Конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим tnf-α, и его применение

Настоящее изобретение предоставляет конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим TNF-, причем конструкт включает: (а) однодоменное антитело (dAb), которое связывается с человеческим TNF-; (b) модифицированную последовательность шарнирной области; (с) последовательность константной области тяжелой цепи человека или примата,имеющую усеченный домен CH1 не более чем из 20 остатков, где указанная модифицированная последовательность шарнирной области содержит или делецию, или одну аминокислотную замену по меньшей мере одного цистеинового остатка, который обычно способствует образованию дисульфидной связи между тяжелой и легкой цепями антитела. Дойл Энтони Джерард (AU), Вулвен Бенджамин П., Томлинсон Ян М.,Ли Дженнифер А. (GB), Дженнингз Филип Энтони (AU) Медведев В.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: СЕФАЛОН АСТРАЛИЯ ПТИ ЛТД. 017417 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к конструкту однодоменного антитела, полезному для лечения людей. Более конкретно, настоящее изобретение относится к конструкту однодоменного антитела, который связывается с человеческим TNF-, и к его применению при лечении расстройств, характеризующихся активностью TNF-. Предпосылки изобретения Фактор некроза опухоли альфа (TNF-) представляет собой цитокин, который вовлечен в опосредование шока и патофизиологии разнообразных заболеваний человека и расстройств, включающих сепсис, инфекции, аутоиммунные заболевания, например ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит и другие кишечные заболевания, псориаз, токсический шок, отторжение трансплантата и болезнь"трансплантат против хозяина". TNF- продуцируется, главным образом, активированными макрофагами и Т-лимфоцитами, но также нейтрофилами, эндотелиальными клетками, кератиноцитами и фибробластами во время острых воспалительных реакций.TNF-, ввиду его роли при воспалении, стал важной мишенью для ингибирования при усилиях по снижению симптомов воспалительных заболеваний. Преследуются различные подходы к ингибированию TNF- для клинического лечения заболеваний, включая, в частности, применение растворимых рецепторов TNF- и TNFспецифичных антител. Однодоменные антитела. Однодоменные антитела (dAb) представляют собой самые маленькие функционирующие связывающие единицы антител и соответствуют вариабельным областям или тяжелой (VH), или легкой (VL) цепей антител. Однодоменные антитела имеют молекулярную массу приблизительно 13 кДа или менее одной десятой размера полного антитела. В отличие от обычных антител однодоменные антитела хорошо экспрессируются в системах бактерий, дрожжей и млекопитающих. Их малый размер дает возможность получения более высоких молярных количеств на грамм продукта, обеспечивая, таким образом, значительное увеличение активности на миллиграммовую дозу. Кроме того, dAb можно использовать в качестве строительных блоков для создания терапевтических продуктов, таких как dAb-содержащие молекулы множественного нацеливания, в которых два или более dAb связываются с двумя или более определенными молекулярными мишенями,или dAb могут быть включены в структуры, предназначенные для легочного или перорального введения. Заявители в настоящее время разработали новый конструкт однодоменного антитела, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина, соединенный с константной областью, включающей усеченный домен СН 1. Считают, что включение константной области поможет продлить период полужизни in vivodAb, который обычно имеет короткую продолжительность. Иммуноглобулин приматов Нового Света. Эволюционно отдаленные приматы, такие как приматы Нового Света, по существу, подобны человеку в отношении наличия антител, аналогичных человеческим антителам, так что хозяин не генерирует иммунный ответ против антитела, когда такие антитела, полученные от приматов, вводят человеку. Приматы Нового Света (подотряд Platyrrhini) включают по меньшей мере 53 вида, обычно разделенные на два семейства, Callithricidae и Cebidae. Callithricidae состоят из игрунок и тамаринов. Cebidae включают беличьих обезьян, прыгунов, паукообразных обезьян, шерстистых обезьян, капуцинов, ночных или совиных обезьян и ревунов. Предыдущие исследования характеризовали экспрессированный репертуар тяжелой цепи иммуноглобулина игрунки Callithrix jacchus (von Budingen II.-C. et al., Characterization of the expressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Callithrix jacchus. Immunogenetics; 53:557-563(2001. Были идентифицированы шесть подгрупп IGHV, которые проявили высокую степень аналогии последовательности с их человеческими копиями IGHV. Каркасные области были более сохранными по сравнению с областями, определяющими комплементарность (CDR), при наибольшей степени вариабельности, локализованной в CDR3. Степень аналогии между С.jacchus и последовательностями IGHV человека была меньше, чем между обезьянами Старого Света и людьми. Сущность изобретения В первом аспекте настоящее изобретение предоставляет конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим TNF-, причем конструкт включает:(b) модифицированную последовательность шарнирной области;(c) последовательность константной области тяжелой цепи человека или примата, имеющую усеченный домен СН 1 не более чем из 20 остатков, более предпочтительно не более чем из 10 остатков, еще более предпочтительно не более чем из 5 остатков и даже более предпочтительно из одного остатка; где указанная модифицированная последовательность шарнирной области содержит или делецию,или одну аминокислотную замену цистеинового остатка, который обычно способствует образованию дисульфидной связи между тяжелой и легкой цепями антитела. Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет последовательность нуклеиновой кисло-1 017417 ты, кодирующую конструкт однодоменного антитела по первому аспекту изобретения. В третьем аспекте настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую конструкт однодоменного антитела, который связывает человеческий TNF-, где молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичную,более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности,представленной в SEQ ID No: 50 или SEQ ID No: 51, и наиболее предпочтительно последовательность,представленную в SEQ ID No: 50 или SEQ ID No: 51. В четвертом аспекте настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую конструкт однодоменного антитела, который связывает человеческий TNF-, где молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой строгости с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID No: 50 или SEQ ID No: 51. В пятом аспекте изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество конструкта однодоменного антитела в соответствии с первым аспектом вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. В шестом аспекте настоящее изобретение предусматривает применение конструкта однодоменного антитела в соответствии с пятым аспектом изобретения при диагностике для выявления человеческогоTNF-. В седьмом аспекте изобретение предоставляет способ лечения расстройства, характеризующегося активностью человеческого TNF- у индивидуума-человека, включающий введение индивидууму фармацевтической композиции в соответствии со вторым аспектом изобретения. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана аминокислотная (SEQ ID No: 5) и нуклеотидная последовательность (SEQ IDNo: 6) акцепторного dAb. На фиг. 2 показана структура предпочтительного варианта осуществления конструкта однодоменного антитела в соответствии с настоящим изобретением в виде (А) мономера и (В) димера. На фиг. 3 показаны нуклеотидная и аминокислотная последовательности сегментов гена V одиннадцати (11) игрунок и шести (6) совиных обезьян. На фиг. 4 показана аминокислотная (SEQ ID No: 5) и нуклеотидная последовательности акцепторного dAb (обеих нитей; SEQ ID No: 6 и 68). На чертеже показаны рестрикционные сайты переваривания для Kpn I и San DI, которые осуществляют удаление области, включающей CDR2. Удаленные остаткиCDR2 указаны подчеркиванием. На фиг. 5 показана способность соединения 170 (SEQ ID No: 11) нейтрализовать опосредованнуюTNF- цитотоксичность при анализе жизнеспособности мышиных клеток L929. На фиг. 6 показано, что соединение 170 (SEQ ID No: 11) предотвращает взаимодействие TNF- с рецепторами р 55 или р 75 человеческого TNF. На фиг. 7 показано окрашивание соединением 170 (SEQ ID No:11) клеток NSO 27D4, экспрессирующих трансмембранный TNF- (сплошная черная линия), проявляющих более высокую интенсивность флуоресценции, чем нерелевантный, подобранный по изотипу специфичности контроль (серая закраска). На фиг. 8 показано, что соединение 170 (SEQ ID No: 11), продуцируемое в бактериальной экспрессионной системе, сохраняет связывание с TNF- в ELISA. На фиг. 9 показана эффективность соединения 170 (SEQ ID No: 11) на мышиной модели TNFопосредованного артрита относительно человеческого IgG1, регулирующего специфичность. Через еженедельные интервалы у мышей проводили балльную оценку (балльная оценка артрита),А, и их взвешивали, В. На фиг. 10 показано влияние на экспрессию белка соединения 112 (SEQ ID No: 59) и соединения 170 (SEQ ID No: 11). На фиг. 11 показан невосстанавливающий анализ SDS PAGE соединения 170 (SEQ ID No: 11), очищенного белком А, из 410 л ферментаций лидерной клеточной линии; полоса 1 = контроль между анализами; полоса 2 = маркеры молекулярной массы; полоса 3 = контроль; полоса 4 = соединение 170 (SEQID No: 11), очищенное белком А, в 10 л ферментационной ID (цикл 1); полоса 5 = соединение 170, очищенное белком А, в 10 л ферментационной ID (цикл 2); полоса 6 = соединение 170, очищенное белком А,в 10 л ферментационной ID (цикл 3); полоса 7 = соединение 170, очищенное белком А, в 10 л ферментационной ID (цикл 4). На фиг. 12 показан восстанавливающий анализ SDS PAGE соединения 170 (SEQ ID No: 11), очищенного белком А, из 410 л ферментаций лидерной клеточной линии; полоса 1 = контроль между анализами; полоса 2 = маркеры молекулярной массы; полоса 3 = контроль; полоса 4 = соединение 170 (SEQID No: 11), очищенное белком А, в 10 л ферментационной ID (цикл 1); полоса 5 = соединение 170, очищенное белком А, в 10 л ферментационной ID (цикл 2); полоса 6 = соединение 170, очищенное белком А,-2 017417 в 10 л ферментационной ID (цикл 3); полоса 7 = соединение 170, очищенное белком А, в 10 л ферментационной ID (цикл 4). Подробное описание изобретения Заявители создали конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим TNFи который, как указано, проявляет низкую иммуногенность при введении людям. Конструкт однодоменного антитела включает часть, соответствующую вариабельному домену тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина (т.