Выделенная молекула нуклеиновой кислоты и ее применение

ВЫДЕЛЕННАЯ МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые уникальны для трансгенного MIR162 растения кукурузы, и способам детектирования ДНК этих растений. Изобретение также относится к растениям кукурузы, содержащим трансгенный генотип MIR162, и способам получения растения кукурузы путем скрещивания растения кукурузы, которое содержит генотип растения MIR162, с самим собой или с другим сортом кукурузы. Семена растений кукурузы, содержащие указанный генотип, также являются предметом настоящего изобретения. 019578 Настоящее изобретение относится в основном к области молекулярной биологии растений, трансформации и селекции растений. В частности, изобретение связано с устойчивыми к поражению насекомыми трансгенными растениями кукурузы, содержащими новый трансгенный генотип, и со способами детектирования присутствия нуклеиновых кислот, которые уникальны только для трансгенных растений кукурузы, и к составам на их основе. Сельскохозяйственные вредители являются основной причиной потери мирового сельскохозяйственного урожая. Только в США убытки от повреждения урожая сельскохозяйственными вредителями,включая насекомых, составляют около 8 млрд долларов. Кроме причинения ущерба полевым культурам сельскохозяйственные вредители также доставляют большие неудобства фермерам, выращивающим овощи, фрукты, декоративные цветы, а также садоводам-любителям. Количество насекомых-вредителей контролируется в основном интенсивным использованием химических пестицидов, которые задерживают рост насекомых, препятствуют питанию и размножению насекомых или приводят к их гибели. Таким образом, достигается хороший контроль над численностью насекомых, но данные химикаты могут навредить и другим, полезным, насекомым. Другая проблема,вызванная широким применением химических пестицидов, заключается в появлении видов насекомых,устойчивых к их воздействию. Частично данная проблема была решена путем внедрения различных методов повышения стойкости к повреждениям, но наблюдается увеличение спроса на альтернативные агенты для борьбы с вредителями. Биологические агенты для борьбы с вредителями, например штаммыBacillus thuringiensis (Bt), экспрессирующие пестицидные токсины, например -эндотоксин, также применялись для растений кукурузы и показывали удовлетворительные результаты, являясь альтернативой или дополнением к химическим пестицидам. Выделены гены, кодирующие некоторые из эндотоксинов, и показана их экспрессия в гетерологичных хозяевах. Гены оказались другим средством для контроля популяций вредных насекомых, приносящих убытки экономике. В частности, экспрессия 5 эндотоксинов Bt обеспечила эффективную защиту от выбранных вредных насекомых, а трансгенные растения, экспрессирующие такие токсины, принесли коммерческую пользу, позволяя фермерам снизить объем применения химических агентов для борьбы с насекомыми. Также установлено другое семейство инсектицидных белков, продуцируемых видами Bacillus во время вегетативной стадии роста (вегетативные инсектицидные белки (Vip. В патентах США 5877012,6107279 и 6137033, которые включены в настоящий документ со ссылкой, описан новый класс инсектицидных белков под названием Vip3. В других публикациях, включая WO 98/18932, WO 98/33991,WO 98/00546 и WO 99/57282, также было дано определение гомологам белков класса Vip3. Кодирующие последовательности Vip3 кодируют белки около 88 кДа, которые проявляют инсектицидную активность по отношению к ряду чешуекрылых вредителей, включая, без ограничения, совку-ипсилон (BCW, Agrotisipsilon), совку травяную (FAW, Spodoptera frugiperda), табачную листовертку (TBW, Heliothis virescens),огневку сахарного тростника, (SCB, Diatraea saccharalis), малого сверлильщика стеблей кукурузы (LCB,Elasmopalpus lignosellus) и червя коробочного (CEW, Helicoverpa zea), и проявляют экспрессию в трансгенных растениях, например, кукурузе (Zea mays), обеспечивая защиту растения от пожирания насекомыми. В целом способы трансформации растений приводят к произвольной интеграции трансгенов, например vip3, в геном растения-хозяина. Такое произвольное инсертирование представленной введенной ДНК в геном растения может оказаться летальным, если также в растение инсертируется чужеродная ДНК, и, таким образом, мутирует критически важный нативный ген. Кроме того, даже если произвольная инсерция не нарушит функционирование гена клетки-хозяина, на экспрессию инсертированного чужеродного гена могут повлиять "эффекты положений", вызванные окружающей геномной ДНК. В некоторых случаях ген инсертируется в сайты, в которых эффекты положения достаточно сильны для предупреждения синтеза эффективного количества продукта из введенного гена. Например, было обнаружено,что в растениях присутствует большое число вариаций с точки зрения уровней экспрессии гетерологичного гена, введенного в хромосому растения, среди индивидуально выбранных объектов. Также могут возникнуть различия в пространственных или временных структурах экспрессии, например различия в относительной экспрессии трансгена в различных тканях растения, которые могут не соответствовать структурам, которые ожидаются от транскрипционных регуляторных элементов, присутствующих в структуре встроенного гена. В других случаях перепродукция генного продукта может иметь отрицательные последствия для клетки. На фоне таких потенциальных проблем принято разрабатывать сотни различных объектов и проводить скрининг таких объектов для выявления единственного объекта, который обладает желательными моделями и уровнями экспрессии трансгена из коммерческих соображений. Тем не менее, сразу, как только будет выявлен коммерчески ценный сайт внутри генома растения, будет целесообразным доставить представляющие интерес гены-мишени в такой невредный сайт. Были описаны некоторые способы направленного инсертирования представляющей интерес нуклеотидной последовательности в специфичный хромосомный сайт в клетке растения. Сайт-специфичные системы рекомбинации обнаружены в некоторых прокариотических и низших эукариотических организмах. Как правило, такие системы объединяют один или несколько белков, которые распознают две копии-1 019578 специальной нуклеотидной последовательности, расщепляют и лигируют такие нуклеотидные последовательности и обеспечивают точный, сайт-специфичный обмен генетической информацией. Для такого способа известно несколько сайт-специфичных рекомбиназ. Сюда относятся, включая без ограничения,бактериофаги системы P1 Cre/lox (Остин и др. (1981), Клетка 25: 729-736), система рекомбиназы R/RS из плазмиды pSR1 дрожжей Zygosaccharomyces rouxii (Араки и др. (1985), Дж. Мол. биол. 182: 191-203),система Gin/gix фага Mu (Мезер и Кальман (1991), Мол. генная генетика 230: 170-176), система рекомбиназы FLP/FRT от плазмиды 2.mu.m дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Броач и др. (1982), Клетка 29:227234), и рекомбиназа Int от бактериофага Lambda (Ланди (1989), Ежег. ред. Биохимия. 58: 912-949; Ланди(1993), Тек. ред. Генетика. Часть 3: 699-707; Лорбах и др. (2000), Дж. Мол. биол. 296: 1175-1181; WO 01/16345). Один отдельный пригодный сайт-специфичный способ направленной доставки, описанный в патенте США, заявка на публикацию 2006/0130179, включенный в данный документ со ссылкой, использует рекомбинацию, опосредованную лямбда-интегразой. Этот способ предусматривает введение в клетку растения мишеневой нуклеотидной последовательности, содержащей первый сайт распознавания интегразы; введение в клетку растения донорной нуклеотидной последовательности, содержащей второй сайт распознавания интегразы; и введение в клетку растения интегразы или комплекса интегразы. Другой пригодный сайт-специфичный способ направленной доставки раскрыт в патенте США, заявка на публикацию 2006/0253918, включенном в данный документ со ссылкой, который использует гомологичную рекомбинацию для интеграции одного или нескольких генов (стэкинг генов) в отдельные места в геноме. Объект, который обладает необходимыми уровнями или структурами трансгенной экспрессии, пригоден для интрогрессии трансгена в другой генетический фон путем полового скрещивания с применением традиционных способов получения. Потомство таких скрещиваний поддерживает характеристики трансгенной экспрессии первоначального трансформанта. Такой способ используется для обеспечения надежной экспрессии гена в большом количестве видов, которые хорошо адаптированы к локальным условиям произрастания. Также было бы целесообразно обнаружить присутствие отдельного растения с целью определения того, содержит ли потомство полового скрещивания представляющий интерес трансген. Кроме того, способ детектирования отдельного объекта был бы полезен для соблюдения положений,требующих утверждения до поступления на рынок и маркировки продуктов питания, полученных, например, из рекомбинантных растений кукурузы. Существует необходимость детектирования присутствия трансгена путем применения хорошо известного способа детектирования нуклеиновых кислот,включая, без ограничения, термическую амплификацию (полимеразная цепная реакция (ПЦР с использованием полинуклеотидных праймеров или гибридизацию ДНК при помощи зондов нуклеиновой кислоты. Как правило, ради простоты и единообразия реагентов и методологии для использования при детектировании определенной конструкции ДНК, используемой для трансформации различных видов растений, такие способы детектирования, как правило, фокусируются на часто используемых генетических элементах, например, промоторах, терминаторах и генах-маркерах, так как для многих структур ДНК область кодирующей последовательности является взаимозаменяемой. В результате, такие способы пригодны для определения различия между конструкциями, которые отличаются только с точки зрения кодирующей последовательности. Кроме того, такие способы могут оказаться бесполезными для определения различия между различными растения, в частности, теми которые получают при использовании той же структуры ДНК, если только не известна последовательность хромосомной ДНК, расположенной рядом с инсертированной гетерологичной ДНК ("фланкирующая ДНК"). Ввиду вышеуказанных причин есть потребность в трансгенной кукурузе, устойчивой к поражению насекомыми-вредителями, содержащей новые последовательности нуклеиновых кислот, уникальные для трансгенной кукурузы, пригодные для определения трансгенной кукурузы и для детектирования нуклеиновых кислот трансгенной кукурузы в биологическом образце, а также в наборах, содержащих реагенты,необходимых для детектирования таких нуклеиновых кислот в биологическом образце. Также есть дальнейшая потребность в предоставлении специфичных целевых сайтов внутри генома кукурузы для направленной доставки и контроля за инсертированием нуклеотидных последовательностей, вводимых в геном кукурузы. Краткие выводы Данное изобретение относится к трансгенной кукурузе (Zea mays), названной как MIR162, который содержит новый трансгенный генотип, включающий в себя кодирующую последовательность vip3Aa20,уникальную для MIR162. Кодирующая последовательность vip3Aa20 кодирует инсектицидный белокVip3Aa20, который придает устойчивость к повреждению насекомыми для трансгенных растений кукурузы MIR162. Трансгенное растение MIR162 также содержит кодирующую последовательность pmi, кодирующую белок PMI, который наделяет клетки кукурузы способностью к использованию маннозы в качестве источника углерода. Помимо кодирующей последовательности vip3Aa20 данное изобретение также представляет прочие нуклеиновые кислоты, уникальные для MIR162. Изобретение также предусматривает трансгенные растения кукурузы, уникальные для MIR162, семя трансгенных растений кукурузы и способы получения трансгенного растения кукурузы, содержащего уникальные нуклеиновые кислоты изобретения, путем скрещивания инбредной кукурузы, содержащей нуклеиновые кислоты, уни-2 019578 кальные для MIR162, с самой собой или с другой линией кукурузы различного генотипа. Образец семени и, следовательно, растений кукурузы, выращенных из семян, содержащих нуклеиновые кислоты, уникальные для MIR162, были депонированы в Американской коллекции типовых культур под входящим номеромРТА-8166. Трансгенные растения кукурузы изобретения могут иметь практически все морфологические и физиологические характеристики соответствующих изогенных нетрансгенных растений кукурузы в дополнение к тем, которыми обладают растения кукурузы при использовании нового генотипа изобретения. Биологические образцы и экстракты из трансгенного растения кукурузы MIR162, тканей и семян кукурузы также включены в данное изобретение. Данное изобретение также включает составы и способы детектирования присутствия нуклеиновых кислот, уникальных для трансгенного растенияMIR162 в биологических образцах на основе последовательности ДНК рекомбинантных полигенных экспрессирующих кластеров, инсертированной в геном кукурузы, которая приводит к появлению растения MIR162 и геномных последовательностей, фланкирующих инсерционный сайт. Данное изобретение также предусматривает невредоносный целевой инсерционный сайт на хромосоме кукурузы, пригодный для инсертирования представляющих интерес генов в специфичное положение на хромосоме, и способы изменения генома кукурузы путем инсертирования гетерологичных полинуклеотидов в описанный инсерционный сайт или рядом с ним. Трансгенное растение MIR162 далее может быть охарактеризовано при анализе уровней экспрессии белков Vip3Aa20 и PMI, а также путем испытания MIR162 на эффективность защиты от чешуекрылых насекомых-вредителей. Данное изобретение также предусматривает способы получения трансгенного растения кукурузы, устойчивого к широкому ряду насекомыхвредителей, путем стэкинга характеристики белка Vip3Aa20, устойчивого к поражению насекомымивредителями, и характеристик устойчивости к поражению насекомыми-вредителями, отличающихся отVip3Aa20. Вышеуказанное и прочие аспекты изобретения будут более наглядны из следующего подробного описания. Описание последовательности в списке последовательностейSEQ ID : 4-12 - праймеры и зонды, пригодные для количественного анализа TAQMAN.SEQ ID : 106 - последовательность области хромосомы 5 кукурузы, содержащей указанный хромосомный сайт-мишень.SEQ ID : 107 - геномная последовательность кукурузы, которая замещается в результате инсерции гетерологичной ДНК в MIR162. Подробное описание Для более четкого описания данного изобретения и получения справочной информации по общепринятым специальным знаниям, используемым в данном изобретении, представлены следующие определения и способы. Если не указано иное, то понятия, используемые в данном документе, следует толковать в соответствии с их традиционным пониманием в обычных знаниях в соответствующей области. Определения общих понятий в молекулярной биологии можно найти в работе Ригера и др. "Глоссарий терминов генетики: классической и молекулярной", 5-е издание, Шпрингер-Верлаг: Нью-Йорк, 1994. Номенклатура для оснований ДНК и аминокислот, используемых здесь, изложена в Своде федеральных правил 37,1.822. В том значении, в котором оно используются в данном документе, понятие "амплифицированный" обозначает конструирование многочисленных копий, комплементарных молекуле нуклеиновых кислот, с-3 019578 использованием по меньшей мере одной из молекул нуклеиновых кислот в качестве матрицы. Системы амплификации включают, без ограничения, систему полимеразной цепной реакции (ПЦР), систему лигазной цепной реакции (ЛЦР), последовательность нуклеиновой кислоты на основе амплификации (амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), Канген, Миссисауга,Онтарио), систему репликазы Q-бета, системы амплификации на основании транскрипции (TAS) и амплификации замещением цепей (SDA). См., к примеру, "Диагностическая молекулярная микробиология: Принципы и применение, Д.