Модифицированный полипептид с дикамба-монооксигеназной активностью, кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты и способы их применения

МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД С ДИКАМБА-МОНООКСИГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В изобретении предлагается молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая дикамбамонооксигеназу (DMO), которая при введении в растение обеспечивает толерантность растения к гербициду дикамба. Предлагаются конструкции, содержащие указанную молекулу нуклеиновой кислоты, полипептид с дикамба-монооксигеназной активностью, клетка, трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению, культура растительной ткани, содержащая такие клетки, трансгенное растение и способ получения такого растения. В изобретении предлагается способ получения продуктов из указанного трансгенного растения, а также способ контроля роста сорняков в окружении растения, толерантного гербициду дикамба. Изобретение расширяет спектр растений, которые могут расти в условиях применения гербицидов.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЛЛС; БОРД ОФ РИДЖЕНТС ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ НЕБРАСКА (US) 017638 Уровень техники В настоящей заявке заявлен приоритет предварительной патентной заявки с серийным номером US 60/811152 от 6.06.2006 и предварительной патентной заявки с серийным номером US 11/758657 от 5.06.2007, описание которых полностью введено в настоящее описание с помощью ссылки. Область техники Настоящее изобретение относится в основном к области биотехнологии. Более конкретно, изобретение относится к модифицированным ферментам дикамба-монооксигеназы, способным придавать толерантность к гербициду дикамба в трансгенных организмах. Описание уровня техники Способы получения полевых сельскохозяйственных культур, таких как кукуруза, соя и хлопок,серьезно изменились в течение последней декады благодаря введению таких свойств, как устойчивость к воздействию насекомых и гербицидная толерантность, посредством использования методов генетической инженерии растений. Указанные изменения привели в результате к увеличению продуктивности на гектар, к уменьшению стоимости, увеличению гибкости и эффективности режимов производства,уменьшению использования пестицидов и, в случае хлопка, устойчивого к воздействию насекомых, к улучшению здоровья фермеров. Таким образом, трансгенные сельскохозяйственные культуры получили широкое распространение, и сейчас выращиваются на миллионах акрах по всему миру. Однако для продолжения конкурентоспособности трансгенных сельскохозяйственных культур на рынке требуется введение дополнительных свойств. Хотя новые свойства, улучшающие количество и качество сельскохозяйственных и садовых культур, появились и продолжают появляться с течением времени с возрастающей скоростью, при этом существует спрос на свойства, которые улучшают способы производства пищи, корма и других продуктов. Например, в то время как в настоящий момент являются доступными трансгенные растения, толерантные к обработкам гербицидами в виде глифосфата, бромоксинила, сульфонилмочевины и другими гербицидами, существуют пробелы по части контролируемых сорняков и свойств обработок, которые могут быть переадресованы по направлению развития дополнительных сельскохозяйственных культур, толерантных к гербицидам. Более того, появление сорняков, устойчивых к гербицидам, отмеченное выше,хотя в основном локализованное и переменно возникающее, накладывает ограничения в виде необходимости дополнительных или альтернативных мер контроля сорняков. В то время как трансгенная толерантность к гербицидам доказала ценность с коммерческой точки зрения, появилась, таким образом, необходимость того, чтобы для растений, толерантных к другим гербицидам, избегали риска повышенного доверия к любому единственному гербициду и увеличивали свойства для управления трудными для контроля видами сорняков. Особенно необходимым является развитие толерантности к гербицидам, которые безвредны для окружающей среды и одновременно высокоэффективны при контроле сорняков. Дикамба представляет собой один такой пример эффективного и безвредного для окружающей среды гербицида, который использовался фермерами в течение более 40 лет. Дикамба в особенности используется для контроля однолетних и многолетних широколистных сорняков и некоторых травянистых сорняков в сельскохозяйственных культурах кукурузы, сорго, мелких зерновых, в кормовых культурах, культурах для сена, культурах на пастбищах, в культурах сахарного тростника, спаржи, дерна и культур семенной травы (Crop. Protection Reference, 1995). К сожалению, дикамба может повреждать многие коммерческие сельскохозяйственные культуры и двудольные растения,такие как соя, хлопок, горох, картофель, подсолнечник и канола, которые особенно чувствительны даже к низкому уровню гербицида. Несмотря на это дикамба представляет собой высокоэффективное средство в контроле роста сорняков и, таким образом, является важным инструментом в сельском хозяйстве. Недавно из Pseudomonas maltophilia был выделен ген, кодирующий дикамба-монооксигеназу(DMO), которая придает толерантность к дикамбе (патент US7022896). DMO вовлечен в превращение гербицида дикамба (3,6-дихлор-о-анисовой кислоты) в нетоксичную 3,6-дихлорсалициловую кислоту. Указанный ген описан в патенте US7022896 как обеспечивающий толерантность к дикамбе в растениях, экспрессирующих ген DMO. Однако разработка вариантов указанного гена могла бы принести огромную пользу. Такие варианты могли бы потенциально иметь различную эффективность экспрессии при определенных условиях окружающей среды. Таким образом, может быть выбран вариант, который оптимизируется для определенной окружающей среды, для которой предназначено его использование, и может демонстрировать особенно полезные динамические черты. Вариант, который демонстрирует конкретную эффективность при различных температурах или различных условиях рН, и таким образом, может быть выбран для конкретного вида сельскохозяйственной культуры в зависимости от внутриклеточных условий и/или от ожидаемых условий роста сельскохозяйственной культуры. Сущность изобретения В одном аспекте в изобретении предлагается выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из: а) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид из SEQ ID NO: 1; b) последовательности нуклеиновой кислоты, включающей последовательность SEQ ID NO: 2; и с) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичности последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 1, где полипептид-1 017638 обладает дикамба-монооксигеназной активностью и включает цистеин в положении, соответствующем положению 112 аминокислоты SEQ ID NO: 1. В других воплощениях предлагается конструкция ДНК,включающая заявленную нуклеиновую кислоту, кодирующую DMO, функционально связанную с промотором. Промотор может быть функциональным в растительной клетке. В определенных воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей дикамба-монооксигеназу, может быть функционально связана с хлоропластным транзитным пептидом. В другом аспекте в изобретении предлагается полипептид, последовательность которого имеет по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: 1, где полипептид обладает дикамба-монооксигеназной активностью и включает цистеин в положении, соответствующем положению 112 аминокислоты SEQ IDNO: 1. Еще в одном аспекте в изобретении предлагается клетка-хозяин, трансформированная вушеуказанной нуклеиновой кислотой по изобретению, кодирующей дикамба-монооксигеназу. В определенных воплощениях клетка-хозяин может представлять собой растительную клетку. В следующих воплощениях указанная растительная клетка может быть определена как клетка двудольного растения или клетка однодольного растения. В определенных воплощениях клетка-хозяин представляет собой клетку растений сои, хлопчатника, маиса или рапса. В следующих воплощениях предлагается тканевая культура, включающая указанную трансгенную клетку. Еще в одном воплощении в изобретении предлагается трансгенное растение и его потомство,трансформированные заявленной нуклеиновой кислотой, кодирующей дикамба-монооксигеназу. В определенных воплощениях растение может быть определено как двудольное или однодольное растение. В определенных воплощениях растение представляет собой сою, хлопчатник, маис или рапс. Еще в одном аспекте в изобретении предлагается способ получения растения, толерантного к дикамбе, включающий введение в растение трансформирующей ДНК конструкции. Введение трансформирующей конструкции может быть проведено путем стабильной трансформации исходных растительных клеток и регенерации клеток в растение, толерантное к дикамбе. В другом воплощении растение, толерантное к дикамбе, может быть получено путем скрещивания родительского растения с самим собой или со вторым растением, где родительское растение и/или второе растение включают трансформирующую конструкцию, и растение, толерантное к дикамбе, наследует трансформирующую конструкцию от родительского растения и/или от второго растения. Еще в одном аспекте в изобретении предлагается способ получения пищевых или кормовых продуктов, включающий: а) получение растения по изобретению или его части и b) приготовление продукта из растения или его части. Частью растения может являться семя. В определенных воплощениях пищевой или кормовой продукт представляют собой масло, муку, белок, зерно, крахмал или белок. В изобретении также предлагаются способы производства волокон, лекарственных средств, нутрицевтиков и химических веществ для производственных нужд, включая биотоплива, а также любой другой продукт, выделенный из растения по изобретению. Еще в одном аспекте в изобретении предлагается способ контроля роста сорняков, которые окружают растущее растение по изобретению или его семя, причем способ включает применение эффективного для контроля роста сорняков количества гербицида дикамба вокруг растущих растений по изобретению или его семян. В определенных воплощениях изобретения гербицид дикамба может наноситься на верхние части растений, окружающих растущую сельскохозяйственную культуру, такую как растения по изобретению. При этом применяемое количество гербицида дикамба не повреждает растение по изобретению или его семя, но повреждает растение такого же генотипа, что и указанное растение, лишенное предлагаемой по изобретению нуклеиновой кислоты, кодирующей DMO. Краткое описание чертежей Следующие чертежи образуют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение можно лучше понять со ссылкой на один или более из этих чертежей в комбинации с подробным описанием определенных воплощений,представленных в настоящем описании. Фиг. 1. Схема кассеты, использованной для генетической инженерии гена дикамба-монооксигеназы(DMOc) для экспрессии в высших растениях с использованием промотора FLt36 из вируса хлоротической полосатости арахиса, с использованием энхансерной последовательности трансляции (лидер TEV) из вируса гравировки табака и участка терминации из малой субъединицы гена Rubisco гороха. Другая версия гена DMOc, полученная с использованием генетической инженерии, содержала участок, кодирующий транзитный пептид, из малой субъединицы гена Rubisco гороха для локализации DMO в хлоропластах, между энхансерным участком трансляции TEV и кодирующим участком для DMOc. Фиг. 2. Панели блотов ДНК, РНК и белка, демонстрирующие присутствие и экспрессию полученного с помощью генетической инженерии гена DMO в генерации T1 трансгенных растений табака. Дорожки Q-V показывают образцы ДНК, мРНК и DMO, выделенные из различных генераций T1 трансгенных растений