Вакцина

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента Стандартная доза полиовакцин содержит 40 D-антигенных единиц инактивированного полиовируса типа 1 (Mahoney), 8 D-антигенных единиц инактивированного полиовируса типа 2 (MEF-1) и 32 D-антигенные единицы инактивированного полиовируса типа 3 (Saukett). В настоящем изобретении раскрыто, что уменьшенные дозы инактивированного полиовируса могут поддерживать адекватный или улучшенный уровень защиты против полиомиелита. 015964 Область изобретения Настоящее изобретение относится к области вакцин для защиты против полиомиелита и, в частности, к комбинированным вакцинам для защиты против заболеваний полиомиелитом, дифтерией, столбняком и коклюшем. Предшествующий уровень техники Весьма желательно иметь комбинированные вакцины (которые обеспечивают защиту против различных патогенов) для того, чтобы минимизировать количество иммунизаций, необходимых для придания защиты против различных патогенов, снизить затраты при введении и увеличить переносимость и скорости обработки. Документально подтвержденное явление антигенной конкуренции (или интерференции) осложняет разработку многокомпонентных вакцин. Антигенная интерференция относится к наблюдению, что введение множества антигенов часто приводит к ослабленному ответу на некоторые антигены по сравнению с иммунным ответом, наблюдающимся, когда такие антигены вводят по отдельности. Известны комбинированные вакцины, которые могут предупреждать инфекцию, вызываемую Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae и, возможно, инактивированным полиовирусом (IPV), и/или вирусом гепатита В, и/или Haemophilus типа В (см., например, WO 93/24148, WO 97/00697 и WO 2000/030678). После многих лет исследований стандартная доза полиовакцин, принятая как эффективная сообществом по вакцинам, в настоящее время содержит 40 D-антигенных единиц инактивированного полиовируса типа 1 (Mahoney), 8 D-антигенных единиц инактивированного полиовируса типа 2 (MEF-1) и 32 Dантигенные единицы инактивированного полиовируса типа 3 (Saukett) (например, Infanrix-IPV). Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что уменьшенные дозы IPV могут поддерживать адекватный или улучшенный уровень защиты против полиомиелита. Такие вакцины обладают значительными преимуществами, включая способность предоставления большего количества доз IPVвакцин для индивидуумов, нуждающихся в этом. Сущность изобретения Соответственно согласно настоящему изобретению предложены различные вакцины с уменьшенной дозой IPV (которые могут иметь только компоненты IPV или могут иметь компоненты IPV, комбинированные с другими антигенами). Соответственно в одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена IPV-вакцина по изобретению, содержащая инактивированный полиовирус типа 1 в дозе более 10 D-антигенных единиц и менее 20 D-антигенных единиц, например 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 D-антигенных единиц. В одном из воплощений согласно настоящему изобретению предложена IPV-вакцина по изобретению, содержащая инактивированный полиовирус типа 3 в дозе 8-20 D-антигенных единиц, например 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 D-антигенных единиц. В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена IPV-вакцина по изобретению, содержащая инактивированный полиовирус типа 2 в дозе 2-4 D-антигенные единицы, например 2, 3 или 4 D-антигенные единицы. В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена IPV-вакцина по изобретению, дополнительно содержащая дифтерийный анатоксин, и/или столбнячный анатоксин, и/или коклюшную вакцину в форме убитой цельноклеточной вакцины Pw или бесклеточных коклюшных антигенов. В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена IPV-вакцина по изобретению,представляющая собой не содержащую тиомерсала комбинированную DTP (дифтерийно-столбнячнококлюшную)-IPV-вакцину, содержащую инактивированный полиовирус типа 1 в дозе от 10 до 36 Dантигенных единиц. В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена не содержащая тиомерсала комбинированная DTP-IPV-вакцина по изобретению, содержащая инактивированный полиовирус типа 2 в дозе 2-7 D-антигенных единиц, например 5, 6 или 7 D-антигенных единиц. В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена не содержащая тиомерсала комбинированная DTP-IPV-вакцина по изобретению, содержащая инактивированный полиовирус типа 3 в дозе 8-29 D-антигенных единиц, например 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 D-антигенных единиц. В другом воплощении вакцины по настоящему изобретению также могут содержать один или более антигенов, выбранных из группы, состоящей из поверхностного антигена вируса гепатита В, антигена(ов) Haemophilus influenzae b, антигена(ов) Neisseria meningitidis А, антигена(ов) Neisseria meningitidis С, антигена(ов) Neisseria meningitidis W, антигена(ов) Neisseria meningitidis Y, везикулы или антигена(ов)Neisseria meningitidis В, антигена(ов) вируса гепатита А и антигена(ов) Salmonella typhi, в частности капсульных сахаридных антигенов указанных бактерий. Также предложены способы получения вакцин по изобретению. Определения Термин "вакцина" может быть заменен термином "иммуногенная композиция" и наоборот.-1 015964 форма полиовируса индуцирует появление защитных нейтрализующих антител. D-антигенные единицы,которые упоминаются в данном описании (например, в вакцинах по изобретению), представляют собой измеренные общие D-антигенные единицы каждого типа неадсорбированного нефасованного антигенаIPV перед получением конечной вакцины, которые добавляют в каждую человеческую дозу изготавливаемой вакцины (обычно в конечном объеме 0,5 мл). Надежные способы измерения D-антигенных единиц хорошо известны в данной области техники и опубликованы, например, в Европейской фармакопее. Например, D-антигенные единицы можно измерить с использованием ELISA-теста, как описано ниже в примере 1 ("Количественное определение D-антигена с помощью ELISA"). Европейская фармакопея предоставляет тест-образец (биологический эталонный препарат согласно Европейской фармакопее, предоставляемый Секретариатом Европейского фармакопейного комитета, например, код Р 216 0000) для стандартизации таких способов среди производителей (Pharmeuropa Special Issue, Bio 96-2). Таким образом,значение D-антигенных единиц хорошо понятно в данной области техники. Термин "доза" в данном описании обычно соответствует одному введению вакцины по изобретению, которое обычно представляет собой одну инъекцию. Типичная человеческая доза составляет 0,5 мл. Конечно, согласно схеме введения вакцины можно вводить различные дозы. Термин "IPV" или вакцина, содержащая эти компоненты, в данном описании предназначен для обозначения инактивированного полиовируса типа 1 (например, Mahoney, который предпочтительно используется, или Brunhilde, который продается Statens Serum Institut (Датский государственный институт вакцин и сывороток) под названием DiTeKiPol), типа 2 (например, MEF-1) или типа 3 (например, Saukett) либо комбинации любых двух или всех этих трех типов. Примером IPV-вакцины в полной (или стандартной) дозе (40-8-32 D-антигенных единиц IPV типов 1, 2 и 3 соответственно) для задач этого изобретения могла бы служить Poliorix (GSK Biologicals S.A.). Таким образом, если в данном описании указано, что в вакцине по изобретению присутствует Х% стандартной дозы IPV, то это означает, что в каждой дозе указанной вакцины содержатся D-антигенные единицы, равные Х% от 40, 8 и/или 32 D-антигенных единиц IPV 1, 2 и/или 3 типов соответственно (которые измерены в нефасованной форме каждого типа антигена IPV). Термины "липополисахарид" (LPS) и "липоолигосахарид" (LOS) взаимозаменяемы. Термин "сахарид" на протяжении всего описания может указывать на полисахарид или олигосахарид и включает в себя и то и другое. Капсульный сахаридный антиген может представлять собой полноразмерный полисахарид, или он может распространяться на бактериальные "уменьшенные в размере сахариды" и "олигосахариды" (которые от природы имеют небольшое количество повторяющихся единиц или которые представляют собой полисахариды, уменьшенные в размере для облегчения работы с ними,но все еще способные индуцировать защитный иммунный ответ у хозяина), которые хорошо известны в области вакцин (см., например, ЕР 497525). Термин "нуклеиновая кислота" в данном описании может включать в себя одно- или двухцепочечную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или одно- или двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту(РНК) либо их смесь. Термин "компонент(ы)" патогена или "компонент(ы), обеспечивающий защиту против такого патогена" в вакцинах по изобретению в данном описании предназначен для обозначения одного или более антигенов этого патогена. Термины "примерно" или "приблизительно" в данном описании используют для обозначения среднего значения 10% от установленной величины, но должны быть использованы в контексте их применения. Описание чертежей Фиг. 1 - оценка относительной эффективности (RP) DTPwSF-HB-IPV по "Способу получения 3" в зависимости от дозы IPV. Эффективность IPV в низких дозах для композиций, изготовленных согласно "Способу получения 3", исследовали in vivo в сравнении с эталонными композициями (композиция Poliorix и DTPaIPVHB).RP IPV измеряли в дозах 100, 50, 25 и 12,5% от стандартной дозы IPV (40/8/32 D-антигенные единицы для типов 1/2/3). Фиг. 2 - оценка относительной эффективности (RP) композиций DTPwSF-HB-IPV для разных технологических процессов (formulation flowsheet). Эффективность IPV в низких дозах для обеих композиций, изготовленных согласно "Способу получения 3" и "Способу получения 4", исследовали in vivo в сравнении с эталонными композициями (композиция Poliorix и DTPaIPVHB). RP измеряли как для "Способа получения 3", так и для "Способа получения 4" в дозе 25% от стандартной дозы IPV (40/8/32 D-антигенные единицы для типов 1/2/3) в сравнении с плацебо, содержащим только 25% IPV. Фиг. 3. Относительная эффективность IPV типов 1, 2 и 3 в момент времени 0 и 8 месяцев. Относительную эффективность IPV измеряли (относительно DTPaHBIPV (Pediarix) (фиг. 3 а илиPoliorix (фиг. 3 б с целью определить, оказывает ли компонент Hib (Haemophilus influenzae типа b) влияние на эффективность IPV, и с целью оценить стабильность IPV во времени при разных дозах IPV.-2 015964 Подробное описание Согласно настоящему изобретению предложена вакцина (например, комбинированная вакцина),содержащая антигены полиовируса (IPV) и, возможно, Corynebacterium diphteriae (D), Clostridium tetani(T), Bordetella pertussis (P) или вируса гепатита В. Антигены по изобретению. Компоненты IPV-вакцин. Вакцины по изобретению могут быть составлены из IPV типа 1, или IPV типа 2, или IPV типа 3 либо IPV типов 1 и 2, или IPV типов 1 и 3, или IPV типов 2 и 3, или IPV типов 1, 2 и 3. Способы получения инактивированного полиовируса (IPV) общеизвестны в данной области техники. В одном из воплощений IPV будет представлять собой IPV типов 1, 2 и 3, как принято в области вакцин, и может представлять собой полиовакцину Солка, которая инактивирована формальдегидом (см.,например, Sutter et al., 2000, Pediatr. Clin. North Am., 47: 287; ZimmermanSpann, 1999, Am. Fam. Physician, 59: 113; Salk et al., 1954, Official Monthly Publication of American Public Health Association, 44(5): 563;Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard, 47: 139; Budowsky, 1991, Adv. Virus Res., 39: 255). В одном из воплощений IPV не является адсорбированным (например, перед смешиванием с другими компонентами, если они присутствуют). В другом воплощении компонент(ы) IPV по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на соли алюминия, например гидрате окиси алюминия (например,до или после смешивания с другими компонентами, если они присутствуют). В другом воплощении компонент(ы) IPV по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении компонент(ы) IPV может(могут) быть адсорбирован(ы) на смеси гидрата окиси алюминия и фосфата алюминия. Если они адсорбированы, то один или более компонентовIPV могут быть адсорбированы по отдельности или вместе в виде смеси. IPV может быть стабилизирован с использованием конкретного способа сушки, как описано в WO 2004/039417. Полиовирус можно выращивать в клеточной культуре. Клеточная культура может представлять собой линию клеток VERO или PMKC, представляющую собой стабильную клеточную линию, полученную из почки мартышки. Клетки VERO могут представлять собой удобно культивируемые микроносители. Культивирование клеток VERO до и во время вирусной инфекции может включать применение полученного от коров материала, такого как телячья сыворотка, и этот материал следует получать из источников, которые не содержат губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE). Культура также может включать такие вещества, как гидролизат лактальбумина. После выращивания вирионы можно очистить с использованием таких методик, как ультрафильтрация, диафильтрация и хроматография. Перед введением пациентам вирусы должны быть инактивированы, и этого можно достичь обработкой формальдегидом. Вирусы могут быть выращены, очищены и инактивированы по отдельности и затем комбинированы с получением концентрированной нефасованной смеси для применения в IPV-вакцине или для добавления к адсорбированному дифтерийному и столбнячному антигену и коклюшным компонентам дляDTPw-IPV- или DTPa-IPV-содержащих вакцин. Антигены в вакцинах по изобретению будут присутствовать в "иммунологически эффективных количествах", т.