Н. Персинг и др., ред., Американское общество микробиологов, Вашингтон(1993). Продукт амплификации называется ампликоном."Кодирующая последовательность" - последовательность нуклеиновых кислот, которая транскрибируется в РНК, например мРНК, рРНК, тРНК, миРНК, смысловую РНК или антисмысловую РНК. Предпочтительно РНК затем транслируется в организме для продуцирования белка. В том значении, в котором он используется в данном документе, термин "кукуруза" означает видZea mays или кукуруза и включает все разнообразия растений, которые можно выводить при помощи кукурузы, включая виды дикой кукурузы."Набор для детектирования", в том значении, в каком он используется в данном документе, относится к набору компонентов, пригодных для детектирования присутствия или отсутствия ДНК, характерной для трансгенного растения MIR162 в образце, причем комплект содержит зонды на основе нуклеиновой кислоты и/или праймеры настоящего изобретения, которые специфически гибридизируются в строгих условиях с последовательностью мишеневой ДНК, и другие материалы, необходимые для проведения методов гибридизации полинуклеотидов или амплификации. В том значении, в котором он используется в данном документе, термин "трансгенное растение" относится к рекомбинатному растению, продуцируемому путем трансформации и регенерации клетки или ткани растения при помощи гетерологичной ДНК, например полигенного экспрессирующего кластера, который включает в себя представляющий интерес ген. Понятие "растение" относится к оригинальному трансформанту и/или потомству трансформанта, которые содержат гетерологичную ДНК. Понятие"растение" также относится к потомству, продуцируемому путем полового скрещивания между трансформантом и другой линией кукурузы. Даже после повторного обратного скрещивания с рекуррентным родителем, инсертированная ДНК и фланкирующая ДНК трансформированного родителя присутствуют в потомстве скрещивания с тем же положением хромосом. Понятие "растение" также относится к ДНК от оригинального трансформанта, содержащего инсертированную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно прилегающую к инсертированной ДНК, как ожидается, передаваемую потомству, которое получает инсертированную ДНК, в том числе представляющий интерес трансген, в результате полового скрещивания одной родительской линии, которая содержит инсертированную ДНК (например, оригинальный трансформант и потомство, образовавшееся путем самовоспроизведения), и родительской клеточной линии, которая не содержит инсертированную ДНК. Как правило,трансформация ткани приводит к образованию множества растений, каждое из которых представляет инсерцию конструкции ДНК в различные участки генома клетки растения. На основе экспрессии трансгена или прочих желаемых характеристик селектируется определенное растение. Поэтому термины"трансгенное растение MIR162", "MIR162" или "MIR162 растение" могут использоваться, взаимно заменяя друг друга. Растение кукурузы MIR162, устойчивое к поражению насекомыми-вредителями, может селектироваться путем первоначального полового скрещивания первого родительского растения кукурузы, состоящего из растения кукурузы, выращенного из трансгенного растения кукурузы MIR162, например растения кукурузы MIR162, выращенного из семени, депонированного в АКТК под входящимРТА 6188, и его потомства, полученного в результате трансформации полигенными экспрессирующими кластерами вариантов выполнения данного изобретения, которое наделяет его стойкостью к повреждению насекомыми-вредителями, и второго родительского растения кукурузы, у которого отсутствует устойчивость к повреждению насекомыми-вредителями, создавая при этом многообразие растений первого потомства, а затем проводя селекцию растения первого потомства, стойкого к повреждению насекомыми; и самовоспроизводя растение первого потомства, создавая при этом многообразие растений второго потомства, а затем проводя селекцию растения, стойкого к повреждению насекомыми, из растений второго потомства. Кроме того, такие шаги могут включать в себя обратное скрещивание растения первого потомства, стойкого к повреждению насекомыми, или растения второго потомства, стойкого к повреждению насекомыми, для получения второго родительского растения кукурузы или третьего родительского растения кукурузы, создавая при этом растение кукурузу, стойкое к повреждению насекомыми."Полигенный экспрессирующий кластер", в том значении, в котором такое понятие используется в этом тексте, обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную к направляющей экспрессии определенной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке-хозяине, содержащей промотор,функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, которая, в свою очередь, функционально связана с сигналами терминации. Как правило, она также содержит последовательности, необходимые для надлежащей соответствующей трансляции нуклеотидной последовательности. Полигенный экспрессирующий кластер может также включать в себя последовательности, не-4 019578 требующиеся для прямой экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности, но которые присутствуют по причине соответствующих сайтов рестрикции для извлечения кассеты из вектора экспрессии. Полигенный экспрессирующий кластер, объединяющий в себе представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть химерным, что означает, что по меньшей мере один из его компонентов является гетерологичным по отношению хотя бы к одному из его компонентов. Полигенный экспрессирующий кластер может быть одним из тех, которые присутствуют в природе, но были получены в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Тем не менее, как правило, полигенный экспрессирующий кластер является гетерологичным по отношению к хозяину, т.е. отдельная последовательность нуклеиновой кислоты полигенного экспрессирующего кластера не существует в природе в клетке-хозяине и должна быть введена в клетку-хозяин или предка клетки-хозяина,при помощи способа трансформации, известного в данной области. Экспрессия нуклеотидной последовательности в полигенном экспрессирующем кластере может контролироваться конститутивным промотором или индуцируемым промотором, который инициирует транскрипцию только тогда, когда клеткахозяин подвержена воздействию некоторого отдельного внешнего раздражителя. В случае с многоклеточными организмами, например с растениями, промотор также может быть специфичен для определенной ткани или органа или стадии развития. Полигенный экспрессирующий кластер или его фрагмент также может называться как "инсертированная последовательность" или "инсерционная последовательность" при трансформации в растении."Ген" - определенная область, расположенная в геноме, которая, кроме вышеуказанной кодирующей последовательности, может объединять другие, преимущественно регуляторные последовательности полинуклеотидов, ответственные за регулирование экспрессии, т.е. за транскрипцию и трансляцию кодирующей области. Ген может также объединять в себе 5' и 3' нетранслируемые последовательности и терминационные последовательности. Прочие элементы, которые могут присутствовать, это, например,интроны."Представляющий интерес ген" относится к любому гену, который, если переносится в растение,наделяет его необходимыми характеристиками, например, устойчивостью к антибиотикам, вирусостойкостью, устойчивостью к повреждениям насекомыми-вредителями, устойчивостью к заболеваниям или устойчивостью к прочим насекомым-вредителям, устойчивостью к гербицидам, повышенной питательной ценностью, повышенной производительностью в любом промышленном процессе или измененной способностью к размножению."Генотип", в том значении, в каком это понятие используется в данном документе, является генетическим материалом, унаследованным от родительского растения кукурузы, не все из которого обязательно экспрессируются в потомственных растениях кукурузы. Генотип MIR162 относится к гетерологичному генетическому материалу, трансформируемому в геном растения, а также к генетическому материалу,фланкирующему инсертированную последовательность."Гетерологичная" последовательность нуклеиновых кислот является последовательностью нуклеиновых кислот, не связанной в природе с клеткой-хозяином, в которую она вводится, включая многочисленные копии неприродного происхождения природной последовательности нуклеиновых кислот."Гомологичная" последовательность нуклеиновых кислот является последовательностью нуклеиновых кислот, естественно связанной с клеткой-хозяином, в которую она вводится."Функционально связанный" относится к ассоциации последовательности нуклеиновых кислот на отдельном фрагменте нуклеиновой кислоты так, что функционирование одной влияет на функционирование другой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью или функциональной РНК, если он способен оказывать влияние на экспрессию такой кодирующей последовательности или функциональной РНК (т.е. кодирующая последовательность или функциональная РНК находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующая последовательность в смысловой или антисмысловой ориентации может быть функционально связана с регуляторной последовательностью."Праймеры", в том значении, в каком это понятие используется в данном документе, являются изолированной нуклеиновой кислотой, которая ренатурируется до комплементарной нити мишеневой ДНК путем гибридизации нуклеиновой кислоты для образования гибрида между праймером и нитью мишеневой ДНК, и затем удлиняется вдоль нити ДНК при помощи полимеразы, например ДНК-полимеразы. Пары праймеров или наборы применимы для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, например,путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) или прочими традиционными методами амплификации нуклеиновой кислоты."Зонд" является изолированной нуклеиновой кислотой, к которой прикрепляется стандартная определяемая метка или репортерная молекула, например, радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентный агент или фермент. Такой зонд комплементарен нити мишеневой нуклеиновой кислоты в данном изобретении нити геномного ДНК MIR162 кукурузы. ДНК MIR162 может быть получена из растения кукурузы или из отдельного образца, который содержит ДНК трансгенного MIR162. Зонды в соответствии с данным изобретением включают в себя не только дезоксирибонуклеиновую кислоту или рибонуклеиновую кислоту, но и полиамиды, и прочие материалы зонда, которые специфично связываются-5 019578 с мишеневой последовательностью ДНК и могут использоваться для обнаружения присутствия такой мишеневой последовательности ДНК. Длина праймеров и зондов в целом варьируется от 10 и 15 нуклеотидов в цепочке. Длина праймеров и зондов также может быть не менее 20 нуклеотидов или больше, или по меньшей мере 25 нуклеотидов или более, или 30 нуклеотидов или более. Такие праймеры и зонды специфично гибридизируются с целевой последовательностью в строгих условиях. Праймеры и зонды в соответствии с данным изобретением могут содержать полную последовательность с комплементарностью к мишеневой последовательности, хотя зонды отличаются от мишеневой последовательности, сохраняют способность к гибридизации с мишеневой последовательностью и создаются традиционными способами. В том значении, в котором он используется в данном документе, термин "стэкинг" генов или признаков обозначает объединение необходимых признаков в одну трансгенную линию. Агрономыселекционеры объединяют трансгенные признаки путем скрещивания между родителями, каждый из которых обладает желаемым признаком, и затем определяют потомство, которое обладает обоими желаемыми признаками. Другим способом стэкинга генов является встраивание двух или более генов в ядро клетки растения во время трансформации. Еще одним способом стэкинга генов является повторная трансформация трансгенного растения при помощи другого "представляющего интерес гена". Например,стэкинг генов может использоваться для объединения двух различных признаков стойкости к повреждениям насекомыми-вредителями, признака стойкости к повреждениям насекомыми-вредителями и признака устойчивости к болезням или признака устойчивости к гербицидам. Использование селектируемого маркера в дополнение к "представляющему интерес гену" также может рассматриваться как стэкинг генов."Строгие условия" или "строгие условия гибридизации" относят к условиям, при которых зонд гибридизируется со своей мишеневой последовательностью, с гораздо более заметной степенью, чем с другой последовательностью. Жесткие условия являются зависимыми от мишеневой последовательности и различаются в зависимости от структуры полинуклеотида. Контролируя строгость гибридизации и/или условия промывки, возможно определение мишеневой последовательности, которая на 100% комплементарна зонду (гомологичное зондирование). В качестве альтернативного варианта, жесткие условия регулируются таким образом, чтобы допустить некоторую несогласованность в последовательностях для обнаружения меньших степеней подобия (гетерологичное зондирование). Более длинные последовательности специфично гибридизируются при более высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в труде Тиджссена (1993), "Лабораторные методы в биохимии и гибридизация с зондами нуклеиновой кислоты в молекулярной биологии", часть I, глава 2 "Обзор принципов гибридизации и методика количественного анализа зондов нуклеиновой кислоты", Эльсевье: Нью-Йорк; и в "Текущих протоколах по молекулярной биологии", часть 2, Аусубель и др. ред., Грин Паблишинг и Уайли-Интерсайэнс: Нью-Йорк (1995), а также Самбрук и др. (2001), Молекулярное клонирование: Лабораторный практикум (5-я ред. лаборатория Коулд Спринг Харбор, Коулд Спринг Харбор, Нью-Йорк). Как правило, специфичность является функцией промывания после гибридизации, критическими факторами являются ионная сила и температура конечного промывочного раствора. В целом гибридизация в строгих условиях и условия промывания задаются на уровне 5 С ниже температуры плавления от теплового излучения (Tm) для специфичной последовательности при определенной ионной силе и рН.Tm - температура (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% мишеневой последовательности гибридизируются с полностью подходящим зондом. Как правило, в жестких условиях строгости зонд гибридизируется со своей мишеневой последовательностью, но не с другой последовательностью. Примером условий высокой строгости для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот,которые содержат более 100 комплементарных остатков на фильтре при нозерн- или саузерн-блоттинге,является 50% формамид с 1 мг гепарина при 42 С, при проведении гибридизации за ночь. Примером очень строгих условий при промывании является 0,15 М NaCl при 72 С в течение около 15 мин. Примером очень строгих условий промывания является 0,2SSC при 65 С в течение 15 мин (см. Самбрук, инфра, для описания буферного раствора SSC). Примерные условия гибридизации для данного изобретения включают в себя гибридизацию в 7% ДСН, 0,25 М NaPO4 с рН 7,2 при 67 С за ночь, после двух промываний в 5% SDS, 0,20 М NaPO4 с рН 7,2 при 65 С в течение 30 мин для каждого промывания и двух промываний в 1% ДСН, 0,20 М NaPO4 с рН 7,2 при 65 С в течение 30 мин для каждого промывания. Характерной средой для промывки при строгих условиях для дуплекса, например, более 100 нуклеотидов является 1 ДСН при 45 С в течение 15 мин. Примером промывки при менее строгих условиях для дуплекса, например, более 100 нуклеотидов является 4-6 SSC при 40 С в течение 15 мин. Для зондов от около 10 до 50 нуклеотидов условия высокой строгости, как правило, включают в себя концентрацию соли менее 1,0 М ионов Na, как правило, с концентрацией от около 0,01 до 1,0 М ионовNa (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, при температуре, как правило, не менее 30 С. Условия высокой строгости также можно достичь при добавлении агентов дестабилизации, например формамида. В-6 019578 целом соотношение сигнала к шуму 2 (или выше) в отличие от того, которое наблюдается для неродственного зонда в отдельном количественном анализе гибридизации, показывает обнаружение отдельной гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизируются друг с другом, при более строгих условиях, все еще остаются преимущественно идентичными, если белки, которые они кодируют, преимущественно идентичны. Это происходит, например, когда копия нуклеиновой кислоты создается при максимальном вырождении кодона, допускаемое генетическим кодом. Ниже приводится примерная группа условий гибридизации/промывания, которые применимы для гибридизации нуклеотидных последовательностей, преимущественно идентичным стандартным нуклеотидным последовательностям данного изобретения: стандартная нуклеотидная последовательность предпочтительно гибридизуется со стандартной нуклеотидной последовательностью в 7% растворе додецилсульфата натрия (ДСН), 0,5 М NaPO4, 1 мМ ЭДТУ при 50 С с промывкой в 2 SSC, 0,1% ДСН при 50 С, более предпочтительно в 7% растворе додецилсульфата натрия (ДСН), 0,5 М NaPO4, 1 мМ ЭДТУ при 50 С с промывкой в 1 SSC, 0,1% ДСН при 50 С, более предпочтительно еще в 7% растворе додецилсульфата натрия (ДСН), 0,5 М NaPO4, 1 мМ ЭДТУ при 50 С с промывкой в 0,5 SSC, 0,1% ДСН при 50 С, предпочтительно в 7% растворе додецилсульфата натрия (ДСН), 0,5 М NaPO4, 1 мМ ЭДТУ при 50 С с промывкой в 0,1 SSC, 0,1% ДСН при 50 С, более предпочтительно в 7% растворе додецилсульфата натрия (ДСН), 0,5 М NaPO4, 1 мМ ЭДТУ при 50 С с промывкой в 0,1 SSC, 0,1% ДСН при 65 С. Последовательность данного изобретения может обнаруживаться во всех вышеуказанных условиях. В целях определения изобретения используются условия высокой строгости."