табака. Экстракты из нетрансгенного растения табака показаны на дорожке WT, в то время как дорожка Ох демонстрирует гидролизованный с помощью рестрикции продукт клонированной конст-2 017638 рукции гена DMO (верхняя панель) и сверхпродуцирование в Е. coli приблизительно 37 кДа ферментаDMO (нижняя панель). Большая субъединица приблизительно 55 кДа Rubisco была детектирована с помощью белкового блота путем добавления антител Rubisco к антисыворотке DMO, и детектированиеRubisco служило в качестве внутреннего стандарта для сравнения общей загрузки белка в каждую дорожку. Равные количества РНК загружали в каждую дорожку, что оценивали с помощью окрашивания этидиум бромидом дубликата геля. Стрелки указывают локализацию полосы ДНК, мРНК или белка, соответствующей DMO. Фиг. 3. Эффект обработки с помощью дикамбы в количестве 2,2 кг/га двух T1 растений табака, одно содержало полученный с помощью генетической инженерии ген DMOc, лишенный последовательности,кодирующей хлоропластный транзитный пептид (справа), и другое было лишено гена DMOc (второе справа). Трансгенное растение справа проявило слабое, если это вообще имело место, повреждение, вызванное от обработки с помощью дикамбы. Два растения слева не были подвержены обработке с помощью дикамбы и представляют собой нетрансгенное растение (слева) и трансгенное растение, содержащее ген DMOc (второе слева). Фиг. 4. Образование DCSA против времени с помощью DMOw. Фиг. 5. Определение оптимального анализа рН для DMOw. Фиг. 6. Определение оптимального анализа температуры для DMOw. Фиг. 7. Определение оптимального значения рН для DMOc. Фиг. 8. Определение оптимального значения температуры для DMOc. Фиг. 9. Суммирование оптимальных температурных и рН условий для DMOc и DMOw. Фиг. 10. Кинетика устойчивого состояния для DMOw. Фиг. 11. Кинетика устойчивого состояния для DMOc. Фиг. 12. Эффекты предварительной инкубации DMOc в течение 45 мин при 30 С в растворе 50 мМTRIS рН 7,5 и 100 мМ KPi рН 7,0. Фиг. 13. DMOc-анализы с ферментом проводили в течение одной недели и хранили при 4 С в буфере TRIS (два анализа слева; анализы перед хранением и после хранения соответственно) и в буфере KPi(два анализа справа; анализы перед хранением и после хранения соответственно). Фиг. 14. Конструкция гена дикамба-монооксигеназы, полученная с помощью генетической инженерии для гомологичной рекомбинации и экспрессии в хлоропластах табака. Фиг. 15. Демонстрация гомопластидного статуса хлоропластного генома трансгенных линий табака,трансформированных геном DMO, сконструированным для гомологичной рекомбинации и экспрессии в хлоропластах табака. На левой панели показана конструкция для интеграции DMO в хлоропласты путем гомологичной рекомбинации (как показано на фиг. 14). Полоса выше левой обозначенной последовательности указывает фрагмент ДНК, амплифицированный для получения меченного дигоксигенином гибридизационного зонда. На панелях справа показаны ДНК-блоты: дорожка 1 содержит маркеры по размеру. Дорожка 2 содержит ДНК из нетрансгенных растений табака. Дорожки 3-11 содержат ДНК,выделенную из трансгенных растений сразу после первого раунда селекции и регенерации в присутствии спектиномицина (верхняя панель) и после нескольких раундов селекции и регенерации, когда получают очевидную гомопластидность хлоропластного генома (нижняя панель). ДНК для ДНК-блот анализов выделяли из трансгенных и нетрансгенных растений и подвергали рестриктному гидролизу ферментомBamH I перед разделением с помощью электрофореза и гибридизацией ДНК-блота с меченым фрагментом ДНК, комплементарным "левой последовательности-мишени" трансформирующего вектора с хлоропластным геномом (то есть гибридизационным зондом, меченным дигоксигенином). 5,6-т.п.о. фрагмент ДНК соответствует фрагменту ДНК хлоропластов, содержащему ген DMO, и 3,3-т.п.о. фрагмент ДНК соответствует гомологичному нативному фрагменту ДНК хлоропластов, лишенному вставленной конструкции гена DMO. Фиг. 16. T1 генерация гомопластидных растений табака, содержащих кодируемый в хлоропластах ген дикамба-монооксигеназы, обработанных с помощью дикамбы на уровне 28 кг/га (растения 1 и 2 и растения 3 и 4 были выделены из двух независимо трансформированных R0 растений.) Фиг. 17. Экспрессия DMO, чувствительность и устойчивость к обработке с помощью дикамбы в нетрансгенных и трансгенных растениях табака, содержащих ген DMO в хлоропластном геноме. Белковый блот гибридизовали с DMO-антителами: дорожка 1 содержит очищенный белок DMO. Дорожка 2 является пустой и дорожка 3 содержит белковые экстракты из нетрансгенных растений табака. Дорожки 4 и 8 содержат белки, выделенные из "ложноположительных" растений табака, демонстрирующие устойчивость к антибиотикам во время селекции на спектиномицине, но лишенные интактного гена DMO. Дорожки 5-7 содержат экстракты трансгенных растений, экспрессирующих DMO, кодируемый геном DMO,интегрированным в хлоропластный геном. S представляет собой растения, чувствительные к дикамбе при 0,56 кг/га; R представляет собой растения, устойчивые к дикамбе при 0,56 кг/га. Почти равные количества экстрактов загружали в дорожки 4-8, что оценивали по количеству большой субъединицы белкаRubisco, который детектировался с помощью Rubisco-антител, в то время как значительно большее количество белка из нетрансгенных растений загружали в дорожку 3. Стрелками указано положение белка-3 017638 Фиг. 18. Сравнение участка полипептидной последовательности DMO дикого типа с консервативными участками других железосерных оксигеназ, показывающее, что DMO является уникальным с низкой степенью идентичности с известными ферментами, но W112 (стрелка) является консервативным в других железосерных оксигеназах, и граничит с двумя консервативными доменами, Rieske негеминовогоFe (SEQ ID NO: 4-23). Подробное описание изобретения В изобретении предлагаются варианты дикамба-монооксигеназы (DMO), включающие цистеин в положении, соответствующем положению 112 в DMO, показанные в SEQ ID NO: 1, обозначенные в настоящем описании как DMOc. Было продемонстрировано, что с помощью DMOc получают высокий уровень толерантности к гербициду дикамба при экспрессии в трансгенных растениях. Результаты оказались неожиданными, поскольку другое положение аминокислоты является высококонсервативным в других железосерных оксигеназах. Из 78 проанализированных последовательностей железосерных оксигеназ из 45 образцов все из 52 последовательностей оксигеназ с идентичностью, составляющей по меньшей мере 15%, содержали аминокислоту W в положении, соответствующем положению аминокислоты 112 из SEQID NO: 1, несмотря на то, что наибольшая идентичность составляла только 38%. Указанное положение также граничит с двумя консервативными функциональными доменами (фиг. 18). Поэтому высокий уровень толерантности к гербициду, полученный с помощью DMOc, оказался неожиданным. Анализ параметров Михаэлиса-Ментена для DMOc по отношению к неизмененной последовательности (DMOw; патент US7022896) обнаружил, что ферменты отличались по части каталитических эффективностей: DMOc был в пять раз более эффективней, чем DMOw, и, по-видимому, DMOc обладает более высоким порядком обновления и более тесным связыванием с субстратом. Кроме того, DMOc функционировал лучше при условиях, соответствующих более низким значениям рН и более высоким температурам по отношению к нативному. Полученные результаты указывают на потенциал для селекции DMO-вариантов для использования в конкретном трансгенном растении на основе ожидаемых условий использования, таких как условия растущей сельскохозяйственной культуры. Таким образом, один аспект изобретения включает идентификацию окружения растущей сельскохозяйственной культуры, по меньшей мере, для первого вида сельскохозяйственной культуры и идентификацию фермента DMO,наиболее подходящего для указанного окружения на основе динамики, например DMOc и DMOw. Например, специалист в данной области может в конкретных воплощениях выбрать последовательность,кодирующую DMOc, для использования в растениях, представляющих условия, соответствующие более низким значениям рН в растении, и/или в случае роста в условиях с более высокими температурами по отношению к другим видам растений или условиям роста соответственно. Дикамба может применяться путем введения в почву (предпосевное введение), путем орошения почвы (довсходовое введение) и путем обработки всходов (послевсходовая обработка), в то время как уровень толерантности к дикамбе может отличаться в различное время в течение роста растения. Как указано выше, толерантность к экстремально высокому уровню гербицида дикамба была получена в трансгенных растениях, экспрессирующих DMOc. В случае растения табака, например, которое обычно является чувствительным даже к очень низкому уровню дикамбы, были сконструированы трансгенные растения, экспрессирующие DMOc, которые были толерантны к обработке с помощью дикамбы в количестве 5,6 кг/га или выше, например в 10-20 раз выше, чем обычная рекомендованная полевая доза для контроля широколистных сорняков. Когда ген DMOc был вставлен в хлоропластный геном растений табака, получили толерантность к дикамбе, составляющую по меньшей мере 2,8 кг/га. Также были сконструированы трансгенные растения сои, томата и Arabidopsis thaliana, несущие кодируемый в ядре генDMOc в ядерный геном растений сои получают толерантность к обработкам в количестве 2,8 кг/га, таким образом разрешая использование дикамбы для контроля сорняков в полях с растениями, экспрессирующими DMOc. Таким образом, было продемонстрировано, что DMOc является эффективным в придании толерантности к дикамбе без необходимости дополнительных кодирующих последовательностей, таких как ферредоксина или редуктазы из P. maltophilia, штамма DI-6. Модифицированный ген DMO наследовался стабильно согласно правилу Менделя без видимой потери пенетрантности или экспрессии. В то время как получали чуть более высокий уровень экспрессии растений с хлоропластным транзитным пептидом,трансгенные растения с DMO, лишенные последовательности, кодирующей хлоропластный транзитный пептид, также демонстрировали высокий уровень послевсходовой толерантности к дикамбе. А. Нуклеиновые кислоты и рекомбинантные конструкции. 