Трансгенная клетка и трансгенное растение сахарной свеклы, у которых подавлена реакция яровизации, и способы получения и использования указанного растения

ТРАНСГЕННАЯ КЛЕТКА И ТРАНСГЕННОЕ РАСТЕНИЕ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, У КОТОРЫХ ПОДАВЛЕНА РЕАКЦИЯ ЯРОВИЗАЦИИ, И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УКАЗАННОГО РАСТЕНИЯ Изобретение решает задачу управления выбросом стрелки и цветением у сахарной свеклы и относится к способам подавления яровизации и трансгенным растениям сахарной свеклы с подавленными реакциями яровизации. В особенности настоящее изобретение включает растения сахарной свеклы и способы модулирования реакций яровизации у сахарной свеклы за счет сверхэкспрессии гена FLC или подавления экспрессии гена AGL20. Гилен Йоханнес Якобус Лудгерус(FR), Ван Роген Петронелла Мария,Времерт Веик Сигне Ирене Элизабет(71)(73) Заявитель и патентовладелец: СИНДЖЕНТА ПАРТИСИПЕЙШНС АГ (CH) 016749 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к проблеме управления выбросом стрелки и цветением у сахарной свеклы, особенно к способам подавления яровизации и трансгенным растениям сахарной свеклы с подавленным стрелкованием. Уровень техники изобретения Сахарная свекла тысячелетиями возделывалась как сладкое растение, но ее потенциал как источника сахара не был открыт вплоть до 18-го столетия. Сахарная свекла - это двулетнее растение, принадлежащее к семейству Chenopodiaceae (маревых, лебедовых). Обычный жизненный цикл сахарной свеклы завершается за два года. На первом году у растения развивается сочный мясистый корень, который запасает энергию в виде сахарозы. По этой причине свеклу возделывают как однолетнее растение. На втором году жизненного цикла она цветет и дает семена. Если на первом году жизни растения случаются длительные периоды похолоданий, то у свеклы может преждевременно образоваться семяносец. Эта генетически детерминированная температурная индукция приводит к феномену, известному под названием стрелкование (выброс стрелки). Обрезка ботвы у свеклы для экстракции сахара наполовину сокращает двухлетний жизненный цикл, пока накопление сахарозы находится на пике. Как уже упоминалось, непременной частью полного жизненного цикла сахарной свеклы является индуцируемая холодом яровизация, которая вызывает стрелкование растений. Вероятность яровизации свеклы повышается в зависимости от числа дней, когда максимальная температура не превышает 12 С. Это явление ведет к потерям урожая при раннем посеве, так как по экспертным оценкам 1% стрелкующихся растений снижает урожай сахара на 0,4-0,7%. Существуют два способа обрезки сахарной свеклы, весенняя и осенняя, которые практикуются в южных странах с мягким климатом и в северных широтах соответственно. Оба способа основаны на наличии у растений вариабельности по такому признаку, как степень устойчивости к стрелкованию. Устойчивость к стрелкованию зависит от температуры, длительности и переносимых пределов облучения для индукции семяносца и является ключевым признаком в селекции сахарной свеклы. Для того чтобы полностью сдержать стрелкование и цветение посредством блокирования яровизации, деяровизации яровизированных растений или подавления цветения и выработки жизнеспособных семян, посев сахарной свеклы в северных широтах следует проводить осенью, что исключает риск стрелкования и цветения на следующий сезон. Этот сдвиг с весеннего на подзимний посев позволяет свекловодам проводить посевы осенью и собирать урожай на следующее лето. Сравнение озимых и яровых сортов культурных растений,например пшеницы и масличных культур, показало, что озимые сорта стабильно дают более высокий урожай по сравнению с яровыми. Ожидаемый результат заключается в повышении экономической жизнеспособности и рентабельности сельскохозяйственных культур. Еще одно преимущество заключается в возможности комбинировать выращивание яровых и озимых культур с расширением сроком компании по сбору урожая, которая может начинаться на два-три месяца раньше, что повышает эффективность капиталовложений в оборудование и инфраструктуру, которые необходимы для уборки урожая, транспортировки и переработки сахарной свеклы. Функциональный анализ арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) позволил различить четыре разных пути цветения (Levy and Dean, 1998). Эти четыре пути можно связать со стимулами из внешней среды, например с фотопериодическими и яровизирующими путями стимуляции, или с врожденными сигналами развития, например с путями автономной стимуляции и подавления цветения. У некоторых видов время цветения, прежде всего, зависит от факторов внешней среды, например от светового периода, качества/количества света, яровизации и доступности воды или питательных веществ. Другие виды растений меньше зависят от экзогенных сигналов и в большей степени полагаются на эндогенные, например на размер растения или количество узловых точек. В литературе описан один важный локус, FLOWERING LOCUS С (FLC), который встречается в природе у экотипов арабидопсиса (Koornneef et al., 1994; Lee et al. 1994). FLC - это регулятор транскрипции из семейства генов MADS-box (Michaels, S.D. and Amasino R.M., 1999), который подавляет цветение. В отличие от этого, существуют гены, вызывающие переключение с вегетативного роста на репродуктивный рост, включая "локус цветения Т" (FT), "локус облиствения" (LFY) и "супрессор сверхэкспрессии констант", упоминаемый в литературе под названием "Agamous-like 20" (AGL20), (Nilsson et al.,1998; Kobayashi et al., 1999; Blazquez et al., 2000; Lee et al., 2000; Sarmach et al., 2000; Borner et al., 2000). Избыточная экспрессия AGL20 вызывает раннее цветение у арабидопсиса, в то время как понижающая регуляция этого гена вызывает позднее цветение. Применительно к сахарной свекле было показано, что реакция яровизации является одним из наиболее важных факторов индукции цветения. Хотя свекловодам известны и доступны разновидности сахарной свеклы, устойчивые к стрелкованию, до сих пор не решены серьезные проблемы с культивированием высокоурожайных озимых сортов, что связано со вспышками стрелкования. В настоящее время не существует растений или способов, способных обеспечить гарантированную задержку яровизации сахарной свеклы. Яровизация и ее влияние на двулетнюю сахарную свеклу довольно подробно описаны в литературе (см., например, Jaggard et al., 1983). Сахарная свекла реагирует на температуры в диапазоне от 3 до 12 С, накапливая эффекты похолоданий. Для того чтобы свекла начала выбрасывать стрелку,-1 016749 необходимо несколько недель с температурой 3-12 С. Модель стрелкования ITB показывает, что во Франции яровизация может происходить в период до 90 дней (13 недель) после рядового посева. Критическим числом для инициации стрелкования из этих 90 дней являются семнадцать дней с температурой 7 С. Сущность изобретения Настоящее изобретение включает растения сахарной свеклы и способы модулирования реакции яровизации за счет сверхэкспрессии гена FLC или подавления экспрессии гена AGL20 у сахарной свеклы. В одном из вариантов реализации изобретение относится к растениям сахарной свеклы и способам модулирования реакции яровизации за счет сверхэкспрессии гена FLC и подавления экспрессии генаAGL20 у одного и того же растения сахарной свеклы. Краткое описание чертежей и идентификаторов последовательностей (SEQ ID) Фиг. 1 представляет плазмидную карту бинарного вектора pHiNK260. Фиг. 2 представляет выверку последовательностей кДНК гомологичных вариантов гена AGL20 от растений Arabidopsis thaliana (AtAGL20), Nicotiana tabacum (NtAGL20) и Sinapsis alba (SaAGL20). Вырожденные праймеры HiNK624 и HiNK619, которые были сконструированы для консервативных регионов и обозначены подчеркиванием. Фиг. 3 представляет филогенетическое древо, умозрительно построенное по выверке кодирующего региона гомолога AGL20 сахарной свеклы в сравнении с гомологами AGL20 растений Arabidopsisthaliana, Pinus taeda, Pisum sativum, Sinapsis alba и Nicotiana tabacum. Фиг. 4 представляет плазмидную карту бинарного вектора pHiNK382. Фиг. 5 представляет таблицу, содержащую фенотипические результаты событий в гене FLC. Фиг. 6 представляет таблицу, содержащую фенотипические результаты событий в гене AGL20. Фиг. 7 представляет плазмидную карту бинарного вектора pHiNK440. Фиг. 8 представляет плазмидную карту бинарного вектора pHiNK441. Фиг. 9 отображает выверку трех белковых последовательностей гена FLC Beta vulgaris (BvFLC), которая показывает различия INDEL между тремя разными вариантами сплайсинга. Фиг. 10 отображает приращение трех вариантов сплайсинга предполагаемого гомолога FLC сахарной свеклы, демонстрирующее наличие двух INDEL внутри рамки считывания. Последовательность вырожденного праймера HiNK5279, использованного для амплификации этих трех фрагментов кДНК, заключена в рамку. Фиг. 11 показывает результат экспрессии компонентов RNAi pHiNK 440 и 441, контрольного генаGAPC и эндогенного гена сахарной свеклы BvAGL20 посредством RT-PCR. Эндогенный ген BvAGL20 был подвергнут понижающей регуляции у гибрида (А), но не у растений, трансгенных только по одному компоненту dsРНК (В и С), но не по NT (D). W = вода; D = ДНК; R = РНК; 0,5, 1 и 2 = количество кДНК в мкл на реакцию RT-PCR.SEQ ID NO: 1 отображает нуклеотидную последовательность бинарного вектора pHiNK260, несущую экспрессионную кассету, в которой содержится ген FLC арабидопсиса.SEQ ID NO: 2 отображает нуклеотидную последовательность бинарного вектора pHiNK382, несущую экспрессионную кассету, в которой содержится инвертированный повтор гомолога AGL20 сахарной свеклы.SEQ ID NO: 3 отображает нуклеотидную последовательность кДНК гена FLC арабидопсиса (инвентарный номер AF537203).SEQ ID NO: 4 отображает нуклеотидную последовательность части геномной последовательности гомолога AGL20 сахарной свеклы.SEQ ID NO: 5 отображает нуклеотидную последовательность фрагмента кДНК размером 0,28 кб,состоящую из экзонов 3-7 гомолога AGL20 сахарной свеклы.SEQ ID NO: 6 отображает нуклеотидную последовательность гомолога AGL20 сахарной свеклыSEQ ID NO: 7 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK529.SEQ ID NO: 8 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK792.SEQ ID NO: 9 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK793.SEQ ID NO: 10 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK794.SEQ ID NO: 11 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK795.SEQ ID NO: 12 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK796.SEQ ID NO: 13 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK624.SEQ ID NO: 14 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK619.SEQ ID NO: 15 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK725.SEQ ID NO: 16 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK729.SEQ ID NO: 17 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK2617.SEQ ID NO: 18 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK2618.SEQ ID NO: 19 отображает нуклеотидную последовательность бинарного вектора pHiNK440, несущую экспрессионную кассету, в которой содержится фрагмент гомолога AGL20 сахарной свеклы в смы-2 016749 словой ориентации.SEQ ID NO: 20 отображает нуклеотидную последовательность бинарного вектора pHiNK441, несущую экспрессионную кассету, в которой содержится фрагмент гомолога AGL20 сахарной свеклы в антисмысловой ориентации.SEQ ID NO: 21 отображает нуклеотидную последовательность contig71+EST, идентифицирующую кодирующий регион варианта сплайсинга 1 эндогенного гена FLC сахарной свеклы.SEQ ID NO: 22 отображает аминокислотную последовательность продукта экспрессии кодирующего региона варианта сплайсинга 1 эндогенного гена FLC сахарной свеклы.SEQ ID NO: 23 отображает нуклеотидную последовательность contig78+EST, идентифицирующую кодирующий регион варианта сплайсинга 2 эндогенного гена FLC сахарной свеклы.SEQ ID NO: 24 отображает аминокислотную последовательность продукта экспрессии кодирующего региона варианта сплайсинга 2 эндогенного гена FLC сахарной свеклы.SEQ ID NO: 25 отображает нуклеотидную последовательность contig79+EST, идентифицирующую кодирующий регион варианта сплайсинга 3 эндогенного гена FLC сахарной свеклы.SEQ ID NO: 26 отображает аминокислотную последовательность продукта экспрессии кодирующего региона варианта сплайсинга 3 эндогенного гена FLC сахарной свеклы.SEQ ID NO: 27 отображает нуклеотидную последовательность contig71+EST.SEQ ID NO: 28 отображает нуклеотидную последовательность contig78+EST.SEQ ID NO: 29 отображает нуклеотидную последовательность contig79+EST.SEQ ID NO: 30 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK5277.SEQ ID NO: 31 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK5279.SEQ ID NO: 32 отображает нуклеотидную последовательность праймера AGL20 А.SEQ ID NO: 33 отображает нуклеотидную последовательность праймера AGL20 В.SEQ ID NO: 34 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK023.SEQ ID NO: 35 отображает нуклеотидную последовательность праймера gapCex5/6F.SEQ ID NO: 36 отображает нуклеотидную последовательность праймера gapCex8R.SEQ ID NO: 37 отображает нуклеотидную последовательность праймера HiNK 819. Определения Технические термины и выражения, использованные в рамках этой заявки, как правило, имеют тот же смысл, который обычно придается им в данной области техники, то есть в области знаний, относящейся к разведению и культивации растений, если далее в этом тексте не будет специально указано иное. При использовании в тексте этой заявки и прилагаемых пунктах формулы изобретения формы единственного числа, подразумевают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Так, например, ссылка на "растение" включает одно и более растений, а ссылка на "клетку" включает смеси клеток, ткани и т.п. Термин "сахарная свекла" относится ко всем видам и подвидам рода Beta, а также ко всем сортам культивируемой свеклы биологического вида Beta vulgaris. Культивируемая свекла подразделяется на четыре группы: листовая свекла, столовая свекла, кормовая свекла и сахарная свекла. Термин "сахарная свекла" относится также ко всем возделываемым разновидностям свеклы, которые выращивают в других целях, нежели получение сахара, например для производства этилового спирта, пластмасс или других промышленных продуктов. Однако в большей степени термин "сахарная свекла" относится к кормовой свекле и сахарной свекле, особенно к сахарной свекле. Термин "стрелкование" относится к переходу растения из стадии вегетативной розетки в стадию цветения или репродуктивного роста. Термин "яровизация" относится к процессу, в котором у некоторых растений за счет воздействия холодных температур на протяжении определенного времени индуцируется переход к цветению."Кодирующая последовательность" - это такая последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в РНК, то есть в мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК, смысловую РНК или антисмысловую РНК. В предпочтительном варианте в организме происходит последующая трансляция РНК, подразумевающая выработку белка."Ген" - это определенный регион, который имеет определенную локализацию в пределах генома и помимо вышеупомянутой кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты включает другие,главным образом, регуляторные последовательности нуклеиновой кислоты, ответственные за контроль экспрессии, иначе говоря за транскрипцию и трансляцию кодирующей части. Ген также может включать другие 5' и 3' нетранслируемые последовательности и терминирующие последовательности. Другими элементами, которые могут быть представлены в гене, являются, например, интроны. Термин "нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам, а также к их полимерам в однонитевой или двунитевой форме, состоящей из мономеров (нуклеотидов), которые содержат сахар, фосфат и азотистое основание, представляющее собой либо пурин, либо пиримидин. Если не представлено специальных ограничений, этот термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают такими же способностями связывания, как и эталонная нуклеиновая кислота, и метаболизируются сходным образом с нуклеотидами,-3 016749 встречающимися в природе. Если нет других указаний, то специфическая последовательность нуклеиновой кислоты также неявно охватывает консервативно модифицированные варианты (например, вырожденные замещения кодонов) и комплементарные последовательности, а также явно указанные последовательности. Конкретно, вырожденные замещения кодонов могут быть достигнуты за счет генерирования последовательностей, в которых третье положение одного или более выбранных (либо всех) кодонов замещается остатками смешанных оснований и/или дезоксиинозина. "Фрагмент нуклеиновой кислоты" это часть молекулы данной нуклеиновой кислоты. У высших растений генетическим материалом является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), тогда как рибонуклеиновая кислота (РНК) задействована в переносе информации, содержащейся в ДНК, в белки. Термин "нуклеотидная последовательность" относится к полимеру ДНК или РНК, который может быть однонитевым или двунитевым и, по выбору, содержать синтетические, не природные или измененные нуклеотидные основания, способные встраиваться в полимеры ДНК или РНК. Термины "нуклеиновая кислота" или "последовательность нуклеиновой кислоты" могут также быть использованы взаимозаменяемо с терминами ген, кДНК, ДНК и РНК, кодируемая геном. Термин "гетерологичный" при его использовании применительно к гену или нуклеиновой кислоте относится к гену, кодирующему фактор, который не является его естественной средой (то есть был изменен рукой человека). Например, гетерологичный ген может включать ген одного биологического вида,введенный в геном другого биологического вида. Гетерологичный ген также может включать ген, изначально присущий организму, который был изменен каким-либо образом (например, мутирован, добавлен во множественных копиях, сцеплен с неприродной промоторной или энхансерной последовательностью и т.