е. однодоменное антитело (dAb, шарнирную область и часть, соответствующую константной области тяжелой цепи антитела, но где константная область имеет усеченный домен СН 1. Указывается, что включение константной области увеличивает период полужизни dAb in vivo, а также обеспечивает эффекторные функции, которые, как считают, являются компонентом противовоспалительного механизма антител против TNF. В первом аспекте настоящее изобретение предоставляет конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим TNF-, причем конструкт включает:(a) однодоменное антитело (dAb), которое связывается с человеческим TNF-,(b) модифицированную последовательность шарнирной области;(c) последовательность константной области тяжелой цепи человека или примата, имеющую усеченный домен СН 1 не более чем из 20 остатков, более предпочтительно не более чем из 10 остатков, еще более предпочтительно не более чем из 5 остатков и даже более предпочтительно из одного остатка; где указанная модифицированная последовательность шарнирной области содержит или делецию,или одну аминокислотную замену цистеинового остатка, который обычно способствует образованию дисульфидной связи между тяжелой и легкой цепями антитела. В предпочтительном варианте осуществления последовательность домена СН 1 и шарнирная область представляют собой XEPKSZDKTIITCPPCPA, где X обозначает валин, лейцин или изолейцин, a Z отсутствует или обозначает аминокислоту, отличную от цистеина. Предпочтительно, чтобы X был валином, aZ был серином. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения dAb содержит вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, где указанный вариабельный домен включает по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (CDR), имеющую последовательность,полученную от примата Нового Света, где CDR выбрана из группы, состоящей из AATKLQS (SEQ IDNo: 1), EASSLQS (SEQ ID No: 2), EASKLQS (SEQ ID No: 3) и SASNLET (SEQ ID No: 4). В другом предпочтительном варианте осуществления CDR представляет собой CDR2. В предпочтительном варианте осуществления dAb имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из: и последовательность, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96, 97,98 или 99% идентичную одной из этих последовательностей. В еще одном предпочтительном варианте осуществления константная область включает домены СН 2 и СН 3, которые вместе имеют следующую последовательность: или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей. В другом предпочтительном варианте осуществления конструкт однодоменного антитела включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, представленной в SEQ ID No: 11, а наиболее предпочтительно последовательность,представленную в SEQ ID No: 11. Используемый в настоящем документе термин "связывается с" предназначен для указания связывания антигена вариабельной областью иммуноглобулина с константой диссоциации (Kd), составляющей 1 мкМ или ниже, по данным измерения анализом поверхностного плазмонного резонанса с использованием, например, устройства поверхностного плазмонного резонанса BIAcore и программного обеспечения кинетической оценки BIAcore (например, версии 2.1). Константа сродства или диссоциации (Kd) для взаимодействия в виде специфического связывания составляет предпочтительно примерно 500 нМ или ниже, более предпочтительно примерно 300 нМ или ниже и предпочтительно по меньшей мере от 300 нМ до 50 пкМ, от 200 нМ до 50 пкМ и более предпочтительно по меньшей мере от 100 нМ до 50 пкМ, от 75 нМ до 50 пкМ, от 10 нМ до 50 пкМ. Используемый в настоящем документе термин "dAb" относится к полипептиду одного вариабельного домена антитела (VH или VL), который специфически связывает антиген. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конструкт однодоменного антитела образует гомо- или гетеродимер с другим конструктом однодоменного антитела в соответствии с настоящим изобретением. Димеризация может увеличить прочность связывания антигена, где сила связывания зависит от суммы величин сродства связывания множественных сайтов связывания. Для содействия образованию димера шарнирная область конструкта однодоменного антитела включает по меньшей мере один, а предпочтительно два цистеиновых остатка. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конструкт однодоменного антитела образует гомодимер с идентичным конструктом однодоменного антитела. Соответственно в другом аспекте настоящее изобретение предоставляет димерный конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим TNF-, где димер состоит из двух конструктов однодоменного антитела в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно, чтобы димерный конструкт однодоменного антитела представлял собой гомодимер и особенно предпочтительно, чтобы конструкты однодоменного антитела, составляющие гомодимер,включали аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98% или 99% идентична последовательности, представленной в SEQ ID No: 11, и наиболее предпочтительно последовательность, представленную в SEQ ID No: 11. Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую конструкт однодоменного антитела по первому аспекту изобретения. В третьем аспекте настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую конструкт однодоменного антитела, который связывает человеческий TNF-, где молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичную,более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности,представленной в SEQ ID No: 50 или SEQ ID No: 51, и наиболее предпочтительно последовательность,представленную в SEQ ID No: 50 или SEQ ID No: 51. В четвертом аспекте настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую конструкт однодоменного антитела, который связывает человеческий TNF-, где молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой строгости с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID No: 50 или SEQ ID No: 51. При определении того, входят ли две полипептидные последовательности в пределы процентной доли идентичности или нет, специалистам в данной области известно, что необходимо провести параллельное сравнение или множественное выравнивание последовательностей. При таких сравнениях или выравниваниях возникнут различия в расположении неидентичных остатков, в зависимости от алгоритма, используемого для выполнения выравнивания. В настоящем контексте ссылку на "идентичность в процентах" или "сходство" между двумя или более аминокислотными последовательностями следует-4 017417 воспринимать как указание на количество соответственно идентичных и аналогичных остатков между указанными последовательностями, как определено с использованием любого стандартного алгоритма,известного специалистам в данной области. Например, значения идентичности или сходства аминокислотных последовательностей можно рассчитать, используя программу GAP, и/или выровнять с использованием программы PILEUP Computer Genetics Group, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin,United States of America (Devereaux et al., 1984). В программе GAP используется алгоритм Needleman andWunsch (1970) для максимизации количества идентичных/сходных остатков и для минимизации количества и длины гэпов последовательностей при выравнивании. Альтернативно или дополнительно, при сравнении более чем двух аминокислотных последовательностей используется программа Clustal W изThompson et al. (1994). При определении того, входят ли две нуклеотидные последовательности в пределы процентной доли идентичности или нет, специалистам в данной области известно, что необходимо провести параллельное сравнение или множественное выравнивание последовательностей. При таких сравнениях или выравниваниях возникнут различия в расположении неидентичных остатков, в зависимости от алгоритма, используемого для выполнения выравнивания. В настоящем контексте ссылку на идентичность в процентах между двумя или более нуклеотидными последовательностями следует воспринимать как указание на количество идентичных остатков между указанными последовательностями, как определено с использованием любого стандартного алгоритма, известного специалистам в данной области. Например,нуклеотидные последовательности можно выровнять и их идентичность можно рассчитать, используя программу BESTFIT или другую соответствующую программу Computer Genetics Group, Inc., UniversityResearch Park, Madison, Wisconsin, United States of America (Devereaux et al., Nucl. Acids Res., 12:387-395,1984). Высокая строгость предпочтительно включает гибридизацию в условиях 65 С и 0,1SSC(1SSC=0,15 M NaCl, 0,015 М цитрат Na3 pH 7,0). В одном варианте осуществления изобретение далее основано на способе амплификации генов вариабельной области иммуноглобулина приматов Нового Света, например путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) из нуклеиновой кислоты, экстрагированной из лимфоцитов приматов Нового Света с использованием праймеров, специфичных для семейств генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи. Например, данные относительно границ вариабельных доменов генов тяжелой и легкой цепи (соответственно VH и VL) можно использовать для конструирования праймеров ПЦР, которые амплифицируют вариабельный домен из кодирующей тяжелую или легкую цепь клонированной последовательности,кодирующей антитело, которое, как известно, связывает данный антиген. Затем амплифицированная вариабельная область вставляется или отдельно, или в виде слияния с другой полипептидной последовательностью последовательности константной области человека или примата по изобретению, в подходящий вектор экспрессии для получения конструкта однодоменного антитела по изобретению. Подходящие векторы экспрессии известны специалистам в данной области. Репертуар доменов VH, VL и константной области может представлять собой природный репертуар последовательностей иммуноглобулина или синтетический репертуар. Природный репертуар представляет собой репертуар, полученный, например, из экспрессирующих иммуноглобулин клеток, собранных из культуры клеток от одного или нескольких приматов. Такие репертуары могут быть "наивными", т.