1. Дикамба-монооксигеназа (DMO). В одном воплощении настоящего изобретения предлагаются конструкции ДНК, включающие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид дикамба-монооксигеназы, включающий цистеин в положении, соответствующем положению 112 из SEQ ID NO: 1. Типичная последовательность, кодирующаяDMO, предлагается в настоящем описании в виде SEQ ID NO: 2. Указанная последовательность дополнительно к включению цистеина в положении 112 из SEQ ID NO: 1 включает дополнительный кодонGCC (аланин), следующий за старт-кодоном ATG, с добавлением сайта рестрикции Nco I по отношениюSEQ ID NO: 1 также включает дополнительный остаток Ala, следующий непосредственно за Met, кодируемым старт-кодоном. Последовательность транзитного пептида вырезали из плазмиды с помощью BglII и EcoR I и затем клонировали по сайтам BamH I и EcoR I в вектор pBluescript II KS+. Указанную конструкцию использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР с праймерами, с помощью которых добавляли сайты рестрикции Nco I к каждому концу последовательности, кодирующей транзитный пептид. Гидролиз ПЦР-продукта с помощью Nco I давал возможность вставки последовательности, кодирующей транзитный пептид в сайт инициирующего кодона ATG модифицированного гена DMO. Таким образом, в одном воплощении изобретения предлагаются последовательности, кодирующие полипептид из SEQ ID NO: 1, включая, но не ограничиваясь, SEQ ID NO: 2. Как хорошо известно из уровня техники, гомологичные последовательности и производные указанных последовательностей могут быть легко получены и использованы. Например, может быть использована нуклеиновая кислота,которая кодирует полипептид DMO, имеющий по меньшей мере 90% идентичности последовательности с полипептидом DMOc из SEQ ID NO: 1, включая по меньшей мере приблизительно 92, 94-99% или более идентичности с такой последовательностью. Также может использоваться нуклеиновая кислота, которая демонстрирует по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в виде SEQ ID NO: 2, включая по меньшей мере приблизительно 92, 94-99% или более идентичности с такой последовательностью, и которая кодирует DMO, включающий цистеин в положении 112. В одном воплощении идентичность последовательности определяют с использованием пакета программного обеспечения Анализа Последовательности из пакета GCG Wisconsin (Accelrys, San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715) со стандартными параметрами. Указанная программа выбирает подобные последовательности путем оценки степени подобия или идентичности. Полинуклеотидная молекула, которая экспрессирует полипептид DMO, может быть получена с помощью методов, хорошо известных из уровня техники, принимая во внимание настоящее описание. Варианты DMO, представленные в настоящем описании, способные к деградации декамбы, можно, таким образом, получить и оценить на предмет активности согласно описанной в настоящем описании методологии. Такие последовательности также могут быть идентифицированы, например, из подходящих организмов, включая бактерии, которые подвергают деградации дикамбу (патент US5445962; Krueger etal., 1989; Cork and Krueger, 1991; Cork and Khalil, 1995). Один способ выделения клонированной последовательности DMO представляет собой гибридизацию нуклеиновой кислоты, например, с библиотекой,сконструированной на основе организма-источника, или способ на основе РТ-ПЦР с использованием мРНК из организма-источника и праймеров на основе описанной последовательности DMO. Таким образом, изобретение охватывает использование гибридизации нуклеиновых кислот при жестких условиях с описанной в настоящем описании последовательностью, кодирующей DMO. Специалисту в данной области понятно, что условия могут быть заменены на менее жесткие путем увеличения концентрации соли и уменьшения температуры. Таким образом, условиями гибридизации легко манипулировать, и, таким образом, указанные условия, как правило, представляют собой метод выбора в зависимости от желаемых результатов. Примером условий высокой жесткости является 5 Х SSC, 50% формамид и 42 С. При проведении отмывки при указанных условиях, например, в течение 10 мин, те последовательности, что не загибридизовались с конкретной последовательностью-мишенью при указанных условиях, могут быть удалены. Таким образом, одно воплощение изобретения включает применение нуклеиновой кислоты,кодирующей DMO, которую определяют как последовательность, гибридизующуюся с нуклеиновой кислотой согласно SEQ ID NO: 2 при условиях отмывки в 5 Х SSC, 50% формамиде и при 42 С в течение 10 мин. Варианты также могут быть химически синтезированы с использованием полинуклеотидных последовательностей DMO, описанных в настоящем описании, согласно методам, хорошо известным из уровня техники. Например, последовательности ДНК могут быть синтезированы с помощью химии фосфоамидитов в автоматическом ДНК-синтезаторе. Химический синтез имеет ряд преимуществ. В частности, химический синтез является желательным, поскольку кодоны, предпочтительные для организмахозяина, в котором последовательность ДНК будет экспрессироваться, могут быть использованы для оптимизации экспрессии. Пример указанной последовательности, которая оптимизируется для экспрессии в двудольных растениях с использованием кодонов, используемых в Arabidopsis thaliana, представляет собой последовательность DMO, представленную в SEQ ID NO: 3. Полипептид с предсказанными аминокислотами Ala, Thr, Cys в положениях 2, 3, 112 соответственно представлен в SEQ ID NO: 1. Остаток Ala в положении 2 был добавлен по отношению к дикому типу DMO в результате вставки кодона для аланина непосредственно после инициирующего кодона ATG для облегчения создания векторной конструкции, как объяснено ниже. Нет необходимости изменять все кодоны для получения улучшенной экспрессии, но предпочтительно изменять, по меньшей мере, кодоны, редкие в использовании в организме-хозяине, на кодоны,предпочтительные для организма-хозяина, например на кодоны, более часто используемые в организмехозяине и которые, как правило, более легко транслируются, чем редкие, непредпочтительные кодоны.-5 017638 Высокий уровень экспрессии может быть получен путем изменения более приблизительно 50% непредпочтительных кодонов, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% непредпочтительных кодонов на кодоны, предпочтительные для организма-хозяина. Предпочтительные кодоны большинства клеток-хозяев являются известными (РСТ WO 97/31115; РСТ WO 97/11086; ЕР 646643; ЕР 553494 и патенты US5689052; 5567862; 5567600; 5552299 и 5017 692). Предпочтительные кодоны других клеток-хозяев могут быть установлены с помощью методов, известных из уровня техники. Также,при использовании химического синтеза последовательность молекулы ДНК или ее кодируемый белок могут быть легко изменены, например, для оптимизации экспрессии (например, исключение вторичных структур мРНК, которые препятствуют транскрипции или трансляции), могут быть добавлены уникальные сайты рестрикции в подходящих положениях и могут быть делетированы сайты расщепления протеазами. Модификация и изменения могут быть произведены с сохранением ферментативной активности с полипептидной последовательностью белка, такой как последовательности DMO, представленные в настоящем описании. Дальнейшее представляет собой обсуждение, в основе которого лежит изменение аминокислот белка с созданием эквивалентного или даже улучшенного модифицированного полипептида и соответствующих кодирующих последовательностей. В конкретных воплощениях изобретения последовательности DMO могут быть изменены таким образом и применены в способах по изобретению. Аминокислотные изменения могут быть достигнуты путем изменения кодонов последовательности ДНК. Известно, например, что определенные аминокислоты могут быть заменены на другие аминокислоты в белковой структуре без заметной потери способности интерактивного связывания с такими структурами, как сайты связывания на молекулах субстрата. Благодаря указанной интерактивной способности и природе белка, которая определяет биологическую функциональную активность указанного белка, в белковой последовательности могут быть произведены определенные замены аминокислотных последовательностей, и, конечно, в соответствующей последовательности кодирующей ДНК, и, тем не менее,будет получен белок с подобными свойствами. Таким образом, предполагается, что в описанных в настоящем описании пептидных последовательностях DMO и в соответствующих последовательностях кодирующей ДНК могут быть произведены разнообразные изменения без заметной потери их биологического применения или активности. При осуществлении указанных изменений может учитываться гидропатический индекс аминокислот. Важность гидропатического индекса аминокислот в придании белку интерактивной биологической функции, как правило, понятна из уровня техники (Kyte et al., 1982). Считается, что относительный гидропатический характер аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру получаемого в результате белка, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и с подобными. Каждую аминокислоту оценивали на основе характеристик ее гидрофобности и заряда на предмет гидропатического индекса (Kyte et al., 1982), который составляет: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин(-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5). Из уровня техники известно, что аминокислоты могут быть заменены на другие аминокислоты,имеющие подобный гидропатический индекс или коэффициент, и все равно приводят в результате к получению белка с подобной биологической активностью, т.е. к получению биологически функционального эквивалентного белка. При осуществлении таких изменений является предпочтительной замена аминокислот, чьи гидропатические индексы составляют 2, особенно предпочтительной является замена аминокислот, чьи гидропатические индексы составляют 1, и наиболее предпочтительной является замена аминокислот, чьи гидропатические индексы составляют 0,5. В данном случае наблюдение того, чтоDMO, имеющий замену триптофана в положении 112 на цистеин, обладает биологической активностью и приводит к получению в результате растений, толерантных к высокому уровню дикамбы, оказалось неожиданным, представляя различные гидропатические индексы между нативными и измененными аминокислотами, и таким образом, не использовалось специалистами в данной области для создания функциональных вариантов согласно известному уровню техники. Из уровня техники понятно, что замена подобных аминокислот может быть эффективно осуществлена на основе гидрофильности. Патент US4554101 устанавливает, что наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, на которую влияет гидрофильность его соседних аминокислот, коррелирует с биологическим свойством белка. Как подробно описано в US патенте 4554101, для остатков аминокислот были определены следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,01); глутамат (+3,01); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин(-0,51); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Понятно, что аминокислота может быть заменена на другую аминокислоту, имеющую подобное значение гидрофильности, и все равно будет получен биологически эквивалентный белок. При таких изменениях является предпочтительной за-6 017638 мена аминокислот, чьи значения гидрофильности составляют 2, особенно предпочтительной является замена аминокислот, чьи значения гидрофильности составляют 1 и наиболее предпочтительной является замена аминокислот, чьи значения гидрофильности составляют 0,5. Типичные замены, которые принимают во внимание указанные и другие из вышеупомянутых характеристик, хорошо известны специалисту в данной области из уровня техники и включают аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серин и треонин; глутамин и аспарагин; валин, лейцин и изолейцин. Кроме того, активность DMOc была неожиданной, представляя сильно отличающиеся гидрофильные значения между измененными и нативными аминокислотами, и указанная замена не использовалась специалистами в данной области для создания функциональных вариантов согласно известному уровню техники. Модификация последовательности DMO согласно изобретению может проводиться с рассмотрением консервативных доменов внутри фермента. Например, ниже демонстрируется, что фермент DMO содержит функциональные домены, такие как железосерный кластер Rieske и сайт связывания для свободного железа (см., например, фиг. 18). Таким образом, указанная информация, объединенная со знанием из уровня техники, рассматривающим функциональные домены и модификацию белков, как правило,может использоваться в рамках настоящего изобретения для получения модифицированных ферментовDMO, тем не менее сохраняющих ферментативную активность (см., например, Mason and Cammack,1992; Jiang et al., 1996). 