Модифицированный олигомер для уменьшения количества микрорнк в клетке

МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОЛИГОМЕР ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА микроРНК В КЛЕТКЕ Настоящее изобретение относится к олигомеру непрерывной последовательности длиной 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных единиц, используемому для уменьшения эффективного количества микроРНКмишени в клетке или организме, где олигомер является комплементарным последовательности микроРНК, выбранной из группы, состоящей из микроРНК с SEQ ID NO: 40-976, где по меньшей мере 70% нуклеотидных единиц олигомера выбраны из группы, состоящей из единиц ЗНК и 2'замещенных нуклеотидных аналогов, и где по меньшей мере 50% нуклеотидных единиц олигомера представляют собой единицы ЗНК, и где по меньшей мере одной из имеющихся межнуклеозидных связей между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности является фосфоротиоатная межнуклеозидная связь, и к применению указанного олигомера для лечения гепатита С и гиперхолистеринемии и связанных с ними нарушений. Область изобретения Настоящее изобретение относится к очень коротким олигонуклеотидам, ингибирующим микроРНКin vivo, мишенью для которых являются микроРНК, и к их применению в лекарственных средствах и фармацевтических композициях. Уровень изобретения МикроРНК (миРНК) представляют собой многочисленный класс коротких эндогенных РНК, которые действуют как посттранскрипционные регуляторы генной экспрессии путем спаривания оснований с их целевой матричной РНК (мРНК). Они процессируются из более длинных (около 70-80 нуклеотидов(нт шпилькообразных предшественников, называемых пре-миРНК, посредством дайсер-фермента РНКазы III. Сборка микроРНК происходит в рибонуклеопротеиновых комплексах, называемых miRNP,при этом миРНК распознают свои участки-мишени посредством антисмысловой комплементарности,что, таким образом, содействует даун-регуляции их генов-мишеней. Почти совершенная или совершенная комплементарность между миРНК и ее сайтом-мишенью приводит к гидролизу мРНК-мишени, тогда как ограниченная комплементарность микроРНК и ее сайта-мишени приводит к трансляционному ингибированию гена-мишени. Сущность роли микроРНК в заболеваниях человека и ингибирование микроРНК с использованием одноцепочечных олигонуклеотидов рассмотрены в патентах WO 2007/112754 и WO 2007/112753, которые оба полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Патент WO 2008046911,включенный в настоящее описание посредством ссылки, описывает последовательности микроРНК, связанные с раковыми заболеваниями. Существует связь многих микроРНК с фенотипами заболеваний, и поэтому желательно получить вещества, способные модулировать доступность микроРНК in vivo. В патентах WO 2007/112754 и WO 2007/112753 раскрыты короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, для которых предполагается образование мощных дуплексов с миРНК-мишенью. Согласно патентам WO 2007/112754 и WO 2007/112753 раскрытые в них последовательности SEQ ID NO: 1-45 представляют собой примеры антимикроРНК олигонуклеотидов. Родственные заявки В настоящей заявке испрашивается приоритет четырех заявок: US60/977497, поданной 4 октября 2007 г., US60/979217, поданной 11 октября 2007 г., US61/028062, поданной 12 февраля 2008 г., и ЕР 08104780, поданной 17 июля 2008 г., все из которых включены со ссылкой в настоящее изобретение посредством ссылки. Кроме того, авторы ссылаются на патенты WO 2007/112754 и WO 2007/112753,которые являются более ранними заявками этих же заявителей, и включают их в настоящее изобретение посредством ссылки. Сущность изобретения Настоящее изобретение основано на открытии, что использование очень коротких олигонуклеотидов, нацеленных на микроРНК и имеющих высокое соотношение нуклеотидных аналогов нуклеотидов,таких как ЗНК-нуклеотидов (замкнутых нуклеиновых кислот (LNA, является высокоэффективным для облегчения репрессии РНК, таких как мРНК, посредством нацеленных микроРНК in vivo. Настоящее изобретение относится к олигомеру непрерывной последовательности длиной 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных единиц, используемому для уменьшения эффективного количества микроРНК-мишени в клетке или организме, где олигомер является комплементарным последовательности микроРНК, выбранной из группы, состоящей из микроРНК с SEQ ID NO: 40-976, где по меньшей мере 70% нуклеотидных единиц олигомера выбраны из группы, состоящей из единиц ЗНК (замкнутой нуклеиновой кислоты) и 2'-замещенных нуклеотидных аналогов, и где по меньшей мере 50% нуклеотидных единиц олигомера представляют собой единицы ЗНК, и где по меньшей мере одной из имеющихся межнуклеозидных связей между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности является фосфоротиоатная межнуклеозидная связь. Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором все межнуклеозидные связи, расположенные между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности, являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями. Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором длина олигомера составляет 7, 8 или 9 непрерывных нуклеотидов, где все непрерывные нуклеотидные единицы независимо выбраны из группы, состоящей из единиц ЗНК и 2'-замещенных нуклеотидных аналогов. Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором по меньшей мере 70% нуклеотидных единиц олигомера представляют собой единицы ЗНК. Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором все нуклеотидные единицы представляют собой единицы нуклеотидных аналогов. Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором все межнуклеозидные связи, расположенные между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности, являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями. Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором единицы нуклеотидных аналогов выбраны из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК, 2'-ОМе-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК,ЗНК и 2'-МОЕ-РНК. Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором все нуклеотидные единицы представляют собой единицы ЗНК. Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области hsa-miR-122 с SEQ ID NO: 150. Настоящее изобретение относится к применению олигомера по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения клинического нарушения или заболевания, выбранного из группы,состоящей из гепатита С и гиперхолестеринемии и связанных с ними нарушений. Настоящее изобретение относится к способу in vitro уменьшения количества миРНК в клетке,включающему введение в клетку, которая экспрессирует указанную миРНК, олигомера по изобретению. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Схематическое отображение 8-мерных ЗНК-антимикроРНК: miR-21, miR-155 и miR-122, с указанием положений мишеней с полной ЗНК-модифицированной и фосфоротиолированной ЗНК-антиmiR. Также обозначены предпочтительные положения гибридизации для 7-мерных, 8-мерных, 9-мерных и 10-мерных олигонуклеотидов ЗНК на зрелой микроРНК. Фиг. 2. Оценка антагонизма miR-21 с помощью SEQ ID NO: 3205 и SEQ ID NO: 3204 ЗНК-анти-miR в клетках MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) с использованием люцифераза-сенсорного анализа. Клетки MCF-7 котрансфицировали люцифераза-чувствительными плазмидами, содержащими полностью совпадающий сайт-мишень для miR-21 или ошибочный сайт-мишень (mm2) и ЗНК-анти-miR в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Все показанные средние значения соотношения люцифераз Renilla/светлячка в трех отдельных экспериментах (черта сверху = стандартная ошибка среднего s.e.m.) были стандартизованы по 0 нМ psiCHECK2 (=контроль). Фиг. 3. Оценка антагонизма miR-21 с помощью SEQ ID NO: 3205 и SEQ ID NO: 3204 ЗНК-анти-miR в клетках HeLa с использованием люцифераза-сенсорного анализа. Клетки HeLa были котрансфицированы люцифераза-чувствительными плазмидами, содержащими полностью совпадающий сайт-мишень дляmiR-21 (mir-21) или ошибочный сайт-мишень (mm2) и ЗНК-анти-miR в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Все показанные средние значения соотношения люцифераз Renilla/светлячка в трех отдельных экспериментах (черта сверху = s.e.m.) были стандартизованы по 0 нМ psiCHECK2 (=контроль). Фиг. 4. Оценка антагонизма miR-155 с помощью с SEQ ID NO: 3206 и SEQ ID NO: 3207 ЗНК-антиmiR в обработанных ЛПС (липополисахаридом) мышиных клетках RAW с использованием люциферазасенсорного анализа. Клетки RAW были котрансфицированы miR-155 и разными ЗНК-анти-miR в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Все показанные средние значения соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ psiCHECK2. Фиг. 5. Оценка антагонизма miR-122 с помощью с SEQ ID NO: 3208 и SEQ ID NO: 4 ЗНК-анти-miR в клетках HuH-7 с использованием люцифераза-сенсорного анализа. Клетки HuH-7 котрансфицировали люцифераза-чувствительной miR-122, содержащей полностью совпадающий сайт-мишень miR-122 и отличающиеся ЗНК-анти-miR в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Все показанные средние значения соотношения люцифераз Renilla/светлячка в трех отдельных экспериментах (черта сверху = s.e.m.) были стандартизованы по 0 нМ psiCHECK2(=контроль). Фиг. 6. Схематическое представление репортерных конструкций miR-21-люциферазы. Фиг. 7. Оценка антагонизма miR-21 с помощью 8-мерных ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3205) по сравнению с 15-мерными ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3204) в клетках РС 3 с использованием люцифераза-сенсорного анализа. Клетки РС 3 были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий сайт-мишень miR-21 или ошибочный сайт-мишень и ЗНКанти-miR при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = s.e.m.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени(=контроль). Также показано схематическое представление последовательности miR-21 и конструкция и положение замкнутых нуклеиновых кислот ЗНК-анти-miR. Нуклеотиды ЗНК обозначены овалами, и остатки ДНК обозначены черточками. Фиг. 8. Оценка специфичности антагонизма miR-21 с помощью 8-мерных ЗНК-анти-miR в клеткахHeLa с использованием анализа с люциферазным репортером. Клетки HeLa котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий или ошибочный сайтмишень для miR-21 и ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3205) или 8-мерный ЗНК-ошибочный контрольный олигонуклеотид (SEQ ID NO: 3218) при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = s.e.m.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности miR-21 и конструкция и положение замкнутых нуклеиновых кислот ЗНК-анти-miR. Несовпадения обозначены черными овалами. Фиг. 9. Оценка возможной наиболее короткой длины полностью ЗНК-модифицированной ЗНК-2 019939 анти-miR, которая содействует эффективному антагонизму miR-21. Клетки HeLa были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий или ошибочный сайт-мишень для miR-21 и ЗНК-анти-miR при разных концентрациях (SEQ ID NO: 3209 = 6-мерная и SEQ ID NO: 3210 = 7-мерная). Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = s.e.m.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени(=контроль). Также показано схематическое представление последовательности miR-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 10. Оценка длины полностью ЗНК-замещенных ЗНК-анти-miR, которые являются антагонистами miR-21. Клетки HeLa котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий или ошибочный сайт-мишень для miR-21 и ЗНК-анти-miR при разных концентрациях (SEQ ID NO: 3211 = 9-мерная, SEQ ID NO: 3212 = 10-мерная, SEQ ID NO: 3213 = 12 мерная и SEQ ID NO: 3214 = 14-мерная). Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = s.e.m.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайтамишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности miR-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 11. Определение наиболее оптимального положения для 8-мерных ЗНК-анти-miR в распознаваемой последовательности-мишени miR. Клетки HeLa были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий или ошибочный сайт-мишень для miR21 и ЗНК-анти-miR при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = s.e.m.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности miR-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 12. Признание взаимодействия Pdcd4-3'-UTR и miR-21 с помощью 8-мерных SEQ ID NO: 3205 ЗНК-анти-miR. Клетки HeLa котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей часть 3'UTR из гена Pdcd4 и ЗНК-анти-miR при разных концентрациях (SEQ ID NO: 3205 = 8-мерные,полностью совпадающие; SEQ ID NO: 3218 = 8-мерные, ошибочные; SEQ ID NO: 3204 = 15-мерные,смесь ЗНК/ДНК; SEQ ID NO: 3220 = 15-мерные, с разрывом (gapmer. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны соотношения люцифераз Renilla/светлячка, стандартизованные по 0 нМ. Также показано схематическое представление последовательности miR-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 13. Сравнение 8-мерной ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3207) с 15-мерной ЗНК-анти-miR (SEQ IDNO: 3206) в отношении антагонизма к miR-155 в мышиных клетках RAW. Мышиные клетки RAW котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающиеmiR-155 и разные ЗНК-анти-miR в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = s.e.m.) трех независимых экспериментов,в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени miR-155 (=контроль). Также показано схематическое представление последовательностиmiR-155 и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 14. Оценка с/EBPer ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3207) с 15-мерной ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3206) в отношении антагонизма к miR-155 в клетках RAW мыши. Клетки RAW мыши были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полное совпадение к miR-155, и через 20 ч клетки собирали и анализировали белковые экстракты из клеток RAW с помощью вестернблоттинга. Обозначены разные изоформы с/ЕВР, и ниже показаны соотношения, вычисленные поNO: 3221) ЗНК-анти-miR или 15-мерной (SEQ ID NO: 3228) анти-miR с чередующимися короткими участками (миксмер). Клетки HeLa были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами,содержащими полные совпадения для miR-106b и отличающиеся ЗНК-анти-miR при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения четырех репликаций, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени миРНК (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности miR-106b и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 16. Антагонизм miR-19b с помощью полностью ЗНК-модифицированной 8-мерной (SEQ IDNO: 3222) ЗНК-анти-miR и 15-мерной (SEQ ID NO: 322 9) анти-miR с чередующимися короткими участками. Клетки HeLa были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полные совпадения для miR-19 а и две ЗНК-анти-miR в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения четырех репликаций, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишениmiR-19a (=контроль). Показано также схематическое представление последовательности miR-19a и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 17. Схематическое изображение, показывающее зрелые человеческие последовательностиmiR-221 и miR-222. В квадрате показана исходная последовательность (7-мерная), которая сохранена в обеих последовательностях миРНК. Фиг. 18. Направленное воздействие на семейство микроРНК с использованием короткой, полностью ЗНК-замещенной ЗНК-анти-miR. Клетки РС 3 котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами для miR-221 и miR-222 раздельно или вместе и с разным ЗНК-анти-miR при варьирующих концентрациях. При котрансфекции ЗНК-анти-miR (15-мерными) SEQ ID NO: 3223 (против miR-221) иSEQ ID NO: 3224 (против miR-222) общая концентрация составляла 2 нМ (1 нМ каждой), а при трансфекции клеток SEQ ID NO: 3225 (7-мерной) концентрации составляли 0, 1, 5, 10 или 25 нМ. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху =s.e.m.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени миРНК (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности miR-221/222 и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 19. Оценка уровней белка р 27 как функционального показателя антагонизма семейства miR221/222 с помощью 7-мерной SEQ ID NO: 3225 ЗНК-анти-miR. Клетки РС 3 трансфицировали 7-мерной ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3225, направленной и на miR-221, и на miR-222 при варьирующих концентрациях. Через 24 ч клетки собирали и измеряли уровни белка с помощью вестерн-блоттинга. Показаны соотношения р 27/тубулин. Фиг. 20. Оценка антагонизма miR-21 с помощью 8-мерной ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3205) по сравнению с 15-мерной ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3204) и 8-мерной последовательностью с 2 ошибками (SEQ ID NO: 3218) в клетках HepG2 с использованием анализа с люциферазным репортером. КлеткиHepG2 котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей полностью совпадающий сайт-мишень miR-21 и ЗНК-анти-miR в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = s.e.m.