д.). Кроме того, гетерологичные гены могут включать последовательности генов растений в виде кДНК, причем эти последовательности кДНК могут экспрессировать или в смысловой ориентации (с выработкой мРНК) или в антисмысловой ориентации (с выработкой антисмыслового транскрипта РНК,комплементарного транскрипту мРНК). В одном из аспектов изобретения гетерологичные гены отличаются от эндогенных генов растений тем, что последовательности гетерологичных генов типично связаны с нуклеотидными последовательностями, содержащими регуляторные элементы, например промоторы,которые в природных условиях не ассоциированы с геном белка, кодируемого гетерологичным геном,или с последовательностями генов растений в хромосоме, либо ассоциированы с такими частями хромосом, которые не встречаются в природе (например, гены, экспрессируемые в локусах, где они в норме не экспрессируются). Понятие "инвертированный повтор" относится к нуклеотидной последовательности, обнаруживаемой в двух сайтах одной и той же последовательности нуклеиновой кислоты, но имеющих противоположную ориентацию. Понятие "экспрессионная кассета" при использовании здесь означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную к прямой экспрессии специфической нуклеотидной последовательности или последовательностей в соответствующей клетке-хозяине, которая содержит промотор, функционально связанный с важной нуклеотидной последовательностью или последовательностями, функционально связанной/связанными с сигналами терминации, кроме того, экспрессионная кассета типично включает последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности (последовательностей). Экспрессионная кассета может также включать последовательности, не являющиеся необходимыми для прямой экспрессии важной нуклеотидной последовательности, но представленные в близких сайтах рестрикции для удаления кассеты из вектора экспрессии. Экспрессионная кассета, включающая важную нуклеотидную последовательность (последовательности), может быть химерной, что означает гетерологичность по меньшей мере одного из ее компонентов по отношению по меньшей мере к одному из других ее компонентов. Экспрессионная кассета также может иметь природное происхождение, но при этом ее получают в рекомбинантной форме, полезной для гетерологичной экспрессии. Однако в типичном случае экспрессионная кассета гетерологична по отношению к хозяину, то есть специфичная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессионной кассеты не представлена естественным образом в клетке-хозяине и должна быть введена в эту клетку или в ее клеточный предшественник посредством процесса трансформации, известного в данной области знаний. Экспрессия нуклеотидной последовательности (последовательностей) в экспрессионной кассете может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцируемого промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда на клетку-хозяина воздействует некий специфичный стимул, который может быть внешним стимулом или внутренним стимулом, исходящим от самого хозяина. В случае многоклеточного организма, например растения, промотор также может быть специфичен для особой ткани или органа, или стадии развития. Под экспрессионной кассетой или ее фрагментом также может подразумеваться "вставочная последовательность" или "инсерционная последовательность", трансформированная в геном растения. Понятие "функционально связанный (связанная)" относится к такой ассоциации последовательностей нуклеиновой кислоты на единичном фрагменте нуклеиновой кислоты, когда функция одной из них влияет на функцию другой. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью или функциональной РНК, если он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности или функциональной РНК (то есть кодирующая последовательность или функциональная РНК-4 016749 находятся под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности в смысловой или антисмысловой ориентации могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями. Термин "праймеры" при использовании здесь означает выделенные нуклеиновые кислоты, способные отжигаться с комплементарной целевой нитью ДНК посредством гибридизации нуклеиновых кислот с образованием гибрида между праймером и целевой нитью ДНК, а затем наращиваться вдоль целевой нити ДНК при помощи полимеразы, например ДНК-полимеразы. Пары или наборы праймеров можно использовать для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, например, в полимеразной цепной реакции (ПЦР/PCR) или на основе других традиционных методов амплификации нуклеиновых кислот. Термин "супрессия" относится к отсутствию или наблюдаемому снижению уровня белка и/или продукта мРНК, кодируемого целевым геном. В особенности "супрессия" относится к снижению уровня белка и/или продукта мРНК, кодируемого целевым геном, в диапазоне от 20 до 100%, особенно от 40 до 80%, более предпочтительно от 50 до 90%, еще предпочтительнее от 60 до 95%, но особенно предпочтительно от 75 до 98 и до 100%. Последствия ингибирования можно подтвердить исследованием внешних свойств клетки или организма либо применяя биохимические методики и методики выявления экспрессии генов, известные компетентному специалисту. Например, на супрессию экспрессии гена AGL20 указывает отсутствие или задержка реакции яровизации у культивируемых растений сахарной свеклы. Понятие о существенной идентичности или гомологии в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или белков относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые идентичны по меньшей мере на 60%, предпочтительнее на 80%, более предпочтительно на 90%, еще предпочтительнее на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% нуклеотидных или аминокислотных остатков при их сравнении или выверке на максимальное соответствие с применением одного из указанных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или визуального контроля. В частности, существенная идентичность существует в отношении тех участков последовательностей,длина которых составляет по меньшей мере приблизительно 50 остатков, более предпочтительно в отношении участков длиной по меньшей мере 100 остатков и особенно, если последовательности, по существу, идентичны, по меньшей мере приблизительно по 150 остаткам. В специфическом варианте последовательности, по существу, идентичны по всей длине кодирующих регионов. Более того, существенно идентичные последовательности нуклеиновых кислот или белков, по существу, выполняют одну и ту же функцию. При сравнении последовательностей в типичном случае одна последовательность считается эталонной, с которой сравнивается другая последовательность, т.н. тестируемая. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, обозначая при необходимости координаты подпоследовательности и вводя параметры программы алгоритма секвенирования. После этого алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает процентный показатель идентичности тестируемой последовательности (последовательностей) с эталонной последовательностью на основе введенных параметров программы. Можно провести оптимальную выверку последовательностей для их сравнения, например, применяя алгоритм локальной гомологии (SmithWaterman (1981, алгоритм выверки гомологии (NeedlemanWunsch (1970, поиск по методу сходства (PearsonLipman, Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 2444(1988 с компьютерной реализацией этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, штат Висконсин) или с визуальным контролем (см. в целом, Ausubel et al., ниже). Один из примеров алгоритма, пригодного для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, это алгоритм BLAST, который описан в ссылке Altschul et al. (1990). Еще одним указанием на то, что две последовательности нуклеиновых кислот, по существу, идентичны, служит то, что две молекулы гибридизируются друг с другом в жестких условиях. Фраза "специфическая гибридизация с" относится к связыванию, дуплексированию или гибридизации молекулы только со специфической нуклеотидной последовательностью в строгих условиях, когда эта последовательность представлена в сложной смеси (например, тотальной клеточной) ДНК или РНК. Понятие "связывание, по существу" относится к комплементарной гибридизации между нуклеиновой кислотойзондом и целевой нуклеиновой кислотой, охватывая минорные несоответствия, которые могут наблюдаться при уменьшении строгости среды для гибридизации в целях желательного выявления последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Понятия "строгие условия гибридизации" и "строгие условия отмывания после гибридизации" в контексте таких экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, как гибридизация с использованием саузерн-блоттинга и нозерн-блоттинга находятся в зависимости от последовательностей и различаются при разных параметрах окружающей среды. Более длинные последовательности специфически гибридизируются при более высоких температурах. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в ссылке Tijssen (1993). Дальнейшее указание на то, что две последовательности нуклеиновых кислот или белков, по существу, идентичны, заключается в том, что белок, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, дает пере-5 016749 крестную иммунологическую реакцию или специфически связывается с белком, кодируемым второй нуклеиновой кислотой. Таким образом, в типичном случае белок, по существу, идентичен второму белку, например, если оба белка отличаются только по консервативным замещениям. Термин "синтетическая" относится к нуклеотидной последовательности, обладающей такими структурными характеристиками, которые не представлены в природной последовательности. Например,можно сказать, что синтетической является такая искусственная последовательность, которая по содержанию Г+Ц и по нормальному распределению кодонов в большей степени напоминает гены однодольных и/или двудольных растений."Трансформация" - это процесс введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку или организм хозяина. Понятие "трансформация" в особенности означает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном целевого организма. Понятие "трансформированный/трансгенный/рекомбинантный" относится к организму хозяина, например бактерии или растения, в который была введена молекула гетерологичной нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно встроена в геном хозяина или также может быть представлена как внехромосомная молекула. Такая внехромосомная молекула может самовоспроизводиться. Подразумевается, что трансформированные клетки, ткани или растения охватывают не только конечный продукт процесса трансформации, но и его трансгенное потомство. Понятия "не трансформированный", "не трансгенный" или "не рекомбинантный" хозяин относятся к организму дикого типа, например к бактерии или растению, который не содержит молекулы гетерологичной нуклеиновой кислоты. Термин трансгенное "явление" относится к рекомбинантному растению, полученному посредством трансформации и регенерации единственной растительной клетки с применением гетерологичной ДНК,например экспрессионной кассеты, которая включает целевой ген. Термин "явление" относится к первоначальному трансформанту и/или потомству трансформанта, включающему гетерологичную ДНК. Термин "явление" также относится к потомству, полученному в результате полового ауткроссинга (неродственного скрещивания) между трансформантом и другой линией сахарной свеклы. Даже после повторного обратного скрещивания с той же исходной родительской линией целевая ДНК и фланкирующая ДНК трансформированного родителя представлены в гибридном потомстве, имея ту же хромосомную локализацию. В норме трансформация растительной ткани порождает множественные явления, каждое из которых представляет собой инсерцию структурного компонента ДНК в разные локусы генома растительной клетки. Специфическое явление выбирают на основе экспрессии трансгена или по другим желательным характеристикам. Термин "трансген" относится к гену, введенному в геном организма посредством генетической манипуляции в целях изменения его (организма) генотипа."Трансгенное растение" - это растение, обладающее одной или более растительных клеток, в которых содержится вектор экспрессии. Термин "матричная РНК (мРНК)" относится к РНК, в которой нет интронов и которая может транслироваться клеткой в белок. Термин "кДНК" относится к однонитевой или двунитевой ДНК, которая получена из мРНК и комплементарна ей. Термин "экспрессия" при его использовании применительно к последовательности нуклеиновой кислоты, например к гену, относится к процессу преобразования генетической информации, которая закодирована в гене, в РНК (например, в мРНК, рРНК, тРНК или мяРНК) через "транскрипцию" гена (то есть через ферментативное действие РНК-полимеразы), а также в белок, где это применимо (если ген кодирует белок), через "трансляцию" мРНК. Экспрессию гена можно регулировать на многих стадиях процесса. Понятие "сверхэкспрессия" относится к такому уровню экспрессии в трансгенных клетках или организмах, который превышает уровень экспрессии в нормальных или не трансформированных (не трансгенных) клетках или организмах. Понятие "антисмысловое ингибирование" относится к выработке антисмысловых транскриптов РНК, способных подавлять экспрессию белка, кодируемого эндогенным геном или трансгеном. Понятие "молчание гена" относится к зависимой от гомологии супрессии вирусных генов, трансгенов или эндогенных ядерных генов. Молчание генов может быть транскрипционным, когда супрессия является следствием пониженной транскрипции пораженных генов, или посттранскрипционным, когда супрессия является следствием усиленного оборота (деградации) разновидностей РНК, гомологичных пораженным генам. Молчание гена включает индуцированное вирусом молчание гена. Понятие "РНК-интерференция" (иРНК) относится к процессу специфичного в отношении последовательности посттрансляционного молчания гена у растений и животных, опосредованного малыми (или короткими) интерферирующими РНК (миРНК). Компетентному специалисту известны концептуальные понятия различных терминов, например миРНК, целевая молекула РНК, дайсер или фермент рибонуклеаза III, а полное описание этих терминов и других концептуальных понятий, относящихся к РНКи,можно найти в литературе. Для справки некоторые термины, относящиеся к РНКи, определены ниже. Однако следует понимать, что в рамках практической реализации настоящего изобретения ни одна частная гипотеза, описывающая механизмы РНКи, не должна рассматриваться как необходимая.-6 016749 Термин "миРНК" относится к малым (коротким) интерферирующим РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения миРНК включает дуплекс или двунитевой регион длиной приблизительно 21-23 нуклеотида, часто миРНК содержит приблизительно от двух до четырех неспаренных нуклеотидов на 3'конце каждой нити. По меньшей мере одна нить дуплекса или двунитевого участка миРНК, по существу,гомологична или, по существу, комплементарна целевой молекуле РНК. Нить, комплементарная целевой молекуле РНК, является "антисмысловой нитью", нить, гомологичная целевой молекуле РНК, является"смысловой нитью" и также комплементарна антисмысловой нити миРНК. Молекула миРНК может также содержать дополнительные последовательности, не ограничивающие примеры таких последовательностей включают связующие последовательности или петли, а также стебли и другие складчатые структуры. Конструкции типа миРНК, по-видимому, функционируют как ключевые посредники в пусковой РНК-интерференции у беспозвоночных и позвоночных, а также в пусковой деградации РНК, специфической в отношении последовательности, в период посттрансляционного молчания гена у растений. Термин "целевая молекула РНК" относится к такой молекуле РНК, по отношению к которой гомологична или комплементарна по меньшей мере одна нить короткого двунитевого участка миРНК. В типичном случае, если гомология или комплементарность составляет приблизительно 100%, то миРНК способна заглушить или подавить экспрессию целевой молекулы РНК. Хотя считается, что целью для миРНК является мРНК, прошедшая процессинг, настоящее изобретение не ограничивается какой-либо частной гипотезой, и такая гипотеза не должна рассматриваться как необходимая для практической реализации настоящего изобретения. Таким образом, предполагается, что целями для миРНК также могут быть другие молекулы РНК. Такие целевые молекулы РНК включают мРНК, не прошедшую процессинг,рибосомную РНК и геномы вирусной РНК."