2. Трансформирующие конструкции. Полинуклеотид, кодирующий DMO, применяемый согласно изобретению, обычно вводится в клетку в виде конструкции, включающей элементы контроля экспрессии, необходимые для контроля экспрессии. Методы функционального связывания элементов контроля экспрессии с кодирующими последовательностями хорошо известны из уровня техники (Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989). Последовательности контроля экспрессии представляют собой последовательности ДНК, вовлеченные любым способом в контроль транскрипции. Подходящие последовательности контроля экспрессии и методы их использования хорошо известны из уровня техники. Промотор, в частности, может использоваться вместе или в отсутствие энхансерных элементов, 5'-нетранслируемого участка, транзитного или сигнального пептидов для направления белка или продукта РНК в органеллу растения, в частности в хлоропласты, и 3'-нетранслируемые участки, такие как сайты полиаденилирования. Специалисту в данной области будет известно, что разнообразные энхансеры, промоторы, интроны, транзитные пептиды, последовательности направления сигнала и 5'- и 3'-нетранслируемые участки (UTR) используются в дизайне эффективных векторов для экспрессии в растениях, таких как те, что описаны, например, в патентной заявке US 2003/01403641. Промоторы, подходящие для настоящего и других применений, хорошо известны из уровня техники. Примеры, описывающие такие промоторы, включают патент US6437217 (промотор RS81 маиса),патент US5641876 (промотор актина риса), патент US6426446 (промотор RS324 маиса), патент US6429362 (промотор PR-1 маиса), патент US6232526 (промотор A3 маиса), патент US6177611(конститутивные промоторы маиса), патенты US5322938, 5352605, 5359142 и 5530196 (промотор 35S), патент US6433252 (промотор L3 олеозина маиса), патент US6429357 (промотор актина 2 риса, а также интрон актина 2 риса), патент US5837848 (промотор, специфичный для корня), патентUS6294714 (промоторы, индуцируемые светом), патент US6140078 (промоторы, индуцируемые солью), патент US6252138 (промоторы, индуцируемые патогеном), патент US6175060 (промоторы, индуцируемые дефицитом фосфора), патент US6635806 (промотор гамма-коиксина) и патентную заявку US с серийным 09/757089 (промотор альдолазы хлоропластов маиса). Дополнительные промоторы, которые могут найти свое применение, представляют собой промотор нопалин-синтазы (NOS)(Ebert et al., 1987), промотор октопин-синтазы (OCS) (который переносится на плазмидах, индуцирующих опухоль, из Agrobacterium tumefaciens), промоторы колимовируса, такие как промотор 19S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (Lawton et al., 1987), промотор 35S CaMV (Odell et al., 1985), промотор 35S вируса мозаики норичника (Walker et al., 1987), промотор синтазы сахарозы (Yang et al., 1990), промотор комплекса гена R (Chandler et al., 1989) и промотор гена, кодирующего белок связывания с хлорофиллом а/b, и т.д. Особенно полезными для применения в настоящем изобретении могут быть промоторы CaMV35SAccession V00087; Depicker et al., 1982; Bevan et al., 1983). Может быть получена польза при экспрессии гетерологичных генов с использованием последовательности, кодирующей транзитный пептид. Транзитные пептиды, как правило, относятся к пептидным молекулам, которые при связывании с интересующим белком направляют белок в конкретную ткань,клетку, субклеточную локализацию или клеточную органеллу. Примеры включают, но не ограничены ими, хлоропластные транзитные пептиды, сигналы ядерной локализации и вакуольные сигналы. Хлоропластный транзитный пептид, в частности, применяется в настоящем изобретении для направления экспрессии фермента DMO в хлоропластах. Ожидается, что функция DMO будет облегчена эндогенными-7 017638 редуктазами и ферредоксинами, обнаруженными в растительной клетке, для деградации дикамбы. Хлоропласты растения особенно богаты редуктазами и ферредоксинами. Соответственно в предпочтительном воплощении для получения трансгенных растений, толерантных к дикамбе, может применяться последовательность, кодирующая пептид, которая будет направлять оксигеназу, деградирующую дикамбу,в хлоропласты. Альтернативно или дополнительно, гетерологичная редуктаза и/или ферредоксин также могут экспрессироваться в клетке. ДНК, кодирующая последовательность, направляющую в хлоропласты, может предпочтительно располагаться выше (5') последовательности, кодирующей DMO, но может также располагаться ниже (3') кодирующей последовательности, или одновременно выше и ниже кодирующей последовательности. Хлоропластный транзитный пептид (СТР), в частности, может быть сконструирован для сшивки с Nконцом белков, которые должны быть направлены в хлоропласты растения. Большинство белков с локализацией в хлоропластах экспрессируются из ядерных генов в виде предшественников и направляются в хлоропласты с помощью СТР, который удаляется во время стадий импорта. Примеры хлоропластных белков включают малую субъединицу (RbcS2) рибулоза-1,5-бифосфат карбоксилазы, ферредоксин, оксидоредуктазу ферредоксина, светособирающий комплексный белок I и белок II и тиоредоксин F. Было продемонстрировано in vivo и in vitro, что нехлоропластные белки могут направляться в хлоропласты путем использования белковых сшивок с СТР и что СТР является достаточным для направления белка в хлоропласты. Например, было показано, что введение подходящего транзитного пептида, такого как Arabidopsis thaliana EPSPS СТР (Klee et al., 1987) и Petunia hybrida EPSPSCTP (della-Cioppa et al., 1986), направляет гетерологичные последовательности белка EPSPS в хлоропласты в трансгенных растениях. Другие типичные последовательности для направления в хлоропласты включают сигнальную последовательность cab-m7 маиса (Becker et al., 1992; РСТ WO 97/41228) и сигнальную последовательность глутатион-редуктазы гороха (Creissen et al., 1991; РСТ WO 97/41228). В настоящем изобретении могут быть особенно полезными AtRbcS4 (CTP1; патент US5728925), AtShkGPsRbcS (Coruzzi et al., 1984), например, в отношении экспрессии полипептида DMO. Последовательность 5'-UTR, которая функционирует в качестве лидерной последовательности трансляции, представляет собой генетический элемент ДНК, локализованный между промоторной последовательностью гена и кодирующей последовательностью. Лидерная последовательность трансляции присутствует в полностью процессированной мРНК выше последовательности старта трансляции. Лидерная последовательность трансляции может влиять на процессинг первичного транскрипта в мРНК, на стабильность мРНК или эффективность трансляции. Примеры лидерных последовательностей трансляции включают среди прочих лидеры белка теплового шока маиса и петуньи (патент US5362865), лидеры белка оболочки растительных вирусов, лидеры растительных вирусов rubisco (Turner and Foster,1995). В настоящем изобретении последовательности 5'-UTR, которые, в частности, обнаружили полезное применение, представляют собой GmHsp (патент US5659122), PhDnaK (патент US5362865),AtAnt1, TEV (Carrington and Freed, 1990) и AGRtunos (GenBank Accession V00087; Bevan et al., 1983). 3'-нетранслируемая последовательность, 3'-участок терминации транскрипции или участок полиаденилирования относятся к молекулам ДНК, связанным с кодирующим участком и локализованным ниже кодирующего участка гена, и включают полинуклеотиды, которые обеспечивают сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, способные влиять на транскрипцию, процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования функционирует в растениях с целью вызвать вставку полиаденилатных последовательностей к 3'-концу предшественника мРНК. Последовательность полиаденилирования может быть выделена из природного гена, из множества растительных генов или из генов Т-ДНК. Примером 3'-участка терминации транскрипции является 3'-участок нопалин-синтазы (nos 3';Fraley et al., 1983). Использование различных нетранслируемых 3'-участков было описано (Ingelbrecht etal., 1989). Молекулы полиаденилирования из гена RbcS2 Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al., 1984) и AGRtu.nos (Rojiyaa et al., 1987, Genbank Accession E01312) могут иметь конкретное полезное применение в изобретении. Единица экспрессии молекулы полинуклеотида, кодирующего DMO, может быть связана со второй полинуклеотидной молекулой в единице экспрессии, содержащей генетические элементы для способного к детекции/количественному определению маркера или для гена, придающего желаемое свойство. Обычно используемые гены для скрининга предположительно трансформированных клеток включают глюкуронидазу (GUS), -галактозидазу, люциферазу и хлорамфеникол ацетилтрасферазу (Jefferson, 1987;Teeri et al., 1989; Koncz et al., 1987; De Block et al., 1984), зеленый флуоресцентный белок (GFP) (Chalfieet al., 1994; Haseloff et al., 1995 и РСТ заявка WO 97/41228). Вторая полинуклеотидная молекула может включать, но не ограничена им, ген, который действует в качестве маркера селекции. Второй или дополнительный ген может обеспечивать желаемую характеристику, ассоциированную с растительной морфологией, физиологией, ростом и развитием, урожаем,усилением питания, устойчивостью к заболеваниям или вредителям либо толерантностью к окружающей среде или к химическим веществам, и может включать генетические элементы, включающие устойчи-8 017638 вость к гербицидам (патенты US6803501; 6448476; 6248876; 6225114; 6107549; 5866775; 5804425; 5633435; 5463175), увеличивающие урожай (патенты USRE38446; 6716474; 6663906; 6476295; 6441277; 6423828; 6399330; 6372211; 6235971; 6222098; 5716837), элементы контроля насекомых (патенты US6809078; 6713063; 6686452; 6657046; 6645497; 6642030; 6639054; 6620988; 6468523; 6326351; 6313378; 6284949; 6281016; 6248536; 6242241; 6221649; 6177615; 6156573; 6153814; 6110464; 6093695; 5959091; 5942664; 5942658, 5880275; 5763245; 5763241), элементы устойчивости к грибковым заболеваниям (патенты US6653280; 6573361; 6506962; 6316407; 6215048; 5516671; 5773696; 6121436; 6316407; 6506962), элементы устойчивости к вирусам (патенты US6617496; 6608241; 6015940; 6013864; 5850023; 5304730), элементы устойчивости к нематодам (патент US6228992), элементы устойчивости к бактериальным заболеваниям (патент US5516671), элементы роста и развития растения(патенты US6723897; 6518488), элементы для получения крахмала (патенты US6538181; 6538179; 6538178; 5750876; 6476295), элементы для получения модифицированных масел (патенты US6444876; 6426447; 6380462), элементы для получения продуктов с высоким содержанием масла (патенты US6495739; 5608149; 6483008; 6476295), элементы содержания модифицированных жирных кислот (патенты US6828475; 6822141; 6770465; 6706950; 6660849; 6596538; 6589767; 6537750; 6489461; 6459018), элементы для получения продуктов с высоким содержанием белка (патент US6380466), элементы для созревания плодов (патент US5512466), элементы для усиления питания животных и человека (патенты US6723837; 6653530; 6541259; 5985605; 6171640), элементы для биополимеров (патенты USRE37543; 6228623; 5958745 и US патентная публикацияUS20030028917), элементы для устойчивости к стрессу окружающей среды (патент US6072103), элементы для лекарственных пептидов и секретируемых пептидов (патенты US6812379; 6774283; 6140075; 6080560), элементы для улучшения свойств процессинга (патент US6476295), элементы для улучшения гидролизуемости (патент US6531648), элементы для низкого содержания рафинозы (патент US6166292), элементы для промышленного получения фермента (патент US5543576), элементы для улучшения вкуса (патент US6011199), элементы для фиксации азота (патент US5229114), элементы для получения гибридных семян (патент US5689041), элементы для получения волокна (патент US6576818; 6271443; 5981834; 5869720) и элементы для получения биотоплива (патент US5998700). Любые из указанных и другие генетические элементы, методы и трансгены могут использоваться в изобретении, а также приниматься во внимание специалистами в данной области с точки зрения настоящего описания. Единица экспрессии может быть представлена в виде Т-ДНК между участками правой границы (RB) и левой границы (LB) первой плазмиды вместе со второй плазмидой, несущей трансферные и интеграционные функции для Т-ДНК в Agrobacterium. Конструкции также могут содержать остов плазмидных ДНК сегментов, которые обеспечивают репликативную функцию и селекцию с помощью антибиотика в бактериальных клетках, например точку начала репликации из Escherichia coli, такую какori322, точку начала репликации для широкого предела организмов-хозяев, такую как oriV или oriRi, и кодирующий участок для маркера селекции, такого как Spec/Strp, который кодирует Tn7 аминогликозид аденилтрансферазу (aadA), придающую устойчивость к спектиномицину или стрептомицину, или ген маркера селекции гентамицина (Gm, Gent). Для трансформации растений штамм бактерий-хозяев часто представляет собой Agrobacterium tumefaciens ABI, C58 или LBA4404. Однако другие штаммы, известные специалисту в данной области трансформации растений, могут функционировать в настоящем изобретении. 