Вакцина

Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим антиген, имеющий происхождение от так называемого антигена отторжения опухоли PRAME (также известного как DAGE), связанный с иммунологическим партнером слияния, который дает эпитопы Тхелперов, таким как, например, белок D из Haemophilus influenzae В, к белкам-партнерам слияния,содержащим фрагменты белка D, к способам их получения и приготовления вакцин и к их применению для лечения целого ряда раковых заболеваний. 016326 Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим антиген, имеющий происхождение от так называемого антигена отторжения опухоли PRAME (антиген, преимущественно экспрессирующийся в меланоме) (также известного как DAGE), связанный с иммунологическим партнером слияния, который дает эпитопы Т-хелперов, таким как, например, белок D из Haemophilus influenzae В, к способам их получения и приготовления вакцин и к их применению для лечения целого ряда раковых заболеваний, включая, без ограничения, меланому, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак легкого,такой как NSCLC (немелкоклеточный рак легкого), саркому, рак яичника, рак в области головы и шеи,рак почки, колоректальную карциному, множественную миелому, лейкоз, включая острый лейкоз, и карциному пищевода. В другом воплощении настоящее изобретение относится к белкам-партнерам слияния, содержащим производные белка D, и к способам их получения. Среди разных групп антигенов, ассоциированных с опухолями, раково-тестикулярные антигены представляют интерес для иммунотерапии благодаря их широкой опухолеспецифичной экспрессии и благодаря тому, что эти антигены обычно не экспрессируются в здоровых клетках. К настоящему времени описано более 50 раково-тестикулярных антигенов, и для многих из них были идентифицированы эпитопы, распознаваемые Т-лимфоцитами. PRAME является раково-тестикулярным антигеном и исследуется в качестве потенциального иммунотерапевтического средства. При иммунотерапии раковый антиген вводят пациенту обычно в виде вакцины, например вакцины,содержащей антиген в виде белка или его иммуногенного фрагмента, или в виде ДНК, кодирующей белок, или в виде вектора, содержащего указанную ДНК, который стимулирует иммунную систему пациента атаковать опухоли, экспрессирующие тот же самый антиген. Если стимулируется соответствующий ответ, то Т-лимфоциты (Т-клетки) непосредственно атакуют антигены и обеспечивают контроль иммунного ответа. Развиваются В-клетки и Т-клетки, которые специфичны к одному типу антигена. Когда иммунная система подвергается воздействию другого антигена,образуются другие В-клетки и Т-клетки. По мере развития лимфоцитов они обычно учатся распознавать собственные ткани организма (свое) как отличающиеся от тканей и частиц, которые обычно не встречаются в организме (чужое). Как только В-клетки и Т-клетки образовались, некоторые из этих клеток будут размножаться и обеспечивать "память" иммунной системы. Это дает возможность иммунной системе отвечать быстрее и более эффективно в следующий раз, когда она подвергнется воздействию того же самого антигена. Некоторые эксперименты указывают на то, что раково-тестикулярные антигены могут стимулировать механизмы памяти в иммунной системе. Выдвинута гипотеза, что PRAME вовлечен в гибель клеток или в клеточные циклы. Было показано,что он экспрессируется в меланоме и в различных опухолях, включая опухоли легкого, почки и в области головы и шеи. Интересно то, что он, по всей вероятности, также экспрессируется в 40-60% случаев лейкоза, такого как острый лимфоидный лейкоз и острый миелоидный лейкоз (см., например, Exp. Hematol. 2000 Dec.; 28(12):1413-22). У пациентов наблюдалась сверхэкспрессия PRAME, которая, по всей вероятности, связана с более высокой выживаемостью и с меньшими показателями рецидивов по сравнению с пациентами, у которых нет сверхэкспрессии данного белка. Данный антиген и его получение описаны в патенте США 5830753.PRAME находится в аннотированной базе данных человеческих генов Н-Inv DB под инвентарными номерами U65011.0, ВС 022008.1, AK129783.1, ВС 014974.2, CR608334.1, AF025440.1, CR591755.1,ВС 039731.1, CR623010.1, CR611321.1, CR618501.1, CR604772.1, CR456549.1 и CR620272.1. Белок D представляет собой поверхностный белок грамотрицательной бактерии Haemophilus influenzae В. Информацию по иммунологическим партнерам слияния, имеющим происхождение от белка D,можно получить в WO 91/18926. Иногда получают слитые белки из участка антигена и гетерологичного партнера слияния для увеличения иммуногенности данного антигена, и/или для облегчения продуцирования белка в подходящих количествах, и/или для очистки (см., например, WO 99/40188), где описан слитый белок MAGE и, например, белок D, поверхностный белок грамотрицательной бактерии Haemophilus influenzae В. Слитый белок получают рекомбинантно, и в слитый белок может быть включена секреторная последовательность белка D для потенциального содействия секреции и солюбилизации конечного продукта.-1 016326 Краткое описание чертежей и конструкций/последовательностей Краткое изложение сущности изобретения Согласно настоящему изобретению предложен слитый белок, содержащий: а) PRAME или его иммуногенный фрагмент и б) гетерологичный партнер слияния, имеющий происхождение от белка D,где указанный слитый белок не включает в себя секреторную последовательность (сигнальную последовательность) белка D. Согласно настоящему изобретению предложен также белок-партнер слияния, как описано здесь,имеющий происхождение от белка D, в котором белок-партнер слияния не включает в себя секреторную последовательность или сигнальную последовательность белка D. Согласно настоящему изобретению предложен также слитый белок, как описано здесь, и его антиген или фрагмент. Согласно настоящему изобретению предложен также белок-партнер слияния, имеющий происхождение от белка D, в котором белок-партнер слияния содержит или состоит из аминокислот 20-127 белкаD. В одном из воплощений настоящего изобретения одна или более аминокислот из белка-партнера слияния белка D, как описано здесь, может быть удалена или может быть заменена заменой. Аминокислоты могут быть заменены консервативными заменами, как определено здесь, или могут быть использо-4 016326 ваны другие аминокислоты. В одном из воплощений могут быть заменены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот. Белок-партнер слияния белка D, как описано здесь, дополнительно или альтернативно может содержать делеции или вставки в аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью белка D дикого типа. В одном из воплощений могут быть вставлены или удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9 или более аминокислот. В контексте этой заявки термины "секреторная последовательность", или "сигнальная последовательность", или "сигнал секреции" белка D относятся к приблизительно аминокислотам 1-16, 17, 18 или 19 встречающегося в природе белка. В одном из воплощений секреторная или сигнальная последовательности или сигнал секреции белка D относятся к N-концевым 19 аминокислотам белка D. В настоящем описании изобретения термины "секреторная последовательность", или "сигнальная последовательность", или "сигнал секреции" используются взаимозаменяемо. Белок-партнер слияния по настоящему изобретению может содержать остаточный полноразмерный белок D или может содержать приблизительно остаточную N-концевую треть белка D. Например, остаточная N-концевая треть белка D может содержать приблизительно или примерно аминокислоты 20-127 белка D. В одном из воплощений последовательность белка D для использования в настоящем изобретении содержит аминокислоты 20-127 белка D. В другом воплощении настоящее изобретение включает или состоит из любой из последовательностей, начиная с любой из следующих аминокислот последовательности белка D: 17, 18, 19, 20, 21 или 22 и заканчивая любой из следующих аминокислот последовательности белка D: 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140. В контексте данного описания под "остаточным(ой)" подразумевается последовательность белка белка D без секреторной или сигнальной последовательности, как описано здесь. В одном из воплощений настоящего изобретения, в котором слитый белок содержит PRAME или его иммуногенный фрагмент, производное белка D по настоящему изобретению содержит приблизительно первую 1/3 данного белка, более конкретно аминокислоты 20-127. В альтернативном воплощении настоящего изобретения, в котором слитый белок содержит PRAME или его иммуногенный фрагмент,белок D содержит приблизительно первую 1/3 данного белка, в которой используются 109 N-концевых аминокислот белка D. В одном из воплощений настоящего изобретения часть белка D не включает в себя секреторную последовательность данного белка. В одном из воплощений настоящего изобретения производное белка D является