазой хрена (белка LHRP). Результаты ELISA подтверждают, что антитело K8 имеет две специфичности. На фиг. 6 показаны характеристики связывания клона K8V/модельный VH, анализируемого с использованием ELISA растворимого scFv. Образование растворимых фрагментов scFv было индуцировано изопропилтиогалактозидом (IPTG), как описано Harrison et al., Methods Enzymol. 1996; 267:83-109, и супернатант, содержащий scFv, анализировали непосредственно. ELISA растворимого scFv проводили,как описано в примере 1, и связанные scFv выявляли с использованием белка L-HRP. Результаты ELISA выявили, что данный клон был все еще способен связывать -gal, в то время как связывание BSA было ликвидировано. На фиг. 7 показана последовательность 1 и 2 векторов вариабельных доменов. На фиг. 8 представлена карта вектора CH, используемого для конструирования мультиспецифичного лиганда VH1/VH2. На фиг. 9 представлена карта вектора V, используемого для конструирования мультиспецифичного лиганда V1/V2. На фиг. 10 показано исследование с рецептором TNF по сравнению 4 димера TAR1-5, 4 димераTAR1-5-19 и мономера TAR1-5-19. На фиг. 11 показано исследование с рецептором TNF по сравнению 1-6 димеров TAR1-5. Все димеры очищали жидкостной хроматографией быстрого разрешения (FPLC), и показаны результаты оптимальных димерных разновидностей. На фиг. 12 показано исследование с рецептором TNF гомодимеров TAR1-5 19 в различных форматах: формате dAb-линкер-dAb с линкером 3U, 5U или 7U, формате Fab и формате цистеинового шарнирного линкера. На фиг. 13 представлена последовательность модельного VH для библиотеки 1. Последовательность каркасной области VH, основанная на последовательности эмбрионального типа DP47 - JH4b. Положения, в которых в библиотеке 1 была проведена NNK-рандомизация (N=нуклеотиды А, или Т, или С, илиG; K=нуклеотиды G или Т), указаны жирным шрифтом с подчеркиванием. На фиг. 14 представлена последовательность модельного VH для библиотеки 2. Последовательность каркасной области VH, основанная на последовательности эмбрионального типа DP47-JH4b. Положения,в которых в библиотеке 2 была проведена NNK-рандомизация (N=нуклеотиды А, или Т, или С, или G;K=нуклеотиды G или Т), указаны жирным шрифтом с подчеркиванием. На фиг. 15 представлена последовательность модельного V для библиотеки 3. Последовательность каркасной области V, основанная на последовательности эмбрионального типа DP9 - J1. Положения, в которых в библиотеке 3 была проведена NNK-рандомизация (N=нуклеотиды А, или Т, или С, или G;K=нуклеотиды G или Т), указаны жирным шрифтом с подчеркиванием. На фиг. 16 представлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность dAb против MSAMSA 16 и MSA 26. На фиг. 17 представлено Biacore-ингибирование MSA 16 и 26. Очищенные dAb MSA16 и MSA26 анализировали ингибированием Biacore для определения Kd. Кратко, dAb анализировали для определения концентрации dAb, необходимой для достижения 200 резонансных единиц (RU) ответа на чипеBiacore CM5, покрытом MSA с высокой плотностью. Когда необходимые концентрации dAb были определены, антиген MSA в диапазоне концентраций около ожидаемой Kd предварительно смешивали с dAb и инкубировали в течение ночи. Связывание dAb с покрытым MSA чипом Biacore в каждой из предварительных смесей затем измеряли при высокой скорости потока 30 мкл/мин. На фиг. 18 представлены сывороточные уровни MSA16 после инъекции. Определяли период полувыведения dAb MSA16 в сыворотке у мышей. MSA16 дозировали в виде однократных внутривенных(i.v.) инъекций в дозе приблизительно 1,5 мг/кг мышам CD1. Моделирование с использованием 2 компартментной модели показало, что t1/2 MSA16 составлял 0,98 ч и t1/2 - 36,5 ч, AUC (площадь под кривой) - 913 ч.мг/мл. MSA16 имело существенно увеличенный период полувыведения по сравнению сHEL4 (dAb против лизоцима белка куриного яйца), t1/2 которого составлял 0,06 ч и t1/2 - 0,34 ч. На фиг. 19 представлены ELISA (а) и исследование с рецептором TNF (в), демонстрирующее ингибирование связывания TNF Fab-подобным фрагментом, содержащим MSA26Ck и TAR1-5-19CH. Добавление MSA с Fab-подобным фрагментом снижает уровень ингибирования. Планшет для ELISA, покрытый 1 мкг/мл TNF, исследовали Fab-подобным фрагментом V CH и V C с двойной специфичностью и также контрольным dAb, связывающим TNF, в концентрации, вычисленной для того, чтобы дать сходный сигнал при ELISA. Как dAb с двойной специфичностью, так и контрольное dAb использовали для зондирования планшета для ELISA в присутствии и в отсутствие 2 мг/мл MSA. Сигнал в лунках с фрагментами с двойной специфичностью был снижен более чем на 50%, но сигнал в лунках с dAb был полностью сохранен (см. фиг. 19 а). Такой же белок с двойной специфичностью был подвергнут исследованию с рецептором с и без MSA, и также была показана конкуренция с MSA (см. фиг. 19 в). Это демонстрирует, что связывание MSA с фрагментом с двойной специфичностью конкурирует со связыванием с TNF. На фиг. 20 представлено исследование с рецептором TNF, показывающее ингибирование связывания TNF со связанным дисульфидными связями гетеродимером dAb TAR1-5-19 и dAb MSA16. Добавление MSA с димером снижает уровень ингибирования дозозависимым образом. Исследование с рецептором TNF (фиг. 19 (б проводили в присутствии постоянной концентрации гетеродимера (18 нМ) и серийных разведений MSA и HSA. Присутствие HSA в диапазоне концентраций (до 2 мг/мл) не вызывало снижения способности димера ингибировать TNF. Тем не менее, добавление MSA вызывало дозозависимое снижение способности димера ингибировать TNF (фиг. 19 а). Это демонстрирует, что MSA иTNF конкурируют за связывание со связанным дисульфидными связями димером TAR1-5-19, MSA16.MSA и HSA сами по себе не оказывали влияния на уровень связывания TNF в исследовании. На фиг. 21 представлены очищенные рекомбинантные домены человеческого сывороточного альбумина (HSA), дорожки 1-3 содержат домены I, II и III HSA соответственно. На фиг. 22 представлен пример иммунопреципитации, показывающий, что HSA-связывающее dAb связывает полноразмерный HSA (дорожка 8) и домен II HSA (дорожка 6), но не связывает домены I и IIIHSA (дорожки 5 и 7 соответственно). dAb, не связывающее HSA, не осаждает ни полноразмерный HSA,ни домены I, II или III HSA (дорожки 1-4). На фиг. 23 представлен пример определения связывания домена HSA dAb, как определено поверхностным плазмонным резонансом. Исследуемое dAb наносили, как описано, на сенсорный чип СМ 5(Biacore), покрытый человеческим сывороточным альбумином с низкой плотностью. В точке 1 исследуемое dAb наносили само по себе в концентрации 1 мкМ. В точке 2 использовали команду одновременного нанесения, нанесение образца переключали на смесь 1 мкМ dAb плюс 7 мкМ домена 1, 2 или 3HSA, продуцированного в Pichia. В точке 3 нанесение останавливали, но сохраняли поток буфера. Результаты для двух различных dAb показаны на фиг. 23(а) и 23(б). Когда dAb наносят с доменом HSA,который его связывает, он образует комплекс, который не может больше связывать HSA на чипе, поэтому сигнал Biacore уменьшается в точке 2, со скоростью диссоциации, отражающей 3-компонентное равновесие между dAb, растворимым доменом HSA и связанным с чипом HSA. Когда домен не связываетdAb, сигнал остается неизменным в точке 2 и начинает уменьшается только в точке 3, где поток переключается на буфер. В обоих случаях dAb связывает домен 2 HSA. На фиг. 24 представлены последовательности антител клонов AlbudAb (dAb, специфично связывающего сывороточный альбумин), идентифицированных фаговой селекцией. Все клоны были выравнены с генами человеческой эмбриональной линии. Остатки, идентичные эмбриональному типу, были обозначены ".". В VH CDR3, символ "-" был использован для облегчения выравнивания, но не обозначает остаток. Все клоны были выбраны из библиотек, основанных на одной человеческой каркасной области,содержащей гены тяжелых цепей эмбрионального типа V3-23/DP47 и JH4b для библиотек VH и гены легких цепей O12/O2/DPK9 и J 1 для библиотек V, с разнообразием боковых цепей, внесенным в положения в антигенсвязывающей области. На фиг. 25 представлены выравнивания трех доменов человеческого сывороточного альбумина. Консервативность цистеиновых остатков очевидна. Определения"Комплементарный". Два домена иммуноглобулина "комплементарны", когда они принадлежат семействам структур, образующих когнатные пары или группы, или имеют происхождение от таких семейств и сохраняют это свойство. Например, домен VH и домен VL антитела комплементарны; два домена VH некомплементарны, и два домена VL некомплементарны. Комплементарные домены могут быть обнаружены у других членов суперсемейства иммуноглобулинов, как, например, домены V и V (илии ) Т-клеточного рецептора. В контексте второй формы настоящего изобретения некомплементарные домены не связывают молекулу-мишень кооперативно, но действуют независимо на разные эпитопымишени, которые могут быть расположены на одной или разных молекулах. Домены, являющиеся искусственными, как, например, домены на основе белковых каркасов, не связывающие эпитопы, если они не конструированы для этого, некомплементарны. Подобным образом, два домена на основе (например) домена иммуноглобулина и домена фибронектина некомплементарны."Иммуноглобулин". Это относится к семейству полипептидов, сохраняющих конформацию иммуноглобулинов, характерную для молекул антител, которая содержит две -складчатости и, обычно, консервативную дисульфидную связь. Члены суперсемейства иммуноглобулинов вовлечены во многие аспекты клеточных и неклеточных взаимодействий in vivo, включая широко распространенные функции в иммунной системе (например, антитела, молекулы Т-клеточных рецепторов и т.п.), участие в клеточной адгезии (например, молекулы межклеточной адгезии (ICAM и межклеточную передачу сигналов (например, рецепторные молекулы, такие как рецептор PDGF). Настоящее изобретение применимо ко всем молекулам суперсемейства иммуноглобулинов, имеющим связывающие домены. Предпочтительно настоящее изобретение относится к антителам."Объединение". Вариабельные домены по изобретению объединяют с образованием группы доменов; например, могут быть объединены комплементарные домены, как, например, домены VL, объединяемые с доменами VH. Также можно объединять некомплементарные домены. Домены можно объединять несколькими способами, включая связывание доменов ковалентным или нековалентным способом."Домен". Домен представляет собой складчатую белковую структуру, сохраняющую свою третичную структуру независимо от остальной части белка. В большинстве случаев домены обеспечивают дискретные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перемещены на другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена. При использовании здесь "отдельный вариабельный домен" представляет собой домен, способный специфично связывать эпитоп, антиген или лиганд независимо, т.е. это не требует кооперативного связывания эпитопа, антигена или лиганда другим связывающим доменом. Такой эпитоп, антиген или лиганд может быть встречающимся в природе или может представлять собой модификацию встречающегося в природе эпитопа, антигена или лиганда, или может быть синтетическим. "Вариабельная" часть отдельного вариабельного домена определяет главным образом специфичность связывания каждого конкретного отдельного вариабельного домена. Таким образом, термин "вариабельный" в контексте отдельных вариабельных доменов относится к тому факту, что вариабельность последовательности не распределена равномерно по отдельному вариабельному домену, а распределена главным образом между каркасными или скелетными частями отдельного вариабельного домена. Например, в отдельном вариабельном домене антитела вариабельность сконцентрирована в одном-трех сегментах, обычно известных как гипервариабельные участки (CDR). Один или более CDR могут быть распределены между каркасными областями (FR) легкой цепи или тяжелой цепи антитела с образованием либо отдельного вариабельного домена легкой цепи антитела, либо отдельного вариабельного домена тяжелой цепи антитела, соответственно, каждый из которых специфично связывает эпитоп независимо от другого связывающего домена. Сходную структуру имеет отдельный вариабельный домен Т-клеточного рецептора с одним-тремя CDR,распределенными между каркасными доменами Т-клеточного рецептора (TCR). Таким образом, вариабельные части, придающие специфичность связывания отдельным вариабельным доменам, могут значительно отличаться по последовательности от других отдельных вариабельных доменов, имеющих, по существу, такую же остальную каркасную часть, и, соответственно, могут иметь широкий спектр специфичностей связывания. Каркасы отдельных вариабельных доменов включают каркасные области антител, консенсусные каркасные области антител и каркасы, имеющие происхождение и/или полученные из бактериальных белков, например GroEl, GroEs, SpA, SpG, и из белков эукариот,например CTLA-4, липокалинов, фибронектина и т.