Лиофилизированная антигенная композиция

В настоящем изобретении предложены лиофилизированные композиции, содержащие антиген и агонист Толл-подобного рецептора (TLR) 9. Такие композиции можно разводить носителем,выбранным из группы носителей в форме частиц, состоящей из липосом, минеральных солей, эмульсий, полимеров и иммуностимулирующих комплексов (ISCOM), с получением иммуногенных композиций для применения в вакцинации. Здесь также предложены способы изготовления иммуногенных композиций из лиофилизированных композиций по изобретению и их применение в иммунизации. Лемуан Доминик Ингрид (BE) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU) Область техники Настоящее изобретение относится к усовершенствованным антигенным композициям и способам их использования для изготовления иммуногенных композиций. В частности, настоящее изобретение относится к лиофилизированным композициям, содержащим антиген и агонист Toll-подобного рецептора (TLR) 9. Такие композиции можно разводить носителем, выбранным из группы носителей в форме частиц, состоящей из липосом, минеральных солей, эмульсий, полимеров и иммуностимулирующих комплексов (ISCOM), с получением иммуногенных композиций для применения в вакцинации. Способы изготовления иммуногенных композиций из лиофилизированных композиций по изобретению и их применение в иммунизации также составляют часть настоящего изобретения. Предшествующий уровень техники Адъюванты иногда используют для улучшения иммунного ответа, вызванного на любой данный антиген. Однако включение адъювантов в вакцину или иммуногенную композицию увеличивает как сложность приготовления компонентов, так и сложность распределения и включения в препарат вакцинной композиции. Приготовление каждого из адъювантных компонентов, а также антигенного компонента должно быть учтено разработчиками. Это особенно верно, поскольку, например, значение рН адъювантных компонентов может сильно отличаться от оптимального значения рН для данного антигена, и эти отличия необходимо тщательно контролировать и уметь предотвратить, например осаждение или потерю желаемых свойств компонентов. Значение рН антигена в воде для инъекций может, например,составлять примерно рН 7 или несколько выше, и при добавлении адъюванта рН может быть столь низким, как рН 6,3. Антиген может, например, не быть стабильным при хранении в течение длительных периодов при таком значении рН. Затем компоненты должны быть включены в препарат и распределены в форме, которая является настолько стабильной, насколько возможно, поскольку фармацевтические препараты для применения людьми должны быть хорошо охарактеризованы, стабильны и безопасны, прежде чем они могут быть одобрены для продажи. В связи с этим на конечном препарате должны быть проведены исследования долговременной стабильности, чтобы гарантировать, что он удовлетворяет соответствующим критериям. Информацию, полученную в таких длительных исследованиях, используют для подтверждения представления в нормативно-правовые органы, такие как FDA (Федеральное управление по лекарственным средствам - орган, ответственный за одобрение лекарственных средств в США), чтобы показать, что препарат пригоден для применения людьми. Сублимационную сушку или лиофилизацию используют, как правило, для повышения стабильности и, следовательно, срока хранения вещества, включая фармацевтические вещества, такие как антиген,применяемый в вакцинах. Часто лиофилизированные антигенные композиции предлагаются специалистам в области здравоохранения для разведения разбавителем (например, водой для инъекций [WFI] или в некоторых случаях жидким адъювантным препаратом) непосредственно перед введением пациенту. В таком случае период времени, в течение которого различные компоненты конечной вакцины поддерживаются в тесном контакте, сводят к минимуму. Многие факторы должны быть учтены, когда антигены лиофилизируют с образованием лиофилизированных осадков (сухого продукта в результате лиофилизации). Например, антигенность/иммуногенность антигена должна сохраняться в лиофилизированной форме. Антиген не должен образовывать агрегаты или распадаться, когда он находится в лиофилизированной форме. Лиофилизированный осадок должен быть хорошо сформирован и не должен спадаться. Наконец, антиген должен, конечно, находиться в форме, которая быстро растворяется при разведении. Когда раствор для разведения не представляет собой просто WFI, например, когда антиген разводят жидким адъювантом, тогда необходимо учитывать влияние компонентов этого раствора на свойства разведенного продукта. Как упомянуто, адъюванты применяли в течение многих лет для улучшения иммунного ответа на антигенный компонент вакцины. Особенно сильной адъювантной комбинацией является такая, которая содержит 3-деацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) и сапонин, в частности QS21, где очищенная фракция сапонина экстрагирована из коры Quillaja saponaha Monara. Данная комбинация может быть представлена, например, в виде эмульсии масло-в-воде, препарата липосом или т.п. В предшествующих клинических испытаниях с антигенами, например с малярийными антигенами,такими как RTS,S, предложен лиофилизированный антиген, а также предложен отдельный флакон жидкого адъюванта, например препарата масло-в-воде MPL и QS21 или препарата липосом MPL и QS21, для разведения антигена. Индивидуальные компоненты объединяют с образованием конечной вакцинной композиции непосредственно перед введением. Некоторые иммуностимулирующие олигонуклеотиды, содержащие неметилированные CpGдинуклеотиды ("CpG"), являются лигандами TLR9 и идентифицированы как являющиеся адъювантами при введении как системным путем, так и путем введения в слизистую оболочку (WO 96/02555,ЕР 468520, Davis et al., J. Immunol., 1998, 160 (2):870-876; McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG представляет собой аббревиатуру для цитозин-гуанозин-динуклеотидных мотивов, присутствующих в ДНК. Исторически наблюдали, что ДНК-фракция вакцины БЦЖ (BCG) может проявлять противоопухолевый эффект. При дальнейших исследованиях было показано, что синтетические олигонуклеотиды, имеющие происхождение от последовательностей гена BCG, способны индуцировать иммуностимулирующие эффекты (как in vitro, так и in vivo). Авторы этих исследований пришли к выводу,что некоторые палиндромные последовательности, включая центральный CG-мотив, являются носителями данной активности. Центральная роль CG-мотива в иммуностимуляции была объяснена позже в публикации Krieg, Nature 374, р. 546, 1995. Подробный анализ показал, что CG-мотив должен находиться в окружении определенной последовательности и что такие последовательности распространены в бактериальной ДНК, но редки в ДНК позвоночных. Иммуностимулирующая последовательность часто представляет собой пурин, пурин, С, G, пиримидин, пиримидин; где динуклеотидный CG-мотив не метилирован, но известно, что другие неметилированные CpG-последовательности являются иммуностимулирующими, и их можно применять в настоящем изобретении. Также показано, что иммуностимулирующий олигонуклеотид может сохранять иммунологическую активность, когда гуанозин мутирован до 7-деазагуанозинового мотива (WO 03057822). Считают, что эти иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют кислый рН в растворе, например ниже рН 7, такой как 6,3, 6,1 или ниже. Это может затруднить их включение в жидкие вакцинные препараты, поскольку они не имеют сходства с другими компонентами препарата. Как обсуждалось, это может вызвать осаждение и/или проблемы долговременной стабильности. Считают, что эти иммуностимулирующие олигонуклеотиды, вероятно, являются очень эффективными адъювантами, в частности, при использовании в комбинации с существующими адъювантными комбинациями, такими как 3D-MPL и QS21. Ожидают, что такие адъюванты применимы при заболеваниях, для которых до сих пор было трудно получить эффективные вакцины, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), рак и, возможно, малярия. Существует ряд различных путей, при которых адъюванты могут быть включены в вакцины, но они должны быть включены таким путем, который не влияет на стабильность ни их самих, ни антигенной композиции, а также таким путем, который не создаст ненужную нагрузку специалистам в области здравоохранения, разводящим вакцину. Простейшим путем для достижения этого должно быть помещение дополнительных компонентов в дополнительные флаконы, так чтобы держать их отдельно до момента непосредственного разведения, сводя, таким образом, к минимуму время, в течение которого компоненты могут влиять друг на друга. Это означает, что антиген и иммуностимулирующий олигонуклеотид каждый должен быть предложен в отдельном флаконе. Затем, если используют дополнительные адъювантные компоненты, такие как MPL и QS21, они могут быть представлены в виде жидкой смеси в третьем флаконе. Однако возрастающее число компонентов при возрастающем числе флаконов приводит к повышенным затратам, отходам и, что важно, к возрастанию возможности ошибок во время разведения. Краткое изложение сущности изобретения Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, когда лиганд TLR9, такой как иммуностимулирующий олигонуклеотид CpG, составляет часть иммуногенной композиции в качестве адъюванта, указанный лиганд TLR9 может быть лиофилизирован вместе с антигеном, так что предложен один флакон,содержащий антиген и лиганд TLR9 в качестве адъюванта вместе в виде одного лиофилизированного осадка. Таким образом, в настоящем изобретении предложена лиофилизированная композиция, содержащая антиген и агонист TLR9. Указанный агонист TLR9 в одном воплощении представляет собой иммуностимулирующий олигонуклеотид, возможно CpG-содержащий олигонуклеотид. В одном аспекте указанный CpG-содержащий олигонуклеотид включает последовательность пурин, пурин, С, G, пиримидин,пиримидин. В другом аспекте указанный иммуностимулирующий олигонуклеотид выбран из группы,состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.He желая быть связанными с теорией, считают, что предоставление антигена и агониста TLR9 вместе дает компонент, который является более стабильным, чем просто добавление TLR9 к жидкому препарату MPL и QS21. Настоящее изобретение обеспечивает преимущество в том, что, когда антиген и агонист TLR9 разводят WFI, есть возможность предложения только одного флакона с лиофилизированным препаратом в нем. Кроме того, когда антиген и агонист TRL9 должен быть разведен жидким препаратом, таким как жидкий адъювантный препарат, преимущество состоит в возможности предложения только двух флаконов компонентов (а не трех). Это, в свою очередь, экономически эффективно, обеспечивая при этом препарат, подходящий для применения однократно разведенной вакцины. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что совместная лиофилизация CpG с антигенами, которые не будут иметь общий положительный заряд в буфере для разведения, может повысить растворимость этих антигенов при разведении либо водой для инъекций, либо жидким адъювантом. Таким образом, в настоящем изобретении также предложен способ повышения растворимости лиофилизированного антигена при разведении, где антиген не будет иметь суммарный положительный заряд в буфере для разведения, включающий стадию совместной лиофилизации агониста TLR9, предпочтительно иммуностимулирующего олигонуклеотида и более предпочтительно CpG-олигонуклеотида, с антигеном. В настоящем изобретении также предложено применение агониста TLR9, предпочтительно имму-2 018201 ностимулирующего олигонуклеотида и более предпочтительно CpG-олигонуклеотида, для повышения растворимости лиофилизированного, не имеющего положительного заряда антигена при разведении. Под "не имеющим положительного заряда" подразумевают, что общий заряд белка не является положительным. Белок может содержать как положительные, так и отрицательные заряды, но общий заряд белка является либо нейтральным, либо отрицательным. В настоящем изобретении также предложен способ изготовления иммуногенной композиции,включающий стадии разведения лиофилизированной композиции, как описано здесь, подходящим носителем. В одном воплощении указанный носитель представляет собой раствор липосом или эмульсию масло-в-воде. Указанный носитель возможно может содержать один или более чем один иммуностимулятор, который может быть выбран из группы, состоящей из агонистов TLR4, антагонистов TLR4, сапонинов, агонистов TLR7, агонистов TLR8, агонистов TLR9. В одном воплощении указанный носитель содержит два или более чем два иммуностимулятора, и в одном аспекте они могут представлять собой 3 деацилированный MPL и QS21. В настоящем изобретении также предложен способ изготовления лиофилизированной композиции по изобретению, включающий объединение одного или более чем одного желательного антигена, лиганда TLR9 и подходящих эксципиентов и сублимационную сушку полученной смеси. Подробное описание изобретения Авторы настоящего изобретения обнаружили, что лиганды TLR9, такие как CpG-олигонуклеотиды,могут быть лиофилизированы с интересующим антигеном, не оказывая влияние на антигенность или стабильность этого антигена. Под лигандом TLR9 подразумевают соединение, которое взаимодействует с рецептором TLR9. Показано, что члены семейства Toll-подобных рецепторов (TLR), впервые открытых у дрозофилы,являются образраспознающими рецепторами, где каждый представитель распознает и отвечает на различные компоненты микроорганизмов, чтобы ограничить/ликвидировать инвазивные микроорганизмы. Связывание ассоциированных с патогенами характерных участков молекулы (РАМР) с TLR индуцирует продуцирование реакционноспособных промежуточных соединений кислорода и азота, инициацию сети провоспалительных цитокинов и позитивную регуляцию костимулирующих молекул, связывая быстрый характерный ответ с адаптивным иммунитетом. Известно, что многие лиганды TLR полезны в качестве адъювантов. Показано, что TLR9 отвечает на олигонуклеотидные агонисты. Следовательно, лигандыTLR9 по изобретению являются иммуностимулирующими олигонуклеотидами. В одном воплощении изобретения такие лиганды TLR9 содержат CpG-мотив. Альтернативные иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут содержать модификации нуклеотидов. Например, в WO 0226757 и WO 03057822 раскрыты модификации С- и G-части CpG-содержащих иммуностимулирующих олигонуклеотидов. В одном воплощении лиганды TLR9 представляют собой CpG-олигонуклеотиды. В одном аспекте данного воплощения CpG-олигонуклеотид содержит два или более чем два динуклеотидных CpGмотива, разделенных по меньшей мере тремя, возможно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению обычно представляют собой дезоксинуклеотиды. В одном воплощении межнуклеотидная связь в олигонуклеотиде представляет собой фосфородитиоатную или, возможно, фосфоротиоатную связь, хотя фосфодиэфирные и другие межнуклеотидные связи также могут быть использованы, включая олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в US 5666153,US 5278302 и WO 95/26204. Рассмотрен олигонуклеотид, содержащий различные межнуклеотидные связи, например смешанные фосфоротиоатные фосфодиэфиры. Могут быть использованы другие межнуклеотидные связи, которые стабилизируют олигонуклеотид. Примеры CpG-олигонуклеотидов имеют приведенные ниже последовательности. В одном воплощении эти последовательности содержат модифицированные фосфоротиоатом межнуклеотидные связи.OLIGO 5 (SEQ ID NO: 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668). Альтернативные CpG-олигонуклеотиды могут содержать приведенные выше последовательности, в которых они имеют несущественные делеции или добавления к ним.CpG-олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники (например, ЕР 468520). Для удобства такие олигонуклеотиды могут быть синтезированы с использованием автоматизированного синтезатора. В контексте настоящего описания термин "антиген" предназначен для обозначения иммуногенного компонента, подходящего для индуцирования специфического иммунного ответа и подходящего для включения в вакцину или иммуногенную композицию, например антиген для включения в вакцину против ВИЧ-1, вакцину против рака, малярийную вакцину, ТВ-вакцину или т.п. Подробности о специфичных антигенах приведены ниже. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку 9,6 или менее. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку 9 или менее. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку 8,5 или менее. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку 8,0 или менее. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку 7,5. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку в интервале от 7 до 8. Суммарный заряд белка при разведении в буфере зависит от количества положительных зарядов против количества отрицательных зарядов в белке, где этот заряд, конечно, будет варьировать в зависимости от рН буфера для разведения. Изоэлектрическая точка представляет собой значение рН, при котором суммарный заряд белка является нейтральным. Если рН буфера для разведения ниже изоэлектрической точки антигена, белок склонен нести суммарный положительный заряд. Если рН буфера для разведения выше изоэлектрической точки антигена, белок склонен нести суммарный отрицательный заряд. Настоящее изобретение особенно полезно при лиофилизации и разведении антигенов, которые имеют такую изоэлектрическую точку, что в предназначенном буфере для разведения белок будет нести суммарный отрицательный заряд. При таких условиях (см. пример 3) присутствие CpG в лиофилизированной композиции может усилить растворимость антигена в буфере для разведения. В одном воплощении лиофилизированный антиген и агонист TLR9 представлены в виде одной дозы, например в одном флаконе. В одном воплощении лиофилизированный антиген присутствует в количестве, которое обеспечивает концентрацию антигена в интервале от 10 до 250 мкг при разведении. В одном воплощении агонист TRL9 присутствует в количестве, которое обеспечивает концентрацию в интервале от 10 до 1000 мкг, как, например, 500 мкг, при разведении. В одном воплощении изобретения антиген, который объединяют в лиофилизированной композиции с лигандом TLR9, может представлять собой противоопухолевый антиген. Следовательно, иммуногенные композиции, изготовленные с использованием лиофилизированной антигенной композиции по изобретению, полезны для иммунотерапевтического лечения злокачественных новообразований. Например,лиофилизированная композиция может быть изготовлена с раковыми антигенами, опухолевыми антигенами или антигенами отторжения опухоли, как описано здесь, такими как белки, экспрессирующиеся,среди прочего, при раке простаты, раке молочной железы, раке прямой и ободочной кишки, раке легкого,раке почки, раке яичника, раке печени и раке головы и шеи. Антигены рака семенников, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают семейство антигенов MAGE A: MAGE-A1, А 2, A3, А 4, А 5, А 6, А 7, А 8, А 9, А 10, А 11 и А 12, также известных как MAGE-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12; антигенов MAGE В: MAGE В 1, В 2, В 3 и В 4; антигенов MAGE C: MAGE-C1 и MAGE-C2; антиген LAGE 1; антиген LAGE 2 (также известный как NYESO-1) и антиген GAGE. Простатоспецифические антигены могут также быть использованы в настоящем изобретении. Примеры простатоспецифических антигенов, которые могут быть гибридными, включают шеститрансмембранный эпителиальный антиген простаты (STEAP), простатоспецифический антиген (PSA),простатическую кислую фосфатазу (РАР), простатический антиген стволовых клеток (PSCA), простатоспецифический мембранный антиген (PSMA) или антиген, известный как простаза (также известный как Р 703 Р). В одном воплощении простатический антиген представляет собой P501S или его фрагмент. P501S,также называемый простеин, представляет собой белок из 553 аминокислот. Иммуногенные фрагменты и участки