Трансформация" - процесс введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин или организм. В частности, "трансформация" означает устойчивую интеграцию молекулы ДНК в геном соответствующего организма."Трансформированный/трансгенный/рекомбинантный" относится к организму-хозяину, например, к бактерии или растению, в которые была введена молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может устойчиво интегрироваться в геном хозяина, или молекула нуклеиновой кислоты также может присутствовать в качестве внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может подвергаться ауторепликации. Подразумевается, что трансформированные клетки, ткани или растения включают в себя не только конечный продукт процесса трансформации, но и его трансгенное потомство."Нетрансформированный", "нетрансгенный" или "нерекомбинантный" хозяин относится к организму дикого типа, т.е. бактерии или растению, которые не содержат гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты. В том значении, в котором оно используется в данном документе, понятие "трансгенный" относится к растению, клетке растения или многообразию структурированных или не структурированных клеток растения с интегрированной путем применения хорошо известных способов генетического манипулирования и инсерции гена, последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей "представляющий интерес ген", в геном растения, и, как правило, в хромосому ядра клетки, митохондрию или в другие хромосомы, содержащие органеллу, на локусе который отличается от локуса нативного растения или клетки растения или для количества копий, превышающих то количество, которое присутствует в нативном растении или клетке растения. Трансгенные растения появляются в результате манипуляции и инсерции таких последовательностей нуклеиновых кислот, по сравнению с мутацией, происходящей естественным путем, для продуцирования ненатурального растения или растения с ненатуральным генотипом. Способы трансформации растений и клеток растений хорошо известны в данной области и могут предусматривать, например, электропорацию, микроинъекцию, трансформацию, опосредуемую агробактериями, и баллистическую трансформацию. В том значении, в котором оно используется в данном документе, понятие "уникальный" дляMIR162 означает отличительную характеристику MIR162. Поэтому нуклеиновые кислоты, уникальные для трансгенного растения MIR162, не обнаружены в других растениях кукурузы, не относящихся к трансгенному растению MIR162. Класс белков "Vip3" включает в себя, например, Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ac, Vip3Ad, Vip3Ae, VipAf,Vip3Ag, Vip3Ba и Vip3Bb и их гомологи. "Гомолог" означает, что указанный белок или полипептид имеет определенную связь с членами класса белков Vip3. "Vip3Aa20" - гомолог Vip3, уникальный для трансгенного растения MIR162. Он был создан путем спонтанных мутаций, встроенных в ген vip3Aa19, оптимизированный для кукурузы, содержащийся в pNOV1300 (SEQ ID : 3) во время процесса трансформации растения. Данное изобретение относится к генетически усовершенствованной линии кукурузы, которая продуцирует белок для борьбы с насекомыми, Vip3Aa20, и фермент фосфоманнозаизомеразу (PMI), который позволяет растению использовать маннозу в качестве источника углерода. Изобретение уделяет особое внимание трансгенной кукурузе, названной как MIR162, содержащему новый генотип, а также составам и способам определения нуклеиновых кислот, уникальных для трансгенного растения MIR162 в биологическом образце. Кроме того, изобретение уделяет внимание растениям кукурузы, содержащим генотип трансгенного растения MIR162, трансгенному семени растений кукурузы, и способам получения растения кукурузы, содержащего генотип растения MIR162 путем скрещивания инбредной кукурузы, содер-7 019578 жащей генотип MIR162, с самой собой или с другой линией кукурузы. Растения кукурузы, содержащие генотип MIR162 изобретения, пригодны для борьбы с чешуекрылыми насекомыми-вредителями, включая, без ограничения, совку-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon), совку травяную (FAW, Spodopterafrugiperda), табачную листовертку (TBW, Heliothis virescens), точильщика сахарного тростника (SCB,Diatraea saccharalis), малого точильщика стеблей кукурузы (LCB, Elasmopalpus lignosellus), совку хлопковую (CEW, Helicoverpa zea) и гусеницу, поедающую западную фасоль (WBCW, Striacosta albicosta). Кроме того, в изобретении уделяется внимание способу защиты трансгенной кукурузы от съедания насекомыми, в результате стэкинга признака стойкости к повреждению насекомыми трансгенного растенияMIR162 с различными признаками стойкости к повреждению насекомыми в том же трансгенном растении, в результате чего получают растение кукурузы, которое защищено от повреждения насекомыми в большей степени, чем если бы такие признаки были только одни. В одном варианте исполнения данное изобретение объединяет в себе выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, уникальную для трансгенного растения MIR162. В другом варианте исполнения данное изобретение включает в себя выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая соединяет молекулу гетерологичной ДНК, инсертированную в геном трансгенного растения MIR162, с ДНК генома в трансгенном растении MIR162, содержащей не менее 10 или более (например, 15, 20, 25, 50 или более) соседних нуклеотидов гетерогенной молекулы ДНК и не менее 10 или более (например, 15, 20, 25, 50 или более) соседних нуклеотидов геномной ДНК, фланкирующей точку инсерции молекулы гетерологичной ДНК. Также представлены нуклеотидные последовательности, которые содержат 10 или более нуклеотидов соседней инсерционной последовательности трансгенного растения MIR162 и хотя бы один нуклеотид фланкирующей ДНК трансгенного растения MIR162,расположенный рядом с инсерционной последовательностью. Такие нуклеотидные последовательности являются уникальными и диагностическими для трансгенного растения MIR162. Амплификация нуклеиновой кислоты или гибридизация геномной ДНК трансгенного растения MIR162 вызывает образование ампликона, содержащего такие уникальные последовательности, который является диагностическим для трансгенного растения MIR162. В одном аспекте данного варианта исполнения нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из SEQ ID : 1, SEQ ID : 38, SEQ ID : 41, SEQ ID : 45, SEQ ID : 47, SEQ ID : 49, SEQ ID : 55, SEQ ID : 59 и их комплементов. В другом варианте исполнения изобретение включает в себя выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, включающую в себя хотя бы одну связующую последовательность трансгенного растения MIR162, причем связующая последовательность охватывает связь между гетерологичным полигенным экспрессирующим кластером, инсертированным в геном кукурузы, и ДНК генома кукурузы, фланкирующую сайт инсерции, и является диагностической для растения. В одном аспекте данного варианта исполнения соединяющая последовательность выбирается из группы,включающей в себя SEQ ID : 45, SEQ ID : 47 и их комплементы. В другом варианте исполнения данное изобретение включает в себя изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, соединяющую молекулу гетерологичной ДНК с геномом трансгенного растения кукурузы MIR162, содержащего последовательность на основе от 11 до 20 соседних нуклеотидов, выбираемых из группы, включающей в себя SEQ ID : 45, SEQ ID : 47 и их комплементы. В другом варианте исполнения изобретение включает в себя изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID: 59 и их комплементов. В одном аспекте данного варианта исполнения изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержится в семени кукурузы, депонированном в Американской коллекции типовых культур под входящимРТА-8166, или в растениях, выращенных из семени. В одном варианте исполнения данного изобретения представлен ампликон, содержащий нуклеотидную последовательность, уникальную для трансгенного растения MIR162. В одном аспекте данного варианта исполнения нуклеотидная последовательность выбирается из группы, включающей в себя SEQID : 59 и их комплементы. В другом варианте исполнения данное изобретение включает в себя праймеры фланкирующей последовательности для детектирования трансгенного растения MIR162. Такие праймеры фланкирующей последовательности содержат нуклеотидную последовательность не менее 10-15 соседних нуклеотидов 5' или 3' фланкирующей последовательности. В одном аспекте данного варианта исполнения соседние нуклеотиды выбираются из нуклеотидов 1-1088 (включительно) SEQ ID : 49 (произвольно обозначенной как 5' фланкирующая последовательность) или их комплементов. В другом аспекте данного варианта исполнения праймеры 5' фланкирующей последовательности выбираются из группы, состоящей из SEQID : 36, SEQ ID : 39, SEQ ID : 53, SEQ ID : 68-80 и их комплементов. В другом аспекте данного варианта исполнения соседние нуклеотиды выбираются из нуклеотидов 9391-10579 (включительно) SEQID : 49 (произвольно обозначаемая здесь как 3' фланкирующая последовательность) или их комплементов. Еще в другом аспекте данного варианта исполнения праймеры 3' фланкирующей последователь-8 019578 ности праймеры выбираются из группы, состоящей из SEQ ID : 58, SEQ ID : 97-105 и их комплементов. Еще в другом варианте исполнения данное изобретение включает в себя пару полинуклеотидных праймеров, содержащих первый полинуклеотидный праймер и второй полинуклеотидный праймер, которые функционируют вместе в присутствии матрицы ДНК трансгенного растения MIR162 в образце для продуцирования ампликона, который является диагностическим для трансгенного растения MIR162. В другом аспекте данного варианта исполнения первый праймер и/или второй праймер выбираются из SEQID : 1 или ее комплементов. В другом аспекте данного варианта исполнения первый праймер и/или второй праймер выбираются из группы, состоящей из SEQ ID : 15-35, SEQ ID : 37, SEQ ID : 42 и их комплементов. Еще в одном аспекте данного варианта исполнения ампликон, который продуцируется парой праймеров, содержит SEQ ID : 1, SEQ ID : 38, SEQ ID : 44 и их комплементы. В другом варианте исполнения данное изобретение включает пару полинуклеотидных праймеров,содержащих первый полинуклеотидный праймер и второй полинуклеотидный праймер, которые функционируют вместе в присутствии матрицы ДНК трансгенного растения MIR162 в образце для продуцирования ампликона, который является диагностическим для трансгенного растения MIR162, причем первый праймер является геномной последовательностью растения кукурузы и комплементарен геномной последовательности растения кукурузы, фланкирующей точку инсерции последовательности гетерологичной ДНК, инсертированной в геном трансгенного растения MIR162, а второй праймер является или комплементарен последовательности гетерологичной ДНК, инсертированной в геном трансгенного растения MIR162. В одном аспекте данного варианта исполнения первый полинуклеотидный праймер содержит хотя бы 10 соседних нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, выбираемой из группы, состоящей из нуклеотидов 1-1088 SEQ ID : 49, нуклеотидов 9391-10579 SEQ ID : 49 и их комплементов. В другом аспекте данного варианта исполнения первый праймер выбирается из группы, состоящей из SEQ IDID : 97-105 и их комплементов. В другом аспекте данного варианта исполнения второй полинуклеотидный праймер содержит не менее 10 соседних нуклеотидов в положения 1089-9390 SEQ ID : 49 или их комплементов. Еще в другом варианте исполнения второй полинуклеотидный праймер выбирается из группы, состоящей из SEQ ID : 15-35, SEQ ID : 37, SEQ ID : 40, SEQ ID : 50-52, SEQ ID : 54,SEQ ID : 56, SEQ ID : 57, SEQ ID : 63, SEQ ID : 73, SEQ ID : 82, SEQ ID : 96 и их комплементов. В другом аспекте данного варианта исполнения первый полинуклеотидный праймер, показанный как SEQ ID : 36, и второй полинуклеотидный праймер, показанный как SEQ ID : 37, функционируют вместе в присутствии матрицы ДНК трансгенного растения MIR162 в образце для продуцирования ампликона, который является диагностическим для трансгенного растения MIR162, как описано в примере 4. В одном варианте исполнения данного аспекта ампликон содержит нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID : 38. Еще в другом варианте данного исполнения первый полинуклеотидный праймер, показанный какSEQ ID : 39, и второй полинуклеотидный праймер, показанный как SEQ ID : 40, функционируют вместе в присутствии матрицы ДНК трансгенной кукурузы MIR162 в образце для продуцирования ампликона, который является диагностическим для трансгенного растения MIR162, как описано в примере 4. В одном варианте исполнения данного аспекта ампликон содержит нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID : 41. В другом аспекте данного варианта исполнения первый полинуклеотидный праймер, показанный как SEQ ID : 53, и второй полинуклеотидный праймер, показанный как SEQ ID : 54, функционируют вместе в присутствии матрицы ДНК трансгенного растения MIR162 в образце для продуцирования ампликона, который является диагностическим для трансгенного растения MIR162, как описано в примере 5. В одном варианте исполнения ампликон содержит нуклеотидную последовательность, показанную какSEQ ID : 55. Еще в одном аспекте данного варианта исполнения первый полинуклеотидный праймер, показанный как