Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы

011923 Изобретение относится к растениям, растительному материалу и семенам устойчивой к глифосату сахарной свеклы. Как товарная культура, сахарная свекла (Beta vulgaris) выращивается многими странами. Ее валовый сбор составляет свыше 240 млн метрических тонн.N-Фосфонометилглицин, обычно называемый глифосат, - гербицид широкого спектра действия,широко применяемый вследствие его высокой эффективности, способности к биологическому разложению и малой токсичности для человека и животных. Глифосат ингибирует проводящую систему шикимовой кислоты, которая участвует в биосинтезе ароматических соединений, включая аминокислоты и витамины. В частности, глифосат ингибирует превращение фосфоенолпировиноградной кислоты и 3 фосфошикимовой кислоты в 5-енолпирувил-3-фосфошикимовую кислоту путем подавления синтазы 5 енолпирувил-3-фосфошикимовой кислоты (EPSP-синтазы или EPSPS). Обработка обычных растений глифосатом приводит к утрате этими растениями способности продуцировать ароматические аминокислоты (например, фенилаланин и тирозин), необходимые для их роста и развития. EPSPS присутствует во всех растениях, бактериях и грибах. Она отсутствует у животных, которые не синтезируют ароматические аминокислоты. Так как у млекопитающих, птиц и водных жизненных форм проводящая система биосинтеза ароматических аминокислот отсутствует, то глифосат мало или вообще нетоксичен для этих организмов. EPSPS-Фермент естественно присутствует в пищевых продуктах животного и микробного происхождения. Глифосат является активным ингредиентом таких гербицидов, как Раундап, производимых компанией Монсанто, США. Обычно его состав определяется как водорастворимая соль, например аммонийная соль, алкиламиновая соль, соль щелочного металла или триметилсульфониевая соль. Одним из наиболее распространенных составов является изопропиламиновая соль глифосата. Именно этот состав применяется в гербициде Раундап. Известно, что устойчивые к глифосату растения можно получать путем встройки в геном растений механизма, способного продуцировать устойчивую к глифосату EPSPS-синтазу, например CP4-EPSPS на основе культур штамма СР 4 Agrobacterium. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы можно получать методом трансформации на основе Agrobacterium путем интродуцирования в геном растения гена, например CP4-EPSPS, кодирующего устойчивую к глифосату EPSPS. Такое растение сахарной свеклы, экспрессирующее CP4-EPSPS, раскрыто в международной заявке, опубликованной подWO99/23232. Однако растения сахарной свеклы,выращиваемые из клеток, трансформированных с помощью гена CP4-EPSPS так, как описано в этой заявке, сильно различаются по своим характеристикам, вследствие того, что этот ген встраивается в геном растения случайным образом. Встройку определенного трансгена в специфичное положение на хромосоме называют явление рекомбинации. Термин явление рекомбинации также применяется для дифференцирования сортов растений, полученных методом генной инженерии. Желаемые явления рекомбинации очень редки. Большинство явлений рекомбинации отбраковываются, потому что встройка трансгена в ген растения, отвечающего за рост, приводит к его прерыванию и прекращению экспрессии, а встройка трансгена в часть хромосомы не обеспечивает экспрессию трансгена, или экспрессия очень слабая. В связи с этим требуется проводить скрининг большого количества явлений рекомбинации с целью идентифицировать явление рекомбинации, отличающееся достаточной экспрессией интродуцируемого гена. Эта процедура требует много времени и является весьма дорогостоящей. Сущность настоящего изобретения состоит в получении растения сахарной свеклы, обладающего высокой степенью устойчивости к глифосату и лишенного недостатков касательно таких важных агротехнических характеристик, как рост, урожайность, качество, резистентность к патогенным микроорганизмам и т.п. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы согласно изобретению отличается тем, что содержит фрагмент ДНК размером от 630 до 700 п.о., предпочтительно 664 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и/или фрагмент ДНК размером 3500-3900 п.о., предпочтительно 3706 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, и/или фрагмент ДНК размером 270-300 п.о.,предпочтительно 288 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, и/или фрагмент ДНК размером 710-790 п.о., предпочтительно 751 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную SEQ ID NO: 9, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, и/или фрагмент ДНК размером 990-1100 п.о., предпочтительно 1042 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК расте-1 011923 ния сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - хорошо известный стандартный метод амплификации молекул нуклеиновой кислоты (см., например, патент США 4683202). Растение сахарной свеклы согласно изобретению (далее - явление рекомбинации Н 7-1) проявляет высокую устойчивость к гербицидному глифосату. Кроме того, трансформация не влияет на особенности роста Н 7-1 и его другие важные агротехнические характеристики. Н 7-1 имеет высокую степень экспрессии гена СР 4-EPSPS Agrobacterium, который стабильно инкорпорируется внутри генома растения и сообщает растению устойчивость к глифосату. Растение продуцировали методом трансформации на основеAgrobacterium с использованием бинарного вектора PV-BVGT08. Данный вектор содержал между лево- и правосторонним участками следующие последовательности: кодирующую область, включающую последовательность, которая кодирует хлоропластный транзит-пептид из EPSPS Arabidopsis thaliana (символctp2), связанную с последовательностью, которая кодирует CP4-EPSPS, под контролем промотора на основе вируса мозаики норичника (pFMV), и Е 9-3'-концевую последовательность терминации транскрипции из Pisum sativum. В предпочитительном варианте осуществления изобретения фрагменты ДНК размером 3706, 664,288, 751 и 1042 п.о. проявляют по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 13, SEQID NO: 11, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 17, соответственно. Например, 95% сродство означает, что 95% нуклеотидов данной последовательности идентичны со сравниваемой последовательностью. В связи с этим последовательности можно выравнивать и проводить сравнение с помощью программы BLAST (доступна, например, на сайте: http://www.ncbi.nlm.nib.gov/blast/b12seq/bl2.html). Наиболее предпочтителен вариант осуществления изобретения, в котором фрагмент ДНК размером 3706 п.о. имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6, фрагмент ДНК размером 664 п.о. имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13, фрагмент ДНК размером 288 п.о. имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11, фрагмент ДНК размером 751 п.о. имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12 и/или фрагмент ДНК размером 1042 п.о. имеет нуклеотидную последовательностьSEQ ID NO: 17. Объектом настоящего изобретения являются также семена вышеуказанного растения. Эти семена могут быть использованы для выращивания устойчивых к глифосату растений сахарной свеклы. Семена можно высевать, и культивируемые растения будут проявлять устойчивость к глифосату. Объектом изобретения являются также клетка, ткань или часть устойчивого к глифосату растения сахарной свеклы. Еще одним объектом настоящего изобретения явлется способ идентификации устойчивого к глифосату растения сахарной свеклы, отличающийся тем, что он включает этап(ы):a) амплификации фрагмента ДНК размером от 630 до 700 п.о., предпочтительно размером 664 п.о.,из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и/илиb) амплификации фрагмента ДНК размером 3500-3900 п.о., предпочтительно 3706 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, и/илиc) амплификации фрагмента ДНК размером 270-300 п.о., предпочтительно 288 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, и/илиd) амплификации фрагмента ДНК размером 710-790 п.о., предпочтительно 751 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, и/илиe) амплификации фрагмента ДНК размером 990-1100 п.о., предпочтительно 1042 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16. Способ позволяет легко осуществлять детекцию устойчивого к глифосату трансгенного растения сахарной свеклы посредством стандартных методов молекулярной биологии. Еще одним объектом изобретения является тест-набор для идентификации устойчивого к глифосату трансгенного растения сахарной свеклы, его клеток, ткани или частей. Набор содержит по крайней мере одну пару праймеров, включающую первый праймер и второй праймер для полимеразной цепной реакции, которые обеспечивают специфичную идентификацию Н 7-1, его клеток, ткани или частей.-2 011923 Первый праймер предпочтительно имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 14, а второй праймер - SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 16. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения как первый праймер, так и второй праймер узнают нуклеотидную последовательность, которая является частью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5. Изобретение иллюстрируется следующими фигурами. Фиг. 1 - карта бинарного вектора PV-BVGT08. Фиг. 2 - идентификация H7-1 методом ПЦР. Проведен анализ проб ДНК из 18 растений. Негативный контроль ДНК из нетрансформированной сахарной свеклы; позитивный контроль ДНК из исходного трансформанта Н 7-1. Фиг. 3 - идентификация Н 7-1 методом многократной ПЦР и дискриминация трансгенного event H71 и нетрансгенных растений. Проведен анализ проб ДНК из 54 растений. Фиг. 4 - pFMV-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3'-встройка и сайты расщепления рестрикционных ферментовHindIII, XbaI, ClaI, PstI и BamHI. Фиг. 5 - анализ зависимости системы встройка/количество копий в Н 7-1. Для Саузерн-блот-анализа 10 г геномной ДНК Н 7-1 расщепляли с помощью PstI, HindIII, XbaI, ClaI и BamHI (дорожка 3-7). Нетрансформированную геномную ДНК в качестве негативного контроля расщепляли с помощью BamHI(дорожка 8). PV-BVGT08-Плазмиду в качестве позитивного контроля расщепляли с помощью BamHI. Дорожки 2 и 9 являются маркерами размеров. Блот исследовали посредством кодирующей области CP4EPSPS, меченной 32 Р. Зонд представляет собой внутреннюю последовательность гена CP4-EPSPS, положение 447-1555 п.о. Фиг. 6 - Саузерн-блот-анализ Н 7-1 с целью изучения интактности ctp2-CP4-EPSPS-кодирующей области. 10 г геномной ДНК Н 7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и нетрансгенной контрольной ДНК,смешанной с PV-BVGT08, расщепляли с помощью XbaI и HindIII/BamHI. Блот исследовали посредствомCP4-EPSPS-ПЦР-фрагмента, меченного 32 Р. Зонд представляет собой последовательность PV-BVGT08,положение 447-1555 п.о. Фиг. 7 - Саузерн-блот-анализ Н 7-1 с целью изучения интактности области промотора. 10 г геномной ДНК Н 7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и нетрансгенной контрольной ДНК, смешанной с PVBVGT08, расщепляли с помощью HindIII, XbaI и SacI/XhoI. Блот исследовали фрагментом промотора,меченного 32 Р (HindIII)(=последовательность PV-BVGT08, положение 7992-8583) или целой промоторctp2-CP4-EPSPS-E9-3'-кассетой (PmeI/HhoI)(=последовательность PV-BVGT08, положение 7935-2389 п.о.). Фиг. 8 - Саузерн-блот-анализ Н 7-1 с целью изучения интактности области полиаденилирования. 10 г геномной ДНК Н 7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и нетрансгенной контрольной ДНК, смешанной сPV-BVGT08, расщепляли с помощью EcoRI/PstI, XbaI, HindIII и PstI. Блот исследовали фрагментом Е 931'-полиаденилирования, меченного 32 Р (BamHI/XhoI)(=последовательность PV-BVGT08, положение 1702-2389 п.о.). Фиг. 9 - фрагменты, использованные в качестве зондов для определения отсутствия основной цепи векторной ДНК в Н 7-1. Фиг. 10 - Саузерн-блот-анализ Н 7-1 для определения отсутствия основной цепи векторной ДНК в Н 7-1. 