P501S, содержащие по меньшей мере 20, 50 или 100 непрерывных аминокислот, или фрагменты,содержащие между 20-50 или 50-100 непрерывных аминокислот, могут быть использованы в качестве опухолеассоциированного антигена или производного по настоящему изобретению. В одном воплощении опухолеассоциированный антиген или производное представляет собой антиген PS108 (раскрытый вWO98/50567) или белок, ассоциированный с раком простаты (см. WO 99/67384). В некоторых воплощениях фрагменты представляют собой аминокислоты 51-553, 34-553 или 55-553 полноразмерного белкаP501S. Они могут экспрессироваться в дрожжевых системах, например, последовательности ДНК, кодирующие такие полипептиды, могут экспрессироваться в дрожжевых системах. В одном воплощении антиген может включать WT-1, экспрессируемый геном опухоли Вильмса,или его N-концевой фрагмент WT-1F, содержащий примерно или приблизительно аминокислоты 1-249,либо состоять из них. WT1 представляет собой белок, сверхэкспрессия которого исходно обнаружена при раке почки у детей, опухоли Вильмса. Антиген, который может быть использован, включает почти полноразмерный белок в качестве антигена. В одном воплощении антиген может включать белок WT1A10, который представляет собой рекомбинантный слитый белок из 292 аминокислот, состоящий из 12 мерной укороченной последовательности tat и аминокислот 2-281 последовательности WT1, или состоять из него. В одном воплощении изобретения опухолеассоциированный антиген или производное представляет собой антиген рака молочной железы, например Her-2/neu, маммаглобин или антиген B305D. Антиген Her-2/neu для применения в настоящем изобретении может содержать полноразмерный внеклеточный домен (ECD; например, последовательность, содержащую приблизительно аминокислоты 1-645 аминокислотной последовательности Her-2/neu) или его фрагменты. Альтернативно или дополни-4 018201 тельно, конструкция может содержать по меньшей мере иммуногенный участок полноразмерного внутриклеточного домена: например, приблизительно 580 С-концевых аминокислот последовательности Her2/neu. Одна из конструкций, которая может быть использована в качестве производного опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению, представляет собой слитый белок из ECD и домена фосфорилирования (PD) Her-2/neu (ECD-PD). Еще одна конструкция, которая может быть использована,представляет собой слитый белок из ECD и фрагмента домена фосфорилирования Her-2/neu (ECD-APD). Слитые белки и конструкции Her-2/neu, которые описаны, могут иметь происхождение от Her-2/neu человека, крысы, мыши или обезьяны/мартышки. Примерные последовательности и конструкции Her-2/neu описаны в WO 00/44899.PRAME (также известный как DAGE) представляет собой другой антиген, который может быть использован в качестве опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению. Также могут быть использованы слитые белки, как описано здесь, которые содержат антиген PRAME. В частности, слияния антигена PRAME, как описано здесь, и белка D в качестве партнера слияния белка или производного,как описано здесь, рассмотрены для применения в настоящем изобретении. Несколькими группами показано, что антиген PRAME экспрессируется при меланоме и широком ряде опухолей, включая рак легкого, почки и головы и шеи. Интересно, что также оказалось, что он экспрессируется при 40-60% лейкозов, таких как острый лимфоидный лейкоз и острый миелоидный лейкоз,см., например, Exp Hematol. 2000 Dec; 28 (12): 1413-22. У пациентов наблюдали, что сверхэкспрессияPRAME, как оказалось, ассоциирована с более высокой выживаемостью и более низкими частотами рецидивов по сравнению с теми, у которых нет сверхэкспрессии этого белка. Антиген и его препарат описаны в патенте США 5830753. PRAME находится в Аннотированной базе данных генов человека H-Inv DB под номерами по каталогу: U65011.1, ВС 022008.1, AK129783.1,ВС 014974.2, CR608334.1, AF025440.1, CR591755.1, ВС 039731.1, CR623010.1, CR611321.1, CR618501.1,CR604772.1, CR456549.1 и CR620272.1. В одном аспекте антиген по настоящему изобретению может включать антиген PRAME или его иммуногенный фрагмент, либо состоять из него. Как правило, белок PRAME имеет 509 аминокислот, и в одном воплощении все 509 аминокислот PRAME могут быть включены в антиген. Колоректальные антигены могут также быть использованы в качестве опухолеассоциированных антигенов по настоящему изобретению. Примеры колоректальных антигенов, которые могут быть использованы, включают: С 1585 Р (ММР 11) и С 1491 (белок, связывающий энхансер Е 1 А), CASB618 (как описано в WO 00/53748); CASB7439 (как описано в WO 01/62778) и С 1584 (Cripto). Другие опухолеассоциированные антигены, полезные в контексте настоящего изобретения, включают: Plu-1, J. Biol. Chem. 274 (22), 15633-15645, 1999, HASH-1, HASH-2, Cripto (Salomon et al. Bioessays 199, 21 61-70, патент США 5654140), Criptin, патент США 5981215. Кроме того, антигены, особенно релевантные для вакцин при терапии рака, также включают тирозиназу и сурвивин. Пептиды, имеющие происхождение от муцина, такие как Muc1, см., например, US 5744144,US 5827666, WO 8805054, US 4963484. Конкретно рассмотрены пептиды, имеющие происхождение отMuc1, которые содержат по меньшей мере одну повторяющуюся единицу пептида Muc1, предпочтительно по меньшей мере два таких повтора, и которые распознаются антителом SM3 (US 6054438). Другие пептиды, имеющие происхождение от муцина, включают пептид из Muc5. Другие опухолеспецифические антигены подходят для применения в лиофилизированной композиции по настоящему изобретению и включают, но не ограничены ими, опухолеспецифические ганглиозиды, такие как GM2 и GM3, или их конъюгаты с белками-носителями; либо указанный антиген может представлять собой аутологичный пептидный гормон, такой как полноразмерный рилизинг-фактор гормона гонадотропина (GnRH, WO 95/20600), короткий пептид длиной 10 аминокислот, полезный в лечении многих видов рака или при иммунокастрации. Изобретение также распространяется на применение вышеописанных антигенов, иммуногенных производных и иммуногенных фрагментов, а также слитых белков, содержащих их, в аспектах настоящего изобретения. Производные, фрагменты и слитые белки Опухолеассоциированные антигены по настоящему изобретению могут быть использованы в форме их производных или фрагментов, а не встречающегося в природе антигена. Термин "производное", как он использован здесь, относится к антигену, который модифицирован относительно его встречающейся в природе формы. Производное может включать мутацию, например точечную мутацию. В одном примере производное может изменять свойства белка, например, благодаря улучшению экспрессии в прокариотических системах или благодаря удалению нежелательной активности, например ферментативной активности. Производные по настоящему изобретению в достаточной степени подобны нативным антигенам в сохранении антигенных свойств и сохранении способности обеспечивать иммунный ответ, который должен быть вызван против природного антигена. Вызывает ли данное производное такой иммунный ответ, можно измерить с помощью подходящего иммунологического анализа, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или проточная цитометрия. В одном воплощении настоящего изобретения производное опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению представляет собой слитый белок, содержащий опухолеассоциированный антиген, связанный с гетерологичным белком-партнером слияния. Под термином "гетерологичный" в отношении опухолеассоциированного антигена подразумевают белок или полипептидную последовательность, которые не будут связываться с опухолеассоциированным антигеном в природе, т.е. они связываются с опухолеассоциированным антигеном в результате намеренного вмешательства человека. Антиген и гетерологичный белок-партнер слияния могут быть конъюгированы химическим путем либо могут экспрессироваться в виде рекомбинантных слитых белков. В одном воплощении слитый белок по настоящему изобретению может обеспечить получение повышенных уровней слитого белка, продуцируемого в экспрессионной системе, по сравнению с неслитым белком. Таким образом, белокпартнер слияния может способствовать обеспечению Т-хелперных эпитопов, например Т-хелперных эпитопов, распознаваемых человеком (т.е. белок-партнер слияния действует как иммунологический партнер слияния). Партнер слияния может способствовать экспрессии белка при более высоких выходах,чем нативного рекомбинантного белка (т.