нелипидизированным. В одном из воплощений настоящего изобретения предложена конструкция белка D, как описано здесь, в виде белка-партнера слияния. Данная конструкция белка D может представлять собой белокпартнер слияния для конструкции, дополнительно содержащей конструкцию PRAME или MAGE А 3, как описано здесь, или может представлять собой белок-партнер слияния для конструкции, дополнительно содержащей другой раковый антиген или любой другой антиген. Представляется, что для слитых белков, содержащих PRAME или его иммуногенный фрагмент и белок D, или для слитых белков, содержащих белок D, или для белка-партнера слияния, содержащего белок D, присутствие секреторной последовательности (или сигнальной последовательности) может вредно влиять на количество продуцированного слитого белка.PRAME. В одном аспекте слитый белок по настоящему изобретению содержит белок-партнер слияния, как описано здесь, и антиген PRAME или его иммуногенный фрагмент. Обычно белок PRAME имеет 509 аминокислот, и в одном из воплощений могут быть использованы все 509 аминокислот PRAME. НаPRAME было идентифицировано несколько эпитопов цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), например Обычно желательно включать в антиген как можно больше этих эпитопов для генерации сильного иммунного ответа и чтобы антиген был как можно более иммуногенным. Хотя существует возможность компенсировать пониженную иммуногенность данной конструкции за счет использования препарата с мощным иммунологическим адъювантом. Сильные адъюванты более подробно обсуждаются ниже. В одном аспекте данного изобретения предложен участок PRAME слитого белка, содержащий, состоящий или по существу состоящий из полноразмерного белка. Тем не менее, данное изобретение также распространяется на конструкции PRAME с консервативными заменами. В одном из воплощений могут быть заменены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот. Конструкция PRAME, как описано здесь, дополнительно или альтернативно может содержать в аминокислотной последовательности делеции или вставки по сравнению с последовательностью PRAME дикого типа. В одном из воплощений могут быть вставлены или удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или боль-5 016326 ше аминокислот. Консервативные замены общеизвестны и обычно установлены по умолчанию в виде оценочных матриц в компьютерных программах выравнивания последовательностей. Эти программы включают РАМ 250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", In "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington и Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matrices from proteinblocks") Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919. В общепринятом понимании замены в пределах указанных ниже групп представляют собой консервативные замены, но замены между группами считаются неконсервативными. Эти группы следующие: 1) аспартат/аспарагин/глутамат/глутамин,2) серин/треонин,3) лизин/аргинин,4) фенилаланин/тирозин/триптофан,5) лейцин/изолейцин/валин/метионин,6) глицин/аланин. Обычно последовательность/аминокислоты PRAME, используемые в слитых белках по изобретению, более чем на 80%, например на 85, 90, 95 и более конкретно на 99% идентичны природномуPRAME. Однако специалистам в данной области известно, что аминокислотные остатки, образованные в результате процесса клонирования, могут сохраняться в рекомбинантно синтезированных белках. Если они не оказывают вредного влияния на характеристики продукта, то удалять или не удалять их является необязательным. В одном аспекте изобретения предложен слитый белок, как описано здесь, включающий, состоящий из или по существу состоящий из полноразмерного белка PRAME. В другом аспекте часть PRAME слитого белка по настоящему изобретению включает, состоит или по существу состоит из одного или более из следующих эпитопов: В другом воплощении настоящего изобретения в слитом белке, как он описан здесь, можно использовать опухолевый антиген, отличающийся от PRAME или в дополнение к PRAME. В одном из воплощений предложен слитый белок, содержащий белок-партнер слияния, как он описан здесь, и один или более из следующих опухолевых антигенов, или производных опухолевых антигенов, или их иммуногенных участков, которые способны направлять иммунный ответ на данный антиген: антиген MAGE,например антиген MAGE А, такой как MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12. Эти антигены известны также как MAGE А 1,MAGE А 2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10,MAGE A11 и/или MAGE A12 (семейство MAGE А). В одном из воплощений может быть использован антиген из одного или двух других семейств MAGE: группа MAGE В и группа MAGE С. СемействоMAGE В включает MAGE В 1 (также известный как MAGE Хр 1 и DAM 10), MAGE B2 (также известный как MAGE Хр 2 и DAM 6), MAGE В 3 и MAGE B4, семейство Mage С в настоящее время включает MAGEC1 и MAGE C2. Антиген MAGE для использования в настоящем изобретении может содержать полноразмерный антиген MAGE. Альтернативно, антиген MAGE может содержать иммуногенный участок MAGE, в котором 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот в аминокислотной последовательности могут быть удалены или заменены. В одном из воплощений настоящего изобретения 2 аминокислоты могут быть удалены из N-конца последовательности MAGE. В одном из воплощений настоящего изобретения, в котором антиген представляет собой MAGE А 3 или его иммуногенный участок, последовательностьMAGE А 3 может состоять из аминокислот 3-314 MAGE A3. В еще одном воплощении опухолевый антиген или его производное для использования в настоящем изобретении может представлять собой PRAME, BAGE, LAGE 1, LAGE 2 (также известный как NYESO-1), SAGE, HAGE, XAGE, PSA, PAP, PSCA, P501S (также известный как простеин), HASH1, HASH2,Cripto, В 726, NY-BR1.1, Р 510, MUC-1, простазу, STEAP, тирозиназу, теломеразу, сурвивин, CASB616,Р 53 и/или Her-2/neu, или их иммуногенный участок, который способен направлять иммунный ответ на данный антиген. В другом воплощении данного изобретения опухолевый антиген может включать или состоять из одного из следующих антигенов или его иммуногенного участка, который способен направлять иммун-6 016326 ный ответ на антиген: SSX-2; SSX-4; SSX-5; NA17; MELAN-A; P790; Р 835; B305D; В 854; CASB618 (как описано в WO 00/53748); CASB7439 (как описано в WO 01/62778); С 1491; С 1584 и С 1585. В одном из воплощений антиген для использования в настоящем изобретении может содержать или состоять из P501S. P501S, также называемый простеином (Xu et al., Cancer Res. 61, 2001, 1563-1568), известен как SEQ ID NO: 113 в WO 98/37814 и представляет собой белок из 553 аминокислот. Его иммуногенные фрагменты и участки, содержащие по меньшей мере 20, предпочтительно 50, более предпочтительно 100 заменимых аминокислот, как раскрыто в патентной заявке, ссылка на которую приведена выше, могут быть использованы в слитых белках по настоящему изобретению. Предпочтительные фрагменты раскрыты в WO 98/50567 (антиген PS108) в качестве белка, ассоциированного с раком простаты(SEQ ID NO: 9 WO 99/67384). Другими предпочтительными фрагментами являются аминокислоты 51553, 34-553 или 55-553 полноразмерного белка P501S. В одном из воплощений антиген может содержать или состоять из WT-1, экспрессируемого геном опухоли Вильма, или его иммуногенного участка, который способен направлять иммунный ответ на антиген, или N-концевого фрагмента WT-1F, содержащего примерно или приблизительно аминокислоты 1249 фрагмента WT-1. В еще одном воплощении антиген может содержать или состоять из антигена, экспрессируемого геном Her-2/neu, или его фрагмента либо его иммуногенного участка, который способен направлять иммунный ответ на антиген. В одном из воплощений антиген Her-2/neu может представлять собой один из слитых белков, описанных в WO 00/44899. Антиген для использования в настоящем изобретении может содержать или состоять из "слитого белка Her-2/neu ECD-ICD", имеющего также название "ECD-ICD" или "слитый белок ECD-ICD", который относится к слитому белку (или его фрагментам), содержащему внеклеточный домен (или его фрагменты) и внутриклеточный домен (или его фрагменты) белка HER-2/neu. В одном из воплощений этот слитый белок ECD-ICD не включает в себя значительный участок трансмембранного домена HER-2/neu или вообще не включает в себя трансмембранный домен HER-2/neu. В другом воплощении антиген может содержать или состоять из "слитого белка HER-2/neu ECDPD", имеющего также название "ECD-PD" или "слитый белок ECD-PD", или "слитый белок HER-2/neuECD-PD", также называемый "ECD-PD" или "слитый белок ECD-PD", который относится к слитым белкам (или их фрагментам), содержащим внеклеточный домен (или его фрагменты) и домен фосфорилирования (или его фрагменты, например PD) белка HER-2/neu. В одном из воплощений слитые белкиECD-PD