п. Один источник вариабельных частей отдельных вариабельных доменов включает один или более CDR, которые могут быть перенесены на неиммуноглобулиновые каркасы, а также каркасные области антител с образованием отдельных вариабельных доменов антител. Другим источником разнообразия отдельного вариабельного домена может являться диверсификация выбранных положений в неиммуноглобулиновой каркасной области, такой как фибронектин,для образования отдельных вариабельных доменов с применением молекулярно-биологических методик,таких как NNK-разнообразие кодонов. Сходным образом, такой источник разнообразия также применим к отдельному вариабельному домену антитела. Отдельный вариабельный домен антитела может иметь происхождение от последовательностей,кодируемых и/или генерируемых продуцирующим антитело видом, и включает фрагмент (фрагменты) и/или производные вариабельной области антитела, включая одну или более каркасных областей или консенсусные последовательности каркасных областей, и/или один или более CDR. Соответственно, отдельный вариабельный домен антитела включает фрагмент (фрагменты) и/или производное (производные) вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, или области VHH антитела. Например, области VHH антитела включают эндогенные области представителей семейства верблюдовых, например верблюдов и лам, и рецептор нового антигена (NAR) акул-нянек и ковровых акул (Roux et al., 1998 PNAS 95(20): 11804-9) и область VH от пятнистой химеры (Rast et al.,1998, Immunogenetics 47:234-245). Вариабельные домены легкой цепи антитела и вариабельные домены тяжелой цепи антитела включают эндогенные домены видов животных, включая, предпочтительно без ограничения, человека, мышь, крысу, свинью, обезьян рода Cynomolgus, хомяка, лошадь, корову, козу,собаку, кошку и виды птиц, например, человеческий V-каппа и человеческий VH3 соответственно. Вариабельные области легкой цепи антитела и вариабельные области тяжелой цепи антитела также включают консенсусные каркасные области антител, как описано ниже, включая области из семейств Vобластей, таких как семейство VH3. Отдельный вариабельный домен Т-клеточного рецептора представляет собой отдельный вариабельный домен, имеющий происхождение от цепи (цепей) Т-клеточного рецептора, например, цепей , ,и , и связывающий эпитоп или антиген, или лиганд, независимо от другого связывающего домена для этого эпитопа, антигена или лиганда, аналогично отдельным вариабельным доменам антител. Отдельный вариабельный домен антитела также включает белковый домен, содержащий каркас, не имеющий происхождение от антитела или Т-клеточного рецептора, и который был создан посредством генной инженерии для того, чтобы демонстрировать разнообразие в специфичности связывания по сравнению с его состоянием до конструирования, включением в каркас одного или более из CDR1, CDR2 и/или CDR3, или их производного или фрагмента, или целого V-домена антитела. Отдельный вариабельный домен антитела может также включать как неимуноглобулиновый каркас, так и иммуноглобулиновые каркасы, как проиллюстрировано мультимерами отдельных вариабельных доменов GroEl, описанными ниже. Предпочтительно CDR имеют происхождение из V-домена антитела цепи антитела, например VH, VL и VHH. Цепь антитела может представлять собой цепь, специфично связывающую антиген или эпитоп вместе со второй цепью антитела, или цепь антитела может представлять собой цепь, специфично связывающую антиген или эпитоп независимо от второй цепи антитела, как, например, VHH. Интеграция одного или более CDR в отдельный вариабельный домен антитела, содержащий неиммуноглобулиновый каркас, должна приводить к способности вариабельного домена с неиммуноглобулиновым каркасом специфично связывать эпитоп или антиген, или лиганд, независимо от другого связывающего домена для этого эпитопа, антигена или лиганда. Отдельный домен трансформируют в отдельный вариабельный домен внесением разнообразия в область (области), разработанные, чтобы стать связывающими областями, с последующей селекцией желаемых характеристик связывания с применением, например, дисплейных технологий. Разнообразие может быть внесено в определенные области рассматриваемого неиммуноглобулинового каркаса рандомизацией аминокислотной последовательности определенных петель каркаса, например, введением кодонов NNK. Этот механизм генерирования разнообразия с последующей селекцией желаемых характеристик связывания сходен с природной селекцией высокоаффинных антиген-специфичных антител, являющейся результатом генерирования разнообразия в петлях, составляющих связывающую область антител в природе. В идеальном случае, отдельный домен, небольшой и содержащий конформацию, сходную с петлей антитела, трансформируют в отдельный вариабельный домен, варианты отдельного вариабельного домена экспрессируют, и из них могут быть выбраны отдельные вариабельные домены с же- 23020464 лаемыми специфичностями и характеристиками связывания, из библиотек, содержащих большое число вариантов отдельного вариабельного домена. Номенклатура отдельных вариабельных доменов: иногда отдельные вариабельные домены обозначают, опуская первую букву "d" или буквы "Dom", например, Ab7h24 идентичен dAb7h24, который идентичен DOM7h24. Под отдельным вариабельным доменом антител подразумевают складчатый полипептидный домен,содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Таким образом, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например,в которых одна или более петли были заменены последовательностями, не характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены, которые были процессированы или содержат N- или Сконцевые удлинения, а также складчатые фрагменты вариабельных доменов, сохраняющие, по меньшей мере частично, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена."Репертуар". Набор различных вариантов, например полипептидных вариантов, различающихся их первичной последовательностью. Библиотека, используемая в настоящем изобретении, будет включать репертуар полипептидов, содержащий по меньшей мере 1000 членов."Библиотека". Термин "библиотека" относится к совокупности гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека составлена из членов, каждый из которых имеет единственную полипептидную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты. В этой степени библиотека синонимична репертуару. Различия последовательностей между членами библиотеки обеспечивают разнообразие, присутствующее в библиотеке. Библиотека может принимать форму простой совокупности полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть в форме организмов или клеток, например бактерий, вирусов, клеток животных или растительных клеток и т.п., трансформированных в библиотеку нуклеиновых кислот. Предпочтительно каждый отдельный организм или клетка содержит только один или ограниченное число членов библиотеки. Преимущественно нуклеиновые кислоты введены в векторы экспрессии с целью сделать возможной экспрессию полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами. В предпочтительном аспекте, таким образом, библиотека может принимать форму популяции организмов-хозяев, каждый из которых содержит одну или более копии вектора экспрессии, содержащего один член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована для выработки ее соответствующего полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет возможность кодировать широкий репертуар генетически различных полипептидных вариантов."Мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией" описывает мультиспецифичный лиганд,как определено здесь, содержащий по меньшей мере два эпитопсвязывающих домена, как определено здесь. Термин "закрытая конформация" (мультиспецифичного лиганда) обозначает, что эпитопсвязывающие домены лиганда расположены таким образом, что связывание эпитопа одним эпитопсвязывающим доменом конкурирует со связыванием эпитопа другим эпитопсвязывающим доменом. Т.е. штатные эпитопы могут быть связаны каждым эпитопсвязывающим доменом по отдельности, но не одновременно. Закрытая конформация лиганда может быть получена с применением способов, описанных здесь."Антитело". Антитело (например, IgG, IgM, IgA, IgD или IgE) или фрагмент (такой как Fab, F(ab')2,Fv, связанный дисульфидными связями Fv, scFv, мультиспецифичное антитело с закрытой конформацией, связанный дисульфидными связями scFv, диатело), либо имеющие происхождение от любого вида,естественным образом продуцирующего антитело, либо созданные методом рекомбинантных ДНК; либо выделенные из сыворотки, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий."Лиганд с двойной специфичностью". Лиганд, содержащий первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, как определено здесь, где вариабельные домены способны связывать два разных антигена или два эпитопа на одном и том же антигене, которые обычно не связывает моноспецифичный иммуноглобулин. Например, два эпитопа могут быть расположены на одном и том же гаптене, но не являются одинаковыми или расположенными достаточно близко друг к другу для связывания одним моноспецифичным лигандом. Лиганды с двойной специфичностью по настоящему изобретению состоят из вариабельных доменов, имеющих разные специфичности, и не содержат пар взаимно комплементарных вариабельных доменов, имеющих одинаковую специфичность. Таким образом, лиганды с двойной специфичностью, которые, как определено здесь, содержат два отдельных вариабельных домена, являются подгруппой мультимерных лигандов,которые, как определено здесь, содержат два или более отдельных вариабельных домена, где по меньшей мере два из отдельных вариабельных доменов способны связывать два разных антигена или два разных эпитопа на одном и том же антигене. Кроме того, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь, также отличен от лиганда, содержащего отдельный вариабельный домен антитела и второй антиген- или эпитопсвязывающий домен, не являющийся отдельным вариабельным доменом. Кроме того,лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь, также отличен от лиганда, содержащего первый и второй антиген-/эпитопсвязывающий домен, где ни один антиген-/эпитопсвязывающий домен не является отдельным вариабельным доменом, как определено здесь."Антиген". Молекула, связываемая лигандом по настоящему изобретению. Обычно антигены связывают лиганды-антитела, и антигены способны вызывать гуморальный иммунный ответ in vivo. Он мо- 24020464 жет представлять собой полипептид, белок, нуклеиновую кислоту или другую молекулу. В большинстве случаев лиганды с двойной специфичностью по изобретению выбирают по специфичности в отношении мишени против двух определенных антигенов. В случае обычных антител и их фрагментов связывающая область антитела, определяемая вариабельными петлями (L1, L2, L3 и Н 1, Н 2, H3), способна связывать антиген."Эпитоп". Единица структуры, обычно связываемая иммуноглобулиновой парой VH/VL. Эпитопы определяют минимальную связывающую область для антитела и, таким образом, представляют собой мишень специфичности антитела. В случае отдельного домена антитела эпитоп представляет собой единицу структуры, связываемую вариабельным доменом в выделенном виде. Эпитопсвязывающий домен содержит белковый каркас и области, взаимодействующие с эпитопом (расположенные преимущественно на поверхности белкового каркаса). Эпитопсвязывающий домен может содержать области, взаимодействующие с эпитопом, являющиеся нелинейными, например, когда эпитопсвязывающий домен содержит несколько областей, взаимодействующих с эпитопом, между которыми есть перекрывающиеся области, например, CDR, разделенные FR, или которые расположены на отдельных полипептидных цепях. Альтернативно, эпитопсвязывающий домен может содержать линейную область, взаимодействующую с эпитопом, состоящую из кодируемых рядом друг с другом аминокислотных остатков на одной полипептидной цепи."Лиганд общего типа". Лиганд, связывающий все члены репертуара. В большинстве случаев он не связан через антигенсвязывающую область, как определено выше. Неограничивающие примеры включают белок А, белок L и белок G."