е. белок-партнер слияния действует как усилитель экспрессии). В одном воплощении белок-партнер слияния может действовать и как иммунологический партнер слияния, и как партнер, усиливающий экспрессию. Белки-партнеры слияния могут иметь происхождение, например, от белка D. Белок D представляет собой липопротеин (белок 42 кДа, связывающий иммуноглобулин D, экспонированный на поверхности грамотрицательной бактерии Haemophilus influenzae). Этот белок синтезируется в виде предшественника с сигнальной последовательностью из 18 аминокислотных остатков, содержащей консенсуспоследовательность для бактериального липопротеина (см. WO 91/18926). Нативный белокпредшественник белка D подвергается процессингу во время секреции, и сигнальная последовательность отщепляется. Цистеин (Cys) процессированного белка D (в положении 19 в молекуле предшественника) становится N-концевым остатком процессированного белка и параллельно модифицируется путем ковалентного присоединения жирных кислот, как связанных сложноэфирной связью, так и связанных амидной связью. Жирные кислоты, связанные с амино-концевым остатком цистеина, затем функционируют в качестве мембранного якоря. В одном воплощении производное опухолеассоциированного антигена для применения в настоящем изобретении может включать белок D или его производное в качестве белка-партнера слияния. Белок D или его производное, как описано здесь, может содержать, например, первую или Nконцевую треть процессированного белка D или приблизительно или примерно первую или N-концевую треть процессированного белка D. В одном воплощении белок D или его производное может включать первые или N-концевые 100-115 аминокислот процессированного белка D; либо первые или N-концевые 109 аминокислот процессированного белка D. В одном воплощении аминокислоты 2-Lys и 3-Leu нативного процессированного белка D могут быть заменены аминокислотами 2-Asp и 3-Pro. В одном воплощении белок D или его производное может дополнительно включать 18- или 19 аминокислотную сигнальную последовательность белка-предшественника D. В одном воплощении белок-партнер слияния, происходящий из белка D, содержит аминокислоты 20-127 белка-предшественникаD или состоит из них. В одном воплощении настоящего изобретения две аминокислоты 21-Lys и 22-Leu белка-предшественника D, который является белком-партнером слияния, могут быть заменены аминокислотами 21-Asp и 22-Pro. Белок-партнер слияния, представляющий собой белок D, как описано здесь, может дополнительно или альтернативно содержать делеции, замены или вставки в пределах аминокислотной последовательности по сравнению с предшественником дикого типа или процессированной последовательностью белка D. В одном воплощении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот могут быть вставлены, заменены или делетированы. Аминокислоты могут быть заменены консервативными заменами, как определено здесь, либо могут быть использованы другие аминокислоты. В одном воплощении белок-партнер слияния может содержать последовательность белка D, как показано в SEQ ID NO: 1, или состоять из нее. В одном воплощении белок-партнер слияния может содержать аминокислоты, подчеркнутые на фиг. 1, т.е. аминокислотные остатки 20-127 включительно из SEQID NO: 12, или состоять из них. В одном воплощении антиген для применения в настоящем изобретении может представлять собой белок-D-MAGE-3, в котором антиген MAGE-3 состоит из аминокислот 3-314MAGE-3, и в котором белок-партнер слияния, представляющий собой белок D, состоит из аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1. В другом воплощении настоящего изобретения белки-партнеры слияния могут быть выбраны изNS1 представляет собой неструктурный белок из вируса гриппа. В одном воплощении производное опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению может включать NS1 или его производное в качестве белка-партнера слияния. NS1 или его производное может содержать его N-концевые аминокислоты 1-81.LytA выделен из Streptococcus pneumoniae. С-концевой домен белка LytA ответственен за сродство к холину или к некоторым аналогам холина, таким как DEAE. В одном воплощении производное опухо-6 018201 леассоциированного антигена по настоящему изобретению может включать LytA или его производное в качестве белка-партнера слияния. LytA или его производное может включать повторяющийся участок молекулы LytA, находящийся на С-конце, начиная с остатка 178. В одном воплощении LytA или его производное содержит остатки 188-305 C-LytA. Иммуногенные полипептиды для применения в настоящем изобретении обычно представляют собой рекомбинантные белки, продуцируемые, например, путем экспрессии в гетерологичном хозяине,таком как бактериальный хозяин, в дрожжах или культивируемых клетках млекопитающих. Термин "производное опухолеассоциированного антигена" означает полипептид, который частично или полностью содержит последовательности, которые встречаются в природе в опухолеассоциированном антигене или которые обладают высокой степенью идентичности последовательности с ними (например, более чем 95% идентичности последовательности на отрезке по меньшей мере из 10 аминокислот, например по меньшей мере 20 аминокислот). Производные также включают последовательности,имеющие консервативные замены. Консервативные замены хорошо известны и в общем представлены в виде матриц замен по умолчанию в компьютерных программах выравнивания последовательностей. В общем смысле замены в пределах приведенных ниже групп представляют собой консервативные замены, а замены между приведенными ниже группами считают неконсервативными. Эти группы представляют собой: 1) аспартат/аспарагин/глутамат/глутамин; 2) серин/треонин; 3) лизин/аргинин; 4) фенилаланин/тирозин/триптофан; 5) лейцин/изолейцин/валин/метионин; 6) глицин/аланин. Производные по настоящему изобретению могут также включать химически обработанные последовательности, такие как обработанные альдегидом (таким как формальдегид или глутаральдегид), карбоксиметилированием, карбоксиамидированием, ацилированием и другими рутинными химическими обработками. Конструкции по настоящему изобретению, имеющие дериватизированные остатки свободного тиола, могут быть также использованы в настоящем изобретении. В частности, могут быть использованы карбоксиамидированные или карбоксиметилированные тиоловые производные. В одном воплощении настоящего изобретения производное опухолеассоциированного антигена может представлять собой антиген MAGE, как описано здесь, имеющий дериватизированные остатки свободного тиола. Эти дериватизированные остатки свободного тиола могут представлять собой карбоксамидные или карбоксиметилированные производные. Производное опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению может альтернативно включать конструкцию, содержащую более чем один опухолеассоциированный антиген. В одном воплощении настоящего изобретения производное опухолеассоциированного антигена может включать два или более чем два опухолеассоциированных антигена. Термин "фрагмент", как он использован здесь, относится к фрагментам опухолеассоциированного антигена или производного этого антигена, которые содержат по меньшей мере один эпитоп, напримерCTL эпитоп, как правило, пептид по меньшей мере из 8 аминокислот. Фрагменты по меньшей мере из 8,например 8-10 аминокислот или вплоть до 20, 50, 60, 70, 100, 150 или 200 аминокислот в длину считают включенными в объем изобретения настолько, насколько этот фрагмент проявляет антигенность, т.е. основные эпитопы (например CTL эпитопы) сохранены этим фрагментом, и этот фрагмент способен к индукции иммунного ответа, который перекрестно реагирует с природным опухолеассоциированным антигеном. Примерные фрагменты могут составлять 8-10, 10-20, 20-50, 50-60, 60-70, 70-100, 100-150,150-200 аминокислотных остатков в длину (включая любое значение в этих интервалах). В одном воплощении изобретения лиофилизированную композицию, содержащую антиген Her 2neu и CpG-олигонуклеотид, разводят носителем, представляющим собой эмульсию липосом или масло-вводе, содержащую 3D-MPL и QS21. Такие разведенные препараты продуцируют как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ. Лиофилизированные композиции по изобретению могут содержать антигены, ассоциированные с механизмами поддержания опухоли (например, ангиогенезом, опухолевой инвазией), например, tie 2,VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). В другом аспекте изобретения антиген в лиофилизированной композиции по изобретению представляет собой антиген, выбранный из антигенов, происходящих из ВИЧ, в частности антигенов, происходящих из ВИЧ-1. В приведенных ниже абзацах описаны антигены, которые могут иметь происхождение из ВИЧ-1. Белки Tat и Nef ВИЧ представляют собой ранние белки, т.е. они экспрессируются на ранней стадии инфекции и в отсутствие структурного белка. Ген Nef кодирует ранний вспомогательный белок ВИЧ, который, как показано, обладает несколькими активностями. Например, известно, что белок Nef вызывает удаление CD4, рецептора ВИЧ, с клеточной поверхности, хотя биологическое значение этой функции является спорным. Кроме того, Nef взаимодействует с биохимическим путем передачи сигнала Т-клетками и индуцирует активное состояние, которое, в свою очередь, может стимулировать более эффективную экспрессию гена. Некоторые изоляты ВИЧ имеют мутации или делеции в этой области, в результате которых они не кодируют функциональный белок, и их репликация и патогенез in vivo сильно нарушены. Ген Gag транслируется с полноразмерной РНК с образованием полипротеина-предшественника, который впоследствии расщепляется на 3-5 капсидных белков; матриксный белок р 17, капсидный белок р 24 и белок, связывающий нуклеиновую кислоту (Fundamental Virology, Fields BN, Knipe DM and HowleyM, 1996, 2. Fields Virology, vol. 2, 1996). Ген Gag образует белок-предшественник Gag, 55 килодальтон (кД), также называемый р 55, который экспрессируется с несплайсированной вирусной мРНК. В процессе трансляции N-конец р 55 подвергается миристоилированию, запускающему его связывание с цитоплазматической стороной клеточных мембран. Связанный с мембраной полипротеин Gag рекрутирует две копии вирусной геномной РНК наряду с другими вирусными и клеточными белками, которые запускают активную репликацию вирусной частицы в результате проникновения в клетку с поверхности инфицированной клетки. После этой активной репликации р 55 расщепляется протеазой, кодируемой вирусом (продуктом гена Pol), в процессе созревания вируса в четыре белка меньшего размера, обозначенные МА (матриксный[р 17]), СА (капсидный[р 24]), NC (нуклеокапсидный [р 9]) и р 6. В дополнение к 3 основным белкам Gag (p17, р 24 и р 9) все предшественники Gag содержат несколько других областей, которые отщепляются и остаются в вирионе в виде пептидов различных размеров. Эти белки играют различные роли, например белок р 2 играет предполагаемую роль в регуляции активности протеазы и вносит вклад в правильный тайминг протеолитического процессинга. Полипептид МА происходит из N-концевого миристоилированного конца р 55. Большинство молекул МА остается присоединенным к внутренней поверхности липидного бислоя вириона, стабилизируя частицу. Подгруппа МА рекрутируется внутрь более глубоких слоев вириона, где она становится частью комплекса, который сопровождает вирусную ДНК в ядро. Эти молекулы МА способствуют ядерному транспорту