е. введение такого количества индивидууму либо в однократной дозе, либо в виде части серии оказывается эффективным для лечения или предупреждения заболевания. Лечение дозами может осуществляться по схеме однократного приема или схеме многократного приема (например, включая бустерные дозы). В настоящее время стандартные дозы полиовакцин обычно содержат 40 D-антигенных единиц инактивированного полиовируса типа 1, 8 D-антигенных единиц инактивированного полиовируса типа 2 и 32 D-антигенных единиц инактивированного полиовируса типа 3 (например, Infanrix-IPV). Однако авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что для получения хорошего иммунного ответа можно использовать уменьшенные дозы IPV. В одном из воплощений вакцинная дозаIPV по настоящему изобретению может содержать от 10 до 36 D-антигенных единиц IPV типа 1 (например, 11-32, 12-28, 13-24, 14-20 или 15-19 D-антигенных единиц). В другом воплощении вакцинная дозаIPV по настоящему изобретению может содержать IPV типа 1 в дозе 10-20 D-антигенных единиц или дозе более 10 D-антигенных единиц и менее 20 D-антигенных единиц. В другом воплощении вакцинная доза по настоящему изобретению может содержать 26-49, 30-45, 33-40, 35-37% или приблизительно либо точно одну треть от стандартной дозы 40 D-антигенных единиц IPV типа 1 (эквивалентную приблизительно 10,4-19,6, 12-18, 13,2-16, 14-14,8 или 13,3 D-антигенным единицам). В другом воплощении вакцинная доза IPV по настоящему изобретению может содержать 11-32 D-антигенные единицы, 12-28 Dантигенных единиц, 13-24 D-антигенные единицы или 14-20 D-антигенных единиц IPV типа 1. Альтернативно, вакцинная доза IPV по настоящему изобретению может содержать 10-19,5 Dантигенных единиц, 12-19 D-антигенных единиц, 14-18,5 D-антигенных единиц или 15-17 D-антигенных единиц; например примерно или точно 16 D-антигенных единиц IPV типа 1. В другом воплощении вакцины по настоящему изобретению могут содержать менее 4 Dантигенных единиц, 2-4 D-антигенные единицы (эквивалентные 25-50% от стандартной дозы 8 Dантигенных единиц) или примерно или точно 3 D-антигенные единицы IPV типа 2 (эквивалентные 37,5%-3 015964 от стандартной дозы 8 D-антигенных единиц). В другом воплощении вакцина по настоящему изобретению может содержать приблизительно или точно одну треть от стандартной дозы 8 D-антигенных единиц IPV типа 2 (эквивалентной приблизительно 2,7 D-антигенных единиц). В другом воплощении вакцины по настоящему изобретению могут содержать 2-7 D-антигенных единиц IPV типа 2. В другом воплощении вакцинная доза IPV по настоящему изобретению может содержать 3-6 D-антигенных единиц или 4-5 D-антигенных единиц IPV типа 2. Альтернативно, вакцинная доза IPV по настоящему изобретению может содержать 2-4,5 D-антигенных единиц, 2,5-4 D-антигенные единицы или 3-3,5 D-антигенных единиц IPV типа 2. В другом воплощении вакцины по настоящему изобретению могут содержать 8-20 D-антигенных единиц, более 8 и менее 20 D-антигенных единиц, 9-19 D-антигенных единиц, 10-18 D-антигенных единиц, 11-17 D-антигенных единиц, 12-16 D-антигенных единиц или 13-15 D-антигенных единиц; например, примерно или точно 14 D-антигенных единиц IPV типа 3 (эквивалентных 25-62,5%, 28,125-59,375%,31,25-46,875% или 43,75% от стандартной дозы 32 D-антигенных единиц). В другом воплощении вакцина по настоящему изобретению может содержать приблизительно или точно одну треть от стандартной дозы 32 D-антигенных единиц IPV типа 3 (эквивалентной приблизительно 10,7 D-антигенных единиц). В другом воплощении вакцинная доза IPV по настоящему изобретению может содержать 8-29 Dантигенных единиц, 9-26 D-антигенных единиц, 10-23 D-антигенных единиц, 11-20 D-антигенных единиц, 12-17 D-антигенных единиц или 13-14 D-антигенных единиц IPV типа 3. Альтернативно, вакцинная доза IPV по настоящему изобретению может содержать 8-19,5 Dантигенных единиц, 9-19 D-антигенных единиц, 10-18,5 D-антигенных единиц, 11-18 D-антигенных единиц, 12-17,5 D-антигенных единиц, 13-17 D-антигенных единиц или 14-16 D-антигенных единиц; например примерно или точно 15 D-антигенных единиц. Компоненты DTP-вакцин.DTP-вакцины представляют собой общеизвестные вакцины для предупреждения или лечения дифтерии, столбняка и заболевания, вызываемого В. pertussis. Вакцины по изобретению могут содержать дифтерийный, столбнячный и/или коклюшный компонент(ы). Дифтерийный антиген обычно представляет собой дифтерийный анатоксин. Получение дифтерийных анатоксинов (DT) документально подтверждено. Может быть использован любой подходящий дифтерийный анатоксин. Например, DT может быть получен в результате очистки токсина из культурыCorynebacterium diphthehae с последующей химической детоксикацией, но, альтернативно, изготовлен путем очистки рекомбинантного или генетически детоксифицированного аналога токсина (например,CRM197 или других мутантов, как описано в US 4709017, US 5843711, US 5601827 и US 5917017). В одном из воплощений DT представлен в количестве 5-50, 7-30 Lf (флокулирующих единиц) или приблизительно или точно 7,5 Lf или 25 Lf на 0,5-мл дозу. В другом воплощении DT представлен в низкой дозе менее 5 Lf или 1-4 Lf либо приблизительно или точно 2 Lf на 0,5-мл дозу. В одном из воплощений дифтерийный анатоксин по изобретению может быть адсорбирован на соли алюминия, например гидрате окиси алюминия. В другом воплощении дифтерийный анатоксин по изобретению может быть адсорбирован на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении дифтерийный анатоксин может быть адсорбирован на смеси как гидрата окиси алюминия, так и фосфата алюминия. Столбнячный антиген по изобретению обычно представляет собой столбнячный анатоксин. Способы получения столбнячных анатоксинов (ТТ) общеизвестны в данной области техники. В одном из воплощений ТТ получают путем очистки токсина из культуры Clostridium tetani с последующей химической детоксикацией, но, альтернативно, готовят путем очистки рекомбинантного, или генетически детоксифицированного аналога токсина (например, как описано в ЕР 209281). Может быть использован любой подходящий столбнячный анатоксин. "Столбнячный анатоксин" может охватывать иммуногенные фрагменты полноразмерного белка (например, фрагмент С - см. ЕР 478602). В одном из воплощений ТТ представлен в количестве 2,5-30 Lf, 3-20 Lf, 5-15 Lf или точно или приблизительно 10 Lf на 0,5-мл дозу. В одном из воплощений столбнячный анатоксин по изобретению может быть адсорбирован на соли алюминия, например гидрате окиси алюминия. В другом воплощении столбнячный анатоксин по изобретению может быть адсорбирован на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении столбнячный анатоксин может быть адсорбирован на смеси как гидрата окиси алюминия, так и фосфата алюминия. Коклюшный компонент по изобретению может быть либо бесклеточным (Ра; от pertussis acellular),когда используются очищенные коклюшные антигены, либо цельноклеточным (Pw; от pertussis wholecell), когда в качестве коклюшного компонента используются убитые цельные "коклюшные" клетки. Pw можно инактивировать несколькими известными методами, включая безртутные методы. Такие способы могут включать инактивацию нагреванием (например, 55-65 С или 56-60 С в течение 5-60 мин или в течение 10-30 мин, например 60 С в течение 30 мин), формальдегидом (например, 0,1% при 37 С, 24 ч),глутаровым альдегидом (например, 0,05% при комнатной температуре, 10 мин), ацетоном-I (например,три обработки при комнатной температуре) или ацетоном-II (например, три обработки при комнатной-4 015964 температуре и четвертая обработка при 37 С) (см., например, Gupta et al., 1987, J. Biol. Stand., 15: 87;Gupta et al., 1986, Vaccine, 4: 185). Способы получения убитой, цельноклеточной Bordetella pertussis (Pw),подходящей для этого изобретения, описаны в WO 93/24148, которые являются подходящими технологическими способами получения DT-TT-Pw-HepB-содержащих вакцин. В прошлом при получении убитой цельноклеточной Bordetella pertussis использовали тиомерсал (см. ниже). Однако в одном из воплощений он не используется в способе получения вакцин по настоящему изобретению. Обычно используют Pw-дозу, равную 5-50 IOU (международных единиц мутности (InternationalOpacity Unit, 7-40 IOU, 9-35 IOU, 11-30 IOU, 13-25 IOU, 15-21 IOU или примерно или точно 20 IOU. Бесклеточные Pa-вакцины также общеизвестны и могут содержать 2 или более антигенов, выбранных из коклюшного анатоксина (РТ), филаментозного гемагглютинина (FHA), пертактина (PRN), агглютиногенов 2 и 3. В одном из воплощений Pa-вакцина содержит РТ, FHA и PRN. Наборы или вакцины по изобретению могут содержать РТ, детоксифицированный общеизвестным способом формальдегидной обработки или посредством мутаций (производное РТ). Обнаружено, что замены остатков в пределах S1 субъединицы данного белка приводят к получению белка, который сохраняет иммунологические и защитные свойства РТ, но при снижении или отсутствии токсичности (ЕР 322533). Детоксифицирующие мутации, рассмотренные в формуле изобретения ЕР 322533, представляют собой примеры детоксифицированных DT-мутантов по настоящему изобретению. Такие мутанты могут быть использованы в дозах ниже 20-25 мкг. В одном из воплощений РТ используют в количестве 2-50, 5-40, 10-30 мкг либо точно или приблизительно 25 мкг на 0,5-мл дозу. В другом воплощении РТ используют в количестве точно или приблизительно 2,5 или 8 мкг на 0,5-мл дозу. В одном из воплощений FHA используют в количестве 2-50, 5-40, 10-30 мкг либо точно или приблизительно 25 мкг на 0,5-мл дозу. В другом воплощении FHA используют в количестве точно или приблизительно 2,5 или 8 мкг на 0,5-мл дозу. В одном из воплощений PRN используют в количестве 0,5-20, 0,8-15, 2-10 мкг либо точно или приблизительно 8 мкг на 0,5-мл дозу. В другом воплощении PRN используют в количестве точно или приблизительно 0,8 или 2,5 мкг на 0,5 мл. В одном из воплощений коклюшный компонент по изобретению может быть адсорбирован на соли алюминия, например гидрате окиси алюминия. В другом воплощении коклюшный компонент по изобретению может быть адсорбирован на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении коклюшный компонент может быть адсорбирован на смеси как гидрата окиси алюминия, так и фосфата алюминия. Например, в одном из воплощений, по меньшей мере, PRN адсорбирован на гидрате окиси алюминия, при этом PT/FHA адсорбирован на гидрате окиси алюминия, фосфате алюминия или смеси их обоих. Дополнительные антигены. Вакцинные композиции по изобретению, возможно, также содержащие DTP (DTPw или DTPa), могут дополнительно содержать один или более антигенов, выбранных из группы, состоящей из поверхностного антигена вируса гепатита В, антигена(ов) Haemophilus influenzae b, антигена(ов) Neisseria meningitidis А, антигена(ов) Neisseria meningitidis С, антигена(ов) Neisseria meningitidis W-135, антигена(ов) Neisseria meningitidis Y, везикулы или очищенного антигена(ов) Neisseria meningitidis В, антигена(ов) вируса гепатита А, антигена(ов) Salmonella typhi и RTS,S. Обычно могут быть использованы капсульные сахаридные или LOS антигены этих патогенов. Антигены обычно будут представлены в концентрации по меньшей мере 1 мкг/мл каждый, например 1-20, 2-15, 2,5-10, 3-8 или 4-6 мкг/мл. В общем случае концентрация любого антигена будет достаточной для вызывания иммунного ответа против этого антигена. Предпочтительно, чтобы защитная эффективность индивидуальных антигенов не устранялась при их объединении, хотя фактическая иммуногенность (например, ELISA-титры) может быть снижена. Дополнительный(е) антиген(ы) в одном из воплощений изобретения может(могут) быть адсорбирован(ы) на соли алюминия, например на гидрате окиси алюминия. В другом воплощении дополнительные антигены по изобретению могут быть адсорбированы на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении дополнительные антигены могут быть адсорбированы на смеси как гидрата окиси алюминия, так и фосфата алюминия, или могут быть неадсорбированными. Если используют капсульный сахаридный или LOS антиген, то он может быть конъюгирован с белком-носителем, содержащим Т-хелперные эпитопы, для усиления иммуногенности. Изобретение также может включать свободные "белки-носители". В качестве альтернативы использованию в композициях по изобретению белковых антигенов может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая антиген. Таким образом, белковые компоненты композиций по изобретению могут быть заменены на нуклеиновую кислоту (например, ДНК, которая может находиться в форме плазмиды), кодирующую этот белок. Аналогично, композиции по изобретению могут содержать белки, которые имитируют сахаридные антигены, например мимеотопы или антиидиотипические антитела. Они могут заменять индивидуальные сахаридные компоненты или могут дополнять их.-5 015964 Антиген вируса гепатита В. Получение поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) документально подтверждено. См.,например, Hartford et al., 1983, Develop. Biol. Standard, 54: 125; Gregg et al., 1987, Biotechnology, 5: 479; EP 0226846; EP 0299108. Он может быть получен следующим образом. Один способ включает очистку антигена в форме частиц из плазмы хронических носителей вируса гепатита В, поскольку в процессе HBVинфекции в печени синтезируются большие количества HBsAg, которые высвобождаются в кровоток. Другой способ включает экспрессирование данного белка методами рекомбинантной ДНК. HBsAg может быть получен путем экспрессии в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, pichia, клетках насекомых (например, Hi5) или клетках млекопитающих. HBsAg может быть вставлен в плазмиду, и его экспрессия из плазмиды может контролироваться промотором, таким как промотор "GAPDH" (гена глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы). Дрожжи можно культивировать в синтетической среде. Затем HBsAg может быть очищен способом, включающим такие стадии, как осаждение, ионообменная хроматография и ультрафильтрация. После очистки HBsAg может быть подвергнут диализу (например, с использованием цистеина). HBsAg можно использовать в форме частиц. Как использовано в данном описании, экспрессия "поверхностного антигена вируса гепатита В" или"HBsAg" охватывает любой антиген HBsAg или его фрагмент, проявляющий антигенность поверхностного антигена HBV. Следует понимать, что в дополнение к 226 аминокислотной последовательности Sантигена HBsAg (см. Tiollais et al., 1985, Nature, 317: 489 и приведенные там ссылки), HBsAg, как он описан в данном изобретении, может, при желании, содержать всю или часть пре-S-последовательности,которая описана в приведенных выше ссылках и в ЕР 0278940. В частности, HBsAg может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, содержащую остатки 133-145, за которыми следуют остатки 175-400 L-белка HBsAg, относительно открытой рамки считывания вируса гепатита В ad-серотипа (этот полипептид обозначается как L; см. ЕР 0414374). HBsAg в пределах объема изобретения также может включать преS1-преS2 S-полипептид, описанный в ЕР 0198474(Endotronics), или его аналоги, например, описанные в ЕР 0304578 (McCormick и Jones). HBsAg, как он описан в данном изобретении, также может относиться к мутантам, например "ускользающему мутанту",описанному в WO 91/14703 или ЕР 0511855 А 1, особенно HBsAg, где аминокислотной заменой в положении 145 является замена глицина на аргинин.HBsAg может быть представлен в форме частиц. Частицы могут содержать, например, S-белок сам по себе или могут представлять собой комбинированные частицы, например L, S, где L определен выше, a S означает S-белок HBsAg. Указанная частица предпочтительно находится в форме, в которой она экспрессируется в дрожжах. В одном из воплощений HBsAg представляет собой антиген, используемый в EngerixB(GlaxoSmithKline Biologicals S.A.), который дополнительно описан в WO 93/24148. В одном из воплощений HBsAg присутствует в количестве 5-20, 8-15 мкг или приблизительно или точно 10 мкг на 0,5-мл дозу. Поверхностный антиген вируса гепатита В может быть адсорбирован на фосфате алюминия, что может быть сделано перед смешиванием с другими компонентами (описано в WO 93/24148). Компонент вируса гепатита В, по существу, не должен содержать тиомерсала (способ получения HBsAg без тиомерсала описан ранее в ЕР 1307473). Антиген(ы) Haemophilus influenzae b. Вакцины, содержащие антигены Haemophilus influenzae типа В, описаны в WO 97/00697. В вакцинах по изобретению может быть использован любой подходящий антиген Haemophilus influenzae типа В. Антиген может представлять собой капсульный сахарид (PRP) Haemophilus influenzae типа В (Hib),конъюгированный с белком-носителем. Сахарид представляет собой полимер рибозы, рибита и фосфата.Hib-антиген, возможно, может быть адсорбирован на фосфате алюминия, как описано в WO 97/00697,или может быть неадсорбированным, как описано в WO 02/00249, или может не подвергаться конкретному процессу адсорбции. Под антигеном, "не адсорбированным на адъювантной соли алюминия", в данном описании подразумевают, например, что особая или специальная стадия адсорбции антигена на свежеприготовленной адъювантной соли алюминия не включена в способ получения композиции. Hib может быть конъюгирован с любым носителем, который может обеспечить по меньшей мере один Т-хелперный эпитоп (примеры которого описаны ниже) и который может представлять собой столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, CRM-197 (мутант дифтерийного токсина) или белок D.Hib может быть лиофилизирован и может быть разведен непосредственно перед использованием(например, с применением разбавителя, возможно, содержащего другие антигенные компоненты вакцин по изобретению). В одном из воплощений Hib присутствует в количестве 5-20, 8-15 мкг либо приблизительно или точно 10 мкг сахарида на 0,5-мл дозу. В другом воплощении Hib присутствует в низкой дозе (например, 1-6, 2-4 мкг либо приблизительно или точно 2,5 мкг сахарида), как описано в WO 02/00249. Антигены Neisseria meningitidis типов А, С, W или Y.-6 015964 Вакцины по изобретению могут дополнительно содержать капсульный сахарид бактерии, выбранной из группы, состоящей из N. meningitidis типа А (MenA, возможно, конъюгированный с белкомносителем), N. meningitidis типа С (MenC, возможно, конъюгированный с белком-носителем), N. meningitidis типа W-135 (MenW, возможно, конъюгированный с белком-носителем) и N. meningitidis типа Y(MenY, возможно, конъюгированный с белком-носителем). Вакцины по изобретению могут содержать один или более антигенов разных штаммов N. meningitidis, которые могут быть использованы сами по себе или в любой комбинации двух, трех или четырех компонентов, как описано подробно ниже:MenY, MenC + MenW + MenY, или MenA + MenC + MenW + MenY. В одном из воплощений компонент(ы) Neisseria meningitidis по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на соли алюминия, например на гидрате окиси алюминия. В другом воплощении компонент(ы) Neisseria meningitidis по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении компонент(ы) Neisseria meningitidis по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на смеси как гидрата окиси алюминия, так и фосфата алюминия. В одном из воплощений компонент(ы) Neisseria meningitidis по изобретению может(могут) быть неадсорбированным(и) на адъюванте, например адъювантной соли алюминия. Везикула или антиген(ы) Neisseria meningitidis типа В. Вакцины по изобретению также могут содержать компонент MenB, такой как везикула или пузырек наружной мембраны, как описано в WO 01/09350, WO 03/105890, WO 04/014417 или WO 04/014418, или конъюгированный капсульный сахаридный антиген MenB (или его производное) (например, см. WO 96/40239), или свободный либо конъюгированный менингококковый LOS L2 или L3 либо L2 и L3 (согласно WO 2004/014417). В одном из воплощений MenB-компонент(ы) по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на соли алюминия, например гидрате окиси алюминия. В другом воплощенииMenB-компонент(ы) по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении компонент(ы) MenB может(могут) быть адсорбирован(ы) на смеси как гидрата окиси алюминия, так и фосфата алюминия. В одном из воплощений компонент(ы)MenB может(могут) быть неадсорбированным(и) на адъюванте, например адъювантной соли алюминия. Антиген(ы) Salmonella typhi. Вакцины по изобретению могут дополнительно содержать Vi сахарид Salmonella typhi, который может представлять собой зарегистрированный продукт Typherix, описанный в ЕР 1107787, или его конъюгат (например, с белком-носителем, как описано в данном изобретении). Процесс конъюгирования может быть осуществлен, как описано в WO 2007/000343. В одном из воплощений Vi сахарид(ы) по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на соли алюминия, например гидрате окиси алюминия. В другом воплощении Vi сахарид(ы) изобретения может(могут) быть адсорбирован(ы) на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении Vi сахарид(ы) может(могут) быть адсорбирован(ы) на смеси как гидрата окиси алюминия, так и фосфата алюминия. В одном из воплощений Vi сахарид(ы) может(могут) быть неадсорбированным(и) на адъюванте, например адъювантной соли алюминия. Антиген(ы) вируса гепатита А. Компонент, обеспечивающий защиту против гепатита А, может представлять собой убитую аттенуированную вакцину против гепатита А, например продукт, известный как Havrix (зарегистрированная торговая марка от GlaxoSmithKline Biologicals S.A.), представляющий собой убитую аттенуированную вакцину, происходящую из штамма НМ-175 вируса гепатита А (HAV) (см. F.E. Andre et al., "Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A", 1980, Prog. Med. Virol., 37:72; и монографию по продуктам"Havrix", опубликованную SmithKline Beecham Biologicals, 1991). В Flehmig et al., 1990, Prog. Med. Virol.,37: 56 приведен обзор клинических аспектов, вирусологии, иммунологии и эпидемиологии гепатита А и обсуждаются подходы к разработкам вакцин против этой распространенной вирусной инфекции. Как использовано в данном описании, экспрессионный "антиген HAV" относится к любому антигену, способному стимулировать нейтрализующее антитело к HAV у людей. В одном из воплощений антигенHAV содержит инактивированные аттенуированные вирусные частицы или в другом воплощении он может представлять собой капсид HAV или вирусный белок HAV, который может быть удобно получен с использованием технологии рекомбинантной ДНК. В одном из воплощений компонент вируса гепатита А по изобретению может быть адсорбирован на соли алюминия, например гидрате окиси алюминия. В другом воплощении компонент вируса гепатита А по изобретению может быть адсорбирован на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении компонент вируса гепатита А может быть адсорбирован на смеси как гидрата окиси алюминия, так и фосфата алюминия. Малярийный(е) антиген(ы). Вакцины по изобретению могут дополнительно содержать малярийный(е) антиген(ы). Малярийный антиген может представлять собой RTS,S (гибридный белок между CS и HBsAg - описанный в US 6306625 и ЕР 0614465). В одном из воплощений RTS,S может быть использован в вакцинах по изобрете-7 015964 нию вместо HBsAg. Другие малярийные антигены также могут быть использованы в вакцинах по изобретению, включая CS белок, RTS, TRAP, 16 кДа белок В 2992, АМА-1, MSP1, возможно, включая CpG(WO 2006/029887, WO 98/05355, WO 01/00231). В одном из воплощений малярийный(е) антиген(ы) по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на соли алюминия, например гидрате окиси алюминия. В другом воплощении малярийный(е) антиген(ы) по изобретению может(могут) быть адсорбирован(ы) на такой соли алюминия, как фосфат алюминия. В другом воплощении малярийный(е) антиген(ы) может(могут) быть адсорбирован(ы) на смеси как гидрата окиси алюминия, так и фосфата алюминия. В одном из воплощений малярийный антиген дополнен адъювантом в виде эмульсии типа "масло-в-воде", и/или производным липида А (таким какMPL), и/или стерином (таким как холестерин), и/или токолом (таким как -токоферол). В другом воплощении малярийный(е) антиген(ы) может быть неадсорбированным на адъюванте, например адъювантной соли алюминия. Конъюгаты. Бактериальные капсульные сахаридные конъюгаты по изобретению могут содержать любой пептид-, полипептид- или белок-носитель, содержащий по меньшей мере один Т-хелперный эпитоп. Используемый белок-носитель(и) может быть выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина,дифтерийного анатоксина, CRM197, рекомбинантного дифтерийного токсина (который описан в любом из US 4709017, WO 93/25210, WO 95/33481 или WO 00/48638), пневмолизина (возможно, химически детоксифицированного или представляющего собой детоксифицированный мутант) S. pneumoniae (см.,например, WO 2004/081515 и приведенные там ссылки), ОМРС (белка С наружной мембраны) N. meningitidis (ЕР 0372501) и белка D (PD) H. influenzae (ЕР 594610). Другие носители могут включать синтетические пептиды (ЕР 0378881; ЕР 0427347), белки теплового шока (WO 93/17712; WO 94/03208), "коклюшные" белки (WO 98/58668; ЕР 0471177), цитокины (WO 91/01146), лимфокины (WO 91/01146), гормоны (WO 91/01146), ростовые факторы (WO 91/01146), искусственные белки, содержащие разнообразные человеческие CD4+ Т-клеточные эпитопы из различных антигенов, происходящих из патогенов (Falugi et al., 2001, Eur. J. Immunol., 31: 3816), пневмококковый поверхностный белок PspA (WO 02/091998),железосвязывающие белки (WO 01/72337), токсин А или В С. difficile (WO 00/61761), пневмококковыйPhtD (WO 00/37105), пневмококковый PhtDE (например, WO 01/98334 и WO 03/054007), PhtX и т.д. Все сахариды могут находиться на одном и том же носителе, в частности все сахариды конкретного микроорганизма, например сахариды MenA, MenC, MenW и MenY, все могут быть конъюгированы с ТТ,DT или CRM-197. Однако вследствие известного эффекта индуцированной носителем супрессии может быть предпочтительно, если в каждой из композиций по изобретению содержащиеся в них сахаридные антигены ("n" антигенов) конъюгированы с более чем одним носителем. Так, (n-1) сахаридов могли бы переноситься (по отдельности) одним типом носителя, а 1 - другим носителем, или (n-2) - одним, а 2 двумя разными носителями и т.