10 г геномной ДНК Н 7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и нетрансгенной контрольной ДНК,смешанной с PV-BVGT08, расщепляли с помощью XbaI. Блоты исследовали 32 Р-меченными зондами,включающими целую основную цепь PV-BVGT08 (зонд 1-4). Один блот исследовали меченным фрагментом CP4-EPSPS. Фиг. 11 - сравнение фрагментов ПЦР и последовательностей PV-BVGT08 в левосторонней области. Фиг. 12 - сравнение фрагментов ПЦР и последовательностей PV-BVGT08 в правосторонней области. фиг. 13 - анализ геномной ДНК снаружи правостороннего места присоединения встройки. Приблизительно 50 нг геномной ДНК Н 7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и воды использовали в реакциях ПЦР с комбинацией праймеров Р 1, в которой оба праймера локализованы снаружи встройки, и Р 3, в которой один праймер локализован внутри встройки, а другой праймер локализован снаружи встройки. Фиг. 14 - анализ геномной ДНК снаружи левостороннего места присоединения встройки. Приблизительно 50 нг геномной ДНК Н 7-1, нетрансгенной контрольной ДНК и воды использовали в реакциях ПЦР с комбинацией праймеров Р 2, в которой оба праймера локализованы снаружи встройки, и Р 4, в которой один праймер локализован внутри встройки, а другой праймер локализован снаружи встройки. Фиг. 15 - карта потомств партии семян Н 7-1. Фиг. 16 - анализ Н 7-1 методом блоттинга по Саузерну для выявления стабильности интеграции встраиваемой ДНК в геном. 10 г геномных ДНК Н 7-1 (исходный трансформант Н 7-1-1995 и три потомства - Н 7-1-1996, Н 7-1-1997 и Н 7-1-1998) и нетрансгенных контрольных ДНК разного происхождения расщепляли с помощью BamIII, XbaI и HindIII. Блот исследовали 32P-меченным зондом CP4-EPSPS вектора PV-BVGT08 (=447-1555 п.о.). Описание изобретения иллюстрируется ссылками на нижеследующие примеры. Пример 1. Идентификация явления рекомбинации Н 7-1. Сахарную свеклу (Beta vulgaris), генотип 3S0057, подвергали генетической модификации для экспрессии СР 4-5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазы или СР 4-EPSPS, которая придает устойчивость к гербицидному глифосату и которая также используется в качестве маркера, необходимого для селекции. Эту трансгенную линию продуцировали методом трансформации на основе Agrobacterium-tumefaciens с использованием бинарного вектора PV-BVGT08. Т-ДНК вектора, использованного для трансформации сахарной свеклы, содержала между лево- и правосторонним участками следующие последовательности: кодирующую область, включающую последовательность, которая кодирует хлоропластный транзит-пептид из EPSPS Arabidopsis thaliana (символ ctp2), связанную с последовательностью, которая кодируетCP4-EPSPS, под контролем промотора на основе вируса мозаики норичника 35S (pFMV) и 3'-концевую последовательность терминации транскрипции rbcS-E9-гена Pisum sativum. Применяли следующие методы.I. Экстракция ДНК. Метод 1. Брали свежий лист или другую ткань (20-100 мг), помещали в 1,5 мл пробирку и добавляли 400 г-4 011923 экстракционного буфера (см. ниже). Ткань измельчали небольшим пестиком. Смесь взбалтывали 5 с и инкубировали 30-60 мин при комнатной температуре. Затем проводили центрифугирование в течение 1 мин при 13000 об./мин. Супернатант, содержащий ДНК, переливали в другую 1,5 мл пробирку и смешивали с 320 л изопропанола. Смесь инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре. После добавления этанола образуется преципитат ДНК. Этанол декантировали после центрифугирования в течение 5 мин при 13000 об./мин. Пробу оставляли для просушки на воздухе. Гранулы повторно растворяли в 400 л H2O или ТЕ-буфера (см. ниже). Экстракционный буфер (100 мл). Метод 2. Брали свежий растительный материал (20-100 мг), помещали в пробирку объемом 1,5 мл Эппендорфа и добавляли 500 л СТАВ-буфера (65 С) (см. ниже). Смесь инкубировали в течение 1-1,5 ч при 65 С и затем центрифугировали 5 с. Добавляли 5 мл РНК-азы А (10 мг/мл). Полученную смесь инкубировали 30 с при 37 С и затем центрифугировали в течение 5 с. Добавляли 200 мл SEVAG. После перемешивания и центрифугирования при 13000 об./мин в течение 10 мин супернатант помещали в другую пробирку объемом 1,5 мл. С супернатантом осторожно смешивали 1 объем изопропанола (около 400 мл). После этого проводили центрифугирование при 13000 об./мин в течение 10 мин. Добавляли 600 мл этанола. Гранулы промывали путем переворачивания пробирки несколько раз. Смесь снова центрифугировали при 13000 об./мин в течение 2 мин. Этанол осторожно сливали. Пробирку переворачивали и давали стечь содержимому на чистую бумагу. Пробу высушивали на воздухе в течение 15 мин. Гранулы повторно растворяли в 50 мл воды (см. ниже). СТАВ-буфер.(5 мл bidest+50 мг РНК-аза А, аликвоты в пробирках объемом 1,5 мл, кипячение пробирок в течение 30 мин при 100 С, хранение при - 20 С) Обычно применяли метод 1. Данный метод позволяет экстрагировать большое количество проб ДНК в день, при этом качество ДНК приемлемое. Метод 2 применяли в случаях, когда листовой материал был старым или когда возникали проблемы с качеством ДНК. Этот метод более сложен, требует больше времени и дает меньший выход ДНК, но более высокого качества. Количественное определение ДНК не проводили, и в полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали от 0,5 до 1 мл раствора экстрагированной ДНК.II. Полимеразная цепная реакция. Для реакций ПЦР приготовляли 10-кратную буферную смесь, состоящую из буфера+dNTP. Применяли следующую процедуру.III. Идентификация Н 7-1 методом ПЦР. Идентификацию Н 7-1 осуществляли методом ПЦР с использованием сайтспецифичных праймеров. Верхний праймер (SEQ ID NO: 1): Н 7-207030: 5' TTA ATT TTT GCA GGC GAT GGT GGC TGT TAT 3' Нижний праймер (SEQ ID NO: 2):H7-841L30: 5' CAT ACG CAT TAG TGA GTG GGC TGT CAG GAC 3' Верхний праймер локализован снаружи встройки и является частью геномной ДНК сахарной свеклы. Нижний праймер локализован внутри встроенного гена CP4-EPSPS. Условия проведения ПЦР. Этапы 2 а-в повторяли 34 раза. Предполагаемый продукт ПЦР - фрагмент ДНК размером 664 п.о. (SEQ ID NO: 13, см. фиг. 2).IV. Идентификация Н 7-1 методом многократной ПЦР. Для дифференцировки нетрансгенных и трансгенных растений, как гомозиготных, так и геми/гетерозиготных, проводили многократную ПЦР с тремя различными праймерами. Были использованы следующие праймеры. Этапы 2 а-в повторяли 34 раза. Нетрансгенные растения проявляют только один фрагмент ПЦР размером 350 п.