вирусного генома, поскольку сигнал ядерной локализации на МА распознается клеточным механизмом ядерного транспорта. Этот феномен дает возможность ВИЧ инфицировать неделящиеся клетки, что является необычным свойством для ретровируса. Белок р 24 (СА) образует конический кор вирусной частицы. Продемонстрировано, что циклофиллин А взаимодействует с областью р 24 р 55, что приводит к его включению в частицы ВИЧ. Взаимодействие между Gag и циклофиллином А существенно, поскольку прерывание этого взаимодействия циклоспорином ингибирует вирусную репликацию. Область NC Gag ответственна за специфичное распознавание так называемого сигнала упаковки ВИЧ. Сигнал упаковки состоит из четырех структур типа "стебель-петля", локализованных вблизи 5'конца вирусной РНК, и достаточен для того, чтобы опосредовать включение гетерологичной РНК в вирионы ВИЧ-1. NC связывается с сигналом упаковки посредством взаимодействий, опосредованных двумя мотивами типа "цинковые пальцы". NC также способствует обратной транскрипции. Область полипептида р 6 опосредует взаимодействия между р 55 Gag и вспомогательным белкомVpr, приводя к включению Vpr в собирающиеся вирионы. Область р 6 также содержит так называемый поздний домен, который требуется для эффективного высвобождения активно реплицирующихся вирионов из инфицированной клетки. Ген Pol кодирует три белка, обладающих активностями, необходимыми вирусу на ранней стадии инфекции, обратную транскриптазу RT, протеазу и белок интегразу, необходимый для интеграции вирусной ДНК в клеточную ДНК. Первичный продукт Pol расщепляется протеазой вириона с образованием амино-концевого пептида RT, который содержит активности, необходимые для синтеза ДНК (РНК- и ДНК-направленную ДНК полимеразу, рибонуклеазу Н), и карбокси-концевого белка интегразы. RT ВИЧ представляет собой гетеродимер полноразмерной RT (р 66) и продукта расщепления (р 51), у которого отсутствует карбокси-концевой домен РНКазы Н.RT представляет собой один из наиболее высоко консервативных белков, кодируемых ретровирусным геномом. Двумя основными активностями RT являются ДНК Pol и рибонуклеаза Н. ДНК Pol активность RT использует ДНК и РНК в качестве матриц взаимозаменяемо и, подобно всем известным ДНКполимеразам, неспособна инициировать синтез ДНК de novo, а требует уже существующей молекулы,которая служит в качестве праймера (РНК). Активность РНКазы Н, присущая всем белкам RT, при ранней репликации играет незаменимую роль по удалению РНК-генома в процессе синтеза ДНК. Она селективно разрушает РНК из всех гибридных молекул РНК-ДНК. Структурно полимераза и РНКаза Н занимают отдельные, неперекрывающиеся домены в пределах Pol, охватывающие две трети с амино-конца Pol. Каталитическая субъединица р 66 уложена в 5 отдельных субдоменов. Амино-концевые 23 аминокислоты из них имеют участок с активностью RT. Карбокси-концевые аминокислоты от них представляют собой домен РНКазы Н. После инфицирования клетки-хозяина ретровирусный РНК-геном копируется в линейную двунитевую ДНК обратной транскриптазой, которая присутствует в инфицирующей частице. Интеграза (обзор сделан Skalka AM '99 Adv in Virus Res 52, 271-273) распознает концы вирусной ДНК, обрезает их и сопровождает вирусную ДНК к сайту хромосомы хозяина для катализа интеграции. Многие сайты в ДНК хозяина могут быть мишенями интеграции. Хотя интеграза достаточна для катализа интеграции in vitro,она является не единственным белком, связанным с ДНК in vivo; большой комплекс белок-вирусная ДНК, выделенный из инфицированных клеток, обозначен как прединтеграционный комплекс. Это способствует приобретению генов клетки-хозяина потомством вирусных геномов. Интеграза состоит из 3 отдельных доменов: N-концевого домена, каталитического кора и Сконцевого домена. Каталитический коровый домен содержит все необходимое для химии полинуклеотидильного переноса. Антигены, происходящие из ВИЧ-1, для применения в изобретении могут быть, таким образом, выбраны, например, из Gag (например, полноразмерного Gag), p17 (участка Gag), p24 (другого участкаGag), p41, p40, Pol (например, полноразмерного Pol), RT (участка Pol), p51 (участка RT), интегразы (участка Pol), протеазы (участка Pol), Env, gp120, gp140 или gp160, gp41, Nef, Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat, а также их иммуногенных производных и их иммуногенных фрагментов, в частности, Env, Gag, Nef и Pol и их иммуногенных производных и их иммуногенных фрагментов, включая р 17, р 24, RT и интегразу. ВИЧвакцины могут содержать полипептиды и/или полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, соответствующие множественным различным антигенам ВИЧ, например, 2 или 3 либо 4 или более антигенов ВИЧ, которые могут быть выбраны из приведенного выше перечня. Несколько различных антигенов могут, например, быть включены в единый слитый белок. Более чем один первый иммуногенный полипептид и/или более чем один второй иммуногенный полипептид, каждый из которых представляет собой антиген ВИЧ, либо слияние более чем одного антигена могут быть использованы. Например, антиген может включать Gag или его иммуногенное производное или иммуногенный фрагмент, слитый с RT или его иммуногенным производным или иммуногенным фрагментом, слитым сNef или его иммуногенным производным или иммуногенным фрагментом, где участок Gag слитого белка присутствует на 5'-конце полипептида. Последовательность Gag, применяемая в соответствии с изобретением, может исключать последовательность, кодирующую полипептид р 6 Gag. Конкретный пример последовательности Gag для применения в изобретении включает кодирующие последовательности р 17 и/или р 24. Последовательность RT может содержать мутацию, для того чтобы, по существу, инактивировать какую-либо активность обратной транскриптазы (см. WO 03/025003). Ген RT представляет собой компонент гена pol большего размера в геноме ВИЧ. Следует понимать,что последовательность RT, применяемая в соответствии с изобретением, может присутствовать в контексте Pol или фрагмента Pol, соответствующего по меньшей мере RT. Такие фрагменты Pol сохраняют основные CTL эпитопы Pol. В одном конкретном примере RT включает по меньшей мере только фрагмент р 51 или только фрагмент р 66 RT. Компонент RT слитого белка или композиции согласно изобретению возможно содержит мутацию для удаления сайта, который служит в качестве внутреннего сайта инициации в прокариотических экспрессионных системах. Возможно последовательность Nef для применения в изобретении укорочена для удаления последовательности, кодирующей N-концевую область, т.е. удаления от 30 до 85 аминокислот, например от 60 до 85 аминокислот, в частности N-концевых 65 аминокислот (на последнее укорочение здесь ссылаются как на trNef). Альтернативно или дополнительно, Nef может быть модифицирована для удаления сайта миристоилирования. Например, сайт миристоилирования Gly 2 может быть удален путем делеции или замены. Альтернативно или дополнительно, Nef может быть модифицирована для изменения дилейцинового мотива Leu 174 и Leu 175 путем делеции или замены одного или обоих лейцинов. Важность дилейцинового мотива в негативной регуляции CD4 описана, например, в Bresnahan P.A. et al. (1998), Current Biology, 8 (22): 1235-8. Антиген Env может присутствовать в его полноразмерном виде как gp160, либо в укороченном виде как gp140 или короче (возможно с подходящей мутацией для разрушения мотива сайта расщепления между gp120 и gp41). Антиген Env может также присутствовать в его встречающейся в природе процессированной форме в виде gp120 и gp41. Эти два производных gp160 могут быть использованы индивидуально или вместе в виде комбинации. Вышеупомянутые антигены Env могут дополнительно проявлять делеции (в частности, вариабельных петель) и укорочения. Фрагменты Env также могут быть использованы. Примерная последовательность gp120 показана в SEQ ID NO: 6. Примерная последовательностьgp140 показана в SEQ ID NO: 7. Иммуногенные полипептиды для применения в лиофилизированной композиции согласно изобретению могут включать Gag, Pol, Env и Nef, где присутствует по меньшей мере 75%, либо по меньшей мере 90%, либо по меньшей мере 95%, например 96%, CTL эпитопов этих нативных антигенов. В лиофилизированных композициях, содержащих иммуногенные полипептиды, которые включают р 17/р 24 Gag, р 66 RT и укороченный Nef, как определено выше, подходящим образом присутствует 96%CTL эпитопов нативных антигенов Gag, Pol и Nef. В одном воплощении изобретения предложена лиофилизированная композиция, содержащая лиганд TLR9 и иммуногенный полипептид, содержащий р 17, р 24 Gag, р 66 RT, укороченный Nef (без нуклеотидов, кодирующих концевые аминокислоты 1-85 - "trNef") в порядке Gag, RT, Nef. Конкретные полинуклеотидные конструкции и соответствующие полипептидные антигены для применения в лиофилизированных композициях согласно изобретению включают: 1) р 17, р 24 (оптимизированный по кодонам)Gag - р 66 RT (оптимизированный по кодонам) - укороченный Nef; 2) укороченный Nef - р 66 RT (оптимизированный по кодонам) - р 17, р 24 (оптимизированный по кодонам) Gag; 3) укороченный Nef - р 17, р 24 (оптимизированный по кодонам) Gag - р 66 RT (оптимизированный по кодонам); 4) р 66 RT (оптимизированный по кодонам) - р 17, р 24 (оптимизированный по кодонам) Gag - укороченный Nef; 5) р 66 RT (оптимизированный по кодонам) - укороченный Nef - р 17, р 24 (оптимизированный по кодонам) Gag; 6) р 17, р 24 (оптимизированный по кодонам) Gag - укороченный Nef - р 66 RT (оптимизированный по кодонам). Примерный слитый белок представляет собой слияние Gag, RT и Nef, в частности в порядке GagRT-Nef (см., например, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9). Другой примерный слитый белок представляет собой слияние р 17, р 24, RT и Nef, в частности в порядке p24-RT-Nef-p17. Этот слитый белок назван F4 и описан в WO 2006/013106. F4 является предпочтительным примером антигена ВИЧ, который может находиться в лиофилизированной