д. Например, в вакцине, содержащей 4 бактериальных сахаридных конъюгата, 1, 2 или все четыре могли бы быть конъюгированы с разными носителями. Белок D, однако, может использоваться для различных (2, 3, 4 или более) сахаридов в композиции без заметного эффекта индуцированной носителем супрессии. Hib может быть представлен в виде конъюгата с ТТ, DT илиCRM197, а MenA, MenC, MenY и MenW могут представлять собой конъюгаты либо с ТТ, DT, CRM197,либо с PD. Vi может присутствовать в виде конъюгата с ТТ, DT или CRM197. Белок D полезен в качестве носителя, поскольку предоставляет дополнительный антиген, который может обеспечить защиту против Н. influenzae. В одном из воплощений все сахариды конъюгированы с одним и тем же белком-носителем.Vi может быть конъюгирован с белком-носителем, например, способом химической конденсации с использованием карбодиимида (например, EDAC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (при условии, что повторяющаяся субъединица Vi содержит группы карбоновой кислоты). Этого можно достичь либо путем: (1) одинарной карбодиимидной реакции между СООН из Vi и NH2 белка, либо (2) двойной карбодиимидной реакции, которая может протекать либо между СООН из Vi и NH2 молекулы гомобифункционального линкера и СООН белка и NH2 молекулы гомобифункционального линкера, либо между СООН из Vi и NH2 молекулы гетеробифункционального линкера и NH2 белка и СООН молекулы гетеробифункционального линкера. Конъюгирование может быть использовано вместе со свободным белком-носителем(ями). В одном из воплощений, когда заданный белок-носитель присутствует в композиции по изобретению как в свободной, так и в конъюгированной форме, неконъюгированная форма составляет не более 5% от общего количества белка-носителя в композиции в целом, или в другом воплощении она присутствует в количестве менее 2 мас.%. Сахарид может быть связан с белком-носителем любым известным способом (например, по Likhite,патент США 4372945, и по Armor и др., патент США 4474757) с использованием любого подходящего линкера, где это необходимо. Обычно перед конъюгированием сахарид будет активирован или функционализирован. В активацию могут быть вовлечены, например, цианилирующие агенты, такие как CDAP (тетрафторборат 1 цианодиметиламинопиридиния) (WO 95/08348 и WO 96/29094). Реакция цианилирования может быть проведена в относительно мягких условиях, позволяющих избежать гидролиза чувствительных к щело-8 015964 чам сахаридов. Этот синтез позволяет осуществлять прямое связывание с белком-носителем. В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборнан,паранитробензойная кислота, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC (1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимид) или TSTU (тетрафторборат O-(N-сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилурония). Связи через линкерную группу могут быть образованы с использованием известной методики, например методики, описанной в US 4882317 и US 4695624. Один тип связи осуществляется посредством восстановительного аминирования сахарида, связывания полученной аминогруппы с одним концом адипиновокислотной линкерной группы (ЕР 0477508, Porro et al., 1985, Mol. Immunol., 22: 907, ЕР 0208375) и затем связывания белка с другим концом адипиновокислотной линкерной группы. Другие линкеры включают В-пропионамидо (WO 00/10599), нитрофенилэтиламин (Gever et al., 1979, Med. Microbiol. Immunol., 165: 171), галогеноацилгалогениды (US 4057685), гликозидные связи (US 4673574; US 4761283;US 4808700), 6-аминокапроновую кислоту (US 4459286), ADH (дигидразид адипиновой кислоты) (US 4965338), C4-С 12-группировки (US 4663160) и т.д. В качестве альтернативы применению линкера можно использовать прямую связь. Прямые связи с белком могут включать окисление сахарида с последующим восстановительным аминированием белка, как описано, например, в US 4761283 и US 4356170, или прямую реакцию с использованием CDAP. После конъюгирования свободные и конъюгированные сахариды могут быть разделены. Существует много подходящих способов для этого разделения, включая гидрофобную хроматографию, тангенциальную ультрафильтрацию, диафильтрацию и т.д. (см. также Lei et al., 2000, Dev. Biol. (Basel), 103: 259;WO 00/38711; US 6146902). В одном из воплощений, если вакцина содержит заданный сахарид как в свободной, так и конъюгированной формах, то неконъюгированная форма составляет не более 20 мас.% от общего количества этого сахарида в композиции в целом (например, не более 15%, не более 10%, не более 5%, не более 2%, не более 1%). Количество сахарида, которое способно придать защиту хозяину (эффективное количество), может быть определено специалистом. В одном из воплощений каждая доза будет содержать 0,1-100 мкг сахарида, в другом воплощении каждая доза будет содержать 0,1-50 мкг, в другом воплощении каждая доза будет содержать 0,1-10 мкг, в еще одном другом воплощении каждая доза будет содержать от 1 до 5 мкг. Адъюванты. Вакцины по изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый эксципиент, например подходящий адъювант. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гидрат окиси алюминия или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соль кальция, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, или могут представлять собой катионные или анионные производные сахаридов, полифосфазены,биоразлагаемые микросферы, монофосфориллипид A (MPL), производные липида А (например, пониженной токсичности), 3-О-деацилированный MPL, quil А, сапонин, QS21, токол (ЕР 0382271), неполный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, MI), адъювант 65 Merck (Merck and Company, Inc.,Rahway, NJ), AS-2 (Smith-Kline Beecham, Philadelphia, PA), CpG-содержащие олигонуклеотиды, биоадгезивы и мукоадгезивы, микрочастицы, липосомы, композиции полиоксиэтиленовых простых эфиров,композиции полиоксиэтиленовых сложных эфиров, мурамилпептиды или имидазохинолоновые соединения (например, имиквимод (imiquamod) и его гомологи). Человеческие иммуномодуляторы, подходящие для применения в качестве адъювантов в данном изобретении, включают цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и т.д.), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). В одном из воплощений изобретения адъювантная композиция препаратов индуцирует иммунный ответ преимущественно ТН 1-типа. Высокие уровни цитокинов ТН 1-типа (например, IFN-, TNF, IL-2 иIL-12) способствуют индукции клеточно-опосредованных иммунных ответов на введенный D-антиген. В одном из воплощений, где наблюдается преимущественно ответ ТН 1-типа, уровень цитокинов ТН 1-типа будет увеличиваться в большей степени, чем уровень цитокинов ТН 2-типа. Уровни этих цитокинов можно легко оценить с использованием стандартных анализов. Для обзора семейств цитокинов см. Mosmannand Coffman, 1989, Ann. Rev. Immunol., 7:145. Таким образом, подходящие адъювантные системы, которые стимулируют преимущественно ТН 1 ответ, включают производные липида А (например, пониженной токсичности), монофосфориллипид A(MPL) или его производное, в частности 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL), и комбинацию монофосфориллипида А, возможно 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А вместе с солью алюминия. Улучшенная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию QS21 и 3D-MPL, которая описана в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 погашен холестерином, которая описана в WO 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция, содержащая QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии типа "масло-в-воде", описана в WO 95/17210. Вакцина может дополнительно содержать сапонин, который может представлять собой QS21. Композиция также может содержать эмульсию типа "масло-в-воде" и токоферол (WO-9 015964 95/17210). Неметилированные CpG-содержащие олигонуклеотиды (WO 96/02555) также являются избирательными индукторами ТН 1-ответа и подходят для применения в настоящем изобретении. Вакцины по изобретению также могут содержать комбинации одного или более адъювантов по изобретению, идентифицированных выше. Любой адъювант по изобретению может быть адсорбирован компонентом IPV по изобретению или комбинирован с ним. Если упоминается гидрат окиси алюминия или фосфат алюминия, то ссылка делается на все адъюванты гидрата окиси алюминия и/или фосфата алюминия, как описано в Hem and White, Pharm. Biotechnol., 1995, 6: 249-276. В одном из воплощений фосфат алюминия также может быть упомянут как гидроксифосфат алюминия. В другом воплощении фосфат алюминия имеет отрицательный заряд при рН 7,4. Обычно изоэлектрическая точка (pI) фосфата алюминия составляет 5-7 или 6-7 либо приблизительно или точно 5. В другом воплощении фосфат алюминия характеризуется молярным соотношением фосфата к алюминию,равным 0,3-0,9, или 0,3-0,6, или 0,8-0,9. В одном из воплощений гидрат окиси алюминия имеет положительный заряд при рН 7,4. Обычно pI гидрата окиси алюминия составляет 8-11, 9-11, 10-11 либо приблизительно или точно 11. Обычно общее содержание алюминия составляет 200-1000, 300-900, 400-800, 500-700 мкг либо приблизительно или точно 630 мкг Al3+ на 0,5-мл дозу. Это может относиться ко всему гидрату окиси алюминия или всему фосфату алюминия. Альтернативно, содержание Al3+ может быть приведено для смеси гидрата окиси алюминия и фосфата алюминия в следующем соотношении фосфат алюминия:гидрат окиси алюминия: 1:8-8:1, 1:4-4:1, 3:8-8:3, 1:2-2:1 или 1:1. В одном из воплощений используют соотношение фосфат алюминия:гидрат окиси алюминия, равное 12:1-4:1, 11:1-5:1, 10:1-6:1, 9:1-7:1 или 8:1. Несмотря на то что перед смешиванием для образования комбинированной вакцины большая часть алюминия представлена в виде предварительно адсорбированных на нем антигенов, некоторое количество алюминия может быть добавлено в свободной форме в процессе получения комбинированной вакцины по изобретению, например, до стадии корректировки рН, описанной в данном изобретении. Обычно содержание свободного алюминия на 0,5-мл дозу может составлять 0-300, 50-250, 75-200, 100-150 мкг либо приблизительно или точно 115 мкг Al3+. Свободный Al3+ весь может представлять собой Al(OH)3 или AlPO4, либо смесь Al(OH)3 и AlPO4 в следующем соотношении (мас.:мас. Al3+:Al3+): 1:1-1:6, 1:1,11:5, 1:1,2-1:4, 1:1,3-1:3, 1:1,4-1:2, например 23/92 или 69/46, или 6:1-1:1, 5:1-1,1:1, 4:1-1,2:1, 3:1-1,3:1, 2:11,4:1, например 46/69 или 92/23. Альтернативно, некоторые компоненты вакцин по изобретению могут специально не адсорбироваться на адъюванте, в частности солях алюминия.IPV может быть не адсорбирован или адсорбирован на Al(OH)3 или смеси Al(OH)3 и AlPO4. DT может быть адсорбирован на Al(OH)3 или AlPO4, TT может быть адсорбирован на Al(OH)3 или AlPO4, Pw может быть адсорбирован на AlPO4 или смешан с ним, PRN может быть адсорбирован на Al(OH)3, FHA может быть адсорбирован на Al(OH)3, PT может быть адсорбирован на Al(OH)3, HB может быть адсорбирован на AlPO4, Hib может быть адсорбирован на AlPO4 или не адсорбирован, Men ACWY может быть адсорбирован на Al(OH)3 или AlPO4 либо не адсорбирован, компонент MenB может быть адсорбирован на Al(OH)3 или AlPO4 либо не адсорбирован, Vi может быть адсорбирован на Al(OH)3 или AlPO4 либо не адсорбирован, НерА может быть адсорбирован на Al(OH)3 или AlPO4. Антигены, которые предварительно адсорбированы на соли алюминия, можно предварительно адсорбировать по отдельности перед их смешиванием. В другом воплощении смесь антигенов может быть предварительно адсорбирована перед смешиванием с другими адъювантами. В одном из воплощенийIPV может быть адсорбирован отдельно или в виде смеси IPV типов 1, 2 и 3 либо когда он уже смешан с адсорбированными D- и Т-компонентами. Термин "адсорбированный антиген" подразумевает, например, более 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% адсорбированного (антигена). Значение терминов "фосфат алюминия" и "гидрат окиси алюминия", как они использованы в данном описании, включает все формы гидрата окиси алюминия или фосфата алюминия, которые подходят для применения в качестве адъювантов для вакцин. Например, фосфат алюминия может представлять собой осадок нерастворимого фосфата алюминия (аморфного, полукристаллического или кристаллического), который возможно, но не исключительно, может быть получен в результате смешивания растворимых солей алюминия и солей фосфорной кислоты. "Гидрат окиси алюминия" может представлять собой осадок нерастворимого (аморфного, полукристаллического или кристаллического) гидрата окиси алюминия, который возможно, но не исключительно, может быть получен в результате нейтрализации раствора солей алюминия. Особенно подходят различные формы гелей гидрата окиси алюминия и фосфата алюминия, доступные из коммерческих источников, например Alhydrogel (гидрат окиси алюминия,3%-ная суспензия в воде) и Adjuphos (фосфат алюминия, 2%-ная суспензия в физиологическом растворе), поставляемые Brenntag Biosector (Дания). Неиммунологические компоненты вакцин по изобретению. Обычно вакцины по изобретению, в дополнение к упомянутым выше антигенным и адъювантным- 10015964 компонентам, будут содержать один или более "фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов", которые включают любой эксципиент, который сам по себе не индуцирует продукции антител,вредных для индивидуума, получающего данную композицию. Подходящими эксципиентами обычно являются большие, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, сахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимеры аминокислот, сополимеры аминокислот, сахароза(Paoletti et al., 2001, Vaccine, 19: 2118), трегалоза (WO 00/56365), лактоза и липидные агрегаты (такие как капельки масла или липосомы). Такие носители общеизвестны средним специалистам в данной области техники. Вакцины также могут содержать разбавители, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и т.д. Кроме того, могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, поддерживающие рН вещества, и тому подобное. Стерильный апирогенный,забуференный фосфатом физиологический раствор представляет собой типичный носитель. Исчерпывающее обсуждение фармацевтически приемлемых эксципиентов приведено в ссылке Gennaro, 2000,Remington: Science and Practice of Pharmacy, 20-е изд., ISBN: 0683306472. Композиции по изобретению могут быть лиофилизированными или в водной форме, т.е. растворы или суспензии. Жидкие композиции этого типа позволяют вводить композиции непосредственно из их упакованной формы без необходимости разведения их в водной среде и, таким образом, являются идеальными для инъекции. Композиции могут быть представлены во флаконах или они могут быть представлены в легко заполняемых шприцах. Шприцы могут поставляться с иглами или без них. Шприц будет содержать однократную дозу композиции, в то время как флакон может содержать одну дозу или множество доз (например, две дозы). В одном из воплощений доза предназначена для человека. В другом воплощении доза предназначена для взрослого человека, подростка, ребенка ясельного возраста, младенца или ребенка в возрасте до года и может быть введена путем инъекции. Жидкие вакцины по изобретению также подходят для разведения в них других вакцин из лиофилизированной формы. В том случае, когда вакцина должна быть использована для такого экстемпорального разведения, в данном изобретении предложен набор, который может содержать два флакона или может содержать один готовый заполненный шприц и один флакон, при этом содержимое шприца используется для разведения содержимого флакона перед инъекцией. Вакцины по изобретению могут быть упакованы в стандартную лекарственную форму или в многодозовую лекарственную форму (например, две дозы). Что касается многодозовых лекарственных форм,то флаконы предпочтительнее предварительно заполненных шприцов. Эффективные объемы дозировок могут быть установлены рутинно, однако типичная человеческая доза композиции для инъекции имеет объем 0,5 мл. В одном из воплощений вакцины по изобретению имеют рН от 6,0 до 8,0, в другом воплощении вакцины по изобретению имеют рН от 6,3 до 6,9, например 6,60,2. Вакцины могут быть забуферены при этом рН. Стабильный рН можно поддерживать путем использования буфера. Если композиция содержит соль гидрата окиси алюминия, то можно использовать гистидиновый буфер (WO 03/009869). Композиция должна быть стерильной и/или апирогенной. Композиции по изобретению могут быть изотоничными в отношении людей. Вакцины по изобретению могут содержать антимикробное средство, в частности, когда они упакованы в многодозовом формате. Тиомерсал должен быть исключен, поскольку это приводит к потере эффективности компонента IPV. Можно использовать другие антимикробные средства, такие как 2 феноксиэтанол или парабены (метил-, этил-, пропилпарабены). Предпочтительно, чтобы любой консервант присутствовал в низких концентрациях. Консервант может быть добавлен экзогенным путем и/или может представлять собой компонент нефасованных антигенов, которые смешивают для получения композиции (например, присутствовать в качестве консерванта в коклюшных антигенах). В одном из воплощений вакцины по изобретению не содержат тиомерсала или, по существу, не содержат тиомерсала. Под "не содержат тиомерсала" или "по существу, не содержат тиомерсала" понимают, что тиомерсал присутствует в конечной композиции в количестве, не достаточном для оказания отрицательного влияния на эффективность компонента IPV. Например, если тиомерсал используют в процессе очистки Pw или поверхностного антигена вируса гепатита В, то он должен быть, по существу, удален перед смешиванием с IPV. Содержание тиомерсала в конечной вакцине должно составлять менее 0,025, 0,02, 0,01 или 0,001 мкг/мкг белка, например 0 мкг/мкг белка. В одном из воплощений тиомерсал не добавляют и не используют в очистке какого-либо компонента. См., например, ЕР 1307473 для гепатита В и смотри выше для способов с Pw, когда инактивация достигается в отсутствие тиомерсала. Вакцины по изобретению могут содержать детергент, например Твин (полисорбат), такой как Твин 80. Обычно детергенты присутствуют в низких концентрациях, например менее 0,01%. Вакцины по изобретению могут содержать соли натрия (например, хлорид натрия) для придания тоничности. Композиция может содержать хлорид натрия. В одном из воплощений концентрация хлорида натрия в композиции по изобретению находится в диапазоне от 0,1 до 100 мг/мл (например, 1-50, 2-20,5-15 мг/мл), а в другом воплощении концентрация хлорида натрия составляет 102 мг/мл NaCl, например примерно 9 мг/мл.- 11015964 Обычно вакцины по изобретению будут содержать буфер. Типичным является фосфатный или гистидиновый буфер. Вакцины по изобретению могут содержать свободные фосфатные ионы в растворе (например, путем использования фосфатного буфера) с целью противодействия адсорбции антигенов. Концентрация свободных фосфатных ионов в композиции по изобретению находится в одном из воплощений в диапазоне от 0,1 до 10,0 мМ, или в другом воплощении от 1 до 5 мМ, или в другом воплощении составляет примерно 2,5 мМ. Свойства вакцин по изобретению. В одном из воплощений вакцины по изобретению изготавливают в виде вакцины для введения invivo хозяину таким образом, чтобы индивидуальные компоненты композиции были приготовлены так,чтобы их иммуногенность, по существу, не ослаблялась под действием других индивидуальных компонентов композиции. Под "по существу, не ослаблялась" понимают, что после иммунизации получают титр антител против каждого компонента, который составляет более 60, 70, 80 или 90% или 95-100% от титра, полученного при введении каждого антигена по отдельности. Таким образом, в предпочтительных воплощениях (по существу) никакого вредного эффекта по отношению к другим компонентам (в контексте эффективности защиты) в комбинации не наблюдается по сравнению с их введением по отдельности. Вакцинные композиции. В одном из воплощений вакцины по изобретению изготовлены в виде вакцин для введения in vivo хозяину таким образом, что они дают титр антител, превосходящий показатель серопротекции для каждого антигенного компонента для приемлемого процента субъектов-людей. Этот тест важен для оценки эффективности вакцины во всей популяции. Антигены с ассоциированным титром антител, выше которого хозяина рассматривают как имеющего сероконверсию против антигена, общеизвестны, и такие титры опубликованы организациями, такими как ВОЗ. В одном из воплощений более 80% статистически значимой выборки субъектов имеют сероконверсию, в другом воплощении более 90% статистически значимой выборки субъектов имеют сероконверсию, в другом воплощении более 93% статистически значимой выборки субъектов имеют сероконверсию и в еще одном воплощении 96-100% статистически значимой выборки субъектов имеют сероконверсию. Количество антигена в каждой вакцинной дозе выбрано как количество, которое индуцирует иммунопротективный ответ без существенных неблагоприятных побочных эффектов типичных вакцин. Такое количество будет варьировать в зависимости от того, какие конкретные иммуногены используются. Обычно ожидается, что каждая доза будет содержать 1-1000 мкг суммарного иммуногена, или 1-100 мкг,или 1-40 мкг, или 1-5 мкг. Оптимальное количество для конкретной вакцины может быть установлено в результате исследований с наблюдением титров антител и других ответов у субъектов. Курс первичной вакцинации может включать 2-3 дозы вакцины, введенные с интервалом от одного до двух месяцев, например, согласно рекомендациям ВОЗ для DTP-иммунизации (т.е. в первый год жизни). Бустерные дозы могут следовать на второй и/или последующий год(ы) жизни. Эффективность полиовируса, измеренная с использованием теста серонейтрализации на крысах. Для задач данного изобретения анализ для IPV количественной оценки иммуногенности IPVсодержащих вакцин по изобретению должен быть проведен с использованием однократной дозы вакцины и должен быть выполнен путем определения соотношения среднего геометрического титра (GMT) тестируемой вакцины к GMT эталонной вакцины, и данные представляют в виде относительного ответа(RR) или относительной эффективности (RP). Эталонный GMT может представлять собой GMT, полученный с использованием любой IPV-вакцины, содержащей 40-8-32 D-антигенных единиц IPV типов 12-3 соответственно, и может представлять собой GMT, полученный с использованием известной вакцины Poliorix. Обычно RP-тест осуществляют следующим образом. Эффективность полиовируса типов 1, 2 и 3 определяют на крысах по серонейтрализации. Группы по 10 здоровых крыс (Sprague-Dawley (OFA) или любой предварительно оговоренной линии) подвергают внутримышечной инокуляции разведениями (1/1,25; 1/3,125; 1/7,81) тестируемых образцов или эталонным веществом в забуференном фосфатом физиологическом растворе. При необходимости диапазон разведений может быть расширен до четырех разведений путем инокуляции неразбавленной вакцины и трех ранее упомянутых разведений. Десять крыс, инокулированных разбавителем,используют в качестве отрицательных контролей. Крыс наблюдают один раз в неделю для определения какой-либо аномальной реакции. Через 20-22 суток после инокуляции каждое животное подвергали глубокой анестезии и собирали кровь и сыворотку для анализа с использованием теста серонейтрализации. Для проведения теста серонейтрализации образцы сыворотки инактивируют путем инкубации при 56 С в течение 30 мин в водяной бане. Готовят серии из трех разведений образцов сыворотки, одну для каждого полиотипа, в микропланшетах, используя соответствующую среду для разведения. Планшеты хранят при +4 С. Для этих трех типов полиовируса в разведения сывороток добавляют заранее заданное количество вируса (30-300 CCID50 (средняя инфицирующая доза для клеточной культуры. Три вирусные суспензии разбавляют, принимая во внимание соответствующие им титры. Конечное разведение называют "рабочим разведением". Каждое рабочее разведение добавляют в соответствующие микропланшеты. Затем- 12015964 планшеты герметично закрывают и инкубируют при 371 С в течение 16 ч. Затем добавляют клетки Нер-2, и микропланшеты инкубируют при 371 С в течение 7 суток. Цитопатогенный эффект (СРЕ) вируса определяют, используя инвертированный микроскоп, после окрашивания Кумасси голубым. Присутствие антиполиомиелитных антител ингибирует рост вируса и появление соответствующего СРЕ. Титры антиполиовирусных антител (типа 1, 2 и 3) соответствуют обратной величине последнего разведения, при котором отсутствует какой-либо СРЕ. В каждой группе регистрируют животных с нейтрализующими антителами и для разного типа полиовируса определяют титр антител из каждого образца сыворотки. Титр нейтрализующих антител выражают в виде log2 обратной величины наибольшего разведения образца сыворотки, при котором полностью ингибируется цитопатический эффект полиовируса на клетках Нер-2. Также определяют средний геометрический титр (GMT) для каждого разведения и каждого типа вируса в каждой группе крыс. Упаковка вакцин по изобретению. Вакцины по изобретению могут быть упакованы в контейнер различных типов, например во флаконы, в шприцы и т.д. Многодозовый флакон обычно будет иметь пластиковый канал с возможностью к повторному герметичному закрыванию, через который можно ввести стерильную иглу для извлечения дозы вакцины и который герметично закрывается, как только игла удалена. Вакцина может поставляться в разных контейнерах (например, 2 или 3). Содержимое контейнеров можно смешивать непосредственно перед введением хозяину в виде однократной инъекции или можно вводить последовательно в разные участки тела. Доза вакцины или каждая вакцина, если набор вводят последовательно (в двух или более контейнерах), обычно будет составлять 0,5 мл. В одном из воплощений этого аспекта изобретения предложен набор, содержащий две поливалентные вакцины для придания хозяину защиты против заболевания, вызываемого полиовирусом, Bordetellapertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae и, возможно, одним или более чем одним из вируса гепатита В, Haemophilus influenzae типа В, Neisseria meningitidis типа А, Neisseria meningitidis типа С,Neisseria meningitidis типа W, Neisseria meningitidis типа Y, Neisseria meningitidis типа В, Salmonella typhi,вируса гепатита А или малярии. Набор включает в себя первый контейнер, содержащий:(1) (а) инактивированный полиовирус (IPV) по изобретению,(b) дифтерийный анатоксин (DT или D) (см. выше),(c) столбнячный анатоксин (ТТ или Т) (см. выше),(d) убитую цельноклеточную Bordetella pertussis (Pw) либо два или более бесклеточных коклюшных компонентов (Ра) (см. выше),(e) возможно, поверхностный антиген вируса гепатита В (НерВ или HB) (см. выше),(f) возможно, конъюгат белка-носителя и капсульного сахарида Н. influenzae типа В (Hib) (см. выше),(g) возможно, один из двух или оба конъюгата белка-носителя и капсульного сахарида N. meningitidis типа А (MenA) или N. meningitidis типа С (MenC) (см. выше), и второй контейнер, содержащий:(2 А) (а) конъюгаты белка-носителя и капсульного сахарида N. meningitidis типа А (MenA), N. meningitidis типа С (MenC), N. meningitidis типа W (MenW) и/или N. meningitidis типа Y (MenY) (см. выше для сахаридных комбинаций по изобретению различных Men), и(3) (а) возможно, поверхностный антиген вируса гепатита В,(b) возможно, конъюгат белка-носителя и Vi сахарида Salmonella typhi. И в том и другом случае контейнеры могут дополнительно содержать антиген(ы) НерА, и/или антиген(ы) MenB, и/или RTS,S, и/или антиген(ы) Streptococcus pneumonia. В каждом случае в обоих контейнерах будет присутствовать один и тот же антиген. В одном из воплощений первый контейнер в дополнение к компонентам a)-d) также имеет e), f), g),e)+f), e)+g), f)+g) или e)+f)+g). В одном из воплощений вакцина из первого контейнера может быть жидкой, а вакцина из второго контейнера может быть либо жидкой, либо лиофилизированной (например, в присутствии известного стабилизирующего эксципиента, такого как сахароза или трегалоза). Контейнеры из набора могут быть упакованы по отдельности или, возможно, упакованы вместе. В одном из воплощений предложен набор с перечнем инструкций по введению вакцин в двух или более контейнерах. В одном из воплощений, если контейнер в наборе содержит некоторый сахаридный конъюгат, то такой же конъюгат не будет представлен в других контейнерах набора.- 13015964 Авторы изобретения полагают, что в наборе, предложенном выше, могут присутствовать предпочтительно различные антигены к иммунной системе хозяина оптимальным образом. Данный набор может обеспечивать практикующего врача оптимальным способом иммунизации хозяина с одним или более чем одним из следующих преимуществ: защитной эффективностью для всех антигенов, минимальной реактогенностью, минимальной интерференцией, обусловленной супрессией носителя, минимальной адъювант/антигенной интерференцией или минимальной антиген/антигенной интерференцией. Таким образом, этих целей можно достичь минимальным количеством (двумя) введений, возможно, осуществляемых за один визит к врачу. В одном из воплощений вакцины из первого и второго контейнеров вводят последовательно в разные участки (как описано ниже под заголовком "Введение вакцин по изобретению"), и в альтернативном воплощении авторы изобретения предполагают, что содержимое первого и второго контейнеров можно смешивать (возможно, экстемпорально) перед введением в виде единой вакцины. Получение вакцин по изобретению. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения вакцинной композиции,включающий стадию смешивания компонентов вакцины вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом. В одном из воплощений настоящего изобретения предложена вакцина, как она описана в данном изобретении, для применения в виде лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией полиовирусом и, возможно, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, вирусом гепатита В, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis типа A, Neisseria meningitidis типа С, Neisseria meningitidis типа W, Neisseria meningitidis типа Y, Salmonella typhi или вирусом гепатита А. В другом воплощении изобретения предложено применение вакцин по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией полиовирусом и, возможно, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, вирусом гепатита В, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis типа А, Neisseria meningitidis типа С, Neisseria meningitidis типа W, Neisseria meningitidis типа Y, Salmonella typhi или вирусом гепатита А. В дополнение к этому также предложен способ иммунизации человека-хозяина против заболевания,вызываемого полиовирусом и, возможно, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, вирусом гепатита В, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis типа A, Neisseria meningitidis типа С, Neisseria meningitidis типа W, Neisseria meningitidis типа Y, Salmonella typhi или вирусом гепатита А,включающий введение хозяину иммунопротективной дозы вакцины по изобретению. Количество антигена в каждой вакцинной дозе выбрано как количество, которое индуцирует иммунопротективный ответ без существенных, неблагоприятных побочных эффектов типичных вакцин. Такое количество будет варьировать в зависимости от того, какой конкретный иммуноген применяют и в каком виде он присутствует. В одном из воплощений каждая доза будет содержать 0,1-100 мкг сахарида, в другом воплощении каждая доза будет содержать 0,1-50 мкг, в другом воплощении каждая доза будет содержать 0,1-10 мкг, в еще одном другом воплощении каждая доза будет содержать от 1 до 5 мкг сахарида. В одном из воплощений содержание белковых антигенов в вакцине будет находиться в диапазоне 1100 мкг, в другом воплощении содержание белковых антигенов в вакцинах будет находиться в диапазоне 5-50 мкг, в другом воплощении содержание белковых антигенов в вакцинах будет находиться в диапазоне 5-25 мкг. Получение вакцин в целом описано в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds PowellM.F.Newman M.J.) (1995) Plenum Press, New York). Инкапсулирование в липосомы описано Fullerton,патент США 4235877. Конъюгирование белков с макромолекулами описано, например, Likhite, патент США 4372945 и Armor и др., патент США 4474757. Применение Quil А описано в Dalsgaard et al., 1977,Acta Vet. Scand., 18: 349. 3D-MPL доступен от Ribi Immunochem (USA) и описан в заявке на патент Великобритании 2220211 и в патенте США 4912094. QS21 описан в патенте США 5057540. В другом воплощении изобретения предложена поливалентная вакцина, содержащая инактивированный полиовирус (IPV) по изобретению и, возможно, убитую цельноклеточную Bordetella pertussis(Pw), столбнячный анатоксин (ТТ), дифтерийный анатоксин (DT), конъюгат белка-носителя и капсульного сахарида Н. influenzae типа В (Hib - возможно конъюгирован с ТТ, DT или CRM197), где количество конъюгата на 0,5-мл дозу нефасованной вакцины составляет 1-8 мкг, а иммуногенность конъюгата эквивалентна или усилена по сравнению с подобными композициями, содержащими более высокие количества конъюгата. Возможно, что также может быть включен поверхностный антиген вируса гепатита В. В одном из воплощений количество конъюгата на 0,5-мл дозу нефасованной вакцины составляет менее 10 мкг (сахарида в конъюгате), в другом воплощении количество конъюгата равно 1-7, в другом воплощении количество конъюгата равно 2-6 мкг или в другом воплощении примерно 2,5, 3, 4 или 5 мкг. Следует понимать, что некоторые компоненты, например компоненты DTPw, могут быть комбинированы отдельно перед добавлением адсорбированного HBsAg или других компонентов. Также предложен способ получения вакцин по изобретению, включающий стадию смешивания IPV- 14015964 типа 1, IPV типа 2 и/или IPV типа 3 с фармацевтически приемлемым эксципиентом. В типичном способе получения нефасованной вакцины по изобретению с дополнительными антигенами компоненты IPV будут добавлены к смеси компонентов D и Т, т.е. компоненты DT смешивают с компонентами IPV. Такой порядок смешивания позволяет регулировать ионную силу и/или рН композиции (например, рН меньше 7) перед добавлением компонентов Ра или Pw. Обычно первым добавляют НВ, предварительно адсорбированный на AlPO4, если он включен в композицию, затем добавляют DT, предварительно адсорбированный на Al(OH)3 или AlPO4, затем добавляют ТТ, предварительно адсорбированный на Al(OH)3 илиAlPO4, затем добавляют IPV, возможно, предварительно адсорбированный на Al(OH)3, перед корректировкой рН, например, до рН 5,9-7,2, или рН 6-7, или рН 6,2-6,8, или рН 6,4-6,6, и затем добавляют Pw,предварительно адсорбированный на AlPO4. Возможно, антигены Hib, Vi, MenA, MenC, MenW, MenY,MenB и/или НерА могут быть добавлены в любой момент этого процесса. В одном из воплощений антигены Hib, Vi, MenA, MenC, MenW, MenY, MenB и/или НерА добавляют перед корректировкой рН. В одном из воплощений один или более антигенов по изобретению адсорбируют на фосфате алюминия или гидрате окиси алюминия либо смеси их обоих. В другом воплощении антигены по изобретению смешивают с фармацевтически приемлемым эксципиентом и/или адъювантом(ами). В одном из воплощений вакцинная композиция по изобретению может быть изготовлена в следующем порядке: добавляют предварительно адсорбированный HBsAg, затем предварительно адсорбированный дифтерийный анатоксин, затем предварительно адсорбированный столбнячный анатоксин иIPV, далее корректируют рН до приблизительно 6,5 перед добавлением предварительно адсорбированного Pw. В другом воплощении вакцинная композиция по изобретению может быть изготовлена в следующем порядке: добавляют предварительно адсорбированный столбнячный анатоксин, затем IPV, затем предварительно адсорбированный HBsAg, затем предварительно адсорбированный дифтерийный анатоксин, далее корректируют рН до приблизительно 6,5 перед добавлением предварительно адсорбированного Pw. В общем случае комбинированные вакцинные композиции, соответствующие любому аспекту изобретения, могут быть изготовлены следующим образом: компоненты IPV, DTPw, HepB, MenA, MenC,MenW, MenY, MenB, Vi, вируса гепатита А или другие компоненты предварительно адсорбируют на подходящем адъюванте, особенно гидрате окиси алюминия или фосфате алюминия либо смеси их обоих. Через некоторое время, в течение которого осуществляется полная и стабильная адсорбция соответствующих компонентов, разные компоненты комбинируют в соответствующих условиях. Конъюгат(ы)Hib, Vi, MenA, MenC, MenW и/или MenY могут быть или могут не быть адсорбированы на адъювантной соли алюминия перед смешиванием с DTPw-вакциной. В одном из воплощений вакцины по изобретению изготавливают при температуре от 15 до 30 С(например, от 19 до 27 С или при 234 С). Введение вакцин по изобретению. Согласно изобретению предложен способ повышения иммунного ответа у млекопитающего, включающий стадию введения эффективного количества вакцины по изобретению. Вакцины могут быть введены с профилактической целью (т.е. для предупреждения инфекции). Иммунный ответ предпочтительно обеспечивает защиту и предпочтительно вовлекает антитела. Данный способ может увеличивать бустерный ответ. После первоначальной вакцинации субъекты могут получить одну или несколько бустерных (последующих) иммунизаций, вводимых с адекватными промежутками. Режим введения доз может соответствовать однократной схеме или многократной схеме. В схеме первичной иммунизации и/или в схеме бустерной иммунизации можно использовать многократные дозы. После схемы введения первичной дозы, которую можно осуществлять в первый год жизни, может следовать схема введения бустерных доз. Подходящие временные промежутки между примирующими дозами (например, в интервале 4-16 недель) и между примированием и бустерным введением могут быть определены обычным образом. В одном из воплощений млекопитающее представляет собой человека. Если вакцина предназначена для профилактического применения, то таким человеком предпочтительно является ребенок (например,ребенок ясельного возраста или младенец) или подросток; если вакцина предназначена для терапевтического применения, то таким человеком предпочтительно является взрослый человек. Вакцину, предназначенную для детей, можно также вводить взрослым людям, например, для оценки безопасности, дозировки, иммуногенности и т.д. Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для защиты или лечения млекопитающего, чувствительного к инфекции, посредством введения указанной вакцины непосредственно пациенту. Прямая доставка может быть выполнена посредством парентерального введения(внутримышечно, внутрибрюшинно, интрадермально, подкожно, внутривенно или в интерстициальное пространство ткани); или посредством ректального, перорального, влагалищного, местного, трансдермального, интраназального введения, введения в глаз, ухо, легкое или другого введения через слизистые. В одном из воплощений введение осуществляют посредством внутримышечной инъекции в бедро или плечо. Инъекцию можно делать с помощью иглы (например, подкожной иглы), однако в качестве аль- 15015964 тернативы можно использовать безыгольную инъекцию. Типичная внутримышечная доза составляет 0,5 мл. Бактериальные инфекции поражают различные участки тела, и поэтому композиции по изобретению могут быть изготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть изготовлены в виде инъекцируемых препаратов, либо в виде жидких растворов или суспензий. Композиция может быть изготовлена для легочного введения, например, в виде ингалятора с использованием тонкоизмельченного порошка или спрея. Композиция может быть изготовлена в виде суппозитория или пессария. Композиция может быть изготовлена для назального, ушного или глазного введения, например, в виде спрея,капель, геля или порошка (см., например, AlmeidaAlpar, 1996, J. Drug Targeting, 3: 455; Bergquist et al.,1998, APMIS, 106: 800). Имеется сообщение об успешном интраназальном введении DTP-вакцин (Ryan etal., 1999, Infect. Immun., 67: 6270; Nagai et al., 2001, Vaccine, 19: 4824). В одном из воплощений вакцины первого и второго (и третьего, где это приемлемо) контейнеров вводят совместно в разные участки тела,а в альтернативном воплощении авторы полагают, что содержимое первого и второго контейнеров можно смешивать (возможно, экстемпорально) перед введением в виде единой вакцины. Изобретение может быть использовано для того, чтобы вызвать системный иммунитет и/или мукозальный иммунитет. Один из способов контроля эффективности терапевтического лечения включает мониторинг бактериальной инфекции после введения композиции по изобретению. Один из способов контроля эффективности профилактического лечения включает мониторинг иммунных ответов против антигенов после введения композиции. Иммуногенность композиций по изобретению может быть определена путем введения их тестируемым субъектам (например, детям в возрасте 12-16 месяцев или животным моделям - WO 01/30390) и затем определения стандартных иммунологических параметров. Эти иммунные ответы обычно будут определять примерно через 4 недели после введения композиции и сравнивать с величинами, определенными до введения композиции. Общеизвестно, что для оценки эффективности DTPвакцин скорее используются стандартные животные модели, модели in vitro и корреляты защиты, чем оценка реальной защитной эффективности на пациентах. Авторы изобретения предполагают, что термины "содержащий", "содержат" и "содержит" в данном описании подразумевают возможную замену терминами "состоящий из", "состоят из" и "состоит из" соответственно в каждом случае. Это не меняет обычного значения этих терминов и предназначено только для обоснования такой замены, а не для того, чтобы сделать их эквивалентными по значению. Все цитированные ссылки и публикации включены в данное описание посредством ссылки. Примеры Примеры приведены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения. Пример 1. Тесты на низкодозовых IPV-композициях. Перед получением всех композиций из примера 1 антигены адсорбируют путем добавления соли алюминия, за исключением IPV, который добавляют без адсорбции. В приведенных ниже таблицах представлен способ адсорбции для D, Т, Pw и HBsAg. Таблица 1 Способ проведения адсорбции дифтерийного анатоксина Таблица 2 Способ проведения адсорбции столбнячного анатоксина Таблица 3 Способ проведения адсорбции Pw Таблица 4 Способ проведения адсорбции HBsAg- 18015964 Тестировали несколько разных композиций: комбинацию дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, коклюшного цельноклеточного антигена и поверхностного антигена вируса гепатита В, DTPwSF-HB, в качестве эталона (DTPwSF означает, что эта композиция не содержит тиомерсала), изготовленную согласно способу получения 1 (табл. 5); продукт Glaxo SmithKline Biologicals S.A. Poliorix (IPV независимый, неадсорбированный) в качестве неадсорбированного эталона в стандартной дозе, изготовленный согласно способу получения 2(табл. 5); комбинацию дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, коклюшного цельноклеточного антигена, поверхностного антигена вируса гепатита В и инактивированного полиовируса, DTPwSF-HBIPV, с добавлением IPV перед Pw, изготовленную согласно способу получения 3 (табл. 5); комбинацию дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, коклюшного цельноклеточного антигена, поверхностного антигена вируса гепатита В и инактивированного полиовируса, DTPwSF-HBIPV, с добавлением IPV сразу после адсорбированного Т. Этот способ добавления способствует адсорбции IPV на Al(OH)3. Эту вакцину изготавливают согласно способу получения 4 (табл. 5). Плацебо содержит только соли алюминия, IPV и буферы для других антигенов. Поскольку IPV является единственным антигеном в этом плацебо, нет никакой конкуренции в отношении адсорбции. Следовательно, IPV полностью адсорбируется. Эту вакцину изготавливают согласно способу получения 5(табл. 5). Вакцины, изготовленные согласно способу получения 2, 3, 4 и 5, готовили в интервале доз IPV от 12,5 до 100% стандартной дозы IPV 40/8/32 МЕ/0,5 мл. Таблица 5 Способ получения из расчета на 0,5-мл дозу Для композиции по способу получения 1: HBsAg, D и Т адсорбируют по отдельности на AlPO4,AlPO4 и Al(OH)3 соответственно. Эти три антигена последовательно добавляют к суспензии, содержащей воду, NaCl и свободный AlPO4. Смесь перемешивают в течение 60-75 мин. Затем рН корректируют до 6,5, после чего добавляют адсорбированный Pw. Для композиции по способу получения 3: эти три адсорбированных антигена последовательно добавляют к суспензии, содержащей воду, NaCl и свободный AlPO4. Смесь перемешивают в течение 60-75 мин, после чего добавляют IPV. Величину рН корректируют до 6,5, после чего добавляют Pw-антигены. Для композиции по способу получения 4: Т-антиген адсорбируют на Al(OH)3. Предварительно адсорбированный Т-антиген добавляют к суспензии, содержащей воду и NaCl, затем IPV типов 1, 2 и 3. Смесь перемешивают в течение 60-75 мин, после чего добавляют свободный AlPO4. Затем добавляют предварительно адсорбированный HBsAg, после чего предварительно адсорбированный D-антиген, и смесь далее перемешивают в течение дополнительных 60-75 мин. Величину рН корректируют до 6,5,после чего добавляют Pw-антигены. В конечном счете выбирают способ получения 3 вследствие легкости выполнения, поскольку этот протокол включает только одну стадию перемешивания. В данном способе получения вакцины тиомерсал не используют и не добавляют к конечному вакцинному продукту. В приведенной ниже таблице представлен состав композиций для 0,5-мл дозы.- 21015964 Таблица 6 Состав композиций из расчета на 0,5-мл дозу Содержание в D-антигенных единицах означает величины, запланированные для разведения концентрированной нефасованной формы инактивированного полиовируса в процессе получения. Определение эффективности полиовируса на крысах по серонейтрализации. Эффективность вакцины определяли согласно тесту серонейтрализации после внутримышечной инокуляции крыс (Sprague-Dawley (OFA) или любой предварительно оговоренной линии). Группы из 10 наивных здоровых крыс инокулировали внутримышечно (0,5 мл) разведениями тестируемых образцов,эталонным веществом в забуференном фосфатом физиологическом растворе или разбавителем (забуференным фосфатом физиологическим раствором). Десять крыс, инокулированных разбавителем, использовали в качестве отрицательных контролей. Через 20-22 суток после инокуляции (период иммунизации) каждое животное подвергали глубокой анестезии, после чего отбирали кровь посредством пункции в сердце. Образцы крови центрифугировали (при приблизительно 800 g) и сыворотки анализировали. Тест серонейтрализации. Сыворотки инактивировали путем инкубации при 56 С в течение 30 мин. Готовили три серии разведений сывороток, одну для каждого полиотипа, в микропланшетах, используя соответствующую среду для разведения. Для трех типов полиовируса добавляли предварительно определенное количество вируса в разведения сывороток. Эти три вирусные суспензии разбавляли, принимая во внимание их соответствующие титры. Конечное разведение называется "рабочее разведение". Каждое рабочее разведение добавляли в соответствующие микропланшеты. Затем планшеты герметично закрывали и инкубировали при 371 С в течение 16 ч. Затем добавляли клетки Нер-2 и микропланшеты инкубировали при 371 С в течение 7 суток. Цитопатогенный эффект (СРЕ) вируса считывали, используя инвертированный микроскоп, после окрашивания Кумасси голубым. Присутствие антиполиомиелитных антител ингибирует рост вируса и возникновение соответствующего СРЕ. Титры антиполиовирусных антител (тип 1, 2 и 3) соответствуют обратной величине последнего разведения без какого-либо СРЕ. В каждой группе регистрируют животных с нейтрализующими антителами и для разного типа полиовируса определяют титр антител из каждого образца сыворотки. Титр нейтрализующих антител выражают в виде log2 обратной величины наибольшего разведения образца сыворотки, при котором полностью ингибируется цитопатический эффект полиовируса на клетках Нер-2. Затем определяют средний геометрический титр (GMT) для разведения и типа вируса в каждой группе крыс. Кроме того, для каждого типа вируса разведение вакцины и затем количество D-антигена, которое индуцировало нейтрализующие антитела у 50% крыс (ED50), рассчитывали с использованием пробитанализа. ED50 выражали в D-антигенных единицах. Для количественного определения эффективности относительно эффективности эталонной вакцины(обычно Poliorix, но, возможно, и DTPaHBIPV-вакцины, такой как Pediarix) измеряли относительную эффективность (RP), определенную как соотношение двух эквивалентных дозовых ответов при многодозовом тестировании. В этом подходе эффективность тестируемой вакцины рассчитывают с использованием метода "параллельных линий" (parallel line analysis), который описан в Finney, 1978 (StatisticalMethod in Biological Assay, Charles GriffinCompany Ltd., London, 1978). Определение эффективности полиовируса типов 1, 2 и 3 с помощью ELISA. Определение эффективности полиовируса с помощью ELISA осуществляют в одну или две стадии в зависимости от того, выполняется ли измерение на нефасованном неадсорбированном IPV относительно вакцин, изготовленных в виде препаратов, соответственно:- 22015964 1) десорбция конечной адсорбированной вакцины (для измерения D-антигенных единиц в изготовленных в виде препаратов вакцинах - не требуется для измерения в неадсорбированном нефасованном антигене IPV); 2) проведение ELISA-теста для количественного определения содержания D-антигена в десорбированной и неадсорбированной вакцине и/или нефасованной форме полиовируса. Стадия десорбции. После центрифугирования в течение 10 мин подвергаемой тестированию адсорбированной вакцины осуществляют три последовательные десорбции, добавляя к осадку десорбирующий фосфатный буфер,перемешивая и инкубируя при комнатной температуре. Периоды первой и второй десорбции составляют около 2 ч, при этом период инкубации для третьей экстракции составляет одну ночь при комнатной температуре. Сборы с этих трех экстракций объединяют и разбавляют фосфатно-буферным раствором (PBS) без Ca и Mg, содержащим бычий сывороточный альбумин (БСА) и Твин 20. Три полиовирусных антигена количественно определяют с помощью ELISA, как описано ниже. Количественное определение D-антигена с помощью ELISA. Титрационные микропланшеты покрывают специфическими кроличьими IgG против полиовируса(типа 1, 2 или 3), разбавленными карбонатным/бикарбонатным буфером (рН 9,6), и инкубируют в течение ночи при 4 С. После промывки добавляют насыщенный раствор (забуференный фосфатом физиологический раствор без Ca и Mg + 1% БСА). Контроли (PBS) и последовательные разведения образцов вакцины и неадсорбированного внутрилабораторного стандарта добавляют в двух повторностях. Внутрилабораторная трехвалентная стандартная композиция содержит откалиброванные антигены типа 1, 2 и 3. Калибровочным веществом является биологический эталон Европейской фармакопеи (European Pharmacopoeia Biological reference (EPBRP. На всех следующих стадиях титрационные микропланшеты инкубируют в течение 1 ч 30 мин при 37 С и промывают. Добавляют кроличьи IgG против полиовируса (типа 1, 2 или 3), конъюгированные с пероксидазой, разбавленные фосфатным буфером (без Ca и Mg + Твин 20), содержащим БСА. Добавляют раствор субстрата, содержащий тетраметилбензидин, растворенный в диметилсульфоксиде (ДМСО) и разбавленный в ацетатном буфере, содержащем 0,003% H2O2, с последующей 15-30-минутной инкубацией в темноте. Затем добавляют блокирующий раствор, содержащий H2SO4. Оптическую плотность (O.D.) в каждой лунке считывают в пределах одного часа, используя фотометр, установленный на 450 нм, при сравнении с 620 нм. Концентрацию D-антигена в тестируемых образцах рассчитывают из стандартной кривой, полученной путем построения зависимости величин O.D. от концентраций стандартного антигена. Как дополнение к определению эффективности с помощью ELISA любой неадсорбированный антиген IPV может быть определен с использованием способа определения полноты (адсорбции). Полнота адсорбции несвязанного с адъювантом полиовируса типа 1, 2 и 3, определяемая с помощью ELISA. Осуществляют два последовательных центрифугирования. Затем супернатант собирают и тестируют в неразведенном виде в двух повторностях на микропланшетах с помощью ELISA. Титрационные микропланшеты покрывают специфическими кроличьими IgG против полиовируса (типа 1, 2 или 3), разбавленными карбонатным/бикарбонатным