е. полученными из только что родившихся клеток, экспрессирующих иммуноглобулин, или реаранжированными, т.е. полученными, например, из В-клеток взрослых приматов. При желании, клоны, идентифицированные из природного репертуара или любого репертуара, которые связывают антиген-мишень, затем подвергаются мутагенезу и дальнейшему скринингу для получения и выбора вариантов с улучшенными характеристиками связывания. Синтетические репертуары одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина получают искусственным введением разнообразия в клонированный вариабельный домен. Можно провести скрининг репертуара доменов VH и VL для выявления желаемой специфичности связывания и функционального поведения, например методом фагового дисплея. Методы конструирования бактериофаг-дисплейных библиотек и библиотек экспрессии фага лямбда хорошо известны в данной области. Технология фагового дисплея широко описана в данной области и примеры способов и соединений для создания и скрининга таких библиотек и их продуктов аффинного созревания можно найти,например, в документах Barbas et al. (1991), PNAS 88:7978-7982; Clarkson et al. (1991), Nature 352:624628; Dower et al. PCT 91/17271, Patent No. 5427908, U.S. Patent No. 5580717 и ЕР 527839; Fuchs et al.PCT WO 92/20791 and EP 368684. Рекомбинантные библиотеки, экспрессирующие репертуар доменов VH и VL, могут быть экспрессированы на поверхности микроорганизмов, например дрожжей или бактерий (см. публикации PCTWO 99/36569 и 98/49286). Конструкт однодоменного антитела по изобретению можно получить рекомбинантным методом,включая получение из эукариотических систем экспрессии, включающих, например, клетки дрожжей,высших растений, насекомых и млекопитающих, а также грибы и кодированные вирусами системы экспрессии, как описано в настоящем документе или как известно в данной области. Конструкты однодоменного антитела по настоящему изобретению можно получить, используя Sантитело, кодирующее нуклеиновую кислоту, для обеспечения клеток трансгенных растений и культивированных растений (например, без ограничения, табака и кукурузы), которые продуцируют такие конструкты в частях растений или в клетках, культивированных из них. В качестве неограничивающего примера, листья трансгенного табака, экспрессирующие рекомбинантные белки, успешно использовали для обеспечения больших количеств рекомбинантных белков, например, с использованием индуцируемого промотора (см., например, Cramer et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240:95-118, 1999 и приведенные в нем ссылки). Также на уровнях промышленной продукции использовали трансгенную кукурузу для экспрессии белков млекопитающих с биологической активностью, эквивалентной белкам, продуцированным в других рекомбинантных системах или очищенным из природных источников (см., например,Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147, 1999 и приведенные в нем ссылки). Антитела также получали в больших количествах из семян трансгенных растений, включая фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела (scFv), включая семена табака и клубни картофеля (см., например, Conrad et al.,Plant Mol. Biol. 38:101-109, 1998 и приведенные в нем ссылки). Таким образом, конструкты однодоменного антитела по настоящему изобретению можно также получить, используя трансгенные растения, в соответствии с известными методами (см. также, например, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 October, 1999; MaHein., Trends Biotechnol. 13:522-7, 1995; Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6,1995; Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944, 1994; и приведенные в них ссылки; каждая из приведенных выше ссылок полностью включена в настоящий документ путем ссылки). Конструкты однодоменного антитела по настоящему изобретению включают естественно очищенные продукты, продукты методов химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами от эукариотического хозяина, включая, например, клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в методе рекомбинантной продукции, конструкты антитела по настоящему изобретению могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными, причем предпочтительны гликозилированные продукты. Такие методы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989, Sections 17.37-17.42; Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1987-1093, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20, Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John WileySons, NY, N.Y. 1997-2001, Protein Science, Chapters 12-14, все полностью включенные в настоящий документ путем ссылки. В одной системе экспрессии библиотека рекомбинантного пептида/белка проявляется на рибосомах(например, см. Roberts, R.W. and Szostak, J.W. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12297-123202 и публикацию РСТ No. WO 98/31700). Таким образом, другой пример включает создание и транскрипцию invitro библиотеки ДНК (например, из антител или производных, предпочтительно полученных из иммунизированных клеток, но без такого ограничения), трансляцию библиотеки так, чтобы белок и "иммунизированные" мРНК оставались на рибосомах, отбор по сродству (например, связыванием с RSP), выделение мРНК, обратную трансляцию и последующую амплификацию (например, с помощью полимеразной цепной реакции или родственной технологии). При необходимости, можно соединять дополнительные циклы отбора и амплификации для созревания сродства посредством введения соматической мутации в этой системе или другими способами созревания сродства, как известно в данной области. Другим примером является применение технологии компартментализации эмульсии для генерирования однодоменных антител по изобретению. При компартментализации эмульсии способы in vitro и оптической сортировки комбинируют с совместной компартментализацией транслированного белка и его кодирующей нуклеотиды последовательности в водной фазе внутри капельки масла в эмульсии (см. публикации РСТWO 99/026711 и WO 00/40712). Последовательности CDR можно получить из нескольких источников, например, баз данных, таких как базы данных белков и нуклеотидов Национального центра биотехнологической информацииwww.ncbi.nlm.nih.gov, база данных Kabat последовательностей белков, представляющих иммунологический интерес, www.kabatdatabase.com или база данных IMGT www.imgt.cines.fr. Альтернативно, областиCDR можно прогнозировать по репертуару доменов VH и VL (см., например, Kabat E.A. and Wu T.T. Attempts to locate complementarity determining residues in the variable positions of light and heavy chains. Ann.NY Acad. Sci. 190:382-393 (1971. Последовательность CDR может представлять собой геномную ДНК или кДНК.-6 017417 Существует ряд путей, которыми заместительная CDR может быть трансплантирована в последовательность вариабельной области, и такие способы должны быть знакомы специалистам в данной области. Предпочтительный способ по настоящему изобретению включает замену CDR2 в вариабельной области (или dAb) посредством направленного мутагенеза с использованием праймера. Этот способ состоит из отжига синтетического олигонуклеотида, кодирующего желательную мутацию (мутации), с областью-мишенью, где он служит в качестве праймера для инициации синтеза ДНК in vitro, удлинения олигонуклеотида ДНК-полимеразой для генерирования двухнитевой ДНК, которая несет желательную мутацию, и лигирования и клонирования последовательности в соответствующий вектор экспрессии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность CDR приматов Нового Света трансплантируется в последовательность вариабельной области, которая имеет низкую иммуногенность у людей. При ссылке на термин "низкая иммуногенность" подразумевается, что конструкт однодоменного антитела или его антигенсвязывающая часть не вызывает у человека силу реакции антитела, достаточную для снижения эффективности продолжительного введения конструкта однодоменного антитела в течение времени, достаточного для достижения терапевтической эффективности. Предпочтительно последовательность вариабельной области, в которую трансплантируется CDR примата Нового Света, представляет собой "акцепторную последовательность dAb" (обозначенную соединением 128) на фиг. 1. Акцепторная последовательность dAb состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No: 5: Эта последовательность кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения последовательностьCDR примата Нового Света игрунки SASNLET (SEQ ID No: 4) трансплантируется в вариабельную область акцепторной последовательности dAb с тем, чтобы заместить последовательность CDR2(SASELQS; SEQ ID No: 55) акцепторной последовательности dAb для продуцирования следующего dAb Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления dAb конструкта однодоменного антитела, которое связывается с человеческим TNF-, включает аминокислотную последовательность,представленную в SEQ ID No: 7. В объем настоящего изобретения входит то, что последовательность вариабельной области (dAb) конструкта однодоменного антитела может далее подвергаться аффинному созреванию для улучшения его антигенсвязывающих характеристик. Это может вызвать необходимость модификации определенных аминокислотных остатков в пределах CDR1, CDR3 или каркаса конструкта однодоменного антитела. Например, SEQ ID No: 7 подвергали аффинному созреванию, как изложено в разделе "Материалы и методы", и испытывали на TNFсвязывание. В еще одном предпочтительном варианте осуществления вариабельная область (dAb) конструкта однодоменного антитела, который связывается с человеческимTNF-, включает аминокислотную последовательность SEQ ID No: 8 или SEQ ID No: 9. Они были обозначены соответственно как соединение 123 и соединение 100, и их последовательности показаны ниже. Соединение 123 В особенно предпочтительном варианте осуществления вариабельная область (dAb) конструкта однодоменного антитела, который связывается с человеческим TNF-, включает аминокислотную последовательность SEQ ID No: 10. Она была обозначена как соединение 196, и последовательность представлена ниже. Соединение 196 Специалисту в данной области должно быть понятно, что последовательность константной области конструкта однодоменного антитела можно получить из последовательностей человека или примата. Последовательность примата может быть от примата Нового Света или от примата Старого Света. Подходящие приматы Старого Света включают шимпанзе или другую человекообразную обезьяну, например гориллу или орангутанга, которые благодаря их тесной филогенетической близости к людям разделяют высокую степень гомологии с последовательностью константной области человека. Предпочтительно константная область получена из последовательности человеческого антитела. Примеры таких последовательностей можно найти в базе данных белков и нуклеотидов Национального центра биотехнологической информации www.ncbi.nlm.nih.gov и в базе данных Kabat последовательностей белков,представляющих иммунологический интерес, www.kabatdatabase.com, или в базе данных IMGTwww.imgt.cines.fr. При проектировании конструкта однодоменного антитела по настоящему изобретению заявители производили усечение домена СН 1 константной (Fc) области. Минимальное количество остатков домена СН 1 сохраняли для обеспечения гибкости в конструкте однодоменного антитела вокруг шарнирной области. Предпочтительно сохраняются по меньшей мере 20 С-терминальных аминокислотных остатков домена CH1, более предпочтительно по меньшей мере 10 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 5 аминокислот, даже более предпочтительно один аминокислотный остаток. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления конструкт однодоменного антитела имеет формат, включающий остаток dAb-C-концевого домена CH1-шарнирная область-домен CH2-домен СН 3, как схематически проиллюстрировано на фиг. 2. В особенно предпочтительном варианте осуществления конструкт однодоменного антитела имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No: 11. Она обозначена как соединение 170. Соединение 170 Шарнирная область природного иммуноглобулина содержит цистеиновую (С) боковую цепь, которая содействует образованию дисульфидной связи между доменом СН 1 тяжелой цепи и константным доменом легкой цепи. Благодаря тому что конструкт включает только один вариабельный домен и, таким образом, оставляет потенциально реактивный неспаренный цистеиновый остаток, цистеиновый остаток был замещен аминокислотным остатком, который предотвращает образование дисульфидной связи. Потенциальные последствия наличия неспаренного цистеина могут включать пониженную экспрессию белка за счет агрегации и ошибочной укладки конструкта. Следует понимать, что любая последовательность шарнирной области, полученная из любого класса антител, была бы целесообразна для использования в настоящем изобретении. Однако предпочтительно, чтобы шарнирная область была получена из подкласса антител IgGI. Предпочтительно шарнирная область основана на природной последовательности шарнирной области IgGI и включает последовательность(SEQ ID No: 12). В этой последовательности Cys, который обычно встречается в положении 5, заменен подчеркнутым, выделенным жирным шрифтом остатком Ser. Предпочтительно С-концевой аминокислотный остаток домена CH1 получен из IgG1. Более предпочтительно остаток СН 1 представляет собой остаток валина (V) или консервативное аминокислотное замещение, такое как лейцин (L) или изолейцин (I). Этот остаток расположен непосредственно прокси-8 017417 мально к шарнирной области и содействует увеличению гибкости конструкта вокруг шарнирной области. Последовательности доменов СН 2 и СН 3 предпочтительно получены из базы данных Swissprot под номером доступа РО 1857: Конструкт однодоменного антитела может быть дериватизирован или связан с другой функциональной молекулой. Например, конструкт однодоменного антитела может быть функционально связан химической связью, генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или иным образом с одной или несколькими другими молекулярными объектами, такими как другое антитело, детектируемый агент,цитотоксический агент, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, который может опосредовать ассоциацию антитела или антитело-связывающую часть с другой молекулой (такой как сердцевинная область стрептавидина или полигистидиновая метка). Полезные детектируемые агенты, которыми может быть дериватизирован конструкт однодоменного антитела, включают флуоресцентные соединения. Иллюстративные флуоресцентные детектируемые агенты включают флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, хлорид 5-диметиламин-1 нафталинсульфонила, фикоэритрин и т.п. Конструкт однодоменного антитела также может быть дериватизирован детектируемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозоксидаза и тому подобное. Когда конструкт однодоменного антитела дериватизирован детектируемым ферментом, его выявляют добавлением дополнительных реагентов, которые фермент использует для продукции детектируемого продукта реакции. Конструкт однодоменного антитела также может быть дериватизирован биотином и выявлен посредством косвенного метода измерения содержания авидина или связывания стрептавидина. Конструкт однодоменного антитела в соответствии с изобретением может быть связан с одной или несколькими молекулами, которые обеспечивают увеличенный период полужизни и устойчивость к разрушению без потери активности (например, сродства связывания) in vivo. Эти молекулы могут быть связаны с конструктом однодоменного антитела посредством линкера так, что они не мешают/стерически не препятствуют сайту связывания антигена. Эти молекулы аддукта включают, например, dAb, направленные на эндогенную молекулу, как описано в заявке на патент США 20050271663. Обычно такие молекулы аддукта представляют собой полипептиды или фрагменты полипептидов, которые встречаются в природе in vivo и которые препятствуют разрушению или удалению за счет эндогенных механизмов. Молекулы, которые увеличивают период полужизни, могут быть выбраны из следующих:(a) белки из внеклеточной матрицы, например коллаген, ламинин, интегрин и фибронектин;(b) белки, обнаруживаемые в крови, например фибрин, макроглобулин -2, сывороточный альбумин, фибриноген А, фибриноген В, сывороточный амилоидный белок А, гептаглобин, белок, убиквитин,утероглобулин, макроглобулин -2, плазминоген, лизоцим, цистатин С, альфа-1-антитрипсин и ингибитор панкреатического кипсина;(f) белки, обнаруживаемые в гематоэнцефалическом барьере или в нервных тканях, например рецептор меланокортина, миелин, транспортер аскорбата;(g) слитые белки из лиганда, специфичного для рецептора трансферрина, и нейрофармацевтического агента (см. US5977307); рецептор эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, трансферрин,рецептор трансферрина, инсулин, рецептор инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), рецептор инсулиноподобного фактора роста-2 (IGF-2), рецептор инсулина;(h) белки, локализованные в почках, например, полицистин, коллаген IV типа, транспортер органических анионов K1, антиген Heymann;(m) белки, локализованные в легких, например секреторный компонент (связывает IgA);(p) костно-специфические белки, такие как костные морфогенные белки (BMP), например, ВМР-2,-4, -5, -6, -7 (также именуемые как остеогенный белок (ОР-1) и -8 (ОР-2);(q) опухолеспецифические белки, например человеческий трофобластный антиген, рецептор гер-9 017417 цептина, рецептор эстрогена, катепсины, например катепсин В (обнаруживаемый в печени и селезенке);(r) белки, специфичные для заболевания, например антигены, экспрессированные только на активированных Т-клетках, включающие LAG-3 (ген активации лимфоцитов); лиганд остеопротегерина(OPGL), см. Kong Y.Y. et al., Nature (1999) 402, 304-309; OX40 (член семейства рецепторов TNF, экспрессированных на активированных Т-клетках, и единственная совместно стимулирующая Т-клеточная молекула, которая, как известно, подвергается специфической стимулирующей регуляции в клетках, продуцирующих вирус человеческого Т-клеточного лейкоза I типа (HTLV-1) - см. Pankow R et al. J. Immunol.CG6512 Drosophila, человеческий параплегин, человеческий FtsH, человеческий AFG3L2, мышиный ftsH,ангиогенный фактор роста, включая кислотный фактор роста фибробласта (FGF-1), основный фактор роста фибробласта (FGF-2), сосудистый эндотелиальный фактор роста/фактор сосудистой проницаемости (VEGF/VPF), трансформирующий фактор роста- (TGF-), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-),ангиогенин, интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-8 (IL-8), эндотелиальный фактор роста, полученный из тромбоцитов (PD-ECGF), плацентарный фактор роста (PIGF), полученный из тромбоцитов фактор ростаВВ (PDGF), фракталкин;(t) белки, участвующие в транспорте Fc. Настоящее изобретение также распространяется на пэгилированный конструкт однодоменного антитела, который обеспечивает увеличенный период полужизни и устойчивость к разрушению без потери активности (например, сродства связывания) относительно полипептидов не пэгилированного антитела. Конструкт однодоменного антитела можно соединить с молекулами полимера (предпочтительноPEG (ПЭГ, используя известные в данной области способы, применяемые для достижения свойств увеличенного периода полужизни и устойчивости к разрушению. Полимерные фрагменты, которые могут быть использованы в изобретении, могут быть синтетическими или природными и включают, но не ограничиваются ими, неразветвленные или разветвленные полиалкиленовые, полиалкениленовые или полиоксиалкиленовые полимеры, или разветвленный или неразветвленный полисахарид, такой как гомоили гетерополисахарид. Предпочтительные примеры синтетических полимеров, которые могут быть использованы в изобретении, включают разветвленный или неразветвленный поли(этиленгликоль) (ПЭГ),поли(пропиленгликоль) или поли(виниловый спирт) и их производные или замещенные формы. Особенно предпочтительные замещенные полимеры для соединения с конструктом однодоменного антитела включают замещенный ПЭГ, включая метокси(полиэтиленгликоль). Природные полимерные фрагменты,которые можно использовать в дополнение или вместо ПЭГ, включают лактозу, амилозу, декстран или гликоген, а также их производные, которые известны специалистам в данной области. Полимерные (ПЭГ) молекулы, которые могут быть использованы в изобретении, можно прикреплять к конструкту однодоменного антитела, используя способы, которые хорошо известны в данной области. Первая стадия прикрепления ПЭГ или других полимерных фрагментов к конструкту однодоменного антитела по изобретению представляет собой замещение гидроксильных концевых групп полимера ПЭГ функциональными группами, содержащими электрофил. В частности, полимеры ПЭГ прикреплены или к цистеиновым остаткам, или к лизиновым остаткам в мономерах или мультимерах конструкта однодоменного антитела. Цистеиновые и лизиновые остатки могут быть природными или могут быть включены методами генной инженерии в молекулу конструкта однодоменного антитела. Пэгилирование конструкта однодоменного антитела по изобретению можно осуществить любым путем (см., например, Kozlowski-AHarris-J.M. (2001), Journal of Controlled Release 72:217). ПЭГ может быть прикреплен к конструкту однодоменного антитела или непосредственно, или промежуточным линкером. Безлинкерные системы для прикрепления полиэтиленгликоля к белкам описаны в публикацияхDelgado et al. (1992), Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304; Francis et al. (1998), Intern. J. Hematol. 