композиции по изобретению. Нуклеотидная последовательность F4 приведена в SEQ ID NO: 10, где последовательность р 24 выделена жирным шрифтом, последовательностьNef подчеркнута, а прямоугольники представляют собой нуклеотиды, введенные генетическим конструированием. Аминокислотная последовательность F4 приведена в SEQ ID NO: 11, где последовательность Р 24: аминокислоты 1-232 (жирным шрифтом); последовательность RT: аминокислоты 235-795; последовательность Nef: аминокислоты 798-1002; последовательность Р 17: аминокислоты 1005-1136; прямоугольники: аминокислоты, введенные генетическим конструированием; К (Лизин): вместо триптофана (W). Мутация введена для удаления активности фермента. В другом воплощении лиофилизированная композиция содержит Gag, RT, интегразу и Nef, в частности в порядке Gag-RT-интергаза-Nef (см., например, SEQ ID NO: 11). В других воплощениях антиген ВИЧ может представлять собой слитый полипептид, который содержит Nef, или его иммуногенное производное, или его иммуногенный фрагмент и р 17 Gag и/или р 24Gag, или их иммуногенные производные, или их иммуногенные фрагменты, где, когда присутствуют оба р 17 и р 24 Gag, между ними находится по меньшей мере один ВИЧ или его иммуногенный фрагмент. Например, Nef подходящим образом представляет собой полноразмерный Nef. Например, р 17 Gag и р 24 Gag подходящим образом представляют собой полноразмерные р 17 и р 24,соответственно. В одном воплощении лиофилизированная композиция содержит иммуногенный полипептид, включающий оба р 17 и р 24 Gag или их иммуногенные фрагменты. В такой конструкции компонент р 24 Gag и компонент р 17 Gag разделены по меньшей мере одним дополнительным антигеном ВИЧ или его иммуногенным фрагментом, таким как Nef и/или RT или их иммуногенные производные или их иммуногенные фрагменты. Дополнительные подробности см. в WO 2006/013106. В слитых белках, которые содержат р 24 и RT, может быть предпочтительным, чтобы р 24 предшествовал RT в конструкции, поскольку, когда антигены экспрессируются отдельно в Е.coli, наблюдают лучшую экспрессию р 24, чем RT. Некоторые конструкции для применения в лиофилизированных композициях согласно изобретению, включают приведенные ниже: 1. p24-RT-Nef-p17; 2. p24-RT-Nef-p17; 3. p24-p51RT-Nef-p17; 4. p24-p51RT-Nef-p17; 5. p17-p51RT-Nef; 6. p17-p51RT-Nef; 7. Nef-p17; 8. Nef-p17 с линкером; 9. p17-Nef; 10. p17-Nef с линкером.представляет собой мутацию RT метионин 592 на лизин. В другом аспекте в настоящем изобретении предложена лиофилизированная композиция, содержа- 10018201 щая слитый белок антигенов ВИЧ, содержащий по меньшей мере четыре антигена ВИЧ или их иммуногенных фрагмента, где эти четыре антигена или фрагмента представляют собой Nef, Pol и Gag или их производные. Предпочтительно Gag присутствует в виде двух отдельных компонентов, которые разделены по меньшей мере одним другим антигеном в слитом белке. Предпочтительно Nef представляет собой полноразмерный Nef. Предпочтительно Pol представляет собой р 66 или p51RT. ПредпочтительноGag представляет собой р 17 и р 24 Gag. Другие предпочтительные признаки и свойства антигенных компонентов слитого белка в данном аспекте изобретения являются такими, как описано ниже. Предпочтительными воплощениями данного аспекта являются четырехкомпонентные слияния, как уже перечислено выше. 1. p24-RT-Nef-p17; 2. p24-RT-Nef-p17; 3. p24-p51RT-Nef-p17; 4. p24-p51RT-Nef-p17. Иммуногенные полипептиды, применяемые в лиофилизированной композиции по настоящему изобретению, могут иметь линкерные последовательности, присутствующие между последовательностями,соответствующими конкретным антигенам, таким как Gag, RT и Nef. Такие линкерные последовательности могут составлять, например, вплоть до 20 аминокислот в длину. В конкретном примере они могут составлять от 1 до 10 аминокислот или от 1 до 6 аминокислот, например 4-6 аминокислот. Дополнительное описание таких подходящих антигенов ВИЧ можно найти в WO 03/025003. Антигены ВИЧ для применения в настоящем изобретении могут иметь происхождение от любой филогенетической ветви ВИЧ, например филогенетической ветви А, филогенетической ветви В или филогенетической ветви С. Например, антигены ВИЧ могут иметь происхождение от филогенетической ветви А или В, в частности В. В одном конкретном воплощении изобретения лиофилизированная композиция содержит более чем один иммуногенный полипептид. В одном аспекте данного воплощения первый иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, включающий Gag и/или Pol и/или Nef или фрагмент или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17). В одном конкретном аспекте данного воплощения изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, включающий Gag и/илиPol и/или Nef или фрагмент или производное любого из них (например, Gag-RT-Nef или Gag-RTинтеграза-Nef). Таким образом, в одном конкретном воплощении полипептид, включающий Gap и/или Pol и/илиNef или фрагмент или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17), представляет собой первый иммуногенный полипептид, а полипептид, включающий Gag и/или Pol и/или Nef или фрагмент или производное любого из них (например, Gag-RT-Nef или Gag-RT-интеграза-Nef), представляет собой второй иммуногенный полипептид. В другом конкретном воплощении изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой Env или его фрагмент или производное, например, gp120, gp140 или gp160 (в частности, gp120). В одном конкретном воплощении изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, включающий Gag и/или Pol и/или Nef или фрагмент или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17). Таким образом, в одном конкретном воплощении Env или его фрагмент или производное, напримерgp120, gp140 или gp160 (в частности, gp120) представляет собой первый иммуногенный полипептид, а полипептид, включающий Gag и/или Pol и/или Nef или фрагмент или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17), представляет собой второй иммуногенный полипептид. В другом конкретном воплощении изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, включающий Gag и/или Pol и/или Nef или фрагмент или производное любого из них(например, p24-RT-Nef-p17). В одном конкретном воплощении изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой Env или его фрагмент или производное, например gp120, gp140 или gp160(в частности, gp120). Таким образом, в одном конкретном воплощении полипептид, включающий Gag и/или Pol и/илиNef или фрагмент или производное любого из них (например, p24-RT-Nef-p17), представляет собой первый иммуногенный полипептид, a Env или его фрагмент или производное, например gp120, gp140 илиgp160 (в частности, gp120), представляет собой второй иммуногенный полипептид. Лиофилизированная композиция может содержать один антиген или может содержать более чем один антиген. В одном аспекте изобретения лиганд TLR9 используют для улучшения растворимости антигенов,которые не являются положительно заряженными. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, в частности, с антигенами, которые заряжены отрицательно, совместная лиофилизация Cpg может улучшить их растворимость при разведении. Когда лиганд TLR9 является иммуностимулирующим олигонуклеотидом, антиген представляет собой молекулу с суммарным отрицательным зарядом. Когда этот лиганд лиофилизируют совместно с антигеном с суммарным положительным зарядом, существует возможность, что лиганд TLR9 будет взаимодействовать с антигеном при разведении лиофилизированной ком- 11018201 позиции, возможно, вызывая осаждение антигена. Это нежелательно, но специалист в данной области техники может избежать этого путем включения вместе с композицией для лиофилизации эксципиентов,которые известны как повышающие растворимость в таких ситуациях, такие как, например, L-аргинин. Лиганд TLR9 и один или более чем один антиген объединяют с подходящими эксципиентами с образованием конечной массы препарата, который должен быть лиофилизирован. Оптимально эксципиенты будут содержать криозащитный агент для защиты белка от денатурации на ранних стадиях лиофилизации и защитный агент лиофилизации для предотвращения инактивации белка в процессе сушки. Могут быть использованы две различные молекулы, либо может быть использована одна молекула, которая обладает обоими свойствами, такая как дисахарид. Возможно, также можно добавлять кристаллический наполнитель, такой как маннит или глицин. Неионное поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат или Tween, может также быть добавлено, чтобы способствовать предотвращению агрегации белка. Эксципиенты могут также включать буферные соли для изменения рН конечной массы препарата. Подходящие эксципиенты включают следующие: сахара, такие как сахароза, трегалоза, рафиноза, и мальтодекстрины, такие как мальтотриоза, мальтотетраоза, мальтопентаоза или мальтогексаоза; полиолы, такие как маннит или сорбит; полимеры, такие как декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или поливинилпирролидон (ПВП); аминокислоты, такие как глицин, аланин или аргинин. Эксципиенты можно также объединять, так чтобы два или более чем два, например три или четыре эксципиента можно было использовать вместе. Возможные комбинации включают сахар и декстран, например сахарозу и декстран или трегалозу и декстран; сахар и ПЭГ, например ПЭГ 8000 и сахариды; сахар и ПВП, например сахарозу и ПВП; сахар и аминокислоты, например глицин и сахарозу; два сахара вместе, например сахарозу и глюкозу или сахарозу и рафинозу; сахарозу и полиолы, например сахарозу и сорбит или сахарозу и маннит; полиолы и аминокислоты, такие как маннит и глицин. Поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат или Tween, могут быть добавлены к любой комбинации эксципиентов. В целях образования иммуногенной композиции, которая может быть использована для вакцинации, лиофилизированную композицию, содержащую антиген и лиганд TLR9, разводят фармацевтически приемлемым