о. Гомозиготные трансгенные растения - один фрагмент размером около 1042 кб. Гетерозиготные растения проявляют оба фрагмента (см. фиг. 3). Пример 2. Характеристика Н 7-1. Для характеристики интегрированной в Н 7-1 ДНК проводили молекулярный анализ. В частности,определяли количество встроек (количество сайтов интеграции внутри генома сахарной свеклы), количество копий (количество фрагментов ДНК внутри одного локуса), целостность встроенной кодирующей области и ее регуляторных элементов, последовательность pFMV-промотора и последовательность E9-3'концевой терминации транскрипции, отсутствие последовательностей основной цепи в векторе, который использовали для трансформации, а также стабильность наследования встройки. Кроме того, были идентифицированы последовательности, фланкирующие встройку ДНК. Определение характеристик встроенной ДНК Н 7-1, полученной в результате трансформации сахарной свеклы, осуществляли с применением методов Саузерн-блоттинга, ПЦР и инвертированной ПЦР. Это включало также позитивный и негативный контроль (PV-BVGT08, ДНК нетрансгенного растения),который осуществляли теми же методами, что и определение характеристик исследуемого вещества (Н 7-1). ДНК выделяли из партии 749034 растений Н 7-1, выращенных в 1997 г. ДНК выделяли также из исходного трансформанта H7-1/3S0057 (=6401 VH), выращенного в 1995 г., и из дополнительных потомств, выращенных в 1996, 1997 и 1998 гг. (Н 7-1/64801 Н, Р 7-1/74922 Н и H7-1/83002S). Нетрансгенная линия сахарной свеклы 3S0057 служила в качестве контроля. Кроме того, линии сахарной свеклы 5R7150, 8K1180 и 6S0085 использовали в качестве негативного контроля. Это обычные нетрансгенные линии, которые используются для выращивания традиционной сахарной свеклы. Эталонные вещества соответствуют плазмиде PV-BVGT08, использованной для трансформации. Плазмидную ДНК смешивали с ДНК из контрольной линии сахарной свеклы, расщепляли рестрикционным ферментом и разделяли методом электрофореза в агарозном геле параллельно с исследуемыми веществами. Плазмида служила в качестве маркера для определения размера предполагаемого фрагмента, а также в качестве позитивного контроля гибридизации. Для демонстрации чувствительности метода блоттинга по Саузерну плазмидную ДНК смешивали с геномной ДНК растения в концентрации менее 1 копии анализируемого элемента (10 г геномной ДНК и 28 пг PV-BVGT08-ДНК). Устанавливали размеры с использованием маркера для определения молекулярных размеров RAOUL (фирма ONCOR/Appligene,каталог 160673). Выделение ДНК. Растительную ткань (1-3 г сырого веса) из партии 74903 Н Н 7-1 растирали в жидком азоте в мелкий порошок, используя ступку и пестик. Порошок переносили в 50 мл пробирку Оукриджа и добавляли 7,5 мл предварительно нагретого (60 С) СТАВ-буфера (2%-ный СТАВ, 1,4 М NaCl и 0,2%-ный меркаптоэтанол). Пробы инкубировали при 65 С в течение приблизительно 30 мин при непрерывном перемешивании. К пробам добавляли равный объем (8 мл) смеси RT хлороформ:изоамиловый спирт (24:1 об./об.). Суспензию перемешивали путем инверсии. Используя центрифугирование (10 мин, 9000 об./мин), отделяли две фазы. Водную фазу переносили в другую пробирку Оукриджа объемом 50 мл и затем осаждали ДНК добавлением 5 мл изопропанола. ДНК раздробляли центрифугированием (2 мин, 9000 об./мин) и удаляли супернатант. Осажденную ДНК инкубировали с промывным раствором, состоящим из 76% этанола и 10 мМ ацетата аммония, в течение около 20 мин. После центрифугирования и декантирования супернатанта ДНК высушивали в вакууме и повторно растворяли в ТЕ (рН 8,0) при 4 С в течение ночи. В качестве альтернативного метода ДНК выделяли с использованием набора Dneasy Plant Maxi фирмы Qiagen (Дюссельдорф, Германия, каталог 68163). Выделение ДНК проводили согласно инструкциям производителя. В качестве дополнительного альтернативного метода ДНК выделяли с использованием набораDneasy Plant Maxi фирмы Qiagen (Дюссельдорф, Германия, каталог 69103). Выделение ДНК проводили согласно инструкциям производителя. Количественное определение ДНК и расщепление рестрикционными ферментами. Количество ДНК определяли с использованием LKB Biochrom UV/visible спектрофотометра (фирмаAmersham Pharmacia, Фрейбург, Германия) или, альтернативным путем, определение количества ДНК осуществляли после электрофореза в агарозном геле сканированием ДНК с помощью компьютерной программы RFLPscan (фирма MWG-Biotech, Эберсберг, Германия). В качестве калибровочного стандарта использовали High DNA Mass Ladder фирмы Gibco/Life Technologies (Карлсруэ, Германия, каталог 10496-016). Рестрикционные ферменты приобретали у фирм Boehringer Mannheim (Маннхайм, Германия), Stratagene (Амстердам, Нидерланды) и New England Biolabs (Франкфурт, Германия) и применяли в соответствии с инструкциями изготовителя. Приготовление зонда ДНК. ДНК плазмиды PV-BVGT08 выделяли из культур Е. coli. Матрицы зонда, гомологичные кодирующей области CP4-EPSPS, 35S-промотору, области Е 9-3'-полиаденилирования, 35S-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3'кассете и боковым областям, приготовляли путем расщепления соответствующими рестрикционными ферментами с последующим разделением методом электрофореза в агарозном геле или полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукты очищали, используя набор Gene Clean II фирмы Bio 101 (Ла Джолла,Калифорния). Зонды (25 пг) метили 32P-dCTP или 32P-dATP, используя систему для мечения ДНКMegaprime фирмы Amersham-Pharmacia Biotech Europe (Фрайбург, Германия). Саузерн-блот-анализы. Пробы ДНК, обработанные рестрикционными ферментами, разделяли методом электрофореза в агарозном геле 15 ч при 35 в. После фотографирования геля ДНК очищали посредством замачивания геля в течение 15 мин в растворе 0,25 М HCl, денатурировали инкубированием геля в течение 30 мин в денатурационном растворе, содержащем 0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl, при постоянном перемешивании и в конце нейтрализовали посредством замачивания в течение 2 ч в нескольких объемах раствора, содержащего 2 М NaCl и 1 М трис-HCl, рН 5,5. ДНК из агарозных гелей переносили на нейлоновые мембраныHybond (Amersham-Pharmacia Biotech Europe, Фрайбург, Германия), используя PosiBlot Pressure блоттер фирмы Stratagene в соответствии с протоколом изготовителя. После замачивания фильтров в течение 15 мин в 2-кратном SSPE (20-кратный SSPE: 3,6 М NaCl, 20 мМ EDTA, 0,2 М NaH2PO4/Na2HPO4, рН 7,4) ДНК фиксировали на мембране путем облучения ультрафиолетом (Transilluminator Pharmacia, Фрайбург,Германия) в течение 0,1 мин и упаривания под вакуумом 1 ч при 80 С. Блоты предгибридизовали 4 ч в водном растворе 50%-ного формамида, 5-кратного SSC, 0,1%-ного лаурилсаркозина, 0,02%-ного SDS и 2%-ного блокирующего реагента (Boehringer Mannheim, Германия, каталог 1096176). Гибридизацию