3. Получение трансгенных клеток. Получения трансформированных растительных клеток можно достичь с помощью любого из методов, известных из уровня техники для введения трансгенов в клетки (см., например, публикацию Miki etal., 1993). Полагают, что примеры таких методов практически включают любой метод, с помощью которого ДНК может быть введена в клетку. Методы, которые были описаны, включают электропорацию,как иллюстрируется в патенте US5384253; бомбардировку микрочастицами, как иллюстрируется в патентах US5015580; 5550318; 5538880; 6160208; 6399861 и 6403865; трансформацию, опосредованную Agrobacterium, как иллюстрируется в патентах US5635055; 5824877; 5591616; 5981840 и 6384301; и трансформацию протопластов, как иллюстрируется в патенте US5508184. Посредством применения методов, таких как указанные, клетки практически любого вида растения могут быть стабильно трансформированы и селектированы согласно изобретению, и указанные клетки развиваются в трансгенные растения. Наиболее широко применяемый метод введения экспрессирующего вектора в растения основан на природной системе трансформации из Agrobacterium (например, Horsch et al., 1985). A. tumefaciens и A.rhizogenes представляют собой патогенные почвенные бактерии, которые генетически трансформируют растения. Плазмиды Ti и Ri из A. tumefaciens и A. rhizogenes соответственно несут гены, ответственные за генетическую трансформацию (например, Kado, 1991). Описания векторных систем Agrobacterium и методов для переноса гена, опосредованного Agrobacterium, представлены в многочисленных ссылках,которые включают Miki et al. выше, Moloney et al., 1989 и патенты US4940838 и 5464763. Другие бактерии, такие как Sinorhizobium, Rhizobium и Mesorhizobium, которые в природе взаимодействуют с-9 017638 растениями, могут быть модифицированы для опосредования переноса гена во множество различных растений. Указанные ассоциированные с растениями симбиотические бактерии могут быть сделаны компетентными для переноса гена путем поглощения обоих - обезвреженной Ti-плазмиды и подходящего бинарного вектора (Brothers et al., 2005). В. Культура клеток тканей и регенерация растения. Получения регенерирующейся и трансформированной клетки в фертильном растении можно достичь путем первого культивирования эксплантата на ростовой среде и впоследствии на корневой среде. Иногда эксплантат может культивироваться на каллюсной среде перед переносом на ростовую среду. Множество сред и необходимых условий переноса могут быть реализованы и оптимизированы для каждой растительной системы для трансформации растения и получения трансгенных растений. Следовательно, такие условия среды и культивирования могут быть модифицированы или заменены эквивалентными компонентами питания или подобными способами селекции и получения случаев трансгенных растений. Питательную среду готовят в виде жидкости, но указанная жидкость может стать твердой путем добавления жидкости к веществам, способным обеспечивать твердую подложку. Агар является самым обычным веществом, используемым для этой цели. Бактоагар, Hazelton агар, Gelrite и Gelgro представляют собой определенные типы твердой подложки, которые являются подходящими для роста растительных клеток в культуре клеток тканей. Некоторые типы клеток будут расти и делиться или в жидкой суспензии, или на твердой среде, или в обоих типах сред. Реципиентные клетки-мишени включают, но не ограничены ими, клетки меристемы, каллюс, незрелые зародыши и гаметические клетки, такие как клетки пыльцы микроспор, спермий и яйцеклетки. Любая клетка, из которой может быть регенерировано фертильное трансгенное растение, может быть использована в определенных воплощениях. Например, незрелые зародыши могут быть трансформированы с последующей селекцией и инициированием каллюса и последующей регенерацией фертильных трансгенных растений. Непосредственная трансформация незрелых эмбрионов избегает необходимости длительной разработки реципиентных клеточных культур. Меристематические клетки (то есть растительные клетки, способные к продолжительному клеточному делению и характеризующиеся недифференцированным цитологическим проявлением, обычно обнаруживают в растущих точках или тканях в растении, таких как концы корней, верхушки ствола, боковые ростки и т.д.), также могут быть использованы в качестве реципиентной растительной клетки. Из-за их недифференцированного роста и способности к дифференцировке в орган и тотипотентности цельное трансформированное растение может быть получено из единственной трансформированной меристематической клетки. Соматические клетки представляют собой клетки множества типов. Эмбриогенные клетки представляют собой один из примеров соматических клеток, которые могут быть индуцированы к регенерации растения посредством образования зародыша. Неэмбриогенные клетки представляют собой такие клетки, которые обычно не реагируют таким образом. Могут использоваться определенные методы, которые обогащают реципиентные клетки внутри популяции клеток. Например, развитие каллюса типа II с последующей ручной селекцией и культивированием хрупкой эмбриогенной ткани, как правило, приводит в результате к обогащению реципиентных клеток для использования в них, например, трансформации с помощью бомбардировки микрочастиц. В определенных воплощениях реципиентные клетки селектируются после роста в культуре. Культивированные клетки могут быть выращены или на твердых подложках, или в форме жидких суспензий. В каждом случае клетки могут быть обеспечены питательными веществами в форме среды и контролируемых условий окружающей среды. Для культур клеток тканей существует много типов сред, состоящих из аминокислот, солей, сахаров, ростовых регуляторов и витаминов. Большинство из применяемых в практике изобретения сред будет содержать некоторые подобные компоненты, в то время как среды могут отличаться в составе и пропорциях ингредиентов согласно известным практическим применениям культур клеток тканей. Например, различные типы клеток обычно растут в более чем одном типе среды, но демонстрируют различные скорости роста и различные морфологические черты в зависимости от ростовой среды. В некоторых средах клетки выживают, но не делятся. Состав среды также часто оптимизируется на основе выбранных видов или типов клеток. Ранее было описано множество типов сред, подходящих для культур растительных клеток. Примеры указанных сред включают, но не ограничены ими, среду N6, описанную в публикации Chu et al.(1975), и среду MS (MurashigeSkoog, 1962). В некоторых воплощениях может быть предпочтительным использование среды с немного меньшим соотношением аммоний/азот, такой как N6, для стимулирования генерации реципиентных клеток путем поддержания клеток в проэмбриональном состоянии способными к продолжительным делениям. Также может использоваться растительная среда Woody (WPM)(Lloyd and McCown, 1981). Метод поддержания клеточных культур может вносить вклад в их применение в качестве источников реципиентных клеток для трансформации. Ручная селекция клеток для переноса в свежую культуральную среду, частота переноса в свежую культуральную среду, состав культуральной среды и факторы окружающей среды, включающие, но не ограниченные ими, качество и количество света и температуру,- 10017638 представляют собой все факторы для поддержания каллюса и/или суспензионных культур, которые применяются в качестве источников реципиентных клеток. Попеременное использование каллюса среди различных культуральных условий может быть полезным в обогащении реципиентных клеток в культуре. Например, клетки могут культивироваться в суспензионной культуре, но переносятся на твердую среду с регулярными интервалами. После периода роста на твердой среде клетки могут быть вручную селектированы для возвращения в жидкую культуральную среду. Повторение указанной последовательности переносов в свежую культуральную среду можно использовать для обогащения культуры реципиентными клетками. Пропускание клеточных культур через фильтр 1,9 мм также можно применять для поддержания рыхлости каллюса или суспензионной культуры и для обогащения клетками, способными к трансформации, когда используют такие типы клеток. С. Трансгенные растения. После селекции трансгенной клетки клетка может регенерироваться в фертильное трансгенное растение с использованием методов, хорошо известных из уровня техники. Трансформированные растения могут быть впоследствии подвергнуты анализу для определения присутствия или отсутствия конкретной интересующей нуклеиновой кислоты в конструкции ДНК. Молекулярный анализ может включать, но не ограничен ими, блоты по Саузерну (Southern, 1975) или ПЦР-анализы, иммунодиагностические методы. Полевые оценки также можно использовать. Указанные и другие хорошо известные методы могут быть осуществлены для подтверждения стабильности трансформированных растений, полученных описанными методами. Указанные методы хорошо известны специалисту в данной области (Sambrook et al., 1989). Таким образом, могут быть получены представленные в настоящем описании трансгенные растения, включающие последовательность, кодирующую DMO. В частности, экономически важные растения, включающие сельскохозяйственные культуры, деревья и другие растения, могут быть трансформированы с помощью конструкций ДНК по настоящему изобретению так, чтобы они были толерантны к дикамбе или имели повышенную толерантность. Растения, которые в настоящее время считаются толерантными к ауксинподобным гербицидам, таким образом, могут быть трансформированы для повышения их толерантности к гербициду. Некоторые неограничивающие примеры растений, которые могут найти применение по изобретению, включают люцерну, ячмень, бобы, свеклу, брокколи, капусту, морковь, канолу, цветную капусту, сельдерей, китайскую капусту, зерно, хлопок, огурец, баклажан, лукпорей, салат, дыню, овсяное зерно, лук, горох, перец, арахис, картофель, тыкву, редьку, рис, сахарную кукурузу, сорго, сою, шпинат, сквош, сахарную свеклу, подсолнечник, помидор, арбуз и пшеницу. Как только получено трансгенное растение, содержащее трансген, указанный трансген может быть введен в любое растение, совместимое по полу с первым растением, путем скрещивания без необходимости когда-либо непосредственно трансформировать второе растение. Таким образом, при использовании в настоящем описании, термин "потомство" обозначает продукт любой генерации родительского растения, полученного согласно настоящему изобретению, где потомство включает выбранную конструкцию ДНК, полученную согласно изобретению. "Трансгенное растение", таким образом, может представлять собой растение любой