разбавителем. Предпочтительный аспект изобретения состоит в том, что такой разбавитель должен представлять собой разбавитель в форме частиц, например раствор частиц соли металла или липосом, либо эмульсию масло-в-воде. В одном воплощении разбавитель содержит дополнительные иммуностимуляторы. Это означает,что конечная разведенная иммуногенная композиция содержит другие иммуностимуляторы в дополнение к лиганду TLR9, находящемуся в лиофилизированной композиции. Существует ряд известных иммуностимуляторов, которые известны как адъюванты либо отдельно,либо в комбинации. Врожденная или природная иммунная система распознает широкий спектр патогенов без необходимости в предварительном воздействии. Основные клетки, ответственные за врожденный иммунитет, моноциты/макрофаги и нейтрофилы, фагоцитируют патогены микроорганизмов и запускают врожденный, воспалительный и специфический иммунные ответы. Липополисахариды (ЛПС) являются основной поверхностной молекулой внешней поверхности наружной мембраны грамотрицательных бактерий и встречаются исключительно в нем. Показано, что ЛПС являются лигандами TLR4. ЛПС затрудняют разрушение бактерий сывороточными комплементами и фагоцитарными клетками и вовлечены в адгезию для колонизации. ЛПС представляют собой группу структурно родственных комплексных молекул размером приблизительно 10000 Дальтон (Да) и состоят из трех ковалентно сшитых участков:(2) коровый олигосахаридный центральный участок;(3) липид А - самый дальний внутренний участок, который служит в качестве гидрофобного якоря,он содержит дисахаридные звенья глюкозамина, которые несут длинноцепочечные жирные кислоты. Показано, что биологические активности ЛПС, такие как летальная токсичность, пирогенность и адъювантные свойства, связаны с группировкой липида А. Напротив, иммуногенность ассоциирована с О-специфичным полисахаридным компонентом (О-антигеном). Давно известно, что как ЛПС, так и липид А обладают сильными адъювантными эффектами, но высокая токсичность этих молекул исключила их применение в вакцинных препаратах. Следовательно, предприняты значительные усилия в направлении снижения токсичности ЛПС и липида А при сохранении их адъювантных свойств. Мутант Salmonella minnesota R595 был выделен в 1966 году из культуры исходного (smooth) штамма (Luderitz et al. 1966, Ann. N. Y. Acad. Sci. 133: 349-374). Был проведен скрининг отобранных колоний на их чувствительность к лизису панелью фагов, и только те колонии, которые проявляли узкий диапазон чувствительности (чувствительные только к одному или двум фагам), были отобраны для дальнейшего исследования. Эти усилия привели к выделению мутантного штамма deep rough, который является дефектным по биосинтезу ЛПС, и он был назван S. minnesota R595. По сравнению с другими ЛПС, продуцируемые мутантом S. minnesota R595, имеют относительно простую структуру.(1) они не содержат О-специфичный участок - характерный признак, ответственный за сдвиг от фенотипа дикого типа smooth к мутантному фенотипу rough, и приводит в результате к потере вирулентности;(2) коровый участок очень короткий - этот характерный признак повышает чувствительность штамма к ряду химических веществ;(3) группировка липида А в высокой степени ацилирована жирными кислотами в количестве вплоть до 7. 4'-Монофосфориллипид A (MPL), который может быть получен кислотным гидролизом ЛПС, экстрагированного из мутантного штамма deep rough грамотрицательных бактерий, сохраняет адъювантные свойства ЛПС, демонстрируя при этом токсичность, которая снижена более чем в 1000 раз (как измерено на основании летальной дозы на эмбрионах куриных яиц) (Johnson et al., 1987, Rev. Infect. Dis. 9 Suppl:S512-S516). ЛПС обычно кипятят с обратным холодильником в растворах минеральных кислот средней силы (например, 0,1 М HCl) в течение периода приблизительно 30 мин. Этот процесс приводит в результате к дефосфорилированию в положении 1 и декарбогидрированию в положении 6' с получением MPL. 3-О-деацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL), который может быть получен путем мягкого щелочного гидролиза MPL, обладает еще более сниженной токсичностью, при этом, опять же, сохраняя адъювантные свойства, см. US 4912094 (Ribi Immunochemicals). Щелочной гидролиз обычно проводят в органическом растворителе, таком как смесь хлороформ/метанол, путем насыщения водным раствором слабого основания, таким как 0,5 М карбонат натрия, при рН 10,5. Дополнительная информация по получению 3D-MPL имеется, например, в US 4912094 и WO 02/078637 (Corixa Corporation). Показано, что некоторые молекулы, которые не являются лигандами TLR, обладают адъювантной активностью. Сапонины килайи (Quillaja) представляют собой смесь тритерпеновых гликозидов, экстрагированных из коры дерева Quillaja saponaria. Неочищенные сапонины широко применяли в качестве ветеринарных адъювантов. Quil-A представляет собой частично очищенный водный экстракт вещества сапонинов килайи. QS21 представляет собой очищенную высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) нетоксичную фракцию Quil А, и этот способ ее получения (как QA21) раскрыт в патенте США 5057540. В одном аспекте изобретения разбавитель содержит один дополнительный иммуностимулятор. В другом аспекте изобретения разбавитель содержит более чем один дополнительный иммуностимулятор. Такие иммуностимуляторы могут представлять собой лиганды TLR4, сапонины, лиганды TLR7, лигандыTLR8 или лиганды TLR9. В одном воплощении изобретения дополнительный иммуностимулятор представляет собой лиганд TLR4, такой как 3D-MPL, как описано здесь. В еще одном воплощении изобретения дополнительный иммуностимулятор представляет собой QS21, как описано здесь. В еще одном воплощении изобретения разбавитель содержит QS21 и 3D-MPL. В одном аспекте данного воплощения разбавитель представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую QS21 и 3D-MPL. В другом аспекте данного воплощения разбавитель представляет собой раствор липосом, содержащий QS21 и 3D-MPL. Далее изобретение будет описано дополнительно со ссылкой на приведенные ниже не ограничивающие примеры. Примеры Пример 1. Сублимационная сушка CpG-олигонуклеотида и СРС-P501S в качестве антигена Используемый антиген представлял собой CPC-P501S. Этот антиген показан на фиг. 1 в виде диаграммы, на которой часть, показывающая ТМ 2-ТМ 12, представляет собой антиген P501S; овальные формы на левой стороне представляют собой партнеры слияния СРС, а гистидиновый (His) хвост показан на правой стороне. Антиген продуцировали, как показано, с His-хвостом в S. cerevisiae, a затем доводили до концентрации 700 мкг/мл, используя буфер Трис (5 мМ, рН 7,5) и Твин 80 (0,3%). Для получения конечной массы препарата сахарозу (35%) добавляли в воду для инъекций до достижения конечной концентрации 6,3%. Затем добавляли Трис (1 М, рН 8,8), а затем Твин 80 (25%) до достижения конечной концентрации 0,2%. Эту смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 5 минт при комнатной температуре. Добавляли CPC-P501S и смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 4 мин при комнатной температуре. Затем добавляли CpG-олигонуклеотид с SEQ ID NO: 4 и полученную в результате смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 15 минут при комнатной температуре с получением конечной массы препарата. Композицию анализировали следующим образом: 0,5 мл композиции заполняли в стеклянный флакон, который подвергали циклу лиофилизации, как показано на фиг. 2. Характеристику осадка проводили путем визуального осмотра и измерения диаметра при Т 0, через 1 неделю, 2 недели, 3 недели и 4 недели при 37 С на трех флаконах композиции (см. фиг. 3). Остаточное содержание влаги измеряли в те же моменты времени и при той же температуре, используя термогравиметрический анализ (ТГ) или анализ по Карлу Фишеру (КФ). Как видно ниже, осадки были стабильны в течение времени вплоть до 2 недель. Лиофилизированный осадок. КФ: метод Карла Фишера. ТГ: Термогравиметрический метод. нд: не делали. ОК: нет ни агрегации, ни разрушения. Спецификация: 3% (термогравиметрический метод). Влажность в конечном контейнере, который хранят при 37 С (для ускорения анализа на стабильность), возрастает со временем. Через 1 месяц при 37 С осадки содержат 1,3% Н 2 О и подвергаются ретракции. В данном эксперименте возрастание влажности является следствием того факта, что гигроскопичный порошок абсорбирует воду из пробок. Замена пробок новыми типами пробок может способствовать предотвращению такой ретракции. Затем осадки разводили либо водой для инъекций, либо следующими жидкими носителями: адъювантная система А (липосомный адъювант, приготовленный, как описано в WO 2005/112991), адъювантная система Е (адъювант в виде эмульсии масло-в-воде, приготовленный, как описано вWO 2005/112991) или адъювантная система F (адъювант в виде эмульсии масло-в-воде, приготовленный,как описано в WO 2005/112991). Никакой агрегации или разрушения белка не наблюдали с водой для инъекций, адъювантной системой Е или адъювантной системой F. Некоторую агрегацию и разрушение наблюдали с адъювантной системой А. Был сделан вывод, что это является следствием снижения рН ниже изоэлектрической точкиCPC-P501S. Повышение концентрации эксципиента Трис до 50 мМ решало эту проблему, и затем никакой агрегации не наблюдали с адъювантной системой А. Было также обнаружено, что присутствие CpG в лиофилизированном осадке (т.