SEQ ID : 58, и второй полинуклеотидный праймер, показанный как SEQ ID : 56, функционируют вместе в присутствии матрицы ДНК трансгенного растения MIR162 в образце для продуцирования ампликона, который является диагностирующим для трансгенного растения MIR162, как описано в примере 5. В одном варианте исполнения ампликон содержит нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID : 59. Разумеется, известно, что в данном способе целесообразно превратить далее дополнительную последовательность в геномную последовательность, фланкирующую с любым окончанием инсертированных последовательностей гетерологичной ДНК для использования в качестве последовательности праймера, которая применима в такой паре праймеров для амплификации последовательностей, которые являются диагностическими для трансгенного растения MIR162. В целях описания выражение "далее в геномную последовательность, фланкирующую с любым окончанием инсертированной последовательности гетерологичной ДНК" относится, в частности, к последовательному движению от окончания ин-9 019578 сертированной последовательности гетерологичной ДНК, в точках, в которых инсертированные последовательности ДНК находятся по соседству с нативной геномной последовательностью ДНК, и обратно,в геномную ДНК отдельной хромосомы, в которую инсертируется последовательность гетерологичной ДНК. Предпочтительно, чтобы последовательность праймера, соответствующая или комплементарная части инсерционной последовательности, охватывала транскрипционное увеличение возникающей нити ДНК или РНК относительно ближайшей фланкирующей связующей последовательности. Следовательно,первичная последовательность, соответствующая или комплементарная части геномной фланкирующей последовательности, должна охватывать транскрипционное увеличение появляющегося признака ДНК или РНК относительно ближайшей фланкирующей соединяющей последовательности. Последовательность праймера может являться или быть комплементарной последовательности гетерологичной ДНК,инсертированной в хромосому растения или геномной фланкирующей последовательности. Специалист,знакомый с данным способом, быстро осознает, есть ли необходимость в последовательности праймера или она должна быть комплементарной последовательности, показанной внутри инсертированной последовательности гетерологичной ДНК, или как показано в SEQ ID : 38 в зависимости от природы продукта, который должен быть получен в результате использования представленного набора праймеров,предназначенных для использования при амплификации отдельной фланкирующей последовательности,содержащей геномную последовательностью ДНК и инсертированную последовательность гетерологичной ДНК. В другом варианте исполнения данное изобретение включает в себя выделенный инсектицидный белок, содержащий SEQ ID : 2 и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID : 2. В одном аспекте данного варианта исполнения молекула нуклеиновой кислоты - SEQ ID : 1. Данное изобретение также включает в себя химерный ген, содержащий гетерологичный промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, и рекомбинантные векторы и клетки-хозяева, содержащие химерный ген. Еще в одном варианте исполнения данное изобретение объединяет в себе способ детектирования присутствия молекул нуклеиновой кислоты, которые уникальны для трансгенного растения MIR162 в образце, содержащем нуклеиновые кислоты кукурузы, причем данный способ включает в себя: (а) контактирование образца с парой полинуклеотидных праймеров, которые, если они используются в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с геномной ДНК трансгенного растения MIR162 продуцируют ампликон, который является диагностирующим для трансгенного растения MIR162; (b) проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты для продуцирования ампликона и (с) детектирование ампликона. В одном аспекте данного варианта исполнения ампликон включает в себя нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID : 1, SEQ ID : 38, SEQ ID : 41, SEQ ID: 45, SEQ ID : 47, SEQ ID : 49, SEQ ID : 55, SEQ ID : 59 и их комплементы. В другом варианте исполнения данное изобретение включает в себя способ детектирования присутствия молекул нуклеиновой кислоты, которые уникальны для трансгенного растения MIR162 в образце,содержащем нуклеиновые кислоты кукурузы, причем данный способ включает в себя (а) контактирование образца с зондом, который гибридизируется в очень строгих условиях с геномной ДНК трансгенного растения MIR162 и не гибридизируется в очень строгих условиях с ДНК контрольного растения кукурузы; (b) выдерживание образца и зонда в очень строгих условиях гибридизации и (с) детектирование гибридизации зонда с ДНК. Детектирование может осуществляться при помощи любых известных средств,включая флуоресцентные, хемилюминесцентные, иммунологические и другие. В случае, если гибридизация предназначена для использования в качестве средства амплификации отдельной последовательности для продуцирования ампликона, который является диагностирующим для трансгенного растенияMIR162, продуцирование и детектирование могут проводиться любыми способами, известными для ампликона, который должен служить признаком предполагаемой гибридизации с мишеневой последовательностью, когда используется один зонд или один праймер, или для последовательности, когда используются два или более зонда или праймера. Под понятием "биологический образец" подразумевается образец, который содержит или предположительно содержит нуклеиновую кислоту, состоящую из пяти до десяти нуклеотидов с любой стороны точки, на которой тот или другой из двух терминалов завершает инсертированную последовательность гетерологичной ДНК, которая контактирует с геномной последовательностью ДНК внутри хромосомы, в которую инсертируется последовательность гетерологичной ДНК, известная под названием "связующие последовательности". Кроме того, связующая последовательность содержит по меньшей мере два нуклеотида: это первый нуклеотид внутри фланкирующей геномной ДНК, расположенной рядом и ковалентно соединенный с первым нуклеотидом внутри инсертированной последовательности гетерологичной ДНК. В одном аспекте данного варианта исполнения зонд содержит нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID : 1, SEQ ID: 38, SEQ ID : 41, SEQ ID : 45, SEQ ID : 47, SEQ ID : 49, SEQ ID : 55, SEQ ID : 59 и их комплементы. Еще в другом варианте исполнения данное изобретение включает в себя набор для детектирования присутствия нуклеиновых кислот, которые уникальны для трансгенного растения MIR162, в биологическом образце. Набор включает в себя хотя бы одну молекулу нуклеиновой кислоты достаточной длины- 10019578 соседних полинуклеотидов в качестве праймера или зонда для способа детектирования присутствия нуклеиновой кислоты, и который, после амплификации или гибридизации с мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты в образце с последующим детектированием ампликона или гибридизацией с мишеневой последовательностью, является диагностическим на присутствие последовательности нуклеиновой кислоты, уникальной для трансгенного растения MIR162 в образце. Кроме того, набор включает в себя другие материалы, необходимые для проведения гибридизации нуклеиновой кислоты или амплификации. В одном аспекте данного варианта исполнения молекула нуклеиновой кислоты, содержащаяся в наборе, включает в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID : 1 или SEQ ID : 49. В другом аспекте данного варианта исполнения молекула нуклеиновой кислоты является праймером, выбираемым из группы, состоящей из SEQ ID : 15-37, SEQ ID : 39, SEQ ID : 40, SEQ ID: 42, SEQ ID : 43, SEQ ID : 50-54, SEQ ID : 56-58, SEQ ID : 60-105 и их комплементов. Еще в другом аспекте данного варианта исполнения ампликон содержит SEQ ID : 1, SEQ ID : 38, SEQ ID: 41, SEQ ID : 45, SEQ ID : 47, SEQ ID : 49, SEQ ID : 55, SEQ ID : 59 или их комплементы. Возможно использование большого числа способов детектирования, включая, без ограничения, TAQMAN (Перкин Эльмер), термическую амплификацию, лигазную цепную реакцию, саузернгибридизацию, способы иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) и колориметрические и флуоресцентные способы детектирования. В частности, данное изобретение предлагает наборы для детектирования присутствия мишеневой последовательности, т.е., по меньшей мере, последовательностиvip3Aa20 или связующей последовательности, в образце, содержащем геномную нуклеиновую кислотуMIR162. Набор, по меньшей мере, содержит один полинуклеотид, способный к связыванию с заданным сайтом или вплотную располагаться рядом с выбранным сайтом, и хотя бы одно средство для детектирования связывания полинуклеотидов с выбранным сайтом. Средства детектирования могут быть флуоресцентными, хемилюминесцентными, колориметрическими или изотопными и могут использоваться совместно с иммунологическими способами для детектирования связывания. Также предусмотрены наборы, которые могут детектировать присутствие выбранного сайта в образце, т.е., по меньшей мере, последовательность vip3Aa20 или связующую последовательность MIR162, используя две или более полинуклеотидные последовательности, которые вместе способны к связыванию нуклеотидных последовательностей, расположенных рядом или внутри около 100 пар оснований, или внутри около 200 пар оснований, или внутри около 500 пар оснований, или внутри около 1000 пар оснований мишеневой последовательности и которые могут удлиняться по направлению друг к другу с образованием ампликона, который содержит выбранный сайт. В другом варианте исполнения данное изобретение объединяет в себе способ детектирования белкаVip3Aa20 в биологическом образце, способ включает в себя: (а) извлечение белка из ткани трансгенного растения MIR162; (b) количественное определение извлеченного белка при помощи иммунологического способа, предусматривающего использование антитела, специфичного для белка Vip3Aa20, продуцируемого трансгенным растением MIR162 и (с) детектирование связывания указанного антитела с белкомVip3 Аа 20. Еще в одном варианте исполнения данное изобретение включает в себя биологический образец, полученный из трансгенного растения MIR162, ткани или семени, причем образец включает в себя нуклеотидную последовательность, которая комплементарна последовательности, уникальной для трансгенного растения MIR162, а последовательность может быть детектирована в образце при помощи способа амплификации нуклеиновой кислоты или способа гибридизации нуклеиновой кислоты. В одном аспекте данного варианта исполнения нуклеотидная последовательность комплементарна к SEQ ID : 1, SEQ ID: 38, SEQ ID : 41, SEQ ID : 45, SEQ ID : 47, SEQ ID : 49, SEQ ID : 55 или SEQ ID : 59. В другом аспекте данного варианта исполнения образец выбирается из группы, состоящей из кукурузной муки, кукурузного крахмала, кукурузного сиропа, кукурузного масла, крупы, полученных, полностью или частично, с содержанием побочных продуктов кукурузы. В другом варианте исполнения данное изобретение представляет экстракт биологического образца,полученного из трансгенной кукурузы MIR162, ткани или семени, содержащих нуклеотидную последовательность, уникальную для MIR162. В одном аспекте данного варианта исполнения последовательность детектируется в экстракте при помощи способа амплификации нуклеиновой кислоты или способа гибридизации нуклеиновой кислоты. В другом аспекте данного варианта исполнения последовательность комплементарна SEQ ID : 1, SEQ ID : 38, SEQ ID : 41, SEQ ID : 45, SEQ ID : 47, SEQ ID: 49, SEQ ID : 55 или SEQ ID : 59. Еще в одном варианте исполнения образец выбирается из группы, состоящей из кукурузной муки, кукурузного крахмала, кукурузного сиропа, кукурузного масла, крупы, полученных, полностью или частично, с содержанием побочных продуктов кукурузы. Другой аспект варианта исполнения данного изобретения объединяет в себе растение кукурузы или его части и семя из растения кукурузы, содержащие генотип трансгенного растения MIR162, причем генотип содержит нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID : 1, SEQ ID : 38, SEQ ID: 41, SEQ ID : 45, SEQ ID : 47, SEQ ID : 49, SEQ ID : 55, SEQ ID : 59 или их комплементы. Одним из примеров является семя зерна, содержащее молекулы нуклеиновой кислоты изобретения, депонированное 23 января 2007 г. под номеромРТА-8166 в АКТК. В одном аспекте данного варианта- 11019578 исполнения растение кукурузы селектируется из линий инбредных растений кукурузы CG5NA58,CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP911,NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034,NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275,NP2276, NP2316, ВСТТ 609, AF031, NPH8431, 894, BUTT201, R327H, 2044 ВТ и 2070 ВТ. Тем не менее,специалист, знакомый с данным способом, распознает, что генотип MIR162 может быть встроен в любое многообразие растений, которые могут выбираться из кукурузы, включая, дикие виды кукурузы, и поэтому список инбредных линий такого варианта исполнения неограничен. В другом варианте исполнения данное изобретение включает в себя растение кукурузы, содержащее по меньшей мере первую и вторую последовательность ДНК, соединенные вместе, для образования соседней нуклеотидной последовательности; причем первая последовательность ДНК находится внутри связующей последовательности и содержит по меньшей мере 11 соседних нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из нуклеотидов 1079-1098 SEQ ID : 49, нуклеотидов 9381-9400 и их комплементов,а вторая последовательность ДНК находится внутри инсерционной последовательности гетерологичной ДНК, как указано в SEQ ID : 49 и их комплементы; и при этом первая и вторая последовательности ДНК пригодны в качестве нуклеотидных праймеров и зондов для детектирования присутствия последовательностей нуклеиновых кислот трансгенной кукурузы MIR162 в биологическом образце. В одном аспекте данного варианта исполнения нуклеотидные праймеры используются в способе амплификации ДНК для амплификации мишеневой последовательности ДНК из матрицы ДНК, извлеченной из растения кукурузы, а растение кукурузы распознается среди других растений кукурузы по продуцированию ампликона, соответствующего последовательности ДНК SEQ ID : 45 или SEQ ID : 47. Растения кукурузы изобретения в дальнейшем отличаются тем, что одновременное усваивание геномной ДНК растения при помощи эндонуклеаз рестрикции Kpnl, EcoRV или Ncol приводит к бэнду после гибридизации vip3Aa20 около 8 kb, 13 kb или 4,6 kb соответственно, при помощи зонда vip3Aa20 в более строгих условиях. Иллюстрацией этого является зонд vip3Aa20, содержащий нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID : 13. Растения кукурузы изобретения в дальнейшем различаются тем, что усваивание геномного ДНК растения при помощи эндонуклеазы рестрикции Асс 65I или BamHI приводит к появлению единичного бэнда pmi после гибридизации при помощи зонда pmi в более строгих условиях. Иллюстрацией этого является зонд pmi, включающий в себя нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID : 14. В одном варианте исполнения данное изобретение представляет растение кукурузы, в котором генотип MIR162 придает растению стойкость к повреждению насекомыми-вредителями или способность использовать маннозу в качестве источника углерода, или как стойкость к повреждению насекомыми,так и способность использовать маннозу в качестве источника углерода. В одном аспекте данного варианта исполнения трансгенный генотип, придающий растению кукурузы стойкость к повреждению насекомыми, содержит ген vip3Aa20 и трансгенный генотип, придающий способность использовать маннозу