буфером (рН 9,6), и инкубируют в течение ночи при 4 С. После промывки добавляют насыщенный раствор (забуференный фосфатом физиологический раствор безCa и Mg + 1 % БСА). Контрольные образцы (PBS), супернатант и неадсорбированный стандарт собственного производства добавляют в двух повторах. На всех следующих стадиях титрационные микропланшеты инкубируют в течение 1 ч 30 мин при 37 С и промывают. Добавляют кроличьи антиполиовирусные (типа 1, 2 или 3) IgG, конъюгированные с пероксидазой, разбавленные фосфатным буфером (без Ca и Mg + Твин 20), содержащим БСА. Добавляют раствор субстрата, содержащий тетраметилбензидин, растворенный в диметилсульфоксиде (ДМСО) и разбавленный в ацетатном буфере, содержащем 0,003% Н 2 О 2, с последующей 15-30-минутной инкубацией в темноте. Затем добавляют блокирующий раствор, содержащий H2SO4. Оптическую плотность (O.D.) в каждой лунке считывают в пределах одного часа, используя фотометр, установленный на 450 нм, при сравнении с 620 нм. Полноту считают положительной (антиген в супернатанте), если средняя OD образца превышает средние величины OD контрольных образцов + 3 стандартных отклонения и если средняя OD образца выше 0,1. В случае положительной полноты содержание антигена измеряют с помощью ELISA-способа, как описано на второй стадии определения эффективности полиовируса типа 1, 2 и 3 с помощью ELISA. Способ определения международной единицы мутности (IOU). Концентрация клеток (в IOU) может быть определена с использованием либо визуального IRPO(международный эталонный препарат мутности) стандартного раствора, либо путем измерения поглощения при 660 нм. Затем определяют мутность суспензии единичного штамма, применяя уравнение для "заданной мутности", как изложено ниже: где АО = заданная мутность (assigned opacity), LO = мутность живого сбора (live harvest opacity),KO = мутность убитого сбора (killed harvest opacity) и СО = мутность концентрата. Результаты Определение эффективности полиовируса на крысах по серонейтрализации в стандартной дозе 40:8:32. Проводили эксперименты с целью определения эффективности IPV типов 1, 2 и 3. Результаты показаны в табл. 8 ниже (в представленном документе 40:8:32 D-антигенных единиц IPV типов 1, 2 и 3 соответственно эквивалентны дозе 100% IPV). Таблица 8 Эффективность IPV типов 1, 2 и 3 в трех разных вакцинных композициях Композиция DTPwSF-HB-IPV (100% IPV) демонстрирует эффективности IPV, превышающие эффективность эталонной Poliorix и аналогичные или превышающие эффективность эталонной DTPaHBIPV. Оценка эффективности IPV с уменьшенными дозами IPV. Эффективность измеряют в соответствии с описанными выше методами in vitro и in vivo. Измеренную с помощью ELISA эффективность уменьшенной дозы IPV для обеих композиций способов получения 3 и 4 исследовали in vitro и сравнивали с эффективностью эталонной DTPaIPVHB, как показано в табл. 9. Для способа получения 3 тестировали две партии для каждой композиции. Процент выхода (recovery) рассчитывали относительно содержания антигенов в нефасованной форме IPV для каждой композиции (например, 40/8/32 для композиции, содержащей 100% IPV; 20/8/16 для композиции, содержащей 50% IPV; 10/4/8 для композиции, содержащей 25% IPV; 5/2/4 для композиции, содержащей 12,5% IPV). Таблица 9 В табл. 9 показано, что полнота адсорбции одинакова для всех доз IPV. Тип 1 и тип 3 сильно десорбированы (17-74%), в то время как тип 2 остается хорошо адсорбированным. Эти три типа являются хорошо адсорбированными для плацебо-композиции для всех доз IPV. Адсорбция аналогична таковой для эталонной DTPaIPVHB-вакцины. Наблюдается вариабельность значений IPV-полноты из-за того, что достоверность метода количественного определения полноты не подтверждена ни для DTPwHB IPV композиций, ни для низких концентраций IPV (40/8/32 D-антигенных единиц/0,5 мл).- 24015964 Относительную эффективность (выраженную в сравнении с эталонной вакциной Poliorix) уменьшенной дозы IPV для обеих композиций, изготовленных согласно способам получения 3 и 4, исследовали in vivo в сравнении с эталонными композициями, как показано на фиг. 1 и 2. Для способа получения 3 тестировали по две партии для каждой композиции. На фиг. 1 показано, что эффективность IPV в DTPwSF-HB-IPV с 100% IPV слегка превышает эффективность IPV в DTPaHBIPV. Можно видеть, что эффективность IPV в DTPwSF-HB-IPV 50% из композиции способа получения 3 аналогична DTPaHBIPV 100%. Эффективность IPV для DTPwSF-HB-IPV 25%, изготовленной согласно способу получения 3, слегка ниже таковой для Poliorix. Также было обнаружено, что 12,5% дозы IPV было недостаточно для получения хорошей эффективности IPV. На фиг. 2 показано, что эффективность IPV одинакова для композиции способа получения 3 и композиции способа получения 4. Также показано, что имеется тенденция к лучшей эффективности для плацебо, чем для DTPwSF-HB-IPV. Следовательно, эти данные подтверждают, что уменьшенной дозы IPV достаточно для получения хорошей эффективности in vivo. Пример 2. Возможность использования вакцин по изобретению без тиомерсала. Тест эффективности защиты (PET, preservative efficacy test) позволяет продемонстрировать антимикробную активность тестируемой вакцины. Тест заключается в контрольном заражении вакцинной композицией, на конечной стадии ее получения в контейнере, с использованием предусмотренного инокулята подходящих микроорганизмов,хранении инокулируемой композиции при заданной температуре,извлечении образцов из контейнера через конкретные интервалы времени и подсчете микроорганизмов во взятых образцах. Процедура РЕТ-тестирования описана в Европейской фармакопее (ЕР) (5.1.3) и USP (Фармакопея США) (51). Согласно этим руководствам антимикробную активность оценивают путем сравнения уменьшения количества жизнеспособных микроорганизмов с использованием критериев, приведенных в следующей далее табл. 7 Таблица 7 Критерии ЕР и USP Пример 3. Влияние Hib-компонента на эффективность IPV и стабильность IPV во времени. Относительную эффективность IPV измеряли, как описано в примере 1, для определения возможного влияния Hib-компонента на эффективность IPV и для оценки стабильности IPV во времени при разных дозах IPV. Исследовали вакцины DTPwHBIPV (40-8-32), DTPwHBIPV с повторно разведенным Hib,которую хранили в течение 8 месяцев, DTPwHBIPV (20-4-16), DTPwHBIPV (20-4-16) с повторно разведенным Hib, которую хранили в течение 8 месяцев, DTPwHBIPV (20-4-16), которую хранили в течение 8 месяцев, DTPwHBIPV (10-2-8) и DTPwHBIPV (10-2-8) с повторно разведенным Hib, которую хранили в течение 8 месяцев. RP-величины измеряли относительно DTPaIPVHB (Pediarix) (фиг. 3 а или Poliorix(фиг. 3 б. Было обнаружено, что Hib-компонент не оказывает никакого воздействия на эффективностьIPV. Было обнаружено, что относительная эффективность IPV сохранялась через 8 месяцев (фиг. 3). Пример 4. Влияние соотношения AlPO4/Al(OH)3 на внешний вид, адсорбцию D и Т и эффективность IPV. Готовили композиции с изменением состава алюминиевого компонента. Композиция DTPwSF-HB-IPV обычно содержит 630 мкг алюминия: 560 мкг Al3+ в виде AlPO4, 70 мкг Al3+ в виде Al(OH)3. Соли алюминия используют для адсорбции D, T, Pw и HBsAg. В процессе получения композиции добавляют 115 мкг Al3+ в виде свободного AlPO4. Готовили композиции со следующими соотношениями свободного Al3+. Визуальное наблюдение показало, что вплоть до соотношения 69/46 получают приемлемую агрегацию. Композиции готовили с использованием того же способа получения и диапазона доз для IPV, составляющего от 0 до 100% от обычной дозы IPV. Процент адсорбции D- и Т-анатоксинов измеряли с помощью ELISA. Стабильность адсорбции отслеживали после обработки в течение 7 суток при 37 С. Результаты представлены в табл. 12 и 14. Таблица 12 Процент десорбции D-анатоксина в DTPwHB-IPV в диапазоне доз IPV Отслеживали адсорбцию IPV. Стабильность адсорбции отслеживали после обработки в течение 21 суток при 25 С. Увеличение содержания Al(OH)3 в композициях делает возможным улучшение адсорбции для D, Т и IPV. Лучшее адсорбционное соотношение получали для соотношения Al(OH)3/AlPO4), равного 46/69. При этом соотношении адсорбция Т и D является полной на момент времени Т 0; десорбция после ускоренного исследования стабильности, т.е. через 7 суток при 37 С, обнаруживает менее 20% десорбции для D, менее 30% для Т; адсорбируется IPV каждого типа. Через 21 сутки при 25 С имеет место десорбция IPV типа 3. Композиции с соотношением 46/69 тестировали in vivo и сравнивали с вакциной Tetravac, Poliorix и Нет никаких значительных различий (ED50) между композициями DTPwHB-IPV. DTPaHBIPV, Tetravac и Poliorix дают похожие результаты и хуже, чем композиции DTPw-HB-IPV (за исключением IPV типа 2, для которого все композиции эквивалентны). Пример 5. Клиническая оценка исследуемой DTPw-HBV-IPV/Hib вакцины с уменьшенными дозировками IPV. Исследование осуществимости, фаза II, запланировано для оценки иммуногенности, реактогенности и безопасности трех разных композиций исследуемой DTPw-HBV-IPV/Hib вакцины от GSK Biologicals в сравнении с коммерческими DTPw-HBV/Hib и IPV вакцинами, вводимыми параллельно. Показание/популяции. Первичная иммунизация здоровых младенцев в первую неделю жизни против дифтерии, столбняка,коклюша, гепатита В, полиомиелита и заболеваний Haemophilus influenzae типа b. Исследуемые группы:DTPw-HBV/Hib + IPV вакцины Общие первичные задачи. Общие первичные задачи будут оцениваться последовательно: т.е. вторые и третьи задачи будут оцениваться только тогда, когда на предшествующие задачи будет получен ответ. Продемонстрировать не меньшую эффективность DTPw-HBV-IPV (стандартная доза)/Hib вакцины относительно IPV-вакцины, вводимой совместно с DTPw-HBV/Hib вакциной, в контексте антительного ответа к трем типам полиовируса через один месяц после курса первичной вакцинации. Задача не меньшей эффективности будет достигнута, если верхний предел стандартизированного- 27015964 асимптотического 95% Cl (доверительный интервал) по разнице между группами (DTPw-HBV/Hib + IPV минус DTPw-HBV-IPV (стандартная доза)/Hib) в контексте показателей серопротекции для каждого из трех типов полиовируса составит не более 10%. Продемонстрировать не меньшую эффективность DTPw-HBV-IPV (49% стандартной дозы)/Hib вакцины относительно IPV-вакцины, вводимой совместно с DTPw-HBV/Hib вакциной, в контексте антительного ответа к трем типам полиовируса через один месяц после курса первичной вакцинации. Задача не меньшей эффективности будет достигнута, если верхний предел стандартизированного асимптотического 95% Cl по разнице между группами (DTPw-HBV/Hib + IPV минус DTPw-HBV-IPV(49% стандартной дозы)/Hib) в контексте показателей серопротекции для каждого из трех типов полиовируса составит не более 10%. Продемонстрировать не меньшую эффективность DTPw-HBV-IPV (26% стандартной дозы)/Hib вакцины относительно IPV-вакцины, вводимой совместно с DTPw-HBV/Hib вакциной, в контексте антительного ответа к трем типам полиовируса через один месяц после курса первичной вакцинации. Задача не меньшей эффективности будет достигнута, если верхний предел стандартизированного асимптотического 95% Cl по разнице между группами (DTPw-HBV/Hib + IPV минус DTPw-HBV-IPV(26% стандартной дозы)/Hib) в контексте показателей серопротекции для каждого из трех типов полиовируса составит не более 10%. Вторичные задачи. Иммуногенность. Оценить иммуногенность DTPw-HBV-IPV/Hib вакцины-кандидата в контексте ответа на все вакцинные антигены по сравнению с DTPw-HBV/Hib и IPV вакцинами, вводимыми совместно. Реактогенность. Оценить реактогенность и безопасность исследуемых вакцин в контексте предусмотренных симптомов, не предусмотренных симптомов и серьезных неблагоприятных событий. Схема вакцинации. Схема первичной вакцинации тремя дозами в возрасте 6, 10 и 14 недель. Все субъекты получают дозу вируса гепатита В при рождении. Страна. Филиппины. Забор образцов крови до и после вакцинации 3. Вакцинные композиции. Таблица 16 Вакцинные композиции Предварительная адсорбция антигенов. В DTPw-HBV-IPV-композиции объединены дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, три штамма Bordetella pertussis, очищенный основной поверхностный антиген (HBsAg) вируса гепатита В(HBV) и инактивированный полиовирус (IPV). Эти антигены, за исключением IPV, сначала предварительно адсорбировали на соли алюминия, после чего смешивали с солью алюминия, забуференным хлоридом натрия и водой для инъекций. Адсорбция дифтерийного анатоксина. Очищенный дифтерийный концентрат адсорбировали на фосфате алюминия в соотношении 15 Lf дифтерийного анатоксина/0,15 мг Al3+. Эти два компонента перемешивали в течение 15-45 мин при комнатной температуре. рН корректировали до рН 5,10,1 с последующим перемешиванием в течение 15-45 мин. Смесь хранили в течение одной недели при 37 С. После перемешивания в течение 15-45 мин при комнатной температуре рН корректировали до рН 6,10,1. Адсорбированный концентрат хранили при+2 - +8 С в течение по меньшей мере 7 суток перед конечной стадией получения DTPw-HB-IPV вакцины. На фиг. 1 ниже разъяснен технологический процесс адсорбции предварительно адсорбированной дифтерийной нефасованной формы.