РНК-индуцирующий комплекс молчания" (RISC) опосредует расщепление однонитевой РНК с последовательностью, комплементарной антисмысловым нитям дуплекса миРНК. Расщепление целевой РНК происходит в середине участка, комплементарного антисмысловой нити дуплекса миРНК (Eibashieret al. 2001). Термин "достаточно комплементарный" означает, что последовательность первой или второй нити РНК, введенной в растительную клетку, способна практически полностью гибридизироваться или отжигаться с РНК, вырабатываемой целевым геном (мРНК) в цитоплазме указанной растительной клетки,запуская подавление экспрессии целевого гена. Например, последовательность первой или второй нити РНК, которая связывается с мРНК, вырабатываемой целевым геном, идентична соответствующей последовательности мРНК целевого гена по меньшей мере на 50%, предпочтительнее по меньшей мере на 70%, еще предпочтительнее по меньшей мере на 90% и еще предпочтительнее по меньшей мере на 95%. Необходимо понимать, что процентный показатель идентичности между последовательностью первой или второй нити РНК и мРНК, вырабатываемой целевым геном, который находится в диапазоне между идентичностью по меньшей мере 70% и идентичностью по меньшей мере 95%, может представлять собой любую численную величину в этом диапазоне. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение включает трансгенные растения сахарной свеклы и способы модулирования реакции яровизации у сахарной свеклы за счет сверхэкспрессии гена FLC и/или подавления экспрессии гена AGL20 у сахарной свеклы. Один из вариантов реализации изобретения включает конститутивную экспрессию гена FLC, следствием которой является модулирование устойчивости к стрелкованию у сахарной свеклы. В соответствии с настоящим изобретением трансгенные растения сахарной свеклы со сверхэкспрессией гена FLC перестают реагировать на типичный 18-недельный период яровизации выбросом стрелки и цветением, а в отличие от этого продолжают вегетативный рост (без выброса стрелки) развитием нормального стержневого корня. Изобретение включает трансгенное растение сахарной свеклы, в геноме которого имеется кодирующая область гетерологичного гена FLC, причем экспрессия гена FLC вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC, благодаря чему происходит подавление реакций яровизации у растения сахарной свеклы. Ген считается сверхэкспрессирующимся, если его экспрессия превышает нормальный уровень экспрессии у нативного (не трансформированного) растения сахарной свеклы, в особенности понятие сверхэкспрессии относится к таким ситуациям, когда экспрессия превышает исходный уровень экспрессии у нативного (не трансформированного) растения сахарной свеклы по меньшей мере на 10%, предпочтительнее по меньшей мере на 20%, еще предпочтительнее по меньшей мере на 30%, еще предпочтительнее по меньшей мере на 40%, но особенно предпочтительно по меньшей мере от 50 до 100% или более. В специфическом варианте реализации изобретения предлагается растение сахарной свеклы, у которого указанный гетерологичный ген FLC включает гетерологичную кодирующую область FLC, состоящую из кДНК, зарегистрированную под инвентарным номером AF537203 (http://ftp.dna.affrc.go.jp/pub/dnaall/A/F5/37/20/AF537203/AF537203), особенно под контролем гетерологичного конститутивного промотора, вызывающего сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляющего реакции яровизации у растения сахарной свеклы.-7 016749 Настоящее изобретение также включает трансгенное растение сахарной свеклы, в геноме которого присутствует гетерологичный ген FLC, структура которого описана в SEQ ID NO: 3, причем экспрессия гена FLC вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC, тем самым подавляя реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Настоящее изобретение также включает трансгенное растение сахарной свеклы, в геноме которого присутствует эндогенный ген FLC, структура которого описана в SEQ ID NO: 27, 28 и 29, или кодирующая часть этого гена, особенно под контролем гетерологичного конститутивного промотора, вызывающего сверхэкспрессию продукта эндогенного гена и тем самым подавляющего реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Настоящее изобретение также включает трансгенное растение сахарной свеклы, в геноме которого присутствует эндогенный ген FLC, структура которого описана в SEQ ID NO: 21, 23 и 25, или кодирующая часть этого гена, особенно под контролем гетерологичного конститутивного промотора, вызывающего сверхэкспрессию продукта эндогенного гена и тем самым подавляющего реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Изобретение также включает трансгенное растение сахарной свеклы, в геноме которого присутствует гетерологичный ген FLC, который имеет по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью кДНК FLC, зарегистрированной под инвентарным номером AF537203, особенно под контролем гетерологичного конститутивного промотора,вызывающего сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляющего реакции яровизации у растения сахарной свеклы. В специфическом варианте реализации изобретения предлагается гетерологичный ген FLC, который имеет по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью кДНК FLC, описанной в SEQ ID NO: 3, причем экспрессия гена FLC вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC, тем самым подавляя реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Изобретение также включает трансгенное растение сахарной свеклы, в геноме которого присутствует эндогенный ген FLC, который имеет по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 27, 28 и 29, или кодирующая часть этого гена, причем эта кодирующая часть может находиться под контролем гетерологичного конститутивного промотора, когда экспрессия гена FLC вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляет реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Изобретение также включает трансгенное растение сахарной свеклы, в геноме которого присутствует эндогенный ген FLC, который имеет по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 21, 23 и 25, или кодирующая часть этого гена, причем эта кодирующая часть может находиться под контролем гетерологичного конститутивного промотора, когда экспрессия гена FLC вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляет реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Изобретение также включает семенной материал трансгенной сахарной свеклы, в геноме которого присутствует гетерологичный ген FLC, включающий кодирующий регион, который состоит из кДНКFLC, зарегистрированной под инвентарным номером AF537203, особенно под контролем гетерологичного конститутивного промотора, вызывающего сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляющего реакции яровизации у растения сахарной свеклы. В специфическом варианте реализации изобретения предлагается гетерологичный ген FLC, описанный в SEQ ID NO: 3, причем экспрессия гена FLC у растения, выращенного из указанного семенного материала, вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC, тем самым подавляя реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Изобретение также включает семенной материал трансгенного растения сахарной свеклы, в геноме которого присутствует эндогенный ген FLC, который описан в SEQ ID NO: 27, 28 и 29, или кодирующая часть этого гена, особенно при том условии, что эта кодирующая часть эндогенного гена FLC находится под контролем гетерологичного конститутивного промотора, когда экспрессия гена FLC у растения, выращенного из указанного семенного материала, вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляет реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Изобретение также включает семенной материал трансгенного растения сахарной свеклы, в геноме которого присутствует эндогенный ген FLC, который описан в SEQ ID NO: 21, 23 и 25, или кодирующая часть этого гена, особенно при том условии, что эта кодирующая часть эндогенного гена FLC находится под контролем гетерологичного конститутивного промотора, когда экспрессия гена FLC у растения, выращенного из указанного семенного материала, вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляет реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Изобретение также включает семенной материал трансгенного растения сахарной свеклы, в геноме которого присутствует гетерологичный ген FLC, имеющий по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью кДНК FLC, зарегистрированной под инвентарным номером AF537203, особенно под контролем гетерологичного конститутивного-8 016749 промотора, вызывающего сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляющего реакции яровизации у растения сахарной свеклы. В специфическом варианте реализации изобретения предлагается гетерологичный ген FLC, который имеет по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью кДНК FLC, описанной в SEQ ID NO: 3, причем экспрессия гена FLC у растения, выращенного из указанного семенного материала, вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC,тем самым подавляя реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Изобретение также включает семенной материал трансгенного растения сахарной свеклы, в геноме которого присутствует эндогенный ген FLC, который имеет по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 27, 28 и 29, или кодирующая часть этого гена, причем эта кодирующая часть может находиться под контролем гетерологичного конститутивного промотора, когда экспрессия гена FLC у растения, выращенного из этого семенного материала, вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляет реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Изобретение также включает семенной материал трансгенного растения сахарной свеклы, причем в геноме этого семенного материала присутствует эндогенный ген FLC, который имеет по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью,описанной в SEQ ID NO: 21, 23 и 25, или кодирующая часть этого гена, причем эта кодирующая часть может находиться под контролем гетерологичного конститутивного промотора, когда экспрессия генаFLC у растения, выращенного из этого семенного материала, вызывает сверхэкспрессию продукта генаFLC и тем самым подавляет реакции яровизации у растения сахарной свеклы. Один из вариантов реализации изобретения включает предлагаемое изобретением трансгенное растение сахарной свеклы, которое несет в своем геноме гетерологичный ген FLC, как это раскрыто здесь,причем этот ген был предварительно встроен в экспрессионную кассету, особенно в экспрессионную кассету с нуклеотидной последовательностью 786-2817 из SEQ ID NO: 1. Один из вариантов реализации изобретения включает предлагаемое изобретением трансгенное растение сахарной свеклы, которое несет в своем геноме гетерологичный ген FLC, как это раскрыто здесь,причем этот ген был предварительно встроен в экспрессионную кассету, особенно в экспрессионную кассету с нуклеотидной последовательностью 786-2817 из SEQ ID NO: 1, причем эта экспрессионная кассета включает конститутивный промотор. Один из вариантов реализации изобретения включает предлагаемое изобретением трансгенное растение сахарной свеклы, которое несет в своем геноме гетерологичный ген FLC, как это раскрыто здесь,причем этот ген был предварительно встроен в экспрессионную кассету, особенно в экспрессионную кассету с нуклеотидной последовательностью 786-2817 из SEQ ID NO: 1, причем эта экспрессионная кассета включает промотор CaMV35S. В другом специфическом варианте реализации изобретение относится к трансгенному растению сахарной свеклы, геном которого включает гетерологичный ген FLC, как это раскрыто здесь выше, особенно встроенный в экспрессионную кассету под контролем конститутивного промотора, предпочтительно конститутивного промотора CaMV35S, а также терминатора, предпочтительно маннопинсинтетазы (mas) vis Agrobacterium tumefaciens. В одном из вариантов реализации изобретение относится к трансгенному растению сахарной свеклы, в котором содержится экспрессионная кассета с кодирующим регионом эндогенного гена FLC, предпочтительно гена FLC, структура которого описана в SEQ ID NO: 27, 28 и 29. В одном из вариантов реализации изобретение относится к трансгенному растению сахарной свеклы, в котором содержится экспрессионная кассета с кодирующим регионом эндогенного гена FLC, предпочтительно гена FLC, структура которого описана в SEQ ID NO: 21, 23 и 25. В специфическом варианте реализации изобретения указанная кодирующая область эндогенного гена FLC находится под контролем конститутивного промотора, предпочтительно конститутивного промотора CaMV35S, но наиболее предпочтительно под контролем конститутивного промотора CaMV35S и терминатора, предпочтительно маннопин-синтетазы (mas) из Agrobacterium tumefaciens. Еще в одном варианте реализации изобретение связано со способом получения предлагаемого этим изобретением трансгенного растения сахарной свеклы, причем указанный способ включает трансформирование клетки растения сахарной свеклы трансгеном, включающим регуляторные последовательности, которые функционально связаны с кодирующей областью гетерологичного или эндогенного гена растений FLC; идентификацию клетки растения сахарной свеклы, несущей встроенный трансген; и регенерацию трансгенного растения из растительной клетки, идентифицированной в предыдущем пункте. Далее, настоящее изобретение включает производство биотоплива, в частности этанола, бутанола,метанола, биогаза и дизельного топлива, получаемого из предложенного изобретением трансгенного растения сахарной свеклы, которое, как это описано выше, содержит в своем геноме кодирующую область гетерологичного или эндогенного гена FLC, причем экспрессия указанного гена FLC вызывает сверхэкс-9 016749 прессию продукта гена FLC и тем самым подавляет реакции яровизации у указанного растения сахарной свеклы. Далее, настоящее изобретение включает производство в промышленных масштабах других полезных материалов, например пластиков, получаемых из предложенного изобретением трансгенного растения сахарной свеклы, которое, как это описано выше, содержит в своем геноме кодирующую область гетерологичного или эндогенного гена FLC, причем экспрессия указанного гена FLC вызывает сверхэкспрессию продукта гена FLC и тем самым подавляет реакции яровизации у указанного растения сахарной свеклы. Настоящее изобретение также включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в клетке растения сахарной свеклы, который включает введение в указанную растительную клетку первой нити РНК и второй нити РНК, причем указанная первая нить РНК или в альтернативном варианте указанная вторая нить РНК, по существу, комплементарны по меньшей мере части нити РНК указанного эндогенного гена AGL20 и способны гибридизироваться или отжигаться с РНК, вырабатываемой геномAGL20, вызывая подавление экспрессии эндогенного гена AGL20, а указанная первая нить РНК и указанная вторая нить РНК образуют двунитевую РНК, которая принимает участие в РНК-интерференции,подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20. Один из вариантов реализации изобретения включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 у растения сахарной свеклы, который заключается во введении в указанную растительную клетку первой нити РНК и второй нити РНК, причем введение в указанную растительную клетку первой нити РНК и второй нити РНК приводит к трансформированию указанной клетки с участием гетерологичной ДНК, которая при транскрибировании в растительной клетке дает выход нуклеотидной последовательности, соответствующей указанной первой нити РНК и нуклеотидной последовательности, соответствующей указанной второй нити РНК. Еще в одном варианте реализации изобретения указанная гетерологичная ДНК включает инвертированный повтор, который при транскрибировании дает выход нуклеотидной последовательности, соответствующей указанной первой нити РНК и нуклеотидной последовательности, соответствующей указанной второй нити РНК. В специфическом варианте реализации изобретение относится к предлагаемому способу подавления экспрессии эндогенного гена, как это