в качестве источника углерода, если растение кукурузы изобретения содержит ген pmi. Еще в одном варианте исполнения данное изобретение предусматривает способ получения растения кукурузы, стойкой к чешуекрылым насекомым-вредителям, и включает в себя: (а) половое скрещивание первого родительского растения кукурузы со вторым родительским растением кукурузы, содержащим ДНК трансгенного растения MIR162, выращивая при этом большое многообразие потомства растений первого поколения; (b) селекцию потомства растений первого поколения для получения при этом большого многообразия потомства растений второго поколения и (d) селекцию на основе потомства растений второго поколения растения, которое устойчиво к одним или нескольким чешуекрылым насекомымвредителям; причем потомство растений второго поколения содержит нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, включающей в себя SEQ ID : 1, SEQ ID : 45, SEQ ID : 47, SEQ ID: 49, SEQ ID : 55 и SEQ ID : 59. В другом варианте исполнения данное изобретение предлагает способ продуцирования гибридных семян кукурузы, включающий в себя: (а) высаживание семян культур первой линии инбредной кукурузы, содержащей нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, включающей в себя SEQ ID: 1, SEQ ID : 45, SEQ ID : 47, SEQ ID : 49, SEQ ID : 55 и SEQ ID : 59, и семян второй инбредной линии, обладающих различным генотипом; (b) культивацию растений кукурузы в результате высаживания до момента цветения; (с) срезание указанных цветков растений одной из линий инбредной кукурузы; (d) половое скрещивание двух различных инбредных линий друг с другом и (е) сбор урожая гибридных семян, культивированных таким способом. В одном аспекте данного варианта исполнения первая линия инбредной кукурузы дает родительскую женскую форму. В другом аспекте данного варианта исполнения первая линия инбредного зерна дает родительскую отцовскую форму. Данное изобретение также представляет гибридное семя, продуцируемое указанным способом, и гибридные растения,выращенные из семени. Специалист, знакомый с данным способом, подтвердит, что трансгенный генотип трансгенного растения MIR162 может интрогессироваться в результате селекции других линий кукурузы, содержащих различные трансгенные генотипы. Например, кукурузный инбред MIR162 можно скрестить с кукуруз- 12019578 ным инбредом, содержащим трансгенный Bt11 генотип растения, устойчивого к чешуекрылым насекомым-вредителям (патент США 6114608 и 6342660, включенный в данный документ со ссылкой). Получившиеся семена и потомственные растения имеют набор признаков стойкости к насекомымвредителям и объединенный спектр активности CrylAb и Vip3Aa20. Другой набор признаков, объединенный данным изобретением, включает в себя признак стойкости к повреждениям насекомымивредителями трансгенного растения MIR162 и признак стойкости к повреждениям насекомымивредителями MIR604 (патентная заявка США, публикация 2005/0216970, от 29 сентября, 2005, включенная со ссылкой). Набор признаков в полученном семени и потомстве придает растениям увеличенный спектр активности; т.е. культуры активны по отношению как к чешуекрылым, так и жесткокрылым насекомым-вредителям. Поэтому данное изобретение объединяет способ защиты трансгенного растения кукурузы от пожирания одним или несколькими насекомыми-вредителями, причем данный способ предусматривает стэкинг в одном трансгенном растении кукурузы признака стойкости к повреждению насекомымивредителями Vip3Aa20 с другим признаком стойкости к повреждению насекомыми-вредителями, который отличается от Vip3Aa20, причем объединенные признаки защищают растения кукурузы от пожирания одним или несколькими насекомыми-вредителями в большей степени, чем это ожидается, если бы такой признак стойкости к повреждению насекомыми-вредителями был один. В другом аспекте данного варианта исполнения признак стойкости к повреждению насекомыми-вредителями Vip3Aa20, который содержится в растении MIR162, стэкируется с признаком стойкости к повреждению насекомымивредителями Cry3 А 055 в растении MIR604 в том же самом трансгенном растении кукурузы путем полового скрещивания трансгенного растения MIR162 с MIR604 или путем совместной трансформации признаков в одном и том же растении. Примеры прочих трансгенных растений, которые могут скрещиваться с инбредом MIR162, включают в себя растения, толерантные к глифозатаму GA21, растения MON802, толерантные к глифозатаму/устойчивые к чешуекрылым насекомым-вредителям, растения DBT418, стойкие к жесткокрылым насекомым-вредителям, растения MS3 с мужской стерильностью, растения В 16, толерантные к фосфинотрицину, растения MON 80100, стойкие к чешуекрылым насекомым-вредителям, растения с Т 14 и Т 25,стойкие к фосфинотрицину, растения 176, стойкие к чешуекрылым насекомым-вредителям, и растенияMON863, стойкие к жесткокрылым насекомым-вредителям, все из которых известны в данной области. Далее будет показано, что прочие комбинации или признаки могут быть получены при помощи трансгенного генотипа изобретения, поэтому примеры не следует рассматривать как ограничивающие. Специалист, знакомый с данной областью, также подтвердит, что семя трансгенной кукурузы, содержащее генотип трансгенного растения MIR162, можно обрабатывать различными химическими веществами для обработки семян, включая инсектициды, для увеличения или синергизации инсектицидной активности белка Vip3Aa20. Данное изобретение описывает специфичный сайт на хромосоме 5 в геноме кукурузы, который подходит для встраивания гетерологичной нуклеиновой кислоты. Также описываются молекулярный маркер 5' (opie2; нуклеотиды 1680-3338 SEQ ID : 106) и молекулярный маркер 3' (gag; нуклеотиды 43.275-45.086 SEQ ID : 106), пригодные для определения расположения целевого сайта на хромосоме 5. Поэтому данное изобретение предлагает способы введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в заранее определенный выбранный сайт или вблизи этого выбранного сайта. Данное изобретение также охватывает семя кукурузы и/или растение кукурузы, содержащие гетерологичную нуклеотидную последовательность, инсертированную на выбранном сайте или рядом с ним. Одним из вариантов для выполнения такого направленного инсертирования является замена различного инсерта вместо полигенного экспрессирующего кластера, vip3Aa20, представленного здесь. В данном общем отношении целевая гомологичная рекомбинация, например, без ограничения может использоваться в соответствии с данным изобретением. "Гомологичная рекомбинация" относится к реакции между любой парой нуклеотидных последовательностей с соответствующими сайтами, содержащими аналогичную нуклеотидную последовательность (например, гомологичную последовательность), через которую две молекулы могут взаимодействовать (рекомбинировать) для образования новой, рекомбинантной последовательности ДНК. Сайты аналогичной нуклеотидной последовательности называются здесь как "гомологичная последовательность". В целом частота гомологичной рекомбинации увеличивается с увеличением длины гомологичной последовательности. Поэтому в то время как гомологичная рекомбинация может происходить между двумя нуклеотидными последовательностями, которые менее идентичны, частота рекомбинации (или эффективность) уменьшается с увеличением дивергенции между двумя последовательностями. Рекомбинация может проводиться с использованием одной гомологичной последовательности на каждом доноре и молекулах-мишенях, создавая продукт регенерации "единичный кроссовер". В качестве альтернативного варианта, две гомологичные последовательности могут располагаться на каждой мишеневой и донорской нуклеотидной последовательности. Рекомбинация между двумя гомологичными последовательностями на доноре с двумя гомологичными последовательностями на мишени приводят к появлению продукта рекомбинации "двойного кроссовера". В случае если гомологичные последовательности на молекуле донора фланкируют с последовательностью, которой можно управлять (например, представляю- 13019578 щая интерес последовательность), то соединение двойного кроссовера с молекулой-мишенью может привести к получению продукта рекомбинации, причем представляющая интерес последовательность заменяет последовательность ДНК, которая была первоначально между гомологичной последовательностью на молекуле-мишени. Замена последовательности ДНК между мишенью и донором за счет рекомбинации двойного кроссовера называется "замена последовательности." Данный тип технологии является, к примеру, темой патентной заявки США 2006/0253918, включенной в документ со ссылкой. При помощи описанного целевого сайта и последовательностей, окружающих выбранный сайт, специалист,знакомый с данной областью, подтвердит, что могут использоваться прочие способы для направленной интеграции гетерологичной нуклеиновой кислоты. Такие способы, например, без ограничения, раскрыты в патентной заявке, публикация 2007/0039074 и патентной заявке США 2006/0130179. В одном варианте исполнения данное изобретение объединяет в себе хромосомный целевой сайт кукурузы, расположенный на хромосоме 5 между молекулярным маркером opie2, описываемым в виде нуклеотидов 1680-3338 SEQ ID : 106, и молекулярным маркером gag, описываемым в виде нуклеотидов 43.275-45.086 SEQ ID : 106, причем целевой сайт содержит гетерогенную нуклеиновую кислоту. В другом варианте исполнения хромосомный целевой сайт кукурузы расположен на хромосоме 5 между нуклеотидами 25.454 и 25.513 SEQ ID : 106. Еще в другом варианте исполнения хромосомный целевой сайт 5' фланкируется нуклеотидами 5.454-25.454 SEQ ID : 106 и 3' фланкируется с нуклеотидами 25.513-45.513 SEQ ID : 106. В одном варианте исполнения данное изобретение объединяет в себе способ получения трансгенного растения кукурузы, предусматривающий инсертирование гетерогенной нуклеиновой кислоты в положении на хромосоме 5, расположенной между молекулярным маркером opie2, описываемым в виде нуклеотидов 1680-3338 SEQ ID : 106 и молекулярным маркером gag, описываемым в виде нуклеотидов 43.275-45.086 SEQ ID : 106. В другом варианте исполнения гетерологичная нуклеиновая кислота инсертируется на хромосому 5 между нуклеотидами 25.454 и 25.513 SEQ ID : 106. Еще в другом варианте исполнения инсертированная гетерологичная нуклеиновая кислота 5' фланкируется с нуклеотидами 5.454-25.454 SEQ ID : 106 и 3' фланкируется с нуклеотидами 25.513-45.513 SEQ ID : 106. Трансгенный генотип данного изобретения может встраиваться в любой кукурузный инбред или гибрид при помощи признанных методик скрещивания. Цель селекции растений - объединить в одно многообразие или гибрид различные желаемые признаки. Для полевых растений такие признаки могут включать в себя сопротивление к повреждению насекомыми и стойкость к болезням, стойкость к гибридам, стойкость к теплу и засухе, уменьшение времени на спелость, повышение урожая и улучшение агрономических характеристик. При машинной уборке кукурузы единообразие характеристик растения,например прорастание и образование ствола, ежегодный прирост, зрелость и высота растения и высота початка, имеет важное значение. Полевые растения кукурузы выращиваются с применением способов, которые имеют преимущества над способом опыления растений. Растение самоопыляется, если пыльца от одного цветка переносится на тот же или другой цветок того же растения. Растение перекрестно опыляется, если пыльца переходит от цветка на другое растение. Растения, которые самоопыляются и подбираются по типу, стали гомозиготными почти на всех локусах генов и дают равномерную популяцию потомства для разведения гомозигот. Скрещивание между двумя разными гомозиготными линиями дает равномерную популяцию гибридных растений, которые могут быть гетерозиготными для большинства локусов генов. Скрещивание двух растений, каждое из которых является гетерозиготным для ряда локусов генов, дает популяцию гибридных растений, отличающихся генетически, и не будет равномерным. Кукурузу (Zea mays L.) можно выращивать путем применения как методик гомоклинного опыления, так и перекрестного опыления. Кукуруза содержит отдельно женские и мужские цветки на одном и том же растении, расположенные на метелке и початке соответственно. Естественное опыление происходит на кукурузе, когда ветер сдувает пыльцу из метелки на пестичные столбики, которые выступают с верхней части початка. Надежный способ контроля оплодотворяющей способности в растениях дает возможность улучшенного скрещивания растения. Это особенно необходимо для развития гибридов кукурузы, что зависит в некоторой степени от системы мужской стерильности. Есть несколько вариантов контроля над оплодотворяющей способностью, доступной для селекционеров, а именно: ручное или механическое удаление несозревших пестиков (или удаление метелок), цитоплазматическая мужская стерильность, генетическая мужская стерильность, гаметоциды и др. Как правило, семена гибридной кукурузы вырабатываются при помощи системы мужской стерильности, включающей в себя ручное или механическое удаление несозревших цветков. Чередующиеся стрипы двух кукурузных инбредов выращиваются, высаживаются в поле, и метелки, наполненные пыльцой, срезаются с инбредов (женских). При условии, что есть достаточная изоляция от источников пыльцы от чужого зерна, початки обессултаненного инбреда оплодотворяются только от другого инбреда(мужского), и получившееся семя становится гибридом и образует гибридное растение. Трудоемкий и зачастую ненадежный процесс обреза метелок можно не использовать, а применять- 14019578 несколько способов создания генетической мужской стерильности в данном способе, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. В таких способах используют большое многообразие подходов,например, доставка в растение гена, кодирующего цитотоксическую субстанцию, связанную тканеспецифичным промотором ткани мужской особи или с антисмысловой системой, в которой определяется ген, важный для фертильности, и затем антисенс такого гена инсертируется в растение (см. Фабинянский и др. ЕРО 89/3010153.8, публикация 329308 и публикация РСТ/СА 90/00037, опубликованная какWO 90/08828). Использование инбредов, обладающих мужской стерильностью, является единственным фактором при селекции гибридов кукурузы. Способы получения растений, известны в данной области, и могут использоваться в программе селекции растения кукурузы, включая, без ограничения, рекуррентную селекцию, обратное скрещивание, племенной подбор, улучшенную селекцию путем ограничения длины полиморфизмов, улучшенную селекцию генетических маркеров и трансформацию. Развитие гибридов кукурузы в программе выращивания растения кукурузы в целом требует разработки инбредных гомозиготных линий, скрещивания таких линий и оценки скрещиваний. Племенной подбор и методы рекуррентной селекции используются для развития инбредных линий из популяции скрещивания. Программы скрещивания растения кукурузы объединяют в себе генетический фон от двух или более инбредных линий или различных прочих источников зародышевой плазмы в пулы скрещивания, на основе которых разрабатываются новые инбредные линии путем самоопыления и селекции нужных фенотипов. Новые инбреды скрещиваются с прочими инбредными линиями, и гибриды от таких скрещиваний оцениваются для определения того, какие из них обладают коммерческой ценностью. Селекция растений и развитие гибридов, как это осуществляется в программе селекции растения кукурузы, являются затратным процессом,требующим много времени. Племенной подбор начинается со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может иметь одну или несколько требуемых характеристик, которая отсутствует в другом или которая дополняет другой. В случае, если два оригинальных родителя не обладают всеми необходимыми характеристиками, то другие источники могут быть включены в популяцию скрещивания. Согласно методу племенного подбора высшие растения самоопыляются и селектируются в последующих поколениях. В последующих поколениях гетерозиготное состояние изменяется для гомологичных линий в результате гомоклинного опыления и селекции. Как правило, при племенном подборе скрещивания используются пять или более поколений для самоопыления и селекции: F1 - F2; F2 - F3; F3 - F4; F4 - F5 и т.