и ECD-PD не включают в себя значительную часть трансмембранного домена HER-2/neu или вообще не включают в себя трансмембранный домен HER-2/neu. Слитые белки антигена PRAME и белка-партнера слияния белка D, как описано здесь, могут быть химически конъюгированными, но они предпочтительно экспрессируются в виде рекомбинантных слитых белков, которые могут обеспечить продуцирование повышенных уровней белка PRAME в системе экспрессии по сравнению с одним PRAME без партнера слияния, такого как белок D или модифицированные белки белка D. Дополнительно или альтернативно, описанные здесь опухолевые антигены и белок-партнер слияния по настоящему изобретению могут быть химически конъюгированными или могут экспрессироваться в виде рекомбинантных слитых белков, которые могут обеспечить продуцирование повышенных уровней белка PRAME или другого опухолевого антигена в системе экспрессии по сравнению с однимPRAME или одним другим опухолевым антигеном без партнера слияния, такого как белок D или модифицированные белки белка D. Слитые белки по настоящему изобретению, как они описаны здесь, могут дополнительно содержать одну или более линкерных последовательностей между белком-партнером слияния и опухолевым антигеном или его иммуногенным участком, или между белком-партнером слияния и His-хвостом или другой аффинной меткой (если она присутствует), или между опухолевым антигеном или его иммуногенным участком и His-хвостом или другой аффинной меткой (если она присутствует). Аминокислоты в линкерных последовательностях могут быть неродственными последовательностям антигена и/или партнера слияния. Слитые белки по настоящему изобретению, как они описаны здесь, могут дополнительно содержать аминокислоты Met-Asp-Pro на N-конце последовательности слитого белка. Аминокислота Met может иметь происхождение от последовательности исходного белка D или может иметь происхождение от неродственной последовательности. Партнер слияния может содействовать экспрессии белка (энхансер экспрессии) с более высокими выходами, чем нативный рекомбинантный белок. Белок D-партнер слияния благодаря его чужеродной природе может быть особенно иммуногенным in vivo и может содействовать слитому белку, содержащему PRAME или другой опухолевый антиген, предоставляя эпитопы Т-хелперов, предпочтительно эпитопы Т-хелперов, распознаваемые Т-клетками CD4. Считается, что такие Т-клетки CD4 могут вносить вклад в генерацию благоприятного иммунного ответа, в частности ответа цитолитических Т-клеток CD8. В одном из воплощений партнер слияния может действовать и как партнер, усиливающий экспрес-7 016326 сию, и как иммунологический партнер слияния. В одном аспекте данного изобретения предложен слитый белок, где N-концевой участок белка D(как описано выше или здесь) слит с N-концом PRAME или его иммуногенным фрагментом. Более конкретно, слияние с фрагментом белка D и N-концом PRAME осуществляется так, что PRAME заменяет Сконцевой фрагмент белка D, который был вырезан. Таким образом, N-конец белка D становится Nконцом слитого белка. В другом аспекте изобретения предложен слитый белок, где N-концевой участок белка D (как описано выше или здесь) слит с N-концом или с другим участком опухолевого антигена или его иммуногенным фрагментом. Более конкретно, слияние с фрагментом белка D и N-концом или другим участком опухолевого антигена может быть осуществлено так, что PRAME или другой опухолевый антиген или его производное, как они описаны здесь, заменяет С-концевой фрагмент белка D, который был вырезан. Таким образом, N-конец белка D становится N-концом слитого белка. Другие партнеры слияния или их фрагменты могут быть включены в слитые белки по изобретению или могут заменять элемент белка D по настоящему изобретению, например, в воплощениях, включающих антиген PRAME или его фрагмент или участок, как описано здесь. Примеры других партнеров слияния включают неструктурный белок из вируса гриппа, NS1 (гемагглютинин) - обычно используются N-концевые 81 аминокислот, хотя могут быть использованы и другие фрагменты при условии, что они включают эпитопы Т-хелперов;LYTA, имеющий происхождение от Streptococcus pneumoniae, который синтезирует N-ацетил-Lаланинамидазу, амидазу LYTA (кодируемую геном lytA (Gene, 43 (1986) с. 265-272, например повторяющаяся область молекулы Lyta, находящаяся на С-конце, например, начиная с остатка 178, например остатки 188-305. Очистка гибридных белков, содержащих фрагмент C-LYTA на их аминоконцах, была описана (Biotechnology: 10, (1992) с. 795-798). Слитые белки по изобретению могут включать в себя аффинную метку, такую как, например, гистидиновый хвост, содержащий от 5 до 9, например 6, гистидиновых остатков. Эти остатки могут находиться, например, на концевом участке белка D (например, на N-конце белка D) и/или они могут быть слиты с концевым участком антигена PRAME или его производного, или опухолевого антигена, или его производного, как описано здесь. Как правило, однако, гистидиновый хвост будет находиться на концевом участке антигена PRAME или его производного, или опухолевого антигена, или его производного,как они описаны здесь, например на С-конце антигена PRAME или его производного, или опухолевого антигена, или его производного, как описано здесь. Гистидиновые хвосты могут быть полезны в очистке. Согласно настоящему изобретению предложена также нуклеиновая кислота, кодирующая белки по настоящему изобретению. Такие последовательности могут быть вставлены в подходящий вектор экспрессии и использованы для ДНК/РНК-вакцинации или могут быть экспрессированы в подходящем хозяине. Микробные векторы, экспрессирующие нуклеиновую кислоту, могут быть использованы в качестве вакцин. Такие векторы включают, например, вирус оспы, аденовирус, листерию и монофаг. Последовательность ДНК, кодирующая белки по настоящему изобретению, может быть синтезирована с использованием стандартных методик синтеза ДНК, таких как ферментативное лигирование, как описано D.M. Roberts et al. в Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, методами химического синтеза, ферментативной полимеризации in vitro или ПЦР-технологии (полимеразная цепная реакция) с использованием,например, термостабильной полимеразы или с использованием комбинации этих методов. Ферментативная полимеризация ДНК может быть осуществлена in vitro с использованием ДНКполимеразы, такой как ДНК-полимераза I (фрагмент Кленова), в подходящем буфере, содержащем нуклеозидтрифосфаты dATP, dCTP, dGTP и dTTP, как требуется, при температуре 10-37 С, обычно в объеме 50 мкл или менее. Ферментативное лигирование фрагментов ДНК может быть осуществлено с использованием ДНК-лигазы, такой как ДНК-лигаза Т 4, в подходящем буфере, таком как 0,05 М Tris (рН 7,4), 0,01 М MgCl2, 0,01 М дитиотрейтола, 1 мМ спермидина, 1 мМ АТР и 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, при температуре от 4 С до температуры окружающей среды, обычно в объеме 50 мл или менее. Химический синтез ДНК-полимера или фрагментов может быть осуществлен в результате традиционной фосфотриэфирной, фосфитной или фосфорамидитной химической реакции с использованием твердофазных технологий, таких как технологии, описанные в "Chemical and Enzymatic Synthesis of GeneM.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers,Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus and H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984,12, 4539 and H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801. Способ по изобретению может быть осуществлен с использованием традиционных рекомбинантных технологий, таких, которые описаны в Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; ColdSpring Harbor, 1982-1989. В частности, способ может включать следующие стадии: 1) получение реплицируемого или интегрирующего вектора экспрессии, способного экспрессировать в клетке-хозяине ДНК-полимер, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок или его иммуногенное производное; 2) трансформирование клетки-хозяина указанным вектором; 3) культивирование указанной трансформированной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного ДНК-полимера с продуцированием указанного белка; и 4) выделение указанного белка. Используемый здесь термин "трансформирование" означает введение чужеродной ДНК в клеткухозяин. Этого можно достичь, например, в результате трансформации, трансфекции или инфицирования подходящей плазмидой или вирусным вектором с использованием, например, общепринятых методов,как описано в Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman and A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications;Oxford, England, 1988. Термин "трансформированный" или "трансформант" далее применяется к образующейся клетке-хозяину, содержащей и экспрессирующей интересующий чужеродный ген. Векторы экспрессии являются новыми и также являются частью данного изобретения. Реплицируемые векторы экспрессии могут быть получены в соответствии с изобретением путем расщепления вектора, совместимого с клеткой-хозяином, с получением линейного сегмента ДНК,имеющего интактный репликон, и объединения указанного линейного сегмента с одной или более молекулами ДНК, которые вместе с указанным линейным сегментом кодируют целевой продукт, такой как ДНК-полимер, кодирующий белок по изобретению или его производное в лигирующих условиях. Таким образом, ДНК-полимер может быть образован заранее или может быть образован в процессе конструирования вектора, по желанию. Выбор вектора отчасти будет определяться клеткой-хозяином, которая может быть прокариотической или эукариотической, но обычно представляет собой клетки Е. coli или СНО (клетки яичника китайского хомячка). Подходящие векторы могут включать плазмиды, например ТМСР 14, или рЕТ 21, или рЕТ 26, pcDNA3, бактериофаги, космиды и рекомбинантные вирусы. Получение реплицируемого вектора экспрессии может быть осуществлено традиционно с использованием подходящих ферментов для рестрикции, полимеризации или лигирования ДНК по методикам,описанным, например, в Maniatis et al., процитированном выше. Рекомбинантную клетку-хозяин получают в соответствии с изобретением путем трансформирования клетки-хозяина реплицируемым вектором экспрессии по изобретению в условиях трансформации. Подходящими условиями трансформации являются общепринятые условия, описанные, например, в Maniatis et al., процитированном выше, или в "DNA Cloning" vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd., 1985. Выбор условий трасформации определяется клеткой-хозяином. Так, бактериальный хозяин, такой как Е. coli, может быть обработан раствором CaCl2 (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) или раствором, содержащим смесь RbCl, MnCl2, ацетата калия и глицерина, и затем 3-[Nморфолино]пропансульфоновой кислотой, RbCl и глицерином. Клетки млекопитающих в культуре могут быть трансформированы соосаждением с кальцием векторной ДНК на клетки. Изобретение также распространяется на клетку-хозяина, трансформированную реплицируемым вектором экспрессии по изобретению. ДНК может быть кодон-оптимизирована по стандартным методикам с целью дальнейшего облегчения экспрессии у релевантного хозяина. В одном из воплощений настоящего изобретения предложена ДНК, кодирующая слитый белок, содержащий антиген PRAME или его участок или фрагмент, как они описаны здесь, в котором нуклеотидная последовательность антигена PRAME или его участка либо фрагмента кодон-оптимизирована. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность белка D не является кодон-оптимизированной. Культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию ДНК-полимера, обычно проводят, как описано, например, в Maniatis et al. и в "DNA Cloning", процитированных выше. Так, предпочтительно клетку помещают в питательную среду и культивируют при температуре менее 50 С. Белки по настоящему изобретению могут экспрессироваться в прокариотах или в эукариотах, таких как дрожжи, но часто экспрессируются в E. coli. Можно использовать конкретные штаммы Е. coli, такие как AR58 и BLR DE3. Обычно для облегчения идентификации успешного включения рекомбинантного гена/конструкции в систему экспрессии включают маркер селекции, например устойчивости к канамицину или устойчивости к ампициллину. Продукт выделяют общепринятыми способами согласно клетке-хозяину и согласно локализации продукта экспрессии (внутриклеточный или секретируемый в культуральную среду или в периплазму клетки). В одном из воплощений настоящего изобретения продукт экспрессии является внутриклеточным. В одном из воплощений настоящего изобретения продукт экспрессии является нерастворимым белком. Таким образом, когда клетка-хозяин является бактериальной клеткой, такой как клетка Е. coli, тогда-9 016326 она может быть лизирована, например, физически, химически или ферментативно, и белковый продукт может быть выделен из полученного лизата. Если клетка-хозяин является клеткой млекопитающего, то обычно продукт может быть выделен из питательной среды или из экстрактов, не содержащих клеток. Общепринятые методы выделения белков включают селективное осаждение, адсорбционную хроматографию и аффинную хроматографию, включая хроматографию на аффинной колонке с моноклональными антителами. В одном из воплощений изобретения предложен способ получения слитого белка, как он описан здесь, включающий стадию экспрессии в клетке слитого белка, содержащего белок-партнер слияния, как он описан здесь. Клеткой может быть бактерия. В одном из воплощений, в котором клеткой является бактерия, этой бактерией может быть Е. coli. Способ по настоящему изобретению может включать стадию экспрессии слитого белка, как он описан здесь, в клетке в виде нерастворимого белка. Способ может дополнительно включать стадию лизирования клетки и очистки экспрессированного слитого белка из лизированных клеток. В одном из воплощений изобретения предложен слитый белок, полученный или получаемый методом или способом, описанным здесь. Белки по настоящему изобретению предоставляются либо в жидкой форме, либо в лиофилизированной форме. Ожидается, что каждая доза для человека будет содержать от 1 до 1000 мкг белка и предпочтительно 30-300 мкг. Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, такая как вакцина, содержащая слитый белок по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом эксципиенте. Вакцина, возможно, может содержать один или более других ассоциированных с опухолью антигенов или полипептидов или предпочтительно может быть объединена с другими противораковыми вакцинами на основе ассоциированного с опухолью антигена. Например, эти ассоциированные с опухолью антигены могут представлять собой антигены, как они описаны здесь, и/или могут быть членами семейств MAGE, LAGE и GAGE или WT-1. В одном из воплощений ассоциированный с опухолью антиген может содержать или состоять из антигена MAGE A3. Получение вакцин, в общем, описано в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds.Powell M.F.Newman M.J). (1995) Plenum Press New York). Инкапсулирование в липосомах описано в патенте США 4235877, Fullerton. В вакцинном препарате по изобретению белки по настоящему изобретению предпочтительно могут присутствовать вместе с адъювантами. Подходящие адъюванты могут включать соль алюминия, такую как гидроксид алюминия в виде геля (алюм) или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соль кальция, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина, или ацилированные сахара, катионно или анионно дериватизированные полисахариды,или полифосфазены. Другие известные адъюванты включают CpG-содержащие олигонуклеотиды. Олигонуклеотиды характеризуются тем, что динуклеотид CpG не метилирован. Такие олигонуклеотиды общеизвестны и описаны, например, в WO 96/02555. Может быть желательным, чтобы в препарате по изобретению адъювантная композиция индуцировала иммунный ответ предпочтительно ТН 1-типа. В одном из воплощений предложена адъювантная система, включающая, например, комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3-де-Оацилированного монофосфориллипида A (3D-MPL), вместе с солью алюминия. С целью индуцирования ТН 1-ответа адъювант предпочтительно, возможно, может включать также олигонуклеотиды CpG. Улучшенная система, которая может быть использована в настоящем изобретении, содержит комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, конкретно комбинацию QS21 и 3D-MPL,как раскрыто в WO 94/00153, или, например, менее реактогенную композицию, где QS1 гасится холестерином, как описано в WO 96/33739. Композиция, которая может быть использована в препаратах по настоящему изобретению, содержащая QS21, 3D-MPL и токоферол, например, в виде эмульсии масло-в-воде, описана в WO 95/17210. Другая адъювантная композиция, которая может быть использована в препаратах по настоящему изобретению, представляет собой QS21, 3D-MPL и CpG или его эквивалент, например, в виде эмульсии масло-в-воде или в виде липосомного препарата. Соответственно в одном из воплощений настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая слитый белок или белок-партнер слияния, как описано здесь, и адъювант, например, как описано выше. Комбинация PRAME и MAGE. В одном из воплощений настоящего изобретения предложена композиция, содержащая: (а) антигенный компонент, содержащий антиген PRAME или слитый белок, как описано здесь, и (б) антигенный компонент, содержащий антиген MAGE или слитый белок, как описано здесь. В одном из воплощений композиция дополнительно может содержать адъювант, как описано здесь. Антиген MAGE для использования в комбинации может содержать полноразмерный антигенMAGE. Альтернативно, антиген MAGE может содержать иммуногенный участок MAGE, в котором 1, 2,- 10016326 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот в аминокислотной последовательности могут быть удалены или заменены. В одном из воплощений настоящего изобретения 2 аминокислоты могут быть удалены изN-конца последовательности MAGE. В одном из воплощений настоящего изобретения, в котором антиген представляет собой MAGE А 3 или его иммуногенный участок, последовательность MAGE А 3 может состоять из аминокислот от 3 до 314 MAGE A3. Для комбинации, описанной выше, любой из или оба антигена PRAME и/или MAGE могут быть частью слитого белка или белков, как описано здесь, или эти антигены могут присутствовать в других слитых белках или могут присутствовать как один антиген. В одном из воплощений настоящего изобретения предложена композиция, содержащая слитый белок, содержащий антиген PRAME и белок-партнер слияния, как описано здесь, и слитый белок, содержащий антиген MAGE А 3 и белок-партнер слияния, как описано здесь. В альтернативном воплощении слитый белок, содержащий антиген MAGE А 3, содержит или состоит из антигена MAGE А 3 и белкапартнера слияния, содержащего приблизительно первые 109 аминокислот белка D, в котором одна или две либо более аминокислот из белка D, возможно, заменены и в котором, возможно, присутствует сигнальная последовательность белка D в дополнение к первым 109 аминокислотам белка D. Слитые белки по настоящему изобретению дополнительно, возможно, могут содержать одну или более аминокислот в качестве "линкеров" между последовательностями антигена и белка-партнера слияния или между антигеном и His-хвостом, если он присутствует. Данные аминокислоты могут быть неродственными последовательностям антигена и/или партнера слияния. Слитые белки по настоящему изобретению, как описано здесь, могут дополнительно содержать аминокислоты Met-Asp-Pro на N-конце последовательности слитого белка. Аминокислота Met может иметь происхождение от исходной последовательности белка D или может иметь происхождение от неродственной последовательности. В одном из воплощений последовательность слитого белка, содержащего MAGE А 3 и белок D для использования в настоящем изобретении, показана на фиг. 12, SEQ ID NO: 43. Настоящее изобретение также распространяется на способы получения указанных вакцин/композиций. Примеры Были получены четыре слитых конструкции, и здесь они будут называться примеры/конструкции 1,2, 3 и 4. Кодон-оптимизированная конструкция была получена из конструкции примера 3, и здесь она обозначена как пример 3 а. Кодон-оптимизированная конструкция была получена из конструкции примера 4, и здесь она обозначена как пример 4 а. В примерах 3 а и 4 а последовательность, относящаяся к участку белка D молекулы, одна и та же. Однако некоторые кодоны в области PRAME были модифицированы для дальнейшего улучшения экспрессии и в примере 3 а линкер между PRAME и His-хвост были удалены. Таблица А Структуры слитых белков и плазмиды примеров/конструкций 1-4 Слитые белки в приведенных выше примерах содержат аминокислоты 20-127 белка D. Аминокислоты Met, Asp и Pro были включены на N-конце фрагмента белка D (т.е. аминокислоты MDP-20-127 бел- 11016326 ка D). Считается, что эти три дополнительные аминокислоты могут способствовать стабильности белка и/или увеличивать уровень экспрессии белка. Аминокислота 127 белка D слита с N-концом полноразмерного PRAME (т.е. аминокислота 127 белка D слита с N-концом PRAME). В трех из шести белков включена метка гистидиновый хвост для способствования очистке. Точная последовательность этого хвоста зависит от использованной плазмиды. Было сконструировано три разных типа плазмид, ТСМР 14 и рЕТ 21 или рЕТ 26: для каждой плазмиды была включена ДНК, кодирующая слитый белок с гистидиновым хвостом и без него. Если не указано иное, для получения каждого из примеров/конструкций использовали общую стратегию, приведенную ниже. Стратегия клонирования для образования рекомбинантного белка PD1/3-PRAME (с или без Hisметки) с использованием вектора ТСМР 14. Амплификацию последовательностей, присутствующих в плазмиде ТСМР 14, выполняли с использованием стратегии трехстадийной ПЦР. Вектор pHIC348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую целый ген белка D, был получен от Dr. A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malm General Hospital, Malm, Sweden. Последовательность ДНК белка D была опубликована Janson et al. (1991) (H. Janson, L.O. Heden, A. Grubb, M. Ruan,A. Forsgren, 1991, Infect. Immun. 59:119-125). Вектор экспрессии pMG81 представляет собой производное pBR322, в который были введены контрольные элементы для транскрипции и трансляции чужеродных вставленных генов, являющиеся производными бактериофага(Shatzman et al., 1983) (A. Shatzman, Y.S. Ho,M. Rosenberg, 1983, Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed), p. 1-14. Academic NY). Кроме того, ген устойчивости к ампициллину заменяли геном устойчивости к канамицину. Кодирующую последовательность для участка белка NS1 (аминокислоты 4-81) заменяли множественными клонирующими сайтами с получением pMG81 MCS. Кодирующую последовательность для 1/3 белка D (аминокислоты 20-127) клонировали в pMG81 MCS, используя сайты рестрикции BamHI и NcoI, с получением pMG81-1/3PD. Сначала выполняли ПЦР-амплификацию отрезка, соответствующего аминокислотам 20-127 белка D, с использованием вектора pMG81-1/3PD в качестве матрицы и смыслового олигонуклеотида 5' ATATAACATATGGATCCAAGCAGCCATTCATCAAAT 3' (CAN008; SEQ ID NO: 18) и антисмыслового олигонуклеотида 5' CCACAAACGCCTTCGTTCCATGGTTTCAAAGTTTTCTGTC 3' (CAN037; SEQ ID NO: 19). кДНК PRAME, полученную из Ludwig Institute, Brussels, Belgium, вставляли в сайты Bstx1-Not1 вектора pCDNA1 (Invitrogen) для образования рекомбинантного вектора pCDNA-1-PRAME. ПЦРамплификацию отрезка, соответствующего аминокислотам белка PRAME, выполняли с использованием вектора pcDNA-1-PRAME (GSKBio) в качестве матрицы и смыслового олигонуклеотида 5' GACAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGAAGGCGTTTGTGG 3' (CAN036; SEQ ID NO: 20) и антисмыслового олигонуклеотида 5' AGAGAGACTAGTCTAGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG 3' (CAN029; SEQ ID NO: 21) или 5' GGAGGAACTAGTGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG 3' (CAN002; SEQ ID NO: 22) в зависимости от того, был добавлен His-хвост (CAN002) или нет (CAN029). Конечную последовательность PRAME, вставленную в плазмиду ТСМР 14, получали после ПЦР-амплификаций с использованием матриц генов 1/3PD и PRAME, которые образовывались на предварительных стадиях для матрицы и смыслового олигонуклеотида CAN008 и антисмыслового олигонуклеотида CAN029 или CAN002, в зависимости от того, присутствовал His-хвост (CAN002) или нет (CAN029). Для клонирования фрагмента в вектор ТСМР 14 также добавляли сайты NdeI на 5'-конце и SpeI на 3'-конце. Конструирование вектора для экспрессии рекомбинантного белка 1/3PD-PRAME с или без Hisметки с использованием вектора рЕТ 21. Использовали рекомбинантную кДНК плазмиду, названную pcDNA1-PRAME (как описано в предыдущей стратегии), содержащую кодирующую последовательность гена PRAME, и вектор PMG811/3PD (как описано в предыдущей стратегии), содержащий N-концевую часть кодирующей последовательности белка D. Стратегия клонирования включала следующие стадии. а. Сначала последовательность 1/3PD без сигнала секреции (секреторная или сигнальная последовательность) ПЦР-амплифицировали из плазмиды PMG81-1/3PD с использованием смыслового олигонуклеотида 5' AGAGAGCATATGAGCAGCCATTCATCAAATATGGCG (CAN040; SEQ ID NO: 22) и антисмыслового олигонуклеотида 5' ACGTGGGCGGCCGCGGTTTCAAAGTTTTCTGTCATTTCTAA (CAN032; SEQ ID NO: 23); добавляли также сайты Nde1 на 5'-конце и Not1 на 3'-конце для клонирования фрагмента в вектор рЕТ 21b(+). б. Последовательность PRAME ПЦР-амплифицировали из плазмиды pcDNA1-PRAME с использованием смыслового олигонуклеотида 5' TTGTTGGCGGCCGCAATGGAACGAAGGCGTTTGTGGGGT (CAN033; SEQ ID NO: 25) и антисмыслового олигонуклеотида 5' GGAGGACTCGAGGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG (CAN034; SEQ ID NO: 26);- 12016326 добавляли также сайты Not1 на 5'-конце и Xho1 на 3'-конце для клонирования фрагмента в вектор рЕТ 21b. Эта амплификация привела к добавлению на С-конце белка из двух аминокислот, Leu и Glu, с последующими 6 His в плазмиде рЕТ 21b(+). Для образования белка без His-метки на 3'-конце генаMutagenesis Kit (Stratagene) и смыслового олигонуклеотида 5' CAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGAAGGCG (CAN106; SEQ ID NO: XX) и антисмыслового олигонуклеотида 5' CGCCTTCGTTCCATGGTTTCAAAGTTTTCTG (CAN107; SEQ ID NO: XX). д. Добавление двух аминокислот Asp и Pro, затем Met по положению 1 на N-конце белка D 1/3 посредством мутагенеза и с использованием смыслового олигонуклеотида 5' GGAGATATACATATGGATCCAAGCAGCCATTCATCAAATATGG (CAN 104; SEQ ID NO: XX) и антисмыслового олигонуклеотида 5' CCATATTTGATGAATGGCTGCTTGGATCCATATGTATATCTCC (CAN 105; SEQ ID NO: XX). Конструирование вектора для экспрессии кодон-оптимизированного рекомбинантного белка 1/3PDPRAME (с или без His-метки) в векторе РЕТ 26. Ген PRAME кодон-оптимизировали и клонировали в каркас pGA4 с добавлением сайтов Not1 иXho1 соответственно на 5'-конце и 3'-конце оптимизированного гена. Эту плазмиду, названную 0606420pGA4, использовали для клонирования гена в слиянии с PD1/3 в векторе рЕТ 26 с использованием приведенных ниже стадий. а. Удаление фрагмента Not1/Xho1, соответствующего оптимизированной последовательностиPRAME со стоп-кодоном на 3'-конце гена, из плазмиды 0606420pGA4. б. Клонирование оптимизированного фрагмента PRAME в плазмиду рЕТ 26b(+), которая содержит 1/3PD, ранее клонированный Nde1/Not1, с использованием олигонуклеотидов CAN040 и CAN032, как описано выше, и где аминокислоты Asp и Pro добавляли в N-конец методом мутагенеза с использованием олигонуклеотидов CAN104 и CAN105. в. Удаление сайта Not1 посредством мутагенеза с использованием олигонуклеотидов: смыслового 5' GACAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGTCGTCGTCTGTGG (CAN123; SEQ ID NO: XX) и антисмыслового 5' CCACAGACGACGACGTTCCATGGTTTCAAAGTTTTCTGTC (CAN124; SEQ ID NO: XX). Это дало слитый кодон-оптимизированный белок 1/3PD-PRAME без His-хвоста. г. Плазмиду затем использовали в качестве матрицы для образования кодон-оптимизированного 1/3PD-PRAME с 6 His. ПЦР-амплификацию слитого белка выполняли с использованием смыслового олигонуклеотида 5' GGAATTCCATATGGATCCAAGCAGCCATTC (CAN199; SEQ ID NO: XX) и антисмыслового олигонуклеотида 5' GGAGCTCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCGGCATAAAGCACGGGC (CAN198;SEQ ID NO: XX); добавляли также сайты Nde1 на 5'-конце, Xho1 на 3'-конце, затем 6 His и стоп-кодон для клонирования фрагмента в вектор рЕТ 26b(+). д. Клонирование амплифицированного фрагмента в плазмиде рЕТ 26b(+) от Invitrogen. Для получения слитого белка конструкцию ДНК клонировали в вектор экспрессии ТСМР 14. В этой плазмиде используются сигналы из ДНК фага лямбда для стимуляции транскрипции и трансляции вставленных чужеродных генов. Вектор содержит промотор PL лямбда PL, оператор OL и два сайта утилизации (NutL и NutR) для ослабления эффектов транскрипционной полярности, когда предусмотрен белок N(Gross et al., 1985. Mol.Cell. Biol. 5:1015). Плазмиду, экспрессирующую слитый белок pD-PRAME, конструировали так, чтобы аминокислотыPRAME были добавлены к С-концу 108-аминокислотного производного pD без его сигнальной последовательности (секреторная или сигнальная последовательность) (т.е. остатки 20-127). В эту конструкцию вN-конец производного pD добавляли три неродственные аминокислоты (Met, Asp и Pro), и для некоторых конструкций включали His-хвост на С-конце аминокислот PRAME (см. табл. А, приведенную выше). Альтернативно, эта конструкция может быть описана как содержащая производное pD из 109 аминокислот, если N-концевой Met рассматривать как Met из последовательности pD. Штамм клеток-хозяев и трансформация. Клетки-хозяева из штамма AR58 Е. coli (Mott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, p. 88-92, January 1985, Biochemistry) трансформировали плазмидной ДНК для примеров/конструкций 1 и 2. Лизогенный штамм AR58 Е. coli, использованный для получения примеров/конструкций 1 и 2,- 13016326 представляет собой производное стандартного штамма N99 Е. coli K12 NIH (Национальный институт здоровья (США (F- su- galK2, lacZ- thr-). Он содержит дефектный лизогенный фаг лямбда (galETN10,1 Kil- cI857 DH1). Фенотип Kil предотвращает выключение макромолекулярного синтеза. Мутация cI857 дает чувствительное к температуре повреждение репрессора cI. Делеция DH1 удаляет правый оперон фага лямбда и локусы bio, uvr3 и chlA хозяина. Штамм AR58 генерировали путем трансдуцирования N99 исходным раствором фага лямбда Р, ранее выращенного на производном SA500 (galETN10, 1 Kil- cI857DH1). Выбирали введение дефектного лизогена в N99 с тетрациклином в силу присутствия транспозонаTN10, кодирующего устойчивость к тетрациклину, в соседнем гене galE. N99 и SA500 представляют собой штаммы Е. coli K12, полученные из лаборатории доктора Мартина Розенберга в Национальном институте здоровья (США). Векторы, содержащие промотор PL, вводят в лизогенные клетки-хозяева Е. coli для стабилизации плазмидной ДНК. Лизогенные штаммы клеток-хозяев содержат ДНК фага лямбда, дефектного по репликации, интегрированную в геном (Shatzman et al., 1983; In Experimental Manipulation of Gene Expression.Inouya (ed) p. 1-14. Academic Press NY). ДНК фага лямбда управляет синтезом белка-репрессора cI, который связывается с репрессором OL вектора и предотвращает связывание РНК-полимеразы с промоторомPL и соответственно транскрипцию вставленного гена. Ген cI штамма экспрессии AR58 содержит чувствительную к температуре мутацию так, что PL-направленная транскрипция может регулироваться температурным сдвигом, т.е. увеличение температуры культуры инактивирует репрессор и синтез чужеродного белка инициируется. Эта система экспрессии обеспечивает контролируемый синтез чужеродных белков, особенно белков, которые могут быть токсичными для клетки (ShimatakaRosenberg, 1981, Nature 292:128). Клетки-хозяева из штамма Е. coli BLR (DE3) Novagen, WI, USA (каталожный номер: 69053-4), который является recA- производным BL21, который улучшает выход плазмидных мономеров и может способствовать стабилизации целевых плазмид, содержащих повторяющиеся последовательности, или чьи продукты могут вызвать потерю профага DE3 (1, 2), трансформировали плазмидной ДНК из примеров/конструкций 3 и 4. Каждую трансформацию проводили стандартными способами с CaCl2-обработанными клетками(1985): p. 109-135). Культивирование и индуцирование штамма бактериальных клеток-хозяев. Культура. Бактерии выращивали на 20 мл бульона Луриа-Бертани (Luria-Bertani) (LB) (BD) + 1% (мас./об.) глюкозы (Laboratoire MAT, каталожный номер: GR-0101) + антибиотик (карбенициллин 100 мкг/мл для рЕТ 21b, канамицин 40 мкг/мл для ТСМР 14). Культуры инкубировали при 33 С для клеток AR58 и при 37 С для клеток BLR (DE3) до достижения O.D.600 НМ (оптическая плотность при длине волны 600 нм) около 0,8. Индукция. При O.D.600HM около 0,8 культуры BLR (DE3) индуцировали 1 мМ изопропилD-1 тиогалактопиранозидом (IPTG; EMD Chemicals Inc., каталожный номер: 5815) и инкубировали в течение 2 или 3 ч при 37 С, хотя растворимость может быть увеличена, если использовать более низкую температуру. При O.D.600HM около 0,8 культуры AR58 индуцировали путем активации нагреванием при 37 С и инкубировали в течение 7 ч. Для двух систем экспрессии бактериальный рост был адекватным. Экстракция и очистка белка. При экспрессии полипептида в культуре клетки обычно собирают центрифугированием, затем разрушают физическими или химическими методами (если экспрессируемый полипептид не секретируется в среду) и полученный неочищенный экстракт сохраняют, чтобы выделить интересующий полипептид. Реактив для экстракции белка BugBuster используют в условиях, рекомендованных поставщиками(Novagen). Очистка белка PD1/3-PRAME-His. Пасту из клеток Е. coli ресуспендировали в 20 мМ Tris буфере, рН 8,5, затем пропускали через систему гомогенизатора (Panda от Niro Soavi S.p.A. - 2 пропускания - 750 бар (75 МПа. После добавления 2 мМ MgCl2 и бензоназы (Benzonase) (50 Ед./мл) гомогенат инкубировали 1 ч при комнатной температуре при слабом перемешивании, затем центрифугировали 30 мин при 15900 g и при комнатной температуре. Полученный осадок ресуспендировали в 20 мМ Tris буфере, рН 8,5, содержащем 1% додецилсульфата натрия (SDS) и 60 мМ глутатиона, и инкубировали 30 мин при комнатной температуре при слабом перемешивании. После центрифугирования в течение 30 мин при 15900 g и комнатной температуре осадок отбрасывали. Супернатант после центрифугирования 10-кратно разводили в 20 мМ Tris буфере, содержащем 6,66 М мочевины, 0,333 М хлорида натрия (NaCl) и 11,11 мМ имидазола и затем подвергали хроматографиче- 14016326 скому разделению на никель-ионной аффинной колонке (IMAC Sepharose 6 FF - GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Tris буфере, рН 8,5, содержащем 0,1% SDS, 6,0 М мочевины, 0,3 М NaCl и 10 мМ имидазола. После промывки колонки 20 мМ Tris буфером, рН 8,5, содержащим 0,5% саркозила, 6,0 М мочевины, 0,3 М NaCl и 10 мМ имидазола, антиген элюировали из колонки, увеличивая концентрацию имидазола до 40 мМ в том же самом промывочном буфере. После добавления фосфата до 50 мМ антигенпозитивный элюат пропускали через колонку Macro-Prep с керамическим гидроксиапатитом типа II(Bio-Rad), уравновешенную в 20 мМ Tris буфере, рН 8,5, содержащем 50 мМ фосфата, 0,5% саркозила,6,0 М мочевины и 0,3 М NaCl. Элюат с гидроксиапатитовой колонки, содержащий антиген, затем подвергали диафильтрации против 5 мМ боратного буфера, рН 9,8, содержащего 3,15% сахарозы, на мембране Omega 30 кДа (Pall). Ультраконцентрат стерилизовали фильтрацией через мембрану из ацетата целлюлозы 0,45/0,22 мкм (Sartorius). Очищенное вещество хранили при -70 С. Был использован также альтернативный способ очистки, который отличается от приведенного выше способа следующим: нет обработки бензоназой,нет перехода от SDS к саркозилу на колонке IMAC (SDS от экстракции до стадии пропускания через гидроксиапатит),буфер, используемый для диафильтрации, представлял собой 5 мМ Tris буфер, рН 8,5-0,5 М аргинин. Результатом этого альтернативного способа очистки было неполное удаление SDS с остаточным значением около 0,05 и 0,085%. Очистка. Экспрессируемые рекомбинантные белки очищали из фракций супернатантов, полученных после центрифугирования индуцированной Е. coli, с использованием металл-хелатирующей смолы His-Bind(QIAgen, Chatsworth, СА) согласно инструкциям производителя этой смолы. Характеризация белка.NP0323BOX). На фиг. 1 и 2 ниже показан анализ SDS-PAGE соединений примера 3 и 4 и 3 а и 4 а соответственно,где разные рекомбинантные белки 1/3pD-PRAME с His-меткой или без нее мигрируют на геле с кажущейся молекулярной массой 70 кДа. Рекомбинантные белки обнаружены в виде тел включения в клеточном лизате Е. coli после индукции. Подготовка образцов, буферов и условий миграции была выполнена в соответствии с рекомендациями поставщиков (Invitrogen). По 10 мкл всех препаратов загружали (до индукции (ДИ) и после индукции (ПИ в лунки, что соответствует 100 мкл культурального эквивалента. Пояснения к фиг. 1: анализ SDS-PAGE после окрашивания Кумасси синим рекомбинантного 1/3PDPRAME после IPTG-индукции штамма BLR DE3 Е. coli, трансформированного рекомбинантным рЕТ 21. Эквивалент 100 мкл культуры после 2 ч индукции в штамме BLR DE3 1 мМ с использованием IPTG(изопропил-бета-d-тиогалактопиранозид) при 25, 30 или 37 С наносили на гель. Клон 3 (1/3PDPRAME/pET21) и клон 4 (1/3PD-PRAME-His/pET21) присутствуют на геле до (ДИ) и после (ПИ) индукций в растворимой (супернатант) и в нерастворимой (осадок) фракциях. Дорожки 1 и 10: предварительное окрашивание стандартов масс в широком диапазоне (BioRad Cat161-0318), дорожка 2 (клон 3, ДИ,супернатант), дорожка 3 (клон 3, ДИ, осадок), дорожка 4 (клон 3, ПИ, 25 С, супернатант), дорожка 5(клон 4, ПИ, 30 С, осадок), дорожка 17 (клон 4, ПИ, 37 С, супернатант), дорожка 18 (клон 4, ПИ,37 С, осадок). Пояснения к фиг. 2: анализ SDS-PAGE после окрашивания Кумасси синим рекомбинантного 1/3PDPRAME после IPTG-индукции штамма BLR DE3 Е. coli, трансформированного рекомбинантным рЕТ 26. Эквивалент 100 мкл культуры после 2 ч индукции в штамме BLR DE3 1 мМ IPTG при 25, 30 или 37 С наносили на гель. Клон 3 а (кодон-оптимизированный 1/3PD-PRAME/pET26) и клон 4 а (кодоноптимизированный 1/3PD-PRAME-His/pET26) присутствуют на геле до (ДИ) и после (ПИ) индукций в растворимой (супернатант) и в нерастворимой (осадок) фракциях. Дорожка 2 и 10: предварительное окрашивание стандартов масс в широком диапазоне (BioRad Cat161-0318), дорожка 1 (клон 3 а, ДИ, супернатант), дорожка 3 (клон 3 а, ДИ, осадок), дорожка 4 (клон 3 а, ПИ, 25 С, супернатант), дорожка 5- 15016326 18 (клон 4 а, ПИ, 37 С, осадок). Вестерн-блоттинг. Мембраны блокировали в течение 30 мин при 37 С, 60 об/мин, используя свежий раствор 3% молока/PBS 1 Х (фосфатно-солевой буферный раствор). После блокирующей инкубации добавляли первичные антитела (кроличьи антитела против PRAME, GSK Biologicals SA) в разведении 1:5000 или -6 Х Hisметку (AbCam) в разведении 1:3000 в свежем растворе 3% молока/PBS 1X в течение 1 ч при 37 С, 60 об/мин. После этого мембраны промывали трижды в течение 5 мин при комнатной температуре, используя 0,02% Tween20/PBS 1X. Добавляли вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена антитела осла против IgG (H+L) кролика (Jackson laboratory) в разведении 1:20000, используя свежий раствор 3% молока/PBS1X. Мембраны инкубировали в течение 1 ч при 37 С, 60 об/мин. После этого мембраны промывали трижды в течение 5 мин при комнатной температуре, используя 0,02%Tween20/PBS 1X, затем мембраны подвергали воздействию пероксидазного субстрата (KH2PO4, 10 мМ;(NH4)2SO4, 10 мМ; О-дианизидин, 0,01% и перекись водорода, 0,045%) или щелочного фосфатазного субстрата (Sigma Fast), следуя рекомендациям поставщика. Молекулярный анализ. Пример/конструкция 1 Пример 5. Оценка продуцирования белков с или без секреторного сигнала (секреторная или сигнальная последовательность) белка D 1/3 в слитом белке Таблица Б Фиг. 11: анализ SDS-PAGE после окрашивания Кумасси синим рекомбинантного 1/3PD-PRAME с или без секреторного сигнала (SS) после IPTG-индукции штамма BL21 DE3 Е. coli, трансформированного рекомбинантным рЕТ 21. Эквивалент 100 мкл культуры после 3 ч индукции в штамме BL21 DE3 1 мМIPTG при 37 С наносили на гель. Эти конструкции присутствуют на геле до (ДИ) и после (ПИ) индукций в растворимой (супернатант) и в нерастворимой (осадок) фракциях. Дорожка 1: предварительное окрашивание стандартов масс в широком диапазоне (BioRad Cat161-0318), дорожка 2 (pD1/3-PRAME + SS,ДИ, супернатант), дорожка 3 (pD1/3-PRAME + SS, ДИ, осадок), дорожка 4 (pD1/3-PRAME + SS, ПИ, супернатант), дорожка 5 (pD1/3-PRAME + SS, ПИ, осадок), дорожка 6 (pD1/3-PRAME + SS + His, ДИ, супернатант), дорожка 7 (pD1/3-PRAME + SS + His, ДИ, осадок), дорожка 8 (pD1/3-PRAME + SS + His, ПИ,супернатант), дорожка 9 (pD1/3-PRAME + SS + His, ПИ, осадок), дорожка 10 (pD1/3-PRAME без SS, ДИ,супернатант), дорожка 11 (pD1/3-PRAME без SS, ДИ, осадок), дорожка 12 (pD1/3-PRAME без SS, ПИ,супернатант), дорожка 13 (pD1/3-PRAME без SS, ПИ, осадок), дорожка 14 (pD1/3-PRAME без SS + His,ДИ, супернатант), дорожка 15 (pD1/3-PRAME без SS + His, ДИ, осадок), дорожка 16 (pD1/3-PRAME безSS + His, ПИ, супернатант), дорожка 17 (pD1/3-PRAME без SS + His, ПИ, осадок). Пример 6. Иммуногенность PD-PRAME-His, приготовленного в AS01B или в AS15: дозовый диапазон антигена в постоянной дозе адъюванта. Цель: дозовый диапазон антигена для выбора наилучшей дозы для использования в доклинических экспериментах. Протокол: 6 группам по 12 мышей CB6F1 в день 0 и день 14 делали внутримышечные (ВМ) инъекции: 1) PBS,2) PRAME (50 мкг) в AS01B или в AS15,3) PRAME (10 мкг) в AS01B или в AS15,4) PRAME (2 мкг) в AS01 В или в AS15,5) PRAME (0,4 мкг) в AS01 В или в AS15,6) PRAME (0,08 мкг) в AS01B или в AS15, в действительности вводили 44,7 мкг вместо запланированной дозы 50 мкг.AS01B представляет собой липосомный адъювантный препарат, содержащий QS21 и 3D-MPL;AS15 представляет собой липосомный адъювантный препарат, содержащий QS21, 3D-MPL и CpG. Конструкция, использованная в этом примере, представляла собой пример/конструкцию 3 а (рЕТ 26 с His-хвостом), представленную в 5 мМ Tris буфере с 0,5 М аргинином. Можно использовать также белок, представленный в боратном буфере с сахарозой. Выдаваемые данные. Окрашивание внутриклеточных цитокинов (ISC) через 14 суток после 2 инъекций после in vitro рестимуляции клеток селезенки (4 пула по 3 мыши на группу) с использованием пула пептидов PRAME в концентрации 1 мкг/мл/пептид (15-мер). Ответ CD4 (адъювант AS01 В). Результаты ICS для цитокинов CD4 для адъюванта AS01B показаны на фиг. 3. Из этого экспери- 17016326 мента можно сделать вывод, что наилучшая доза антигена PRAME для индукции ответа CD4 в AS01B в этих условиях по всей вероятности составляет 2 мкг. Ответ CD8 (адъювант AS01B). Результаты ICS для цитокинов CD8 для адъюванта AS01B показаны на фиг. 4. Данные демонстрируют весьма низкий ответ CD8 и низкую гетерогенность ответа внутри группы. Ответ CD4 (адъювант AS15). Результаты ICS для цитокинов CD4 для адъюванта AS15 показаны на фиг. 5. Видно, что аналогичный ответ CD4 был индуцирован с использованием 44, 10, 2 и 0,4 мкг PRAME, приготовленного в AS15; с пониженным ответом, индуцированным 0,08 мкг PRAME. Ответ CD8 (адъювант AS15). Результаты ICS для цитокинов CD8 для адъюванта AS15 показаны на фиг. 6. Эти данные показывают отсутствие ответа CD8 (фон в группе PBS). Пример 7. В итоге, для описанных здесь изобретений можно применить следующее обобщенное описание конкретных конструкций PD1/3-PRAME, которые были получены. Конструкции, использованные для PD1/3-PRAME. Сигнальная последовательность белка D не включена (аминокислоты 2-19 белка D). Включен метионин белка D (AK 1 белка D). Две неродственные аминокислоты (Asp и Pro) заменяют аминокислоты 2-Lys и 3-Leu белка D. Включены первые 109 аминокислот белка D после сигнальной последовательности белка D (109 аминокислот, включая первый Met в N-конце + аминокислоты 20-127 белка D). Включены аминокислоты 1-509 PRAME (полноразмерная исходная последовательность PRAME). С или без His-хвоста, состоящего из одного из следующих: три неродственные аминокислоты (Thr, Ser и Gly) + 6 остатков His для клонирования в плазмиде ТСМР 14; или две неродственные аминокислоты (Leu и Glu) + 6 остатков His для клонирования в плазмиде рЕТ 21; или 6 остатков His для клонирования в плазмиде рЕТ 26. Белок pD1/3-PRAME +/- His-хвост На фиг. 7 показана размеченная аминокислотная последовательность примеров конструкций по настоящему изобретению. На фиг. 8-10 показано выравнивание следующих конструкций: выравнивание между LipoDMAGE3-His и D1/3-PRAME-His (фиг. 8); выравнивание между общей последовательностью исходного белка D из Haemophilus influenzae и LipoD-MAGE3-His (фиг. 9); выравнивание между общей последовательностью исходного белка D из Haemophilus influenzae, LipoD-MAGE3-His и pD1/3-PRAME-His (фиг. 10). Приготовление вакцинного препарата с использованием слитых белков. Слитые белки по изобретению могут быть приготовлены в виде вакцинных препаратов с добавлением адъюванта или без адъюванта. В одном из воплощений в качестве адъюванта препарат может содержать смесь 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида A (3D-MPL) и QS21 в эмульсии типа масло-в-воде. Адъювантная система SBAS2 была ранее описана в WO 95/17210. Альтернативно, адъювант для использования в настоящем изобретении может содержать 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3D-MPL), QS21 и CpG в виде эмульсии масло-в-воде или в виде липосомного препарата. 3D-MPL представляет собой иммуностимулятор, имеющий происхождение от липополисахарида(LPS) грамотрицательной бактерии Salmonella minnesota. MPL деацилирован и не имеет фосфатной группы на группировке липида А. Эта химическая обработка значительно снижает токсичность при сохранении иммуностимулирующих свойств (Ribi, 1986). Считается, что 3D-MPL совместно с различными носителями может сильно увеличивать как гуморальный иммунитет, так и клеточный иммунитет ТН 1-типа.QS21 представляет собой молекулу природного сапонина, экстрагированного из коры южноамериканского дерева Quillaja saponaria Molina. Методика очистки, разработанная для выделения индивидуальных сапонинов из неочищенных экстрактов коры, позволила выделить конкретный сапонин, QS21,который представляет собой тритерпеновый гликозид, демонстрирующий более сильную адъювантную активность и меньшую токсичность по сравнению с родительским компонентом. Было показано, чтоQS21 активирует CTL (цитотоксические Т-лимфоциты), ограниченные классом I МНС (главного ком- 18016326 плекса гистосовместимости), к нескольким антигенам, а также стимулирует антигенспецифичную пролиферацию лимфоцитов (Kensil, 1992). Представляется, что может иметь место синергетический эффект комбинаций MPL и QS21 в индуцировании как гуморальных, так и клеточных иммунных ответов ТН 1-типа. Эмульсия типа масло/вода содержит органическую фазу из 2 масел (токоферол и сквален) и водную фазу из PBS, содержащего Tween 80 в качестве эмульгатора. Эта эмульсия содержала 5% сквалена, 5% токоферола, 0,4% Tween 80 и имела средний размер частиц 180 нм, и она известна как SB62 (см. WO 95/17210). Образовавшиеся капельки масла должны иметь размер приблизительно 180 нм. Адъювант для использования в настоящем изобретении может быть приготовлен в виде комбинации MPL и QS21 в эмульсии масло/вода или в липосомном препарате. Этот препарат следует поставлять в сосудах 0,7 мл для смешивания с лиофилизированным антигеном или слитым белком (сосуды, содержащие от 30 до 300 мкг антигена). Также можно использовать иммуностимулирующие олигонуклеотиды. Примеры олигонуклеотидов для использования в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению включают олигонуклеотиды,содержащие CpG, обычно содержащие два или более динуклеотидных мотива CpG, разделенных по меньшей мере тремя, чаще по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив CpG представляет собой нуклеотид цитозин, за которым следует нуклеотид гуанин. Олигонуклеотиды CpG обычно являются дезоксинуклеотидами. В одном из воплощений промежуточным нуклеотидом в данном олигонуклеотиде является фосфородитиоат или более предпочтительно фосфоротиоатная связь, хотя фосфодиэфирная связь и другие межнуклеотидные связи входят в объем изобретения. В объем изобретения также входят олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоата описаны в US 5666153, US 5278302 и WO 95/26204. Примерами олигонуклеотидов являются следующие олигонуклеотиды: и эти последовательности могут содержать межнуклеотидные связи, модифицированные фосфоротиоатом. Альтернативно, олигонуклеотиды CpG могут содержать одну или более вышеуказанных последовательностей, в которых они имеют несущественные делеции или добавки. Олигонуклеотиды CpG могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области(см., например, ЕР 468520). Такие олигонуклеотиды удобно синтезировать, используя автоматический синтезатор. В одном из воплощений настоящего изобретения адъювантная комбинация для использования в изобретении включает один или более из следующих компонентов: 3D-MPL и QS21 (ЕР 0671948 В 1); эмульсии типа масло-в-воде, содержащие 3D-MPL и QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414); или 3D-MPL,приготовленный с другими носителями (ЕР 0689454 В 1). Другие адъювантные системы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, содержат комбинацию 3D-MPL, QS21 и олигонуклеотидаCpG, как описано в US 6558670 и US 6544518. Конечная вакцина может быть получена после растворения лиофилизированного препарата. Ссылки. 1. A.Roca (U. of Wisconsin), личные контакты. 2. Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219, 37-44. 3. Jan H. Kesslera et al. The Journal of Experimental Medicine, vol. 193, Number 1, January 1, 2001, 7388. 4. Ikeda H. et al. Immunity, Feb.; 6(2): 1997, 199-208.SEQ ID NO: 1. Последовательность ДНК для примера 1SEQ ID NO: 2. Аминокислотная последовательность для примера 1SEQ ID NO: 3. Последовательность ДНК для примера 2SEQ ID NO: 4. Аминокислотная последовательность для примера 2SEQ ID NO: 5. Последовательность ДНК для примера 3SEQ ID NO: 6. Аминокислотная последовательность для примера 3SEQ ID NO: 7. Последовательность ДНК для примера 4SEQ ID NO: 8. Аминокислотная последовательность для примера 4SEQ ID NO: 9. Кодон-оптимизированная последовательность ДНК для примера 3 аSEQ ID NO: 10. Аминокислотная последовательность для примера 3 аSEQ ID NO: 11. Кодон-оптимизированная последовательность ДНК для примера 4 аSEQ ID NO: 12. Аминокислотная последовательность для примера 4 а(б) гетерологичный белок-партнер слияния, имеющий происхождение от белка D, где белокпартнер слияния содержит аминокислоты 20-127 белка D; и(в) дополнительные аминокислоты Met-Asp-Pro на N-терминальном конце последовательности слитого белка,где гетерологичный белок-партнер слияния, имеющий происхождение от белка D (б), слит с Nконцом PRAME. 2. Слитый белок по п.1, дополнительно содержащий аффинную метку. 3. Слитый белок по п.2, где аффинная метка представляет собой гистидиновый хвост. 4. Слитый белок по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий одну или более линкерных последовательностей между белком-партнером слияния и PRAME; или между белком-партнером слияния и аффинной меткой; или между PRAME и другой аффинной меткой. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-4. 6. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.5. 7. Выделенная клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.6. 8. Вакцина, содержащая слитый белок по любому из пп.1-4. 9. Вакцина, содержащая нуклеиновую кислоту по п.5 или вектор по п.6. 10. Вакцина по п.8 или 9, дополнительно содержащая адъювант и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин. 11. Вакцина по п.10, где адъювант содержит 3D-MPL, OS21 и/или олигонуклеотид CpG. 12. Применения вакцины по любому из пп.8-11 в медицине. 13. Применение белка по любому из пп.1-4, или нуклеиновой кислоты по п.5, или вектора по п.6- 25016326 для изготовления вакцины для иммунотерапевтического лечения пациента, страдающего раковым заболеванием. 14. Применение по п.13, где раковое заболевание выбрано из меланомы, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака легкого, такого как NSCLC (немелкоклеточный рак легкого), саркомы, рака яичника, рака в области головы и шеи, рака почки, колоректальной карциномы, множественной миеломы, лейкоза, включая острый лейкоз, и карциномы пищевода. 15. Способ получения слитого белка, включающий стадию экспрессии в выделенной клетке слитого белка по любому из пп.1-4. 16. Способ по п.15, в котором клетка представляет собой бактерию. 17. Способ по п.16, в котором бактерия представляет собой Е. coli. 18. Способ по любому из пп.15-17, дополнительно включающий стадию лизирования клетки и очистки экспрессированного слитого белка из лизированных клеток. 19. Слитый белок, полученный или получаемый способом по любому из пп.15-18.