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Показано также схематическое представление последовательности miR-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 21. Признание взаимодействия Pdcd4 3'UTR и miR-21 с помощью 8-мерной SEQ ID NO: 3205 ЗНК-анти-miR по сравнению с 15-мерной (SEQ ID NO: 3204) и 8-мерной последовательности с двумя несоответствиями (SEQ ID NO: 3218). Клетки Huh-7 котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей часть 3'UTR из гена Pdcd4, пре-miR-21 (10 нМ) и ЗНК-анти-miR при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = s.e.m.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз Renilla/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности miR-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-miR. Фиг. 22. Антагонизм miR-21 посредством SEQ ID NO: 3205 приводит к увеличению уровня белкаPdcd4. Клетки HeLa трансфицировали 5 нМ ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3205 (полностью совпадающей),или скремблированной SEQ ID NO: 3219 ЗНК (8-мерной) или SEQ ID NO: 3218 (8-мерной несоответствующей). Через 24 ч клетки собирали и проводили вестерн-блоттинг с антителом Pdcd4. Фиг. 23. Уровни АЛТ (аланинаминотрансферазы) и ACT (аспартатаминотрансферазы) у мышей, которым вводили SEQ ID NO: 3205 (полностью совпадающую) или SEQ ID NO: 3218 (контрольную, несоответствующую). Мышей умерщвляли через 14 дней и после введения 25 мг/кг через день. Фиг. 24. Оценка уровней белка PU.1 как функционального показателя антагонизма miR-155 с помощью короткой ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3207). Клетки ТНР-1 котрансфицировали пре-miR-155 (5 нмоль) и добавляли разные олигонуклеотиды ЗНК (5 нМ) и 100 нг/мл ЛПС. Через 24 ч клетки собирали и способом вестерн-блоттинг анализировали экстракты белка из клеток ТНР-1. Обозначены PU.1 и тубулин. Фиг. 25. Оценка уровней белка р 27 как функционального показателя антагонизма семейства miR221/222 с помощью 7-мерной SEQ ID NO: 3225 ЗНК-анти-miR. Клетки РС 3 были трансфицированы 7-мерной ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3225, направленной и наmiR-221, и на miR-222 и в качестве контроля скремблированной ЗНК в количестве 5 и 25 нМ. Через 24 ч клетки собирали и измеряли уровни белка с помощью вестерн-блоттинга. Показаны соотношения р 27/тубулин. Фиг. 26. Нокдаун miR-221/222 посредством 7-мерной SEQ ID NO: 3225 (полностью совпадающей) ЗНК-анти-miR уменьшает образование колоний клеток РС 3 на мягком агаре. Клетки РС 3 трансфицировали 25 нМ 7-мерной ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3225, направленной наmiR-221 и на miR-222 или на 7-мерную скремблированную контрольную последовательность (SEQ IDNO: 3231). Через 24 ч клетки собирали и высевали на мягкий агар. Подсчет колоний проводили через 12 дней. Один эксперимент проводили три раза. Фиг. 27. Обзор семейства человеческого let-7 и тестированных антагонистов (вверху). Последовательности представляют зрелую миРНК для каждого участника, в квадрате показаны нуклеотиды 2-16, и ЗНК-анти-miR обычно являются антагонистами для указанных положений. Колонки справа показывают число нуклеотидных отличий по сравнению с let-7a, в пределах исходной (S: положение 2-8), расширенной исходной (ES; положение 2-9) и остающейся последовательности, которые обычно являются мишенью для ЗНК-анти-miR (NE; положение 9-16), соответственно. Нуклеотиды, выделенные белым на черном фоне, являются измененными по сравнению с let-7a (ниже). Обобщены данные тестированных антагонистов против семейства let-7, включающие информацию о конструкции, длине и абсолютно комплементарных мишенях. Все соединения являются полностью фосфоротиолированными. Фиг. 28. Оценка антагонизма let-7 с помощью шести разных ЗНК-анти-miR в клетках Huh-7, с помощью анализа с люциферазным репортером. Клетки Huh-7 котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами, содержащими частичный ген HMGA2 3'UTR (с четырьмя let-7 сайтами связывания), с предшественником let-7 а или без (серые и черные столбцы, соответственно), и с 6 разными ЗНКанти-miR при возрастающих концентрациях. Клетки собирали через 24 часа и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения соотношений Renilla/светлячка для двукратных измерений и допустимые отклонения в каждом анализе. В каждой группе ЗНК-анти-miR все отношения были стандартизированы по среднему числу лунок, не содержащих предшественник let-7a (черные столбцы). Фиг. 29. Результаты люциферазного анализа клеток Huh-7, трансфицированных сенсорной плазмидой HMGA2 3'UTR, нуклеиновыми кислотами ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3226 (слева) и SEQ ID NO: 3227 (справа) и предшественником-miR (пре-miR) для let-7a (A), let-7d (B), let-7e (С) и let-7i (D). Серые столбцы показывают целевую дерепрессию после включения предшественников mi, a черные столбцы контроля отображают эквивалентный уровень без добавления пре-miR. Каждое соотношение показано на основе четырехкратных измерений и стандартизировано по среднему числу лунок, не содержащих предшественника (черные столбцы) в каждой группе введения. Фиг. 30. Результаты люциферазного анализа клеток HeLa, трансфицированных сенсорной плазмидой HMGA2 3'UTR или контрольным вектором, и ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3227 в разных концентрациях. Каждое соотношение показано на основе четырехкратных измерений и стандартизировано по пустому контрольному вектору без введения (0 нМ) (psi-CHECK-2; серые столбцы). Фиг. 31. Оценка антагонизма miR-21 с помощью 8-мерной (SEQ ID NO: 3205) в клетках НСТ 116 в анализе с люциферазной репортерной плазмидой. Клетки НСТ 116 котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей полностью совпадающий сайт-мишень miR-21 (серые столбцы) и ЗНК-анти-miR и контрольные олигонуклеотиды в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показан один типичный пример из двух, в котором соотношения Renilla/светлячка стандартизированы по пустому вектору 0 нМ (= черные столбцы). Фиг. 32. Сайленсинг miR-21 с помощью 8-мерной SEQ ID NO: 3205 ЗНК-анти-miR уменьшает образование колоний в мягком агаре в клетках РС 3. Клетки РС 3 были трансфицированы 25 нМ 8-мерной ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3205, нацеленной на miR-21. Через 24 ч клетки собирали и высевали на мягком агаре. Подсчет колоний проводили через 12 дней. Показаны средние значения в трех отдельных экспериментах, каждый из которых проводили трижды, и указанные значения стандартизированы по контролю 0 нМ (то есть трансфекция, но без ЗНК). р=0,01898 для SEQ ID NO: 3205. Фиг. 33. Нокдаун miR-21 посредством 8-мерной SEQ ID NO: 3205 ЗНК-анти-miR уменьшает образование колоний клеток HepG2 на мягком агаре. Клетки HepG2 трансфицировали 25 нМ 8-мерной ЗНКанти-miR SEQ ID NO: 3205, направленной на miR-21. Через 24 ч клетки собирали и высевали на мягкий агар. Подсчет колоний проводили через 17 дней. Показаны средние значения из трех повторов одного эксперимента (черта сверху = SEM). Фиг. 34. Закрытие раны в инвазивной клеточной линии РС 3 простаты человека после введения SEQ(8-мерной, ошибочной) и на следующий день наносили экскориацию. Через 24 ч делали снимки для контроля миграции. (В) В каждой точке времени измеряли зону с помощью программного обеспечения Image J и стандартизировали по соответствующей точке времени 0 ч. Фиг. 35. Оценка длины полностью ЗНК-замещенных ЗНК-анти-miR, которые являются антагонистами для miR-155. Клетки RAW котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей полностью совпадающий сайт-мишень miR-155, и олигонуклеотидами ЗНК-анти-miR при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = s.e.m) для трех независимых экспериментов, где соотношения Renilla/светлячка были стандартизированы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (= mock). Также показано схематическое представление последовательности miR и конструкция и положения ЗНК-анти-miR. Фиг. 36. Связывание меченной 5'-FAM (флуорофор карбоксифлуоресцеин) ЗНК-анти-miR-21 (SEQID NO: 3205) с мышиным белком плазмы. (А) % несвязанного соединения ЗНК-анти-miR-21 в зависимости от концентрации олигонуклеотида в плазме мыши. (В) Концентрация несвязанного соединения 3 НК-5 019939 анти-miR-21 SEQ ID NO: 3205 в зависимости от концентрации 3205 в плазме мыши. Фиг. 37. Количественный вестерн-блот анализ уровней белка Ras.A. Изображение геля, показывающее белки Ras и тубулин (внутренний стандарт) в образцах легкого и почки, обработанных (анти-let-7; 8-мерной) по сравнению с необработанными (солевой раствор). В. Количественные анализы уровней белка Ras в легком и почке, соответственно, у мышей после введения ЗНК-анти-miR (черные столбцы), стандартизированные по эквивалентным контрольным образцам (введение солевого раствора - серые столбцы), с использованием тубулина в качестве контроля равномерного внесения.B. Сайленсинг miR-21 посредством SEQ ID NO: 3205 приводит к возрастанию уровней белка Pdcd4C. Мышам вводили солевой раствор или ЗНК-анти-miR в дозе 25 мг/кг (SEQ ID NO: 3205) на протяжении 14 дней через день, в общей сложности в 5 доз. Мышей умерщвляли, выделяли белок из почки и подвергали его вестерн-блот анализу с антителом Pdcd4. А. Изображение геля, показывающее белкиPdcd4 и Gapdh (внутренний стандарт) в образцах почки (M1, мышь 1; М 2, мышь 2), обработанных (антиmiR-21; 8-мерной) по сравнению с необработанными (солевой раствор). В. Количественный анализ уровня белка Pdcd4 в почках мышей, обработанных ЗНК-анти-miR (темно-серые столбцы), стандартизированного по среднему уровню эквивалентного введения контрольного солевого раствора (светло-серые столбцы), используя Gapdh в качестве контрольного внесения. Подробное описание изобретения Короткие олигонуклеотиды, включающие ЗНК, известны в области реагентов in vitro (см., например, патенты WO 2005/098029 и WO 2006/069584). Вместе с тем, молекулы, разработанные для диагностики или использования в качестве реагентов, значительно отличаются по конструкции от молекул,применяемых in vivo или для фармацевтического использования. Например, терминальными нуклеотидами реагента олиго обычно являются не ЗНК, а ДНК, и межнуклеозидные связи обычно не являются фосфоротиоатными, представляющими собой предпочтительную связь для использования в олигонуклеотидах по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение рассматривает, по существу, новый класс олигонуклеотидов (упоминаемых здесь как олигомеры). Следующие варианты осуществления относятся к конкретным вариантам осуществлениям олигомера по настоящему изобретению, который можно применять в фармацевтической композиции. Аспекты, относящиеся к олигомеру, могут также относиться к смежной последовательности нуклеотида, и наоборот. Олигомер. Олигомер по настоящему изобретению представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид, который содержит нуклеотидные аналоги, такие как ЗНК, которые образуют часть нуклеотидной последовательности или всю непрерывную нуклеотидную последовательность олигонуклеотида. Нуклеотидная последовательность олигомера состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности. Термин "олигонуклеотид" (или просто "олиго"), который используется попеременно с термином"олигомер", в контексте настоящего изобретения относится к молекуле, образованной ковалентной связью двух или нескольких нуклеотидов. Термин "олигонуклеотид", используемый в контексте олигонуклеотида по изобретению (который также относится к одноцепочечному олигонуклеотиду), в одном варианте осуществления может иметь, например, от 7 до 10 нуклеотидов, например в отдельных вариантах осуществления 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. Термин "нуклеотид" относится к нуклеотидам, таким как ДНК и РНК, и к нуклеотидным аналогам. Необходимо признать, что в некоторых аспектах также можно использовать термин "нуклеиновое основание" для описания нуклеотида, который может быть природного или искусственного происхождения,то есть в этом отношении термины нуклеиновое основание и нуклеотид можно использовать в настоящем изобретении попеременно. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 7 нуклеотидных аналогов. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотида состоит из 8 нуклеотидных аналогов. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 9 нуклеотидных аналогов. В одном варианте осуществления по меньшей мере около 50% нуклеотидов в олигомере являются нуклеотидными аналогами, например по меньшей мере около 55%, например по меньшей мере около 60 или по меньшей мере около 65%, или по меньшей мере около 70%, например по меньшей мере около 75%, например по меньшей мере около 80%, например по меньшей мере около 85%, например по меньшей мере около 90%, например по меньшей мере около 95% или, например, 100%. Также будет очевидно, что олигонуклеотид может содержать последовательность нуклеотидов, которая состоит только из нуклеотидных аналогов. Соответственно, олигомер может содержать по меньшей мере один мономер ЗНК, например 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9 или 10 мономеров ЗНК. Как описано ниже, непрерывная последовательность нуклеотида может состоять только из единиц ЗНК (включая связывающие группы, такие как фосфоротиоатные связи),или может состоять из элементов ЗНК и ДНК, или из ЗНК и других нуклеотидных аналогов. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов содержит или один, или два ДНК-нуклеотида, и остальные нуклеотиды являются нуклеотидными аналогами, такими как указанные ЗНК. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 6 нуклеотидных аналогов и единственного ДНК-нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления непрерывный нуклеотид состоит из 7 аналогов нуклеотида и единственного ДНК-нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 8 нуклеотидных аналогов и единственного ДНК-нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 9 нуклеотидных аналогов и единственного ДНК-нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 7 нуклеотидных аналогов и двух ДНК-нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 8 нуклеотидных аналогов и двух ДНК-нуклеотидов. Олигомер может состоять из непрерывной последовательности нуклеотидов. В особенно предпочтительном варианте осуществления все нуклеотидные аналоги представляют собой ЗНК. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления все нуклеотиды в олигомере являются ЗНК. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления все нуклеотиды в олигомере являются ЗНК, и все межнуклеозидные связывающие группы являются фосфоротиоатными. Согласно настоящему изобретению термин "азотистое основание" охватывает пурины и пиримидины, такие как ДНК-основания А-аденин, С-цитозин, Т-тимин и G-гуанин, РНК-основания А, С, U-урацил и G, а также не-ДНК/РНК нуклеиновые основания, такие как 5-метилцитозин (MeC), изоцитозин, псевдоизоцитозин, 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропинил-6-фторурацил, 5-метилтиазолурацил, 6 аминопурин, 2-аминопурин, инозин, 2,6-диаминопурин, 7-пропин-7-деазааденин, 7-пропин-7 деазагуанин и 2-хлор-6-аминопурин, в частности MeC. Подразумевается, что фактический выбор не-ДНК/РНК нуклеиновых оснований будет зависеть от соответствующего (или комплементарного) нуклеотида, расположенного в цепочке микроРНК, которая считается мишенью для олигонуклеотида. Например, если соответствующим нуклеотидом является G,обычно необходимо выбирать не-ДНК/РНК основание, которое может образовывать водородные связи сG. В этом конкретном случае, где соответствующим нуклеотидом является G, типичным примером предпочтительного не-ДНК/РНК основания является MeC. Необходимо понимать, что понятие "в одном варианте осуществления" не обязательно должно ограниченно относиться к одному конкретному варианту осуществления, но может относиться к признаку,который может присутствовать в "некоторых вариантах осуществления" или даже служить родовым признаком изобретения. Аналогично, использование понятия "некоторые варианты осуществления" может иметь место для описания признака одного конкретного варианта осуществления или группы вариантов осуществления или даже быть родовым признаком изобретения. Понятия "соответствующий чему-либо" и "соответствовать" относятся к сравнению нуклеотидной последовательности олигомера или непрерывной нуклеотидной последовательности (первая последовательность) с эквивалентной непрерывной нуклеотидной последовательностью другой последовательности, выбираемой из i) суб-последовательности обратно комплементарной нуклеиновой кислоты микроРНК-мишени (например, микроРНК-мишени, выбираемая из последовательностей SEQ ID NO: 40-976,и/или ii) последовательности нуклеотидов, рассматриваемой в настоящем изобретении, такой как группа,состоящая из SEQ ID NO: 977-1913, или SEQ ID NO: 1914-2850, или SEQ ID NO: 2851-3787. Нуклеотидные аналоги сравнивают непосредственно с их эквивалентными или соответствующими нуклеотидами. Первая последовательность, которая соответствует другой последовательности из пп. i) или ii), обычно идентична указанной последовательности по длине первой последовательности (например, непрерывной нуклеотидной последовательности). Длина нуклеотидной молекулы, как указано в изобретении, соответствует числу мономерных единиц, то есть нуклеотидов, безотносительно того, являются ли эти мономерные единицы нуклеотидами или нуклеотидными аналогами. Что касается нуклеотидов или нуклеиновых оснований, термины мономер и единица используются в настоящем изобретении попеременно. Подразумевается, что понятие "около", используемое в настоящем раскрытии в контексте конкретных значений или диапазонов значений, включает конкретное значение или упоминаемый диапазон. Используемый в настоящем изобретении термин "гибридизация" означает образование водородной связи, которое может происходить по Уотсону-Крику, по Хугстену (Hoogsteen), путем обратного водородного связывания Хугстена и т.