с радиоактивно меченным зондом проводили в свежем предгибридизационном растворе в течение 16-18 ч при 42 С. После гибридизации мембраны промывали 5 мин в 2-кратном SSC, 1%-ном SDS при 65 С и 2 раза по 15 мин в 0,2-кратном SSC, 0,1%-ном SDS при 68 С. Авторадиографическое изображение блотов получали путем экспонирования блотов на пленку Kodak Biomax MST с использованием интенсифицирующих экранов Kodak Biomax MST. Идентификация геномных 5'- и 3'-фланкирующих последовательностей. Место сшивки трансген-растение геномной ДНК идентифицировали методом инвертированной ПЦР. Геномную ДНК очищали, как описано выше. Приблизительно 1 г ДНК расщепляли в отдельных реакциях рестрикционными нуклеазами TaqI, AluI, NdeIII или RsaI. Расщепленные ДНК-фрагменты повторно лигировали Т 4-лигазой в течение ночи, после чего проводили полимеразную цепную реакцию. Получали различные комбинации инвертированных праймеров, используя пакеты программ для анализа праймеров OLIGO (National Biosciences, Inc., Плимут, Мичиган). Фрагменты, полученные в результате этой инвертированной ПЦР-амплификации, разделяли гельэлектрофорезом, вырезали из геля и подвергали очистке с использованием набора Gene Clean II. Очищенные фрагменты клонировали в вектор pCR2.1 ТОРОТА фирмы Invitrogen (Гренинген, Нидерланды). Встройки направляли для секвенирования на фирму MWG-Biotech (Эберсберг, Германия). Полученные данные о последовательностях анализировали с использованием пакетов программ для анализа ДНКMac Molly Tetra (Soft Gene GmbH, Бухольд, Германия). Анализ методом ПЦР. Геномную ДНК готовили, используя комплект Plant DNAeasy Plant Mini (Qiagen, Дюссельдорф,Германия) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для ПЦР использовали приблизительно 50 нг геномной ДНК. Реакции проводили 30 с при 95 С, 30 с при 55 С и 35 циклов в течение 2 мин при 72 С. ПЦР выполняли на циклере РТС 200 (Biozym, Ольдендорф, Германия). Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в агарозном геле. 1. Количество встроек. Для H7-1 определяли количество встроек и количество сайтов интеграции трансгенной ДНК в геном сахарной свеклы. Чтобы установить количество встроек, геномную ДНК расщепляли рестрикционными ферментами HindIII, XbaI и BamHI. В качестве негативного контроля ДНК из нетрансформирован-8 011923 ного контрольного растения, представляющего собой ту же генетическую линию, расщепляли с помощью HindIII. В качестве позитивного контроля использовали ДНК вектора трансформации (PVBVGT08).XbaI и BamHI расщеплялись только 1 раз в PV-BVGT08 и не расщеплялись внутри меченого зондаCP4-EPSPS, который использовали (см. фиг. 4). Hindlll расщеплялся 3 раза в PV-BVGT08, но все три сайта локализованы снаружи зонда и на том же 5'-конце относительно зонда. Таким образом, каждый фермент предположительно высвобождает один фрагмент ДНК, который гибридизуется с зондом CP4EPSPS, и, по-видимому, содержит часть встроенной ДНК и прилегающей геномной ДНК растения. Число детектированных фрагментов указывает на количество присутствующих в Н 7-1 встроек. Результаты приведены на фиг. 5. После расщепления посредством HindIII, XbaI и BamHI обнаруживали только один гибридизационный фрагмент соответственно. Фрагменты размером 5,2 кб, полученные в результате расщепления с помощью HindIII (дорожка 4), 4 кб - с помощью XbaI (дорожка 5) и приблизительно 11 кб - с помощьюBamHI, показывают, что трансформант Н 7-1 является единственным явлением интеграции (фиг. 4). Сильный сигнал на дорожке 1 представляет линеаризованную плазмиду PV-BVGT08. Дополнительные слабые сигналы относятся к небольшим количествам нерасщепленной PV-BVGT08 или являются неспецифичными фоновыми сигналами гибридизации. 2. Количество копий. Теоретически, один сайт интеграции может содержать более 1 копии встроенной ДНК. Однако,учитывая размер фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикционного анализа, как показано выше, это невозможно. Если бы Н 7-1 включал более 1 копии встроенной ДНК, были бы обнаружены дополнительные фрагменты. Это подтверждали также и результаты расщепления рестрикционным ферментом PstI. PstI расщепляется дважды внутри лево- и правосторонних последовательностей. Один из рестрикционных сайтов находится внутри кодирующей области CP4-EPSPS, поэтому после расщепления можно было бы предполагать наличие двух фрагментов гибридизации с CP4-EPSPS-зондом. Один из фрагментов предположительно соответствует внутреннему фрагменту размером около 1,2 кб. Второй фрагмент предположительно является боковым фрагментом. Итак, в случае более одной копии были бы обнаружены дополнительные фрагменты. Но результаты показывают, что PstI разрезает ДНК, как предполагалось. Были обнаружены внутренний фрагмент размером 1,2 кб и только один дополнительный фрагмент размером около 4,9 кб (фиг. 5; дорожка 3, фиг. 4). В качестве дополнительного внутреннего контроля ДНК расщепляли с помощью ClaI (фиг. 5, дорожка 6, фиг. 4). Как предполагалось, гибридизовался один фрагмент размером 2,4 кб, так как ClaI расщеплялся дважды, но снаружи слева и справа от использованного фрагмента CP4-EPSPS. Это также доказывает интактность интегрированного фрагмента ДНК и согласуется с нижеследующими результатами. Как предполагалось, гибридизация плазмиды PV-BVGT08 с фрагментом СР 4-EPSPS дает сигнал в 8,6 кб (дорожка 1) (PV-BVGT08=8590 п.o.). Вторая меньшая и очень слабая полоса является результатом неполной рестрикции PV-BVGT08. Таким образом, результаты экспериментов показывают, что трансформированная линия сахарной свеклы Н 7-1 содержит единственную копию интеграции Т-ДНК плазмиды PV-BVGT08 в геном растения. 