68:1-18; US 4002531; US 5349052; WO 95/06058; WO 98/32466, описания каждого из которых включены в настоящий документ путем ссылки. В одной из систем для прикрепления полиэтиленгликоля непосредственно к аминокислотным остаткам белков без промежуточного линкера используется трезилированный МПЭГ, который продуцируется путем модификации монометоксиполиэтиленгликоля (МПЭГ) с использованием трезилхлорида. После взаимодействия аминокислотных остатков с трезилированным МПЭГ, полиэтиленгликоль непосредственно прикрепляется к аминогруппам. Таким образом, изобретение включает конъюгаты "белокполиэтиленгликоль", продуцируемые взаимодействием белков по изобретению с молекулой полиэтиленгликоля, имеющей 2,2,2-трифторэтансульфонильную группу. Полиэтиленгликоль может также быть прикреплен к белкам с использованием ряда различных промежуточных линкеров. Например, в патенте США 5612460 раскрыты уретановые линкеры для соединения полиэтиленгликоля с белками. Конъюгаты "белок-полиэтиленгликоль", где полиэтиленгликоль прикреплен к белку линкером, можно также получить взаимодействием белков с такими соединениями, как МПЭГ-сукцинимидилсукцинат, МПЭГ, активированный 1,1'-карбонилдиимидазолом, МПЭГ 2,4,5-трихлорфенилкарбонат, МПЭГ-п-нитрофенолкарбонат и различные производные МПЭГ-сукцината. Ряд дополнительных производных полиэтиленгликоля и химизм реакций для прикрепления полиэти- 10017417 ленгликоля к белкам раскрыты в документе WO 98/32466, полное описание которого включено в настоящий документ путем ссылки. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конструкт однодоменного антитела непосредственно связан с полиэтиленгликолем через лизиновый остаток. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конструкт однодоменного антитела непосредственно связан с ПЭГ через цистеиновый остаток. Неспаренный цистеиновый остаток может предварительно существовать в последовательности, может быть добавлен включением цистеинового остатка, например, в С-конец конструкта однодоменного антитела. Альтернативно, прикреплению ПЭГ к конструкту однодоменного антитела можно содействовать посредством связанного дисульфидной связью цистеина, такого как цистеин, описанный в документе US 20060210526. Другие дериватизированные формы полимерных молекул включают, например, производные, которые имеют дополнительные фрагменты или реактивные группы, присутствующие в них, для обеспечения возможности взаимодействия с аминокислотными остатками описанного в настоящем документе конструкта однодоменного антитела. Такие производные включают активные сложные эфиры Nгидроксисукцинимида (NHS), полимеры сукцинимидилпропионата и сульфгидрил-селективные реактивные агенты, такие как малеимид, винилсульфон и тиол. Полимеры ПЭГ могут представлять собой линейные молекулы или могут быть разветвленными, где множественные фрагменты ПЭГ присутствуют в одном полимере. Реактивная группа (например, MAL, NHS, SPA, VS или тиол) может быть прикреплена непосредственно к полимеру ПЭГ через линкерную молекулу. Размер полимеров, используемых в изобретении, может находиться в диапазоне от 500 Да до 60 кДа, например от 1000 Да до 60 кДа, от 10 до 60 кДа, от 20 до 60 кДа, от 30 до 60 кДа, от 40 до 60 кДа и до 50-60 кДа. Полимеры, используемые в изобретении, в частности ПЭГ, могут представлять собой полимеры с прямой цепью или могут иметь разветвленную конформацию. В еще одном варианте осуществления конструкт однодоменного антитела в соответствии с первым аспектом может быть мультимеризован, как, например, гетеро- или гомодимеры, гетеро- или гомотримеры, гетеро- или гомотетрамеры или гетеро- или гомомультимеры более высокого порядка. Мультимеризация может увеличить прочность связывания антигена, причем прочность связывания зависит от суммы величин сродства связывания множественных сайтов связывания. В пятом аспекте изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество конструкта однодоменного антитела в соответствии с первым аспектом, вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем."Фармацевтически приемлемый носитель" включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие всасывание агенты и подобные соединения, которые являются физиологически приемлемыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько носителей из воды, солевого раствора, забуференного фосфатом солевого раствора, декстрозы, глицерина, этанола и тому подобное, а также их комбинаций. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Также в композицию включают фармацевтически приемлемые вещества, такие как небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы. Композиция может быть представлена в разнообразных формах, включая жидкие, полужидкие и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для ингаляции, инъекций и вливаний), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительно композиция представлена в форме инъецируемого раствора для иммунизации. Введение может быть внутривенным, внутриартериальным, подкожным, внутрибрюшинным или внутримышечным. Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и устойчивыми в условиях изготовления и хранения. Композиции можно составлять в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Соответствующую текучесть раствора можно поддерживать, например, использованием покрытия, такого как лецитин и/или поверхностно-активные вещества. Стерильные инъецируемые растворы можно получить включением активного соединения (т.е. конструкта однодоменного антитела) в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией перечисленных выше ингредиентов, с последующей фильтрационной стерилизацией. Композицию можно также составить в виде стерильного порошка для получения стерильных инъецируемых растворов. В определенных вариантах осуществления активное соединение можно получить с носителем, который защитит соединение против быстрого высвобождения, например, лекарственная форма с контролируемым высвобождением, включающая имплантаты, трансдермальные системы и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат,полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота.- 11017417 Композиция может также быть составлена для перорального введения. В этом варианте осуществления конструкт однодоменного антитела может быть заключен в желатиновую капсулу из твердой или мягкой оболочки, спрессован в таблетки или включен непосредственно в рацион индивидуума. Лекарственные формы, которые обеспечивают возможность легочного, ректального, трансдермального, подоболочечного и внутриглазного введения, должны быть знакомы специалистам в данной области. В композицию могут также быть включены дополнительные активные соединения. Конструкт однодоменного антитела может быть совместно включен в лекарственную форму и/или совместно введен с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например растворимым рецептором TNF- или химическим агентом, который ингибирует продукцию человеческого TNF-, или антителами, которые связывают другие мишени, такие как цитокины или молекулы клеточной поверхности. Альтернативно, его можно совместно вводить с растворимым иммунохимическим реагентом, таким как белок А, С, G или L. Эффективное количество может включать терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество конструкта однодоменного антитела по изобретению. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периода времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периода времени,необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Ввиду того что профилактическую дозу вводят индивидууму перед заболеванием или на более ранней стадии заболевания, то профилактически эффективное количество может быть меньше, чем терапевтически эффективное количество. В шестом аспекте настоящее изобретение предусматривает использование конструкта однодоменного антитела в соответствии с первым аспектом изобретения в диагностическом применении для выявления человеческого TNF-. Например, конструкт однодоменного антитела против человеческого TNF- в соответствии с изобретением можно использовать для выявления человеческого TNF-, например, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма, с использованием обычного иммунного анализа, такого как ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или иммуногистохимия ткани. Конструкт однодоменного антитела против человеческого TNF- в соответствии с изобретением можно анализировать в биологических жидкостях конкурентным иммуноанализом, используя стандарты рекомбинантного человеческого TNF-, меченные детектируемым веществом, и немеченое антитело против человеческого TNF-. Конструкт однодоменного антитела против человеческого TNF-a в соответствии с изобретением можно также использовать для выявления TNF- у видов, отличных от людей, таких как нечеловекообразные приматы, включая зеленых мартышек, шимпанзе, игрунок, макак резус и другие виды, такие как собака, крыса, мышь, кролик, кошка, свинья, корова. Конструкт однодоменного антитела против человеческого TNF-a в соответствии с изобретением можно также использовать при выращивании клеточных культур, где желательно ингибировать активность TNF-. В седьмом аспекте