описано выше, причем в этом способе указанная первая нить РНК имеет степень комплементарности с частью РНК фрагмента гена AGL20 сахарной свеклы размером приблизительно 0,6 кб, получаемого из кДНК сахарной свеклы, которая, в свою очередь, получена из тотальной РНК, экстрагированной из листьев сахарной свеклы в реакции с обратной транскриптазой и с использованием праймера 5'-CCRATGAACARTTSNGTCTCNACWTC-3' (SEQ ID NO: 14), причем полученная кДНК используется как шаблон в ПЦР (полимеразной цепной реакции), где задействован вырожденный прямой праймер с нуклеотидной последовательностью 5'ATGGTKMGRGGNAARACNCAGATGA-3' (SEQ ID NO: 13), которая совмещает гомологию последовательности с крайним концевым участком NH2, начиная от кодона ATG с охватом кодонов с 1 по 9, а также вырожденный обратный праймер с нуклеотидной последовательностью 5'CCRATGAACARTTSNGTCTCNACWTC-3' (SEQ ID NO: 14), которая комплементарна концевому участку СООН, гибридизируясь непосредственно вверх от стоп-кодона в экзоне 8, что позволяет указанной первой нити РНК гибридизироваться или отжигаться с нитью РНК, указанного фрагмента гена AGL20,приводя к подавлению экспрессии эндогенного гена AGL20. Еще один вариант реализации изобретения включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20, как это описано здесь выше, причем в этом способе указанная первая нить РНК, по существу, комплементарна части РНК фрагмента гена AGL20 сахарной свеклы, структура которого описана вSEQ ID NO: 6, что позволяет ей гибридизироваться или отжигаться с РНК, вырабатываемой геномAGL20, и тем самым вызывать супрессию экспрессии эндогенного гена AGL20. Эта супрессия гена AGL20 приводит к задержке реакций яровизации у растущей сахарной свеклы или вызывает у сахарной свеклы развитие не стрелкующегося фенотипа, а это означает, что растение сахарной свеклы перестает реагировать на типичный 18-недельный период яровизации выбросом стрелки и последующим цветением, продолжая вегетативный рост (без выброса стрелки) и развивая нормальный стержневой корень. Растения, экспрессирующие указанное замедление реакций яровизации или указанный не стрелкующийся фенотип, можно достаточно просто идентифицировать и отбирать, применяя эксперименты с фенотипическим анализом при стандартизованных условиях выращивания подопытных растений. Изобретение также включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20, как это описано здесь выше, причем в этом способе указанная первая нить РНК включает фрагмент последовательности длиной приблизительно от 21 до 23 нуклеотидов, который, по существу, комплементарен части РНК указанного гена AGL20 сахарной свеклы, благодаря чему и происходит подавление экспрессии эндогенного гена AGL20. Изобретение включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20, как это описано здесь выше, причем в этом способе указанная первая нить РНК включает фрагмент последовательности- 10016749 длиной приблизительно от 21 до 25 нуклеотидов, который, по существу, комплементарен части РНК указанного гена AGL20 сахарной свеклы, благодаря чему и происходит подавление экспрессии эндогенного гена AGL20. Изобретение дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе указанная первая нить РНК включает фрагмент последовательности длиной приблизительно от 21 до 30 нуклеотидов, который, по существу, комплементарен части РНК указанного гена AGL20 сахарной свеклы, благодаря чему и происходит подавление экспрессии эндогенного гена AGL20. Один из вариантов реализации изобретения дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе указанная первая нить РНК включает фрагмент последовательности длиной приблизительно от 18 до 23 нуклеотидов, который, по существу, комплементарен части РНК указанного гена AGL20 сахарной свеклы, благодаря чему и происходит подавление экспрессии эндогенного гена AGL20. Один из вариантов реализации изобретения дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе указанная первая нить РНК включает фрагмент последовательности длиной приблизительно от 18 до 25 нуклеотидов, который, по существу, комплементарен части РНК указанного гена AGL20 сахарной свеклы, благодаря чему и происходит подавление экспрессии эндогенного гена AGL20. Один из вариантов реализации изобретения дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе указанная первая нить РНК включает фрагмент последовательности длиной приблизительно от 18 до 30 нуклеотидов, который, по существу, комплементарен части РНК указанного гена AGL20 сахарной свеклы, благодаря чему и происходит подавление экспрессии эндогенного гена AGL20. В одном из вариантов реализации изобретение относится к предлагаемому способу подавления экспрессии гена AGL20, как это описано выше, причем в этом способе гетерологичная ДНК, которая транскрибирует указанную первую нить РНК, получена из фрагмента кДНК размером 0,26 кб, состоящего из экзонов 3-7 фрагмента гена AGL20 сахарной свеклы размером приблизительно 0,6 кб, получаемого из кДНК сахарной свеклы, которая, в свою очередь, получена из тотальной РНК, экстрагированной из листьев сахарной свеклы в реакции с обратной транскриптазой и с применением праймера 5'CCRATGAACARTTSNGTCTCNACWTC-3' (SEQ ID NO: 14), причем полученная кДНК используется как шаблон в ПЦР (полимеразной цепной реакции), где задействован вырожденный прямой праймер с нуклеотидной последовательностью 5'-ATGGTKMGRGGNAARACNCAGATGA-3' (SEQ ID NO: 13), которая совмещает гомологию последовательности с крайним концевым участком NH2, начиная от кодона ATG с охватом кодонов с 1 по 9, а также вырожденный обратный праймер с нуклеотидной последовательностью 5'-CCRATGAACARTTSNGTCTCNACWTC-3' (SEQ ID NO: 14), которая комплементарна СООНконцу, гибридизируясь непосредственно вверх от стоп-кодона в экзоне 8, в реакции ПЦР с применением прямого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 5'-CTATGGATCCGCATGCTGATCTCCTGATC-3' (SEQ ID NO: 8) и обратного праймера с нуклеотидной последовательностью 5'GAAGCAGAAACTTACCTAAGA AGTTAAAAAGTCTCGAAC-3' (SEQ ID NO: 9). Один из вариантов реализации изобретения дополнительно включает способ подавления экспрессии гена AGL20, в котором структура гетерологичной ДНК, транскрибирующей указанную первую нить РНК, описана в SEQ ID NO: 5. В одном из аспектов изобретение относится к экспрессионной кассете, включающей гетерологичную ДНК, которая, в свою очередь, включает первую нить РНК и вторую нить РНК, причем указанная первая нить РНК имеет такую степень комплементарности по меньшей мере с частью нити РНК, транскрибируемой эндогенным геном AGL20, которая позволяет указанной первой нити РНК гибридизироваться или отжигаться с нитью РНК, транскрибируемой указанным эндогенным геном AGL20, а указанная первая нить РНК и указанная вторая нить РНК образуют двунитевую РНК, которая экспрессируясь в растении вызывает супрессию эндогенного гена AGL20. В специфическом варианте реализации изобретения предлагается экспрессионная кассета, включающая инвертированный повтор, который, транскрибируясь в клетке сахарной свеклы, формирует в указанной растительной клетке молекулу двунитевой РНК, включающую указанные первую и вторую нити РНК. Еще в одном специфическом варианте реализации изобретения предлагается экспрессионная кассета, в которой указанный инвертированный повтор функционально связан с конститутивным промотором,предпочтительно с промотором CaMV. В одном из вариантов реализации изобретение относится к экспрессионной кассете, которая описана здесь выше, содержащей гетерологичную ДНК, которая транскрибирует указанную первую нить РНК,причем эта гетерологичная ДНК получена из фрагмента кДНК размером 0,28 кб, состоящего из экзонов 3-7 фрагмента гена AGL20 сахарной свеклы размером приблизительно 0,6 кб, получаемого из кДНК сахарной свеклы, которая, в свою очередь, получена из тотальной РНК, экстрагированной из листьев сахарной свеклы в реакции с обратной транскриптазой и с применением праймера 5'- 11016749CCRATGAACARTTSNGTCTCNACWTC-3' (SEQ ID NO: 14), причем полученная кДНК используется как шаблон в ПЦР (полимеразной цепной реакции), где задействован вырожденный прямой праймер с нуклеотидной последовательностью 5'-ATGGTKMGRGGNAARACNCAGATGA-3' (SEQ ID NO: 13), которая совмещает гомологию последовательности с крайним концевым участком NH2, начиная от кодона ATG с охватом кодонов с 1 по 9, а также вырожденный обратный праймер с нуклеотидной последовательностью 5'-CCRATGAACARTTSNGTCTCNACWTC-3' (SEQ ID NO: 14), которая комплементарна СООНконцу, гибридизируясь непосредственно вверх от стоп-кодона в экзоне 8, в реакции ПЦР с применением прямого праймера,имеющего нуклеотидную последовательность 5'CTATGGATCCGCATGCTGATCTCCTGATC-3' и обратного праймера с нуклеотидной последовательностью 5'-GAAGCAGAAACTTACCTAAGA AGTTAAAAAGTCTCGAAC-3'. Еще в одном специфическом варианте реализации изобретения экспрессионная кассета содержит гетерологичную ДНК, описанную в SEQ ID NO: 5. В одном из вариантов реализации изобретения предлагаемая изобретением экспрессионная кассета,которая описана здесь выше, включает инвертированный повтор, который, транскрибируясь в клетке сахарной свеклы, формирует в указанной растительной клетке молекулу двунитевой РНК, включающую указанные первую и вторую нити РНК. В специфическом варианте реализации изобретения указанный инвертированный повтор функционально связан с конститутивным промотором, предпочтительно с промотором CaMV. В одном из вариантов реализации изобретение относится к описанной здесь выше экспрессионной кассете, в которой указанная гетерологичная ДНК вставлена между промотором и терминатором, причем эта гетерологичная ДНК может быть получена посредством:a) амплификации фрагмента кДНК размером 0,28 кб, состоящего из экзонов 3-7 фрагмента генаAGL20 размером 0,6 кб, соответствующего изобретению и описанного здесь выше, в ПЦР с использованием прямого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 5'-CTATGGATCCGCATGCTGb) амплификации фрагмента 0,19 кб, включающего интрон ST-LS1 и фланкирующие сайты сплайсинга с использованием прямого праймера 5'-ATCCAACCGCGGACCTGCACATCAACAA-3' (SEQ IDc) слияния продуктов амплификации, полученных на этапах а) и b), друг с другом посредством повторной ПЦР с применением праймеров, описанных в SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 7, а также с использованием смеси обоих продуктов амплификации в качестве шаблона, что дает на выходе гибридный продукт длиной 0,47 кб;d) амплификации фрагмента BvAGL20 размером 0,28 кб во второй раз с применением прямого праймера 5'-TAAATCCGCGGAAGAAGTTAAAAAGTCTCGAAC-3' (SEQ ID NO: 10) и обратного праймера 5'-CTATTTGTCGACGCATGCTGATCTCCTGATC-3' (SEQ ID NO: 11), которые отличаются от праймеров, использованных на этапе а) в отношении их линкеров;e) слияния обоих фрагментов в сайтах рестрикции Sac II для создания инвертированного повтора последовательности BvAGL20, отделенного интроном от гена картофеля ST-LS1. В специфическом варианте реализации изобретения предлагается экспрессионная кассета, описанная нуклеотидной последовательностью 233-2657 из SEQ ID NO: 2. Один из вариантов реализации изобретения дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе введение указанных первой и второй нити РНК осуществляется посредством вставки в геном указанной растительной клетки экспрессионной кассеты, предлагаемой изобретением и описанной выше, которая включает указанную гетерологичную ДНК. Один из вариантов реализации изобретения дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе указанная экспрессионная кассета описана нуклеотидной последовательностью 233-2657 из SEQ ID NO: 2. Один из вариантов реализации изобретения дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе введение указанных первой и второй нитей РНК осуществляется посредством инсерции (вставки) указанных нитей в растительную клетку через инъекцию. Один из вариантов реализации изобретения дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, который дополнительно включает введение в геном растения экспрессионной кассеты, включающей инвертированный повтор, который при транскрибировании образует молекулу двунитевой РНК в указанной растительной клетке, включающей указанные первую и вторую нити РНК. Один из вариантов реализации изобретения дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе указанная экспрессионная кассета описана нуклеотидной последовательностью 233-2657 из SEQ ID NO: 6.- 12016749 Изобретение дополнительно включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе указанный инвертированный повтор функционально связан с конститутивным промотором. Изобретение включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, дополнительно включающий интрон, расположенный между первой и второй нитями РНК. Изобретение также включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, причем в этом способе указанный интрон описан нуклеотидной последовательностью 817-1009 из SEQ ID NO: 2. Изобретение включает трансгенную клетку сахарной свеклы, предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, включающую гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция включает гетерологичную ДНК, которая при транскрибировании в клетке сахарной свеклы дает на выходе первую нуклеотидную последовательность РНК и вторую нуклеотидную последовательность РНК, причем первая нуклеотидная последовательность РНК, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК, воспроизводимой указанным эндогенным геном AGL20, благодаря чему она способна гибридизироваться или отжигаться с РНК, вырабатываемой геном AGL20, то есть вызывать подавление экспрессии эндогенного гена AGL20, а указанная первая нуклеотидная последовательность РНК и указанная вторая нуклеотидная последовательность РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНКинтерференции, подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20. В одном из вариантов реализации изобретения предлагается трансгенная клетка сахарной свеклы,предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, в которой гетерологичная ДНК может быть получена из фрагмента кДНК размером 0,28 кб, состоящего из экзонов 3-7 фрагмента гена AGL20 размером 0,6 кб,соответствующего изобретению и описанного здесь выше, в ПЦР с использованием прямого праймера,имеющего нуклеотидную последовательность 5'-CTATGGATCCGCATGCTG ATCTCCTGATC-3' (SEQNO: 8),и обратного праймера с нуклеотидной последовательностью 5'GAAGCAGAAACTTACCTAAGA AGTTAAAAAGTCTCGAAC-3' (SEQ ID NO: 9). В специфическом варианте реализации изобретения трансгенная клетка сахарной свеклы, предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, в соответствии с изобретением включает гетерологичную генную конструкцию, причем гетерологичная ДНК описывается SEQ ID NO: 5. Еще в одном специфическом варианте реализации изобретения трансгенная клетка сахарной свеклы, предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, в соответствии с изобретением включает гетерологичную генную конструкцию, причем указанная генная конструкция включает инвертированный повтор,который при транскрибировании образует в указанной растительной клетке молекулу двунитевой РНК,включающую указанные первую и вторую нити РНК, причем указанная молекула двунитевой РНК является пусковым фактором молчания гена AGL20. В специфическом варианте реализации изобретения предлагается трансгенная клетка сахарной свеклы, предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, включающая гетерологичную ДНК, которая вставлена между промотором и терминатором, причем указанная гетерологичная ДНК получена посредством:a) амплификации фрагмента кДНК размером 0,28 кб, состоящего из экзонов 3-7 фрагмента генаAGL20 размером 0,6 кб, соответствующего изобретению и описанного здесь выше, в рекомбинантной ПЦР с использованием прямого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 5'CTATGGATCCGCATGCTG ATCTCCTGATC-3' (SEQ ID NO: 8), и обратного праймера с нуклеотидной последовательностью 5'-GAAGCAGAAACTTACCTAAGA AGTTAAAAAGTCTCGAAC-3' (SEQ ID NO: 9);b) амплификации фрагмента 0,19 кб, включающего интрон ST-LS1 и франкирующие сайты сплайсинга с использованием прямого праймера 5'-ATCCAACCGCGGACCTGCACATCAACAA-3' (SEQ IDID NO: 12); с) слияния продуктов амплификации, полученных на этапах а) и b), друг с другом посредством повторной ПЦР с применением праймеров, описанных в SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 7, и использование смеси обоих продуктов амплификации в качестве шаблона с получением на выходе гибридного продукта размером 0,47 кб;d) амплификации фрагмента BvAGL20 размером 0,28 кб во второй раз с применением прямого праймера 5'-TAAATCCGCGGAAGAAGTTAAAAAGTCTCGAAC-3' (SEQ ID NO: 10) и обратного праймера 5'-CTATTTGTCGACGCATGCTGATCTCCTGATC-3' (SEQ ID NO: 11), которые отличаются от праймеров, использованных на этапе а) в отношении их линкеров; е) слияния обоих