генерации. "Скрещивание" растения для получения линии растения,имеющего один или более добавленных трансгенов или аллелей по отношению к стартовой линии растения, как описано в настоящем описании, определяется как методы, которые приводят в результате к введению конкретной последовательности в линию растения путем скрещивания стартовой линии с донорной линией растений, которая включает трансген или аллель по изобретению. Для достижения указанного специалист может, например, осуществить следующие стадии: (а) семена растения первого родительского растения (стартовой линии) и второго родительского растения (линии донорного растения, которая включает желаемый трансген или аллель); (b) вырастить семена первого и второго родительских растений до состояния цветущих растений; (с) опылить цветок из первого родительского растения с помощью пыльцы из второго родительского растения и (d) собрать семена, полученные на первом растении, несущем фертилизованный цветок. В изобретении также предлагаются ткани трансгенного растения, включающие предложенную в настоящем описании нуклеиновую кислоту, кодирующую DMO. Ткани могут быть непосредственно трансформированы с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей DMO, или могут наследовать нуклеиновую кислоту от клетки-предшественника. Ткани, предложенные в изобретении, в частности, включают, но не ограничены ими, клетки, зародыши, незрелые зародыши, меристематические клетки, незрелые кисточки, микроспоры, пыльцу, листья, пыльники, корни, концы корней, цветы и семена. Таким образом, в изобретении предлагаются любые такие ткани, включающие любую часть растения, включающего описанную в настоящем описании нуклеиновую кислоту. В частности, семена находят конкретное полезное применение одновременно для коммерческих или пищевых применений в форме зерна, а также на плантациях для выращивания дополнительных сельскохозяйственных культур. Примеры Следующие примеры включены для иллюстрации воплощений изобретения. Специалисту в данной области следует принять во внимание, что методы, описанные в примерах, которые следуют описанным методам, разработаны заявителем для приемлемого практического функционирования изобретения. Однако специалисту в данной области в свете настоящего изобретения следует принять во внимание, что- 11017638 могут быть произведены многие изменения в определенных воплощениях, указанные изменения описаны и приводят к получению подобного или похожего результата, не выходя за рамки концепции, сущности и границ изобретения. Более конкретно, очевидно, что определенные агенты, которые связаны одновременно химически и физиологически, могут быть заменены описанными в настоящем описании агентами, тогда как при этом будут достигнуты такие же или подобные результаты. Считается, что все такие подобные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области, будут находиться в рамках сущности, границ и концепции изобретения, как определено в прилагающейся формуле изобретения. Пример 1. Векторная конструкция для полученного с помощью генетической инженерии генаDMO. Последовательность, кодирующая вариант DMOc, исходно была получена с помощью ПЦРамплификации из матрицы DMOw. В указанном процессе амплификации участок, кодирующий DMOw,амплифицировали из плазмиды pPLH1, которая содержала ген DMOw в виде 3,5-т.п.о. фрагмента XhoI/Sst I ДНК из P. maltophilia, штамм DI-6. Для ДНК-амплификации применяли 5'-праймер, с помощью которого вставляли сайт рестрикции Nco I около 5'-конца ПЦР-продукта и кодон для аланина, следом за инициирующим кодоном ATG, и применяли 3'-праймер, который создает сайт рестрикции Xba I на 3'конце ПЦР-продукта (детали процедуры представлены ниже). Замену 112W на 112 С впоследствии идентифицировали с помощью секвенирования нуклеиновой кислоты. Для создания вектора, трансформирующего растения, кодирующий участок гена DMOc вставляли с использованием сайтов Nco I и Xba I, добавленных к 5'- и 3'-концам соответственно в вектор pRTL2 (Carrington and Freed, 1990), посредством чего сшивая кодирующий участок с векторным энхансерным элементом трансляции (TEV-лидер) из вируса гравировки табака. 5'-сайт Nco I вводили вместе с добавлением GCC-кодона (аланин) следом за старт-кодоном ATG и создавали сайт рестрикции Xba I на 3'-конце участка кодона с использованием специально созданных ПЦР-праймеров. Чтобы дать возможность доставки DMOc в хлоропласты, участок, кодирующий хлоропластный транзитный пептид, из субъединицы гена Rubisco гороха (Coruzzi et al., 1983) помещали выше участка, кодирующего DMO, чтобы дать возможность направления белка в хлоропласты. Последовательность, кодирующая транзитный пептид, которую несет в себе фрагмент Bgl II и EcoR I, клонировали по сайтам BamH I и EcoR I вектора pBluescriptII KS+. Полученную конструкцию использовали в качестве матрицы в ПЦР-реакции, с помощью которой вставляли сайт Nco I с обоих концов, 3' и 5', последовательности транзитного пептида. Амплифицированный продукт клонировали по сайту Nco I вектора pRLT2 так, чтобы последовательность транзитного пептида располагалась непосредственно перед кодирующей последовательностью и в рамке с кодирующей последовательностью гена DMO. Кассету, состоящую из TEV-лидера, участка транзитного пептида и последовательностей ДНК, кодирующих DMO, вырезали из вектора pRTL2 по сайтам Xho I и Xba I, и клонировали в вектор pKLP36 (US 5850019; фиг. 5) с использованием тех же сайтов рестрикции для связывания кассеты с PClSV-промотором и поли-А-последовательностью PsRbcS2-E9. Новый вектор обозначали как pKLP3 6-TEV-TP-DMOc (также обозначенный как pKLP36-DMOc), депонировали в Американскую Типированную Коллекцию Клеточных Культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas,Va. 20110-2209 USA от 2.02.2006 и присвоили уникальный номер АТСС AccessionРТА-7357. Вектор pKLP36-DMOc использовали для трансформации растений табака, Arabidopsis и томата. Для трансформации сои DMOc-кассету вырезали из pKLP3 6-TEV-TP-DMOc в виде сегмента EcoR I/Acc I и клонировали в гидролизованный pPZP101 по EcoR I/Acc I (Hajdukiewicz et al., 1994) для получения правой и левой границ. Указанный вектор (кассета pPZP101+DMOc) затем резали с помощью ScaI и DMOcкассету клонировали в бинарный вектор pPTN200 (см. ниже), производное pPZP201 (Hajdukiewicz et al.,1994), который содержит ограничительную кассету, фланкированную левой и правой границами Т-ДНК,и дает возможность селекции регенерирующих трансформантов в присутствии гербицида Баста. Новый бинарный вектор с двумя Т-ДНК обозначили pPTN348 и использовали для трансформации сои. ВекторpPTN200 получали сперва с помощью клонирования элемента nos промотор-bar из pGPTV-bar (Becker etal., 1992) в виде сегмента PstI/BamHI в pPZP201 (см. Hajdukiewicz et al., 1994), и полученную в результате плазмиду назвали pPTN193. nos-терминатор из pE7113-GUS (см. Mitsuhara et al., 1996) клонировали вpPTN193 ниже элемента nos промотор-bar для получения bar-кассеты. Ферменты рестрикции и другие ферменты получали или на фирме Fermentas, или на Invitrogen.DIG-11-dUTP (меченный с помощью щелочного металла), CSPD (готовый к использованию), DIG III маркеры молекулярного веса, антидигоксигенин-АР (Fab-фрагменты) и блокирующий реагент были получены из Roche. Раствор предгибридизации, ULTRAhyb, был получен из Ambion. DIG-РНК маркер молекулярного веса I был получен из Roche. Антикроличьи IgG, антитело, связанное с пероксидазой (ослиное) и мембрана Hybond ECL (нитроцеллюлоза) были получены из Amersham Biosciences. ДНК, РНК и белковые блоты, методы рекомбинантной ДНК и другие процедуры молекулярной биологии проводили с использованием стандартных методов (Ausubel et al., 1995). Пример 2. Получение и анализ трансгенных растений. Табак, томат, сою и Arabidopsis использовали для трансгенной экспрессии полученного с помощью генетической инженерии гена DMOc и для подтверждения толерантности к дикамбе в растениях, экспрессирующих ген. Последовательность, кодирующая DMOc, в бинарном векторе pKLP36 вводили в А.tumefaciens штамм С 58 С 1, содержащий обезвреженную Ti-плазмиду рМР 90 (Koncz and Schell, 1986) с помощью триплоидного родительского скрещивания (Ditta, 1980). Полученные в результате трансконъюгаты использовали для трансформации табака (cv Xanthi) и томата (cv Rutgers) с использованием протокола для листового диска, описанного в публикации Horsch et al. (Horsch, 1985). Arabidopsis thaliana трансформировали с помощью метода цветковой жидкости (Clough and Bent, 1998). Трансформацию видов сои Thorne и NE-3001 проводили с помощью системы трансформации, опосредованной семядольным узлом Agrobacterium (Zhang et al., 1999). С помощью опосредованного Agrobacterium переноса гена DMOc в ядерный геном растений табака получали несколько независимо выделенных генераций T1 растений. Растения тестировали на присутствие и экспрессию гена DMOc с использованием анализов с помощью ДНК, РНК и белковых блотов. Фиг. 2 иллюстрирует, что хотя все трансгенные растения (дорожки 1-6) в указанном анализе содержали одни и те же фрагменты ДНК после гидролиза ферментами рестрикции в виде клонированного гена DMO (дорожка 8), уровень транскриптов мРНК и белка DMO существенно варьировался среди трансформантов. Например, растение, чьи экстракты изображены в дорожке 5, показали относительно высокий уровеньDMO мРНК, но при этом очень низкий уровень фермента. Наоборот, почти одинаковый уровень DMO мРНК в экстрактах, показанный в дорожке 3, сочетался с высоким уровнем экспрессии DMO. Однако было показано, что случаи сильной экспрессии равным образом могли быть получены с помощью указанного метода. Растения в теплице опрыскивали растворителем и дикамбой коммерческого класса (Clarity; BASF) с использованием трекового распылителя с сжатым воздухом, с механическим приводом, вентиляторным отделением 8002 Е, перемещением сопла со скоростью 1,87 миль/ч. Добавки включают: 28% мочевину,нитрат аммония 1,25% об./об. и неионное поверхностно-активное вещество 1,0% об./об. Применяли раствор, содержащий дикамбу в различных концентрациях 182 л/га (40 галлонов на акр). Плантации полей сои опрыскивали с помощью гербицида Clarity в количестве 2,8 кг/га (2,5 фунт/акр). Растения табака, подобно большинству двудольных растений, достаточно чувствительны к обработке с помощью дикамбы. Указанное свойство было проиллюстрировано с помощью сравнения нетрансгенных растений табака - необработанных или обработанных с помощью повышенного количества дикамбы. Симптомы повреждения гербицида легко детектировали после опрыскивания с помощью дикамбы в количестве на уровне 0,017 кг/га. Симптомы были достаточно серьезными при количествах 0,28 и 0,56 кг/га, которые представляют собой уровни гербицида, обычно используемые для контроля сорняков при применении в сельском хозяйстве. Послевсходовая обработка трансгенных растений табака, содержащих DMOc, гербицидом в количестве 5,6 кг/га (в 10-20 раз выше обычных доз) вызывала слабые симптомы повреждения, если они были, в то время как нетрансгенное растение получало серьезное повреждение. Уменьшение повреждения нижних листьев трансгенных растений может быть удвоено при опрыскивании растений с помощью раствора растворителя, содержащего поверхностно-активное вещество, используемое в качестве носителя при применении дикамбы. Листья, полученные после обработки трансгенных растений с помощью дикамбы, демонстрировали отсутствие видимых признаков повреждения. Трансгенные растения томата,несущие полученный с помощью генетической инженерии ген DMOc, также показывали отсутствие повреждения при опрыскивании раствором с высоким уровнем дикамбы, в указанном конкретном случае составляющим сначала 0,56 кг/га и