д. Скрещивание рекуррентной селекции, например обратное скрещивание, применимо для усовершенствования инбредной линии и гибрида, который получается при использовании таких инбредов. Обратное скрещивание может использоваться для передачи отдельного специфичного признака от одного инбреда или источника к инбреду, у которого такой признак отсутствует. Например, это может проводиться путем первого скрещивания высшего инбреда (рекуррентный родитель) с инбредным донором(небэккроссируемый родитель), который предоставляет соответствующий(е) ген(ы) для рассматриваемого признака. Потомство такого скрещивания затем заново скрещивается с высшим рекуррентным родителем после селекции в получившемся потомстве для передачи желаемого признака от небэккроссируемого родителя. После пяти или более поколений обратного скрещивания с селекцией желаемого признака, потомство становится гомозиготным для локуса, контролирующего передаваемую характеристику, но становится схожим с высшим родителем практически по всем генам. Последнее поколение обратного скрещивания затем самоопыляется для чистого разведения потомства для передаваемого(ых) гена(ов). Гибрид, полученный из инбредов, содержащих передаваемый(ые) ген(ы), практически тот же самый, что и гибрид, полученный из тех же инбредов без передачи гена(ов). Элитные инбредные линии, т.е. чистопородное разведение, гомозиготные инбредные линии, также могут использоваться как сырье для скрещивания или исходной популяции, из которой развиваются другие инбредные линии. Такие инбредные линии, полученные из элитных инбредных линий, могут разрабатываться с использованием чистопородного разведения и способов рекуррентной селекции, описанных ранее. В качестве примера, если используется возвратное скрещивание для создания таких производных линий в программе скрещивания растения кукурузы, элитные инбреды применимы в качестве родительской клеточной линии или сырья или исходного поколения и могут служить в качестве либо донора, либо рекуррентного родителя. Результаты простого скрещивания гибрида кукурузы, полученного путем скрещивания двух инбредных линий, каждая из которых имеет генотип, который комплементирует генотип другого инбреда. Гибридное потомство первого поколения обозначается как F1. Для разработки коммерческих гибридов в программе скрещивания растения кукурузы используется только гибридное растение F1. Предпочитаемые гибриды F1 более эффективны, чем их инбредные родители. Такая гибридная сила или гетерозис может проявляться во многих полигенных признаках, включая увеличение темпов вегетативного роста и урожайности. Разработка гибрида кукурузы в программе скрещивания растения кукурузы включает в себя три этапа: (1) селекцию растений из различных пулов зародышевой плазмы для первоначального скрещивания; (2) самоопыление выбранных растений из скрещивания для различных поколений для выращивания- 15019578 серии инбредных линий, которые, хотя они и отличаются друг от друга, точно скрещиваются и довольно единообразны; (3) скрещивание выбранных инбредных линий с различными инбредными линиями для выращивания гибридного потомства (F1). Во время процесса инбридинга кукурузы, эффективность линий уменьшается. Сила восстанавливается, если две разные инбредные линии скрещиваются для выращивания гибридного потомства (F1). Важным последствием гомозиготности и гомогенности инбредных линий является то, что гибрид между парой инбредов всегда остается тем же самым. Как только инбреды, которые дают высший инбред, будут определены, семя гибрида может воспроизводиться до бесконечности, до гомогенности инбредных родителей. Простой гибрид продуцируется, когда две инбредные линии скрещиваются для выращивания потомства F1. Двойной гибрид продуцируется из четырех инбредных линий, скрещенных парами (А X В и С X D), затем два гибрида F1 скрещиваются вновь (А X В) X (С X D). Трехлинейный гибрид вырабатывается из трех инбредных линий, когда две инбредные линии скрещиваются (А X В), и вновь образуемый гибрид F1 скрещивается с третьим инбредом (А X В) X С. Большая часть гибридной силы, проявляемой у гибрида F1, теряется в следующем поколении (F2). Следовательно, семена гибридов не используются в качестве посадочного материала. Селекция гибридного семени требует сокращения или уменьшения активности пыльцы, выработанной женской особью. Неполное исключение или уменьшение активности пыльцы приводит к возможному самоопылению. Такое семя, самоопыление которого произошло непроизвольно, может случайно собираться и упаковываться с гибридным семенем. Сразу после того как растение будет посажено, есть возможность определить и выбрать путем селекции такие растения с самоопылением. Растения с самоопылением генетически эквивалентны женской инбредной линии для продуцирования гибрида. Как правило, такие растения с самоопылением можно определять и выбирать из-за их уменьшенной силы. Женские виды могут идентифицироваться по их менее четкому броскому виду для вегетативных и/или репродуктивных характеристик, включая укороченную высоту растения, меньший размер початка,форму початка и ядра, цвет стержня кукурузного початка или прочие характеристики. Идентификация таких линий с самоопылением может проводиться путем анализа молекулярных маркеров. См. п. "Идентификация женских особей в гибридной кукурузе: Сопоставление с использованием электрофореза и морфологии", Смит Дж.Эс.Си. и Вяч Р.Д. Seed Science and Technology 14, с. 1-8(1995), информация о которых включена в данный документ со ссылкой. Используя такие технологии,гомозиготность линии самоопыления может проверяться путем анализа аллеломорфного состава на различных локусах в геноме. Такие методы позволяют быстро обнаружить растения, указанные в данном документе. См. также "Идентификация атипичных растений в семенах гибридной кукурузы путем контроля после завершения процедуры и электрофореза" Сарка В и др. Probleme de Genetica Teoritica si Aplicata, Vol. 20 (1), с. 29-42. Для специалиста в данной области совершенно очевидно, что вышеприведенное - только лишь некоторые из способов, посредством которых можно получить инбред данного изобретения, в попытках встраивания трансгенного генотипа в другие линии зерна. Есть и другие средства, а приведенные примеры представлены только в качестве иллюстрации. Цель следующих примеров - только дать наглядное представление об одном или нескольких предпочитаемых вариантах исполнения, они не должны толковаться как ограничивающие объем изобретения. Примеры Пример 1. Трансформация и селекция трансгенного растения MIR162. Растения MIR604 были получены путем трансформации опосредуемой агробактериями запатентованной линии кукурузы (Zea mays). Незрелые эмбрионы были трансформированы преимущественно способом, указанным в работе Негротто и др. (Отчеты о растительных клетках 19: 798-803, 2000), включенной в настоящий документ ссылкой, с помощью фрагмента ДНК из плазмида pNOV1300 (SEQ ID : 3).pNOV1300 содержит нуклеотидную последовательность, включающую в себя последовательные полигенные экспрессирующие кластеры. Первый полигенный экспрессирующий кластер содержит промоторную область ZmUbilnt полибикитинового гена Zea mays, который содержит первый интрон (входящий номер в GenBank S94464), функционально связанный с кодирующей последовательностью vip3Aa19,далее функционально связанный с интроном 9 пептидазы-С гена фосфоенолпируваткарбоксилазы(входящий номер в GenBank Х 15239) Zea mays (Матсуока и Минамиб 1989. European J. Of Biochem. 181:593-598), и 35S терминаторной последовательностью РНК 35S генома вируса мозаики цветной капусты (аналогично входящему номеру в GenBank AF140604). Его функция заключается в обеспечении полиаденильной последовательности (Фрэнк и др., 1980. Клетка 21:285-294). Ген vip3Aa19 в pNOV1300 включает синтетическую кодирующую последовательность vip3Aa, оптимизированную для кукурузы(Эстрах и др., 1999), синтезированную для обеспечения предпочтительного использования кодона для кукурузы (Муррэй и др., 1989). Синтетическая кодирующая последовательность vip3Aa19, используемая в трансформациях растений, кодирует идентичную аминокислотную последовательность в качестве нативной кодирующей последовательности vip3Aa1, обнаруженной в штамме АВ 88 (патент США 5877012)- 16019578 почвенных бактерий Bacillus thuringiensis, кроме единственного различия в аминокислоте в положении 284; нативная кодирующая последовательность vip3Aa1 кодирует лизин, а синтетическая кодирующая последовательность кодирует глютамин в данном положении. Кодирующая последовательность vip3Aa1 кодирует белок для борьбы с насекомыми, Vip3Aa19, который обеспечивает устойчивость к чешуекрылым насекомым. Второй полигенный экспрессирующий кластер состоит из промотора ZmUbilnt, функционально связанного с кодирующей последовательностью pmi (также известной как E.coli тип А), кодирующей фосфоманнозаизомеразу (входящий номер в GenBank M15380), которая катализирует изомеризацию манноза-6-фосфат в фруктоза-6 фосфат (Негротто и др., 2000). Кодирующая последовательность pmi далее функционально связана с синтаза 3' терминацией конечной транскрипции и полиаденильной последовательностью. Незрелые эмбрионы были извлечены из 8-12-дневных початков и промыты свежей средой при подготовке к трансформации. Эмбрионы смешивались с суспензией клеток Agrobacterium, содержащей вектор трансформации pNOV1300, взбалтывали в течение 30 с и помещали в инкубатор еще на 5 мин. Избыточный раствор, содержащий Agrobacterium, удалили, а эмбрионы поместили в чашечки, содержащие неселективную питательную среду. Эмбрионы выращивались совместно с оставшимися Agrobacterium при температуре 22 С в течение 2-3 дней в темноте. Затем эмбрионы были помещены в питательную среду с тицарциллином (100 мг/мл) и нитратом серебра (1,6 мг/л) и выращивались в инкубаторе в темноте 10 дней. Эмбрионы, продуцирующие эмбриогенный каллюс, были помещены в среду культивирования клеток, содержащую маннозу. Регенерированные ростки были исследованы при помощи анализа TAQMAN ПЦР (см. пример 2) на присутствие обоих генов pmi и vip3Aa19, а также на отсутствие гена резистентности к спектиномициновым антибиотикам. Позднее было обнаружено (см. пример 4 ниже), что в процессе трансформации в кодирующую последовательность vip3Aa19 были встроены две мутации, одна из которых привела к изменению аминокислоты в белке Vip3Aa19. Поэтому такая новая кодирующая последовательностьvip3Aa, присущая только трансгенному растению MIR162, была обозначена как vip3Aa20. Кодирующая последовательность vip3Aa20 кодирует изолейцин в положении 129 вместо остатка метионина, кодируемых геном vip3Aa19. Культуры, положительные на присутствие обоих трансгенов и отрицательные на ген spec, были помещены в теплицу для дальнейшего развития. Положительные растения были идентифицированы и проведен их скрининг при помощи биоанализа в отношении совки травяной. Инсектицидные свойства были характерны для ряда копий при анализе TAQMAN. MIR162 был выбран для дальнейшего анализа на основании наличия единственной копии трансгенов, хорошей экспрессии белка, установленной иммуноферментным твердофазным анализом, и хорошего инсектицидного действия в отношении совки травяной. Генеалогическая схема селекции трансгенного растения MIR162 следующая: растение Т 0 MIR162 (хB9620). Материал растения поколения ВС 4 использовался для саузерн-анализа, определения количества копий и последовательности инсерционной ДНК. Негативные контроли для экспериментов состояли из 10 отдельных отрицательных растений поколения ВС 4. Пример 2. MIR162 детектирование при помощи TAQMAN ПЦР. Анализ TAQMAN проводился в основном, как это описано в работах Ингхэм и др. (Биотехнология,31:132-140, 2001), включенных в настоящий документ ссылкой. Кратко, геномная ДНК была выделена из листьев трансгенных и нетрансгенных растений кукурузы с использованием набора для извлечения геномной ДНК Puregene ("Gentra Systems", Миннеаполис, штат Миннесота) в соответствии с инструкцией производителя, за исключением того, что все этапы выполнялись в 1,2 мл 96-ячеечных чашечках. Сухой остаток ДНК поместили для повторного растворения в буферный раствор ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). Реакции ПЦР TAQMAN проводились в 96-ячеечных чашечках. Для эндогенного генетического контроля кукурузы были разработаны праймеры и зонды, характерные для кодирующей последовательности спиртовой дегидрогеназы (adhl) Zea mays (входящий номер в Genbank AF044295). Специалист,знакомый с данной областью, признает, что другие гены растений кукурузы могут использоваться в качестве средств эндогенного контроля. Реакции были усилены, чтобы одновременно увеличить vip3Aa иadhl или pmi и adhl Для каждого праймера была создана основная смесь, состоящая из 20 мкл извлеченной геномной ДНК и 35 мкл 2-универсальной мастер-смеси для проведения ПЦР TAQMAN ("AppliedBiosystems"), дополненная праймерами до окончательной концентрации 900 нМ каждая, зондами с окончательной концентрацией 100 нМ каждый, и водой с окончательным объемом 70 мкл. Такая смесь была разлита в трех экземплярах по 20 млк в 96-ячеечные чашечки для амплификации и запечатана оптически чистой теплоизолирующей пленкой ("Marsh Bio Products"). ПЦР проводилась в аппарате "ABI Prism 7700" со следующими параметрами амплификации: 2 мин при 50 С и 10 мин при 95 С, за которыми следуют 35 циклов по 15 с при 95 С и 1 мин при 60 С.