Селекция". Полученный скринингом или полученный способом дарвиновской селекции, где связывающие взаимодействия происходят между доменом и антигеном или эпитопом или между антителом и антигеном или эпитопом. Таким образом, первый вариабельный домен может быть селектирован для связывания антигена или эпитопа в присутствии или в отсутствие комплементарного вариабельного домена."Универсальная каркасная область". Отдельная последовательность каркасной области антитела,соответствующей областям антитела, сохраняемым в последовательности, как определено Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services), или соответствующей репертуару человеческих иммуноглобулинов эмбрионального типа или структуре, как определено Chothia and Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196:910-917. Согласно изобретению предложено применение отдельной каркасной области или набора таких каркасных областей, которые, как было обнаружено, позволяют получить практически любую специфичность связывания посредством изменения только гипервариабельных областей. При использовании здесь "конъюгат" относится к композиции, содержащей антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающий сывороточный альбумин, связанный с лекарственным средством. При использовании здесь термин "малая молекула" обозначает соединение с молекулярной массой менее чем 1500 дальтон (Да), предпочтительно менее чем 1000 Да. Такие конъюгаты включают "конъюгаты лекарственных средств", содержащие антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающий сывороточный альбумин, с которым лекарственное средство связано ковалентно, и "нековалентные конъюгаты лекарственных средств", содержащие антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающий сывороточный альбумин, с которым лекарственное средство связано нековалентно. При использовании здесь "конъюгат лекарственного средства" относится к композиции, содержащей антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающий сывороточный альбумин, с которым лекарственное средство связано ковалентно. Лекарственное средство может быть ковалентно связано с антигенсвязывающим фрагментом непосредственно или косвенно посредством подходящей линкерной группировки. Лекарственное средство может быть связано с антигенсвязывающим фрагментом в любом подходящем положении, таком как N-конец, С-конец или через боковые цепи подходящих аминокислот (например, аминогруппу лизина)."Период полувыведения". Время, занимаемое снижением концентрации лиганда в сыворотке на 50% in vivo, например, вследствие деградации лиганда и/или клиренса, или секвестрации лиганда естественными механизмами. Лиганды по изобретению стабилизированы in vivo, и их период полувыведения увеличен связыванием с молекулами, препятствующими деградации и/или клиренсу, или секвестрации. Типично, такие молекулы представляют собой встречающиеся в природе белки, сами по себе имеющие длительный период полувыведения in vivo. Период полувыведения лиганда увеличен, если его функциональная активность сохраняется in vivo в течение более длительного периода, чем у сходного лиганда, не являющегося специфичным в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения. Таким образом, лиганд, специфичный в отношении HSA и молекулы-мишени, сравнивают с таким же лигандом без специфичности в отношении HSA, не связывающим HSA, но связывающим другую молекулу. Например, он может связывать второй эпитоп на молекуле-мишени. Типично, период полувыведения увеличен на 10, 20, 30, 40, 50% или более. Возможны увеличения в пределах 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 или более периодов полувыведения. Альтернативно, или в дополнение, возможны увеличения в пределах до 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 периодов полувыведения. Фраза "по существу, одинаковый" при использовании для сравнения периода полувыведения Тбета(Т) лиганда с периодом полувыведения Т сывороточного альбумина в организме-хозяине означает, что период полувыведения Т лиганда в организме-хозяине отличается от периода полувыведения Т сывороточного альбумина самого по себе в том же организме-хозяине, предпочтительно в человеке-хозяине,не более чем на 50%, например период полувыведения Т такого лиганда не более чем на 50% меньше или не более чем на 50% больше периода полувыведения Т сывороточного альбумина в указанном организме-хозяине. Предпочтительно применительно к фразе "по существу, одинаковый", период полувыведения Т лиганда в организме-хозяине отличается от периода полувыведения сывороточного альбумина самого по себе не более чем на 10-20% и более предпочтительно отличается от периода полувыведения сывороточного альбумина самого по себе не более чем на 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%, или менее, или вообще не отличается от периода полувыведения сывороточного альбумина самого по себе. Альтернативно, фраза "по существу, неодинаковый" при использовании для сравнения периода полувыведения Т лиганда с периодом полувыведения Т сывороточного альбумина в организме-хозяине означает, что период полувыведения Т лиганда в организме-хозяине отличается от периода полувыведения Т сывороточного альбумина самого по себе в том же организме-хозяине, предпочтительно в человеке-хозяине, по меньшей мере на 50%, например, период полувыведения Т лиганда более чем на 50% превышает период полувыведения Т сывороточного альбумина в указанном организме-хозяине."Гомогенное иммунологическое исследование". Иммунологическое исследование, где анализируемое вещество выявляют без необходимости в стадии разделения связанных и несвязанных реагентов."