д., между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями. Четыре нуклеиновых основания, обычно обнаруживаемые в ДНК, обозначаются G, А, Т и С,которые представляют собой пары G-C и А-Т. В РНК Т замещен на урацил (U), который становится парой для А. Химические группы в нуклеиновых основаниях, которые участвуют в стандартном образовании дуплексов, составляют плоскость Уотсона-Крика. Несколько лет спустя Хугстен показал, что пуриновые нуклеиновые основания (G и А) дополнительно к плоскости Уотсона-Крика имеют плоскость Хугстена, которую можно распознать снаружи дуплекса и использовать для связи пиримидиновых олигонуклеотидов водородной связью, образуя таким образом тройную спиральную структуру. В контексте настоящего изобретения термин "комплементарность" относится к способности двух нуклеотидных последовательностей точно выстраивать пары друг с другом. Например, если нуклеотид в определенном положении в олигонуклеотиде способен к образованию водородной связи с нуклеотидом в соответствующем положении в молекуле ДНК или РНК, то считается, что олигонуклеотид и ДНК или РНК являются комплементарными друг к другу в этом положении. Цепочки ДНК или РНК считаются комплементарными друг к другу, если достаточное число нуклеотидов в олигонуклеотиде может образовывать водородные связи с соответствующими нуклеотидами в ДНК-мишени или РНК-мишени, что позволяет создать устойчивый комплекс. Для устойчивости in vitro или in vivo олигонуклеотидная последовательность не должна быть на 100% комплементарной к его микроРНК-мишени. Таким образом, термины "комплементарность" и "специфично гибридизуемый" подразумевают, что олигонуклеотид связывается достаточно мощно и специфично с молекулой-мишенью, чтобы достичь желательного влияния на нормальную функцию мишени, не воздействуя при этом на функцию нецелевых РНК. Вместе с тем, в одном предпочтительном варианте осуществления термин "комплементарность" будет означать 100% комплементарность или полную комплементарность. В предпочтительном примере олигонуклеотид по изобретению на 100% комплементарен последовательности миРНК, например человеческой последовательности микроРНК, или одной из последовательностей микроРНК, упоминаемых в изобретении. В предпочтительном примере олигонуклеотид по изобретению содержит непрерывную последовательность, которая на 100% комплементарна исходной области человеческой последовательности микроРНК. Предпочтительно термин "микроРНК" или "миРНК" в контексте настоящего изобретения означает олигонуклеотид РНК, имеющий длину от 18 до 25 нуклеотидов. В функциональном плане миРНК обычно представляют собой регуляторные эндогенные молекулы РНК. Термины "целевая микроРНК" или "миРНК-мишень" относятся к микроРНК, играющей биологическую роль в заболеваниях человека, например, в качестве ап-регуляторной, онкогенной миРНК или миРНК опухолевой супрессии при раке, что, таким образом, является целью терапевтического вмешательства при рассматриваемом заболевании. Термины "ген-мишень" или "мРНК-мишень" относятся к регуляторным мРНК-мишеням для микроРНК, в которых микроРНК на основе почти абсолютной или абсолютной комплементарности между миРНК и ее сайтом-мишенью пост-транскрипционно регулирует указанный "ген-мишень" или "мРНКмишень", что приводит к расщеплению мРНК-мишени; или на основе ограниченной комплементарности,которая часто относится к комплементарности между так называемой исходной последовательностью(нуклеотиды 2-7 из миРНК) и сайтом-мишенью, что приводит к трансляционному ингибированию мРНК-мишени. В контексте настоящего изобретения олигонуклеотид является одноцепочечным, это относится к ситуации, когда отсутствует комплементарный олигонуклеотид для указанного олигонуклеотида, то есть не образуется двухцепочечный олигонуклеотидный комплекс, такой как siPHK. В одном варианте осуществления композиция по изобретению не содержит другой олигонуклеотид, у которого существует область комплементарности с олигомером из 5 или более, например из 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных нуклеотидов, например, из восьми или больше нуклеотидов. Длина. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что такие короткие "анти-miR" обеспечивают улучшенное специфичное ингибирование микроРНК in vivo, сохраняя высокую специфичность для микроРНК-мишени. Было выявлено дополнительное преимущество, а именно способность ингибировать несколько микроРНК одновременно благодаря консервации гомологичных коротких последовательностей между видами микроРНК, таких как исходные области, описанные в изобретении. Согласно настоящему изобретению было выявлено особое преимущество коротких олигонуклеотидов в 7, 8, 9, 10 нуклеотидов, например в 7, 8 или 9 нуклеотидов. Последовательности. Непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной (например, комплементарной на 100%, то есть абсолютно комплементарной) соответствующей области последовательности микроРНК (миРНК) млекопитающих, человека или вируса, предпочтительно человеческой или вирусной последовательности миРНК. Подходящей последовательностью микроРНК может быть зрелая микроРНК. В некоторых вариантах осуществления микроРНК может быть микроРНК-предшественником. Человеческую последовательность микроРНК можно выбирать из SEQ ID NO: 1-558 согласно раскрытию в патенте WO 2008/046911, который полностью и конкретно включен посредством ссылки в настоящее изобретение. Как описано в патенте WO 2008/046911, эти микроРНК связаны с раком. В некоторых вариантах осуществления вирусную последовательность микроРНК можно выбирать из группы, состоящей из вируса простого герпеса 1, вируса герпеса, ассоциированного с саркомой Капоши, вируса Эпштейна-Барра и цитомегаловируса человека. В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность является компле-8 019939 ментарной (например, 100%-комплементарной) соответствующей области миРНК последовательности,выбираемой из группы миРНК, перечисленных в табл. 1. Табл. 1 показывает нацеленные на человеческие и вирусные микроРНК 7-мерные, 8-мерные и 9-мерные олигомеры, которые приведены в базе данныхmiRBase (выпуск 12.0 - http://microrna.sanger.ас.uk/sequences/). В некоторых вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут состоять из непрерывной последовательности нуклеотидов или содержать такую последовательность, которая комплементарна соответствующей последовательности микроРНК, выбираемой из группы, состоящей из miR-1, miR-10b,miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122,miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222, miR-375. Поэтому в одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) выбирают из группы,состоящей из miR-1, miR-10b, miR-17-3 р, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93,miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222 и miR-375. В одном варианте осуществления миРНК-мишень входит в состав кластера miR 17-92, напримерmiR 17, miR 106a, miR 106b, miR 18, miR 19a, miR 19b/l, miR 19b/2, miR20/93, miR92/l, miR92/2 и miR25. В некоторых вариантах осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной соответствующей области последовательности микроРНК (миРНК), выбираемой из группы, состоящей из miR-21, miR-155, miR-221, mir-222 и mir-122. В некоторых вариантах осуществления указанные миРНК выбирают из группы, состоящей из miR1, miR-10, miR-29, miR-125b, miR-126, miR-133, miR-141, miR-143, miR-200b, miR-206, miR-208, miR302, miR-372, miR-373, miR-375 и miR-520c/e. В некоторых вариантах осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области последовательности микроРНК (миРНК), присутствующей в кластереmiR 17-92, например, микроРНК, выбираемой из группы, состоящей из miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93,miR-106a/b, miR-18a/b, miR-19a/b, miR-25, miR-92a, miR-363. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) представляет собой miR-21, например, hsa-miR-21. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) представляет собой miR-122, например hsa-miR-122. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНКмишень) представляет собой miR-19b, например hsa-miR-19b. В одном варианте осуществления миРНК(то есть миРНК-мишень) представляет собой miR-155, например hsa-miR-155. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) представляет собой miR-375, например hsa-miR-375. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) представляет собой miR-375, например hsamiR-106b. Соответственно, непрерывная нуклеотидная последовательность может быть комплементарна соответствующей области микроРНК, такой как hsa-miR, которую выбирают из группы, состоящей из 19b,21, 122, 155 и 375. Исходная область и исходные олигомеры (сидмеры). Авторы настоящего изобретения выявили, что тщательно сконструированные короткие одноцепочечные олигонуклеотиды содержат или состоят из нуклеотидных аналогов, таких как высокоаффинные нуклеотидные аналоги, например единицы замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК), проявляющие значительный сайленсинг микроРНК, который приводит к снижению уровня микроРНК. Было выявлено большое значение прочного связывания указанных олигонуклеотидов с так называемой исходной последовательностью микроРНК мишеней, обычно от 2 до 8 нуклеотидов или от 2 до 7, считая от 5'-конца. Нуклеотид 1 из микроРНК-мишеней представляет собой непарное основание и, наиболее вероятно, спрятан в связывающем кармане белка Ago 2. Без связи с конкретной теорией авторы настоящего изобретения полагают, что при выборе исходной области последовательностей, в частности с олигонуклеотидами, которые содержат ЗНК, предпочтительно единицы ЗНК в области, которая комплементарна исходной области, дуплекс миРНК и олигонуклеотида имеет особую эффективность в нацеливании на миРНК,избегаются эффекты мишеней и, возможно, обеспечивается дополнительный признак, которая предотвращает действие миРНК, направленное на индуцированный РНК комплекс сайленсинга (RISC). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что сайленсинг микроРНК еще больше возрастает,если ЗНК-модифицированные одноцепочечные олигонуклеотиды не содержат на 3'-конце нуклеотид,соответствующий указанному непарному нуклеотиду 1. Было дополнительно обнаружено, что по меньшей мере две единицы ЗНК на 3'-конце олигонуклеотидов по изобретению делают указанные олигонуклеотиды высоко устойчивыми к нуклеазам. В одном варианте осуществления первые или вторые 3'-нуклеотида в олигомере соответствуют вторым 5'-нуклеотидам в последовательности микроРНК и могут быть нуклеотидным аналогом, таким как ЗНК. В одном варианте осуществления нуклеотидные единицы 1-6 (включительно) олигомера, считая от 3'-конца области олигомера, являются комплементарными последовательности исходной области микроРНК, и все они могут представлять собой нуклеотидные аналоги, такие как ЗНК. В одном варианте осуществления нуклеотидные единицы 1-7 (включительно) олигомера, считая от 3'-конца области олигомера, являются комплементарными последовательности исходной области микроРНК, и все могут быть нуклеотидными аналогами, такими как ЗНК. В одном варианте осуществления нуклеотидные единицы 2-7 (включительно) олигомера, считая от 3'-конца области олигомера, являются комплементарными последовательности исходной области микроРНК, и все могут быть нуклеотидными аналогами, такими как ЗНК. В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере одну единицу нуклеотидного аналога, например по меньшей мере одну единицу ЗНК, в положении, которое находится в пределах области, комплементарной исходной области миРНК. В одном варианте осуществления олигомер может содержать от около 1 до 6 или от 1 до 7 единиц нуклеотидного аналога, например в диапазоне от 1 до 6 и от 1 до 7 единиц ЗНК, в положении, которое находится в пределах области, комплементарной исходной области миРНК. В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность состоит из последовательности или содержит последовательность, комплементарную (например, на 100% комплементарную) исходной последовательности указанной микроРНК. В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность состоит из последовательности или содержит последовательность, выбираемую из любой из сидмерных последовательностей, перечисленных в табл. 1. В одном варианте осуществления 3'-нуклеотиды сидмера образуют 3' большинство нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности, при этом непрерывная нуклеотидная последовательность может необязательно содержать один или два дополнительных 5'-нуклеотидов к сидмерной последовательности. В одном варианте осуществления олигомер не содержит нуклеотид, который соответствует первому нуклеотиду, присутствующему в последовательности микроРНК, считая от 5'-конца. В одном варианте осуществления олигонуклеотид согласно изобретению не содержит нуклеотид на 3'-конце, который соответствует первым нуклеотидам 5'-конца в микроРНК-мишени. Нуклеотидные аналоги. Согласно настоящему изобретению было обнаружено особое преимущество коротких олигонуклеотидов из 7, 8, 9, 10 нуклеотидов, например из 7, 8 или 9 нуклеотидов, в которых по меньшей мере 50%,например 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или, например, 100% нуклеотидных единиц олигомера являются нуклеотидными аналогами (предпочтительно высокоаффинными), такими как нуклеотидная единица замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК). В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 7, 8 или 9 нуклеотидов и содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая комплементарна исходной области человеческой или вирусной микроРНК и в которой по меньшей мере 75%, например по меньшей мере 80, например по меньшей мере 85, например по меньшей мере 90, например по меньшей мере 95, например 100% нуклеотидов представляют собой нуклеотидные единицы замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК). В таких олигомерах в некоторых вариантах осуществления связывающие группы представляют собой не фосфодиэфирные связи, а являются, например, фосфоротиоатными связями. В одном варианте осуществления все нуклеотидные единицы непрерывной нуклеотидной последовательности являются нуклеотидными единицами ЗНК. В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 7, 8, 9 или 10, предпочтительно из непрерывных нуклеотидных единиц ЗНК. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 7, 8 или 9 нуклеотидов и содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая комплементарна исходной области человеческой или вирусной микроРНК и в которой по меньшей мере 80% нуклеотидов является ЗНК, и в которой по меньшей мере 80%, например 85, например 90, например 95, например 100% межнуклеотидных связей являются фосфоротиоатными связями. Подразумевается, что непрерывная нуклеотидная последовательность олигомера (сидмера) может выходить за пределы исходной области. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 7 нуклеотидов, все из которых являются ЗНК. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 8 нуклеотидов, из которых до 1 нуклеотида может не быть ЗНК. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 9 нуклеотидов, из которых до 1 или 2 нуклеотида могут отличаться от ЗНК. В некоторых вариантах осуществления длина олигонуклеотида изобретения составляет 10 нуклеотидов, из которых 1, 2 или 3 нуклеотида могут отличаться от ЗНК. Нуклеотиды, отличные от ЗНК,могут представлять собой, например, ДНК или 2'-замещенные нуклеотидные аналоги. Высокоаффинные нуклеотидные аналоги являются нуклеотидными аналогами, которые образуют олигонуклеотиды, обладающие более высокой температурной дуплексной стабильностью с комплементарным РНК-нуклеотидом, в отличие от связывающей аффинности эквивалентного ДНК-нуклеотида. Это можно определить путем измерения Tm. В некоторых вариантах осуществления единицы нуклеотидных аналогов, присутствующие в непрерывной нуклеотидной последовательности, необязательно независимо выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы ЗНК, единицы протеин-нуклеиновой кислоты (ПНК), единицы гексит-нуклеиновой кислоты (ГНК),единицы INA (ИНК) и единицы 2'-МОЕ-РНК. В некоторых вариантах осуществления единицы нуклеотидных аналогов, присутствующие в непрерывной нуклеотидной последовательности, необязательно независимо выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы ЗНК и единицы 2'-МОЕ-РНК. Термин 2'-фтор-ДНК относится к аналогу ДНК с замещением на фтор в 2' положении (2'F). Предпочтительной формой 2'-фтор-ДНК является 2'-фтор-нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления олигомер содержит по меньшей мере 4 единицы нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 5 единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 6 единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 7 единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 8 единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 9 единиц нуклеотидных аналогов, например 10 единиц нуклеотидных аналогов. В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере 3 единицы ЗНК, например по меньшей мере 4 единицы ЗНК, например по меньшей мере 5 единиц ЗНК, например по меньшей мере 6 единиц ЗНК, например, по меньшей мере 7 единиц ЗНК, например, по меньшей мере 8 единиц ЗНК,например, по меньшей мере 9 единиц ЗНК, например 10 единиц ЗНК. В одном варианте осуществления по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов, например,единица ЗНК, является или цитозином, или гуанином, как, например, между 1-10 из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, находится или цитозин, или гуанин, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, представляют собой или цитозин, или гуанин. В одном варианте осуществления по меньшей мере два из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, представляют собой или цитозин, или гуанин. В одном варианте осуществления по меньшей мере три из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере четыре из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере пять из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере шесть из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере семь из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере восемь из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидные аналоги обладают более высокой температурной дуплексной стабильностью для комплементарного РНК-нуклеотида в отличие от связывающей аффинности эквивалентного ДНК-нуклеотида к указанному комплементарному РНК-нуклеотиду. В одном варианте осуществления нуклеотидные аналоги повышают стабильность сыворотки к одноцепочечному олигонуклеотиду. В списке последовательностей и в табл. 1 указаны конкретные SEQ ID, относящиеся к олигомерам мономеров ЗНК с фосфоротиоатным (PS) скелетом, вместе с тем подразумевается, что настоящее изобретение также охватывает использование других нуклеотидных аналогов и/или связей, или в качестве альтернативы, или в комбинации с ЗНК. Также последовательность нуклеотидов (оснований), указанная в списках последовательностей, может быть последовательностью ЗНК, такой как 3 НК/PS, ЗНК или может представлять собой олигомеры, имеющие альтернативную химию скелета, например, сахарные химические связи, сохраняя при этом ту же основную последовательность (А, Т, С или G). Поскольку предполагается, что в олигомерах по изобретению могут быть полезны другие нуклеотидные аналоги, такие как 2'-МОЕ-РНК или 2'-фтор-нуклеотид, предпочтительной является высокая пропорция олигомеров, например, по меньшей мере 50% нуклеотидов ЗНК. Нуклеотидный аналог может быть аналогом ДНК, таким как аналог ДНК, в котором 2'-Н группа замещена заместителем, отличным от -ОН(РНК), например, путем замещения -О-СН 3, -О-СН 2-СН 2-О-СН 3,-O-CH2-CH2-CH2-NH2, -О-СН 2-СН 2-СН 2-ОН или -F. Нуклеотидный аналог может быть аналогами РНК, такими как аналог РНК, модифицированный в его группе 2'-ОН, например, путем замещения группой, отличной от -Н(ДНК), например, -О-СН 3, -ОСН 2-СН 2-О-СН 3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH или -F. В одном варианте осуществления аналогом нуклеотида является "ENA". Замкнутые нуклеиновые кислоты. Используемые в контексте настоящего изобретения термины "единица ЗНК", "мономер ЗНК", "остаток ЗНК", "единица замкнутой нуклеиновой кислоты", "мономер замкнутой нуклеиновой кислоты" или 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 и WO 03/095467. Определение единицы ЗНК можно также давать по ее химической формуле. Таким образом, "единица ЗНК", используемая в настоящем изобретении,имеет химическую структуру, показанную на схеме 1 ниже Схема 1Y является (-СН 2)r, где r составляет целое число от 1 до 4 и В является азотистым основанием. В предпочтительном варианте осуществления изобретения r равен 1 или 2, в частности 1, то есть предпочтительная единица ЗНК имеет химическую структуру, показанную в схеме 2 ниже Схема 2 в которой определение X и В приведено выше. В интересном варианте осуществления единицы ЗНК, включенные в олигонуклеотиды по изобретению, независимо выбирают из группы, состоящей из единиц тио-ЗНК, единиц амино-ЗНК и единиц оксиЗНК. Таким образом, единица тио-ЗНК может иметь химическую структуру согласно схеме 3 ниже Схема 3 в которой определение В приведено выше. Предпочтительно единица тио-ЗНК находится в своей -D-форме, то есть имеет структуру, показанную в схеме 3 А выше, аналогично единица амино-ЗНК может иметь химическую структуру согласно схеме 4 ниже Схема 4 в которой определение В и RH приведено выше. Предпочтительно единица амино-ЗНК находится в своей -D-форме, то есть имеет структуру, показанную в схеме 4 А выше. Единица окси-ЗНК может иметь химическую структуру, показанную на схеме 5 ниже Схема 5 в которой определение В приведено выше. Предпочтительно единица окси-ЗНК находится в своей -D-форме, то есть имеет структуру, пока- 12019939 занную в схеме 5 А выше. Как обозначено выше, В представляет собой азотистое основание, которое может быть природного или синтетического происхождения. Конкретные примеры азотистых оснований включают аденин (А), цитозин (С), 5-метилцитозин (МеС), изоцитозин, псевдоизоцитозин, гуанин (G),тимин (Т), урацил (U), 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропинил-6,7-метилтиазолурацил, 6 аминопурин, 2-аминопурин, инозин, 2,6-диаминопурин, 7-пропин-7-деазааденин, 7-пропин-7 деазагуанин и 2-хлор-6-аминопурин. Термин "единица тио-ЗНК" относится к единице ЗНК, в которой X на схеме 1 является S. Единица тио-ЗНК может находиться и в -D-форме, и в -L-форме. В общем, предпочтительной является -Dформа единицы тио-ЗНК. Единицы тио-ЗНК в -D-форме и -L-форме показаны на схеме 3 как соединения 3 А и 3 В соответственно. Термин "единица амино-ЗНК" относится к единице ЗНК, в которой X на схеме 1 представляет собой NH или NRH, где RH является водородом или C1-4-алкилом. Единица амино-ЗНК может быть и в -Dформе, и в -L-форме. В общем, предпочтительной является -D-форма единицы амино-ЗНК. Единицы амино-ЗНК в -D-форме и -L-форме показаны на схеме 4 как соединения 4 А и 4 В соответственно. Термин "единица окси-ЗНК" относится к единице ЗНК, в которой X на схеме 1 представляет собой О. Единица окси-ЗНК может быть и в -D-форме, и в -L-форме. В общем, предпочтительной является-В-форма единицы окси-ЗНК. Единицы окси-ЗНК в -D-форме и -L-форме показаны на схеме 5 как соединения 5 А и 5 В соответственно. В настоящем описании термином "C1-6-алкил" обозначена линейная или разветвленная насыщенная углеводородная цепь, при этом самые длинные цепи имеют от одного до шести атомов углерода, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил,неопентил и гексил. Разветвленной углеводородной цепью считается C1-6-алкил, замещенный по любому атому углерода углеводородной цепью. В настоящем описании термин "С 1-4-алкил" предназначен для обозначения линейной или разветвленной насыщенной углеводородной цепи, при этом самые длинные цепи имеют от одного до четырех атомов углерода, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил и третбутил. Разветвленной углеводородной цепью считают C1-4-алкил, замещенный по любому атому углерода углеводородной цепью. Используемый в настоящем изобретении термин "C1-6-алкокси" означает C1-6-алкил-окси, например метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентокси,изопентокси, неопентокси и гексокси. В настоящем описании термин "С 2-6-алкенил" означает линейную или разветвленную углеводородную группу, имеющую от двух до шести атомов углерода и содержащую одну или более двойных связей. Иллюстративные примеры С 2-6-алкенильных групп включают аллил, гомо-аллил, винил, кротил, бутенил,бутадиенил, пентенил, пентадиенил, гексенил и гексадиенил. Ненасыщенным (двойной связью) может быть любое положение в углеродной цепи. В настоящем описании термин "С 2-6-алкинил" означает линейные или разветвленные углеводородные группы, содержащие от двух до шести атомов углерода и содержащие одну или более тройных связей. Иллюстративные примеры С 2-6-алкинильных групп включают ацетилен, пропинил, бутинил, пентинил и гексинил. Ненасыщенным (тройной связью) может быть любое положение в углеродной цепи. Большее чем одна связь может быть ненасыщенной таким образом, что "С 2-6-алкинил" может представлять собой ди-ин, или енеди-ин, что известно специалисту в данной области техники. В отношении замещения единицы ДНК на соответствующую ей единицу ЗНК в контексте настоящего изобретения термин "соответствующая единица ЗНК" означает, что единицу ДНК заменили на единицу ЗНК, содержащую то же самое азотистое основание, что и замененная единица ДНК, например на единицу ЗНК, содержащей азотистое основание А, соответствующую единице ДНК, которая также содержит азотистое основание А. Исключение состоит в том, что если единица ДНК содержит основание С, то соответствующая единица ЗНК может содержать основание С или основание МеС, предпочтительно Ме С. Термин "единица не-ЗНК", используемый в настоящем изобретении, относится к нуклеозиду, отличающемуся от единицы ЗНК, то есть термин "единица не-ЗНК" содержит единицу ДНК, а также единицу РНК. Предпочтительная единица не-ЗНК представляет собой единицу ДНК. Термины "единица", "остаток" и "мономер" используются в изобретении взаимозаменяемо. Термин "по меньшей мере один" охватывает целое число, которое больше или равно 1, например 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д. Единственное число, используемое в отношении нуклеотида, агента, единицы ЗНК и т.д., предназначено означать один или более. В частности, выражение "компонент (например, нуклеотид, агент, единица ЗНК или подобное), выбираемый из группы, состоящей из " означает, что один или более указанных компонентов можно выбирать. Таким образом, такие выражения, как "компонент, выбираемый из группы, состоящей из А, В и С", указывают, что все комбинации А, В и С, то есть А, В, С, А+В, А+С,В+С и А+В+С, включены в число рассматриваемых компонентов. Межнуклеозидные связи. Термин "группа межнуклеозидной связи" означает группу, способную к ковалентному связыванию двух нуклеотидов, например образованию связи между единицами ДНК, между единицами ДНК и нуклеотидными аналогами, между двумя единицами не-ЗНК, между единицей не-ЗНК и единицей ЗНК, и между двумя единицами ЗНК и т.д. Примеры включают фосфатные, фосфодиэфирные группы и фосфоротиоатные группы. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из связей или, например, все межнуклеозидные связи в олигомере являются фосфодиэфирными. Однако в условиях использования in vivo могут быть предпочтительными фосфоротиоатные связи. Обычными группами межнуклеозидных связей в олигонуклеотидах являются фосфатные группы,но их можно заменять на нефосфатные группы межнуклеозидной связи. В дополнительном представляющем интерес варианте осуществления изобретения модифицируют структуру группы межнуклеозидной связи в олигонуклеотиде по изобретению, то есть модифицированный олигонуклеотид содержит группу межнуклеозидной связи, которая отличается от фосфатной группы. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну группу межнуклеозидной связи, которая отличается от фосфатной группы. Конкретные примеры групп межнуклеозидной связи, которые отличаются от фосфатной группы(-O-Р(О)2-O-), включают -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-,-O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -OPO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -O-CO-O-,-O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -OCH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2NCH3-O-CH2-, где RH является водородом или C1-4-алкилом. При модификации группы межнуклеозидной связи предпочтительной группой межнуклеозидной связи является фосфоротиоатная группа (-O-Р(O,S)-O-). В предпочтительном варианте осуществления все группы межнуклеозидной связи олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению являются фосфоротиоатными. Межнуклеозидную связь можно выбирать из группы, состоящей из -O-Р(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -OP(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, OPO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -О-РО(ВН 3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-,-NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, и/или межнуклеозидную связь можно выбирать из группы,состоящей из -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-СН 2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRHCH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -OCH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, в которой RH выбирают из водорода и C1-4-алкила. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления могут быть предпочтительными межнуклеозидные связи, содержащие серу (S), как указано выше. Межнуклеозидные связи можно независимо выбирать, или все они могут быть одинаковыми, такими как фосфоротиоатные связи. В одном варианте осуществления по меньшей мере 75%, например 80, или 85, или 90, или 95%, или все межнуклеозидные связи, расположенные между нуклеотидными единицами непрерывной последовательности нуклеотидов, являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями. Олигонуклеотиды микро-mir, мишенью для которых является более одной микроРНК. В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей последовательности по меньшей мере из двух последовательностей миРНК, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательностей миРНК. Использование единственного универсального основания может способствовать тому, что единственный олигомер по изобретению будет нацелен на две независимых микроРНК, из которых или одна, или обе имеют единственное несовпадение в том участке, который соответствует олигомеру в месте расположения универсального нуклеотида. В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна последовательности по меньшей мере из двух областей исходной последовательности миРНК, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательностям области исходной миРНК. В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области и miR-221, и miR-222. В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области больше чем одного кластера miR-17-92, например двум или больше, или всемmiR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, miR-106a/b; или двум или больше, или всем miR-25, miR-92a и miR-363. В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна 5'GCTACAT3'. Конструкция олигомера. В одном варианте осуществления первый нуклеотид олигомера согласно изобретению, считая от 3'конца, является нуклеотидным аналогом, таким как единица ЗНК. В одном варианте осуществления, который может быть аналогичным или другим, последний нуклеотид олигомера согласно изобретению,- 14019939 считая от 3'-конца, является нуклеотидным аналогом, таким как единица ЗНК. В одном варианте осуществления второй нуклеотид олигомера по изобретению, считая от 3'-конца,является нуклеотидным аналогом, например единицей ЗНК. В одном варианте осуществления девятый и/или десятый нуклеотид олигомера по изобретению,считая от 3'-конца, является нуклеотидным аналогом, например единицей ЗНК. В одном варианте осуществления девятый нуклеотид олигомера по изобретению, считая от 3'конца, является нуклеотидным аналогом, например единицей ЗНК. В одном варианте осуществления десятый нуклеотид олигомера согласно изобретению, считая от 3'-конца, является нуклеотидным аналогом, например, единицей ЗНК. В одном варианте осуществления и девятый, и десятый нуклеотиды олигомера по изобретению,считая от 3'-конца, являются нуклеотидными аналогоми, например единицей ЗНК. В одном варианте осуществления олигомер по изобретению не содержит область из более 3 последовательных нуклеотидных единиц ДНК. В одном варианте осуществления олигомер по изобретению не содержит область из более 2 последовательных нуклеотидных единиц ДНК. В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере область, состоящую по меньшей мере из двух последовательных единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере из двух последовательных единиц ЗНК. В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере область, состоящую по меньшей мере из трех последовательных единиц нуклеотидных аналогов,например по меньшей мере из трех последовательных единиц ЗНК. Другие образцы нуклеотидных аналогов, такие как ЗНК в олигомере. Предполагается, что олигомеры, содержащие по меньшей мере 6 ЗНК, например по меньшей мере 7 нуклеотидных единиц, могут быть предпочтительными, поэтому открытие эффективности настолько коротких олигомеров в нацеливании на микроРНК in vivo можно использовать для подготовки более коротких олигомеров согласно изобретению, которые содержат другие нуклеотидные аналоги, такие как высокоаффинные нуклеотидные аналоги. Фактически, комбинация ЗНК с другими высокоаффинными нуклеотидными аналогами рассматривается как часть настоящего изобретения. Модификация нуклеотидов в положениях 1-2, считая от 3'-конца. Нуклеотид в положениях 1 и/или 2 может быть нуклеотидным аналогом, например высокоаффинным нуклеотидным аналогом, таким как ЗНК, или нуклеотидным аналогом, выбираемым из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фторДНК, единицы 2'-МОЕ-РНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицы ИНК. Таким образом, два 3'-нуклеотида могут представлять собой Хх, хХ, XX или хх, в которых: в одном варианте осуществления X представляет собой ЗНК, и х является ДНК или другим нуклеотидным аналогом, например 2'-замещенным нуклеотидным аналогом, который выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-Оалкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, ЗНК и единицы 2'МОЕ-РНК. Указанная единица не-ЗНК (х), таким образом, может представлять собой 2'-МОЕ-РНК или 2'-фтор-ДНК. Альтернативно X является нуклеотидным аналогом, и х представляет собой ДНК. Вышеупомянутая модификация в 2-х 3'-концевых нуклеотидах может сочетаться с модификацией нуклеотидов в положениях 3-8, считая от 3'-конца, как описано ниже. В этом отношении нуклеотиды,обозначенные как X и х, везде в олигомере могут быть одинаковыми. Необходимо отметить, что можно не учитывать 8-ой нуклеотид, считая от 3'-конца, если длина олигомера составляет только 7 нуклеотидов. В нижеупомянутых вариантах осуществления, которые относятся к модификации нуклеотидов в положениях 3-8, считая от 3'-конца, единицы ЗНК в одном варианте осуществления могут заменяться на другие нуклеотидные аналоги, такие как упомянутые в настоящем изобретении. Поэтому "X" можно выбирать из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК,единицы 2'-фтор-ДНК, единицы 2'-МОЕ-РНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицыИНК. х предпочтительно является ДНК или РНК, наиболее предпочтительно ДНК. Вместе с тем, X предпочтительно представляет собой ЗНК. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотиды по изобретению модифицируют в положениях 3-8, считая от 3'-конца. Конструкцию этой последовательности можно определять по количеству присутствующих единиц не-ЗНК или по количеству присутствующих единиц ЗНК. В предпочтительном варианте осуществления в указанной последовательности по меньшей мере один, например,один нуклеотид в положении от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, является единицей не-ЗНК. В другом варианте осуществления по меньшей мере два, например, два нуклеотида в положении от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, являются единицами не-ЗНК. В еще одном варианте осуществления по меньшей мере три, например три нуклеотида в положении от третьего до восьмого, считая от 3'-конца,являются единицами не-ЗНК. Еще в одном варианте осуществления по меньшей мере четыре, например четыре нуклеотида в положении от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, являются единицами неЗНК. В дополнительном варианте осуществления по меньшей мере пять, например, пять нуклеотидов от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, является единицами не-ЗНК. Еще в одном дополнительном варианте осуществления все шесть нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца,являются единицами не-ЗНК. Альтернативно указано как вариант осуществления, что олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере три единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. В варианте осуществления указанного олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит три единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. Образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, можно выбирать из группы, состоящей из ХХХххх, хХХХхх, ххХХХх, хххХХХ, ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, хХХхХх, хХХххХ,ххХХхХ, ХхХХхх, ХххХХх, ХхххХХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ, хХхХхХ и ХхХхХх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. В предпочтительном варианте осуществления образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, выбирают из группы, состоящей из ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, хХХхХх, хХХххХ, ххХХхХ, ХхХХхх, ХххХХх,ХхххХХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ, хХхХхХ и ХхХхХх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. В более предпочтительном варианте осуществления образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, выбирают из группы, состоящей из хХХхХх, хХХххХ, ххХХхХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ и хХхХхХ, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. В одном варианте осуществления образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, представляет собой хХхХхХ или ХхХхХх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. В одном варианте осуществления образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, представляет собой хХхХхХ, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. В дополнительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере четыре единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. В варианте осуществления указанного олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит четыре единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. Образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, можно выбирать из группы, состоящей из ххХХХХ, хХхХХХ, хХХхХХ, хХХХхХ, хХХХХх, ХххХХХ, ХхХхХХ, ХхХХхХ, ХхХХХх,ХХххХХ, ХХхХхХ, ХХхХХх, ХХХххХ, ХХХхХх и ХХХХхх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. Еще в одном дополнительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере пять единиц ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. В одном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит пять единиц ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. Образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, можно выбирать из группы, состоящей из хХХХХХ, ХхХХХХ, ХХхХХХ, ХХХхХХ, ХХХХхХ и ХХХХХх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. Предпочтительно олигонуклеотид согласно настоящемуизобретению содержит одну или две единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. Считается, что для стабильности Аспирали, образованной олиго, обладают преимуществом: дуплекс микроРНК, дуплекс, сходный с РНК: дуплексная структура РНК. Еще в одном дополнительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере шесть единиц ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит от трех до шести единиц ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца,и дополнительно в той же области он содержит от одного до трех других высокоаффинных нуклеотидных аналогов, таким образом, что общее количество высокоаффинных нуклеотидных аналогов (включающих в себя единицы ЗНК) в области от третьего до восьмого положения, считая от 3'-конца, составляет шесть. В некоторых вариантах осуществления, например, когда X представляет собой ЗНК, указанная единица не-ЗНК (х) является другой единицей нуклеотидного аналога, например 2'-замещенного нуклеотидного аналога, которую выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМеРНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, ЗНК и единицы 2'-МОЕ-РНК. Указанная единица не-ЗНК (х) поэтому может представлять собой 2'-МОЕ-РНК или 2'-фтор-ДНК. В олигомерах, имеющих 9 или 10 нуклеотидов, нуклеотид в положениях 9 и/или 10 может быть нуклеотидным аналогом, например высокоаффинным нуклеотидным аналогом, таким как ЗНК, или нуклеотидным аналогом, который выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы 2'-МОЕ-РНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицы ИНК. Два 5'-нуклеотида поэтому могут представлять собой Хх, хХ, XX или хх, в которых в одном варианте осуществления X представляет собой ЗНК, и х является ДНК или другим нуклеотидным аналогом, например 2'-замещенным нуклеотидным аналогом, который выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, ЗНК и единицы 2'-МОЕ-РНК. Указанная единица не-ЗНК (х) поэтому может представлять собой 2'-МОЕ-РНК или 2'-фтор-ДНК. Альтернативно X является нуклеотидным аналогом, и х представляет собой ДНК. Вышеупомянутую модификацию в 2-х 5'-концевых нуклеотидах и/или в 2-х 3' нуклеотидах можно комбинировать с модификацией нуклеотидов в положениях 3-8, считая от 3'-конца, как описано выше. В этом отношении нуклеотиды, обозначенные X и х, могут быть одинаковыми во всем олигомере. В предпочтительном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит единицу ЗНК на 5'-конце. В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит единицу ЗНК в первых двух положениях,считая от 5'-конца. В одном варианте осуществления изобретение дополнительно относится к олигомеру, описание которого приведено в контексте фармацевтической композиции изобретения, или для использования invivo в организме, например, в качестве лекарственного средства, при этом указанный олигомер (или непрерывная нуклеотидная последовательность) содержит илиi) по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь, и/илиii) по меньшей мере одну 3'-концевую единицу ЗНК, и/илиiii) по меньшей мере одну 5'-концевую единицу ЗНК. Таким образом, олигомер может содержать по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь, например иметь все фосфоротиоатные связи, и по меньшей мере одну 3'-концевую единицу ЗНК, и по меньшей мере одну 5'-концевую единицу ЗНК. В большинстве терапевтических применений предпочтительным является полностью фосфоротиолированный олигонуклеотид, за исключением терапевтических олигонуклеотидов для введения в ЦНС,например в мозг или спинной мозг, где фосфоротиолирование может быть токсичным, и благодаря отсутствию нуклеаз можно использовать фосфодиэфирные связи даже между смежными единицами ДНК. Как упомянуто в настоящем изобретении в отношении олигонуклеотида согласно изобретению,другим аспектом является то, что второй 3'-нуклеотид, и/или 9-й и 10-й (от 3'-конца), в случае их присутствия, также могут представлять собой ЗНК. В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере пять единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере пять единиц ЗНК, в положениях, которые комплементарны исходной области миРНК. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность олигомера, комплементарного последовательности исходной области микроРНК, выбирают из группы, состоящей из (Х)хХХХХХ,(Х)ХхХХХХ, (Х)ХХхХХХ, (Х)ХХХхХХ, (Х)ХХХХхХ и (Х)ХХХХХх, где X обозначает нуклеотидный аналог, например единицу ЗНК, (X) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу. В одном варианте осуществления олигомер содержит шесть или семь единиц нуклеотидных аналогов, например шесть или семь единиц ЗНК, в положениях, которые комплементарны исходной области миРНК. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность олигомера, который комплементарен последовательности исходной области микроРНК, выбирают из группы, состоящей из ХХХХХХ, ХхХХХХХ, ХХхХХХХ, ХХХхХХХ, ХХХХхХХ, ХХХХХхХ и ХХХХХХх, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНКнуклеотидную единицу. В одном варианте осуществления два нуклеотидных мотива в положении 7-8, считая от 3'-конца олигомера, выбирают из группы, состоящей из хх, XX, хХ и Хх, где X обозначает нуклеотидный аналог,такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу. В одном варианте осуществления два нуклеотидных мотива в положении 7-8, считая от 3'-конца олигомера, выбирают из группы, состоящей из XX, хХ и Хх, где X обозначают аналог нуклеотида, такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу. В одном варианте осуществления олигомер содержит 12 нуклеотидов, при этом два нуклеотидных мотива в положении 11-12, считая от 3'-конца олигомера, выбирают из группы, состоящей из хх, XX, хХ и Хх, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу. В одном варианте осуществления олигомер содержит 12 нуклеотидов, при этом два нуклеотидных мотива в положении 11-12, считая от 3'-конца олигомера, выбирают из группы, состоящей из XX, хХ и Хх, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу, например единицу ДНК. В одном варианте осуществления олигомер содержит на 5'-конце единицу нуклеотидного аналога,такую как единица ЗНК. В одном варианте осуществления единицы нуклеотидных аналогов, например, X, независимо выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-аминоДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы 2'-МОЕ-РНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицы ИНК. В одном варианте осуществления все нуклеотиды олигомера по настоящему изобретению представляют собой единицы нуклеотидных аналогов. В одном варианте осуществления единицы нуклеотидных аналогов, например X, независимо выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-фтор-ДНК и единицы ЗНК. В одном варианте осуществления олигомер содержит указанную по меньшей мере одну единицу аналога ЗНК и по меньшей мере одну дополнительную единицу нуклеотидного аналога, отличную от ЗНК. В одном варианте осуществления единицу или единицы не-ЗНК нуклеотидного аналога независимо выбирают из единиц 2'-ОМе-РНК и единиц 2'-фтор-ДНК. В одном варианте осуществления олигомер состоит по меньшей мере из одной последовательностиXYX или YXY, в которых X представляет собой ЗНК, и Y является или единицей 2'-Оме-РНК или единицей 2'-фтор-ДНК. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность олигомера состоит из альтернативных единиц X и Y. В одном варианте осуществления олигомер содержит чередующиеся единицы ЗНК и ДНК (Хх) или(хХ). В одном варианте осуществления олигомер содержит мотив из чередующихся ЗНК, сопровождающихся 2 единицами ДНК (Ххх), хХх или ххХ. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна из ДНК- или не-ЗНК-единиц нуклеотидного аналога заменена на ЗНК-нуклеотид в положении, которое выбирают из положений, обозначаемых ЗНК-нуклеотидными единицами в любом из вариантов осуществления, упомянутых выше. В одном варианте осуществления X является донором единицы ЗНК. Дополнительные конструкции олигомеров по изобретению. В табл. 1 ниже приведены неограничивающие объем настоящего изобретения примеры коротких последовательностей микроРНК, которые могут иметь преимущество в качестве мишеней для олигонуклеотидов по настоящему изобретению. Олигонуклеотиды согласно изобретению, такие как раскрытые в табл. 1, в одном варианте осуществления могут иметь последовательность в 7, 8, 9 или 10 ЗНК-нуклеотидов 5'-3' L(L) (L) (L) (L), или иметь последовательность нуклеотидов, которую выбирают из группы, состоящей из первых 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов следующих мотивов: Фармацевтическая композиция и применение в медицине. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей олигомер по изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант. Изобретение дополнительно предусматривает использование олигонуклеотида согласно изобретению, например олигонуклеотидов, которые могут входить в состав фармацевтической композиции, для производства лекарственного средства для лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией (ап-регуляцией) микроРНК. Изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК, включающему стадию введения нуждающемуся в лечении человеку композиции (например, фармацевтической композиции) по изобретению. Изобретение дополнительно относится к способу уменьшения эффективного количества миРНК в клетке или в организме, включающему введение в клетку или организм композиции (например, фармацевтической композиции) по изобретению или олигомера по изобретению. Снижение эффективного количества в этом контексте относится к уменьшению содержания в клетке или организме функциональной миРНК. Признается, что предпочтительные олигонуклеотиды по изобретению возможно не всегда значительно уменьшают фактическое количество миРНК в клетке или организме, поскольку обычно они образуют очень устойчивые дуплексы с их миРНК-мишенями. В одном варианте осуществления можно измерить снижение эффективного количества миРНК в клетке путем определения клеточного уровня дерепрессии миРНК-мишени. Изобретение дополнительно относится к способу дерепрессии мРНК-мишени из миРНК в клетке или в организме, включающему введение в клетку или организм композиции (например, фармацевтической композиции) или олигомера по изобретению. Изобретение дополнительно относится к использованию олигомера, имеющего длину от 7 до 10,например 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов, для производства лекарственного средства для лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК. В одном варианте осуществления клиническое состояние (или болезнь) представляет собой гепатит С (HCV) и миРНК представляет собой miR-122. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению предназначена для применения в лечении клинического нарушения или болезни, выбираемой из группы, состоящей из вирусной инфекции гепатита С и гиперхолестеринемии и связанных с ними нарушений, и раковых заболеваний. В одном варианте осуществления клиническое нарушение или заболевание представляет собой патологию ЦНС, например заболевание ЦНС, для которого известна одна или более идентифицированных микроРНК. В контексте связанных с гиперхолестеринемией патологий рассматриваются такие болезни, как атеросклероз или гиперлипидемия. Дополнительные примеры связанных с гиперхолестеринемией заболеваний также включают различные типы холестеринового дисбаланса ЛПВП/ЛПНП (липопротеины высокой плотности/липопротеины низкой плотности); дислипидемии, например семейная сочетанная гиперлипидемия (FCHL), приобретенная гиперлипидемия, статин-резистентная гиперхолестеринемия; заболевание коронарных артерий (ЗКА), ишемическая болезнь сердца (ИБС), атеросклероз. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению дополнительно содержит второй независимый активный компонент, который является ингибитором пути сборкиVLDL (липопротеинов очень низкой плотности), например ингибитор АроВ или ингибитор МТР (микросомального белка, переносящего триглицериды) (например, раскрытые в патенте США 60/977497, включенном ссылкой в настоящее изобретение). Изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК, включающему стадию введения нуждающемуся в лечении человеку композиции (например, фармацевтической композиции), которая содержит олигомер, имеющий длину от 7 до 10, например 7, 8, 9 или 10, нуклеотидов. Изобретение дополнительно относится к способу уменьшения эффективного количества миРНКмишени (т.е. "доступных" миРНК) в клетке или организме, включающему введение в клетку или организм композиции (например, фармацевтической композиции), которая содержит олигомер, имеющий длину от 6-7 до 10, например 7, 8, 9 или 10, нуклеотидов. Необходимо считать, что "уменьшение эффективного количества" одной или более микроРНК в клетке или организме относится к ингибированию функции микроРНК в клетке или организме. Клеткой предпочтительно является клетка млекопитающего или человеческая клетка, которая экспрессирует одну микроРНК или несколько микроРНК. Изобретение дополнительно относится к способу дерепрессии в клетке или организме мРНКмишени из миРНК, которые содержат олигомер, имеющий длину от 7 до 10, например 7, 8, 9 или 10,нуклеотидов (или композиция, содержащая указанный олигонуклеотид) в клетке или организме. Как упомянуто выше, микроРНК связаны со многими заболеваниями. Следовательно, четвертый аспект изобретения относится к применению олигонуклеотида по изобретению для производства лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с экспрессией микроРНК, которое выбрано из группы, состоящей из спинальной мышечной атрофии, синдрома Туретта, гепатита С, синдрома умственной отсталости с ломкой X-хромосомой, синдрома Ди Георга и рака, в качестве неограничивающего примера, хронического лимфоцитарного лейкоза, рака молочной железы, рака легкого и рака ободочной кишки, в частности рака. Способы синтеза Изобретение дополнительно относится к способу синтеза олигомера, нацеленного на человеческую микроРНК, например олигомера, описанного в настоящем изобретении, при этом указанный способ содержит следующие этапы:a) необязательно выбор первого нуклеотида, считая от 3'-конца, который является нуклеотидным аналогом, таким как нуклеотид ЗНК;b) необязательно выбор второго нуклеотида, считая от 3'-конца, который является нуклеотидным аналогом, таким как нуклеотид ЗНК;c) выбор области олигомера, который соответствует исходной области миРНК, при этом указанная область представляет собой область, определенную по изобретению;e) необязательно выбор одного или двух дополнительных 5'-концов олигомера согласно изобретению; при этом синтез осуществляют путем последовательного синтеза областей, указанных в этапах а-е,при этом указанный синтез можно проводить или в направлении 3'-5' (от а) к e, или в направлении 5'-3'(от е) к а, и при этом указанный олигомер комплементарен последовательности миРНК-мишени. Изобретение дополнительно относится к способу получения олигомера (такого как олигомер по изобретению), при этом указанный способ включает этапы а) сравнения последовательностей двух или более последовательностей миРНК для идентификации двух или более последовательностей миРНК,которые содержат общую непрерывную последовательность нуклеотидов с длиной по меньшей мере 7 нуклеотидов, например 7, 8, 9 или 10, нуклеотидов (т.е. последовательность, обнаруживаемую в обеих неидентичных миРНК), b) изготовления последовательности олигомера, содержащей или состоящей из непрерывной нуклеотидной последовательности, которая комплементарна указанной общей непрерывной нуклеотидной последовательности, при этом указанный олигомер является олигомером по изобретению. В предпочтительном примере общая непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из исходной области каждой из указанных двух или более последовательностей миРНК (которые содержат общую непрерывную нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 6 нуклеотидов). В одном варианте осуществления исходные области двух или более миРНК являются идентичными. Соответственно, олигомер содержит или состоит из сидмерной последовательности длиной 7 или 8 нуклеотидов, которая содержит последовательность, комплементарную указанным двум или более миРНК. Этот способ можно использовать в сочетании с этапом с) вышеупомянутого способа. Способ синтеза олигомера согласно изобретению можно осуществлять с использованием стандартного твердофазного синтеза олигонуклеотидов. В одном варианте осуществления способ синтеза олигомера, нацеленного против человеческой микроРНК, осуществляют в направлении а-е от 3'- к 5'-концу. Дополнительным аспектом настоящего изобретения является способ уменьшения уровня микроРНК-мишени путем контакта микроРНК-мишени с олигонуклеотидом, как указано в изобретении, при этом олигонуклеотид (i) комплементарен последовательности микроРНК-мишени, (ii) на 3'-конце не содержит нуклеотид, который соответствует первым нуклеотидам микроРНК-мишени 5'-конца. Стабильность дуплекса и температура Tm. В одном варианте осуществления олигомер по настоящему изобретению способен к образованию дуплекса с комплементарной одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты РНК (обычно примерно аналогичной длины указанного одноцепочечного олигонуклеотида) с фосфодиэфирными межнуклеозидными связями, при этом дуплекс имеет температуру Tm в диапазоне от 30 и до 70 или 80 С, например от 30 и до 60, до 70 С или от 30 до 50 или до 60 С. В одном варианте осуществления Tm составляет по меньшей мере 40 С. Можно определять Tm, определяя Tm олигомера и комплементарной РНК-мишени со следующими буферными условиями: 100 мМ NaCl, 0,1 мМ этилендиамин-тетрауксусной кислоты ЭДТА,10 мМ Na-фосфата, уровень рН 7,0 (см. примеры подробного протокола). Высокоаффинные аналоги можно определить как аналог, который при использовании в олигомере по изобретению приводит к повышению Tm олигомера по сравнению с идентичным олигомером, содержащим только ДНК-основания. Конъюгаты. В одном варианте осуществления указанный олигомер конъюгирован с одним или несколькими ненуклеотидными (или полинуклеотидными) соединениями. В настоящем описании термин "конъюгат" применяется для обозначения гетерогенной молекулы,образованной ковалентным присоединением ("конъюгацией") олигомера, описанного в изобретении, к одному или нескольким ненуклеотидным или неполинуклеотидным функциональным группам. Примеры ненуклеотидных или неполинуклеотидных функциональных групп включают макромолекулярные агенты, такие как белки, цепи жирных кислот, остатки сахаров, гликопротеины, полимеры или их комбинации. Обычные белки могут представлять собой антитела к белку-мишени. Обычные полимеры могут представлять собой полиэтиленгликоль. Таким образом, в разных вариантах осуществления олигомер по изобретению может содержать как полинуклеотидную область, которая обычно состоит из непрерывной последовательности нуклеотидов и комплементарной области ненуклеотида. В отношении олигомера по изобретению, состоящего из непрерывной нуклеотидной последовательности, соединение может содержать ненуклеотидные компоненты,например компонент конъюгат. В разных вариантах осуществления изобретения олигомерное соединение присоединено к лигандам/конъюгатам, которые можно использовать, например, для увеличения клеточного захвата олигомерных соединений. В патенте WO 2007/031091, включенном со ссылкой в настоящее изобретение, рассмотрены подходящие лиганды и конъюгаты. Изобретение также относится к конъюгату, который содержит описанное в изобретении соединение и по меньшей мере одну ненуклеотидную или неполинуклеотидную функциональную группу, ковалентно присоединенную к указанному соединению. Поэтому в разных вариантах осуществления, где соединение по изобретению состоит из конкретной нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, раскрытых в изобретении, соединение также может содержать по меньшей мере одну ненуклеотидную или неполинуклеотидную функциональную группу (например, не содержащую один или более нуклеотидов или нуклеотидных аналогов), присоединенную ковалентно к указанному соединению. Конъюгация (к функциональной группе конъюгата) может увеличить активность, распределение в клетке или клеточный захват олигомера по изобретению. Такие функциональные группы включают без ограничения антитела, полипептиды, липидные функциональные группы, например группы холестерина,холевой кислоты, тиоэфира, например гексил-s-тритилтиол, тиохолестерин, алифатическую цепь, например остатки додекандиола или ундецила, фосфолипиды, например дигексадецил-rac-глицерин или триэтиламмония 1,2-ди-о-гексадецил-rac-глицеро-3-h-фосфоната, цепи полиамингликоля или полиэтиленгликоля, адамантануксусную кислоту, функциональные группы пальмитила, окстадециламина или гексиламинокарбонил-оксихолестерина. Олигомеры по настоящему изобретению также могут конъюгироваться с действующей лекарственной субстанцией, например с аспирином, ибупрофеном, сульфа-препаратом, противодиабетическим, антибактериальным средством или антибиотиком. В некоторых вариантах осуществления конъюгированная функциональная группа представляет собой стерин, например холестерин. В разных вариантах осуществления конъюгированная функциональная группа содержит или состоит из положительно заряженного полимера, например из положительно заряженных пептидов, например,длиной от 1 до 50, например от 2 до 20, например от 3 до 10, аминокислотных остатков, и/или из окисиполиалкилена, например из полиэтиленгликоля (ПЭГ) или полипропиленгликоля - см. патент WO 2008/034123, включенный в настоящее изобретение ссылкой. Соответственно положительно заряженный полимер, например окись полиалкилена, можно присоединять к олигомеру по изобретению посредством линкера, например свободного линкера, описанного в WO 2008/034123. В конъюгатах по настоящему изобретению можно использовать в качестве примера следующие конъюгированные функциональные группы: Активированные олигомеры. Термин "активированный олигомер", используемый в настоящем изобретении, относится к олигомеру по изобретению, ковалентно связанному (т.е. функционализированному) по меньшей мере с одной функциональной группой, которая допускает ковалентное связывание олигомера с одной или несколькими конъюгированными функциональными группами, т.е. с группами, которые сами по себе не являются нуклеиновыми кислотами или мономерами, для образования конъюгата, описанного в изобретении. Обычно функциональная группа содержит химическую группу, которая способна к ковалентному соединению с олигомером, например, посредством 3'-гидроксильной группы или экзоциклической NH2 группы аденинового основания, спейсер, который предпочтительно является гидрофильным, и терминальную группу, способную к связыванию с конъюгированной функциональной группой (например, амино,сульфгидрильная или гидроксильная группа). В некоторых вариантах осуществления указанная терминальная группа не является защищенной, например группа NH2. В других вариантах осуществления терминальная группа защищена, например, любой подходящей защитной группой, например, как описанной в издании "Protective Groups in Organic Synthesis" авторов Theodora W Greene и Peter G.M. Wuts, 3rd edition (John WileySons, 1999). Примеры подходящих гидроксильных защитных групп включают сложные эфиры, такие как уксусный эфир, аралкильные группы, такие как бензил, дифенилметил или трифенилметил и тетрагидропиранил. Примеры подходящих защитных аминогрупп включают бензил, метилбензил, дифенилметил, трифенилметил, бензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, и ацильные группы, такие как трихлоруксусная или трифторуксусная группы. В некоторых вариантах осуществления функциональная группа является саморасщепляемой. В других вариантах осуществления функциональная группа является биоразлагаемой. См., например, патент США 7087229, который полностью включен посредством ссылки в настоящее изобретение. В некоторых вариантах осуществления олигомеры по изобретению являются функционализированными на 5'-конце для возможности ковалентного присоединения конъюгированной функциональной группы к 5'-концу олигомера. В других вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут быть функционализированными на 3'-конце. Еще в одних вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут быть функционализированными по всему скелету или в гетероциклическом основании функциональной группы. Еще в одних вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут быть функционализированными более чем в одном положении, независимо выбираемом из 5'-конца, 3'-конца,скелета и основания. В некоторых вариантах осуществления активированные олигомеры по изобретению синтезируют путем включения в них во время синтеза одного или более мономеров, ковалентно присоединенных к функциональной группе. В других вариантах осуществления активированные олигомеры по изобретению синтезируют с мономерами, которые не были функционализированы, и функционализацию олиго- 21019939 мера осуществляют после завершения синтеза. В некоторых вариантах осуществления олигомеры функционализированы с затрудненными сложными эфирами, содержащими аминоалкильный линкер, в котором алкильная часть имеет формулу (CH2)w, в которой w является целым числом в диапазоне от 1 до 10,предпочтительно около 6, и в котором алкильная часть алкиламиногруппы может представлять собой прямую цепь или разветвленную цепь и в котором функциональная группа присоединена к олигомеру посредством эфирной группы (-O-C(O)-(CH2)wNH). В других вариантах осуществления олигомеры функционализированы с затрудненными сложными эфирами, содержащими (СН 2)w-сульфгидрильный (SH) линкер, при этом w составляет целое число в диапазоне от 1 до 10, предпочтительно около 6, в котором алкильная часть алкиламиногруппы может представлять собой прямую цепь или разветвленную цепь и в котором функциональная группа присоединена к олигомеру посредством эфирной группы (-O-С(О)-(СН 2)wSH). В некоторых вариантах осуществления сульфгидрил-активированные олигонуклеотиды конъюгированы с полимерными функциональными группами, такими как полиэтиленгликоль или пептиды (посредством образования дисульфидной связи). Активированные олигомеры, содержащие затрудненные сложные эфиры, как описано выше, можно синтезировать любым способом, известным в данной области техники, и, в частности, способами, раскрытыми в опубликованной РСТ WO2008/034122 и в примерах указанной заявки, которая включена посредством ссылки полностью в настоящее изобретение. Еще в одних вариантах осуществления олигомеры по изобретению являются функционализированными путем введения в олигомер сульфгидрильной, амино или гидроксильной группы посредством, по существу, функционализирующего реактива, как описано в патентах США 4962029 и 4914210, то есть, по существу, линейного реактива, имеющего фосфорамидит на одном конце, связанный посредством гидрофильной спейсерной цепи с противоположным концом, который содержит защищенную или незащищенную сульфгидрильную, амино или гидроксильную группу. Такие реактивы прежде всего реагируют с гидроксильными группами олигомера. В некоторых вариантах осуществления такие активированные олигомеры имеют функционализирующий реактив, соединенный с 5'-гидроксильной группой олигомера. В других вариантах осуществления активированные олигомеры имеют функционализирующий реактив, соединенный с 3'-гидроксильной группой. Еще в одних вариантах осуществления активированные олигомеры по изобретению имеют функционализирующий реактив, соединенный с гидроксильной группой в скелете олигомера. В других дополнительных вариантах осуществления олигомер по изобретению функционализирован более чем одним из функционализирующих реактивов, как описано в патентах США 4962029 и 4914210, включенных в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте. Способы синтезирования таких функционализирующих реактивов и включения их в мономеры или олигомеры раскрыты в патентах США 4962029 и 4914210. В некоторых вариантах осуществления 5'-конец твердофазного связанного олигомера является функционализированным с производным диенил-фосфорамидита, с последующей конъюгацией олигомера со снятой защитой, например аминокислоты или пептида, посредством реакции циклоприсоединения Дильса-Альдера. В разных вариантах осуществления включение в олигомер мономеров, содержащих 2'-сахарные модификации, например 2'-карбаматзамещенный