3. Интактность кодирующей области. Целостность генной кассеты CP4-EPSPS относительно отдельных элементов (Р-FMV-промотора,ctp2-CP4-EPSPS-кодирующей области и Е 9 3'-концевого нетранслируемого участка) определяли расщеплением при помощи ферментов HindIII для P-FMV, HindIII плюс BamHI для ctp2-CP4-EPSPS и EcoRI плюс PstI для Е 9 3'-концевого нетранслируемого участка. Проводили дополнительные эксперименты с использованием SacI плюс XhaI для P-FMV-ctp2-СР 4-ЕР 8 Р 8-области и Е 9 3'-концевого участка. Плазмидную ДНК, смешанную с ДНК нетрансгенной сахарной свеклы, и отдельно ДНК нетрансгенной сахарной свеклы расщепляли теми же ферментами в качестве позитивного и негативного контроля соответственно. Эти ферменты расщепляются внутри предполагаемой встройки ДНК, между левой и правой сторонами Т-ДНК (см. плазмидную карту на фиг. 1), поэтому в случае, если соответствующие элементы являются интактными, то размер гибридизующихся фрагментов должен быть идентичным в ДНК Н 7-1 и ДНК PV-BVGT08. В качестве дополнительного контроля ДНК расщепляли посредством XbaI. XbaI расщеплялся 1 раз между промотором и ctp2-CP4-EPSPS-кодирующей областью. Таким образом, можно сделать предположение, что ДНК PV-BVGT08 дает фрагмент размером 8,6 кб, а в случае с Н 7-1 - боковой фрагмент, размер которого отличается от размера фрагмента PV-BVGT08. Результаты показаны на фиг. 6, 7 и 8. Фиг. 6: расщепление ферментами Hindlll и BamHI высвобождало ген CP4-EPSPS, блот исследовали фрагментом CP4-EPSPS, генерированным методом ПЦР. Негативный контроль (дорожка 6) не обнаруживал полос гибридизации. Геномная ДНК из Н 7-1 и плазмида PV-BVGT08, смешанная с нетрансгенной ДНК, давали фрагмент размером приблизительно 1,7 кб, что соответствует предполагаемому размеру. В результате расщепления ферментом XbaI получали предполагаемый фрагмент размером 8,6 кб линеаризованной PV-BVGT08. Что касается Н 7-1, расщепление давало боковой фрагмент размером приблизи-9 011923 тельно 4,0 кб (см. также фиг. 4 и 5). Негативный контроль, как и прежде, не выявлял каких-либо сигналов. Фиг. 7: расщепление ферментом HindIII высвобождало промотор на основе вируса мозаики норичника, блот исследовали фрагментом промотора, генерированного методом ПЦР. Негативный контроль(дорожка 5) не обнаруживал сигналов гибридизации. Геномная ДНК из Н 7-1 и плазмида PV-BVGT08,смешанная с нетрансгенной ДНК, давали фрагмент гибридизации размером приблизительно 0,6 кб. Этот размер соответствует предполагаемому размеру промотора (дорожки 4 и 6). Расщепление ферментом XbaI давало предполагаемый фрагмент размером 8,6 кб линеаризованнойPV-BVGT08 и левосторонний фрагмент размером приблизительно 1,3 кб (дорожки 1 и 3) из Н 7-1. Этот фрагмент размером 1,3 кб еще раз доказывает, что Н 7-1 содержит только одну копию трансгена. Негативный контроль (дорожка 2) не выявлял каких-либо сигналов. Расщепление с помощью SacI/XhoI высвобождало область промотора вместе с кодирующей областью CH4-EPSPS и областью полиаденилирования. Гибридизация с целой кассетой промотор-ctp2-CP4EPSPS-сигнал полиаденилирования (PmcI/XhoI-фрагмент) давала предполагаемый промотор-ctp2-CP4EPSPS размером 2,3 кб и сигнальные фрагменты полиаденилирования размером 0,7 кб как с ДНК PVBVGT08, смешанной с нетрансгенной ДНК, так и с геномной ДНК Н 7-1 (дорожки 9 и 11). Фиг. 8: расщепление ферментами PstI и EcoRI высвобождало Е 9-3'-концевой сигнал полиаденилирования, блот исследовали фрагментом сигнала полиаденилирования. Негативный контроль (дорожка 3) не обнаруживал полос гибридизации. Плазмида PV-BVGT08, смешанная с нетрансгенной ДНК, и геномная ДНК из Н 7-1 продуцировали фрагмент размером приблизительно 0,6 кб, что соответствует предполагаемому размеру. В результате расщепления ферментом XbaI получали предполагаемый фрагмент размером 8,6 кб линеаризованной плазмиды PV-BVGT08 и боковой фрагмент с Н 7-1 размером приблизительно 4,0 кб. Расщепление ферментом PstI высвобождало Е 9-3'-концевой сигнал полиаденилирования, связанный с 3'-концом размером 0,5 кб кодирующей области СР 4-EPSPS. Получаемый в результате фрагмент размером 1,2 кб обнаруживали, как предполагалось, с геномной ДНК Н 7-1, а также с ДНК PV-BVGT08. В результате расщепления HindIII получали фрагмент размером приблизительно 8,0 кб линеаризованной PV-BVGT08 минус фрагмент промотора (дорожка 13) и боковой фрагмент размером 5,2 кб (дорожка 11) с Н 7-1. Единственный фрагмент размером 5,2 кб, полученный в результате расщепления ферментом Hindlll, и единственный фрагмент размером 4,0 кб, полученный в результате расщепления ферментом XbaI, еще раз подтверждают, что Н 7-1 содержал только одну копию встроенной ДНК. Негативный контроль не выявлял каких-либо сигналов. Таким образом, результаты изучения блотов подтверждают тот факт, что все элементы перенесенной ДНК являются интактными и что Н 7-1 содержит единственную интактную кодирующую областьctp2-CP4-EPSPS с регуляторными элементами, область pFMV-промотора и Е 9-3'-концевую последовательность терминации транскрипции. 4. Анализ для обнаружения фрагментов основной цепи. Область основной цепи Ti-плазмиды определяется как область снаружи Т-ДНК, ограниченной левои правосторонними последовательностями, которая состоит из ori-генов и селекционных генов для бактериальной репликации и бактериальной селекции и которая обычно не переносится в геном растения в результате трансформации на основе Agrobacterium. Для подтверждения отсутствия основной цепи векторной ДНК в Н 7-1 геномную ДНК из Н 7-1 из нетрансформированного контроля и геномную ДНК из Н 7-1, смешанную с ДНК PV-BVGT08, расщепляли рестрикционным ферментом XbaI и исследовали тремя перекрывающимися ПЦР-генерированными зондами, которые включали целую последовательность основной цепи. Четвертый зонд содержал целую последовательность основной цепи в одном фрагменте. Использованные зонды представляют собой последовательность основной цепи (см. фиг. 9). 1. 2730-5370 п.о. 2. 5278-6419 п.о. 3. 6302-7851 п.о. 4. 2730-7851 п.о. На фиг. 10 показаны результаты Саузерн-блот-анализа. Дорожки 6, 10, 14 и 18: расщепление геномной ДНК Н 7-1, исследованной фрагментами основной цепи из целой цепи, не выявило каких-либо полос гибридизации. Только дорожки 4, 8, 12, 16 и 20 (геномная ДНК, смешанная с ДНК PV-BVGT08) давали полосы размером 8,6 кб, как предполагалось. Полосы представляют собой линеаризованную ДНК PV-BVGT08. Дорожки 2 и 4: геномная ДНК Н 7-1 и геномная ДНК Н 7-1, смешанная с PV-BVGT08 и гибридизированная с CP4-EPSPS, давали сигналы гибридизации. Полоса 4 кб на дорожке 2 представляет собой правосторонний фрагмент, две полосы на дорожке 4 представляют собой правосторонний фрагмент в 4,0 кб и линеаризованную плазмиду PV-BVGT08 длиной 8,6 кб. Обе полосы имеют одинаковую интенсивность. Это убедительно показывает, что концентрация добавленной ДНК PV-BVGT08 сравнима с концентрацией элемента CP4-EPSPS в ДНК Н 7-1. Концентрация использованной плазмидной ДНК эквивалентна 0,5 копий. Если бы в геном Н 7-1 интегрировались последовательности основной цепи, обнаруживались бы четкие сигналы.