изобретение предоставляет способ лечения расстройства, характеризующегося активностью человеческого TNF- у человека, включающий введение индивидууму фармацевтической композиции в соответствии со вторым аспектом изобретения. Расстройство, характеризующееся активностью человеческого TNF-, включает заболевания и другие расстройства, при которых было продемонстрировано, что у субъекта, страдающего расстройством,присутствие TNF- или является ответственным, или подозревается, что ответственно за патофизиологию расстройства, или представляет собой фактор, который вносит вклад в усугубление расстройства. Предпочтительно расстройство, характеризующееся активностью человеческого TNF-, выбрано из группы, состоящей из воспаления, воспалительных заболеваний, сепсиса, включая септический шок, эндотоксический шок, грамотрицательный сепсис и синдром токсического шока; аутоиммунного заболевания, включая ревматоидный артрит, ювенильный артрит, ревматоидный спондилит, анкилозирующий спондилит, синдром Шегрена, остеоартрит и подагрический артрит, аллергию, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит, псориаз, псевдопузырчатку и нефротический синдром; воспалительных состояний глаз, включая дегенерацию желтого пятна, увеит, болезнь Бехчета; инфекционного заболевания, включая лихорадку и миалгии вследствие инфекции и кахексию, вызванную инфекцией; болезнь "трансплантат против хозяина"; роста или метастазирования опухоли, злокачественных гематологических заболеваний; легочных расстройств, включая астму, респираторный дистресс-синдром взрослых, шоковое легкое, хроническое легочное воспалительное заболевание, легочный саркоидоз,пневмосклероз и силикоз; воспалительных кишечных расстройств, включая болезнь Крона и язвенный колит; сердечных расстройств, застойной сердечной недостаточности; сосудистых расстройств, включая болезнь Вегенера, гигантоклеточный артериит; воспалительных костных расстройств, расстройств центральной нервной системы, таких как болезнь Альцгеймера; расстройств периферической нервной сис- 12017417 темы, таких как ишиас, гепатит, расстройства свертывания, ожоги, реперфузионное повреждение, эндометриоз, образование келоидов и образование рубцовой ткани. В особенно предпочтительном варианте осуществления расстройство, характеризующееся активностью человеческого TNF-, представляет собой возрастную дегенерацию желтого пятна. TNF- участвует в стимуляции продукции VEGF и стимуляции неоваскуляризации глаза (Oh-H et al., 1999, InvestigativeOphthalmologyVisual Science 40:1891-98), и поэтому ингибиторы активности TNF-, такие как описанный в настоящем документе конструкт однодоменного антитела, можно было бы использовать для лечения связанных с ангиогенезом расстройств, включая возрастную дегенерацию желтого пятна. По всему описанию слово "содержать" или такие его варианты, как "содержит" или "содержащий",следует понимать как включение указанного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов,целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий. Все публикации, указанные в настоящем описании, включены в настоящий документ в виде ссылки. Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий или им подобных, которые были включены в настоящее описание, предназначено исключительно с целью предоставления контекста для настоящего изобретения. Его не следует воспринимать как допущение того, что какой-либо или все эти предметы образуют часть основы предшествующего уровня техники или являлись общеизвестными в области, относящейся к настоящему изобретению, существовавшей в Австралии или в других странах до даты приоритета каждого пункта формулы настоящей заявки. Для более ясного понимания сущности настоящего изобретения его предпочтительные формы будут описаны со ссылкой на следующие неограничивающие примеры. Пример 1. Материалы и методы. Выделение генов VL приматов Нового Света. Геномную ДНК игрунки (род Callthrix, вид неизвестен) и совиной обезьяны (Aotus trivirgatus) получали из Европейской Коллекции Клеточных Культур (ЕСАСС), каталожные номера соответственно 85011419 и 90110510. ДНК игрунок получали из линии клеток В 95-8, тогда как ДНК совиных обезьян получали из линии клеток ОМК 637-69. Дегенеративные праймеры на основе человеческих лидерных последовательностей V и рекомбинантных сигнальных последовательностей (RSS) получали от Walter and Tomlinson, Antibody Engineering: A Practical Approach (1996). Праймеры, используемые для амплификации ДНК линии зародышевых клеток V, были следующие: праймер VK1BL праймер VK1BL35a праймер VK1BL35b ПЦР (30 циклов) выполняли, используя полимеразу Taq, или с парой праймеров VK1BLVK1BL35a или VK1BLVK1BL35b. Имелось перекрытие между клонированными последовательностями и двумя использованными наборами праймеров. Геномные продукты ПЦР клонировали в набор клонирования Invitrogen ТОРО ТА (каталожныйK4500-01) и секвенировали праймерами М 13 Forward и pUC Reverse. Последовательность подтверждали в направлении вперед и назад. Для дополнительного подтверждения того, что ключевые последовательности не были подвергнуты ошибкам ПЦР, ПЦР и процесс клонирования повторяли дважды для последовательностей игрунки. Нуклеотид (SEQ ID No: 16-26 и SEQ ID No: 38-43) и аминокислота (SEQID No: 27-37 и SEQ ID No: 44-49) представлены на фиг. 3. Последовательности игрунки 1, 2 и 3 были подтверждены. Последовательности 4, 5, 6, 7 и 8 наблюдались только при начальной ПЦР. Последовательности 9, 10 и 11 наблюдались только при повторной (второй) ПЦР и клонировании. Синтез олигонуклеотидов и клонирование их в акцепторную последовательность. Четыре последовательности CDR, а именно AATKLQS (SEQ ID No: 1) из последовательности 1 совиной обезьяны (SEQ ID No: 44), EASSLQS (SEQ ID No: 2) из последовательности 2 совиной обезьяны(SEQ ID No: 45), EASKLQS (SEQ ID No: 3) из последовательности 1 игрунки (SEQ ID No: 27) и SASNLET (SEQ ID No: 4) из последовательности 2 игрунки (SEQ ID No: 28) были выбраны из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 3. Было обнаружено, что последовательность 5 совиной обезьяны YASSLQS (SEQ ID No: 56) идентична последовательности кДНК GI6176295 Aotus nancymaac(ночной обезьяны Ма), все другие последовательности не имели аналогов. Последовательность вариабельной области акцептора (однодоменного антитела против TNF) в векторе экспрессии (вектор, являющийся собственностью Domantis) расщепляли (25 мкг) последовательноKpnI и SanDI, которые вырезают большинство FR2, а также CDR2, как указано на карте рестрикционного расщепления, фиг. 4. Затем вектор очищали гелем для удаления вырезанной последовательности FR2 иCDR2 дикого типа. Отжиг олиго выполняли инкубацией олиго-пар (500 пмоль, на основании последовательностей, показанных на фиг. 3), при 95 С в течение 5 мин и затем при 65 С в течение 5 мин с последующим предоставлением возможности медленного достижения комнатной температуры на горячем блоке. Затем перекрытия заполняли во время реакции Кленова в присутствии dNTP. Молекулярного клонирования синтетической двухцепочечной ДНК (полученной отжигом олиго и концевым заполнением) в последовательность вариабельной области акцептора достигали, используя стандартные способы. Созревание сродства.dAb с трансплантированной CDR игрунки, соединение 145 (SEQ ID No: 7), подвергали созреванию сродства конструированием 14 отдельных библиотек, каждая из которых являлась диверсификацией последовательности SEQ ID No: 7 в одном аминокислотном остатке. Выбранные остатки показаны подчеркнутыми ниже. Отбор был основан на остатках в CDR1 и CDR3, которые, как известно, диверсифицированы в репертуаре зрелого человеческого Ig, и каркасных остатках, которые, по наблюдениям, продуцируют функциональные белки после мутагенеза в родственных dAb. Для каждого из отобранных остатков пары комплементарных прямых и обратных праймеров ПЦР были сконструированы с дегенерацией NKK, и каждую из двух начальных реакций ПЦР выполняли с одним мутагенным праймером и фланкирующим праймером. После очистки два продукта ПЦР подвергали отжигу и затем амплифицировали, используя только фланкирующие праймеры (сплайсинг перекрывающим распространением ПЦР; Lowman H.L.Clackson T. (eds), Phage Display: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, UK). Производили первоначальный скрининг клонов с помощью ELISA, используя твердофазный TNF, и проводили секвенирование положительных клонов. Белок dAb очищали из лучших клонов и оценивали на активность при анализах связывания рецепторами и анализах цитотоксичности L929. Было обнаружено, что соединения 100 (SEQ ID No: 9) и 123 (SEQ ID No: 8) обеспечивают улучшенную нейтрализацию TNF относительно материнского dAb, соединения 145 (SEQ ID No: 7). Комбинация усиливающих сродство замещений соединений 100 и 123 давала dAb против TNF с дополнительно повышенной активностью в анализе цитотоксичности L929 (соединение 196; SEQ ID No: 10). Клеточная культура. Клетки CHOK1SV (Lonza Biologics, UK), суспензионный вариант CHOK1, поддерживали на логарифмической фазе роста в среде CD СНО с добавлением 6 мМ L-глутамина (Invitrogen каталожные 10743-029 и 25030-081). Культуры инкубировали при 36,5 С, 10% CO2 и встряхивании при 140 об/мин. За 24 ч до трансфекции оценивали количество клеток и жизнеспособность методом исключения трипанового синего (Sigma, каталожныйТ 8154) на гемоцитометре, 8106 жизнеспособных клеток осаждали центрифугированием при 200g в течение 5 мин и ресуспендировали в 8 мл среды СМ 25 (Lonza Biologics, UK) с добавлением 10% инактивированной нагреванием диализированной фетальной телячьей сыворотки (Invitrogen каталожный 26400-044) и 6 мМ L-глутамина. Клетки высевали из расчета 500 мкл на лунку в 24-луночный планшет и инкубировали при 36,5 С, 10% CO2. За 3 ч до трансфекции среду пополняли свежим аликвотным количеством 500 мкл среды с добавлением 10% инактивированной нагреванием диализированной фетальной телячьей сыворотки и 6 мМ Lглутамина. Векторы экспрессии. Генные последовательности соединения 112 (SEQ ID No: 50) и соединения 170 (SEQ ID No: 51) оптимизировали для экспрессии клеток млекопитающих и синтезировали. Каждую последовательность фланкировали на 5'-конце сайтом Hind III, последовательностью Козака (GCCACC; SEQ ID No: 57) и каппа-лидерной последовательностью человеческого IgG (аминокислотная последовательность MSVPTQVLGLLLLWLTDARC; SEQ ID No:58). К каждой последовательности на 3'-конце добавляли два стоп-кодона и сайт EcoRI. После синтеза гены вводили клонированными в вектор pCRScript (Strategene) и высвобождали расщеплением Hind III/EcoR I в соответствующем рестрикционном ферментном буфере (Roche Diagnostics, каталожныесоответственно 10656313001,10703737001 и 11417967001). Вектор экспрессии GS pEE12.4 (Lonza Biologies, UK) аналогичным образом переваривали и дефосфорилировали, используя щелочную фосфатазу кишечника теленка (Roche Diagnostics, каталожный 10713023001). Каждый ген лигировали в полученный каркас рЕЕ 12.4 с использованием системы лигирования ДНК LigaFast Rapid от Promega (каталожныйМ 8221). Продукты лигирования затем трансформировали в химически компетентные клетки One Shot Top 10 (Invitrogen, каталожныйC4040-03) и положительные колонии идентифицировали по стандартными методикам. Большие количества полученных векторов (рЕЕ 12.4-PNO621 и рЕЕ 12.4-PNO521-S114C) получали с помощью набора культур Midiprep, выращенных в течение ночи, с использованием колонок Midiprep QIAfilter(QIAgen, каталожный 12243). Векторы получали для трансфекции осаждением 20 мкг в 100% этаноле с 1/10 объема 3M ацетата натрия (рН 5,2) (Sigma, каталожныесоответственно Е 7023 и S2889). После промывания в 70% этаноле векторы ресуспендировали в 40 мкл Т.