сахар или сахар 2'-(О-пентил-N-фталимидо)дезоксирибозу, облегчает ковалентное присоединение конъюгированных функциональных групп к сахару олигомера. В других вариантах осуществления изготавливают олигомер с аминосодержащим линкером в 2' положении в одном или более мономере, используя такой реактив, как, например, 5'диметокситритил-2'-О-(е-фталимидиламинопентил)-2'-дезоксиаденозин-3'-N,N-диизопропилцианэтокси фосфорамидит. См., например, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171. Еще в дополнительных вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут иметь аминсодержащие функциональные группы в нуклеотиде, включающем пуриновые аминогруппы в положенииN6, гуанин на экзоциклическом положении N2 или цитозин на N4 или 5 положениях. В разных вариантах осуществления такая функционализация может быть достигнута при использовании коммерческого реактива, который уже функционализирован в синтезе олигомера. Некоторые функциональные группы доступны коммерчески, например гетеробифункциональные и гомобифункциональные связывающие группы можно приобретать в компании Pierce Co. (Rockford, III.). Другие коммерчески доступные связывающие группы представляют собой реактивы 5'-аминомодификатор С 6 и 3'-аминомодификатор, которые продает корпорация Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Компания ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Калифорния) продает 5'-аминомодификатор С 6 под маркой Aminolink-2, и 3'-амино-модификатор доступен в компании Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Калифорния). Терапия и фармацевтические композиции - рецептура и введение. Согласно исходному объяснению олигонуклеотиды по настоящему изобретению входят в состав подходящих препаратов с улучшенными свойствами. Конструирование эффективного и безопасного препарата требует точной регуляции разных параметров, таких как аффинность/специфичность, устойчивость в биологических жидкостях, клеточный захват, механизм действия, фармакокинетические свой- 22019939 ства и токсичность. Соответственно, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид по изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель,носитель или адъювант. Предпочтительно указанный носитель представляет собой солевой раствор или буферный солевой раствор. В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Предполагается, что дозировка зависит от степени тяжести патологического состояния и его восприимчивости к лечению, и курс лечения продолжается от нескольких дней до нескольких месяцев или до достижения лечебного эффекта или уменьшения симптомов болезни. Оптимальные схемы введения дозы можно рассчитать по измерению накопления препарата в организме пациента. Оптимальные дозы могут варьировать в зависимости от относительной мощности отдельных олигонуклеотидов. В общем,основанием для оценки дозы могут быть показатели EC50 (средней дозы воздействия, вызывающей определенный эффект в 50%), при которых выявлен эффект в моделях животных in vitro и in vivo. В общем,доза составляет от 0,01 мкг до 1 г на 1 кг веса тела и может вводиться однократно или чаще ежедневно,еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже однократно каждые 2-10 лет, или путем постоянного вливания в течение от нескольких часов до нескольких месяцев. Частота повторного введения дозы устанавливается на основе измерения времени нахождения и концентраций препарата в жидкостях или тканях организма. После успешного лечения может быть желательным проведение поддерживающего лечения пациента с целью предотвращения рецидива болезни. Как указано выше, изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере один олигонуклеотид по изобретению в качестве активного компонента. Подразумевается, что фармацевтическая композиция согласно изобретению необязательно содержит фармацевтический носитель и что фармацевтическая композиция необязательно содержит дополнительные соединения, такие как химиотерапевтические соединения, противовоспалительные соединения, противовирусные соединения и/или иммуномодулирующие соединения. Олигонуклеотиды по изобретению можно использовать "как есть" или в виде ряда фармацевтически приемлемых солей. Используемый в изобретении термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, которые сохраняют желательное биологическое действие указанных в изобретении олигонуклеотидов и проявляют минимальные нежелательные токсические эффекты. Такие соли в качестве неограничивающих примеров могут быть образованы с органической аминокислотой, и аддитивные соли оснований образуют с катионами металлов, такими как цинк, кальций,висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий, натрий, калий и т.п., или с катионом,образованным аммонием, N,N-дибензилэтилен-диамином, D-глюкозамином, тетраэтиламмонием или этилендиамином. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид может находиться в форме пролекарства. Олигонуклеотиды в силу отрицательного заряда являются ионами. Благодаря липофильной природе клеточной мембраны захват олигонуклеотидов клеткой уменьшен по сравнению с нейтральными или липофильными эквивалентами. Можно избежать "помехи", обусловленной такой полярностью, применяя пролекарственный подход (см., например, Crooke, R.М. (1998) in Crooke, S. Т. Antisense researchand Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140). Фармацевтически приемлемые связующие агенты и адъюванты могут составлять часть рецептуры препарата. Примеры способов доставки для доставки терапевтических агентов, описанных в изобретении, а также подробности фармацевтических рецептур, солей могут быть хорошо описаны в других источниках, например в предварительных заявках США 60/838710 и 60/788995, которые включены посредством ссылки в изобретение, и в датской заявке РА 200600615, которая также включена в качестве ссылки в настоящее изобретение. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают без ограничения растворы,эмульсии и рецептуры, содержащие липосомы. Эти композиции можно получать из ряда компонентов,которые включают без ограничения подготовленные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Доставку препарата в опухолевую ткань можно увеличить с помощью носителей-медиаторов доставки, которые включают без ограничения катионоактивные липосомы, циклодекстрины, производные порфирина, дендримеры с разветвленной цепью, полимеры полиэтиленимина, наночастицы и микросферы (Dass C.R. J. Pharm. Pharmacol. 2002; 54(1):3-27). Фармацевтические рецептуры по настоящему изобретению, приемлемые для монолитной лекарственной формы, можно изготовлять согласно обычным способам, известным в фармацевтической промышленности. Такие способы включают этап соединения в ассоциацию активных компонентов с фармацевтическим носителем (носителями) или наполнителем (наполнителями). В общем, рецептуры изготавливают путем однородного и тщательного соединения в ассоциацию активных компонентов с жидкими носителями или мелкодисперсными твердыми носителями или и с теми, и другими, и затем, в случае необходимости,формования продукта. Рецептуру композиций по настоящему изобретению можно создавать в виде лю- 23019939 бой из многих возможных лекарственных форм, таких как таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели и суппозитории, но не ограничиваясь вышеперечисленным. Композиции по настоящему изобретению также могут создаваться в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия может также содержать стабилизаторы. Соединения по изобретению также могут быть конъюгированы с действующей лекарственной субстанцией, например, с аспирином, ибупрофеном, сульфапрепаратом, противодиабетическим препаратом, антибактериальным препаратом или антибиотиком. В другом варианте осуществления композиции по изобретению могут содержать одно или несколько олигонуклеотидных соединений, нацеленных на первую микроРНК, и одно или несколько дополнительных олигонуклеотидных соединений, нацеленных на вторую микроРНК-мишень. Два или более объединенных соединения можно использовать совместно или последовательно. Композиции, раскрытые в настоящем изобретении, являются полезными в ряде терапевтических применений, как указано выше. В целом, способы лечения по изобретению включают введение млекопитающему, в частности человеку, терапевтически эффективного количества олигонуклеотида. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей (а) одно или несколько соединений по изобретению и (b) один или несколько химиотерапевтических агентов. При использовании с соединениями по изобретению такие химиотерапевтические агенты могут применяться отдельно, последовательно или в комбинации с одним или более другими указанными химиотерапевтическими агентами или в комбинации с лучевой терапией. Все химиотерапевтические агенты, известные специалистам в данной области техники, включены в изобретение в качестве комбинированного лечения вместе с соединением согласно изобретению. Также в композициях по изобретению можно объединять другие активные вещества, такие как противовоспалительные препараты, включающие без ограничения нестероидные противовоспалительные препараты и кортикостероиды, противовирусные препараты и иммуномодулирующие препараты. Два или несколько комбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно. Примеры медицинских показаний, для лечения которых можно применять фармацевтические композиции по изобретению: Было установлено, что ген опухолевой супрессии тропомизин 1 (ТРМ 1) мРНК является мишенью для miR-21. Установлено, что миотрофин (mtpn) мРНК является мишенью для miR 375. Еще в одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида по изобретению для производства лекарственного средства для лечения болезни, выбранной из группы, состоящей из следующих заболеваний: атеросклероз, гиперхолестеринемия и гиперлипидемия; рак, глиобластома, рак молочной железы, лимфома, рак легкого; диабет, нарушения обмена веществ; миобластная дифференцировка; иммунные нарушения. Изобретение дополнительно относится к олигонуклеотидам по изобретению для использования в лечении болезни, выбранной из группы, состоящей из следующего: атеросклероз, гиперхолестеринемия и гиперлипидемия; рак, глиобластома, рак молочной железы, лимфома, рак легкого; диабет, нарушения обмена веществ; миобластная дифференцировка; иммунные нарушения. Изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего заболеванием или состоянием,выбранным из следующей группы: атеросклероз, гиперхолестеринемия и гиперлипидемия; рак, глиобластома, рак молочной железы, лимфома, рак легкого; диабет, нарушения обмена веществ; миобластная дифференцировка; иммунные нарушения, при этом способ включает стадию введения олигонуклеотида или фармацевтической композиции по изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Изобретение дополнительно относится к набору, содержащему фармацевтическую композицию согласно изобретению и второй независимый активный компонент, представляющий собой ингибитор пути сборки VLDL, такой как ингибитор АроВ, или ингибитор МТР. Рак. Еще в одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида по изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака. В другом аспекте настоящее изобретение касается способа лечения или профилактики рака, и указанный способ включает введение олигонуклеотида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению пациенту, который нуждается в таком введении. Указанные раковые заболевания могут включать лимфоретикулярную неоплазию, лимфобластный лейкоз, опухоли головного мозга, опухоли желудка, плазмоцитомы, множественную миелому, лейкоз,опухоли соединительной ткани, лимфомы и солидные опухоли. В отношении применения соединения по изобретению в изготовлении лекарства для лечения рака,оно может быть предназначено для такой формы указанного рака, как солидная опухоль. Аналогично,раскрытый в изобретении способ лечения рака может быть предназначен для такой формы указанного рака, как солидная опухоль. Кроме того, указанный рак также относится к карциноме. Карциному обычно выбирают из группы,состоящей из злокачественной меланомы, базальноклеточной карциномы, карциномы яичника, карциномы молочной железы, немелкоклеточного рака легкого, карциномы почечных клеток, карциномы мочевого пузыря, рецидивирующего поверхностного рака мочевого пузыря, карциномы желудка, карциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, карциномы легкого, цервикальной карциномы,цервикальной дисплазии, папилломатоза гортани, карциномы ободочной кишки, карциномы ободочной и прямой кишки и карциноидных опухолей. Чаще указанную карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной меланомы, немелкоклеточного рака легкого, карциномы молочной железы, карциномы ободочной кишки и карциномы почечных клеток. Злокачественную меланому обычно выбирают из группы, состоящей из поверхностной распространенной меланомы, узловой меланомы, меланомы lentigo maligna, акральной меланомы, амеланотической меланомы и десмопластической меланомы. Альтернативно, указанный рак может относиться к саркоме. Форму саркомы выбирают из группы,состоящей из остеосаркомы, саркомы Эвинга, хондросаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, фибросаркомы и саркомы Капоши. Альтернативно рак соответственно может представлять собой глиому. Дополнительный вариант осуществления направлен на применение олигонуклеотида согласно изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака, при этом указанное лекарственное средство дополнительно содержит химиотерапевтический агент, выбираемый из группы, состоящей из следующих агентов: адренокортикостероиды, такие как преднизон, дексаметазон или декадрон; алтретамин (гексален, гексаметилмеламин (НММ; амифостин (этиол); аминоглутетимид (цитадрен); амсакрин (M-AMSA); анастрозол (аримидекс); андрогены, такие как тестостерон; аспарагиназа (элспар); бацилла Кальметта-Герена; бикалутамид (касодекс); блеомицин (бленоксан); бусульфан (милеран); карбоплатин (параплатин); кармустин (BCNU, BiCNU); хлорамбуцил (лейкеран); хлордезоксиаденозин (2CDA, кладрибин, лейстатин); цисплатин (платинол); цитозин арабинозид (цитарабин); дакарбазин(флоксуридин); 5-фторурацил (5-FU); гемцитабин (гемзар); госерелин (зодалекс); герцептин (трастузумаб); гидроксимочевина (гидреа); идарубицин (идамицин); ифосфамид; интерлейкин ИЛ-2 (пролейкин,алдеслейкин); интерферон альфа (интрон А, роферон А); иринотекан (камптосар); леупролид (лупрон); левамизол (эргамизол); ломустин (CCNU); мехлоратамин (мустарген, хлорметин); мелфалан (алкеран); меркаптопурин (пуринетол, 6-МР); метотрексат (мексат); митомицин-С (мутамуцин); митоксантрон (новантрон); октреотид (сандостатин); пентостатин (2-дезоксикоформицин, нипент); пликамицин (митрамицин, митрацин); прокарбазин (матулан); стрептозоцин; тамоксифин (нолвадекс); таксол (паклитаксел); тенипозид (вумон, VM-26); тиотепа; топотекан (хикамтин); третиноин (весаноид, ол-транс-ретинойная кислота); винбластин (валбан); винкристин (онковин) и винорелбин (навелбин). Подходящим является выбор дополнительного химиотерапевтического агента из группы таксанов, например таксола, паклитак- 25019939 села или доцетаксела. Также изобретение дополнительно относится к применению олигонуклеотида по изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака, при этом указанное лечение дополнительно включает введение дополнительного химиотерапевтического агента, выбираемого из группы, состоящей из следующих агентов: адренокортикостероиды, такие как преднизон, дексаметазон или декадрон; алтретамин (гексален, гексаметилмеламин (НММ; амифостин (этиол); аминоглутетимид (цитадрен); амсакрин (M-AMSA); анастрозол (аримидекс); андрогены, такие как тестостерон; аспарагиназа (элспар); бацилла Кальметта-Герена; бикалутамид (касодекс); блеомицин (бленоксан); бусульфан (милеран); карбоплатин (параплатин); кармустин (BCNU, BiCNU); хлорамбуцил (лейкеран); хлордезоксиаденозин (2CDA, кладрибин, лейстатин); цисплатин (платинол); цитозин арабинозид (цитарабин); дакарбазин(флоксуридин); 5-фторурацил (5-FU); гемцитабин (гемзар); госерелин (зодалекс); герцептин (трастузумаб); гидроксимочевина (гидреа); идарубицин (идамицин); ифосфамид; интерлейкин ИЛ-2 (пролейкин,алдеслейкин); интерферон(интрон А, роферон А); иринотекан (камптосар); леупролид (лупрон); левамизол (эргамизол); ломустин (CCNU); мехлоратамин (мустарген, хлорметин); мелфалан (алкеран); меркаптопурин (пуринетол, 6-МР); метотрексат (мексат); митомицин-С (мутамуцин); митоксантрон (новантрон); октреотид (сандостатин); пентостатин (2-дезоксикоформицин, нипент); пликамицин (митрамицин,митрацин); прокарбазин (матулан); стрептозоцин; тамоксифин (нолвадекс); таксол (паклитаксел); тенипозид (вумон, VM-26); тиотепа; топотекан (хикамтин); третиноин (весаноид, ол-транс-ретинойная кислота); винбластин (валбан); винкристин (онковин) и винорелбин (навелбин). Подходящим при указанном лечении является дополнительное введение дополнительного химиотерапевтического агента, выбираемого из группы таксанов, например таксола, паклитаксела или доцетаксела. С другой стороны, цель настоящего изобретения, кроме того, относится к способу лечения рака,включающему введение олигонуклеотида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению пациенту, который нуждается в таком введении, и дополнительно включающему введение дополнительного химиотерапевтического агента. Указанное дополнительное введение можно осуществлять, например, с дополнительным химиотерапевтическим агентом, конъюгированным с соединением по изобретению, присутствующим в фармацевтической композиции, или с его введением в отдельной рецептуре. Инфекционные заболевания. Установлено, что соединения по изобретению можно широко применять при широком диапазоне инфекционных заболеваний, таких как дифтерия, столбняк, коклюш, полиомиелит, гепатит В, гепатит С,гемофильный грипп, корь, свинка и краснуха. При инфекции гепатита С выявляют Hsa-miR122, и, таким образом, олигонуклеотиды согласно изобретению, мишенью для которых является miR-122, можно использовать для лечения гепатита С. Соответственно, еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению для производства лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания, а также к способу лечения инфекционного заболевания, при этом указанный способ включает введение олигонуклеотида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению пациенту, который нуждается в таком введении. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к комбинированному лечению с использованием олигомера анти-miR-122 в комбинации с ингибитором сборки VLDL, таким как ингибитор АроВ или МТР. Воспалительные заболевания. Важным механизмом защиты организма против атаки возбудителей инфекций является воспалительная реакция, которая также вовлечена в патогенез многих острых и хронических заболеваний, включающих в себя аутоиммунные нарушения. Воспалительный ответ должен бороться с патогенами, но несмотря на это, его эффекты могут быть разрушающими. В этой связи часто необходимо ограничить симптоматологию воспаления путем применения противовоспалительных препаратов. Воспаление представляет собой комплексный процесс, обычно запускаемый повреждением тканей, которое включает активацию большого разнообразия ферментов, повышение проницаемости сосудов и транссудацию жидкостей крови, клеточную миграцию и высвобождение химических медиаторов, и целью всех указанных механизмов является и разрушение, и восстановление поврежденной ткани. Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению для производства лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания, а также к способу лечения воспалительного заболевания, при этом указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению или фармацевтической композиции согласно изобретению нуждающемуся в этом пациенту. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения воспалительное заболевание представляет собой ревматическую болезнь и/или болезни соединительной ткани, такие как ревматоид- 26019939 ный артрит, системная красная волчанка (СКВ) или волчанка, склеродерма, полимиозит, воспалительная болезнь кишечника, дерматомиозит, язвенный колит, болезнь Крона, васкулит, псориатический артрит,эксфолиативный псориатический дерматит, вульгарный пемфигус и синдром Шегрена, в частности воспалительную болезнь кишечника и болезнь Крона. Альтернативно воспалительное заболевание может быть неревматическим воспалением, представляя собой, например, бурсит, синовит, капсулит, тендинит и/или другие воспалительные повреждения травматического и/или спортивного происхождения. Нарушения обмена веществ. Нарушение обмена веществ представляет собой патологию, вызываемую накоплением химических продуктов, вырабатываемых организмом. Эти заболевания обычно являются тяжелыми, некоторые из них даже представляют опасность для жизни. Другие могут замедлять физическое развитие или вызывать задержку умственного развития. У большинства новорожденных с такой патологией вначале не проявляются очевидные признаки заболевания. Надлежащее скрининговое обследование при рождении может часто выявить такие проблемы. При ранней диагностике и лечении нарушения обмена веществ могут часто эффективно контролироваться. Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата для производства лекарственного средства для лечения нарушения обмена веществ, а также к способу лечения нарушения обмена веществ, при это указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата, или фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, который нуждается в таком введении. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нарушение обмена веществ выбирают из группы, состоящей из следующего: амилоидоз, биотинидаза, OMIM (Интернетбаза данных Менделевское наследование в человеке), синдром Криглера-Наджара, диабет, группа поддержки и информации Фабри (Fabry SupportInformation Group), нарушения окисления жирных кислот,галактоземия, дефицит глюкозы-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD), глутаровая ацидурия, Международная организация по глутаровой ацидурии, глутаровая ацидемия I типа, глутаровая ацидемия II типа, глутаровая ацидемия I типа, глутаровая ацидемия II типа, F-HYPDRR-семейная гипофосфатемия, витамин D резистентный рахит, болезнь Краббе, дефицит длинноцепочечной 3-гидроксиацил СоА дегидрогеназы(LCHAD), группа маннозидоза, болезнь кленового сиропа, митохондриальные нарушения, мукополисахаридозные синдромы: болезнь Нимана-Пика, органические ацидемии, фенилкетонурия (ФКУ), болезнь Помпа, порфирия, метаболический синдром, гиперлипидемия и наследственные липидные нарушения,триметиламинурия: синдром рыбного запаха и нарушения цикла мочевины. Заболевания печени. Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата для производства лекарственного средства для лечения заболеваний печени, а также к способу лечения заболеваний печени, при этом указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению, или его конъюгата, или фармацевтической композиции согласно изобретению нуждающемуся в этом пациенту. В одном предпочтительном варианте осуществления болезни печени выбирают из группы, состоящей из атрезии желчных протоков, синдрома Алажилля, -1 антитрипсиновой недостаточности, тирозинемии, гепатита новорожденных и болезни Вильсона. Другие применения. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать в качестве реактивов для диагностических, терапевтических и профилактических исследований. В целях исследования олигонуклеотид можно применять для специфичного ингибирования синтеза генов-мишеней в клетках и экспериментальных животных, что, таким образом, облегчает функциональный анализ мишени или оценку ее полезности в качестве цели для терапевтического вмешательства. Олигонуклеотиды можно использовать в диагностике для обнаружения и подсчета экспрессии мишени в клетке и тканях с помощью анализа нозерн-блоттинг, гибридизации in situ или подобными способами. Для лечения животного или человека с предполагаемым заболеванием или нарушением, которые можно лечить с помощью модуляции экспрессии мишени, указанное лечение осуществляют путем введения олигонуклеотидных соединений согласно настоящему изобретению. Дополнительно рассматриваются способы лечения животного, в частности мыши и крысы, и способы лечения человека с подозрением на наличие или склонность к заболеванию или к состоянию, связанному с экспрессией мишени, путем введения терапевтически или профилактически эффективного количества одного или более олигонуклеотидных соединений или композиций по изобретению. Терапевтическое применение олигонуклеотидов, нацеленных на miR-122a. Авторы показали, что ЗНК-анти-miR, которая нацелена на miR-122a, уменьшает уровень холестерина в плазме. Поэтому другим аспектом изобретения является применение в качестве лекарственного средства описанных выше олигонуклеотидов, нацеленных на miR-122a. Еще одним аспектом изобретения является использование описанных выше олигонуклеотидов, нацеленных на miR-122a, в изготовлении лекарственного средства для лечения повышенного уровня холестерина в плазме (или гиперхолестеринемии и связанных с этим патологий). Специалисту в данной об- 27019939 ласти техники будет понятно, что повышение в плазме уровня холестерина является нежелательным,поскольку при этом увеличивается риск разных состояний, например развития атеросклероза. Еще одним аспектом изобретения является использование описанных выше олигонуклеотидов, нацеленных на miR-122a, для ап-регуляции содержания Nrdg3, Aldo A, Bckdk или CD320 в мРНК. Варианты осуществления Следующие варианты осуществления настоящего изобретения можно использовать в комбинации с другими вариантами осуществлениями, описанными в изобретении. 1. Фармацевтическая композиция, содержащая олигомер длиной от 6 до 12 нуклеотидов, в которой указанный олигомер содержит непрерывную нуклеотидную последовательность общей длиной от 6 до 12 нуклеотидов, например 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 нуклеотидных единиц, в которой по меньшей мере 50% нуклеиновых оснований единиц олигомера представляют собой высокоаффинные единицы нуклеотидных аналогов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант. 2. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 1, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области последовательности микроРНК (миРНК) млекопитающего, человека или вируса. 3. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 2, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области последовательности миРНК,выбранной из группы миРНК, которые перечислены в одной из табл. 3, 4 или 5. 4. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 2 или 3, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна исходной последовательности указанной микроРНК. 5. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 2-4, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которую выбирают из любой из последовательностей, перечисленных в табл. 3 или 4. 6. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 4 или 5, в которой 3'нуклеиновое основание сидмера образует в основном 3'-нуклеиновое основание непрерывной нуклеотидной последовательности, при этом непрерывная нуклеотидная последовательность может необязательно содержать одно или два дополнительных 5'-нуклеиновых оснований. 7. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-6, в которой указанная непрерывная нуклеотидная последовательность не содержит нуклеотид, который соответствует первому нуклеотиду, находящемуся в последовательности микро-РНК, считая от 5'-конца. 8. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-7, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей нуклеотидной последовательности, находящейся в миРНК, которую выбирают из указанных в табл. 3, или 4, или 5. 9. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 8, в которой указанную миРНК выбирают из группы, состоящей из miR-1, miR-10b, miR-17-3 р, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR194, miR-221, miR-222 и miR-375. 10. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-9, в которой по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или все из единиц нуклеиновых оснований из непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой единицы нуклеотидных аналогов. 11. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 10, в которой единицы нуклеотидных аналогов выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК,единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицы ИНК и единицы 2'-МОЕ-РНК. 12. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 10 или 11, в которой по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или все из единиц нуклеиновых оснований из непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой единицы нуклеиновых оснований замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК). 13. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 12, в которой все из единиц нуклеиновых оснований из непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой единицы нуклеиновых оснований ЗНК. 14. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-13, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 7, 8, 9 или 10 предпочтительно непрерывных единиц нуклеиновых оснований ЗНК. 15. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-14, в которой олигомер состоит из 7, 8, 9 или 10 непрерывных единиц нуклеиновых оснований и в которой по меньшей мере 7 единиц нуклеиновых оснований являются единицами нуклеотидного аналога. 16. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 15, в которой единицами нуклеотидных аналогов являются единицы нуклеиновых оснований замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК). 17. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 15, в которой единицы нуклеотидных аналогов в молекуле состоят из смеси по меньшей мере 50% единиц ЗНК и до 50% других единиц нуклеотидных аналогов. 18. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-17, в которой по меньшей мере 75%, например 80, или 85, или 90, или 95%, или все из межнуклеозидных связей, расположенных между единицами нуклеиновых оснований непрерывной нуклеотидной последовательности, представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи. 19. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-18, в которой указанный олигомер конъюгирован с одним или более соединениями, не являющимися нуклеиновыми основаниями. 20. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-19, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей последовательности по меньшей мере из двух последовательностей миРНК, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или из 10 последовательностей миРНК. 21. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-20, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна последовательности по меньшей мере из двух последовательностей исходной области миРНК, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или из 10 последовательностей исходной области миРНК. 22. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 20 или 21, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области и miR221, и miR-222. 23. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 22, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна 5'GCUACAU3'. 24. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-23, в состав которой олигомер входит в качестве пролекарства. 25. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-24, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области has-miR-122. 26. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 25 для использования в лечении клинического нарушения или заболевания, выбираемого из группы, состоящей из вирусной инфекции гепатита С и гиперхолестеринемии и связанных с ними нарушений. 27. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 25 или 26, в которой композиция дополнительно содержит второй независимый активный компонент, который является ингибитором пути сборки VLDL, например ингибитором АроВ или ингибитором МТР. 28. Набор, содержащий фармацевтическую композицию согласно варианту осуществления 25 или 26 и второй независимый активный компонент, который является ингибитором пути сборки VLDL, например ингибитором АроВ или ингибитором МТР. 29. Способ лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК, включающий стадию введения пациенту, у которого диагностировано или предполагается указанное заболевание или клиническое нарушение, фармацевтической композиции согласно любому из вариантов осуществления 1-28. 30. Олигомер согласно описанию в любом из вариантов осуществления 1-25. 31. Конъюгат, содержащий олигомер по варианту осуществления 30 и по меньшей мере одно соединение, которое не является нуклеиновым основанием. 32. Применение олигомера или конъюгата, определенных в любом из вариантов осуществления 3031, для производства лекарственного средства для лечения заболевания или клинического нарушения,связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК. 33. Способ уменьшения количества или эффективного количества миРНК в клетке, экспрессирующей указанную миРНК, который включает введение в указанную клетку олигомера, конъюгата или фармацевтической композиции по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, для уменьшения количества или эффективного количества миРНК в клетке. 34. Способ дерепрессии мРНК, экспрессия которой репрессируется миРНК, в клетке, экспрессирующей и указанную мРНК, и указанную миРНК, который включает введение в указанную клетку олигомера, конъюгата или фармацевтической композиции по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, для дерепрессии экспрессии мРНК. Ссылки: подробности ссылок представлены в приоритетных документах. Примеры Синтез мономеров ЗНК и олигонуклеотидов осуществляли с использованием методик, упомянутых в примерах 1 и 2 из патента WO 2007/112754. Стабильность олигонуклеотидов ЗНК в плазме человека или крысы достигалась с помощью методики, упомянутой в примере 4 из WO 2007/112754. Обработку клеток in vitro антисмысловым олигонуклеотидом ЗНК анти-miR (нацеленным на miR-122) осуществляли по методике, упомянутой в примере 6 из WO 2007/112754. Анализ олигонуклеотидного ингибирования экспрессии miR-специфичной микроРНК путем количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в условиях модели как in vitro, так и in vivo проводили по методике, упомянутой в примере 7 из WO