- 17019578 Результаты анализа TAQMAN показали, что трансгенное растение MIR162 имело только одну копию гена vip3Aa20 и одну копию гена pmi. Праймеры и зонды, используемые в реакциях ПЦР при проведении TAQMAN, указаны в табл. 1. Таблица 1 Праймеры, используемые в анализе TAQMAN Пример 3. Детектирование MIR162 при помощи способа Саузерн-блоттинга. Геномная ДНК, использованная для Саузерн-анализа, была выделена из общей ткани листвы 10 растений, представляющих поколение ВС 4 MIR162 преимущественно с использованием способа в работе Томаса и др. (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993), включенной со ссылкой. Все растения, используемые для выделения ДНК, были проанализированы в отдельности с применением реакции TAQMAN ПЦР(как описано в примере 2) для подтверждения присутствия одной копии гена vip3Aa20 и гена pmi. Для отрицательных сегрегантных контролей, ДНК была выделена из общей ткани листвы отрицательных сегрегантов поколения ВС 4. Такие отрицательные сегрегантные растения анализировались в отдельности с использованием реакции TAQMAN ПЦР для подтверждения отсутствия гена vip3Aa20 и гена pmi, но была, как и ожидалось, положительной для гена эндогенной кукурузы adhl. Саузерн-анализ проводился с использованием стандартных способов молекулярной биологии (см. Хомецинский П, 1992. Аналитическая биохимия 201:34-139). Геномная ДНК (7,5 мкг) расщеплялась рестрикционными ферментами, которые расщепляли внутри инсерта трансгенного растения MIR162, но не внутри кодирующей последовательности, которая соответствует специфичному зонду, используемому в эксперименте. Такой подход позволил детектировать количество копий каждого гена, соответствующего специальному зонду, используемому для каждого Саузерн-анализа, вводимых в трансгенное растениеMIR162. Проводились другие серии рестрикционных расщеплений, в которых инсерт расщеплялся рестрикционными ферментами, которые высвободили бы фрагмент известного размера из инсерта. Такой подход предоставил дополнительное подтверждение присутствия единичной копии каждой кодирующей последовательности, присутствующей в MIR162, и позволил детектировать частичные копии инсерта, который мог быть плотно связан с инсертом MIR162. После электрофореза в агарозном геле и переноса щелочи к мембране Zeta-Probe GT (Bio-Rad, кат. 162-0195), проводилась гибридизация с использованием полных образуемых во время ПЦР элементных зондов. Зонды метились 32 Р с помощью выборочного праймирования с использованием системы MegaPrime (Amersham Biosciences, кат. RPN1607). Гибридизация проводилась при 65 С, после многократного промывания в 2 SSC, 0,1% ДСН и затем 0,1 SSC и 0,1% ДСН. Затем мембраны были подвергнуты радиоавтографии. В каждый Саузерн-анализ были включены три контрольных образца: (1) ДНК отрицательного (нетрансформированного) сегреганта, использованного для идентификации любой эндогенной последовательности Zea mays, которая может перекрестно гибридизироваться с элемент-специфичным зондом; (2) ДНК отрицательного сегреганта, в который было введено определенное количество расщепленногоpNOV1300, который соответствует одной копии, исходя из размера плазмида, для демонстрации чувствительности эксперимента по детектированию одной копии гена в геноме Zea mays; и (3) расщепленный плазмид pNOV1300, соответствующий одному числу копий, исходя из размера плазмида, в качестве положительного контроля для гибридизации, а также для демонстрации чувствительности эксперимента. Результаты Саузерн-анализа показали, что инсерт MIR162 содержит единичную копию генаvip3Aa20 и гена pmi и не содержит базовой последовательности pNOV1300. Зонд vip3Aa19 (SEQ ID : 13) использовался для Саузерн-анализа vip3Aa20. Нуклеотидные последовательности vip3Aa19 иvip3Aa20 отличаются двумя нуклеотидами, и на 99,9% являются идентичными. Поэтому зонд vip3Aa19 гибридизировался с последовательностью vip3Aa20, присутствующей в MIR162 при более строгих условиях. Использование зонда vip3Aa19, гидролизата KpnI и EcoRV привело к отдельным бэндам гибридизации примерно 8 kb и 13 kb соответственно. Кроме того, двойное расщепление NcoI привело к единичным бэндам гибридизации, соответствующим ожидаемому размеру 4,6 kb. Использование зонда pmi(SEQ ID : 14), Асс 65I и гидролизата BamHI, привело к появлению бэнда гибридизации размером около 4 kb и 6 kb соответственно. Кроме того, двойное расщепление XmaI + HindIII привело к появлению отдельного бэнда гибридизации, соответствующему ожидаемому размеру в 8,1 kb. Бэнд размером 8,1 kbpmi, как ожидалось. Была обнаружена некоторая перекрестная гибридизация только в ряде плазмидов с лэддерным зондом ДНК. Как правило, коммерчески доступные лэддеры ДНК могут содержать некоторые векторные последовательности, которые могут перекрестно гибридизироваться с контрольными последовательностями плазмида, как установлено в данном эксперименте, но это не влияет на результаты исследования. И, наконец, основной зонд pNOV1300 не гибридизировался, что явилось признаком отсутствия включения любой основной последовательности вектора pNOV1300 в MIR162 во время процесса трансформации. Пример 4. Секвенирование инсерта гетерологичной ДНК. Определены нуклеотидная последовательность vip3Aa и кодирующие последовательности pmi в молекуле гетерологичной ДНК, инсертируемой в MIR162, для демонстрации общей целостности инсерта, смежности функциональных элементов и для детектирования любых индивидуальных изменений в паре оснований. Кодирующая последовательность была амплифицирована от ДНК, полученного из поколения ВС 4. ПЦР амплификация проводилась с использованием либо системы ПЦР Высокой точности(Expand High Fidelity) (Роше, кат.1732650) или PfuUltra Hotstart ДНК полимеразы высокой точности(Stratagene, кат. 600390). Каждый продукт ПЦР был индивидуально клонирован либо в любой из векторов pCR-XL-TOPO (Invitrogen, кат.K4700-20) либо в вектор pCR-BluntII-ТОРО (Invitrogen, кат.K2800-20), и три отдельных клона для каждого продукта ПЦР были определены и секвенированы. Секвенирование последовательности проводилось с помощью анализатора ABI3730XL при помощи химии ABI BigDye 1.1 или Big Dye 3.1 dGTP (для GC-богатых матриц, насыщенных). Анализ последовательности проводился с использованием пакета Phred, Phrap и Consed из Университета Вашингтона, до процента ошибок менее 10,000 случаев (Эвинг и Грин, 1998. исследование геномов 8:186-194). Окончательная консенсусная последовательность для каждого гена определялась путем комбинации данных последовательности от трех индивидуальных клонов для генерации одной консенсусной последовательности для каждого гена. Выравнивание последовательности проводилось с использованием программыClustalW со следующими параметрами: матрица количественной оценки blosum55, поправка на открытие гэпа 15, поправка на открытие гэпа 6.66 (Томпсон и др., 1994, исследование нуклеиновой кислоты 22:4673-4680). Полная кодирующая последовательность vip3Aa20 - это ПЦР амплифицированная с использованием праймеров MOV3Aa-01-5': 5'ATGAACAAGAACAACACCAA3' (SEQ ID : 15) и MOV3Aa-01-3': 5'CTACTTGATGCTCACGTCGTAG3' (SEQ ID : 16) и фермент PfuUltra Hotstart, генерирующий продукт 2370bp. ПЦР ампликон был секвенирован с использованием праймеров, показанных в табл. 2. Две другие реакции ПЦР перекрывали кодирующую последовательность vip3Aa20. Конец 5'vip3Aa20 был охвачен в результате ПЦР амплификации с использованием праймеров 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEQ ID : 36) и VIPR4 S'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAGS' (SEQ ID : 37) и Expand High Fidelity enzyme. Вторая реакция перекрыла 3' окончаниеvip3Aa20; продукт был амплифицирован праймерами VIP-F3: S'GGTGCTGTTCGAGAAGAGGTS' (SEQenzyme. Ампликоны, сгенерированные в результате двух реакций, содержали нуклеотидную последовательность 2946 bp (SEQ ID : 38) и нуклеотидную последовательность 2577 bp (SEQ ID : 44) соответственно. Данные по консенсусной последовательности выявили два изменения в нуклеотидах в кодирующей последовательности vip3Aa в MIR162 (обозначенная как vip3Aa20), по сравнению с кодирующей последовательностью vip3Aa в pNOV1300 (обозначенная как vip3Aa19), которая использовалась для трансформации трансгенного растения MIR162. Первое нуклеотидное изменение, мутация G в Т, произошло в положении 387 кодирующей последовательности vip3Aa19 (SEQ ID : 3). Такая мутация привела к изменению метионина в положении 129 Vip3Aa19, на изолейцин в Vip3Aa20 (M1291). Второе нуклеотидное изменение произошло в положении 1683 кодирующей последовательности, мутация G на С, но не привело к аминокислотному изменению. Поэтому кодирующая последовательность vip3Aa20 и белокVip3Aa20 являются уникальными для трансгенного растения MIR162 и применимы для идентификации любого растения, содержащего трансгенный генотип MIR162. Кодирующая последовательность pmiMIR162 была идентична той, которая наблюдалась для трансформационного плазмида pNOVBOO. Сравнительный анализ первичной структуры инсектицидных белков Vip3Aa20 и Vip3Aa19 представлен в табл. 3.- 20019578 Таблица 3 Сравнение аминокислотной последовательности Vip3Aa20 и Vip3Aa19 Затененная графа указывает на изменение аминокислоты.- 22019578 Пример 5. Анализ фланкирующей последовательности ДНК. Известно несколько способов для специальных знаний по амплификации неизвестных последовательностей ДНК, располагающихся по соседству с областью ядра последовательности. Такие способы включают в себя, без ограничения, обратную ПЦР (i-ПЦР) [Охман и др. Генетика 120:621-623 (1988); Триглия и др. Нуклеиновая кислота. 16:8186 (1988)], принудительную ПЦР [Джонс и Винисторфер, Нуклеиновая кислота 20:595-600 (1992); Джонс и Винисторфер, Биотехнологии 23:132-138 (1997)], ПЦР с заякоренной кассетой сшивания [Мюллер и Вольд, Science 246:780-786 (1989)], vectorette ПЦР [Рили и др. Нуклеиновая кислота. 18:2887-2890 (1990)], новый Alu-ПЦР [Пускас и др., нуклеиновая кислота 22:3251-3252 (1994)] и Thermal Assymetric Interlaced PCR (TAIL-PCR) [Лиу и Виттир, Genomics 25:673681 (1995)]. Другой способ, используемый для амплификации последовательности геномной ДНК кукурузы,фланкирующей гетерологичную ДНК, инсертируемую в трансгенное растение MIR162, был vectorettePCR, описанный у Рили и др. Нуклеиновые кислоты Res. 18:2887-2890 (1990), включенный со ссылкой. Подтверждены фланкирующая последовательность 5' и связующая последовательность при помощи стандартных процедур ПЦР. Использовались следующие пары праймеров или их комплементов для подтверждения последовательности: 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEQ ID : 36)/VIPR4:(SEQ ID : 40). Получившийся ампликон содержит последовательность, указанную в SEQ ID : 41, и объединяет в себе 5' связующую последовательность SEQ ID : 45. Установлено, что другие последовательности праймеров могут использоваться для подтверждения фланкирующей и связующей последовательности. При помощи данного способа был обнаружен инсерт MIR162, 5'-фланкируемый нуклеотидами 1040-1088 геномной последовательности кукурузы, указанной в SEQ ID : 46. Более крупная область 5'-фланкирующей последовательности трансгенного растения MIR162 была создана при помощи набора Seegene DNA Walking SpeedUp в соответствии с инструкциями производителя. Первая реакция ПЦР проводилась независимо в четырех пробирках с использованием праймераFE1002: 5'CGTGACTCCCTTAATTCTCCGCT3' (SEQ ID : 50) с одним из праймеров DW-ACP 1, 2, 3,или 4, поставляемых производителем. В ПЦР пробирке на льду были перемешаны следующие реагенты: 100 мкг геномной ДНК MIR162, 4 мкл 2,5 мкМ DW-ACP (каждый с DW-ACP 1, 2, 3 или 4), 4 мкл 2,5 мкМ FE1002, 19 мкл дистиллированной воды и 25 мкл 2 Х SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Колбы были помещены в заранее нагретый (94 С) термоциклер. ПЦР проводилась с использованием следующей программы: один цикл при 94 С в течение 5 мин, при 42 С в течение 1 мин и при 72 С в течение 2 мин,30 циклов при 94 С в течение 40 с, при 55 С в течение 40 с и при 72 С в течение 90 с и один цикл при 72 С в течение 7 мин. Продукты ПЦР были очищены при помощи экзонуклеазы I и щелочной фосфатазы из креветок. Вторая реакция ПЦР проводилась независимо в четырех отдельных пробирках с использованием праймера FE1003: 5'GATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTT3' (SEQ ID : 51) с праймером DW-ACPN, поставляемым производителем набора. В колбе ПЦР на льду смешивались следующие реагенты: 3 мкл очищенного продукта ПЦР, 1 мкл 10 мкМ DW-ACPN, 1 мкл 10 мкМ FE1003, 5 мкл дистиллированной воды и 10 мкл 2 Х SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Колбы были помещены в заранее нагретый (94 С) термоциклер. ПЦР выполнялась с использованием следующей программы: один цикл при 94 С в течение 5 мин, 35 циклов при 94 С в течение 40 с, 60 С в течение 40 с и 72 С в течение 90 с и один цикл при 72 С в течение 7 мин. Третья реакция ПЦР проводилась независимо в четырех индивидуальных пробирках при помощи праймера FE1004: 5'GATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT3' (SEQ ID : 52) с универсальным праймером,поставляемым производителем. В пробирке для ПЦР на льду смешивались следующие реагенты: 2 мкл очищенного продукта ПЦР, 1 мкл 10 мкМ универсального праймера, 1 мкл 10 мкМ FE1004, 6 мкл дистиллированной воды и 10 мкл 2 Х SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Колбы были помещены в заранее нагретый (94 С) термоциклер. ПЦР проводился с использованием следующей программы: один цикл при 94 С в течение 5 мин, 35 циклов при 94 С в течение 40 с, при 60 С в течение 40 с и при 72 С в течение 90 с и один цикл при 72 С в течение 7 мин. 10 мкл продуктов ПЦР были помещены на 1% агарозный гель, содержащий бромид этидия. Из агарозного геля был извлечен соответствующий бэнд и очищен при помощи набора Qiagen Qiaquick GelExtraction Kit в соответствии с инструкциями производителя. Полученный ДНК был клонирован в клонирующем векторе Invitrogen TOPO-XL в соответствии с инструкциями производителя. Данный клон был трансформирован в Е.coli, а ДНК плазмиды была экстрагирована из клеток после выращивания при помощи набора Qiagen Miniprep Kit в течение ночи в соответствии с инструкциями производителя. Данный плазмид использовался для конечного секвенирования. Новый праймер был разработан в рамках новой, ранее не известной последовательности, которая должна быть используемой с праймером в инсерте гетерологичной ДНК для амплифицирования полной 1 kb фланкирующей последовательности вне геномной ДНК. Праймер фланкирующей последовательно- 23019578 сти 162DWConf3: 5'CCTGTGTTGTTGGAACAGACTTCTGTC3' (SEQ ID : 53) и праймер инсерта ДНКFE0900: 5GGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC3' (SEQ ID : 54) использовались для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей 5' фланкирующую последовательность для подтверждения. Последовательность получившегося ампликона указана в SEQ ID : 55. Данный 5' ампликон содержит 5' связующую последовательность, как указано в SEQ ID : 45. 10 мкл продукта ПЦР (ампликон) были помещены на 1% агарозный гель, содержащий этидия бромид. Соответствующий бэнд был извлечен из агарозного геля с использованием набора Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit согласно инструкциям производителя. Извлеченный ДНК был клонирован в клонирующем векторе Invitrogen TOPO-XL согласно инструкциям производителя. Данный клон был трансформирован в Е.coli. ДНК плазмиды была извлечена из клеток после ночного роста в среде при помощи использования набора Qiagen Miniprep Kit в соответствии с инструкциями производителя. Три плазмида были полностью секвенированы с использованием праймеров, как показано в табл. 4. Плазмидные последовательности были сгруппированы для завершения подтвержденной 5'-фланкирующей последовательности. При использовании данного способа было определено примерно 1 kb 5'-фланкирующая последовательность (SEQ ID : 46). Таблица 4 Последовательности праймеров 3'-фланкирующая последовательность трансгенного растения MIR162 была создана с использованием универсального набора Clonetech Genome Walker (Clonetech Laboratories, Inc.) в соответствии с инструкциями производителя. Сначала были сконструированы пулы неклонированных, адаптор-легированных фрагментов геномной ДНК, известных как "библиотеки" Genome Walker. Каждая библиотека создавалась путем расщепления геномной ДНК MIR162 рестрикционным ферментом (DraI, EcoRV, PvuII, StuI, и XmnI), как указано далее: например, 25 мкл геномной ДНК MIR162 (0,1 мкг/мкл), 8 мкл рестрикционного фермента (10 ед./мкл), 10 мкл буферного раствора рестрикционного фермента (10 Х) и 57 мкл дистиллированной H2O были смешаны в пробирке и инкубировались при 37 С с вечера до утра. Затем ДНК очищалась путем многократной экстракции в феноле/хлороформе. И, наконец, ДНК осаждалась и промывалась этанолом, высушивалась и растворялась в 20 мкл буферного раствора. Для лигирования концов адаптора Genome Walker с геномной ДНК MIR162 перемешивали 4 мкл расщепленного, очищенного геномного ДНК с 1,9 мкл адаптора Genome Walker (25 мкМ), 1,6 мкл 10 Х буфера для лигирования и 0,5 мкл Т 4 ДНК лигазы (6 ед./мкл). Такие реакции проводились в течение ночи при 16 С. Реакция останавливали при инкубировании при 70 С в течение 5 мин. После приостановления реакции 72 мкл 1 ТЕ было добавлено в каждую колбу и содержимое было тщательно перемешано. Первая реакция ПЦР проводилась с использованием праймера AP1, поставляемого производителем,с различными праймерами, разработанными в рамках известной инсерционной последовательности гетерологичной ДНК (круг 1 "праймеры, специфичные для генов" или "GSP1"). В пробирке для ПЦР на льду были перемешаны следующие реагенты: 1 мкл соответствующей библиотеки ДНК трансгенного растения MIR162, 1 мкл 10 мкМ AP1, 1 мкл 10 мМ GSP1, 1 мкл 10 мМ d-НТФ, 5 мкл 10 Х ПЦР буфера Advantage 2, 1 мкл полимеразы BD Advantage 2 и 40 мкл дистиллированной воды. ПЦР проводился с использованием следующей программы: семь циклов при 94 С в течение 25 с и при 72 С в течение 4 мин, 32 цикла при 94 С в течение 25 с и при 67 С в течение 4 мин, один цикл при 67 С в течение 4 мин. Каждая начальная реакция ПЦР разбавлялась в 50 раз при добавлении 1 мкл первичного продукта ПЦР 49 мкл дистиллированной воды. Реакциями, используемыми здесь, были (1) библиотеки DraI и XmnI с праймеромGSP1 162GW3F1: 5TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (SEQ ID : 56) и праймер AP1. Вторая реакция ПЦР проводилась независимо с использованием праймера АР 2, поставляемого производителем, с различными праймерами, разработанными в рамках известной инсерционной последовательности гетерологичной ДНК (круг 2 "праймеры, специфичные для гена" или "GSP2"). Следующие реагенты были перемешаны в колбе для ПЦР на льду: 1 мкл соответствующего растворенного первичного продукта ПЦР, 1 мкл 10 мкМ АР 2, 1 мкл 10 мкМ GSP2, 1 мкл 10 мкМ d-НТФ, 5 мкл буфера ПЦР 10 ХAdvantage 2, 1 мкл полимеразы BD Advantage 2 и 40 мкл дистиллированной воды. ПЦР проводилась с использованием следующей программы: пять циклов при 94 С в течение 25 с и при 72 С в течение 4 мин, 20 циклов при 94 С в течение 25 с и при 67 С в течение 4 мин и один цикл при 67 С в течение 4 мин. Реакции, используемые здесь: (1) библиотеки DraI и XmnI с праймером GSP2 162GW3F2: 5'AAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG3' (SEQ ID : 57) и праймер АР 2. 