Е. рН 8,0 (Sigma, каталожныйТ 9285) при рабочей концентрации 0,5 мкг/мл. Трансфекция. Для каждой трансфекции 2 мкл липофектамина 2000 добавляли к 50 мкл среды Optimem I (Invitrogen, каталожные 11668-027 и 31985-062) в лунке 96-луночного планшета. Во вторую лунку добавляли 1,6 мкл вектора экспрессии (0,8 мкг) к 50 мкл среды Optimem I. После 5-минутной инкубации при комнатной температуре содержимое двух лунок смешивали вместе и оставляли для дальнейшей 20 минутной инкубации. После этой второй инкубации всю трансфекционную смесь добавляли в лунку в 24-луночном планшете, содержащем клетки CHOK1SV. Клетки инкубировали в течение по меньшей ме- 15017417 ре 72 ч и собирали супернатанты. Супернатанты центрифугировали при 4000g в течение 5 мин для осаждения клеточных фрагментов и хранили при -20 С до тех пор, когда экспрессию соединения 112 (SEQ ID No: 59) и соединения 170 Титровальные микропланшеты (например, Sarstedt 82.9923-148) покрывали раствором 1 мкг/мл человеческого рекомбинантного NHF- (Peprotech каталожный 300-01 А) в карбонатном/бикарбонатном буфере покрытия при рН 9,6, из расчета 100 мкл/лунку. После инкубации в течение ночи при 4 С планшеты промывали 3 раза PBS (0,01 М, рН 7,2) с 0,05% Tween 20 и 3 раза PBS. Добавляли 200 мкл блокирующего буфера (PBS с 1% BSA бычий сывороточный альбумин, Sigma каталожныйА-9647) на лунку и инкубировали при 25 С в течение 1 ч. Планшеты промывали, как указано выше, и добавляли 100-мкл объемы образца или стандартов соединения 170, разбавленных в разбавителе антитела (PBS с 1% BSA и 0,05% Tween 20) на лунку. После инкубации в течение 1 ч при 25 С планшеты промывали, как указано выше, и добавляли 100-мкл объемы вторичного антитела (конъюгированных с пероксидазой козьих античеловеческих иммуноглобулинов, Zymed, каталожный 81-7120) при разведении 1:1000 в разбавителе антитела на лунку. Планшеты промывали и добавляли 100-мкл объемы субстрата ABTS диаммониевой соли (2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты), Sigma, каталожный номер А-1888, 0,5 мг/мл в цитратном буфере при рН 4,4 с 0,03% H2O2) на лунку. Субстрат выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре и поглощение считывали при 405 нм (эталон 620 нм). Концентрации образцов определяли относительно стандартной кривой и выражали относительно средней концентрации экспрессированного соединения 112. Результаты. Включение усеченного СН 1. Включение усеченного СН 1 в конструкт однодоменного антитела приводит к соединению между вариабельным доменом и шарниром с более высокой гомологией с обычным соединением СН 1 IgG1 шарниром (91,7%), чем соединение, не имеющее усеченного СН 1 (83,3%; рассчитанное с использованиемAlign X Vector NTI (Invitrogen), с наказанием в виде открытия гэпа 1). Вероятно, что увеличенная гомология транслируется в увеличенное напоминание пептидных последовательностей обычного иммуноглобулина, к которым люди-пациенты должны быть иммунологически устойчивыми, посредством этого снижая иммуногенный потенциал. Последовательности. Соединение вариабельной области соединения TKVEIKRVEPKS 170-усеченного СН 1-шарнира: Соединение СН 1 IgG1-шарнира (доступ AAG00909 TKVDKRVEPKS в NCBI): Соединение вариабельной области соединения TKVEIKREPKS 170-шарнира (усеченный СН 1 отсутствует): Последовательность СН 1 выделена жирным шрифтом, как указано. Домен СН 1 (SEQ ID No: 60) получен из базы данных белков NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.qov) Соединение CH1-шарнира показано подчеркиванием. Нейтрализация цитотоксичности, вызванной TNF-. Способность конструкта однодоменного антитела, соединения 170 (SEQ ID No: 11), нейтрализовать цитотоксичность, опосредованную TNF-, оценивали с использованием анализа жизнеспособности мы- 16017417 шиных клеток L929. Серийные разведения соединения 170 в среде RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой (RPMI-FBS) получали в объемах по 50 мкл в 96-луночных планшетах с плоским дном. В каждую из этих лунок добавляли 50 мкл рекомбинантного человеческого TNF- (Strathmann Biotec, Hamburg,Germany) в концентрации 360 пг/мл, с последующим добавлением 2,5104 клеток L929 в 50 мкл и 25 мкл актиномицина D в концентрации 40 мкг/мл, все полученные в среде RPMI-FBS. Контроли включали лунки без TNF (для определения 100% жизнеспособности), без клеток (0% жизнеспособность) и стандартную кривую TNF- в диапазоне от 2 до 4200 пг/мл. Культуральные планшеты инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37 С в течение 20 ч, затем в течение еще 3 ч после добавления 25 мкл 3-(4,5-диметилтиазол 2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2 Н-тетразолия (MTS)/феназинэтосульфат (PES)(Promega CellTiter 96 AQucnus One, Madison USA). Поглощение при 492 нм определяли в сравнении с эталонной длиной волны 630 нм и кривые выживаемости строили с использованием средних величин, рассчитанных по тестируемым лункам в трех повторениях. На способность соединения 170 нейтрализоватьTNF- указывает увеличение жизнеспособности клеток увеличивающимися концентрациями соединения 170 (фиг. 6). Нейтрализация связывания TNF- с человеческими рецепторами р 55 и р 75 TNF. Способность конструкта однодоменного антитела, соединения 170 (SEQ ID No: 11), ингибировать связывание TNF- с человеческими рецепторами р 55 и р 75 TNF оценивали анализами связывания с рецепторами. Человеческие рецепторы р 55 (RnD systems, каталожный 372-RI) или р 75 (RnD systems,каталожный 762-R2) наносили в виде покрытия на планшеты Maxisorb (Nunc) в концентрации 0,1 мкг/мл в карбонатном буфере покрытия при рН 9,2 инкубацией в течение ночи при 4 С. Серийные полулогарифмические разведения соединения 170 в диапазоне от 100 мкг/мл до 3,15 нг/мл (и "пустой" контроль без соединения 170) получали в разбавителе антитела (PBS рН 7,2, 0,05% Tween-20, 1% BSA) и смешивали с равным объемом 60 нг/мл человеческого TNF- в разбавителе антитела. Также получали контроль, не содержащий PN0621 и не содержащий TNF-, для измерения фонового связывания. Всем смесям давали возможность инкубироваться точно в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании. В процессе этой инкубации покрытые планшеты промывали 3 раза PBS, 0,05%Tween-20 и затем 3 раза PBS. Затем планшеты блокировали 200 мкл/лунку PBS, 1% BSA в течение 45 мин при комнатной температуре. После промывания планшета в лунки в трех повторениях добавляли 100 мкл смеси соединения 170/TNF- для каждой испытуемой концентрации соединения 170, наряду с добавлением контролей. Затем планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывания планшетов в каждый планшет добавляли биотинилированное антитело против человеческого TNF- (RnD Systems, каталожныйBAF210) в концентрации 0,6 мкг/мл в разбавителе антитела и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания добавляли конъюгат стрептавидин-HRP (Zymed, каталожный 43-4323) в соотношении 1:2000 в разбавителе антитела и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Визуализацию выполняли с использованием субстрата ТМВ (Invitrogen, каталожный 00-2023), прекращая с помощью 1 М HCl через 4 мин. Затем измеряли поглощение при 450 нм с использованием эталона 620 нм. Анализ выполняли, рассчитывая среднее поглощение трех повторений. Среднюю величину неспецифического связывания (без TNF-) вычитали из каждой величины поглощения. Результаты представлены на фиг. 7 и показывают, что соединение 170 предотвращает взаимодействие TNF- с человеческими рецепторами р 55 и р 75 TNF. Связывание связанного с клеткой TNF-. Анализ связывания со связанным с клеткой (трансмембранного) TNF- выполняли, используя линию клеток NSO, 27D4, стабильно трансфицированную геном, кодирующим человеческий белок TNF-,не имеющий сайта расщепления ТАСЕ, так что TNF- остается связанным с клеточной мембраной, поскольку он не может быть расщеплен. Была описана аналогичная клеточная линия на основе другой мышиной миеломы (SP2/0) (Scallon et al. (1995), Cytokine 7, 251-259). Анализ проточной цитометрией выполняли на 5105 жизнеспособных клетках 27D4 на образец,осуществляя все стадии при 4 С или на льду. Клеточные осадки ресуспендировали с тестируемым соединением (соединение 170; SEQ ID No: 11) или с нерелевантным, подобранным по изотипу специфичности контролем (Sigma, каталожный 15154) при концентрации 100 мкг/мл в PBS, содержащем 2%FBS, и инкубировали на льду в течение 1 ч. Выполняли 2 цикла промывания клеток, каждый включающий центрифугирование в течение 10 мин при 1000g и ресуспендирование клеточного осадка в PBS/2%FBS. После другой стадии центрифугирования клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл вторичного конъюгата антитела (конъюгат FITC против человеческого Fc, Sigma, каталожныйF9512) и инкубировали в течение 30 мин. Затем образцы дважды промывали, как описано выше, и клеточные осадки ресуспендировали в 500 мкл PBS/2%FBS с 5 мкг/мл йодида пропидия (Sigma, каталожныйР 4864). Флуоресцентное окрашивание клеток анализировали на проточном цитометре