е. совместная лиофилизация антигена и CpG-олигонуклеотида) способствовало предотвращению агрегации антигена при восстановлении адъювантной системой А. Сравнение разведения лиофилизированных осадков с CpG и без него с использованием адъювантной системы А показало сниженную агрегацию после совместной лиофилизации (данные не показаны). Влияние эксципиентов на размер липосом в адъювантной системе А было также исследовано и было обнаружено отсутствие различия в размере между липосомами, находящимися во флаконе с адъювантной системой А отдельно, и липосомами, находящимися во флаконе с адъювантной системой А после восстановления лиофилизированного осадка, содержащего антиген, CpG, Трис и Твин. Следовательно, авторы изобретения смогли сделать вывод, что компоненты лиофилизированного осадка не влияют на адъювантную систему (фиг. 4). Наконец, была исследована антигенность препарата, и было обнаружено, что в отношении лимфо- 14018201 пролиферации и продуцирования внутриклеточного цитокина (интерферона-, ИФН) отсутствовало различие между жидким и лиофилизированным препаратом CPC-P501S (данные не показаны). Таким образом, авторы изобретения смогли сделать вывод, что на иммуногенность антигена не влияет совместная лиофилизация с CpG. Пример 2. Сублимационная сушка CpG-олигонуклеотида и Mage-3 в качестве антигена. Используемый антиген представлял собой часть белка D, связанного с MAGE-3, который, в свою очередь, был связан с His-хвостом для облегчения очистки PD-Mage3-His (см. фиг. 5: SEQ ID NO: 13). Очищенную массу антигена продуцировали с His-хвостом в Е.coli, a затем доводили до концентрации 750 мкг/мл, используя буфер NaH2PO42H2O/K2HPO42H2O (2 мМ) и Твин 80 приблизительно при 0,2% об./об. (теоретически), рН 7,5. Для получения конечной массы препарата сахарозу (30%) добавляли в воду для инъекций до получения конечной концентрации 3,15%. Затем добавляли NaH2PO42H2O/K2HPO42H2O (100 мМ, рН 7,5) до получения конечной концентрации РО 4 5 мМ, учитывая фосфат, находящийся в буфере для антигена. Также добавляли Твин 80 (3%) до получения конечной концентрации 0,15%, учитывая Твин, находящийся в буфере для антигена. Эту смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение периода времени от 5 до 15 минут при комнатной температуре. Добавляли PD-Mage3-His (750 мкг/мл) и смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 5-15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли CpGолигонуклеотид с SEQ ID NO: 4 и полученную в результате смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 15 минут (5 мин) при комнатной температуре с получением конечной массы препарата. Доводили рН до рН 7,50,1, используя NaOH 0,05 М или 0,5 М, либо HCl 0,03 М или 0,3 М. Композицию анализировали следующим образом. 0,5 мл этой композиции заполняли в стеклянный флакон, который подвергали циклу лиофилизации,показанному на фиг. 6. Влияние эксципиентов и цикла сублимационной сушки на состав осадка анализировали через 7-9 суток хранения осадка при 37 С. Состояние осадка и остаточная влажность. Видно, что осадки не проявляют какого-либо спадения через 7 суток и не меняются на протяжении 8 суток по их стабильности в стрессовой среде. Остаточная влажность осадков, которые хранят в течение 7-9 суток при 37 С, остается ниже спецификации 3%. Никакого изменения в диаметре не наблюдали после хранения в течение 7-9 суток при 37 С. Затем осадки разводили адъювантной системой А (липосомный адъювант, приготовленный как описано в WO 2005/112991). Никакой агрегации или разрушения белка не наблюдали, подтвердив, таким образом, что антиген можно лиофилизировать совместно с CpG без влияния на его способность к разведению. Была исследована антигенность препарата. Было обнаружено, что после разведения в адъювантной системе А имело место снижение антигенности со временем после 24 ч. Посчитали, что это являлось следствием кислого рН (6,20,1), обнаруженного после разведения. Это подтвердили, когда обнаружили,что падение антигенности было уменьшено при повышении рН. Однако все же имело место некоторое снижение антигенности со временем. Таким образом, эти препараты были протестированы для проверки того, влияет ли это снижение на испытание эффективности in vivo. Разведения 3/10, 1/10 и 1/30 дозы для человека давали группам мышей, 10 мышей на группу, как показано на фиг. 7. У мышей брали кровь на 28 сутки. Т 0, 4 ч и 24 ч представляют собой периоды времени после разведения осадка адъювантной системой А. Как видно из фиг. 7, никакого влияния на эффективность не было. Пример 3. Влияние CpG на растворимость антигена после разведения. 1. WT1 представляет собой белок, сверхэкспрессия которого впервые обнаружена при раке почки у детей, опухоли Вильмса. В антигене-кандидате, применяемом в настоящем случае, используют почти полноразмерный белок в качестве антигена. Белок WT1-A10 представляет собой рекомбинантный слитый белок из 292 аминокислот, экспрессируемый в Е.coli, состоящий из 12-мерной укороченной последовательности tat (лидерной последовательности) и аминокислот 2-281 последовательности WT1. После лиофилизации одного этого антигена он осаждается при разведении адъювантной системой А из-за его изоэлектрической точки (5,85-7,5), которая находится близко к рН адъювантной системы А (6,1), и присутствия хлорида натрия в адъювантной системе А. Готовили два препарата WT1-A10. Доза разведенного препарата содержала 400 мкг/мл антигенаWT1-A10, 10% сахарозу, 100 мМ Трис и 0,2% Твин 80 плюс или минус 840 мкг/мл CpG. Оба препарата разводили 500 мкл адъювантной системы А. Полученную в результате жидкость центрифугировали и проводили Вестерн-блоттинг на нецентрифугированной жидкости (NC), супернатанте (SN) и осадке (Р). Результаты показаны на фиг. 8. Как видно из фиг. 8, в присутствии CpG растворимость антигена после разведения улучшается, о чем свидетельствует отсутствие антигена в осадке. Осажденный антиген можно обнаружить в осадке разведенной лиофилизированной композиции, когда лиофилизированный осадок не содержал CpG. Это свидетельствует о том, что в случае антигена, который не является положительно заряженным, совместная лиофилизация с CpG улучшает растворимость антигена при разведении. 2. PRAME. Готовили два препарата PRAME. Доза разведенного препарата содержала 1000 мкг/мл антигенаPRAME, 3,15% сахарозу, 5 мМ борат, 150 нМ хлорид натрия плюс или минус 840 мкг/мл CpG. Оба препарата разводили 500 мкл адъювантной системы А. Полученную в результате жидкость центрифугировали и проводили Вестерн-блоттинг на не центрифугированной жидкости (NC), супернатанте (SN) и осадке (Р). Результаты показаны на фиг. 9, где NC означает нецентрифугированную жидкость, SN означает супернатант и Р означает осадок. Как видно из фиг. 9, в присутствии CpG растворимость антигена после разведения улучшается, о чем свидетельствует отсутствие антигена в осадке. Осажденный антиген можно обнаружить в осадке разведенной лиофилизированной композиции, когда лиофилизированный осадок не содержал CpG. Это дополнительно свидетельствует о том, что в случае антигена, который не является положительно заряженным, совместная лиофилизация с CpG улучшает растворимость антигена при разведении. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Лиофилизированная композиция для лечения рака, содержащая один или более чем один антиген, который не является положительно заряженным, и CpG-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид, где указанный один или более чем один антиген представляет собой антиген WT-1 (белок опухоли Вильмса) или его производное или фрагмент, где указанное производное в достаточной степени подобно нативным антигенам в сохранении антигенных свойств и сохранении способности обеспечивать иммунный ответ, который должен быть вызван против WT-1, и где указанный фрагмент имеет по меньшей мере 8 аминокислот в длину и способен индуцировать иммунный ответ, который перекрестно реагирует с природным WT-1. 2. Композиция по п.1, где указанный иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит последовательность: пурин, пурин, С, G, пиримидин, пиримидин. 3. Композиция по п.1 или 2, где указанный иммуностимулирующий олигонуклеотид выбран из группы, включающей ТСС ATG ACG ТТС CTG ACG ТТ (SEQ ID NO: 1); ТСТ ССС AGC GTG CGC CAT (SEQ ID NO: 2);TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID NO: 5). 4. Композиция по п.1 или 2, где иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит по меньшей мере два неметилированных повтора CG, разделенных по меньшей мере 3 нуклеотидами. 5. Композиция по п.4, где иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит по меньшей мере два неметилированных повтора CG, разделенных 6 нуклеотидами. 6. Способ изготовления лиофилизированной композиции по любому из пп.1-5, включающий стадии смешивания желаемого антигена и иммуностимулирующего олигонуклеотида с подходящими эксципиентами и осуществления цикла лиофилизации полученного препарата. 7. Способ изготовления иммуногенной композиции, включающий стадии разведения лиофилизированной композиции по любому из пп.1-5 подходящим носителем. 8. Способ по п.7, где указанный носитель представляет собой носитель в форме частиц, выбранный из группы, включающей минеральные соли, эмульсии, полимеры, липосомы, иммуностимулирующие комплексы (ISCOM). 9. Способ по п.7, где указанный носитель представляет собой раствор липосом или эмульсию масло-в-воде. 10. Способ по любому из пп.7-9, где указанный носитель дополнительно содержит один или более чем один иммуностимулятор. 11. Способ по п.10, где указанный один или более чем один иммуностимулятор выбран из группы,состоящей из агонистов Toll-подобного рецептора (TLR4), антагонистов TLR4, сапонинов, агонистовTLR7, агонистов TLR8, агонистов TLR9. 12. Способ по п.11, где указанный антагонист TLR4 представляет собой 3-деацилированный монофосфориллипид A (MPL). 13. Способ по п.11, где указанный сапонин представляет собой QS21. 14. Способ по п.10, где указанный носитель содержит два иммуностимулятора. 15. Способ по п.14, где указанные иммуностимуляторы представляют собой 3-деацилированный Красный=сигнальная последовательность 15 аминокислот Синий=первые 109 аминокислот белка D Розовый=неродственные аминокислоты(MDP первые аминокислоты вируса гриппа)(Met-Asp по аминокислотам 128-129 для создания сайта клонирования)(Gly-Gly по 442-443) Зеленый=фрагмент MAGE3; аминокислоты 3-314 MAGE3 (всего 312 аминокислот) Оранжевый=хвост 7 his Фиг. 5