- 10011923 Приведенные результаты доказывают, что Н 7-1 не содержит какой-либо детектируемой последовательности основной цепи плазмиды, использованной для трансформации. Эти результаты также подтверждаются данными анализа 5'- и 3'-фланкирующих геномных областей (см. ниже). 5. Идентификация 5'- и 3'-фланкирующих геномных последовательностей. Трансформация на основе Agrobacterium обычно приводит к интеграции всех последовательностей между левой и правой сторонами в геном растения. 5'- и 3'-концы интегрированной плазмидной ДНК предположительно должны быть внутри или около лево- или правосторонних последовательностей, соответственно. Идентификацию этих областей осуществляли методом инвертированной ПЦР. Клонированные продукты ПЦР секвенировали и результаты секвенирования сравнивали с последовательностьюPV-BVGT08. На фиг. 11 показано выравнивание последовательности клонированного методом инвертированной ПЦР фрагмента (D1U.RPT) (=геном Н 7-1, верхняя последовательность), полученного с помощью праймеров для анализа левосторонней области, против последовательности PV-BVGT08 (нижняя последовательность). Сравнение этих двух последовательностей выявило прерывание гомологии как раз внутри боковой последовательности. На фиг. 12 показано выравнивание последовательности клонированного методом инвертированной ПЦР фрагмента (B3UNI.RPT) (=геном Н 7-1, верхняя последовательность), полученного с помощью праймеров для анализа правосторонней области, против последовательности PV-BVGT08 (нижняя последовательность). Сравнение этих двух последовательностей выявило прерывание гомологии уже за 18 нуклеотидов до боковой последовательности. Таким образом, убедительно показано, что последовательность между левой и правой сторонамиTi-плазмиды PV-BVGT08 интегрирована правильно. Последовательность прерывалась внутри или непосредственно до боковых сторон. Эти данные подтверждают результаты анализа основной цепи, а именно то, что в геном H7-1 не интегрировались последовательности основной цепи снаружи боковых областей. Чтобы установить, являются ли фланкирующие последовательности на правой или левой стороне встройки в H7-1 сахарной свеклы интактными последовательностями генома растения, проводили анализ методом ПЦР с комбинациями праймеров P1, P2, Р 2 и Р 4. Праймеры Р 1 и Р 2 из комбинации праймеров локализованы снаружи встройки. Если ДНК встроенного локуса внутри Н 7-1 идентична ДНК нетрансформированного контроля, то результатом ПЦР предположительно должны быть два фрагмента ПЦР, являющиеся синтезом обоих праймеров. Праймеры Р 3 и Р 4 из комбинации праймеров сконструированы таким образом, что один из этих праймеров локализован внутри встройки CP4-EPSPS, а другой - снаружи встройки внутри геномной ДНК растения. Поэтому в результате ПЦР предположительно должны продуцироваться фрагменты только из ДНК Н 7-1. Данные о последовательности, полученные методом инвертированной ПЦР, вместе с данными из вектора PV-BVGT08 дают последовательность, которая включает встройку Н 7-1 (PV-BVGT08 последовательность), право- и левосторонние участки присоединения и дополнительную геномную ДНК сахарной свеклы (SEQ ID NO: 5). Для идентификации трансген-растение присоединений геномной ДНК (идентификации сайтспецифичности) и участков геномной ДНК на левой и правой сторонах встройки использовали следующие праймеры. Комбинация Р 1 (праймер для анализа геномной ДНК снаружи правосторонней боковой области). Верхний праймер: 5' CGG ТАА ATG CAT TGG CGT TTG ТТ Нижний праймер: 5' CAC CCA GAT CCC AAT AAA ACC GTA AT Предполагаемый продукт ПЦР 241 п.о. Комбинация Р 2 (праймер для анализа геномной ДНК снаружи левосторонней боковой области, SEQID NO: 20, SEQ ID NO: 21). Верхний праймер: 5' AAA TGG TTG TAG ATA AAT AAG GAA ATC А Нижний праймер: 5' АСА TGT TTG AGC ACT CTT CTT GT Предполагаемый продукт ПЦР 377 п.о. Комбинация Р 3 (праймер для анализа трансген-растение присоединения геномной ДНК, SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO: 8). Верхний праймер: 5' ATG CAT TGG CCT TTG TTT TTG AT Нижний праймер: 5' TGT CGT TTC CCG CCT TCA G Предполагаемый продукт ПЦР 288 п.o. (SEQ ID NO: 11). Комбинация Р 4 (праймер для анализа трансген-растение присоединения геномной ДНК, SEQ IDNO: 9, SEQ ID NO: 10). Верхний праймер: 5' CGC TGC GGA CAT СТА CAT TTT TGA AT Нижний праймер: 5' AGT TAA CTT TCC ACT TAT CGG GGC ACT G Предполагаемый продукт ПЦР 751 п.o. (SEQ ID NO: 12). Эксперименты методом ПЦР с ДНК Н 7-1 и ДНК из нетрансгенного контрольного растения с использованием комбинации праймеров Р 3, в которой один из праймеров локализован внутри встройки Н 7- 11011923 1, давали фрагмент только с ДНК Н 7-1. И, наоборот, эксперименты методом ПЦР с использованием комбинации праймеров Р 1, гомологичной последовательностям снаружи встройки, давали фрагменты как с ДНК Н 7-1, так и с ДНК нетрансгенного контроля. Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 13. Из этих результатов видно, что последовательность, прилежащая к правостороннему месту присоединения встройки, присутствует в ДНК трансгенного Н 7-1 и в ДНК из нетрансгенных растений. Из этого можно заключить, что ДНК снаружи встройки Н 7-1 является нетрансгенной геномной ДНК. Эксперименты методом ПЦР с ДНК Н 7-1 и ДНК из нетрансгенного контрольного растения с использованием комбинации праймеров Р 4, в которой один из праймеров локализован внутри встройкиCP4-EPSPS, давали фрагмент только с ДНК Н 7-1. Наоборот, эксперименты методом ПЦР с использованием комбинации праймеров Р 2, гомологичной последовательностям снаружи встройки, давали фрагменты как с ДНК Н 7-1, так и с нетрансгенной контрольной ДНК. См. эти результаты на фиг. 13. Результаты показывают, что последовательность, прилежащая к левостороннему месту присоединения встройки, присутствует в ДНК трансгенного Н 7-1 и в ДНК из нетрансгенных растений. Из этого можно заключить, что ДНК снаружи левостороннего места присоединения является нетрансгенной геномной ДНК. Таким образом, можно сказать, что последовательности снаружи встройки Н 7-1 сахарной свеклы идентичны последовательностям, присутствующим в нетрансгенных растениях. Из этого можно сделать вывод, что эти последовательности являются последовательностями генома растения, присутствующими в родительской линии, использованной для трансформации, и в других традиционных линиях сахарной свеклы. 