впоследствии 5,6 кг/га. Arabidopsis thaliana, экспрессирующие генDMOc, также проявляли сильную толерантность к обработке дикамбы. В настоящем исследовании предлагается применять концентрацию дикамбы с дозой 1,12 кг/га. Неожиданным открытием оказалось наблюдение того, что растения табака, трансформированные геном DMOc, лишенным участка, кодирующего транзитный пептид, также являются толерантными к послевсходовым обработкам с помощью дикамбы в концентрациях, которые в среднем были только чуть ниже концентраций, которыми обрабатывали растения, несущие гены DMOc с участками, кодирующими транзитный пептид. В настоящем исследовании проводили сравнение обработок дикамбой двух растений табака генерации T1 с использованием количества дикамбы 2,2 кг/га, одно растение несет ген DMOc, лишенный хлоропластного транзитного пептида, и другое полностью лишено гена DMOc благодаря генетической сегрегации. Последнее растение обладало абсолютной чувствительностью к повреждению, вызванному обработкой с помощью дикамбы, и погибало в результате обработки (фиг. 3). Трансгенное растение, несущее ген DMOc, лишенный транзитного пептида, обладало абсолютной толерантностью к обработке с помощью дикамбы в количестве 2,2 кг/га. Генетические исследования наследования гена DMOc в трансгенных растениях табака также демонстрировали, что указанное свойство в виде присутствия гена DMOc наследовалось в большинстве растений согласно обычному правилу Менделя, и поддерживался исходный уровень экспрессии в отношении толерантности к гербициду. Для сои было получено более 50 R0 случаев трансгенной сои и собраны генерации семян - T1, Т 2 и Т 3. Поскольку использовали систему бинарного вектора Agrobacterium tumefaciens, были получены оба трансгенных растения - несущие ген маркера и свободные от маркера трансгенные растения, содержащие ген DMOc. В каждом случае большинство линий трансгенной сои показывало существенную толерантность к обработке с помощью дикамбы в количествах 2,8 и 5,6 кг/га в условиях теплицы и растения пока- 13017638 зывали сильную толерантность к дикамбе в количестве 2,8 кг/га (наибольший тестируемый уровень) в течение двух лет полевых испытаний. Полученные результаты предполагают широкий предел безопасности для трансгенной сои и других сельскохозяйственных культур, несущих ген DMOc, совместно с высокоэффективным контролем широкого спектра широколистных сорняков. Высокий уровень устойчивости к дикамбе в трансгенных растениях сои, несущих ген DMO, указывает на способность применения дикамбы на соевых полях с целью сильного подавления конкурирующего роста широколистных сорняков без сопутствующего повреждения сельскохозяйственной культуры. Кроме того, сельскохозяйственные культуры, устойчивые к дикамбе, могут быть важным дополнением к существующим в настоящее время способам контроля сорняков с применением трансгенных толерантных к гербициду сельскохозяйственных культур. То есть они могут представлять собой ценный вклад в стратегии контроля существующих в настоящее время устойчивых к гербицидам сорняков и в стратегии подавления появления дополнительных устойчивых к гербицидам сорняков, которые, в конечном счете,могут угрожать продолжительному применению и стоимости существующих в настоящее время гербицидов и устойчивых к гербицидам сельскохозяйственных культур. Пример 3. Сверхэкспрессия, очистка и сравнение DMOw и DMOc. Ферментативные свойства. А. Клонирование и сверхэкспрессия. Последовательности, кодирующие белок DMO дикого типа (DMOw) и вариант (DMOc), клонировали из плазмид pMON95900DMO (DMOw) и pMON58499DMO (DMOc) в вектор pET28b (Novagen, SanDiego, CA) и трансформировали в клетки Escherichia coli BL21 (Novagen, San Diego, CA). Клетки растили в 1 л среды Luria-Bertani при 37 С до поглощения 0,4-0,6 при 600 нм. Экспрессию белка индуцировали с помощью добавления 50 мкМ Fe(NH4)SO4, 100 мкМ Na2S и 1 мМ изопропил-бета-тиогалактопиранозида(IPTG) и клетки переводили на температуру 15 С. После инкубации в течение 48-72 ч при 15 С клетки собирали с помощью центрифугирования при 10000g в течение 20 мин. Для дальнейшего использования клетки сохраняли при температуре 20 С. Выход экспрессии белка в Е. coli для DMOw и DMOc был различным. В то время как выход DMOw составлял приблизительно 100-150 мг очищенного белка на 1 л среды LB, выход DMOc оказался в 10 раз ниже или приблизительно 10-15 мг очищенного белка на 1 л. Полученный результат не был предсказан,поскольку Е. coli не имеет редких кодонов для цистеина и существует только один кодон для триптофана, но гетерологичная способность получения белков в Е. coli была показана в обоих случаях независимо от выхода. Количество белка в телах включения было низким в обоих случаях, что предполагает присутствие белка главным образом в растворимой фракции. Рекомбинантный белок DMOw, содержащий His-фрагмент, из Pseudomonas maltophilia, штамма DI6, и рекомбинантный белок DMOc, содержащий His-фрагмент, экспрессированный в Е. coli штаммаBL21, были очищены до гомогенного состояния с помощью колоночной хроматографии Ni-NTA. Клетки суспендировали в лизирующем буфере (100 мМ NaPi pH 8,0, 300 мМ NaCl и 10 мМ имидазол) и разрушали с помощью ультразвука. Клеточный лизат центрифугировали при 55000g в течение 1 ч. Супернатант загружали в колонку Ni-NTA, которую промывали с помощью промывающего буфера (100 мМ NaPipH 8,0, 300 мМ NaCl и 20 мМ имидазол) для удаления белков, которые неспецифично присоединялись к смоле. Белок, содержащий His-фрагмент, элюировали с помощью элюирующего буфера (100 мМ NaPipH 8,0, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазол). Для очистки белка DMOw было достаточно ступенчатого градиента для получения фермента со степенью чистоты 95%, в то время как для DMOc был необходим линейный градиент концентрации имидазола от 20 до 250 мМ для достижения такого же уровня степени чистоты. Фермент, который элюировали из колонки, обладал степенью чистоты, составляющей приблизительно 95%, по оценкам с помощью белковых блотов (вестерн-блотов) фермента после фракционирования по размеру с помощью SDS-полиакриламидного гель-электрофореза. Единственная основная полоса, мигрирующая на уровне, соответствующем белку с молекулярной массой 40 кДа (37,3 кДа фермента DMO плюс 3 кДа His-фрагмента), указывала на сверхпродукцию корректного белка. В. Анализы для DMOc и DMOw и стационарная кинетика. Концентрации белка определяли с помощью анализа по Бредфорду, используя в качестве стандарта кроличий IgG. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали с помощью кумасси-синего. Активность DMO измеряли следующим образом: с помощью образования DCSA, которую разделяли с помощью ВЭЖХ (Waters Corporation, Milford, MA) с использованием колонки Discovery С 18 (Supelco,Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Время удерживания для DCSA составляло 8 мин и для дикамбы - 9,5 мин. Для исследований кинетики DCSA детектировали и оценивали количественно с помощью флуоресцентного испускания при 420 нм (длина волны возбуждения 310 нм) после разделения на колонке ВЭЖХ из реакционной смеси. Набор концентраций DCSA (12 и 24 мкМ) использовали в качестве стандартов количественной оценки. Использовали маточный раствор дикамбы (100, 200, 400, 800, 1000, 2000, 5000 и 10000 мкМ), 0,1 МKPi рН 7,2, 0,1 М FeSO4, 0,1 М NADH и 1 М MgCl2. Анализы осуществляли при 30 С в течение 20 мин и реакцию останавливали путем добавления 40 мкл H2SO4. Для измерений активности DMO объединяли с- 14017638 избытком очищенных ферредоксина и редуктазы из P. maltophilia штамма DI-6. Так как анализ измерения активности DMO представлял собой дискретный анализ, было важно установить время, в течение которого следует проводить анализ для того, чтобы получить значимые кинетические параметры. Поэтому анализ следовало проводить при исходных условиях, пока количество получаемой DCSA оставалось линейным в течение времени проведения анализа (фиг. 4). На основе результатов предположили, что анализ может быть проведен в интервале времени от 20 до 30 мин, и все это время сохранять линейность. На фиг. 5 показано, что оптимальное значение рН для осуществляемого анализа в присутствии буфера 0,1 М KPi составило 7,2, и было обнаружено, что оптимальное значение температуры составляло приблизительно 37 С (фиг. 6).C. Анализ кинетических данных. Параметры Михаэлиса-Ментена определяли путем подбора данных для нелинейного уравнения стационарного состояния (уравнение 1). Данные анализировали с использованием сигма-графика 8.0Vo=Vmax[S]/(Km+[S]). Оптимальные значения рН и температуры также определяли для DMOw и DMOc. Оптимальное значение рН измеряли при 30 С в течение 20 мин и определение оптимального значения температуры измеряли также в течение 20 мин при рН 7,2 для обеих форм фермента. Результаты суммированы на фиг. 7-9 и обсуждаются ниже. Исследования показали, что DMOw и DMOc отличаются по кинетическим свойствам. Например,параметры Михаэлиса-Ментена, рассчитанные для DMOw и DMOc, составляли для DMOw, Km=497 мкМ и Vmax=63324 нмоль/мин/мг, и для DMOc, Km=20,55 мкМ и Vmax=67637 нмоль/мин/мг. Полученные результаты показаны на фиг. 10 и 11 и суммированы в табл. 1 ниже. Кроме того, с помощью двух дополнительных анализов для DMOw и DMOc получали подобные результаты (табл. 2 и 3). Как можно заметить, в проявлении каталитических эффективностей ферменты DMOw и DMOc обладают различными свойствами: согласно указанному анализу DMOc представляет собой фермент в пять раз лучший, чем DMOw. Профиль рН для DMOc отличается от профиля рН DMOw. Во-первых, повидимому, DMOc является чувствительным к используемым буферным системам (TRIS против KPi) по сравнению с DMOw (фиг. 9, 12 и 13). Во-вторых, DMOc демонстрирует устойчивую активность в широком пределе рН при проведении анализа в буфере KPi по сравнению с буфером TRIS, когда активностьDMOc уменьшается с увеличением единиц рН. Температурные профили для DMOc, инкубированного в буфере KPi или в буфере TRIS, являются подобными. При взгляде на температурные профили для указанных двух форм фермента можно заметить, чтоDMOw функционирует лучше при 37 С, тогда как DMOc функционирует лучше при чуть меньших температурах (фиг. 9). На фиг. 9 указана более низкая оптимальная температура для DMOc, который может рано применяться в трансгенных растениях в сезон роста. Таблица 1 Кинетические параметры стационарного состояния для DMOw и DMOc Пример 4. Анализ консервативных участков DMO с использованием биоинформатики. Анализ с использованием биоинформатики проводили для сравнения полипептидной последовательности DMO с другими железосерными оксигеназами и для идентификации консервативных участков. Исходно, для анализа выбирали 78 последовательностей на основе е-величины отсекания 1 е-08 и 70% перекрывания с последовательностью DMO при сравнении последовательности. Дальнейший анализ этих 78 последовательностей обнаружил присутствие двух доменов, которые были идентифицированы в других исследованиях, включающих домены Rieske и негеминового Fe (Herman et al., 2005). Из указанных 78 последовательностей 68 содержали оба домена, в то время как 10 содержали только один из указанных доменов. 