10 мкл продуктов ПЦР наносилось на 1% агарозный гель, содержащий бромид этидия. Соответствующий бэнд был извлечен из агарозного геля и очищен при помощи набора Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit в соответствии с инструкциями производителя. Извлеченный ДНК был клонирован в клонирующем векторе Invitrogen TOPO-XL в соответствии с инструкциями производителя. Такой клон был трансформирован в Е.coli, а ДНК плазмиды извлечена из клеток после ночного роста при помощи набораQiagen Miniprep kit в соответствии с инструкциями производителя. Такой плазмид был секвенирован в результате конечного секвенирования. Был разработан новый праймер в рамках ранее неизвестной последовательности, которая использовалась с праймером в инсерте ДНК для амплификации приблизительно 1 kb 3'-фланкирующей последовательности вне геномной ДНК. Праймер инсерта ДНК 162GW3F1: 5'TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (SEQ ID : 56) и праймера 3' фланкирующей последовательности 1623'GWR1: 5CTGGTGAACCGATTTTTACGGAGG3' (SEQ ID : 58) использовали для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей 3'-фланкирующую последовательность для подтверждения. Последовательность полученного ампликона указана в SEQ ID : 59. Такой 3'-ампликон содержит 3'-связующую последовательность, как указано в SEQ ID : 47. 10 мкл ампликона ПЦР наносилось на 1% агарозный гель, содержащий бромид этидия. Соответствующий бэнд был извлечен из агарозного геля при помощи набора Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit в соответствии с инструкциями производителя. Полученная ДНК была клонирована в клонирующем векторе Invitrogen TOPO-XL в соответствии с инструкциями производителя. Такой клон был трансформирован в Е.coli, а ДНК плазмиды была извлечена из клеток в среде после ночного роста в среде с набором Qiagen Miniprep kit в соответствии с инструкциями производителя. Три плазмида были полностью секвенированы при помощи праймеров,указанных в табл. 5. Плазмидные последовательности были сгруппированы для образования полной подтвержденной 3'-фланкирующей последовательности (SEQ ID : 48). Пример 6. Детектирование белка Vip3Aa20 в MIR162 при помощи иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA). Были подготовлены экстракты из листьев, корней, мякоти, сердцевины, сырца, пыльцы и всего растения трансгенного растения MIR162. Провели количественный анализ на Vip3Aa20 при помощи иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) с использованием иммуноаффинных козлиных антиVip3 А и очищенных от белка - кроличьих анти-Vip3A поликлональных антител с использованием утвержденных процедур ELISA. Vip3Aa20 был обнаружен во всех тканях, проанализированных на всех стадиях роста. Средний уровень белка Vip3Aa20, обнаруженный во всем растении при цветении и созревании семени, составил 10 мкг/г свежей массы и 16 мкг/г свежего веса соответственно. Средний уровень белка Vip3Aa20 в листьях при цветении составил 22 мкг/г свежей массы. Пример 7. Эффективность MIR162 в поле. Трансгенное растение MIR162 было испытано в поле на эффективность защиты от совки травянойipsilon) и европейского мотылька кукурузного (ЕСВ, Ostrinia nubilalis). Результаты анализа трансгенного растения MIR162 сравнили с эффективностью Warrior (Syngenta, Inc.), используемого стандартного инсектицида, наносимого со скоростью 11,2 г активного компонента/акр. Трансгенное растение Bt11,содержащее ген cry1Ab и гибрид Bt11X MIR162, получали путем скрещивания инбредной линии Bt11 с инбредной линией MIR162. 21 испытательное растение было выращено в 13 штатах, представляющих основные области выращивания кукурузы континентальных Соединенных Штатов. Опытные растения были выращены по схеме согласно рандомизированному полноблочному плану с четырьмя повторяющимися участками на блок. Величина участков составляла 17,5 футов в ряду на обрабатываемую область на повторяющемся участке. Плотность насаждения составила примерно 30.000 растений/акр. Иммунодиагностические маркеры использовались для подтверждения присутствия или отсутствия белков Vip3Aa20 и Cry1Ab в различных группах обработки. Естественное заражение вредителями использовалось в исследованиях, в которых популяция была достаточно высокая; когда ее не хватало, проводилось искусственное заражение. Искусственное заражение между 2-м и 3-м периодом между линьками гусеницы при V1-V2 использовалось в испытаниях наBCW. Участки земли оценивались после 3, 7 и 14 дней после заражения. Повреждение от BCW было зафиксировано в виде частичного повреждения растений и полностью уничтоженных растений. Участки земли с FAW оценивались по истечении 7 и 14 дней после заражения или после 3-го периода между линьками гусеницы и наблюдались на контрольных растениях. Для оценки повреждения от FAW и CEW использовалась следующая шкала: 0,01 - нет видимых повреждений листвы;- 26019578 1 - повреждение в виде маленьких точек на некоторых листьях; 2 - небольшое количество листовой пятнистости на некоторых листьях; 3 - листовая пятнистость на некоторых листьях; 4 - листовая пятнистость и повреждения на некоторых листьях; 5 - повреждения на некоторых листьях; 6 - крупные повреждения на некоторых листьях; 7 - крупные повреждения и выеденные места на небольшом количестве листьев; 8 - крупные повреждения и выеденные места на некоторых листьях; 9 - крупные повреждения и выеденные места на многих листьях. Повреждения растений оценивались как для первого, так и второго поколения ЕСВ. Для классификации повреждений первого поколения использовалась следующая шкала, как правило, если личинки находились на 3-й или 4-й возрастной стадии: 1 - нет видимых повреждений листвы; 2 - небольшое количество листовой пятнистости на некоторых листьях; 3 - сплошная листовая пятнистость на некоторых листьях; 4 - некоторые повреждения в виде отверстий и продолговатых повреждений; 5 - некоторые листья с продолговатыми повреждениями; 6 - некоторые листья с продолговатыми повреждениями размером около 2,5 см; 7 - сплошные крупные повреждения примерно на половине листьев; 8- сплошные большие повреждения примерно на двух третьих части листьев; 9 - много листьев с большими повреждениями. Повреждения от ЕСВ второго поколения оценивались через 3-4 недели после искусственного заражения или окончания периода откладывания яиц. Проводились следующие измерения: количество живых личинок/цветоножку, количество живых личинок/стебель, количество живых личинок/ножку, количество живых личинок/початок, количество проходов/цветоножку, общая длина проходов(см)/цветоножку, общая длина проходов (см)/стебель, количество проходов/початок, общая длина проходов на повреждении зерна (см)/початок и % зараженных растений. Опытные исследования на CEW в целом проводились на выращенных позднее растениях для увеличения естественного уровня заражений. Повреждения выеданием по гнезду оценивалось, когда личинки CEW, находившиеся на контрольных растениях, были на стадии роста L5-L6. Классификация початков включала запись количества обнаруженных личинок на початок и длину видимого выедания зерна,измеренное от верхушки початка до среднего нижнего разрушенного зерна. Результаты полевых испытаний на BCW представлены в табл. 6. Менее 3% от растений трансгенного растения MIR162 и растений Bt11 X MIR162 было срезано личинками BCW. Значительное число Bt11 и контрольных растений были уничтожены. Растения, содержащие генотип трансгенного растения MIR162, имели меньше повреждений выеданием BCW, чем растения, обработанные стандартным инсектицидом. Таблица 6 Классификация повреждений ножки по 5 исследованиям на BCW после 21 с момента заражения. Повреждения оценивались как процентное количество от общего числа уничтоженных растений Результаты полевых исследований на FAW представлены в табл. 7. Повреждения выеданием FAW измерялись по шкале 0,01 до 9. Среднее число повреждений выеданием в гибридах MIR162 было очень низким (1) и значительно ниже, чем число средних повреждений,наблюдаемых у Bt11 и при стандартных методах обработки инсектицидами. Численность насекомых в таких опытах была высокой и составила примерно от 50 до 100 новорожденных личинок/растение. Растение Bt11 показало некоторую защиту от повреждений, причем традиционная обработка инсектицидами не дала никакой защиты, и сохранился тот же уровень повреждений, что и для контрольного растения.- 27019578 Таблица 7 Повреждения выеданием листвы на примере пяти исследований для FAW. Средний уровень повреждений по истечении 14 дней после заражения представлен по каждому виду защиты Результаты исследований для оценки повреждений от первого поколения ЕСВ представлены в табл. 8. Уровень выедания ЕСВ оценивался по шкале 1-9. В данных исследованиях трансгенного растенияMIR162 придавал минимальную защиту от выедания ЕСВ. Bt11 полностью защищал растения от выедания ЕСВ. Растения Bt11 X MIR162 обладали тем же уровнем защиты, что и растения Bt11. Традиционная обработка инсектицидами обеспечила лучший уровень защиты, чем трансгенного растения MIR162, но значительно меньший уровень защиты, чем для Bt11. Таблица 8 Повреждения выеданием листвы в ходе полевых испытаний. Средний коэффициент повреждений по истечении 14 дней после заражения Результаты по повреждениям от второго поколения ЕСВ представлены в табл. 9. Повреждения выеданием оценивались в виде общей длины прохода в каждом стебле кукурузы (если было обнаружено несколько проходов, то их суммарная длина проходов). Обработка Bt11 и Bt11 X MIR162 обеспечила лучшую защиту от появления отверстий в стебле, но не удалось обеспечить защиту от появления проходов отдельно агентом MIR162 или инсектицидной обработкой. Таблица 9 Классификация повреждений стебля по семи исследованиям на уровень наличия личинок второго поколения ЕСВ, измеряемых в длине прохода (см) на стебель. Измерения проводились через 3-4 недели после искусственного заражения Результаты исследований по оценке повреждения от CEW представлены в табл. 10. Повреждения выеданием оценивались в виде длины повреждения зерна на початок, измеренной с верхней части початка до среднего самого нижнего поврежденного зерна. Значительные повреждения зерна наблюдались дляBt11, инсектицида, и на контрольных участках. Bt11 оказывал некоторый уровень защиты по сравнению с необработанным контрольным растением и был сопоставим с защитой, которая обеспечивалась традиционной инсектицидной обработкой.MIR162 и Bt11X MIR162 оказывали практически полную защиту початков от повреждений выеданием гусеницами CEW.- 28019578 Таблица 10 Классификация повреждений початка по шести исследованиям для CEW, измеренных в виде средней длины повреждения выеданием. Измерения проводились для контрольных растений, когда личинкиCEW находились на стадии развития L5-L6 Пример 8. Эффективность MIR162 для защиты от западной совки, пожирающей фасоль (WBC). Данные коммерческие трансгенные растения, продуцирующие белок Cry1Ab, не обеспечивали нужного уровня защиты от западной совки, пожирающей фасоль (WBCW, Striacosta albicosta). ПоэтомуMIR162 сам по себе и вместе с другими трансгенными генотипами был исследован на эффективность защиты от WBCW. Яйца WBCW были собраны от диких бабочек женского пола. До проведения эксперимента личинок вскармливали согласно рациону совок-ипсилон. Растения кукурузы были выращены в полевых условиях. Испытаны следующие виды обработки: MIR162, Bt11, MIR604, MIR162 X Bt11, MIR162 X MIR604,MIR604 X Bt11, Force (Syngenta, Inc.), традиционная обработка инсектицидами применялась на насаждениях до отрицательной изолинии и двух отрицательных контрольных изолиний. MIR604 является новым трансгенным растением, который содержит ген cry3 А 055, кодирующий белок, активный для защиты от личинок диабротики (Diabrotica spp.). Он описан в патентной заявке США, публикация 2005/0216970 от 29 сентября 2005 г, включенной со ссылкой. Для экспериментов двухдюймовые нити зеленого шелка и листовой обертки были срезаны с початка растений полевой кукурузы зерновых для каждой обработки и повтора. Концевые коричневые части шелка были удалены, а обертка снята. Около 1,5-дюймовые рыльца было помещены в индивидуальные 14 мл пластиковые банки. Затем в каждую банку помещали по одной личинке и банку закупоривали. Изучали несколько стадий развития личинок в диапазоне от 3-го до 6-го периода между линьками. Банки, содержащие рыльца и личинки, выдерживались в течение дня и комнатной температуре на протяжении эксперимента. Выживаемость личинок фиксировалась по истечении восьми дней. Обработка повторялась четыре раза в ходе эксперимента. Результаты эксперимента на WBCW представлены в табл. 11. Выживание WBCW на рыльцах от использования отрицательных изолиний и после традиционной инсектицидной обработки составляло около 100%. Выживание личинок WBCW на рыльцах Bt11 иMIR604, исследованная либо по отдельности, либо в сочетании на том же самом растении, не отличалось от выживания на отрицательных изолиниях. Относительное значение выживания личинки WBCW снизилось, когда личинка питалась рыльцами трансгенного растения MIR162. Использование комплексаMIR162 X Bt11 на том же растении не уменьшило относительное значение выживаемости, кроме трансгенного растения MIR162. Тем не менее, удивительно то, что, когда трансгенный генотип трансгенного растения MIR162 объединялся с трансгенным генотипом MIR604 на одном и том же растении, смертность личинок значительно увеличивалась по сравнению с каждым из MIR162 или MIR604 отдельно. Таблица 11 Относительное значение (SE) выживаемости личинок WBCW на кукурузных рыльцах