6. Стабильность через поколения. Для демонстрации стабильности интегрированной ДНК исходный трансформируемый Н 7-1 сравнивали с тремя потомствами (64801 Н, 74922 Н и 83002S; см. фиг. 15) этой линии, полученной в результате самоопыления нетрансгенными линиями сахарной свеклы. Исходная трансформированная линия и потомства были получены в 1995, 1996, 1997 и 1998 гг. В качестве контроля анализировали четыре различные линии нетрансгенной сахарной свеклы(3S0057, 5R7150, 8K1180, 6S0085). Все ДНК расщепляли XbaI, HindIII и BamHI соответственно и гибридизовали с меченым фрагментом CP4-EPSPS. Чтобы показать, что Т-ДНК стабильно интегрировалась в геном растения, все дорожки потомств Н 7-1, расщепляемые теми же рестрикционными ферментами,предположительно должны давать полосу точно такого же размера. Все ДНК из потомств Н 7-1 на дорожках 3-6 дают предполагаемые фрагменты: ДНК, расщепленная с помощью BamHI, давала полосы размером около 11 кб, расщепления посредством XbaI продуцировали фрагменты размером 4,0 кб и посредством HindIII - полосы размером 5,2 кб. Все полосы, полученные с помощью одинаковых рестрикционных ферментов, но в разные годы, были идентичными по размеру. Никакие нетрансгенные линии не давали каких-либо сигналов (фиг. 16). Эти результаты показывают, что интродуцированная последовательность стабильно интегрируется в геномную ДНК и стабильно наследуется. Протокол последовательностей - свободный текст. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы, отличающееся тем, что содержит фрагмент ДНК размером от 630 до 700 п.о., предпочтительно 664 п.о., который может быть амплифицирован из- 22011923 геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и/или фрагмент ДНК размером 3500-3900 п.о., предпочтительно 3706 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, и/или фрагмент ДНК размером 270-300 п.о., предпочтительно 288 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, и/или фрагмент ДНК размером 710-790 п.о., предпочтительно 751 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную SEQ ID NO: 9, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, и/или фрагмент ДНК размером 990-1100 п.о., предпочтительно 1042 п.о., может быть амплифицирован из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16. 2. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 3706 п.о. имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 6. 3. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 664 п.о. имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 13. 4. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 288 п.о. имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 11. 5. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 751 п.о. имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 12. 6. Устойчивое к глифосату растение сахарной свеклы по п.1, отличающееся тем, что фрагмент ДНК размером 1042 п.о. имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17 или проявляет по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 99%, более предпочтительно по крайней мере 99,9% сродство с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17. 7. Семена растения по одному из пп.1-6. 8. Клетки, ткань или части растения по одному из пп.1-6. 9. Растение или части растения, полученные из семян по п.7. 10. Способ идентификации устойчивого к глифосату растения сахарной свеклы, отличающийся тем,что он включает этап(ы) амплификации фрагмента ДНК размером от 630 до 700 п.о., предпочтительно размером 664 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательностьSEQ ID NO: 1, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и/или амплификации фрагмента ДНК размером 3500-3900 п.о., предпочтительно 3706 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, и/или амплификации фрагмента ДНК размером 270-300 п.о., предпочтительно 288 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательностьSEQ ID NO: 8, и/или амплификации фрагмента ДНК размером 710-790 п.о., предпочтительно 751 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы, его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, и/или амплификации фрагмента ДНК размером 990-1100 п.о., предпочтительно 1042 п.о., из геномной ДНК растения сахарной свеклы,его частей или семян методом полимеразной цепной реакции с помощью первого праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, и второго праймера, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16. 11. Тест-набор для идентификации устойчивого к глифосату трансгенного растения сахарной свек- 23011923 лы, его клеток, ткани или частей, отличающийся тем, что он содержит по крайней мере одну пару праймеров, включающую первый праймер и второй праймер для полимеразной цепной реакции, при этом первый праймер узнает последовательность внутри чужеродной ДНК, инкорпорированной в геном растения, а второй праймер узнает последовательность внутри 3'- или 5'-фланкирующих областей ДНК так,что растение является растением по одному из пп.1-6 или п.9. 12. Тест-набор для идентификации устойчивого к глифосату трансгенного растения сахарной свеклы, его клеток, ткани или частей, содержащий по крайней мере одну пару праймеров, включающую первый праймер и второй праймер для полимеразной цепной реакции, при этом первый праймер узнает последовательность внутри чужеродной ДНК, инкорпорированной в геном растения, а второй праймер узнает последовательность внутри 3'- или 5'-фланкирующих областей ДНК, отличающийся тем, что первый праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и/или первый праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQID NO: 7, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, и/или первый праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, и/или первый праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQID NO: 14, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16. 13. Тест-набор по п.11 или 12, отличающийся тем, что первый праймер и второй праймер узнают нуклеотидную последовательность, которая является частью нуклеотидной последовательности SEQ ID