68 молекул с двумя доменами использовали для дальнейшего анализа мотивов. Сравнение 68 молекул, содержащих оба домена с различным уровнем идентичности, обнаруживало- 15017638 новый мотив WXWX. В то время как некоторые последовательности не содержали мотива, филогенетический анализ показал, что молекулы без мотива попадают в определенные филогенетические ветви в филогенетическом дереве, которые не принадлежат той же группе, что и молекулы с мотивом. Указанные последовательности без мотива были, таким образом, удалены из исходного набора данных, оставались 52 оставшиеся последовательности, для которых повторяли сравнение для дальнейшего анализа. Повторное сравнение 52 последовательностей показало консервативный участок вокруг двух остатков W, содержащий следующий формат: WX1WX2G (W представляет собой Trp, G представляет собой остаток Gly, X1 представляет собой неполярный остаток и Х 2 представляет собой любую аминокислоту). В этом случае второй остаток W соответствует положению 112 из SEQ ID NO: 1. Участок WXG из мотива WX1WX2G недавно был опубликован, и было обнаружено, что белки, содержащие мотив WXG, связаны с системами клеточной секреции (Desvaux et al., 2005). Триптофан (W) и цистеин (С) представляют собой остатки, значительно отличающиеся по размеру.W представляет собой крупный остаток, в то время как С представляет собой относительно небольшой остаток. Поскольку оба W и С представляют собой полярные аминокислоты, они разделяют некоторые общие характеристики, такие как отдача протонов. Так как остаток W кодируется с помощью TGG и Cys кодируется с помощью TGC и TGT, то определенные превращения в третьей букве (GС или GТ) могут привести к получению миссенс-мутации, которая меняет W на С, или С на W. такие превращения были идентифицированы в природе, и такие мутации изменяли биофункции и активности (см., например,ген BRCA1 в наследственном раковом заболевании груди и яичников (Xiaoman and Jinghe, 1999); дефицит фактора коагуляции XII (Wada et al., 2003) и мутация липопротеин-липазы при гиперлипопротеинанемии типа I (Hoffmann et al., 2000. Таким образом, вышеупомянутые результаты указывают на то, что DMO является уникальным ферментом и имеет низкую идентичность с известными ферментами, W112 является консервативным в других родственных железосерных оксигеназах. Кроме того, положение 112 связано с двумя консервативными функциональными доменами (фиг. 18). Далее, превращение W в С обычно оказывает влияние на биоактивность. Открытие того, что с DMOc является функциональным ферментом с кинетическими параметрами, превосходящими кинетические параметры фермента дикого типа DMOw, и обеспечивает высокий уровень толерантности к дикамбе при экспрессии в трансгенных растениях, оказалось особенно неожиданным. Пример 5. Получение высокого уровня устойчивости к дикамбе с помощью кодируемого в хлоропластах белка DMO. Для определения того, может ли DMO функционировать исключительно внутри хлоропластов, и для исследования возможности ограничения "распространения гена" через перенос пыльцы, были созданы конструкции на основе вектора pFMDV1 (например, Svab et al., 1990), чтобы допустить интеграцию гена DMOc в хлоропластный геном табака путем гомологичной рекомбинации и допустить выделение трансформантов с использованием селекции на устойчивость к антибиотику (фиг. 14). В указанной конструкции участок, кодирующий ген DMOc, управляется с помощью промотора хлоропластного генаpsbA, содержащего полную 5'-UTR последовательность гена. Исходные ДНК-блот анализы трансгенных растений, устойчивых к антибиотикам (фиг. 15 А), продемонстрировали присутствие в хлоропластных геномах обоих участков - трансгена DMOc (полоса 5,6 т.п.о.) и участка нативного гена (полоса 3,3 т.п.о.),замещенного с помощью гомологичной интеграции гена DMOc (то есть хлоропласты являлись гетеропластидными для нативного гена и трансгена DMOc). Повторная регенерация и селекция трансгенных растений на среде, содержащей антибиотик, привела в результате к очевидному получению гетеропластидных хлоропластов, несущих фрагмент гена DMOc, но не замещенный участок нативного гена (фиг. 15 В). Генерации T1, T2 и Т 3 потомства из двух независимо выделенных трансформантов хлоропластов тестировали на толерантность к обработке с помощью дикамбы в различных дозах. Все указанные генерации демонстрировали высокий уровень толерантности. Действительно трансформанты хлоропластного генома проявляли отсутствие видимого повреждения (в отличие от "повреждения с помощью только растворителя" для нижних листьев) при опрыскивании дикамбой с дозой 28 кг/га (25 фунт/акр) (фиг. 16), и наблюдалось только временное повреждение, когда растения обрабатывали экстремально высокими дозами дикамбы, составляющими 112 и 224 кг/га. При указанных экстремально высоких уровнях дозы исходные повреждения были вызваны, главным образом, поверхностно-активными веществами и другими компонентами растворителя, в котором осуществлялась доставка дикамбы; ткани, выросшие из поврежденной верхушки, демонстрировали фенотипы от почти нормального до нормального, показывали отсутствие замедления скорости роста после исходной остановки роста и сохраняли способность получения семян в обычном количестве и с обычным качеством. Результаты были совместимы с возможностью того, что восстановленный ферредоксин в хлоропластах табака может являться донором электронов для DMO, необходимых для окисления дикамбы доDCSA. В качестве прямого теста указанной возможности определяли способность очищенного ферредоксина шпината поддерживать превращение дикамбы в DCSA в присутствии и в отсутствие DMO,очищенного из P. maltophilia, штамма DI-6, или полученного с помощью сверхпродукции и очистки из Е.coli (табл. 4). Результаты продемонстрировали, что восстановленный ферредоксин из шпината или изClostridium был вполне способен к донорству электронов для DMO in vitro по измерениям или с помощью деградации дикамбы или по измерениям появления DCSA. В табл. 4 А-В очищенная дикамба-монооксигеназа может утилизировать восстановленный ферредоксин хлоропластов или восстановленный ферредоксин из Clostridium в качестве источника электронов для катализа in vitro превращения дикамбы в 3,6-дихлорсалициловую кислоту. Таблица 4 А Деградация дикамбы В то время как результаты, представленные на фиг. 2, показали, что получаемый уровень DMO варьировался и иногда уровень DMOc не проявлял тесной корреляции с уровнем толерантности к дикамбе, при этом результаты демонстрируют способность последовательно получать высокий уровень толерантности к дикамбе. Показана продукция DMOc для трансформантов из обоих источников - из генаDMOc с ядерной локализацией и из гена gene DMOc с локализацией в хлоропластах. В ядерных трансформантах отсутствовало создание исключительно высокого уровня тотального белка DMOc по отношению к тотальному белку, количество DMOc в хлоропластных трансформантах не имело значительных отличий и иногда было ниже, чем в ядерных трансформантах. Оценки относительной ферментативной активности в бесклеточных экстрактах образцов ткани листа показывали, что больший процент DMOc,полученного в хлоропластах, является активным, по сравнению с DMOc, синтезированным в цитоплазме и искусственно перенесенным в хлоропласты. Во всех растениях анализированная толерантность к дикамбе достигалась без сотрансформации генами ферредоксина или редуктазы. Результаты демонстрируют, что растения содержали одну или более молекул, которые могли переносить необходимые электроны на DMO, чтобы допустить превращение дикамбы в 3,6-дихлорсалициловую кислоту (DCSA). Исходное направление DMO в хлоропласты с использованием последовательности транзитного пептида проводили с целью потенциальной утилизации восстановленного ферредоксина, доступного в больших количествах в хлоропластах. В этом отношении интересно заметить, что трансформация растений табака конструкцией гена DMOc, лишенной последовательности, кодирующей хлоропластный пептид, приводила в результате к неожиданному получению растений, которые были толерантны к послевсходовой обработке дикамбой. Результаты из ограниченного количества испытаний с небольшим количеством растений генерации Т 1, тем не менее, показывали,что уровень толерантности, полученный с указанными трансгенными растениями, был в среднем чуть ниже, чем уровень толерантности, полученный с растениями табака, продуцирующими DMOc, содержащий транзитный пептид. Указанные наблюдения породили интересные вопросы в отношении молекул в трансгенных растениях, которые могут быть продуктивными донорами электронов для DMO. Тот факт,что гомопластидные хлоропласты, продуцирующие внутри себя DMO из гена DMOc, интегрированного в хлоропластный геном, показывают устойчивость к экстремально высокому уровню дикамбы (фиг. 16),и тот факт, что очищенный белок DMO может функционировать in vitro вместе с восстановленным фер- 17017638 редоксином хлоропластов шпината (табл. 4), оба предполагают, что хлоропластный ферредоксин может продуктивно взаимодействовать с DMO, допуская перенос электронов. Однако источник электронов дляDMO, продуцируемого из ядерных генов, лишенных последовательности, кодирующей хлоропластный транзитный пептид, остается неизвестным. Предположение, что ферредоксины отсутствуют вне хлоропластов растения, должно допустить возможность того, что неизвестный цитоплазматический белок может обеспечивать DMO устойчивым снабжением электронами. Альтернативно, DMO сам по себе может содержать избыточный хлоропластный транзитный пептид, который допускает вход достаточного количества DMO в хлоропласты для обеспечения защиты от дикамбы, продвигающегося в клетку после обработки с помощью дикамбы. Все композиции и/или способы, описанные и заявленные в настоящем описании, могут быть сделаны и осуществлены без чрезмерного экспериментирования в свете настоящего описания. В то время как композиции и способы настоящего изобретения были описаны в выражении предпочтительных воплощений, специалисту в данной области будет очевидно, что могут применяться вариации к композициям и/или способам, и в стадиях или в последовательности стадий способа, описанного в настоящем описании, не выходя за рамки концепции, сущности и границ изобретения. Более конкретно, будет очевидно,что определенные агенты, которые связаны одновременно химически и физиологически, могут быть заменены описанными в настоящем описании агентами, тогда как при этом будут достигнуты такие же или подобные результаты. Все такие подобные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области, будут находиться в рамках сущности, границ и концепции изобретения, как определено в прилагающейся формуле изобретения. Ссылки. Ссылки, приведенные ниже, введены в настоящее описание с помощью ссылки в такой степени,чтобы они добавляли, объясняли, обеспечивали описание уровня техники или чтобы они объясняли методологию, методы и/или применяемые в настоящем описании композиции.c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, где полипептид обладает дикамба-монооксигеназной активностью, a SEQ ID NO: 1 содержит цистеин в положении 112. 2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, входящая в состав плазмиды pKLP36-TEV-TP-DMOc,ATCC РТА-7357. 3. Конструкция ДНК, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, где полипептид обладает дикамба-монооксигеназной активностью, a SEQ ID NO: 1 содержит цистеин в положении 112,где указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором. 4. Конструкция по п.3, где промотор является функциональным в растительной клетке. 5. Конструкция по п.3, где молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с хлоропластным транзитным пептидом. 6. Полипептид, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 1, где полипептид обладает дикамба-монооксигеназной активностью, a SEQ ID NO: 1 включает цистеин в положении 112. 7. Растительная клетка, трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты по п.1. 8. Клетка по п.7, представляющая собой клетку двудольного растения. 9. Клетка по п.7, представляющая собой клетку однодольного растения. 10. Клетка по п.8, представляющая собой клетку сои, хлопчатника, маиса или рапса. 11. Культура растительной ткани, включающая клетку по п.7.