фрагментов в сайтах рестрикции Sac II для создания инвертированного повтора последовательности BvAGL20, отделенного интроном от гена картофеля ST-LS1. Еще в одном специфическом варианте реализации изобретения трансгенная клетка сахарной свеклы, предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, в соответствии с изобретением включает гетерологичную генную конструкцию, причем указанная генная конструкция включает экспрессионную кассету,- 13016749 которая описана в SEQ ID NO: 2. В другом специфическом варианте реализации изобретения предлагается трансгенная клетка сахарной свеклы, предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, включающая экспрессионную кассету, соответствующую изобретению, которая была описана здесь выше. В одном из вариантов реализации изобретение связано со способом получения предлагаемого этим изобретением и описанного выше трансгенного растения сахарной свеклы, причем указанный способ включает:a) трансформацию клетки сахарной свеклы экспрессионной кассетой в соответствии с изобретением, как это было описано здесь выше,b) идентификацию клетки сахарной свеклы, содержащей гетерологичную ДНК,c) регенерацию трансгенного растения из указанной растительной клетки, идентифицированной на этапе b).d) идентификацию растения сахарной свеклы, демонстрирующего задержку реакций яровизации или полное подавление реакций яровизации, проявлением чего является нестрелкующийся (NB) фенотип. е) по выбору, подтверждение присутствия в геноме растительной клетки гетерологичной ДНК, введенной на этапе а). Изобретение также включает способ подавления экспрессии гена AGL20 в клетке растения сахарной свеклы, включающий введение в растительную клетку первого фрагмента РНК, который, по существу, идентичен или комплементарен части гена AGL20, второго фрагмента РНК, который, по существу,комплементарен первому фрагменту РНК, для получения в результате этих действий подавления экспрессии эндогенного гена AGL20, причем в этом способе первый и второй фрагменты РНК образуют в растительной клетке молекулу двунитевой РНК, и эта молекула двунитевой РНК подавляет экспрессию гена AGL20 через миРНК-опосредованное молчание гена. Изобретение также включает способ подавления экспрессии эндогенного гена AGL20 в растении сахарной свеклы, причем указанный способ включает:a) введение в клетку растения сахарной свеклы первой нити РНК;b) выращивание указанной растительной клетки в первом растении;c) введение во вторую клетку растения сахарной свеклы второй нити РНК, причем указанная первая нить РНК должна быть, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК, вырабатываемой указанным эндогенным геном AGL20, и способна гибридизироваться или отжигаться с РНК, вырабатываемой геном AGL20, приводя к подавлению экспрессии эндогенного гена AGL20, а указанная первая нить РНК и указанная вторая нить РНК должны быть способными образовывать двунитевую РНК;d) выращивание указанной второй клетки сахарной свеклы во втором растении;e) скрещивание указанного первого растения с указанным вторым растением для получения семян иf) выращивание растения из указанного семени, причем в этом растении указанные первая и вторая нити РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНК-интерференции, подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20. В специфическом аспекте изобретение относится к трансгенной клетке сахарной свеклы, предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, геном которой включает:i) первую гетерологичную генную конструкцию, включающую кодирующую область гетерологичного или эндогенного гена FLC, иii) вторую гетерологичную генную конструкцию, способную кодировать композицию РНК, причем указанная конструкция включает гетерологичную ДНК, которая при транскрибировании дает на выходе первую нуклеотидную последовательность РНК и вторую нуклеотидную последовательность РНК, причем первая нуклеотидная последовательность РНК, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК, воспроизводимой указанным эндогенным геном AGL20, благодаря чему она способна гибридизироваться или отжигаться с РНК, вырабатываемой геном AGL20, а указанная первая нуклеотидная последовательность РНК и указанная вторая нуклеотидная последовательность РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНК-интерференции, подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20. В одном из вариантов реализации изобретения предлагается трансгенная клетка сахарной свеклы,предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, в которой указанная первая гетерологичная генная конструкция включает кодирующую область гена, состоящую из кДНК, зарегистрированной под инвентарным номером AF537203. В специфическом варианте реализации изобретения указанный ген FLC описан в SEQ ID NO: 3. Еще в одном варианте реализации изобретения предлагается трансгенная клетка сахарной свеклы,предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, в которой указанный ген FLC включает кодирующую область гена FLC, которая имеет по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью кДНК FLC с инвентарным номером AF537203. В специфическом варианте реализации изобретения указанный ген FLC имеет по меньшей мере 9399% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, описанной в SEQ ID NO:- 14016749 3. Еще в одном специфическом варианте реализации изобретения указанный ген FLC включает кодирующую область эндогенного гена FLC, описанную в SEQ ID NO: 21, 23 и 25. Еще в одном специфическом варианте реализации изобретения указанный ген FLC включает кодирующую область FLC, которая имеет по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 94 или 93% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью кодирующей области FLC эндогенного генаFLC, описанной в SEQ ID NO: 21, 23 и 25. В одном из вариантов реализации изобретение относится к трансгенной клетке сахарной свеклы,предпочтительно трансгенной сахарной свеклы (в соответствии с изобретением, как это было описано здесь выше), причем указанная гетерологичная ДНК, включенная во вторую генную конструкцию, может быть получена из фрагмента кДНК размером 0,28 кб, состоящего из экзонов 3-7 фрагмента генаAGL20 размером 0,6 кб, соответствующего изобретению и описанного здесь выше, в ПЦР с использованием прямого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность 5'-CTATGGATCCGCATGCTGATCTCCTGATC-3' (SEQ ID NO: 8), и обратного праймера с нуклеотидной последовательностью 5'GAAGCAGAAACTTACCTAAGA AGTTAAAAAGTCTCGAAC-3' (SEQ ID NO: 9). В одном из вариантов реализации изобретение относится к трансгенной клетке сахарной свеклы,предпочтительно трансгенной сахарной свеклы (в соответствии с изобретением, как это было описано здесь выше), причем гетерологичная ДНК, которая транскрибирует указанную первую нить РНК, описана в SEQ ID NO: 5. В одном из вариантов реализации изобретение относится к трансгенной клетке или трансгенному растению сахарной свеклы (в соответствии с изобретением, как это было описано здесь выше), причем указанная гетерологичная ДНК, включенная во вторую генную конструкцию, включает инвертированный повтор, который при транскрибировании образует в указанной растительной клетке молекулу двунитевой РНК, включающую указанные первую и вторую нити РНК, причем указанная молекула двунитевой РНК является пусковым фактором молчания гена AGL20. В одном из вариантов реализации изобретение относится трансгенной клетке или трансгенному растению сахарной свеклы, соответствующим изобретению и описанным здесь выше, которые включают во второй генной конструкции гетерологичную ДНК, вставленную между промотором и терминатором,причем эта гетерологичная ДНК может быть получена посредством:a) амплификации фрагмента кДНК размером 0,28 кб, состоящего из экзонов 3-7 фрагмента генаb) амплификации фрагмента длиной 0,19 кб, включающего интрон ST-LS1 и франкирующие сайты сплайсинга с использованием прямого праймера 5'-ATCCAACCGCGGACCTGCACATCAACAA-3' (SEQc) слияния продуктов амплификации, полученных на этапах а) и b), друг с другом посредством повторной ПЦР с применением праймеров, описанных в SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 7 и с использованием смеси обоих продуктов амплификации в качестве шаблона с получением на выходе гибридного продукта размером 0,47 кб;d) амплификации фрагмента BvAGL20 размером 0,28 кб во второй раз с применением прямого праймера 5'-TAAATCCGCGGAAGAAGTTAAAAAGTCTCGAAC-3' (SEQ ID NO: 10) и обратного праймера 5'-CTATTTGTCGACGCATGCTGATCTCCTGATC-3' (SEQ ID NO: 11), которые отличаются от праймеров, использованных на этапе а) в отношении их линкеров;e) слияния обоих фрагментов в сайтах рестрикции Sac II для создания инвертированного повтора последовательности BvAGL20, отделенного интроном от гена картофеля ST-LS1. В одном из вариантов реализации изобретение относится к трансгенной клетке или трансгенному растению сахарной свеклы, соответствующим изобретению и описанным здесь выше, в которых указанная гетерологичная ДНК, включенная во вторую генную конструкцию, описана нуклеотидной последовательностью 233-2657 из SEQ ID NO: 2. В одном из вариантов реализации изобретения предлагается трансгенная клетка сахарной свеклы,предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, в которой указанная вторая гетерологичная генная конструкция включена в экспрессионную кассету, соответствующую изобретению, которая была описана здесь выше. В специфическом аспекте изобретение относится к трансгенному растению сахарной свеклы, как это описано здесь выше, причем совместная экспрессия первой и второй гетерологичной генной конструкции приводит к синергичной задержке реакций яровизации у указанного растения сахарной свеклы. Таким образом, в одном из вариантов реализации изобретение относится к трансгенной клетке сахарной свеклы, предпочтительно трансгенной сахарной свеклы, включающей продукты экспрессии геновAGL20 и FLC в синергично эффективном количестве. Еще в одном специфическом аспекте изобретение относится к трансгенному растению сахарной свеклы, как это описано здесь выше, причем совместная экспрессия первой и второй гетерологичной генной конструкции приводит к полному подавлению реакций яровизации у указанного растения сахарной свеклы, что выражается в развитии нестрелкующегося (NB) фенотипа. Еще в одном специфическом аспекте изобретение относится к трансгенному растению сахарной свеклы, как это описано здесь выше, причем это растение получено в результате скрещивания двух родительских растений, когда первая гетерологичная генная конструкция унаследована от одного родителя, а вторая гетерологичная генная конструкция унаследована от другого родителя, причем по меньшей мере одно из родительских растений не проявляет нестрелкующийся (NB) фенотип. В одном из вариантов реализации изобретение относится к способу получения предлагаемого этим изобретением трансгенного растения сахарной свеклы, причем указанный способ включает:a) трансформацию клетки сахарной свеклы в экспрессионную кассету, включающую гетерологичный ген FLC, причем указанный ген FLC функционально связан с регуляторными последовательностями, и/или экспрессионная кассета в соответствии с изобретением и так, как это описано здесь выше,включает гетерологичную генную конструкцию, способную подавлять экспрессию эндогенного генаb) идентификацию клетки сахарной свеклы, содержащей гетерологичную ДНК;c) по выбору, трансформацию клетки сахарной свеклы, идентифицированной на этапе b), экспрессионной кассетой, включающей гетерологичный ген FLC, причем указанный ген FLC функционально связан с регуляторными последовательностями, или экспрессионной кассетой, соответствующей изобретению, как это описано здесь выше, причем эта экспрессионная кассета включает гетерологичную генную конструкцию, способную подавлять экспрессию эндогенного гена AGL20 и идентифицировать клетку сахарной свеклы, содержащую обе введенные гетерологичные ДНК;d) регенерацию трансгенного растения из указанной растительной клетки, идентифицированной на этапе b);e) идентификацию растения сахарной свеклы, демонстрирующего задержку реакций яровизации или полное подавление реакций яровизации, проявлением чего является нестрелкующийся (NB) фенотип;f) по выбору, подтверждение присутствия в геноме растительной клетки гетерологичных ДНК, введенных на этапе а) и, по выбору, на этапе с). В специфическом варианте реализации изобретения способ получения трансгенного растения сахарной свеклы включает скрещивание двух родительских растений, причем первая гетерологичная генная конструкция наследуется от одного родителя (1), который представляет собой растение сахарной свеклы, включающее ген FLC в соответствии с изобретением, как это описано здесь выше, а вторая гетерологичная генная конструкция наследуется от другого родителя (2), который представляет собой растение сахарной свеклы, включающее гетерологичную генную конструкцию, которая способна подавлять экспрессию эндогенного гена AGL20 в соответствии с изобретением, как это описано здесь выше. В результате такого скрещивания получают растение, которое содержит генную конструкцию, унаследованную как от первого, так и от второго родителя, более конкретно растение, унаследовавшее генную конструкцию как от первого, так и от второго родителя и проявляющее задержку реакций яровизации или нестрелкующийся фенотип. В специфическом варианте реализации изобретение относится к способу получения трансгенного растения сахарной свеклы, причем в этом способе по меньшей мере одно из родительских растений не проявляет нестрелкующийся (NB) фенотип. Настоящее изобретение включает корень трансгенной сахарной свеклы, соответствующей изобретению, как это описано здесь выше, причем указанный корень получен от растения, выращенного из трансгенной клетки сахарной свеклы, которая включает:a) гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция включает гетерологичную ДНК, которая при транскрибировании в клетке сахарной свеклы дает на выходе первую нуклеотидную последовательность РНК и вторую нуклеотидную последовательность РНК, причем указанная первая нуклеотидная последовательность РНК, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК,воспроизводимой геном AGL20, благодаря чему она способна вызывать подавление экспрессии эндогенного гена AGL20, а указанная первая нуклеотидная последовательность РНК и указанная вторая нуклеотидная последовательность РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНК-интерференции,подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20;b) гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция включает гетерологичный или эндогенный ген FLC;c) комбинацию а) и b). Настоящее изобретение включает растение, выращенное из трансгенной клетки сахарной свеклы в соответствии с изобретением, как это описано здесь выше, причем указанная клетка включает гетерологичную генную конструкцию, а гетерологичная генная конструкция, в свою очередь, включает:a) гетерологичную ДНК, которая при транскрибировании в клетке сахарной свеклы дает на выходе первую нуклеотидную последовательность РНК и вторую нуклеотидную последовательность РНК, причем указанная первая нуклеотидная последовательность РНК, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК, воспроизводимой геном AGL20, благодаря чему она способна гибридизироваться или отжигаться в РНК, вырабатываемой геном AGL20, то есть вызывать подавление экспрессии эндогенного гена AGL20, а указанная первая нуклеотидная последовательность РНК и указанная вторая нуклеотидная последовательность РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНКинтерференции, подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20;b) гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция включает гетерологичный или эндогенный ген FLC;c) комбинацию а) и b). Настоящее изобретение также включает потомственное растение, полученное от трансгенного растения сахарной свеклы в соответствии с изобретением, как это описано здесь выше, причем указанное растение включает гетерологичную генную конструкцию, а гетерологичная генная конструкция, в свою очередь, включает: а) гетерологичную ДНК, которая при транскрибировании в клетке сахарной свеклы дает на выходе первую нуклеотидную последовательность РНК и вторую нуклеотидную последовательность РНК, причем указанная первая нуклеотидная последовательность РНК, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК, воспроизводимой геном AGL20, благодаря чему она способна гибридизироваться или отжигаться в РНК, вырабатываемой геном AGL20, то есть вызывать подавление экспрессии эндогенного гена AGL20, а указанная первая нуклеотидная последовательность РНК и указанная вторая нуклеотидная последовательность РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНКинтерференции, подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20.b) гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция включает гетерологичный или эндогенный ген FLC;c) комбинацию а) и b). Настоящее изобретение включает сахар, полученный из корня трансгенной сахарной свеклы, включающей гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция, в свою очередь, включает:a) гетерологичную ДНК, которая при транскрибировании в клетке сахарной свеклы дает на выходе первую нуклеотидную последовательность РНК и вторую нуклеотидную последовательность РНК, причем указанная первая нуклеотидная последовательность РНК, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК, воспроизводимой геном AGL20, благодаря чему она способна гибридизироваться или отжигаться в РНК, вырабатываемой геном AGL20, то есть вызывать подавление экспрессии эндогенного гена AGL20, а указанная первая нуклеотидная последовательность РНК и указанная вторая нуклеотидная последовательность РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНКинтерференции, подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20;b) гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция включает гетерологичный или эндогенный ген FLC;c) комбинацию а) и b). Настоящее изобретение включает биотопливо, в частности этанол, бутанол, метанол, биогаз (метан) и дизельное топливо, которые получены из корня трансгенной сахарной свеклы, включающей гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция, в свою очередь, включает: а) гетерологичную ДНК, которая при транскрибировании в клетке сахарной свеклы дает на выходе первую нуклеотидную последовательность РНК и вторую нуклеотидную последовательность РНК, причем указанная первая нуклеотидная последовательность РНК, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК, воспроизводимой геном AGL20, благодаря чему она способна гибридизироваться или отжигаться в РНК, вырабатываемой геном AGL20, то есть вызывать подавление экспрессии эндогенного гена AGL20, а указанная первая нуклеотидная последовательность РНК и указанная вторая нуклеотидная последовательность РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНКинтерференции, подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20;b) гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция включает гетерологичный или эндогенный ген FLC;c) комбинацию а) и b). Настоящее изобретение включает другие промышленные продукты, например пластмассы, полученные из корня трансгенной сахарной свеклы, включающей гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция, в свою очередь, включает:a) гетерологичную ДНК, которая при транскрибировании в клетке сахарной свеклы дает на выходе первую нуклеотидную последовательность РНК и вторую нуклеотидную последовательность РНК, причем указанная первая нуклеотидная последовательность РНК, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК, воспроизводимой геном AGL20, благодаря чему она способна гибридизироваться или отжигаться в РНК, вырабатываемой геном AGL20, то есть вызывать подавление экспрессии эндо- 17016749 генного гена AGL20, а указанная первая нуклеотидная последовательность РНК и указанная вторая нуклеотидная последовательность РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНКинтерференции, подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20;b) гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция включает гетерологичный или эндогенный ген FLC;c) комбинацию а) и b). Настоящее изобретение также включает способ промышленного производства сахара, этанола, биогаза и/или дизельного топлива, включающий обработку растения сахарной свеклы в соответствии с любым из предшествующих притязаний, а также получение сахара из растения сахарной свеклы, включающего гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция, в свою очередь, включает: а) гетерологичную ДНК, которая при транскрибировании в клетке сахарной свеклы дает на выходе первую нуклеотидную последовательность РНК и вторую нуклеотидную последовательность РНК, причем указанная первая нуклеотидная последовательность РНК, по существу, комплементарна по меньшей мере части нити РНК, воспроизводимой геном AGL20, благодаря чему она способна гибридизироваться или отжигаться в РНК, вырабатываемой геном AGL20, то есть вызывать подавление экспрессии эндогенного гена AGL20, а указанная первая нуклеотидная последовательность РНК и указанная вторая нуклеотидная последовательность РНК образуют двунитевую РНК, которая участвует в РНКинтерференции, подавляющей экспрессию указанного эндогенного гена AGL20;b) гетерологичную генную конструкцию, причем указанная конструкция включает гетерологичный или эндогенный ген FLC;c) комбинацию а) и b). Далее, настоящее изобретение направлено на новые композиции и способы, имеющие отношение к РНК-интерференции (RNAi). Композиции включают двухцепочечную РНК (дцРНК), содержащую нити РНК, которые, по существу, комплементарны или идентичны целевой мРНК, например мРНК, воспроизводимой геном AGL20. Как принято понимать сейчас, дцРНК подвергаются процессингу по типу куборезки с разрезанием дцРНК на малые интерферирующие РНК (миРНК). В соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения новые композиции миРНК встраиваются в комплексRISC для РНК-интерференции в отношении мРНК целевого гена, например мРНК гена AGL20 сахарной свеклы. Интерференция с экспрессией мРНК гена AGL20 приводит к подавлению или задержке реакций яровизации у сахарной свеклы. Задержка яровизации проявляется в том, что растение сахарной свеклы продолжает вегетативный рост с развитием нормального стержневого корня. В одном из вариантов реализации изобретения миРНК включает первую нить РНК, длина которой составляет от 21 до 23 нуклеотидов, и вторую нить РНК, которая гибридизируется с первой последовательностью в биологических условиях, например, в таких условиях, которые существуют внутри клетки,особенно в цитоплазме и/или в ядре клетки. Еще в одном варианте реализации изобретения миРНК включает первую нить РНК, длина которой составляет от 19 до 30 нуклеотидов, и вторую нить РНК, которая гибридизируется с первой последовательностью в биологических условиях, например, в таких условиях, которые существуют внутри клетки,особенно в цитоплазме и/или в ядре клетки. Изобретение включает миРНК любой длины при том условии, что новая миРНК играет пусковую роль в РНК-интерференции, направленной на мРНК целевого гена, например мРНК гена AGL20 сахарной свеклы. Еще в одном варианте реализации изобретения первая или вторая нити миРНК, по существу, комплементарны или идентичны нуклеотидной последовательности РНК, вырабатываемой геном AGL20,что позволяет им запускать молчание РНК. Термин "по существу, комплементарный" означает, что последовательность первой или второй нити миРНК способна в достаточной степени гибридизироваться или отжигаться с РНК, вырабатываемой целевым геном (мРНК) в условиях цитоплазмы, запуская иРНК,которая ведет к подавлению экспрессии целевого гена. Эта супрессия гена AGL20 вызывает у сахарной свеклы развитие нестрелкующегося фенотипа, а это означает, что растение сахарной свеклы перестает реагировать на типичный 18-недельный период яровизации выбросом стрелки и последующим цветением, продолжая вегетативный рост (без выброса стрелки) и развивая нормальный стержневой корень. Растения, экспрессирующие указанный нестрелкующийся фенотип, можно достаточно просто идентифицировать и отбирать, применяя эксперименты с фенотипическим анализом при стандартизованных условиях выращивания подопытных растений. В одном из вариантов реализации изобретения предлагаемая этим изобретением молекула миРНК включает нить нуклеиновой кислоты, которая, по существу, комплементарна или идентична по меньшей мере части гена AGL20. Известно, что, если нить миРНК идентична, то целевая мРНК, разрезается на бесполезные фрагменты РНК. Однако, если спаривание (оснований) не совсем идентично, то комплексRISC связывается с мРНК и способен блокировать движение рибосом вдоль нативной мРНК, но не способен разрезать мРНК на мелкие фрагменты. Тем не менее, в любом случае экспрессия гена, из которого транскрибируется мРНК, замолкает, то есть белок, кодируемый геном AGL20, не образуется. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно включает одну нить миРНК, которая, по существу, ком- 18016749 плементарна или идентична соответствующей последовательности мРНК, транскрибируемой тем геном,экспрессия которого целенаправленно изменяется. Например, нить миРНК, которая связывается с мРНК,идентична соответствующей последовательности мРНК по меньшей мере на 50%, предпочтительнее по меньшей мере на 70%, еще предпочтительнее по меньшей мере на 90% и еще предпочтительнее по меньшей мере на 95%. Необходимо понимать, что процентный показатель идентичности между одной нитью миРНК, которая, по существу, комплементарна или идентична соответствующей последовательности мРНК, транскрибируемой тем геном, экспрессию которого надо изменить, и мРНК, вырабатываемой целевым геном,который находится в диапазоне между идентичностью по меньшей мере 70% и идентичностью по меньшей мере 95%, может представлять собой любую численную величину в этом диапазоне. Известно, что для подавления экспрессии целевого гена также эффективны последовательности РНК с инсерциями, делециями и единичными точковыми мутациями (относительно целевой последовательности). Идентичность последовательности между молекулой миРНК и продуктом транскрипции целевого гена (например, мРНК целевого гена) можно оптимизировать, используя алгоритмы выверки, известные в данной области знаний, и вычисляя процентное сходство между нуклеотидными последовательностями. В альтернативном варианте молекулу миРНК, соответствующую настоящему изобретению,можно идентифицировать не по сходству ее последовательности с целевой молекулой, а по ее способности гибридизироваться с целевой последовательностью и заглушать экспрессию целевой последовательности. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения новые композиции миРНК можно использовать с РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRp) для получения новой дцРНК, из которой в результате последующего процессинга можно получить больше миРНК. Еще один вариант реализации изобретения заключается в том, что композиции однонитевой миРНК, соответствующей изобретению, не ассоциированы с комплексом RISC при связывании с соответствующей мРНК, например с мРНК, транскрибируемой геном AGL20, причем РНК-зависимая РНКполимераза служит праймером для выработки дцРНК. Еще в одном варианте реализации изобретения способ индукции молчания гена включает раздельное введение в растительную клетку смыслового фрагмента РНК, транскрибируемой целевым геном,например AGL20, и антисмыслового фрагмента РНК того же гена, причем смысловой и антисмысловой фрагменты РНК способны образовывать молекулу двунитевой РНК, которая принимает участие в изменении экспрессии целевого гена в клетке. В предпочтительном варианте реализации изобретения фрагменты РНК включены в две разные молекулы РНК. Еще в одном предпочтительном варианте реализации изобретения фрагменты РНК перед введением в клетку смешивают в таких условиях, которые позволяют им образовывать молекулу двунитевой РНК. Еще в одном предпочтительном варианте реализации изобретения фрагменты РНК вводят в указанную клетку вслед друг за другом. Еще в одном варианте реализации изобретения фрагменты РНК включены в одну молекулу РНК. В таком случае молекула РНК,предпочтительно способна сворачиваться таким образом, что указанные фрагменты РНК, которые включены в нее, образуют молекулу двунитевой РНК. Различные способы индукции молчания целевого гена за счет использования смысловых и антисмысловых фрагментов РНК описаны в документе WO 99/61631. Настоящее изобретение дополнительно предлагает способ введения в растительную клетку молекулы дцРНК, которая включает смысловой и антисмысловой фрагменты мРНК, транскрибируемой целевым геном. Однако надо признать, что лежащие в основе этого подхода механизмы индукции молчания гена за счет иРНК могут быть не вполне понятны, и вследствие этого настоящее изобретение нельзя связывать с какой-либо конкретной теорией молчания генов на основе иРНК. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин "молчание, опосредованное иРНК" не ограничивается каким-либо конкретным клеточным механизмом РНК-интерференции. Примеры Пример 1. Сборка бинарного векторатрансформации для конститутивной экспрессии гена FLC в трансгенной сахарной свекле. Генная кассета FLC находится под контролем конститутивного промотора CaMV35S. Кодирующая область гена FLC состоит из кДНК FLC растения Arabidopsis thaliana (инвентарный номер AF537203,SEQ ID NO: 3) и завершается терминатором маннопин-синтетазы (mas) из Agrobacterium tumefaciens. Генная кассета (кластер) была введена как фрагмент Asc I - Рас I размером 2,4 кб в Т-ДНК собственного бинарного вектора трансформации pVictorHiNK, несущего селектируемый маркерный ген SuperMASPMINOS для отбора маннозы в сахарной свекле (Joersbo et al., 1998), производящий бинарный вектор pHiNK260 (фиг. 1). Полная нуклеотидная последовательность pHiNK260 раскрыта в SEQ 1. По завершении всех действий бинарный вектор pHiNK260 был преобразован в штамм ЕНА 101 Agrobacterium tumefaciens (Hood et al., 198 6) посредством температурного шока, как это описано в ссылке Holsterset al., 1978. Пример 2. Амплификация и клонирование гомологов сахарной свеклы биологического вида Betavulgaris. 2.1. Амплификация и клонирование предполагаемого гомолога гена FLC из сахарной свеклы. Для того чтобы амплифицировать и клонировать гомолог гена FLC из сахарной свеклы, были сконструированы вырожденные праймеры к консервативному MADSMEF2-подобному домену, присутствующему на NH2-конце всех членов типа 2 семейства факторов транскрипции MADS box, к которому относится ген FLC (Parenicova et al., 2003). Вырожденный праймер HiNK5277 (5'CGNCGNAAYGGNCTNCTNAARAARGC-3', SEQ ID NO: 30) нацелен на мотив консервативной аминокислотной последовательности(5'GCNTAYGARCTNTCNGTNCTNTGYGAYGCNGA-3', SEQ ID NO: 31) гибридизируется непосредственно ниже HiNK5277 и нацелен на мотив аминокислотной последовательности "AYELSVLCDAE". Тотальную РНК экстрагировали из листьев и верхушек сахарной свеклы с использованием набораRNeasy Plant Mini производства компании Qiagen и конвертировали в кДНК при помощи набораFirstChoice RLM-RACE производства компании Ambion, Inc. Условия эксперимента практически соответствовали описаниям протокола 3' RLM-RACE, приложенного к набору, кроме того, в качестве праймера в реакции с обратной транскриптазой использовали адаптер 3' RACE. Предполагаемый гомолог гена FLC впоследствии был амплифицирован, начиная с реакции кДНК, как начального шаблона, в двух последовательных прогонах ПЦР с использованием внешнего праймера 3' RACE в комбинации с вырожденным праймером HiNK5277 при последующем комбинировании внутреннего праймера 3' RACE с вырожденным праймером HiNK5279 в типичных ПЦР. Полученный таким образом амплифицированный фрагмент имел длину приблизительно 0,6 кб, как можно было ожидать, исходя из последовательности гомологов гена FLC из растений биологического вида Brassica. Однако ожидается, что полученная связка ДНК может содержать множество последовательностей вследствие вырожденной сущности праймеровHiNK5277 и HiNK5279, что принципиально позволит амплифицировать многих членов семейства факторов транскрипции MADS box. Продукты ПЦР были вырезаны, очищены, клонированы и впоследствии представлены для секвенирования. Среди всех полученных последовательностей, которые в соответствии с ожиданиями, совмещали часть мотива MADS box, три высоко гомологичные последовательности были идентифицированы как предполагаемые гомологи гена FLC и получили названия contig71, 78 и 79. Эти три фрагмента кДНК отличаются друг от друга маленькими делециями внутри рамки, а это позволяет предположить, что они представляют альтернативные варианты сплайсинга одного и того же гена. На 5'-конце все три фрагмента кДНК демонстрируют большую гомологию последовательности с общедоступной последовательностью EST сахарной свеклы, зарегистрированной под инвентарным номером BQ595637. Комбинирование последовательности EST с тремя фрагментами кДНК проводилось с учетом восстановления полноразмерных кДНК, транскрибируемых предполагаемым гомологом генаFLC (SEQ ID NO: 21, 23 и 25) и соответствующих продуктов трансляции (SEQ ID NO: 22, 24 и 26). Выверка трех предполагаемых белков FLC показана на фиг. 9. 2.2 Амплификация и клонирование гомолога гена AGL20 из сахарной свеклы. Для того чтобы амплифицировать и клонировать гомолог гена AGL20 из сахарной свеклы, были сконструированы вырожденные праймеры к консервативным нуклеотидным последовательностям с выверкой кДНК AGL20 из Arabidopsis по гомологам гена AGL20 из горчицы и табака (фигура 2). Поскольку ген AGL20 принадлежит к обширному семейству факторов транскрипции MADS box, праймеры были сконструированы к регионам, консервативным у разных гомологов AGL20, но отличающихся у большинства других членов семейства(5'ATGGTKMGRGGNAARACNCAGATGA-3', SEQ ID NO: 13) совмещает гомологию последовательности с крайним концевым участком NH2, начиная от кодона ATG с охватом кодонов 1-9, а праймер HiNK619(5'-CCRATGAACARTTSNGTCTCNACWTC-3' (SEQ ID NO: 14), комплементарен СООН-концу, гибридизируясь непосредственно выше стоп-кодона в экзоне 8, охватывая кодоны 198-206 в соответствии с последовательностью AGL20 из Arabidopsis. Тотальную РНК экстрагировали из листьев сахарной свеклы с использованием набора RNeasy PlantMini производства компании Qiagen и конвертировали в кДНК с использованием обратной транскриптазы Superscript II RNase H- производства компании Life Technologies. Условия эксперимента практически соответствовали описаниям поставщиков, но в качестве праймера для реакции с обратной транскриптазой был использован HiNK619. Предполагаемый гомолог гена AGL20 был амплифицирован, начиная с реакции кДНК в качестве шаблона, и с использованием праймеров HiNK619 и HiNK624 в типичной ПЦР. Полученный таким образом амплифицированный фрагмент имел длину приблизительно 0,6 кб,как можно было ожидать, исходя из последовательности гомологов гена AGL20 из растений гетерологичных биологических видов. По данным, полученным при клонировании и секвенировании, было показано, что нуклеотидная последовательность гомолога сахарной свеклы (см. фиг. 3) имеет значительную гомологию с геном AGL20 из Arabidopsis (фиг. 4) и далее будет упоминаться здесь под названиемBvAGL20 (SEQ ID NO: 6). Хотя фрагмент BvAGL20 не имеет столь сильной гомологии, как это наблюдается для гомологов гена AGL20 от других биологических видов, включая сосну и горох, гомология сAGL20 была сильнее, чем у любых других членов семейства факторов транскрипции MADS box изArabidopsis. Частичная геномная последовательность, включая интроны 2-6, была получена посредством конструирования праймеров к экзонам 2 и 7 HiNK725 (5'-ACTAAGACAATTATCGGTACCAAAAGC-3'SEQ ID NO: 15) и HiNK729 (5'-AAGGTAGCAGATCTGGTGAAGAATTGAG-3', SEQ ID NO: 16) соответственно, которые были использованы для амплификации и секвенирования геномного фрагмента, полученного при использовании ДНК сахарной свеклы как шаблона в типичной ПЦР. Частичная геномная последовательность гомолога сахарной свеклы (SEQ ID NO: 4) показала сильный консерватизм в отношении положения инвертированных последовательностей по сравнению с последовательностью Arabidopsis, независимо от того факта, что интроны у сахарной свеклы значительно длиннее, чем у арабидопсиса. Пример 3. Сборка бинарного вектора трансформации для супрессии гена AGL20, индуцированной иРНК, у трансгенной сахарной свеклы. Посредством стратегии, известной как "рекомбинантная ПЦР" (Higuchi, 1990), фрагмент кДНК длиной 0,28 кб, состоящий из экзонов 3-7 гомолога AGL20 из сахарной свеклы (SEQ ID NO: 5) был слит со вторым интроном из гена ST-LS 1 картофеля (Eckes et al., 1986; Vancanneyt et al., 1990). При этом уделяли внимание тому, чтобы не включать домен MADS для предупреждения супрессии других факторов транскрипции MADS box в связи с выраженным консерватизмом последовательности домена MADS во всем семействе факторов транскрипции MADS box. Фрагмент BvAGL20 был амплифицирован с праймерами HiNK7 92 (5'-CTATGGATCCGCATGCTG ATCTCCTGATC-3', SEQ ID NO: 8) и 793 (5'GAAGCAGAACTTACTTAAGA AGTTAAAAAGTCTCGAAC-3', SEQ ID NO: 9), причем первый из них несет короткий линкер для присоединения сайта рестрикции BamH I, a второй несет хвост из 17 нуклеотидов, комплементарный 5'-концу интрона ST-LS1 (линкеры и хвосты далее в этом тексте будут выделены подчеркиванием). Фрагмент длиной 0,19 кб, включающий интрон ST-LS1 и фланкирующие сайты сплайсинга,был амплифицирован с праймерами(5'GTTCGAGACTTTTTAACTTCTTAGGTAAGTTTCTGCTTCTAC-3', SEQ ID NO: 12), причем HiNK529 несет линкер, включающий распознающую последовательность Sac II, a HiNK796 несет хвост из 22 нуклеотидов, идентичный 5'-концевому участку фрагмента BvAGL20 длиной 0,28 кб. Как следствие добавления хвостов, праймеры HiNK793 и 796, а также родственные продукты их амплификации комплементарны друг другу по отрезку длиной 39 нуклеотидов. На основании этого перекрывания оба продукта амплификации были слиты друг с другом посредством повторной ПЦР с применением праймеровHiNK792 и 529 и с использованием обоих продуктов амплификации в качестве шаблона, получая на выходе гибридный продукт длиной 0,47 кб. Фрагмент BvAGL20 длиной 0,28 кб был амплифицирован во второй раз с применением праймеров HiNK794 (5'-TAAATCCGCGGAAGAAGTTAAAAAGTCTCGAAC3', SEQ ID NO: 10) и 795 (5'-CTATTTGTCGACGCATGCTGATCTCCTGATC-3', SEQ ID NO: 11), которые отличаются от HiNK793 и HiNK792 соответственно только по их линкерам; HiNK794 и 795 несут 5'линкеры для присоединения распознающих последовательностей Sac II и Sac I соответственно. Оба фрагмента были слиты в сайтах рестрикции Sac II для создания инвертированного повтора последовательности BvAGL20, отделенного интроном от гена картофеля ST-LS1. Интрон был включен как спейсерный фрагмент для стабилизации инвертированного повтора, а также для повышения эффективности феномена иРНК при будущих трансгенных явлениях (Wang and Waterhouse, 2001; Smith et al., 2000). Полученный таким образом инвертированный повтор длиной приблизительно 0,75 кб впоследствии был введен между промотором Ubi3 из Arabidopsis (Norris et al., 1993) и терминатором nos из Agrobacteriumtumefaciens как фрагмент BamH I-Sal I. Позднее генная кассета была перемещена как фрагмент Asc I-PacI длиной 2,5 кб на Т-ДНК собственного бинарного вектора трансформации pVictorHiNK, дававшего на выходе pHiNK382, селективный маркерный ген для отбора по маннозе, идущий вслед за геном SuperMASPMINOS (фиг. 4). Полная нуклеотидная последовательность pHiNK382 раскрыта в SEQ ID NO: 2. Еще один вариант реализации изобретения включает два дополнительных бинарных вектора:pHiNK440 и pHiNK441, которые были собраны для трансгенной экспрессии фрагмента кДНК BvAGL20 в сахарной свекле. В отличие от pHiNK382, который несет инвертированный повтор для фрагмента кДНК BvAGL20, приводящий к моментальному образованию дцРНК или "шпильки" при экспрессии генной кассеты, pHiNK440 и 441 экспрессируют соответственно только смысловую или антисмысловую ориентацию фрагмента кДНК BvAGL20. Следовательно, дцРНК для BvAGL20 получают после событий скрещивания любого из двух векторов с другим, в результате чего происходит одновременное накопление смысловой и антисмысловой ориентации фрагмента кДНК с последующим образованием дцРНК. Генные кассеты для смысловой (pHiNK440) и антисмысловой (pHiNK441) экспрессии были получены при амплификации того же фрагмента BvAGL20 длиной 0,28 кб (SEQ ID NO: 5) с праймерами HiNK2 617 (5'-TAAATGGATCCAAGAAGTTAAAAAGTCTCGAAC-3', SEQ ID NO: 17) и HiNK795 соответственно, праймеров HiNK2618 (5'-GAAGCAGAAACTTACCTGTCGACAAGAAGTTAAAAAGTCTCGAAG3' SEQ ID NO: 18) и HiNK792, с последующим клонированием продуктов амплификации как фрагментаBamH I-Sal I между промотором UM3 и терминатором nos. Как и в случае с pHiNK382, генные кассеты были впоследствии перенесены как фрагменты Asc I-Pac I на Т-ДНК собственного бинарного вектора трансформации pVictorHiNK, который уже нес селективный маркер SuperMASPMINOS для отбора по- 21016749 маннозе с получением на выходе pHiNK440 и 441 (фиг. 7 и 8). Полная нуклеотидная последовательность бинарных векторов pHiNK440 и 441 раскрыта в SEQ 19 и SEQ 20 соответственно. По окончании все бинарные векторы были трансформированы в штамм ЕНА 101 Agrobacterium tumefaciens посредством теплового шока по протоколу, описанному в ссылке Holsters et al., 1978. Следовательно, настоящее изобретение дополнительно предлагает экспрессионную кассету, включающую фрагмент кДНК BvAGL20, ориентированный в смысловом направлении, и вторую экспрессионную кассету, включающую фрагмент кДНК BvAGL20, ориентированный в антисмысловом направлении. В одном из вариантов реализации изобретения экспрессионная кассета, включающая фрагмент кДНК BvAGL20, ориентированный в смысловом направлении, это pHiNK440, тогда как экспрессионная кассета, включающая фрагмент кДНК BvAGL20, ориентированный в антисмысловом направлении, этоpHiNK441. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу условного иРНК подавления эндогенной экспрессии гена AGL20 у сахарной свеклы, причем указанный способ включает: (а) трансформацию мужской или женской инбредной родительской линии сахарной свеклы фрагментом кДНК BvAGL20,ориентированным в смысловом направлении, и трансформацию женской или мужской инбредной родительской линии фрагментом кДНК BvAGL20, ориентированным в антисмысловом направлении; (b) скрещивание женской и мужской родительских линий по пункту (а) для получения гибридного растения сахарной свеклы, причем смысловой и антисмысловой фрагменты кДНК образуют дцРНК в гибридном растении сахарной свеклы, что приводит к сдерживанию стрелкования у указанного гибридного растения. Настоящее изобретение включает признание того факта, что родительские линии, включающие только смысловой или антисмысловой фрагмент кДНК BvAGL20, не проявят эффект иРНК экспрессии гена AGL20, следовательно, будут развиваться в направлении цветения и выработки семян для воспроизводства потомства. Только в том случае, когда смысловой и антисмысловой фрагменты будут скомбинированы в гибридном растении, механизмы иРНК действительно вызовут подавление стрелкования, в связи с чем сахарную свеклу можно будет сеять в северных широтах осенью без риска стрелкования и цветения на следующий год (весенний сезон). Эти сдвиги для сахарной свеклы с традиционного весеннего посева на подзимний посев позволяют свекловодам проводить посевы осенью и собирать урожай на следующее лето. Было показано, что зимние сорта типично дают более высокий урожай по сравнению с весенними сортами. Пример 4. Трансформация. Интактные семена сахарной свеклы были стерилизованы на поверхности, пророщены и подвергнуты предварительной обработке in vitro. Затем эксплантаты были трансформированы через генный перенос, опосредованный Agrobacterium tumefaciens по протоколу множественного прироста, раскрытому в документе WO 02/14523 А 2. 4.1. Стерилизация и проращивание семян. Семена сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) стерилизовали на поверхности и высевали на питательную среду для проращивания (GM) в асептической культуре. Питательная среда GM содержала соли Murashige and Skoog (MS) и сахарозу (приблизительно 30 г/л), миоинозитол (100 мг/л), пантотеновую кислоту (1 мг/л), кроме того, в среду GM были также введены подходящее желатинизирующее средство и регуляторы роста растений с функциями наподобие цитокинина. Уровень цитокинина, как правило, находится в типичном диапазоне от 0,5 до 5 мг/л, обычно от 1,0 до 2,0 мг/л. Был также добавлен ингибитор ауксина TIBA. 4.2. Эксцизия и инициация коротких меристематических культур. Верхушки ростков 10-20-дневных сеянцев отрезали и высевали на питательную среду для размножения ростков (SMM). В данном случае среда SMM включала соли Murashige and Skoog с сахарозой (30 г/л) и подходящее желатинизирующее средство. В дополнение к этому, среда SMM содержала по меньшей мере один цитокининовый регулятор роста, например ВА, кинетин, 2-ip или зеатин, как правило, в диапазоне концентраций приблизительно от 1 до 10 мг/л, а чаще в диапазоне концентраций 1-5 мг/л. Верхушки ростков состояли как из апикальных, так и из пазушных коротких меристематических регионов, примордия листьев, 5 мм гипокотиля и котиледонных листьев, которые обрезали для того, чтобы ограничить их дальнейшее удлинение. Каждые 7-10 дней после посева целевые эксплантаты субкультивировали в свежей среде SMM после удаления любого нового нарастающего листового материала. Целевые эксплантаты множественных ростков типично культивируют при малой интенсивности освещения(10-30 микроэйнштейнов) при 16-часовой продолжительности светового дня и температуре около 2122 С. Через 4-7 недель культуры множественных ростков похожи на компактные розетки, что свидетельствует об их готовности к трансформации. 4.3. Инокуляция и инкубация культуры множественных ростков. Для трансформации культуры множественных ростков использовали трансформацию, опосредованную Agrobacterium tumefaciens. Штамм A. tumefaciens EHA101, в соответствии с изобретением содержащий бинарные векторы (например, pHiNK260, pHiNK382, pHiNK440 и 441), выращивали на твердой питательной среде, состоящей из 1 г/л экстракта дрожжей, 5 г/л пептона и подходящего желатинизи- 22016749 рующего средства, в течение 2-3 дней при 28 С. За день до трансформации культуру множественных ростков готовили для прививки, удаляя любые остатки нарастающего листового материала. Для того чтобы начать прививку, одиночные колонии А. tumefaciens собирали вместе на оригинальном культуральном планшете YEB при помощи стерильной петли. Для фактической прививки каждого целевого эксплантата стерильное лезвие скальпеля окунали в собранный материал колоний A. tumefaciens, после чего делали им надрезы в апикальных и пазушных регионах меристемы каждого целевого объекта. Немедленно вслед за этим этапом прививки в некоторых экспериментах к раневой поверхности каждого целевого объекта прикладывали приблизительно 7 мкл индукционной среды MSMG (соли MS, 2 г/л глюкозы, MES и 200 мкМ ацетосирингона). Надрез по возможности старались делать с максимальным центрированием по меристематическим зонам, чтобы осуществить прямую доставку гена с попаданием в клетки, продуцирующие меристему. В типичном рабочем сеансе вслед друг за другом обрабатывали от десяти до двадцати целевых культур, после чего высушивали их воздухом в стерильных условиях в ламинарном шкафу в течение 10 мин. После воздушного высушивания обработанные целевые эксплантаты помещали в питательную среду MSCC для совместного культивирования (соли MS, витамин В 5, 2 мг/л ВА, 30 г/л сахарозы, 200 мкМ ацетосирингона с подходящим желатинизирующим средством). После этого обработанные эксплантаты инкубировали в питательной среде MSCC в течение 2-4 дней при 21-22 С и при постоянной темноте. 4.4. Целевая культура и отбор. После прививки и совместного культивирования эксплантаты множественных ростков переносили в свежую питательную среду SMM с 2 мг/л ВА, подходящими антибиотиками и желатинизирующим средством не менее чем на четыре дня, после чего осуществляли давление отбора по маннозе. Трансформированные ткани отбирали, постепенно повышая количество маннозы (2,5-15 г/л) и понижая количество сахарозы (20-3 г/л) после трансформации. Селективный уровень маннозы увеличивали пошаговым образом от 2,5 г/л маннозы + 20 г/л сахарозы до 4 г/л маннозы + 20 г/л сахарозы, далее 5 г/л маннозы + 20 г/л сахарозы, далее 6 г/л маннозы + 18 г/л сахарозы и 8 г/л маннозы + 15 г/л сахарозы. Культуры множественных ростков продолжали расти, увеличиваясь в размерах, после чего их осторожно делили при каждом субкультивировании, чтобы стимулировать адекватное давление отбора. В этот период уровень ВА понижали до 0,25 мг/л, а затем полностью элиминировали этот ингредиент, чтобы стимулировать удлинение ростков. Участки выживающей трансформированной ткани постоянно отделяли от умирающих участков первоначальных целевых эксплантатов, а выжившие участки снова осторожно делили для того,чтобы стимулировать строгий отбор. Отбор и регенерация ростков в типичном случае прогрессируют на протяжении промежутка времени приблизительно от 10 до 30 недель. По мере появления молодых ростков их сепарировали и выделяли под давлением отбора для наиболее эффективного отбора трансформированных ростков. 4.5. Удлинение трансформированных ростков. Когда молодые ростки достигали приблизительно 0,5-1,5 см, их переносили в контейнеры с питательной средой для удлинения ростков (удлинение развивающихся ростков усиливается при ограничении уровня цитокинина) и с отбором по маннозе, как это описано выше. Среду для удлинения ростков,содержащую соли MS, подходящее желатинизирующее средство и низкий уровень цитокинина, включают в стандартную среду для удлинения в типичном диапазоне от 0,1 до 1,0 мг/л. Оптимальное внесение цитокинина в питательную среду для сахарной свеклы составляет 0,2 мг/л кинетика. 4.6. Регенерация трансформированных растений. Отбор трансгенных ростков сахарной свеклы проводили на стандартной среде для регенерации с добавкой маннозо-6-фосфата в качестве селективного агента (WO 94/20627). Трансформированные ростки клонировали в среде для клонированияна основе MS с добавкой маннозы в количестве 5-15 г/л. Иногда желательны множественные ростки из одного первоначального трансгенного ростка, и по этому соображению для индукции клонирования была использована комбинация цитокинина и ауксина в основной среде MS. Низкий уровень обоих регуляторов роста типично варьировался в диапазоне от 0,1 до 0,5 мг/л. Для сахарной свеклы использовали соли MS, 30 г/л сахарозы,подходящее желатинизирующее средство, 2 мг/л кинетина и 0,1 мг/л NAA. Через несколько месяцев после прививки трансгенность ростков подтверждали анализом PMI или анализом ПЦР. Клональное размножение и укоренение трансгенных ростков проводили на стандартной среде для размножения и укоренения, поддерживая отбор по маннозе для элиминации химерных растений, которые избежали процедуры отбора. Наконец, растения посылали в теплицу для фенотипического тестирования. Одиночные ростки или клоны успешно укореняли при переносе в питательную среду для укоренения, содержащую основную среду MS с добавкой ауксина, например IBA, в количестве от 0,5 до 5 мг/л. В одном примере среда для укоренения содержит 5 мг/л IBA и приблизительно 12-15 г/л маннозы. Известно, что трансформация биологических видов растений сейчас представляет собой рутинную процедуру для впечатляюще большого числа растений, включая как двудольные, так и однодольные растения. В принципе, можно использовать любой способ трансформации для введения химерной ДНК (в соответствии с изобретением) в подходящую клетку-предка до тех пор, пока клетки способны регенерировать в целое растение. Способы можно подходящим образом выбирать из следующего набора: способal., 1988), бомбардировка различного растительного материала частицами, покрытыми ДНК или РНК(Klein Т.М., et al., 1987), инфицирование вирусами (неинтегративными) и т.п. Один из способов согласно изобретению включает перенос ДНК, опосредованный Agrobacterium. Еще один способ, соответствующий изобретению, заключается в применении так называемой технологии бинарных векторов, раскрытой в документе ЕР А 120516 и в патенте США 4940838. Пример 5. Условия выращивания для растений поколения Т 0. Плазмида pHiNK260 была трансформирована как в однолетних, так и в двухлетних генотипахакцепторах сахарной свеклы, тогда как трансформацию pHiNK382 проводили только в двухлетнем материале. Первое поколение трансформированных растений называется Т 0. Следующие поколения называются T1, T2 и т.д. Семена в экспериментах использовали, начиная с поколений T1, T2 и т.д. Для того чтобы создать не трансгенные (NT) контрольные растения, были воспроизведены ростки сахарной свеклы in vitro. За исключением процедур фактической трансформации и отбора эти ростки NT подвергали такой же обработке и укоренению, как и трансформированные ростки. Каждая доставка трансгенных растений в теплицу сопровождалась по меньшей мере одним контрольным NT растением с таким же генотипом. После переноса в теплицу трансформированные ростки поколения ТО и контрольные NT ростки переводили в фазу укоренения. Мелкие растения высаживали в маленькие горшки с почвой и выращивали две недели при насыщении атмосферы СО 2. По истечении этих двух недель укоренившиеся растения переносили в горшки размером 12 см (0,7 л). После фазы укоренения однолетние растения сахарной свеклы переносили в биокамеру KK3 (17 часовое искусственное освещение, дневная и ночная температура 18 С). День прибытия растения в камеру KK3 был обозначен как 0-й день и считался началом эксперимента по стенотипическому анализу. После фазы укоренения двухлетние растения сахарной свеклы переносили в теплицу VH113 (17 часовое освещение, дневная температура 25 С и ночная температура 15 С) на две недели перед яровизацией. Яровизация происходила в холодной комнате KK6 при постоянной температуре 6 С и 12-часовом малом искусственном освещении в течение нескольких недель. Обычно растения сахарной свеклы с генетическим фоном G018 яровизировались в течение 14 недель, тогда как генетический материал G024 яровизировался в течение 16 недель. День выноса растений из комнаты для яровизации был обозначен как 0-й день и считался началом эксперимента по фенотипическому анализу. Сначала растения медленно акклиматизировали две недели в биокамере KK5, поэтапно повышая температуру от 10 до 18 С, после чего их пересаживали в более крупные горшки (16 см, 2 л) и переносили в биокамеру KK3. Фенотипический анализ явлений в поколении ТО начинали на непрерывной основе и обычно продолжали 3 месяца (90 дней) или до того момента, когда все растения начинали стрелковаться. Растения,которые все еще не начинали стрелковаться по истечении 3 месяцев, называли нестрелкующимися (NB) и подвергали повторной яровизации, пытаясь индуцировать стрелкование и цветение для получения следующего поколения. Пример 6. Условия выращивания для поколений T1, T2, Т 3. Сводные данные по условиям выращивания: эксперименты по фенотипическому анализу начинались с семян. Семена проращивали на поддонах с 96 закрывающимися ячейками (горшочками). Для того чтобы выровнить характер прорастания и корнеобразования, поддерживали 17-часовое освещение поддонов и температуру 18-25 С в светлое время и 16 С в темное время. Через две недели брали образцы растений для проведения анализа методом ПЦР. Анализ методом ПЦР проводили для того, чтобы идентифицировать в популяциях потомства NT и трансгенные растения. Это достигалось посредством ПЦР или на трансгенную кассету, или на селективный маркер PMI. Популяции, сегрегирующие в однолетнем или двухлетнем цикле развития растений,также тестировали с маркерами гена В, контролирующего годичный характер цикла развития. Отбор трансгенных и NT растений проводили по результатам ПЦР. Растения типа NT служили внутренним контролем растений и сопровождали трансгенные растения на всем протяжении эксперимента. Для фенотипического анализа однолетников выбирали и высаживали в горшки только сильные растения (0-й день). Двухлетние растения держали в закрывающихся горшках и искусственно яровизировали перед началом эксперимента. Во втором описанном полуполевом испытании двухлетние растения высаживали в грунт перед яровизацией. После отбора растений проводили эксперименты по фенотипическому анализу, создавая растениям разные условия выращивания, как это более подробно будет описано ниже. Эксперимент 02-703 был выполнен в теплице VH113 в 2002 году. Фенотипический анализ однолетних растений начинали непосредственно с ПЦР, тогда как двухлетние растения сначала яровизировали в камере KK6 в течение 14 недель. Процедура яровизации и акклиматизации в KK5 была идентична таковой для поколения ТО. Эксперименты 02-741 и 735 объединяли и выполняли в теплице VH113. Отбирали только однолетние растения, которые яровизировали в KK6 в течение 17 и 19 недель. После двухнедельной акклимати- 24016749 зации в KK5 сильные растения пересадили в горшки и перенесли в теплицу VH113 на первой неделе мая 2003 года. Эксперимент 03-753 был проведен в теплице VH114. Яровизацию проводили искусственно в KK6 в течение 17 и 19 недель, а акклиматизацию - в KK5 в течение двух недель. В конце апреля и начале мая 2004 года провели пересадку растений в VH114. В этой теплице выращивание двухлетних растений проводили не в горшках, а в грунте. Поэтому эксперимент получил название полуполевого испытания. Эксперименты 04-754 и 755 объединили и выполнили по типу полуполевого испытания в теплицеVH114 с сентября 2004 по май 2005 года. Яровизация носила естественный характер и проводилась в теплице VH114 без подогрева, но и без заморозков. Растения подвергали мягкой яровизации в течение 13 недель (7-12 С) и жесткой яровизации в течение 15 недель (3-7 С). Энергичные выжившие растения яровизировали искусственно в течение 18 недель при 6 С в камере KK6 и после двух недель акклиматизации в камере KK5 перенесли в теплицу VH113 в середине марта 2005 года. Эксперименты 04-766 и 767 объединили и выполнили в климатической камере KK11 (16-часовое освещение, температура 18 С днем и 12 С ночью). Энергичные двухлетние растения яровизировали в камере KK6 в течение 15 недель при 6 С и акклиматизировали в камере KK5 в течение двух недель, после чего пересадили в горшки и перенесли в камеру KK11 (16-часовое освещение, температура 18 С днем и 12 С ночью). В экспериментах по фенотипическому анализу стрелкование растений оценивали в баллах до трех раз в неделю. День выброса стрелки определяли как день, когда впервые удавалось визуально заметить вытягивание междоузлий меристемы. Теперь указанные выше эксперименты будут описаны более подробно. Полуполевое испытание VH114 (сентябрь 2004 - май 2005 г.). Эксперименты 04-754 и 755. Семена проращивали в теплице, как при естественном, так и при искусственном освещении и подогреве для выравнивания условий проращивания. Через две недели растения в лотках с 96 закрывающимися ячейками переносили в более естественные осенние условия окружающей среды. Через шесть недель, 20 и 21 октября 2004 года отобранные растения высаживали в теплицу VH114(в грунт с обычным расположением для полевых испытаний). Измерения температуры проводили на высоте полога теплицы (воздух) и на глубине 10 см (почва). Посев. Теплица VH113, недели 37-39 (середина сентября 2004 года). В дневное время интенсивность освещения могла превышать 800 мкмоль/м 2 вследствие естественного солнечного освещения. Искусственное освещение выключали, если интенсивность освещения превышала 35 клк (600 мкмоль/м) Предварительная яровизация. Теплица VH111, недели 40-43 (конец сентября - середина октября 2004 года). Акклиматизация. Специальной температурной акклиматизации не было. Период после яровизации. Теплица VH114, недели 12-19 (апрель - середина мая 2005 года). Теплица VH113 (сентябрь 2004 - май 2005 года). Эксперименты 04-754 и 755. Семена проращивали в теплице с дополнительным освещением и подогревом для выравнивания условий проращивания (та же партия, что и в эксперименте VH114). Через две недели растения в лотках с 96 закрывающимися ячейками переносили в более естественные осенние условия окружающей среды. Через шесть недель отобранные растения из эксперимента с полуполевым испытанием были искусственно яровизированы в течение 18 недель при 6 С. После искусственной акклиматизации с поэтапным изменением температуры до 18 С растения пересаживали в горшки и переносили в теплицу с естественным и дополнительным освещением и подогревом. Измерения температуры проводили на высоте 50 см от столиков климатической камеры и теплицы. Посев. Теплица VH113, недели 37-39 (середина сентября 2004 года). В дневное время интенсивность освещения могла увеличиваться более чем до 800 мкмоль/м 2 вследствие естественного солнечного освещения. Искусственное освещение выключали, если интенсивность освещения превышала 35 клк (600 мкмоль/м 2). Предварительная яровизация. При ночных заморозках температура могла опускаться ниже 6 С, но не опускалась до 0 С. Акклиматизация. Климатическая камера KK5, недели 8-10 (начало марта). Растения пересаживали на этом этапе после яровизации. Период после яровизации. Теплица VH113, недели 10-19 (середина марта - середина мая 2005 года). В дневное время интенсивность освещения могла увеличиваться более чем до 800 мкмоль/м 2 вследствие естественного солнечного освещения. Искусственное освещение выключали, если интенсивность освещения превышала 35 клк (600 мкмоль/м 2). Климатическая камера KK11 (ноябрь 2004 - июнь 2005 года). Эксперименты 04-766 и 767. Семена проращивали в теплице с дополнительным освещением и подогревом для выравнивания условий проращивания. Через три недели растения в лотках с 96 закрывающимися лунками искусственно яровизировали в течение 16 недель при 6 С. После искусственной акклиматизации с поэтапным повышением температуры до 18 С растения пересаживали в горшки и переносили в климатическую камеру с искусственными послеяровизационными условиями и с содержанием CO2, близким к атмосферному воздуху (400 ppm). Из-за недостатка места растения высаживали в горшки размером 12 см (0,7 л), меньшие,чем в эксперименте VH113. Измерения температуры проводили на высоте 130 см от столиков под навесом климатической камеры. Посев. Теплица VH113, неделя 48 (конец ноября 2004 года). В дневное время интенсивность освещения могла увеличиваться более чем до 800 мкмоль/м 2 вследствие естественного солнечного освещения. Искусственное освещение выключали, если интенсивность освещения превышала 35 клк (600 мкмоль/м 2). Предварительная яровизация. Теплица VH113, недели 49-51 (2004 год). Растения пересаживали на этом этапе после яровизации. Период после яровизации. Климатическая камера OK125:11, недели 16-24 (конец апреля - середина июня 2005 года). Пример 7. Роль событий в генах AGL20 (pHiNK382) и FLC (pHiNK260) для проявлений стрелкования. Из 155 событий в pHiNK260, приводящих к избыточной экспрессии гена FLC, 34 продемонстрировали задержку стрелкования, как в однолетнем, так и в двухлетнем материале, а из 148 событий вpHiNK382, подавляющих экспрессию эндогенного гена AGL20, 22 продемонстрировали задержку стрелкования после типичной яровизирующей обработки растений. Были форсированы самые сильные события с получением семян, а популяции потомков с унаследованными 13 событиями в pHiNK260 и 21 событием в pHiNK382 были вновь протестированы на устойчивость к стрелкованию, чтобы подтвердить результаты, полученные в поколении Т 0. Результаты четырех наилучших событий в pHINK260 иpHiNK382 отображены на фиг. 5 и 6, соответственно, подводя итог результатам, полученным в разных поколениях и фенотипических экспериментах. Средний показатель порядкового дня стрелкования у трансгенных растений всегда сравнивали с соответствующим показателем у контрольных NT растений. Задержку стрелкования рассчитывали как разность между двумя средними показателями (фиг. 5). Например, в эксперименте Т 3-2 04-755 нетрансформированные растения (24 особи) из события 2601 начинали стрелковаться в среднем через 21 день. В то же время 12 трансгенных растений из события 2601 начинали выбрасывать стрелку в среднем через 61 день. Таким образом, задержка стрелкования для данного события в этом эксперименте составила 61-21= 40 дней. В дополнение к этому, была проведена группировка по Дункану, цель которой заключалась в том, чтобы проверить значимость различий по стрелкованию между NT и трансгенными растениями, что показано в итоговом столбце на фиг. 5 и 6. Если к концу эксперимента растения все еще не начинали выбрасывать стрелку, результат фиксировали как NB (отсутствие стрелкования). В некоторых случаях часть растений в период эксперимента,действительно начинала выброс стрелки, тогда как другая часть растений не проявляла признаков стрелкования. Например, в эксперименте Т 3-1 04755 нетрансформированные растения (19 особей) из события 2601 начинали стрелковаться в среднем через 20 дней. В то же время шестнадцать из 17 трансгенных растений из события 2601 начали выбрасывать стрелку в среднем через 61 день. Однако одно трансгенное растение так и не начало стрелковаться. Следовательно, результат этого эксперимента был записан как 17 растений (16+1NB). Таким образом, задержка стрелкования для данного события в этом эксперименте составила 61-20 = 41 дней. Не должно вызывать удивления, что при анализе событий в разных условиях, то есть в разных биокамерах и теплицах, были получены разные результаты. По этим соображениям данные о стрелковании трансгенных растений всегда сравнивали с соответствующими данными по контрольным NT растениям. Наименее индуктивной в отношении стрелкования оказалась климатическая камера KK11. Дополнительная задержка стрелкования здесь наблюдалась также и у NT растений. Вероятно, лимитирующим фактором для быстрой индукции стрелкования в этой климатической камере была низкая интенсивность освещения (200 ммоль/м 2). Тем не менее, 3 из 4 событий в pHiNK382, проанализированных в камереKK11, продемонстрировали существенную задержку стрелкования (фиг. 6). Эксперименты, проведенные в теплице VH113, чаще всего показывали отсутствие стрелкования у растений, особенно при событиях 1, 2 и 3 в pHiNK260 (фиг. 5). Например, из 54 проанализированных растений поколения Т 2 для события 1 в pHiNK260 ни одно не проявило признаков стрелкования (фиг. 5,эксперименты Т 2-1 02-741 и Т 2-2 02-735). Кроме того, событие 1 В в pHiNK382 показало отсутствие стрелкования у растений в поколении Т 1 (фиг. 6, эксперимент Т 1-204-755, 3 из 21). Наиболее индуктивными в отношении стрелкования оказались условия полуполевых испытаний в теплице VH114. Грунт здесь был холодным намного дольше, чем в горшках на столиках теплицы после искусственной яровизации в холодных комнатах. Особенно высокую индуктивность в отношении стрелкования показало полуполевое испытание зимой 2004-2005 года. В этом полуполевом испытании растения получили 22-недельное (5-месячное) воздействие яровизирующих температур с большим числом дней накопления холода (в среднем 5,2 С). Несмотря на исключительно длинный период яровизации,растения, несущие в своем генотипе события в генах FLC или AGL20, демонстрировали выраженную задержку стрелкования.