По существу, идентичный" или "по существу, гомологичный". Первая аминокислотная или нуклеотидная последовательность, содержащая достаточное число идентичных или эквивалентных (например, со сходной боковой цепью, например, консервативные аминокислотные замены) аминокислотных остатков или нуклеотидов по сравнению со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью таким образом, что первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности обладают одинаковыми активностями. В случае первого и второго антител и/или отдельных вариабельных доменов, описанных здесь, первое антитело или отдельный вариабельный домен имеет ту же специфичность связывания, что и первое, и обладает по меньшей мере 50% или по меньшей мере до 55, 60, 70, 75,80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аффинности первого антитела или отдельного вариабельного домена. При использовании здесь термины "условия низкой строгости", "условия средней строгости", "условия высокой строгости" или "условия очень высокой строгости" описывают условия гибридизации и промывания нуклеиновых кислот. Руководство по проведению реакций гибридизации может быть найдено в Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, что полностью включено сюда посредством ссылки. В этой ссылке описаны водные и неводные способы, любой из которых может быть использован. Названные здесь конкретные условия гибридизации представляют следующие: (1) условия гибридизации низкой строгости в 6 Х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при приблизительно 45C с двумя последующими промываниями в 0,2 Х SSC, 0,1% додецилсульфате натрия(SDS) при по меньшей мере 50C (температура промываний может быть увеличена до 55C для условий низкой строгости); (2) условия гибридизации средней строгости в 6 Х SSC при приблизительно 45C с последующим одним или более промываниями в 0,2 Х SSC, 0,1% SDS при 60C; (3) условия гибридизации высокой строгости в 6 Х SSC при приблизительно 45 С с последующим одним или более промываниями в 0,2 Х SSC, 0,1% SDS при 65C; предпочтительно (4) условия гибридизации очень высокой строгости представляют собой 0,5 М фосфат натрия, 7% SDS при 65C с последующим одним или более промываниями при 0,2 Х SSC, 0,1% SDS при 65 С. Условия очень высокой строгости (4) являются предпочтительными условиями, и их следует использовать, если не указано иное."Поверхностный плазмонный резонанс". Конкурентные исследования могут быть применены для определения того, конкурирует ли определенный антиген или эпитоп, такой как человеческий сывороточный альбумин, с другим антигеном или эпитопом, таким как сывороточный альбумин обезьян родаCynomolgus, за связывание с лигандом, связывающим сывороточный альбумин, описанным здесь, таким как специфичный dAb. Сходные конкурентные исследования могут быть применены для определения того, конкурирует ли первый лиганд, такой как dAb, со вторым лигандом, таким как dAb, за связывание антигена-мишени или эпитопа-мишени. При использовании здесь термин "конкурирует" относится к веществу, такому как молекула, соединение, предпочтительно белок, способному в той или иной степени препятствовать специфичному связывающему взаимодействию между двумя или более молекулами. Фраза "не оказывает конкурентного ингибирования" означает, что вещество, такое как молекула, соединение, предпочтительно белок, не препятствует в какой-либо измеримой или значимой степени специфичному связывающему взаимодействию между двумя или более молекулами. Специфичное связывающее взаимодействие между двумя или более молекулами предпочтительно включает специфичное связывающее взаимодействие между отдельным вариабельным доменом и его когнатным партнером или мишенью. Препятствующая или конкурирующая молекула может представлять собой другой отдельный вариабельный домен, или она может представлять собой молекулу, структурно и/или функционально сходную с когнатным партнером или мишенью. Отдельный вариабельный домен включает отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен, содержащий одну, две, три или более CDRобласти из вариабельного домена иммуноглобулина, такого как вариабельный домен антитела, включая отдельный вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела. Отдельный вариабельный домен может иметь происхождение от животного, включая человека, крысу, мышь, свинью, обезьяну, представителей семейства верблюдовых, как, например, вариабельная область (V-область) антитела, или он может иметь происхождение от микроорганизма, такого как Е.coli, в случае неммуноглобулинового каркасаGroEl и GroEs. Отдельный варибельный домен может быть частично или полностью искусственным или может быть образован с применением рекомбинантной молекулярно-биологической технологии.In vitro конкурентные анализы для определения способности отдельного вариабельного домена конкурировать за связывание мишени с другим связывающим мишень доменом, таким как другой отдельный вариабельный домен, а также для определения Kd, хорошо известны в данной области техники. Одним предпочтительным конкурентным исследованием является исследование поверхностного плазмонного резонанса, которое имеет преимущества быстроты, чувствительности и применимости к широкому спектру концентраций белка, и требует небольших количеств исследуемого материала. Предпочтительным конкурентным исследованием поверхностного плазмонного резонанса является конкурентный эксперимент Biacore. Конкурентный эксперимент Biacore может быть применен для определения, например, того, конкурируют ли сывороточный альбумин яванского макака и человеческий сывороточный альбумин за связывание с лигандом, таким как dAb DOM7h-x. Одним экспериментальным протоколом для такого примера является следующий. Например, после покрытия сенсорного чипа СМ 5 (Biacore AB) при 25C приблизительно 1000 резонансными единицами (RU) человеческого сывороточного альбумина (HSA), очищенное dAb наносят на антигенную поверхность в одной концентрации (например, 1 мкм) само по себе и в комбинации с серийными разведениями сывороточного альбумина яванского макака (CSA). Серийные разведения HSA смешивали с постоянной концентрацией (40 нМ) очищенного dAb. Подходящие серийные разведенияCSA могут начинаться с 5 мкМ CSA, с шестью двукратными разведениями до 78 нМ CSA. Этим растворам необходимо дать достичь равновесия перед нанесением. После нанесения получали считываемый ответ для измерения полученных RU связывания для dAb самого по себе в каждой из нескольких смесейdAb/CSA, по данным, использованным в соответствии с программным обеспечением для оценки BIA,строили кривую доза-ответ для каждого случая, когда CSA ингибировал связывание AlbudAb (dAb,специфично связывающего сывороточный альбумин) с чипом, на котором иммобилизирован HSA. При сравнении связанных RU dAb самого по себе со связанными RU dAb + CSA будет видно, конкурирует лиRU dAb, связанного с HSA, будут уменьшаться. Если конкуренции нет, то добавление CSA не будет влиять на количество dAb, связывающего HSA. Специалисту в данной области техники известно как адаптировать этот или другие протоколы для проведения этого конкурентного анализа на множестве различных лигандов, включая несколько лигандов, описанных здесь, связывающих сывороточный альбумин. Множество лигандов включает, без ограничения, мономерные отдельные вариабельные домены, включая отдельные вариабельные домены, содержащие иммуноглобулиновый и/или неиммуноглобулиновый каркас, dAb, лиганды с двойной специфичностью и мультимеры этих лигандов. Специалисту в данной области техники также известно как адаптировать этот протокол для сравнения связывания нескольких разных пар антигенов и/или эпитопов с лигандом с применением этого конкурентного исследования. В этих экспериментах можно установить числовое значение отсечки, по которому можно будет определить, конкурирует ли антиген или эпитоп с другим антиеном или эпитопом за связывание со специфичным лигандом, предпочтительно dAb. Например, если в описанном выше эксперименте 5 мкМ CSA в растворе приводят к 10% или менее снижению RU dAb, связанного с HSA, тогда признают отсутствие конкуренции за связывание. Соответственно, снижение RU связывания dAb с HSA в присутствии CSA более чем на 10% будет указывать на наличие конкуренции CSA за связывание dAb для связывания HSA. Снижение RU связывания dAb с HSA менее чем на 10% будет указывать на отсутствие конкуренции CSA за связывание dAb HSA, где снижения на 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 и 1% являются прогрессивно более строгими требованиями для выявления отсутствия конкуренции. Чем больше снижение RU связывания dAb с HSA,тем больше конкуренция. Таким образом, увеличивающиеся степени конкуренции могут быть расположены в соответствии с процентом снижения RU связывания с HSA, т.е. по меньшей мере 15, 20, 25, 30,35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или вплоть до 100% снижения. При использовании здесь фрагмент относится к менее чем 100% последовательности (например, до 99, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10% и т.д.), но содержащей 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25 или более смежных аминокислотных остатков. Фрагмент имеет длину, достаточную для сохранения интересующего связывания сывороточного альбумина с аффинностью 110-6 М или менее. При использовании здесь фрагмент также относится к возможным вставкам, делециям или заменам од- 27020464 ной или более аминокислот, существенно не меняющим способность измененного полипептида связывать отдельный домен антитела, выработанного против мишени. Число аминокислотных вставок, делеций или замен предпочтительно составляет до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70 аминокислот. Подробное описание изобретения Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, в котором их обычно понимают специалисты в данной области техники (например, в клеточной культуре, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, методиках гибридизации и биохимии). Стандартные методики применяют для молекулярных, генетических и биохимических способов (см., в целом, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. и Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4th Ed,John WileySons, Inc., которые включены сюда посредством ссылки), и химических способов. Стандартные методики для исследований поверхностного плазмонного резонанса включают Jan Terje Andersen et al. (2006), Eur. J. Immunol. 36:304-3051, Fagerstam (1991), Tech. Protein Chem. 2:65-71, и Johnsson etal. (1991), Anal. Biochem 198:268-277. Получение мультиспецифичных лигандов на основе иммуноглобулинов Лиганды с двойной специфичностью по изобретению, с открытой или закрытой конформацией в соответствии с желаемой формой изобретения, могут быть получены по установленным ранее методикам, используемым в области конструирования антител, для получения scFv, "фаговых" антител или других конструированных молекул антител. Методики получения антител и, в частности, биспецифичных антител, описаны, например, в следующих обзорах и приведенных там ссылках: WinterMilstein (1991),Nature 349:293-299; Plueckthun (1992), Immunological Reviews 130:151-188; Wright et al. (1992), Crit Rev.Hematother. 4, 463-470; Chester, K.A.Hawkins, R.E. (1995), Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom,H.R. (1997), Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997), Nature Biotechnol. 15, 618-619; Plckthun, A.Pack, P. (1997), Immunotechnology 3, 83-105; Carter, P.Merchant, A.M. (1997), Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P.Winter, G. (1997), Cancer Immunol. Immunother. 45,128-130. Согласно изобретению предложена селекция вариабельных доменов против двух разных антигенов или эпитопов и последующее комбинирование вариабельных доменов. В методиках, применяемых для селекции вариабельных доменов антител, используют библиотеки и способы селекции, известные в данной области техники. Естественные библиотеки (Marks et al. (1991), J.V-гены, полученные от человеческих В-клеток, хорошо известны специалистам в данной области техники. Синтетические библиотеки (HoogenboomWinter (1992), J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994), EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994), EMBO J.,13: 3245; De Kruif et al. (1995), J. Mol. Biol., 248: 97) получают клонированием V-генов иммуноглобулинов, обычно с применением ПЦР. Ошибки в процессе ПЦР могут привести к высокой степени рандомизации. Библиотеки VH и/или VL можно подвергать селекции против антигенов-мишеней или эпитоповмишеней по отдельности, в случае чего связывание отдельного домена селектируют непосредственно,или совместно. Предпочтительный способ получения лиганда с двойной специфичностью по настоящему изобретению включает применение системы селекции, где репертуар вариабельных доменов подвергают селекции на связывание первого антигена или эпитопа и репертуар вариабельных доменов подвергают селекции на связывание второго антигена или эпитопа. Селектированные первый и второй отдельные вариабельные домены затем комбинируют и лиганд с двойной специфичностью подвергают селекции на связывание как первого, так и второго антигена или эпитопа. Лиганды с закрытой конформацией подвергают селекции на связывание как первого, так и второго антигена или эпитопа по отдельности, но не одновременно. А. Векторные системы библиотек В данной области техники известно множество систем селекции, подходящих для использования в настоящем изобретении. Примеры таких систем описаны ниже. Системы экспрессии бактериофага лямбда могут быть подвергнуты скринингу непосредственно как бактериофагальные бляшки или как колонии лизогенов, в обоих случаях, как описано ранее (Huse et al.(1989), Science, 246: 1275; Caton и Koprowski (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87; Mullinax et al. (1990),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8095; Persson et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2432), и применимы в изобретении. В то время как такие системы экспрессии могут быть использованы для скрининга до 106 различных членов библиотеки, они не являются действительно подходящими для скрининга больших количеств (более чем 106 членов). Особенно полезными в конструировании библиотек являются дисплейные системы селекции, делающие возможным связывание нуклеиновой кислоты с экспрессируемым ею полипептидом. При использовании здесь дисплейная система селекции представляет собой систему, допускающую селекцию,- 28020464 подходящим дисплейным способом, отдельных членов библиотеки связыванием с лигандами общего типа и/или лигандами-мишенями. Селекционные протоколы для выделения желаемых членов больших библиотек известны в данной области техники, типичными примерами которых являются фаговые дисплейные методики. Такие системы, в которых различные пептидные последовательности представлены на поверхности нитчатого бактериофага (Scott и Smith (1990), Science, 249: 386), подтвердили свою полезность для создания библиотек фрагментов антител (и кодирующих их нуклеотидных последовательностей) для in vitro селекции и амплификации специфичных фрагментов антител, связывающих антиген-мишень (McCafferty et al., WO 92/01047). Нуклеотидные последовательности, кодирующие области VH и VL, связаны с фрагментами генов, кодирующими лидерные сигнальные последовательности, направляющие их в периплазматическое пространство Е.coli, и в результате получаемые фрагменты антител представлены на поверхности бактериофага, в большинстве как слитые белки с белками оболочки бактериофага (например, pIII илиpVIII). Альтернативно, фрагменты антител представлены снаружи на капсидах фага лямбда (фаготела). Преимущество основанных на фагах дисплейных систем состоит в том, что поскольку они являются биологическими системами, селектируемые члены библиотеки могут быть амплифицированы просто выращиванием фага, содержащего селектируемый член библиотеки, в бактериальных клетках. Кроме того, поскольку фаг или фагмидный вектор содержат на себе нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидный член библиотеки, секвенирование, экспрессия и последующая генетическая манипуляция относительно просты. Способы конструирования бактериофаговых дисплейных библиотек антител и библиотек экспрессии фага лямбда хорошо известны в данной области техники (McCafferty et al. (1990), Nature, 348: 552;et al. (1991), Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991), J. Immunol, 147: 3610; Breitling et al. (1991),Gene, 104: 147; Marks et al. (1991), supra; Barbas et al. (1992), supra; Hawkins and Winter (1992), J. Immunol,22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992), Science, 258: 1313, включенные сюда посредством ссылки). Один особенно выгодный подход представлял собой применение фаговых библиотек scFv (HustonMol. Biol., 222: 581; Chiswell et al. (1992), Trends Biotechnol., 10: 80; Marks et al. (1992), J. Biol. Chem.,267). Были описаны различные воплощения библиотек scFv, представленных на белках оболочки бактериофагов. Также известны усовершенствования фаговых дисплейных способов, например, как описано вWO 96/06213, WO 92/01047 (Medical Research Council et al.) и WO 97/08320 (Morphosys), включенных сюда посредством ссылки. Другие системы для образования библиотек полипептидов включают применение бесклеточного ферментного оборудования для in vitro синтеза членов библиотеки. В одном способе молекулы РНК селектируют поочередными раундами селекции против мишени и ПЦР-амплификацией (Tuerk и Gold(1990), Science, 249: 505; Ellington и Szostak (1990), Nature, 346: 818). Похожая методика может быть применена для идентификации последовательностей ДНК, связывающих предопределенный человеческий транскрипционный фактор (Thiesen и Bach (1990), Nucleic 4cids Res., 18: 3203; Beaudry и Joyce(1992), Science, 257: 635; WO 92/05258 и WO 92/14843). Похожим образом, in vitro трансляция может быть применена для синтеза полипептидов как способ образования больших библиотек. Эти способы, в большинстве случаев включающие стабилизированные полисомные комплексы, описаны, кроме того, вWO 88/08453, WO 90/05785, WO 90/07003, WO 91/02076, WO 91/05058 и WO 92/02536. В альтернативных дисплейных системах, не основанных на фагах, как, например, раскрытых в WO 95/22625 и WO 95/11922 (Affymax), используют полисомы для представления полипептидов для селекции. Еще одна категория методик включает селекцию репертуаров в искусственных компартментах, допускающих связь гена с его генным продуктом. Например, селекционная система, в которой нуклеиновые кислоты, кодирующие желаемые генные продукты, могут быть селектированы в микрокапсулах,сформированных эмульсиями типа "вода в масле", описана в WO 99/02671, WO 00/40712 и TawfikGriffiths (1998), Nature Biotechnol 16(7), 652-6. Генетические элементы, кодирующие генный продукт,имеющий желаемую активность, компартментализуют в микрокапсулах и затем транскрибируют и/или транслируют для образования их соответствующих генных продуктов (РНК или белка) в микрокапсулах. Генетические элементы, вырабатывающие генный продукт, имеющий желаемую активность, впоследствии хранят. В таком способе селектируют интересующие генные продукты выявлением желаемой активности множеством способов.