Coulter Cell Lab Quanta и данные обрабатывали с использованием WinMDI. Результаты представлены на фиг. 8 и показывают, что окрашивание соединением 170 клеток NSO- 17017417 27D4, экспрессирующих трансмембранный TNF- (сплошная черная линия), проявляют более высокую интенсивность флуоресценции, чем нерелевантный, подобранный по изотипу специфичности контроль(серая штриховка). Создание клеточных линий с высокой экспрессией соединения 170. Устойчивые линии клеток CHOK1SV, экспрессирующих соединение 170 (SEQ ID No: 11), создавали с использованием вектора экспрессии, описанного в разделе "Материалы и методы". Кратко, 1107 клеток в логарифмической фазе роста подвергали электропорации в лишенной глутамина безбелковой среде CDCHO в присутствии 40 мкг линеаризованной плазмидной ДНК. Через 24 ч после трансфекции прикладывали селективное давление 50 мкМ метионинсульфоксимина (Sigma) и устойчивым клеткам давали возможность образовывать колонии в 96-луночных планшетах. Когда слияние приближалось,одиночные колонии трансфицировали в 24-луночные планшеты Т 25 и затем в колбы Т 75. После достижения слияния в колбах Т 75 клеточные линии прогрессировали в культуры в колбах Е 125 Эрленмейера и адаптировали для роста суспензии через 6 субкультур. После адаптации к росту суспензии линии клеток криоконсервировали в замороженной смеси 92,5% среды CDCHO:7,5% ДМСО. Пока линии клеток распространяли по лункам и колбам различного размера, параллельно выполняли ряд оценок производительности для продвижения клеточных линий на следующую стадию. Так, на стадиях 24-луночных планшетов и колб Е 125 Эрленмейера выполняли оценку производительности. В каждом случае клеткам обеспечивали возможность роста в течение 14 дней и супернатанты оценивали методом ELISA TNF, описанным в примере 1, для определения уровней соединения 170. Линии клеток ранжировали по производительности и 10 линий с самой высокой производительностью отбирали для оценки производительности подаваемой партии в анализаторе Lonza Biologies. Величины производительности составляли от 700 мг/л до 3371 мг/л. Ведущую клеточную линию с производительностью 2724 мг/л отбирали для оценки в 10-литровых ферментерах лабораторного масштаба. Четыре отдельных 10-литровых ферментера лабораторного масштаба работали в течение 15 дней с ведущей клеточной линией и фирменным способом подаваемой родовой партии на основе безбелковой среды CDCHO. Итоговая средняя производительность 4 ферментаций составила 4851 мг/л, причем самая высокая производительность составила 4925 мг/л (самый высокий отмеченный уровень производительности, о котором ранее сообщалось Lonza Biologies для не клональной клеточной линии при 15-дневной ферментаций, составляет 3560 мг/л). Используемые 10-литровые ферментеры лабораторного масштаба были предназначены для имитации условий ферментаций, обнаруживаемых в ферментерах большего масштаба до 2000 л, следовательно, ожидается, что ведущая клеточная линия подходит для изготовления в промышленном масштабе. Действительно, аналогичные уровни экспрессии наблюдались в 200 литровом ферментере. Продукт, собранный из 410 л ферментаций ведущей клеточной линии, экспрессирующей соединение 170 (SEQ ID No: 11), очищали методом аффинной хроматографии с белком А и анализировали с помощью SDS PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Как показано на фиг. 11,соединение 170 экспрессируется в виде мономера приблизительно 90 кДа. Этот мономер составлен из 2 субъединиц приблизительно 40 кДа, которые видны на фиг. 12, когда SDS PAGE проводят в восстанавливающих условиях. Поскольку SDS PAGE не подходит для точного определения размера белков, выполняли дополнительный анализ мономера соединения 170. Размер мономера соединения 170, определенный путем ESI-MS (электрораспылительной ионизационной масс-спектрометрии), составил 78,739 кДа. Это согласуется с прогнозируемой молекулярной массой 2 субъединиц (238,058=76,116 кДа),каждая из которых также несет биантеннальную сердцевинную структуру фукозилированного гликанового сахара. Длительный период полужизни в сыворотке у нечеловекообразных приматов. Соединение 170 (SEQ ID No: 11) вводили подкожно зеленым мартышкам в дозах 0,5, 5 и 50 мг/кг, и образцы крови брали через 0,5, 1, 2, 6 и 24 ч, затем через 1 день, 2, 4, 7, 10 и 14 дней. Анализ этих образцов для количественного определения уровней соединения 170 выполняли, используя способ анти-TNFELISA, описанный в примере 1. Период полужизни определяли анализом уровней соединения 170 в этих образцах. При 0,5 мг/кг был рассчитан период полужизни 110,513,9 ч. При 5 и 50 мг/кг был рассчитан период полужизни 110,910,4 и 103,511,5 ч. Когда соединение 170 вводили внутривенным путем в дозе 50 мг/кг, образцы крови брали через 10,30 и 60 мин, 4 и 24 ч, 2, 4, 7, 10 и 14 дней. Анализ этих образцов для количественного определения уровней соединения 170 выполняли, используя способ анти-TNF-ELISA, описанный в примере 1. Период полужизни определяли анализом уровней соединения 170 в этих образцах. После внутривенного введения 50 мг/кг был рассчитан период полужизни 109,610,7 ч. Благоприятный профиль безопасности. Соединение 170 (SEQ ID No: 11), полученное в соответствии со стандартами GMP, оценивали в исследованиях безопасности и токсикологии у животных.- 18017417 Безопасность одной дозы. У различных обезьян, которым вводили соединение 170 разовыми дозами 0,5, 5 и 50 мг/кг подкожным или внутривенным путем введения, не проявлялись эффекты, связанные с их лечением соединением 170. В этих экспериментах проводили микроскопическое исследование ряда органов и не наблюдали никаких эффектов. Безопасность повышающейся дозы и повторной дозы. Зеленым мартышкам в течение 7 дней, начиная с дозы 0,5 мг/кг, вводимой или подкожно, или внутривенно, вводили повышающиеся дозы до 50 мг/кг. У животных проводили оценку широкого диапазона физиологических и поведенческих параметров, включая гематологию, биохимические показатели, массу тела и органов и макроскопический осмотр органов после вскрытия. В ходе этих исследований не было отмечено неблагоприятных реакций на лечение соединением 170. После окончания фазы исследования с повышающейся дозой тем животным, которые подкожно получали повышающиеся дозы, вводили дополнительные 4 дозы по 50 мг/кг в течение еще одного 4-недельного периода. Вновь, по широкому диапазону параметров, не наблюдали эффектов, связанных с лечением соединением 170. Безопасность для сердечно-сосудистой системы. Безопасность соединения 170 в дозе 50 мг/кг для сердечно-сосудистой системы оценивали у зеленых мартышек с установленными радиотелеметрическими мониторами. Эти мониторы осуществляли прямую регистрацию серии параметров функции дыхания и сердечно-сосудистой системы у бодрствующих обезьян. После введения соединения 170 не было отмечено неблагоприятных клинических явлений,связанных с лечением. Бактериальная экспрессия. Соединение 170 (SEQ ID No: 11) в предыдущих примерах получали в системах экспрессии млекопитающих. Функциональное соединение 170 также получали, используя бактериальную систему экспрессии. Проводили обратную трансляцию аминокислотной последовательности для соединения 170 минус сигнальная последовательность и ее оптимизацию с помощью GeneOptimizer для экспрессии E.coli и вновь синтезировали в GeneArt GmbH. Синтезированный ген субклонировали в pBAD gIII/меченный His вектор экспрессии (Invitrogen) через рестрикционные сайты NcoI и HindIII (Roche), генерирующие вектор, готовый для бактериальной экспрессии. Клетки ТОР 10 (Invitrogen) трансформировали вектором способом теплового шока и генерировали запасы глицерина одиночных колоний. Условиями индукции были 0,002% арабиноза (Sigma; конечная концентрация) и период индукции 4 ч. Образцы белка соединения 170 генерировали, используя способ осмотического шока, как подробно описано в руководстве по системе бактериальной экспрессии pBAD (Invitrogen). Анализ ВСА (Pierce) использовали для определения общей концентрации белка в образцах. Бактериально экспрессированное соединение 170 анализировали для выявления связывания с TNF- в ELISA, как описано в примере 1. На фиг. 9 показано, что соединение 170, полученное в бактериальной системе, сохраняло связывание с TNF- в анализе ELISA. Последовательность ДНК для бактериальной экспрессии соединения 170 представлена ниже: Эффективность in vivo соединения 170 на мышиной модели артрита, опосредованного человеческим TNF. Линия трансгенных мышей, экспрессирующая человеческий TNF, Tg197, проявляет разрегулированную экспрессию TNF, и у нее развивается хронический воспалительный полиартрит (Keffer, J. et al.Journal 10:4025-31). Введение соединения 170 (SEQ ID No: 11) предотвратило развитие артрита и связанную с ним потерю массы тела у этих мышей (фиг. 10 А и В). Группы из 8 гетерозиготных мышей Tg197(каждая содержащая 4 самца и 4 самки) лечили дважды в неделю внутрибрюшинными инъекциями соединения 170 и нерелевантным контролем специфичности человеческим IgG1 паливизумаб (Synagis),MedImmune/Abbott в PBS, оба в дозе 10 мг/кг. Лечение начинали, когда возраст мышей достигал 3 недель. Через недельные интервалы мышей взвешивали и проводили балльную оценку (балльную оценку артрита) на основании макроскопической морфологии голеностопного сустава (отек, деформация и степень движения). Замещение Cys в положении 114 в соединении 112 приводит к увеличенной экспрессии белка. Соединение 112 (SEQ ID No: 59) представляет собой модификацию соединения 170 (SEQ ID No: 11), которое содержит цистеиновый остаток в положении 114 вместо серинового остатка, который присутствует в этом положении в соединении 170. Влияние на экспрессию белка замещения цистеина 114 на серин оценивали сравнением с соединением 170. Множественные культуры клеток-хозяев, трансфицированных генными конструктами для соединения 112 и 170, анализировали с помощью ELISA для выявления экспрессии белка твердофазным TNF, как изложено в разделе "Материалы и методы". Результаты представлены на фиг. 11. Специалистам в данной области будет понятно, что в изобретение, представленное в определенных вариантах осуществления, можно внести многочисленные изменения и/или модификации без отхода от сущности или объема широко описанного изобретения. Следовательно, представленные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие.