Антитело к tgf-бета и его применение

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента Дэвис Джулиан, Дикинсон Крейг Дуэйн, Хуан Лихуа, Джонс Брайан Эдвард, Маркис Дэвид Мэттью,Роулинсон Скотт Уилльям, Тан Ин,Вайлланкур Питер Эдвард, Уоткинс Джеффри Дин (US) Изобретение относится к области иммунологии и медицины. Предлагается антитело к TGF-бета или его антигенсвязывающий фрагмент, композиция на основе этого антитела или его фрагмента,а также применение их в качестве лекарственного средства для лечения фиброзного заболевания,хронического заболевания почек и рака. Антитела или их фрагменты включают специфические участки, за счет которых они более специфично и/или селективно связываются со зрелым TGFбета 1 по сравнению со зрелым TGF-бета 2 и/или зрелым TGF-бета 3, и нейтрализуют зрелый TGFбета 1.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) 016038 Область изобретения Изобретение, в общем, относится к композициям для связывания с белками TGF-бета 1. В частности, изобретение предлагает очищенные композиции для связывания и сопутствующие реактивы, пригодные, например для диагностики, лечения и профилактики расстройств, связанных с клеточной пролиферацией, аутоиммунных/воспалительных, сердечно-сосудистых и фиброзных расстройств, а также для оценки влияния экзогенных смесей на экспрессию нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей таких белков. Предпосылки изобретения Первый член суперсемейства секретируемых полипептидных факторов трансформирующего фактора роста-бета (TGF-бета), TGF-бета 1, был обнаружен приблизительно двадцать лет тому назад. Впоследствии семейство значительно расширилось и на сегодняшний день включает свыше тридцати членов среди позвоночных и около дюжины структурно и функционально родственных белков у беспозвоночных, например червей и мух (см., например, AttisanoLee-Hoeflich, 2001 Gen. Biol. 2, обзор 30101;Moustakas, et al., 2001 J. Cell Sci. 114:4359; Wrana, 2000 Cell 100:189). Члены семейства TGF-бета управляют многими клеточными функциями, и их активность является критической для регулирования многочисленных процессов, связанных с развитием и гомеостазом. Эксперименты показали, что консервативный сигнальный путь TGF-бета существует у позвоночных животных, червей и мух. Один из членов данного семейства, TGF-бета 1 принимает участие в разнообразных клеточных процессах, например, таких как пролиферация и дифференциация клеток, миграция, дифференциация,апоптоз, эмбриональное развитие, образование внеклеточного матрикса, развитие кости, заживление ран,гемопоэз, а также иммунные и воспалительные реакции (см., например, Roberts,Sporn 1990 PeptideRev. Biochem 67:753). Кроме того, доклинические и клинические данные указывают на то, что TGF-бета 1 вносит основной вклад в отложение белка в матриксе при интерстициальном фиброзе и принимает участие в инициации и прогрессировании целого ряда сопутствующих фиброзному заболеванию состояний, включая фиброз почек, который обычно встречается при всех формах хронического заболевания почек (ХЗП). Степень фиброза почек положительно коррелирует с прогрессом до хронической почечной недостаточности(ХПН, также известной как терминальная стадия заболевания почек (ESRD и может приводить к смерти, потребовать хронического диализа или трансплантации почки.TGF-бета связан с ХПН посредством комплексных и разнообразных феноменов, которые воздействуют на большинство почечных клеток (Bottinger, 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13:2600). Эти явления, в конечном счете, приводят как к тубулоинтерстициальному фиброзу, так и к гломерулосклерозу, который ведет к снижению функции нефрона и, в конечном счете, к хронической почечной недостаточности. Из трех изоформ TGF-бета, по-видимому, TGF-бета 1 является доминирующим в опосредовании прогресса хронического почечного заболевания, не только в качестве наиболее доминантно экспрессирующейся изоформы, но также и потому, что TGF-бета 2 и, по-видимому, TGF-бета 3 опосредуют свое воздействие посредством регулирования вверх экспрессии TGF-бета 1 (Yu, 2003, Kid. Int. 64, 844). Таким образом,существует потребность в модуляции экспрессии TGF-бета 1, чтобы воспрепятствовать вредному действию таких расстройств, как ХЗП. Соответственно, создание новых композиций для связывания TGF-бета 1 удовлетворяет существующую в уровне техники потребность, предлагая композиции, которые пригодны для диагностики,профилактики и лечения фиброзных расстройств, таких как хроническое заболевание почек. Краткое описание изобретения Изобретение частично основано на создании композиций для связывания с улучшенными свойствами, которые специфично и/или селективно связываются со зрелым TGF-бета 1 по сравнению со зрелым TGF-бета 2 и/или зрелым TGF-бета 3 и которые нейтрализуют зрелый TGF-бета 1. Такие композиции для связывания включают:a) первую часть, содержащую как минимум одну из следующих последовательностей:b) вторую часть, содержащую как минимум одну из следующих последовательностей:-1 016038 композиция для связывания также может содержать:a) указанную первую часть, которая включает как минимум две указанные последовательности;b) указанную первую часть, которая включает три указанные последовательности;c) указанную вторую часть, которая включает как минимум две указанные последовательности;d) указанную вторую часть, которая включает три указанные последовательности;e) указанную первую часть, которая включает как минимум две указанные последовательности и указанную вторую часть, которая включает три указанные последовательности;f) указанную вторую часть, которая включает как минимум две указанные последовательности, и указанную первую часть, которая включает три указанные последовательности; илиg) указанную первую часть, которая включает три указанные последовательности, и указанную вторую часть, которая включает три указанные последовательности; где сайт связывания композиции для связывания: обладает специфичной иммунореактивностю в отношении полипептида человеческого TGFбета 1; обладает специфичной иммунореактивностю в отношении полипептида мышиного TGF-бета 1; направлен против очищенного или продуцированного рекомбинантным способом человеческого белкаTGF-бета 1 или его фрагмента; расположен в моноклональном антителе, Fab, Fv, scFv, F(ab)2 или вариабельном участке антитела; содержит как минимум одну, две или три консервативные замены или находится в каркасе человеческого или гуманизированного антитела; где композиция для связывания: представляет собой молекулу антитела; представляет собой молекулу моноклонального антитела; представляет собой молекулу димерного антитела; представляет собой молекулу тримерного антитела; представляет собой молекулу тетрамерного антитела; представляет собой молекулу миниантитела; представляет собой моноклональную антисыворотку; содержит поддающуюся обнаружению метку; является лиофилизированной, стерильной; или находится в буферизованной композиции; где композиция для связывания представляет собой моноклональное антитело с улучшенными свойствами. Описание фигуры На фиг. 1 показан эффект действия антител по изобретению на уровень белков в моче у крыс. Крысам вводили в/в 2,5 мг/кг mAB -Thy1.1, затем через 30 мин вводили 1 мг герцетина (контрольное mAB),mAB 21D1 и mAB DM4. Вторую дозу герцетина, mAB 21D1 и mAB DM4, вводили на день 7. Животных умерщвляли на день 14. mAB 21D1, также как и mAB DM4, понижали уровни белка в моче (снижение протеиноурии) дозозависимо. Подробное описание предпочтительных вариантовI. Общая информация. Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными композициями, способами и методами, описанными в данном описании, поскольку такие композиции, способы и методы могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном описании, предназначена для описания только конкретных вариантов и не должна ограничивать объем притязаний изобретения, который определен формулой изобретения. В данном описании, в том числе и в формуле изобретения, единственные формы слов включают,например, соответствующие множественные формы, если только в контексте четко не указано иное. Таким образом, например, ссылка на организм включает, например, один или больше различных организмов, ссылка на клетку включает, например, одну или больше таких клеток, и ссылки на способ включают, например, ссылку на равноценные стадии и способы, известные среднему специалисту в данной области, и т.п. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании,имеют такое же значение, как их обычно понимает средний специалист в области, к которой относится данное изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или равноценные описанным в данном описании, могут использоваться, чтобы выполнять или проверять изобретение, ниже описаны пригодные материалы и методы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, обсуждаемые в данном описании, приведены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в данном описании не должно интерпретироваться как допущение, что данное изобретение имеет возможность быть предвиденным из-за более ранних раскрытий. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном описании, включены путем ссылки во всей их полноте для указаний, в отношении которых они процитированы (как четко обусловливает контекст), включая все рисунки, диаграммы, изображения, графики, гиперссылки и другую форму кода, исполняемого программойбраузером."Композиция для связывания" представляет собой молекулярный объект со сродством селективного и/или конкретного связывания как минимум с одним другим молекулярным объектом или партнером по связыванию. Обычно ассоциация будет состоять в естественном физиологически уместном взаимодействии, ковалентном или нековалентном, и может включать компоненты полипротеинового комплекса, в том числе, не ограничиваясь ими, соединения-носители, партнеров для димеризации или мультимеризации. Композиция для связывания может быть получена естественным образом (например, путем выделе-2 016038 ния и/или очистки) или синтетическим путем, в целом или в ее части. Обычно композиция для связывания содержит как минимум один участок, такой как, в качестве не ограничивающего примера, область поверхности, форма (например, впадина, трещина, щель или выступ), молекулярное строение или пространственная конфигурация, который специфично и/или селективно соответствует, связывается с или является комплементарной к конкретной пространственной и/или полярной организации области или участка на партнере связывания. Таким образом, например, если композиция для связывания находится достаточно близко к потенциальному партнеру связывания, композиция для связывания и партнер специфично и/или селективно связываются друг с другом. Неограничивающие примеры композиции для связывания, спаренной с партнером по связыванию, включают антиген-антитело и гаптенсвязывающий сайт. Неограничивающие примеры композиций для связывания антитела включают: антитела, димерные антитела, тримерные антитела, тетрамерные антитела, миниантитела, Fab фрагменты (в том числе, например, димерные или тримерные Fab), фрагменты Fv, фрагменты scFv, фрагменты F(ab)2 и т.п. (см.,например, HudsonSouriau 2003 Nature Medicine 9:129-34 относительно неограничивающих примеров композиций для связывания антитела, охватываемых изобретением). Композиция для связывания в форме моноклонального антитела является моноклональной в том смысле, что она получена из популяции в существенной мере однородных антител (т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются в существенной мере идентичными (например, они могут происходить из клона единого типа клеток. Однако это не подразумевается как ограничивающее их конкретным происхождением. Такое антитело может легко быть получено в клетках, которые обычно не производят антител, таких как клеткиCHO, NSO или COS. Кроме того, такое антитело может быть продуцировано в других видах клеток, особенно клетках млекопитающих и даже растительных клетках, путем получения средствами генной инженерии таких клеток, которые экспрессируют и собирают легкие и тяжелые цепи полипептида, образующие продукт-антитело. Кроме того, такие цепи могут быть химически синтезированы, но, поскольку они были бы специфичными для данной антигенной детерминанты, все еще составляют моноклональное антитело в пределах концепции, в которой данный термин используется в данном описании. Таким образом, в данном описании, термин моноклональное антитело предназначен для обозначения в большей степени специфичности и чистоты молекул антитела, чем механизма, который используется для получения указанных антител."Сайт связывания" представляет собой конкретный участок, область или конфигурацию молекулярного объекта, который принимает участие в конкретном и/или селективном связывании с другим молекулярным объектом. Неограничивающий пример сайта связывания представляет собой последовательность смежных аминокислот, содержащую определяющий комплементарность участок (CDR) антитела. В одном варианте сайт связывания по изобретению содержит последовательность формулы, показанной в табл. 1. В другом неограничивающем варианте сайт связывания содержит комбинацию последовательностей табл. 1. Другой неограничивающий пример представляет собой сайт связывания, образованный на основе трехмерной конфигурации и пространственной организации аминокислотных последовательностей, содержащих шесть CDR петель тяжелых и легких вариабельных цепей в RIM восьмицепочечного бета бочкообразного фрагмента Fab (см., например, ChothiaLesk, 1987 J. Mol. Biol. 196:901-17). Раскрытый CDR по изобретению может быть объединен/встроен в каркасную область или молекулярную структуру, например, как это делается при пересадке CDR. В одном варианте структура,несущая CDR по изобретению, в целом будет представлять собой последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или его существенной части, где CDR размещен в положении, соответствующем CDR природных VH и VL вариабельных участков антитела, кодируемых перегруппированными генами иммуноглобулина. Структура и расположение вариабельных участков иммуноглобулина могут быть определены ссылкой (Kabat, et al., 1987 Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Ed. US Department ofHealth and Human Services, и ее обновленными версиями, на сегодняшний день доступными по Интернетадресу (http://immuno.b-me.nwu.edu). CDR в общем являются такими, как определено Kabat, но также могут соответствовать определениям Chothia (J. Mol. Biol. 196:901-17) и/или MacCallum (J. Mol. Biol. 262:732-45). Специалисты в данной области могут шаблонно определить, какие остатки составляют конкретный CDR, представленный аминокислотной последовательностью вариабельного участка, в которую он встроен. Дополнительно, в ходе пересадки CDR могут быть пересажены остатки петли, определенныеChothia, смежно с Kabat VH CDR1. В одном варианте последовательности CDR по изобретению могут быть введены в репертуар вариабельных участков, где отсутствуют участки CDR, с использованием технологии рекомбинации ДНК. Например, Marks et al. (1992 BioTechnology 10:779-83) описывают способы создания репертуаров переменных участков антитела, в которых консенсусные праймеры направлены на или являются смежными с 5'-концом области вариабельного участка, используются в соединении с консенсусными праймерами к третьему участку структуры генов человеческих VH для обеспечения репертуара вариабельных участковVH, где отсутствует CDR3. Marks et al. дополнительно описывают, как данный репертуар может быть объединен с CDR3 конкретного антитела (такого, как описано в данном описании). Используя аналогичные методы, последовательности CDR3 по данному изобретению, могут быть перетасованы с репер-3 016038 туарами участков VH или VL, где отсутствует CDR3, и перетасованные полные участки VH или VL объединены с родственным участком VL или VH, чтобы обеспечить компоненты композиции для специфического связывания по изобретению. Альтернативно, последовательности CDR3 могут быть объединены с другими CDR по изобретению с использованием подобной стратегии. Далее репертуар может быть показан в системе подходящего хозяина, такой как система фагового дисплея WO92/01047, таким образом, что могут быть выбраны пригодные конкретные компоненты для связывания. Композиция для связывания: комплекс TGF-бета 1. Термин композиция для связывания:комплекс TGF-бета 1 в данном описании обозначает комплекс композиции для связывания и белка TGF-бета 1, образованный путем специфичного и/или селективного связывания композиции для связывания с белком TGF-бета 1. В предпочтительном вариантеTGF-бета 1 в тексте данного описания означает зрелый белок TGF-бета 1 приматов. В более предпочтительном варианте TGF-бета 1 в тексте данного описания означает зрелый человеческий белок TGFбета 1 (см., например, NCBI номер доступа P01137, который описывает аминокислотную последовательность прекурсора человеческого трансформирующего фактора роста-бета 1 (TGF-бета 1) и его зрелую часть). В каждом случае TGF-бета 1 в тексте данного описания означает TGF-бета 1 в его зрелой, биологически активной форме [(TGF-бета 1 высвобождается из клеток в виде неактивного латентного комплекса, содержащего гомодимер TGF-бета 1 в виде нековалентного комплекса с двумя просегментами, с которым часто связан один из нескольких TGF латентных бета-1 белков связывания (см., например, Annes, et al., 2003 J. Cell Science 116:217-24; Miyazono, et al., 1993 Growth Factors 8:11-22; Munger, et al., 1997Kidney Int. 51:1376-82; OkluHesketh 2000 Biochem. J. 352:601-10). Данный латентный комплекс TGFбета 1 представляет собой важную гарантию против неумышленной активации и может стабилизировать и связывать латентный TGF-бета 1 с внеклеточным матриксом, если он изолирован (Taipale, et al. 1998 Adv. Cancer Res. 75:87-134). Внеклеточный матрикс, таким образом, действует как резервуар, из которого TGF-бета 1 может быть легко активирован без необходимости его синтеза клеткой. СекрецияTGF-бета 1 в форме латентного комплекса обуславливает существование регулируемого процесса активации, который, вероятнее всего, опосредуется через активность протеаз, которые предпочтительно разлагают просегменты TGF-бета 1 и, таким образом, высвобождают чрезвычайно стабильную, зрелую, активную димерную форму TGF-бета 1.)]. Специфическое связывание композиции для связывания означает, что композиция для связывания содержит сайт связывания, который распознает участок TGF-бета 1, обычно в его природной, активной конформации. Например, антитела, направленные против TGF-бета 1 и распознающие эпитоп TGF-бета 1, способны образовывать комплекс композиция для связывания:комплекс TGF-бета 1 путем конкретного связывания. Обычно образование белкового комплекса композиция для связывания:комплекс TGFбета 1 позволяет измерить TGF-бета 1 в биологическом образце, например, в смеси с другими белками и биологическими веществами. Эпитоп композиции для связывания по изобретению может быть определен с использованием методов, описанных в данном описании или в уровне техники (см., например, G.Tribbick 2002 Journal of Immunological Methods 267:27-35; WoodsHamuro 2001 Journal of Cellular Biochemistry Supplement 37:89-98) и/или с помощью конкурентного связывания, как описано в данном описании. В предпочтительном варианте эпитоп композиции для связывания по изобретению включает аминокислотные остатки YYVGRK [SEQ ID NO: 136] SEQ ID NO: 1; в другом варианте эпитоп композиций для связывания по изобретению включает аминокислотные остатки YYVGRK [SEQ ID NO: 136] SEQ IDNO: 1 и YSKV SEQ ID NO:1; в дополнительном варианте эпитоп композиции для связывания по изобретению включает как минимум 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остатков (смежных или не смежных) из YYVGRK [SEQSEQ ID NO: 1 (такой вариант включен, чтобы охватить любые и все комбинации, например, но не ограничиваясь ими: YYVGRK [SEQ ID NO: 136] и KV SEQ ID NO: 1; или YVGRK [SEQ ID NO: 137], а такжеY и KV SEQ ID NO: 1 (все такие комбинации доступны только с использованием компьютерного алгоритма и хорошо известных математических формул для перестановок и комбинаций). В другом предпочтительном варианте эпитоп по изобретению определен функционально, например, способностью композиции для связывания по изобретению препятствовать образованию последующего комплекса связывания, конкурируя с композициями для связывания за один и тот же антиген, например, TGF-бета 1 (такое конкурентное связывание описано в данном описании). Термин "специфичное связывание" в данном описании обозначает ситуацию, в которой один член пары конкретного связывания не будет демонстрировать значимого связывания с молекулами, кроме его конкретного(их) партнера(ов) по связыванию. Термин также применим в случаях, когда, например, участок связывания антигена является специфичным для конкретного эпитопа, который несет целый ряд антигенов, когда конкретный член связывания, несущий участок связывания антигена, будет способен связываться с различными антигенами, несущими эпитоп. Соответственно, композиция для связывания,специфичная для зрелого TGF-бета 1, не будет демонстрировать значимого связывания с молекулами,кроме ее конкретного(их) партнера(ов) по связыванию", то есть зрелого TGF-бета 1. Фразы специфично связывает(ся)или специфично иммунореактивный в отношении относи-4 016038 тельно композиции для связывания означают реакцию связывания, которая является определяющей для присутствия композиции для связывания в присутствии гетерогенной популяции белков и других биологических компонентов. Таким образом, в указанных условиях иммуноанализа указанная композиция для связывания связывает конкретный белок и в существенной мере не связывает другие белки, присутствующие в образце. Специфичное связывание с композицией для связывания в таких условиях может потребовать композиции для связывания, выбранной за ее специфичность в отношении конкретного белка. Например, композиция для связывания, такая как антитело, может быть направлена против активной димерной формы человеческого TGF-бета 1, зрелый мономер аминокислотной последовательности которого показан в [SEQ ID NO: 1], и выбрана для получения антител, обладающих специфичной иммунореактивностью в отношении указанного белка TGF-бета 1, но не других белков. Такая композиция для связывания могла бы дифференцировать белки, в высокой степени гомологичные с человеческим белкомTGF-бета 1, например другие изоформы человеческого TGF-бета (например, человеческий TGF-бета 2 или человеческий TGF-бета 3). В предпочтительном варианте специфичность композиции для связывания по изобретению в отношении зрелого TGF-бета 1 равна или превышает в 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0,4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 300,400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000,7500, 8000, 8500, 9000, 9500 или 10 000 раз его специфичность в отношении зрелого TGF-бета 2 и/или зрелого TGF-бета 3. В другом предпочтительном варианте специфичность композиции по изобретению может иметь конкретное значение специфичности в отношении человеческого TGF-бета 2 из приведенного выше списка и другое значение специфичности в отношении человеческого TGF-бета 3, например специфичности в отношении зрелого TGF-бета 1, которая равна или более чем в 100 раз превышает его специфичность в отношении зрелого TGF-бета 2, и равна или более чем в 900 раз превышает его специфичность в отношении зрелого TGF-бета 3. Любые такие комбинации находятся в рамках данного изобретения. Композиция для связывания по изобретению предпочтительно нейтрализует TGF-бета 1 и демонстрирует константу диссоциации (kd) для TGF-бета 1 предпочтительно меньше чем приблизительно: 100,95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 пМ; более предпочтительно меньше, чем приблизительно: 10, 9,9, 9,8, 9,7, 9,6, 9,5, 9,4, 9,3, 9,2, 9,1, 9,0,8,9, 8,8, 8,7, 8,6, 8,5, 8,4, 8,3, 8,2, 8,1, 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4,6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1 или 5,0 пМ; даже более предпочтительно меньше, чем приблизительно 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5,1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0 пМ; и даже более предпочтительно 9,9, 9,8, 9,7, 9,6, 9,5, 9,4, 9,3, 9,2, 9,1, 9,0, 8,9, 8,8, 8,7, 8,6, 8,5, 8,4, 8,3,8,2, 8,1 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7,5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2,3,1, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6,0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 или 0,01 пМ. Константа диссоциации (Kd) композиции для связывания может быть определена с использованием любого способа из уровня техники, например BIACore с адаптированным способом Karlsson et al., 1991 J. Immunol. Methods 145, 299-340. Другие описания см. в Jonsson, et al. 1993 Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, et al. 1991 Biotechniques 11:620-7; Johnsson, et al. 1995 J. Mol. Recognit. 8:125-31; и Johnnson, et al. 1991 Anal. Biochem. 198:268-77. Термин kon в данном описании обозначает ассоциацию или константу скорости или скорость конкретной реакции, процесса или комплексообразования, измеренную в единицах: M-1c-1. Термин koff в данном описании обозначает диссоциацию или константу скорости диссоциации или конкретную скорость реакции для диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген, измеренную в единицах 1/с. Термин Kd в данном описании обозначает константу диссоциации специфического взаимодействия антиген/антитело. Ее вычисляют по формуле koff/kon=Kd. Сродство композиции для связывания часто коррелирует с более низкой koff, чем с более высокой kon, однако не привязываясь к теории, варианты как с улучшенной koff, так и с улучшенной kon находятся в рамках данного изобретения. В более предпочтительном варианте композиции для связывания по настоящему изобретению представляют собой высоко активные антитела или их фрагменты, в общем демонстрирующие низкие значения koff. Даже в более предпочтительном варианте константа скорости kon для варианта Fab по изобретению демонстрирует как минимум в 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3 или 2,4 раза улучшенную скорость kon, чем для Fab сравнения, например, mAb2471, описанного в PCT/US2004/018921; US60/485820. В другом варианте композиция по изобретению обладает улучшенной скоростью koff, которая как минимум в 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90, 100, 125, 130, 150, 195, 200, 225, 250, 260, 270, 280, 290 или 300 раз лучше, чем у сравнимой композиции связывания (например, такой как Fab или mAb). Предпочтительно композиция для связывания антитела специфично и/или селективно связывается сTGF-бета 1 по сравнению с TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3; более предпочтительно композиция для связывания антитела специфично и/или селективно связывается с человеческим TGF-бета 1 по сравнению с-5 016038 человеческим TGF-бета 2 и/или человеческим TGF-бета 3. Предпочтительно такое антитело обладает менее чем приблизительно 20% перекрестной реактивности с TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3 (измеренной по соотношению констант диссоциации), более предпочтительно менее чем приблизительно 15% перекрестной реактивности и даже более предпочтительно обладает менее чем приблизительно 10% перекрестной реактивности, и даже более предпочтительно обладает менее чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3,2 или 1% перекрестной реактивности. Кроме того, композиция для связывания антитела более предпочтительно распознает активную, но не латентную форму TGF-бета 1, более предпочтительно активную, но не латентную форму человеческого TGF-бета 1. Нейтрализация Термин нейтрализовать или проявлять антагонизм в отношении композиции для связывания означает ситуацию, в которой специфичное и/или селективное связывание композиции для связывания с другим молекулярным объектом приводит к прекращению или ингибированию биологической эффекторной функции молекулярного объекта, связанного композицией для связывания. В отношении TGFбета 1 термин нейтрализовать или проявлять антагонизм обозначает композицию для связывания,связывание или взаимодействие которой с TGF-бета 1 приводит к ингибированию биологической активности, индуцированной TGF-бета 1. Ингибирование биологической активности TGF-бета 1 может быть оценено путем измерения одного или больше in vitro или in vivo индикаторов биологической активностиTGF-бета 1, в том числе, например, но не ограничиваясь ими, ингибирование связывания с рецептором,ингибирование фиброза, ингибирование хемотаксиса или ингибирование преобразования сигнала в анализе связывания TGF-бета 1 (см., например, EP 0945464 относительно неограничивающих примеров анализов нейтрализации, включенных в данное изобретение). В неограничивающем варианте способность композиции для связывания нейтрализовать или проявлять антагонизм в отношении активности TGFбета 1 оценена с использованием анализа, описанного в примере данного описания. Нейтрализующая активность композиции для связывания, например варианта антитела, может быть исследована общепризнанным в уровне техники методом. В неограничивающем примере исследование проводят, адаптируя/модифицируя анализ TGF Randall et al. (1993) J. Immunol Methods 164, 61-67. Данное испытание основано на способности TGF-бета 1 и TGF-бета 2 ингибировать индуцированную интерлейкином-5 (IL-5) пролиферацию клеточной линии эритролейкемии TF1 и на способности обращать ингибирование TGF-бета композициями для специфического связывания. Сообщалось, что анализ является быстрым, воспроизводимым и чувствительным к концентрациям менее 500 фг/мл TGF-бета 1 и 5-10 пг/мл TGF-бета 2. Также сообщалось, что анализ в 100-1000 раз менее чувствителен к другим ингибиторным молекулам, таким как бета интерферон, гамма интерферон и опухолевый некротический фактор-альфа (TNF-альфа). Также сообщалось, что анализ может быть сделан специфичным для TGF-бета 1 или TGF-бета 2 путем включения конкретных нейтрализирующих антител к TGF-бета 1 или TGF-бета 2 и для распознавания всех легкодоступных рекомбинантных молекулярных разновидностей данных молекул, а также природных белков, полученных из человеческих и бычьих тромбоцитов, и для обнаружения TGF-бета в образцах сыворотки. Другие анализы, раскрытые в данном описании или известные из уровня техники, также находятся в рамках данного изобретения. Например, крысиная модель анти-Thy1.1 представляет собой общепризнанную модель мезангиопролиферативного гломерулонефрита (см., например, Morita, et al., 1998 Am JKidney Dis 31:559-73; Bagchus, et al., 1986 Lab. Invest. 55:680-7 и YamamotoWilson 1987 Kidney Int. 32:514-25), в которой инъекция антитела, направленного против антигена Thy, локализованного на поверхности мезангиальных клеток, индуцирует мезангиолиз с последующей фазой сверхкомпенсаторной пролиферации мезангиальных клеток, что приводит к повышению уровней белка в моче (протеинурия). Модель нефрита анти-Thy1.1 во многих аспектах имеет сходство с нефритом IgA у человека или пурпурой Хенош-Шонлейна (O'Donoghue, et al., 1991 J. Clin Invest 88:1522-30) и применяется для исследования потенциальных терапевтических подходов к заболеванию почек путем определения способности исследуемых тестовых композиций вызывать коррелирующее с дозой уменьшение протеинурии (см., например, Burg, et al., 1997 Lab Invest 76:505-16; Johnson, et al., 1995 Kidney Int 47:62-9). В предпочтительном варианте композиция для связывания по изобретению уменьшает протеинурию на такой модели на 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80% или больше. Кроме того, изобретение включает варианты, содержащие интервал снижения протеинурии (на такой модели) между какими-либо двумя из указанных значений, причем данный интервал может включать или не включать одно или оба цифровых значения,соответствующие конечным точкам интервала (например, интервал 12% и 42%). Дополнительно, можно принять любой анализ Sharma (см., например, 2000 PNAS 97:8015-20) на модели диабетических мышей db/db, демонстрируя, что хроническое ингибирование биологического действия TGF-бета в почке эффективно предупреждает почечную недостаточность, которая является обычным результатом диабета, или можно принять модель на мышах со стрептозотоциновым диабетомSharma (1996 Diabetes 45, 522-30) для анализа способности композиции для связывания облегчать или предупреждать диабетическую нефропатию. В дальнейшем, Ueberham et al., 2003 Hepatology 37(5):106778, описали регулируемую тетрациклином систему генной экспрессии на модели дважды трансгенной мыши с фиброзом печени, где экспрессия TGF-бета 1 регулируется добавлением или удалением гидрохлорида доксициклина к питьевой воде, таким образом позволяя инициацию или прекращение экспрессии TGF-бета 1 по желанию. Повышение экспрессии TGF-бета 1 в печени таких животных ведет к состояниям фиброзного заболевания, которые являются обратимыми при прекращении экспрессии TGFбета 1, даже после того, как масса печени снижена на 59%. Использование данной модели позволяет оценивать воздействие композиций для связывания по изобретению на ингибирование биологических функций TGF-бета 1, сравнивая композицию для связывания по изобретению с воздействиями гидрохлорида доксициклина, который прекращает экспрессию TGF-бета 1. В конкретном варианте с использованием анализа пролиферации клеток HT-2 (как описано в данном описании) заявители предпочтительно включают варианты композиции для связывания с IC50, улучшенным как минимум в 50, 60, 70, 80, 90,100, 105, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425 или 450 раз или больше, по сравнению со значением IC50, полученным с использованием подобной композиции для связывания, например,такой как mAb2471 (описана в PCT/US2004/018921; США 60/485820), в таких же или подобных условиях анализа. Кроме того, изобретение включает варианты, демонстрирующие интервал улучшения IC50 (как определяется выше) двух таких значений, которые могут включать или не включать любую или обе конечные точки (например, улучшение IC50 в интервале 80 раз и 100 раз по сравнению, например, сmAb2471). Антитела Композиции для связывания антитела по изобретению включают, например, но не ограничиваясь ими, поликлональные, моноклональные, мультиспецифичные, человеческие, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, фрагменты Fab, фрагменты F(ab'), фрагменты, продуцированные библиотекой экспрессии Fab, антиидиотипические (анти-Id) антитела (в том числе, например,анти-Id антитела к антителам по изобретению) и фрагмент связывания эпитопа любого из упомянутого выше. Термин антитело в данном описании означает композиции иммуноглобулина и иммунологически активные части композиций иммуноглобулина, например молекула композиции для связывания, которая содержит сайт связывания, который специфично и/или селективно связывается с антигеном. Композиция иммуноглобулина по изобретению может быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY),класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина. Предпочтительно антитело представляет собой фрагмент человеческого антигенсвязывающего антитела по изобретению, например, но не ограничиваясь ими, Fab, Fab' и F(ab')2, Fc, одноцепочечный Fvs(scFv), одноцепочечные антитела, связанный с дисульфидом Fvs (sdFv), а также фрагменты, содержащие участок VL или VH. Фрагменты антигенсвязывающего антитела, в том числе одноцепочечные антитела,могут включать вариабельный(ые) участок(ки) только отдельно или в комбинации с полной длиной или частью следующего: шарнирная область, CH1, CH2 или область CH3 или их комбинации. Изобретение также включает, например, но не ограничиваясь ими, антигенсвязывающий фрагмент, который также может содержать любую комбинацию вариабельного(ых) участка(ов) с шарнирной областью, например,такой как область CH1, CH2 или CH3 или их комбинации. Антитело по изобретению может происходить из любого животного, в том числе птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела являются человеческими, антителами приматов, мышиными (например, мышь и крыса), ослиными, кроличьими, козьими,антителами морской свинки, верблюда, лошади или курицы. В данном описании фраза человеческие антитела включает, например, но не ограничиваясь ими,антитела, содержащие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, в том числе, например, но не ограничиваясь ими, антитело, выделенное из библиотеки человеческого иммуноглобулина (например, библиотеки зародышевой линии человека) или из трансгенного животного, которое не экспрессирует эндогенных иммуноглобулинов, для одного или больше человеческих иммуноглобулинов, как описано в данном описании или как описано в патенте США 5939598. Композиция для связывания может быть моноспецифичной, обладать двойной специфичностью,тройной специфичностью или мультиспецифичностью. Мультиспецифичные антитела могут быть специфичными в отношении различных эпитопов целевого белка, полипептида (или его фрагмента) или могут быть специфичными в отношении как TGF-бета 1, так и гетерологичного эпитопа, такого как гетерологичная изоформа TGF-бета или твердый материал подложки (см., например, WO 2093/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69; патенты США 4474893; 4714681; 4925648; 5573920 или 5601819; или Kostelny, et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553). Композиция для связывания может быть описана или указана в терминах эпитопа(ов) или части(ей) белка TGF-бета 1 (или его фрагмента), который она распознает или с которым селективно и/или специфично связывается. Эпитоп(ы) или часть(и) полипептида могут быть указаны, как описано в данном описании, например, по N-концевым и C-концевым положениям, по размеру в смежных аминокислотных-7 016038 остатках, или как перечислено в приложенной таблице и/или на фигуре, или как описано в данном описании. Дополнительно, антитело, которое специфично связывается с эпитопом, полипептидом, белком или фрагментом полипептида или белка, также может быть специфично исключенным из данного изобретения. Например, заявители оставляют за собой право на условие исключения любого антитела, которое специфично связывается с эпитопом, полипептидом, белком или фрагментом полипептида или белка. Соответственно, изобретение может включать первое (или другое) антитело, которое специфично связывается с полипептидом или белком или его фрагментом, и, в то же время, из изобретения может быть исключено второе (или другое) антитело, которое также может селективно связываться с тем же белком или полипептидом или его фрагментом, например, путем связывания другого эпитопа. В предпочтительном варианте заявители оговаривают композицию для связывания, которая специфично и/или селективно связывается с изоформой TGF-бета 1 по сравнению с TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3 и которая нейтрализует TGF-бета 1, содержащую как минимум один сайт связывания, содержащий как минимум: четыре смежные аминокислоты из QQWNGNPPA [SEQ ID NO: 126]; как минимум шесть смежных аминокислот из QQWDSNPPA [SEQ ID NO: 127]; как минимум пять смежных аминокислот из YIYPYNGDTGYNQKFKS [SEQ ID NO: 128] (где одна из указанных как минимум пяти смежных аминокислот представляет собой D); или как минимум пять смежных аминокислот из GYTFTDYTMH [SEQ IDNO: 129]. Антитела по изобретению также могут быть описаны или определены единицами их перекрестной реактивности. Изобретение включает антитела, которые не связываются с любым другим аналогом, ортологом, паралогом или гомологом целевого белка, полипептида (или его фрагмента). Изобретение дополнительно включает антитело, которое селективно связывается с полипептидом, который кодируется полинуклеотидом, который стабильно гибридизуется, в условиях строгой гибридизации (как описано в данном описании), с человеческой последовательностью полинуклеотида TGF-бета 1. Композиция для связывания также может быть описана или определена единицами сродства связывания с белком или полипептидом (его фрагментом), или эпитопом. В другом варианте предпочтительное сродство связывания композиции для связывания, например, антитела или антителосвязывающего фрагмента включает, например, сродство связывания (с использованием описанного в данном описании анализа), которое демонстрирует константу диссоциации или Kd менее (или в интервале между двумя числами, определенными ниже, причем данный интервал может включать или не включать любую или обе конечные точки): 510-2 М, 10-2 М, 510-3 М, 10-3 М, 510-4 М, 10-4 М, 510-5 М, 10-5 М, 510-6 М, 10-6 М, 510-7 М, 10-7 М, 510-8 М, 10-8 М, 510-9 М, 10-9 М, 510-10 М, 10-10 М, 510-11 М, 10-11 М, 510-12 М,4,910-12 М, 4,810-12 М, 4,710-12 М, 4,610-12 М, 4,510-12 М, 4,410-12 М, 4,310-12 М, 4,210-12 М,4,110-12 М, 4,010-12 М, 3,910-12 М, 3,810-12 М, 3,710-12 М, 3,610-12 М, 3,510-12 М, 3,410-12 М,3,310-12 М, 3,210-12 М, 3,110-12 М, 3,010-12 М, 2,910-12 М, 2,810-12 М, 2,710-12 М, 2,610-12 М,2,510-12 М, 2,410-12 М, 2,310-12 М, 2,210-12 М, 2,110-12 М, 2,010-12 М, 1,910-12 М, 1,810-12 М,1,710-12 М, 1,610-12 М, 1,510-12 М, 1,410-12 М, 1,310-12 М, 1,210-12 М, 1,110-12 М, 1,010-12 М,0,910-12 М, 0,810-12 М, 0,710-12 М, 0,610-12 М, 0,510-12 М, 0,410-12 М, 0,310-12 М, 0,210-12 М,0,110-12 М, 10-12 М, 510-13 М, 10-13 М, 510-14 М, 10-14 М, 510-15 М или 10-15 М. Изобретение также включает антитела, которые конкурентно ингибируют связывание композиции для связывания с эпитопом TGF-бета 1, что определяется любым из известных в уровне техники способов для определения конкурентного связывания, например иммуноанализ, описанный в данном описании или в процитированной публикации. В предпочтительных вариантах антитело конкурентно препятствует связыванию с эпитопом как минимум 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92 или 91%, как минимум 90, 89,88, 87, 86%; как минимум 85%, как минимум 80%, как минимум 75%, как минимум 70%, как минимум 60% или как минимум 50% (или в интервале между двумя такими значениями, причем интервал может включать или не включать любую или обе конечные точки). Антитела по изобретению могут действовать как антагонисты TGF-бета 1 (или его фрагмента). Например, антитело или композиция для связывания по изобретению может нарушать, например, взаимодействие, частично или полностью, TGF-бета 1 с родственным рецептором/лигандом. Предпочтительно антитела по изобретению связываются с антигенным эпитопом TGF-бета 1 или его частью. Подобным образом изобретение включает антитела, которые связываются с лигандом и препятствуют его связыванию с рецептором (например, путем создания стерических помех). Также изобретение включает лигандсвязывающие антитела, которые препятствуют активации рецептора без ингибирования связывания с рецептором. Антитела по изобретению могут применяться, например, но не ограничиваясь ими, для очистки,обнаружения или атаки TGF-бета 1 (или его фрагмента), например, в диагностических и/или терапевтических способах in vitro и/или in vivo. Например, антитела используются в иммуноанализах для качественного и/или количественного измерения уровней TGF-бета 1 (или его фрагмента) по изобретению в биологическом образце (см., например, HarlowLane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1999). Композиция для связывания может применяться отдельно или в комбинации с другими компози-8 016038 циями. Кроме того, композиция для связывания, такая как антитело, может быть рекомбинантным способом объединена с гетерологичным полипептидом на N- или C-конце или химически конъюгирована (в том числе ковалентные и нековалентные конъюгаты) с полипептидом или другими композициями. Например, антитела по изобретению могут быть рекомбинантным способом объединены или конъюгированы с молекулами, пригодными в качестве меток в анализах по обнаружению, и с эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства, радионуклиды или токсины(см., например, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США 5314995 и EP 396387). Композиция для связывания включает, например, производные, которые модифицированы, например, ковалентным присоединением молекулы какого-либо типа, например, антитела, таким образом, ковалентно присоединенный фрагмент не препятствует антителу генерировать анти-идиотипическую реакцию. Например, производное антитела включает, не ограничиваясь ими, антитела, модифицированные,например, гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическим расщеплением, присоединением к клеточному лиганду или другому белку и т.п. Любая из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена известными способами, в том числе, например, но не ограничиваясь ими, специфичным химическим расщеплением, ацетилированием, подбором состава, метаболическим синтезом туникамицина и т.п. Дополнительно, производное может содержать одну или больше неклассических аминокислот. Композиция для связывания может быть сгенерирована любым пригодным способом, известным из уровня техники. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием любой техники, известной из уровня техники, например HarlowLane, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); HarlowLane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); BreitlingDubel 1999 RecombinantAntibodies (John WileySons, New York); H. Zola, Monoclonal Antibodies (Garland Press) и James W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic Press). Термин моноклональное антитело в данном описании не ограничен антителами, полученными с помощью конкретной техники (например, технологии гибридомы). Способы получения и скрининга конкретных антител с использованием технологии гибридомы являются шаблонными и известны из уровня техники. Термин моноклональное антитело означает антитело, полученное из единого клона, в том числе любого эукариотного, прокариотного или фагового клона, а не способ, которым оно получено. Фрагменты антитела, которые распознают специфические эпитопы, могут быть получены известными способами. Например, Fab и F(ab')2 фрагменты по изобретению могут быть продуцированы протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулина с использованием ферментов, таких как папаин(для получения Fab фрагментов) или пепсин (для получения фрагментов F(ab')2). Фрагменты F(ab')2 содержат вариабельный участок, константный участок легкий цепи и область CH1 легкой цепи. Например,композиция для связывания также может быть получена с использованием различных способов фагового дисплея, известных из уровня техники, в которых функциональные области антитела показаны на поверхности частиц фага, которые несут кодирующую их последовательность полинуклеотида. В конкретном варианте способ фагового дисплея используется, чтобы показать участки связывания антигена, экспрессированные из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человеческих или мышиных). Фаг, который экспрессирует антигенсвязывающий участок, который связывается с целевым антигеном, может быть выбран или идентифицирован с помощью антигена, например с использованием меченого антигена или антигена, связанного или захваченного твердой поверхностью или гранулой. После выделения фага антитело, кодирующее участки фага, выделяют и используют для генерации целых антител, в том числе человеческих антител или любого другого целевого антигенсвязывающего фрагмента, и экспрессируют в любом желательном хозяине, включая клетки млекопитающих,клетки насекомых, клетки растений, дрожжей и бактерий, например, как описано в данном описании или в литературе. Рекомбинантные техники получения Fab, Fab' и F(ab')2 фрагментов также могут применяться с использованием известных из уровня техники способов, например, WO 92/122324; Mullinax, et al., BioTechniques 1992 12(6): 864-9; и Sawai, et al., 1995 AJRI 34:26-34; и Better, et al., 1988 Science 240:1041-3. Примеры получения одноцепочечного Fvs и антител включают, например, патенты США 4946778 и 5258498; Huston, et al., 1991 Methods in Enzymology 203:46-88; Shu, et al., 1993 PNAS USA 90:7995-9; иSkerra, et al., 1988 Science 240:1038-40. Для некоторых видов применения, в том числе in vivo применения антител у человека и анализах по обнаружению in vitro, может быть предпочтительным применять гуманизированные или человеческие антитела, полученные по известным из уровня техники способам. Гуманизированные антитела в данном описании представляют собой композиции для связывания,которые связываются с целевым антигеном, содержащим один или больше определяющих комплементарность участков (CDR), описанных в данном описании, встроенных в каркасную область, которая с меньшей вероятностью будет вызывать вредную реакцию иммуногенности in vivo при введении в систему хозяина-человека (например, после парентерального введения). Часто участки CDR донора подходящим образом встраиваются в человеческие каркасные области, чтобы улучшить связывание с антигеном-9 016038 и/или уменьшить иммуногенность. Пригодные каркасные области могут быть идентифицированы с использованием известных из уровня техники способов, например (1) моделированием взаимодействияCDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания с антигеном;(2) сравнением последовательностей для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях (см., например, патент США 5585089, Riechmann, et al., Nature 332:323 (1988); или (3) эмпирически. В табл. 1 (а и b) ниже показаны определяющие комплементарность участки (CDR) вариабельной тяжелой и легкой цепей конкретных вариантов моноклонального антитела композиции для связывания по изобретению. Участки CDR показаны с использованием стандартного однобуквенного кода аминокислот и стандартной нумерации CDR (т.е. с увеличением цифрового значения CDR в соответствии с увеличивающейся близостью к постоянному участку типичной структуры тяжелой или легкой цепи IgG; например, VH CDR3 является в большей степени проксимальным по отношению к области CH1, чем VHCDR1). Конкретные варианты CDR представлены в общем виде с использованием формул аминокислот,чтобы описать род CDR (опять с использованием стандартного однобуквенного кода аминокислот с допускающими замещение остатками аминокислоты, показанными буквой X, и указанием расположения остатка в пределах конкретного CDR цифровым индексом, значение которого возрастает от самого низкого (наивысший амино) до самого высокого (наивысший карбокси) остатка в CDR (например, X1 вVHCDR2 представляет собой наивысший амино остаток CDR, в то время как карбоксильный остаток, в наибольшей мере допускающий замещение, представляет собой X6). С использованием таких общих формул средний специалист в данной области способен определить все варианты CDR, возможные при каждом обозначенном положении в вариабельном участке тяжелой или легкой цепи (VL или VH), включенном в изобретение. Любой конкретный экземпляр возможной аминокислотной последовательности определяется исключительно путем генерации всех возможных замен в каждом конкретном X остатке в пределах конкретной формулы CDR с использованием кода аминокислот. Все такие варианты включены в данное изобретение). Кроме того, изобретение в равной степени включает все возможные VL или VH варианты возможных комбинаций CDR (например, с использованием приведенной информации можно легко вычислить, что существуют 72 возможных VHCDR1; 384 возможных VHCDR2 и 12 возможныхVHCDR3, которые позволяют получить общее количество 7238412 возможных комбинаций VH CDR в пределах конкретного варианта вариабельной тяжелой цепи антитела композиции для связывания по изобретению. Изобретение также включает все такие комбинации. Подобный подход применяется к любому VL CDR и ко всем возможным комбинациям, включенным в вариабельный участок VL легкой цепи. Например, существуют 192 возможных VLCDR1; 12 возможных VLCDR2 и 48 возможных VLCDR3,которые позволяют генерировать общее количество 1921248 возможных комбинаций VL CDR в пределах конкретного варианта вариабельной легкой цепи антитела композиции для связывания по изобретению). Подобным образом, изобретение также включает все возможные комбинации парного сочетанияVH и VL в пределах конкретного варианта композиции для связывания. Таблица 1a. Формула CDR тяжелой цепи композиций для связывания В случае VHCDR1: X1 представляет собой T или D; X2 представляет собой T, E или F; X3 представляет собой M, I, L или V и X4 представляет собой H, V или A.В случае VHCDR2: X1 представляет собой Y, Q или S; X2 представляет собой I или V; X3 представляет собой D или E; X4 представляет собой Y, T, H или L; X5 представляет собой Q, K, P или S и X6 представляет собой F или Y.В случае VHCDR3: X1 представляет собой W или A; X2 представляет собой или F или L и X3 представляет собой A, E или Y. Таблица 1b. Формула CDR легкой цепи композиций для связывания- 10016038 В случае VLCDR2: X1 представляет собой L, N или P и X2 представляет собой S, K, Y, L, M, F, E,Q, R или H.В случае VLCDR3: X1 представляет собой Q или S; X2 представляет собой L, D или P; X3 представляет собой N или R и X4 представляет собой P, F, Y или R. Далее, изобретение включает композиции для связывания антитела с использованием CDR, включенных в данное описание, которые встроены (в подходящей ориентации) или их несут каркасные области человеческого антитела, чтобы дать возможность композиции для связывания специфично и/или селективно связываться со зрелым TGF-бета 1, зрелым TGF-бета 2 и/или зрелым TGF-бета 3 и нейтрализовать зрелый TGF-бета 1. Известные из уровня техники способы могут использоваться для того, чтобы встроить или разместить конкретные CDR в пределах подходящих каркасных областях. Вариабельные участки, используемые в изобретении, могут происходить из какой-либо зародышевой линии или реорганизованного человеческого вариабельного участка или могут представлять собой синтетический вариабельный участок, основанный на консенсусных последовательностях известных человеческих вариабельных участков. Предпочтительными вариабельными участками каркасной области являются те, которые не воздействуют в значительной мере на биологические свойства варианта композиции для связывания антитела анти-TGF-бета 1, то есть способность специфично и/или селективно связываться и нейтрализовать зрелый TGF-бета 1 по сравнению со зрелым TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3. Более предпочтительными являются каркасные области, которые дополнительно не вызывают значительных иммуногенных реакций при введении субъекту-человеку (например, парентеральном). Предпочтительные каркасные последовательности могут быть последовательностями природных человеческих антител или консенсусными последовательностями нескольких человеческих антител. Неограничивающие примеры последовательностей каркасной области для вариабельного участка вариантов тяжелой цепи антитела по изобретению включают VH сегмент DP-5 (Tomlinson, et al. 1992 J. Mol. Biol. 227:776-98) и J сегмент JH4, JH1 или JH5 (Ravetch, et al. 1981 Cell 27:583-91). Vk сегмент L1 (Cox, et al. 1994 Eur. J. Immunol. 24:827-36) и J сегмент Jk4 (Hieter, et al. 1982 J. Biol. Chem. 10:1516-22) представляют собой неограничивающие примеры последовательностей каркасных областей для вариабельного участка легкой цепи. В предпочтительном варианте каркасная область HCVR FR1 включает[SEQ ID NO: 11]. В другом предпочтительном варианте каркасная область LCVR FR1 включаетFGQGTKLEIK [SEQ ID NO: 38]. В более предпочтительном варианте такие каркасные области могут содержать сдвиги, делеции, добавления, замены или какую-либо их комбинацию. Более того, каркасные области, в которых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот заменены, удалены или добавлены в какуюлибо комбинацию, также являются предпочтительными. В одном варианте предпочтительный постоянный участок тяжелой цепи для встраивания в композицию для связывания антитела CDR по изобретению включает, например, постоянный участок IgG. В более предпочтительном варианте постоянный участок IgG представляет собой постоянный участокIgG1 или постоянный участок IgG4, как показано ниже: Предпочтительная последовательность постоянного участка легкой цепи по изобретению представляет собой постоянный участок цепи каппа, показанный ниже: В другом предпочтительном варианте антитело композиций для связывания содержит постоянный участок тяжелой цепни IgG1 или постоянный участок тяжелой цепни IgG4 и постоянный участок легкой цепи каппа. С использованием информации, предоставленной в данном описании, средний специалист мог бы создать вариант mAb по изобретению, например, такой как 46P-L1-6, в состав которого входила бы легкая цепь, содержащая:VL CDR3 = QQWDLNPPA [SEQ ID NO: 140] формулы X1QWDX2X3X4PA [SEQ ID NO: 7], где X1 представляет собой Q или S; X2 представляет собой L, D или P; X3 представляет собой N или R и X4 представляет собой P, F, Y или R; каркас LCVR FR4 = FGQGTKLEIK [SEQ ID NO: 38]; и постоянный участок легкой цепи =VH CDR3 = GYRWFAY [SEQ ID NO: 143] формулы GYRX1X2X3Y [SEQ ID NO: 4]; где X1 представляет собой W или A; X2 представляет собой F или L и X3 представляет собой A, E или Y; каркас HCVR FR4 = WGQGTLVTVSS [SEQ ID NO: 11]; и постоянный участок тяжелой цепи = Полинуклеотиды, кодирующие антитела Изобретение дополнительно включает молекулы нуклеиновых кислот, содержащие полинуклеотидные последовательности, которые кодируют композицию для связывания (или ее фрагмент) или последовательность полипептида по изобретению. Полинуклеотиды могут быть получены, и нуклеотидная последовательность полинуклеотидов определена любым способом, известным из уровня техники, например, если последовательность полипептида (например, антитела или его фрагмента) известна, полинуклеотид, кодирующий полипептид, может быть определен просто с использованием вырождения генетического кода в каком-либо компьютерном алгоритме, и информация о полученной последовательности может использоваться для сборки, например, химически синтезированных олигонуклеотидов (например,как описано в Kutmeier, et al., (1994) BioTechniques 17:242), которая, в двух словах, включает синтез частично перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей последовательность полипептида, отжиг и лигирование полученных олигонуклеотидов с последующей амплификацией лигированных олигонуклеотидов в ходе полимеразной цепной реакции. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий последовательность полипептида по изобретению,может быть сгенерирован из нуклеиновой кислоты из какого-либо подходящего источника. Если клон,содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую конкретное антитело, недоступен, но последовательность молекулы антитела известна, то нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноглобулин, может быть химически синтезирована или получена из подходящего источника. Например, источником может быть антитело кДНК библиотеки или кДНК библиотека, генерируемая из поли A+РНК, выделенных из какой-либо ткани или клетки, экспрессирующей целевое антитело, например клеток гибридомы,выбранных для экспрессии антитела по изобретению, ПЦР амплификацией с использованием синтетических праймеров, которые гибридизуются с 3' и 5' концами последовательности целевого полинуклеотида,или клонированием с использованием олигонуклеотидного зонда, специфичного для конкретной последовательности гена, для идентификации, например, кДНК клона из кДНК библиотеки, который кодирует антитело, может быть сгенерирована молекула нуклеиновой кислоты для антитела. Амплифицированные нуклеиновые кислоты могут быть клонированы в способные к репликации векторы клонирования с использованием какого-либо известного из уровня техники способа. Как только- 13016038 нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательность антитела определены, уклеотидной последовательностью антитела можно манипулировать с использованием какого-либо известного из уровня техники способа, например, методов рекомбинации ДНК, сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и т.п., чтобы генерировать антитела, содержащие другую аминокислотную последовательность, с целью создания замен, делеций и/или вставок аминокислот (см., например, Sambrook, et al., and Ausubel, et al.,eds., cur. ed., Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, NY). В конкретном варианте аминокислотная последовательность вариабельных участков тяжелой и/или легкой цепи может быть проинспектирована для идентификации последовательностей определяющих комплементарность участков (CDR) известными способами, например, сравнивая известные аминокислотные последовательности других вариабельных участков тяжелой и легкой цепей для определения участков гипервариабельности последовательности. С использованием шаблонных методов рекомбинации ДНК один или больше CDR, описанные в данном описании, могут быть вставлены в подходящие каркасные области, например в человеческие каркасные области для снижения иммуногенности. Каркасные области могут представлять собой природные или консенсусные каркасные области (или как описано в данном описании) и предпочтительно представляют собой человеческие каркасные области (перечень человеческих каркасных областей см., например, в Chothia, et al. 1998 J. Mol. Biol. 278:457-79). Вообще говоря, чтобы идентифицировать остатки в пределах человеческих каркасных областей, которые,вероятно, влияют на целостность антигенсвязывающего сайта и, таким образом, на связывание с антигеном, как донорная, так и отобранные человеческие акцепторные последовательности могут быть выровнены с несколькими шаблонами последовательности, происходящими из репертуаров антитела. Идентифицированы инвариантные остатки (Kabat et al., 1991) и ключевые остатки (Chothia et al., 1989) назначения канонического класса петель связывания донорного антигена L1-L3, H1 и H2, соответственно,определяются путем экранирования оследовательности против шаблонов последовательности (MartinVH/VL (Chothia et al., 1985) и остатках, которые известны как структурно консервативные в основных сайтах (Chothia et al., 1998), сравнивают с соответствующими донорными и акцепторными остатками. Несоответствующие остатки донора и каркасной области акцептора в этих сайтах анализируют на основе информации от других антител известной структуры из Protein Data Bank (Berman, et al., 2000 Nucl. Кислоты Res. 28(1):235-42). Выделение человеческих каркасных областей для использования в качестве шаблонов с целью гуманизации чужеродных V участков может определить последующие решения, относительно каких остатков осуществлять гуманизацию. Выбор гомологичных шаблонов из антител с известной кристаллической структурой, из зародышевой линии, незародышевой линии или консенсусной последовательности, полученной из доступных баз данных, представляет собой варианты (обзор см. вAntibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press. Другая стратегия гуманизации антител состоит в выборе наиболее близкой человеческой последовательности (Tomlinson et al., 1992) зародышевой линии в качестве каркасного участка для получения донора CDR. Данный подход зародышевой линии основан на том же обосновании, что и стратегия наилучшего соответствия, но поиск в базах данных осуществляют только по последовательностям зародышевой линии (см., например, V BASE, которые являются всеобъемлющим каталогом всех оследовательностей вариабельного участка человеческой ародышевой линии, скомпилированных из свыше тысячи опубликованных последовательностей, в том числе в текущих редакциях библиотек данных Genbank и EMBL. База данных V BASE разрабатывалась в течение нескольких лет в MRC Center for Protein Engineering (Cambridge, Великобритания), как продолжение работы по установлению последовательности и картированию генов человеческих антител и как удобный в применении инструмент для их анализа). Способ каркасной области зародышевой линии является наиболее пригодным, поскольку последовательность человеческой зародышевой линии не представляет соматических гипермутаций, которые являются потенциально иммуногенными. CDR также могут быть пересажены или встроены в человеческие каркасные области с использованием стратегии консенсусной человеческой зародышевой линии, в которой одна из человеческих подгрупп используется в качестве каркасной области (см., например, Presta et al., 1993 J. Immunol 151:2623-32; Couto et al., 1994Hybridoma, 13:215-9; Couto et al., 1995 Cancer Res. (Suppl.), 55, 5973s-7s; Werther et al., 1996 J. Immunol.,157:4986-95; O'Connor et al., 1998 Protein Engng 11:321-8). Предпочтительно полинуклеотид, генерируемый комбинацией участков каркасной области и CDR,кодирует антитело (или его фрагмент), который специфично и/или селективно связывается с TGF-бета 1(или его эпитопом). Предпочтительно, как обсуждается в данном описании, одна или больше замен аминокислот могут быть сделаны в каркасных областях, чтобы улучшить связывание антитела с целевым антигеном. Кроме того, такие способы могут применяться с целью создания замен или делеций аминокислот в одном или больше вариабельных участков, остатков цистеина, участвующих в образовании внутрицепочечных дисульфидных связей для того, чтобы генерировать молекулы антитела, где одна или больше внутрицепочечных дисульфидных связей отсутствуют. Другие изменения полинуклеотида включены в- 14016038 данное изобретение и находятся в рамках навыков среднего специалиста в данной области, такого как молекулярный биолог. Альтернативно, способы могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител (см.,например, патент США 4946778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston, et al., PNAS 85:5879-5883(1988); and Ward, et al., Nature 334:544-54 (1989. Одноцепочечные антитела образуют путем связывания фрагментов тяжелых и легких цепей участка Fv через аминокислотный мостик с образованием одноцепочечного полипептида. Также могут применяться методы сборки ункциональных Fv фрагментов в E.coli (Skerra, et al. (1988) Science 242: 1038- 1041). Фрагменты полипептида Изобретение также включает фрагменты композиции для связывания. Фрагмент полипептида или сегмент" включает аминокисло, или частью последовательности полипептида SEQ ID NO. Белок и/или фрагменты полипептида или сегменты могут существовать отдельно или они могут включать часть полипептида больших размеров или белка, из которого фрагмент или сегмент образует часть или участок, например единый непрерывный участок SEQ ID NO: в данном описании соединен в слитом белке. Предпочтительно сегмент полипептида может содержать участок смежных аминокислот, длина которого составляет как минимум приблизительно 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96,98, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 смежных аминокислот. В данном контексте приблизительно включает, например, специфически заявленные интервалы или значения, описанные в данном описании, и он также включает значения, которые отличаются от этих заявленных значений несколькими аминокислотными остатками (например,5,4,3,2 или 1 аминокислотный остаток) на одном или обоих концах фрагмента. Полинуклеотиды, кодирующие такой фрагмент полипептида, также включены в изобретение. Кроме того, изобретение включает белки или полипептиды, содержащие множество указанных аминокислотных сегментов или фрагментов, например, не перекрывающихся частично, сегменты указанной длины. Обычно, множество будет представлено как минимум двумя, более обычно как минимум тремя и более предпочтительно как минимум четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или больше. В то время как минимальные значения длины сегмента приведены, максимальные значения длины различных размеров также включены для любого конкретного множества сегментов, например, множества трех сегментов in toto могло бы содержать один сегмент длиной 7 смежных аминокислот, и два дополнительных не перекрывающихся частично сегментов, каждый из которых имеет длину 12. Также предпочтительными являются фрагменты или сегменты полипептида (и соответствующие фрагменты полинуклеотида), которые характеризуют структурные или функциональные области, такие как фрагменты или их комбинации, которые включают, например, определяющие комплементарность участки (CDR, такие как VL или VH: CDR1, CDR2 или CDR3), вариабельные участки (например, тяжелых или легких цепей, VL или VH), участки каркасной области (FH1, 2, 3 или 4), участки D или J, постоянные участки (такие как CL, CH1, CH2 или CH3), шарнирные области, участки связывания гамма рецептора Fc, альфа-спираль и образующие альфа-спираль участки, бета-лист и образующие бета-лист участки, изгиб и образующие изгиб участки, кольцо и образующие кольцо участки, гидрофильные участки,гидрофобные участки, альфа-амфифильные участки, бета-амфифильные участки, гибкие участки, петлевые участки, области шпильки, мотивы бета-альфа-бета, пучки спиралей, альфа/бета бочкообразные,вверх и вниз бета бочкообразные, рулет с вареньем или мотивы рулета с вареньем, трансмембранные участки, формирующие поверхность участки, участки связывания с субстратом, трансмембранные участки, линкеры, иммуногенные участки, участки эпитопов, а также участки с высоким антигенным индексом. Кроме того, в изобретение также включены полинуклеотиды, кодирующие эти области. Другие предпочтительные сегменты полипептида представляют собой биологически активные фрагменты. Биологически активные фрагменты представляют собой такие, которые демонстрируют подобную, но не обязательно идентичную активность с активностью полипептида композиции для связывания (или его фрагмента), например Fab, Fv, scFv или F(ab)2. В изобретение также включены полинуклеотиды, кодирующие эти фрагменты полипептида. Предпочтительно фрагменты полинуклеотида кодируют полипептид, который демонстрирует функциональную активность. Фраза функциональная активность" включает сегмент полипептида, который может проявлять один или больше известных видов функциональной активности. Такие виды функциональной активности включают, например, но не ограничиваясь ими, биологическую активность, антигенность [способность связываться (или конкурировать с полипептидом за связывание) с композицией для связывания антитела с полипептидом по изобретению], иммуногенность (способность генерировать антитело, которое связывается с полипептидом по изобретению), способность образовывать мультимеры с полипептидом по изобретению, а также способности связываться с рецептором или лигандом полипептида, описанного в данном описании. Функциональная активность полипептида (в том числе его фрагментов, вариантов, производных и аналогов) может быть исследована различными способами. Например, для исследования способности- 15016038 связываться или конкурировать с полипептидом полной длины по изобретению за связывания с антителом полипептида по изобретению могут применяться различные иммуноанализы, известные из уровня техники, в том числе, например, но не граничиваясь ими, конкурентные и неконкурентные системы анализа с использованием таких методов, как радиоиммуноанализ, ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ), сэндвичевый иммуноанализ, иммунорадиометрические анализы, реакции реципитации диффузией в геле, иммунодиффузионные анализы, иммуноанализы in situ (например, с использованием коллоидных золотых, ферментных или радиоизотопных меток), вестерн-блоттинг, реакции образования осадка, анализы агглютинации (например, анализы агглютинации в геле, анализы гемагглютинации, анализы фиксации комплемента, анализы иммунофлуоресценции, анализы протеина A, анализы иммуноэлектрофореза и т.п.). В другом варианте связывание антитела достигается путем обнаружения метки на исходном антителе. В другом варианте исходное антитело обнаруживают путем выявления связывания вторичного антитела или реактива с исходным антителом. Еще в одном варианте вторичное антитело несет на себе метку. Из уровня техники известно множество средств для обнаружения связывания в иммуноанализе, и они находятся в рамках данного изобретения. В другом варианте, где идентифицируют лиганд или оценивают способность фрагмента, варианта или производного полипептида по изобретению мультимеризоваться, связывание может быть проанализировано, например, с восстанавливающей и не восстанавливающей гель-хроматографией, хроматографией сродства белка и блоттинга сродства (в общем см. Phizicky, et al. (1995) Microbial. Rev. 59:94-123). В другом варианте физиологические корреляции со связыванием полипептида с его субстратами (преобразование сигнала) могут быть проанализированы с помощью общих методов. Кроме того, анализы, описанные в данном описании (см., например, раздел заявки Примеры) или иным образом известные из уровня техники, могут быть шаблонно применены для измерения способности композиции для связывания (ее фрагментов, производных вариантов и аналогов) модулировать родственную биологическую активность TGF-бета 1 (in vitro или in vivo). Способы получения антител Композиция для связывания антитела может быть получена с использованием любого известного из уровня техники способа, в частности химическим синтезом или более предпочтительно методами рекомбинантной экспрессии. Рекомбинантная экспрессия композиции для связывания или ее фрагмента, производного или аналога (например, тяжелая или легкая цепь антитела по изобретению или одноцепочечное антитело по изобретению) требует конструирования вектора экспрессии, содержащего последовательность полинуклеотида, которая кодирует антитело. Как только последовательность полинуклеотида, кодирующая молекулу антитела или тяжелую или легкую цепь антитела, или их части (предпочтительно содержащая вариабельный участок тяжелой или легкой цепи) по изобретению, получена, вектор для выработки молекулы антитела может быть получен известными способами рекомбинации ДНК. Известные из уровня техники способы могут применяться для конструирования векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие композицию для связывания, и подходящие транскрипциональные и трансляциональные контрольные сигналы. Эти способы включают, например, но не ограничиваясь ими, методы рекомбинации ДНК in vitro, синтетические методы и генетическую рекомбинацию in vivo. Изобретение, таким образом, включает способные к репликации векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по изобретению (или его фрагмент) или его тяжелую или легкую цепь, или вариабельный участок тяжелой или легкой цепи, или CDR, функционально связанный с промотором. Такие векторы могут содержать, например, нуклеотидную последовательность, одирующую постоянный участок молекулы антитела (см., например, WO 86/05807; WO 89/01036; или патент США 5122464) и вариабельный участок антитела может быть клонирован в такой вектор для экспрессии полной тяжелой или легкой цепи или какой-либо ее части. В целом, вектор экспрессии переносят в клетку-хозяина обычными методами, и трансфицированные клетки затем культивируют для получения антитела или его части. Таким образом, изобретение также включает, например, клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело по изобретению или его тяжелую или легкую цепь или одноцепочечное антитело по изобретению, функционально связанный с гетерологичным ромотором. В предпочтительных вариантах для экспрессии двухцепочечных антител векторы, кодирующие как тяжелые, так и легкие цепи, могут быть соэкспрессированы в клетке-хозяине для экспрессии полной молекулы иммуноглобулина, как подробно описано в данном описании или известно из уровня техники. Разнообразные системы хозяин-вектор экспрессии могут использоваться для экспрессии молекул антитела по изобретению. Такие системы хозяин-вектор экспрессии представляют носители, с помощью которых любая целевая кодирующая последовательность может быть получена и впоследствии очищена. Однако преобразованные или трансфицированные подходящей кодирующей нуклеотидной последовательностью клетки системы хозяин-вектор экспрессии также могут представлять молекулу антитела по изобретению in situ. Такие клетки включают, например, но не ограничиваясь ими, микроор- 16016038 ганизмы, такие как бактерии (например, E. coli, B. subtilis), преобразованные с помощью рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или векторов экспрессии космидной ДНК, содержащих последовательности, кодирующие антитело; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia), преобразованные с помощью рекомбинантных векторов экспрессии дрожжей, содержащие последовательности, кодирующие антитело; системы клеток насекомого, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирус), содержащими последовательности, кодирующие антитело; системы растительных клеток, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса мозаики табака, TMV) или преобразованные с помощью рекомбинантных плазмидных векторов экспрессии (например, плазмида Ti), содержащими последовательности, кодирующие антитело; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS,CHO, BHK, 293, 3T3), укрывающие рекомбинантные конструкты экспрессии, содержащие промоторы,происходящие из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор вируса коровьей оспы 7.5 K). Предпочтительно для экспрессии рекомбинантной молекулы антитела используют бактериальные клетки, такие как Escherichia coli, и более предпочтительно эукариотные клетки. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомяка (CHO), в соединении с вектором, таким как главный промежуточный ранний элемент промотора гена из цитомегаловируса человека, представляют собой эффективную систему экспрессии антител (Foecking, et al. (1986) Gene 45:101; Cockett, et al. (1990)Bio/Technology 8:2). В бактериальных системах целый ряд векторов экспрессии может быть преимущественно выбран в зависимости от предусмотренного использования экспрессированной молекулы антитела. Например,если должно быть получено большое количество белка, например, для изготовления фармацевтических композиций молекулы антитела, то могут быть желательными векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней продуктов слитого белка, которые можно легко очистить. Такие векторы включают,например, но не ограничиваясь ими, вектор экспрессии E. coli pUR278 (Ruther, et al., EMBO J. 2:1791(1983, в котором антитело, кодирующее последовательность, может быть лигировано индивидуально в вектор каркасе с кодирующим участком lac Z, таким образом, что продуцируется слитый белок; векторыpIN (Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3 101-3 109 (1985); Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989; и т.п. Векторы pGEX также могут использоваться для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион S-трансферазой (GST). В целом, такие слитые белки обладают растворимостью и могут быть легко очищены от лизированных клеток адсорбцией и связыванием с матричными гранулами глутатиона-агарозы с последующей элюацией в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX разработаны для включения, например,тромбина или сайтов расщепления протеазой фактора Xa, таким образом, что клонированный продукт целевого гена может высвобождаться из фрагмента GST. Одна из систем насекомого, которая используется в качестве вектора для экспрессии чужеродного гена, представляет собой систему вируса ядерного полиэдроз Autographa californica (AcNPV). Вирус AcNPV размножается в клетках Spodopteru frugiperda. Последовательность, кодирующая антитело, может быть клонирована индивидуально в несущественные участки вируса (например, ген полиэдрина) и размещена под контролем промотора AcNPV (например,промотор полиэдрин). В клетках-хозяевах млекопитающих может использоваться целый ряд систем экспрессии на основе вирусов. В случаях, где аденовирус используется в качестве вектора экспрессии, целевая последовательность, кодирующая антитело, может быть лигирована с комплексом контроля транскрипции/трансляции аденовируса, например поздний промотор и тройственная лидерная последовательность. Данный химерный ген далее может быть вставлен в геном аденовируса с использованием рекомбинации in vitro или invivo. Вставка в несущественный участок вирусного генома (например, участок E1 или E3) приводит к образованию рекомбинантного вируса, который жизнеспособен и способен экспрессировать молекулу антитела в инфицированных хозяевах (см., например, LoganShenk, 1984 PNAS 8 1:355-9). Специфические сигналы инициации могут потребоваться для эффективной трансляции вставленных последовательностей, кодирующих антитело. Такие сигналы включают, например, кодон инициации ATG и смежные последовательности. Кроме того, кодон инициации должен находиться в фазе с рамкой считывания целевой кодирующей последовательности, чтобы гарантировать надлежащую трансляцию вставки целиком. Такие экзогенные сигналы контроля трансляции и кодоны инициации могут иметь различное происхождение, как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии может быть повышена включением подходящих элементов-энхансеров транскрипции, терминаторов транскрипции и т.п. (см., например, Bittner, et al., 1987 Methods in Enzymol. 153:5 1-4). Кроме того, может быть выбран штамм клеток-хозяев, который модулирует экспрессию вставленной последовательности или изменяет и обрабатывает генный продукт специфическим желательным образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функционирования белка. Различные клетки-хозяева содержат характерные и специфические механизмы посттрансляциональной обработки и модификации белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или сис- 17016038 темы хозяев могут быть выбраны таким образом, чтобы гарантировать правильную модификацию и обработку экспрессированного чужеродного белка. С этой точки зрения могут быть использованы эукариотные клетки-хозяева, клетки которых снабжены механизмами для соответствующей обработки исходного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования. Такие клетки-хозяева, происходящие из млекопитающих, включают, например, но не ограничиваясь ими, CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK,293, 3T3, W138 и, в частности, клеточные линии рака молочной железы, например, BT483, Hs578T,HTB2, BT20 и T47D, и клеточные линии нормальной молочной железы, например, CRL7030 и Hs578Bst. Изобретение включает антитела, слитые рекомбинантными средствами или химически конъюгированные (в том числе как ковалентно, так и нековалентно конъюгированные) с полипептидом (или его частью, более предпочтительно содержащий как минимум 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 смежных аминокислот полипептида) для получения слитых белков. Слияние не обязательно должно быть прямым, но может происходить посредством линкерных последовательностей. Антитела, слитые или конъюгированные с полипептидом, также могут применяться в иммуноанализах in vitro и в способах очищения с применением известных из уровня техники способов (см., например, Harbor, et al., выше, и WO 9312 1232; EP 439095; Naramura et al. (1994) Immunol. Lett. 39:9 1-9; патент США 5474981; Gillies, et al. 1992 PNAS 89:1428-32; Fell, et al. 1991 J. Immunol. 146:2446-52). Изобретение дополнительно включает композиции, содержащие полипептид (или его фрагмент),слитый или конъюгированный с участком антитела, кроме вариабельного участка. Например, полипептид по изобретению (или его фрагмент) может быть слитым или конъюгированным с постоянным участком антитела, участком D или J, участком Fc или частью указанных фрагментов. Часть антитела, которая слита с полипептидом по изобретению (или его фрагментом), может включать постоянный участок,шарнирную область, область CH1, область CH2 и/или область CH3 или какую-либо комбинацию участков в целом или их частей. Полипептид (или его фрагмент) также может быть слитым или конъюгированным с частью антитела, описанной в данном описании, с целью образования мультимеров. Например,части Fc, слитые с полипептидом по изобретению (или его фрагментом), могут образовывать димеры посредством образования дисульфидной связи между частями Fc. Мультимерные формы более высоких классов могут быть получены путем влияния полипептидов с частями IgA и IgM. Способы слияния или конъюгации полипептида по изобретению (или его фрагмента) с частью антитела известны из уровня техники (см., например, патенты США 5336603; 5622929; 5359046; 5349053; 5447851; 5112946; EP 307434; EP 367166; WO 96/04388; WO9106570; Ashkenazi, et al. (1991) PNAS 88:10535-10539; Zheng, et al.(1995) J. Immunol. 154:5590-5600; и Vie, et al. (1992) PNAS 89:11337-11341). Как обсуждено в данном описании, полипептид, фрагмент полипептида может быть слитым или конъюгированным с частью антитела, описанной в данном описании или известной из уровня техники, с целью увеличения периода полувыведения in vivo. В дальнейшем, полипептид, фрагмент полипептида,может быть слитым или конъюгированным с частью антитела для облегчения очистки. В одном примере используются химерные белки, содержащие первые два домена человеческого CD4-полипептида и различные области постоянных участков тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов млекопитающих(см., например, EP 394827; Traunecker, et al. (1988) Nature 33 1:84-86). Во многих случаях часть Fc слитого белка дает преимущество в лечении и диагностике и, таким образом, может приводить, например, к улучшению фармакокинетических свойств (см., например, EPA232, 262). Альтернативно, может отдаваться предпочтение удалению части Fc после того, как слитый белок экспрессирован, обнаружен и очищен. Например, часть Fc может препятствовать осуществлению лечения и диагностики, если слитый белок используется в качестве антигена для иммунизации. При разработке лекарственных средств, например, человеческие белки, такие как hIL-5, сливали с частями Fc для обеспечения высокой производительности скрининговых анализов для идентификации антагонистовChem. 270:9459-9471). Кроме того, композиция для связывания (или ее фрагмент) может быть слита с маркерными последовательностями, такими как пептид, для облегчения очистки. В предпочтительных вариантах аминокислотная последовательность маркер представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, в векторе pQE (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA), многие из которых, в том числе, являются коммерчески доступными. Гексагистидин предусмотрен для традиционной очистки слитого белка (Gentz, et al. (1989)PNAS 86:821-824). Другие пептидные метки, пригодные для очистки, включают, например, метку HA,которая соответствует эпитопу, происходящему из белка гемагглютинина гриппа (Wilson, et al. (1984)Cell 37:767), и метку flag. Изобретение дополнительно включает антитела или их фрагменты, конъюгированные с диагностическим или терапевтическим агентом. Антитела могут применяться с диагностической целью, например,для отслеживания развития или прогрессирования опухоли как части клинической процедуры обследования для определения эффективности схемы лечения. Обнаружение может быть облегчено путем соединения антитела с субстанцией, которая поддается обнаружению. Примеры субстанций, которые поддаются обнаружению, включают, например, различные ферменты, простетические группы, флуорес- 18016038 центные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, испускающие позитрон металлы с применением различных видов позитрон-эмиссионной томографии, а также ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов. Субстанция, которая поддается обнаружению, может быть связана или конъюгирована непосредственно с антителом (или его фрагментом) или косвенно, через промежуточное соединение (например, известный из уровня техники линкер) с применением признанных методов (см., например, патент США 4741900 относительно металлических ионов, которые могут конъюгироваться с антителами для применения в диагностике по изобретению). Примеры подходящих ферментов включают, не ограничиваясь ими, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры комплексов подходящих простетических групп включают, не ограничиваясь ими, стрептавидин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают, не ограничиваясь ими, умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, флуоресцеин дихлортриазиниламин, данзил хлорид или фикоэритрин; примеры люминесцентного материала включают, не ограничиваясь ими, люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают, не ограничиваясь ими, люциферазу, люциферин и экворин; и примеры подходящего радиоактивного материала включают, например, I125, I131, I111 или Tc99. Композиция для связывания по изобретению также может быть присоединена к твердым подложкам, которые особенно пригодны для иммуноанализов или очищения целевого антигена. Такие твердые поддержки включают, например, но не ограничиваясь ими, стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон,полистрол, поливинилхлорид или полипропилен. Способы конъюгации терапевтического фрагмента с антителом известны, см., например, Amon, et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InB. Иммуноанализы. Содержание конкретного белка, такого как TGF-бета 1, может быть измерено с помощью различных методов иммуноанализа, например, но не ограничиваясь ими, систем конкурентного и неконкурентного анализа с использованием таких методов, как, не ограничиваясь ими, вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализы, ELISA (твердофазный иммуносорбентный анализ), сэндвичевые иммуноанализы, анализы иммунопреципитации, реакции осаждения преципитирующим антителом, реакции осаждения преципитирующим антителом путем диффузии в геле, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализы фиксации добавления, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы и иммуноанализы с использованием протеина A. Обзоры иммунологических методов и методик иммуноанализа в целом см. Stites and Terr (eds.) (1991) Basic and Clinical Immunology (7th ed.). Более того, иммуноанализы по изобретению могут осуществляться во многих конфигурациях, которые обширно рассматриваются в Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Gosling J P 2000 Immunoassays: A Practical Approach (Practical Approach Series) Oxford Univ Press; DiamandisChristopoulus,1996 Immunoassay Academic Press, San Diego, CA; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; Wild, D. (Ed.), 2001 The Immunoassay Handbook (2nd edition) Nature Pub Group; James T. Wu, 2000Plenum Press, NY. Иммуноанализы для измерения могут выполняться разнообразными способами, известными из уровня техники. Если коротко, иммуноанализы для измерения содержания белка могут представлять собой анализы конкурентного или неконкурентного связывания. В конкурентных анализах связывания подлежащий анализу образец конкурирует с меченым анализируемым веществом за конкретные сайты связывания на улавливающем агенте, связанном с твердой поверхностью. Предпочтительно улавливающий агент представляет собой антитело, которое специфично реагирует с белком TGF-бета 1, как описано в данном описании. Концентрация меченого анализируемого вещества, связанного с улавливающим агентом, является обратно пропорциональной количеству свободного анализируемого вещества, присутствующего в образце. В иммуноанализе конкурентного связывания целевой белок, присутствующий в образце, конкурирует с меченым белком за связывание с конкретной композицией для связывания, например композицией для связывания, такой как антитело, которая специфично и/или селективно реагирует с целевым бел- 19016038 ком. Композиция для связывания может быть связана с твердой поверхностью для осуществления отделения связанного меченого белка от несвязанного меченого белка. Альтернативно, анализ конкурентного связывания может проводиться в жидкой фазе, и разнообразные методы, известные из уровня техники,могут применяться для отделения связанного меченого белка от свободного меченого белка. После отделения определяют количество несвязанного меченого белка. Количество белка, присутствующее в образце, обратно пропорционально количеству связанного меченого белка. Альтернативно, может быть осуществлен гомогенный иммуноанализ, где нет необходимости в стадии отделения. В таких иммуноанализах метка на белке изменяется при связывании белка со специфичной композицией для связывания. Такое изменение меченого белка приводит к уменьшению или увеличению сигнала, испускаемого меткой, таким образом, что измерение метки в конце иммуноанализа позволяет осуществить обнаружение или количественную оценку белка. Конкурентные анализы также особенно пригодны, если клетки контактируют и инкубируются с меченым партнером по связыванию или антителом, обладающим известным сродством связывания к белку,таким как 125I-антитело, и исследуемым образцом, для которого подлежит измерению сродство связывания с композицией для связывания. Затем связанную и свободную меченые композиции для связывания отделяют, чтобы оценить степень связывания белка. Количество связанного исследуемого соединения обратно пропорционально количеству меченого партнера по связывания, связанного с известным источником. Любой из многочисленных методов может использоваться для отделения связанного от свободного белка, чтобы оценить степень связывания белка. Данная стадия отделения обычно может включать такие процедуры, как адгезия к фильтрам с последующим промыванием, адгезия к пластику с последующим промыванием или центрифугированием клеточных мембран. Жизнеспособные клетки также могли бы использоваться для скрининга на предмет влияния лекарственных средств на опосредованную белком TGF-бета функцию (например, уровни вторичного мессенджера, например, пролиферация клеток; изменения пула инозитола фосфата, транскрипция с использованием анализа по типу люциферазы; и другие). Некоторые способы обнаружения позволяют устранить стадию отделения, например чувствительная к близости система обнаружения. Качественный или количественный анализ белков также может осуществляться различными неконкурентными методами иммуноанализа. Например, может применяться двухсайтовый твердофазный сэндвичевый иммуноанализ. В данном виде анализов композиция для связывания белка, например антитело,присоединена к твердой подложке. Вторая композиция для связывания белка, которая также может представлять собой антитело и которая связывается с белком на другом сайте, содержит метку. После того как произошло связывание на обоих сайтах белка, свободную меченую композицию для связывания удаляют и измеряют количество меченой композиции для связывания, связанной с твердой фазой. Количество связанной меченой композиции для связывания является прямо пропорциональным количеству белка в образце. В описанных выше форматах иммуноанализа используют меченые компоненты анализы. Метка может быть связана прямо или косвенно с целевым компонентом анализа в соответствии со способами,хорошо известными из уровня техники. Могут использоваться разнообразные метки и способы. Традиционно, используют радиоактивную метку с инкорпорированным 3H, 125I, 35S, 14C или 32P. Нерадиоактивные метки включают белки, которые связаны с мечеными антителами, флюорофорами, хемилюминесцентными агентами, ферментами и антителами, которые могут выступать в роли парных членов специфического связывания для меченого белка. Выбор метки зависит от необходимой чувствительности, легкости конъюгирования с соединением, требований стабильности и доступных инструментов. Обзор различных меток или систем генерации сигнала, которые могут быть использованы, см. в патенте США 4391904. Композиции для связывания антитела, которые реагируют с конкретным белком, также могут быть измерены разнообразными методами иммуноанализа. Обзор иммунологических методов и методик иммуноанализа, пригодных для измерения антител методами иммуноанализа, см. в Stites and Terr (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.), выше; Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, выше; и Harlow and LaneUsing Antibodies, A Laboratory Manual, выше. Если коротко, иммуноанализы для измерения антисывороток, реагирующих с целевым белком, могут представлять собой анализы конкурентного или неконкурентного связывания. В анализах конкурентного связывания образец анализируемого вещества конкурирует с меченым анализируемым веществом за специфические сайты связывания на улавливающем агенте, связанном с твердой поверхностью. Предпочтительно улавливающий агент представляет собой очищенный рекомбинантный белок. Также могут использоваться другие источники белков, в том числе изолированный или частично очищенный природный белок. Неконкурентные анализы включают сэндвичевые анализы, в которых образец анализируемого вещества связывается двумя специфическими для анализируемого вещества реактивами связывания. Одна из композиций для связывания используется в качестве улавливающего агента и связана с твердой поверхностью. Вторая композиция для связывания содержит метку и используется для измерения или обнаружения образующегося комплекса визуальными или инструментальными средствами. Может использоваться ряд комбинаций улавливающего агента и меченой композиции для связывания. Множество- 20016038 различных форматов иммуноанализа, методов отделения и меток может использоваться подобно описанному выше для измерения белка. Способность целевого антитела к иммунопреципитации конкретного антигена может быть оценена,например, с помощью вестерн-блоттинга. Среднему специалисту в данной области хорошо известны параметры, которые могут быть модифицированы, чтобы увеличить связывание антитела с антигеном и уменьшить фон (например, перед осветлением лизата клеток с гранулами сефарозы). Дальнейшее обсуждение протоколов иммунопреципитации может быть найдено, например, в Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John WileySons, Inc., New York. Анализ ELISA включает подготовку антигена, покрытие лунки 96-луночного планшета для микротитрования антигеном, добавление целевого антитела интереса, конъюгированного с поддающимся обнаружению соединением, таким как субстрат фермента (например, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза), в лунку, инкубация в течение периода времени и обнаружение присутствия антигена. В анализах ELISA целевое антитело не должно быть конъюгировано с поддающимся обнаружению соединением; вместо этого второе антитело (которое распознает целевое антитело), конъюгированное с поддающимся обнаружению соединением, может быть добавлено в лунку. Кроме того, вместо покрытия лунки антигеном, она может быть покрыта антителом. В данном случае может быть добавлено второе антитело,конъюгированное с поддающимся обнаружению соединением, с последующим добавлением целевого антигена к покрытой лунке. Средний специалист может определить без лишнего экспериментирования,какие параметры модифицировать, например, чтобы увеличить сигнал, а также какие другие вариации метода ELISA необходимо использовать (см., например, Ausubel, et al., eds., 1994, Current Protocols inMolecular Biology, Vol. 1, John WileySons, Inc., New York). Сродство связывания антитела с антигеном, а также скорость ассоциации и диссоциации в ходе взаимодействия антиген/антитело может быть определена, например, с использованием анализа конкурентного связывания. Неограничивающий пример представляет собой радиоиммуноанализ, включающий инкубацию меченого антигена (например, с использованием H или I) с целевым антителом в присутствии повышенных количеств немеченого антигена, с последующим обнаружением количества антитела, связанного с меченым антигеном. Сродство целевого антитела к конкретному антигену и скорость диссоциации могут быть определены на основе данных, например анализ графика Скатчерда (Scatchard). Конкуренция со вторым антителом также может быть определена с использованием, например, радиоиммуноанализа. В данном случае антиген инкубируют с целевым антителом, конъюгированным с меченым соединением (например, 3H или 125I) в присутствии повышенного количества немеченого второго антитела. Физические варианты Изобретение также включает полипептидные последовательности, обладающие значительным сходством и/или идентичностью с аминокислотными последовательностями, описанными в данном описании. Сходство или идентичность аминокислотных последовательностей определяют, оптимизируя остаточные пары. Оно изменяется, если рассматривать консервативные замены как пары. Консервативные замены обычно включают замены в пределах следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; а также фенилаланин, тирозин. См. также Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, etChapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; а также пакеты программного обеспечения IntelliGenetics,Mountain View, CA; и University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. Изобретение включает, но не ограничиваясь ими, полипептидные последовательности, которые функционально связаны с полипептидом, который кодируется конкретным идентификатором последовательности в соответствии с данной заявкой. Функционально связанные полипептиды включают любой полипептид, разделяющий функциональную характеристику с композицией для связывания (например,способность селективно и/или специфично связываться с TGF-бета 1 и не связываться с TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3). Такие функционально связанные полипептиды включают, но не ограничиваясь ими,вставки или замены аминокислотных остатков в пределах аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностями, описанными в данном описании; особенно те, которые приводят к молчащему изменению, таким образом, образуя функционально равноценный полипептид. Замены аминокислот могут быть сделаны на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности,гидрофильности и/или амфифильной природы вовлеченных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин,пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают глицин,серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Кроме того, неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислот могут быть заменены или добавлены в последовательность полипептида. Неклассические аминокислоты включают, например, но не ограничиваясь ими, D-изомеры распространенных аминокислот; 2,4-диаминомасляную- 21016038 кислоту; -аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, Abu, 2-аминомасляную кислоту, gAbu, e-Ahx, гексановую аминокислоту, Aid, 2-аминомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту,орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллиновую кислоту, гомоцитруллин,цистиновую кислоту, t-бутилглицин, t-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, b-аланин, аминокислоты, такие как -метиловые фторированные аминокислоты, конструированные аминокислоты, такие как b-метиламинокислоты, Ca-метиловые аминокислоты, Na-метиловые аминокислоты, а также аналоги аминокислот в целом. Кроме того, аминокислота может быть правовращающей (D) или левовращающей(L). Вставки пептидных фрагментов с целью удобства обращения представляют собой известные из уровня техники шаблонные методы. Кроме того, композиция для связывания (в том числе какой-либо ее фрагмент, и, конкретно, эпитоп) может быть объединена с частями постоянного домена иммуноглобулина, например (IgA, IgE, IgG, IgM), его частями (CH1, CH2, CH3) и любой их комбинацией, включая как участки целиком, так и их части), с образованием химерного полипептида. Такие слитые белки могут облегчить очистку и часто пригодны для увеличения периода полувыведения белка in vivo. Например,это продемонстрировано для химерных белков, содержащих два первых домена человеческого полипептида CD4 и различные домены постоянных участков тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов млекопитающих (EP 394827; Traunecker, et al., 1988 Science 331:84-6). Слитые белки со связанной дисульфидными связями димерной структурой (за счет домена IgG) также могут быть более эффективны с точки зрения связывания и нейтрализации других молекул, чем секретированный мономерный белок или отдельный фрагмент белка (Fountoulakis, et al. 1995 J. Biochem.15 270:3958-64). Увеличенная доставка антигена сквозь эпителиальный барьер в иммунную систему продемонстрирована для антигенов (например, инсулина), конъюгированных с партнером по связыванию Fey, таким как фрагменты IgG или Fc(см., например, WO 96/22024 и WO 99/104813). Дополнительно, слитый белок может включать различные части постоянного участка молекулы иммуноглобулина вместе с человеческим белком (или его частью). Во многих случаях часть Fc в слитом белке дает преимущество в лечении и диагностике и, таким образом, может приводить, например, к улучшенным фармакокинетическим свойствам. Альтернативно, может быть желательным удаление части Fc после того, как слитый белок экспрессирован, обнаружен и очищен. Например, часть Fc может препятствовать лечению и/или диагностике, если слитый белок используется в качестве иммуногенного средства для иммунизации. При разработке лекарственных средств, например, человеческие белки сливали с частями Fc для обеспечения высокой производительности скрининговых анализов для идентификации антагонистов. Кроме того, новые конструкции могут быть изготовлены путем сочетания сходных функциональных доменов из других белков. Например, связывающие белок или другие сегменты могут быть переставлены между различными новыми слитыми полипептидами или фрагментами. Таким образом, новые химерные полипептиды, проявляющие новые комбинации специфичности, будут получены в результате функционального соединения специфичности связывания белка и других функциональных участков. Дополнительно, слитые конструкции могут быть генерированы посредством методов перетасовки генов, перетасовки мотивов, перетасовки экзонов и/или перетасовки кодонов. В существенной мере чистый означает нуклеиновую кислоту, белок или полипептид, которые извлечены из их естественного окружения и изолированы и/или отделены от других загрязняющих белков,нуклеиновых кислот и другого биологического материала. Чистота или выделение может быть проанализирована стандартными способами и обычно будет составлять как минимум приблизительно 50%, более обычно как минимум приблизительно 60%, в общем как минимум приблизительно 70%, более в общем как минимум приблизительно 80%, часто как минимум приблизительно 85%, чаще как минимум приблизительно 90%, более предпочтительно как минимум приблизительно 95%, более предпочтительно как минимум приблизительно 98% и в большинстве предпочтительных вариантов как минимум 99%. Подобные понятия применяют, например, к композициям для связывания, например, таким как антитела по изобретению. Например, это может быть желательным для очистки полипептида от рекомбинантных клеточных белков или полипептидов. Растворимость белка или полипептида отображается осаждением, измеренным в единицах Сведберга, которые являются мерой скорости осаждения молекулы в конкретных условиях. Определение скорости осаждения классически выполняли в аналитической ультрацентрифуге, но на сегодняшний день его обычно проводят в стандартной ультрацентрифуге (см., Freifelder 1982 Physical Biochemistry (2dEd.) W.H. FreemanCo., San Francisco, CA; and Cantor and Schimmel (1980) Biophysical Chemistry parts 13, W.H. FreemanCo., San Francisco, CA). Для приблизительного определения образец, содержащий предполагаемый растворимый полипептид, центрифугируют в стандартной полноразмерной ультрацентрифуге приблизительно при 50 тыс. об./мин в течение приблизительно 10 мин, и растворимые молекулы остаются в супернатанте. Растворимая частица или полипептид типично будет составлять меньше приблизительно 30S, более типично меньше приблизительно 15S, обычно меньше приблизительно 10S, более обычно меньше приблизительно 6S и, в конкретных вариантах, предпочтительно меньше приблизи- 22016038 тельно 4S, и более предпочтительно меньше приблизительно 3S. Растворимость полипептида или фрагмента зависит от среды и полипептида. На растворимость полипептида воздействует много параметров, в том числе температура, электролитное окружение, размер и молекулярные характеристики полипептида,а также природа растворителя. Обычно, температура, при которой используется полипептид, варьирует от приблизительно 4C до приблизительно 65C. Обычно температура использования составляет больше приблизительно 18C и обычнее больше приблизительно 22C. В случае диагностических целей температура обычно будет комнатной или теплее, но ниже температуры денатурирования компонентов в анализе. В случае терапевтических целей температура обычно будет являться температурой тела человека,обычно приблизительно 37C, однако в конкретных ситуациях температура может быть выше или нижеin situ или in vitro. Размер и структура полипептида в целом должны находиться в существенной мере в устойчивом состоянии и обычно не в денатурированном состоянии. Полипептид может быть связан с другими полипептидами в четвертичной структуре, например, для обеспечения растворимости, или связан с липидами или детергентами способом, который приближает его к природным липидным двухслойным взаимодействиям. Растворитель обычно будет представлять собой биологически совместимый буфер типа, используемого для сохранения биологической активности, и обычно будет приближаться к физиологическому растворителю. Обычно растворитель будет иметь нейтральное значение рН, обычно приблизительно в интервале 5-10 и более предпочтительно приблизительно 7,5. В некоторых случаях будет добавляться детергент, обычно мягкий не денатурирующий детергент, например CHS (гемисукцинат холестерина) или CHAPS (3-[3-хлорамидопропил)-диметиламмоний]-1-пропан сульфонат), или в достаточно низкой концентрации во избежание существенного нарушения структурных или физиологических свойств белка. В предпочтительном варианте растворимость композиции для связывания по изобретению (pH 5,0-6,0 и 150 мМ NaCl) превышает 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 мг/мл; в более предпочтительном варианте превышает 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 мг/мл; в еще более предпочтительном варианте превышает 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 мг/мл, в даже более предпочтительном варианте превышает 65, 70, 7 5,80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 или 150 мг/мл (или в интервале между любыми двумя из указанных значений, причем интервал может включать или не включать одну или обе конечные точки). Варианты Изобретение направлено на полипептиды, которые включают или, альтернативно, состоят из аминокислотной последовательности, которая является как минимум на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% идентичной, например, последовательности полипептида по изобретению (или его фрагментов). Определение того, проявляет ли конкретная последовательность идентичность по отношению к последовательности композиции для связывания, может быть осуществлено с использованием известных из уровня техники способов. Обычно, при таком сравнении последовательностей одна последовательность выполняет роль справочной последовательности, с которой сравнивают исследуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей исследуемые и справочные последовательности вводят в компьютер, при необходимости присваивают последовательные координаты и указывают параметры алгоритма программы последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процентную идентичность исследуемой(ых) последовательности(ей) относительно справочной(ых) последовательности(ей) на основании параметров обозначенной программы. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может осуществляться, например,с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, алгоритма гомологии выравнивания Needlman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, поиском по методу сходства Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444, компьютерной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics ComputerGroup, 575 Science Dr., Madison, WI), набора для биоинформатических расчетов LASERGENE, производимого DNASTAR (Мэдисон, Висконсин), способов выравнивания множественных последовательностей, разработанных Notredame, et al. (например, 3Dcoffee или Tcoffee, например, в Nucleic Acids Res. 2004:32(Web Server issue):W37-40; Nucleic Acids Res. 2003 Jul 1;31 (13): 3503-6; или Pharmacogenomics. 2002 Jan;3(1):131-4); или визуальной проверкой (в общем, см. Ausubel, et al., выше). Хорошо известны другие способы сравнения нуклеотидных или аминокислотных последовательностей путем определения оптимального выравнивания (см., например, Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: ToolsPress, Inc. 1997); или Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998. Полипептид, демонстрирующий или содержащий как минимум приблизительно, например, 95% идентичности последовательности с другой аминокислотной последовательностью, может включать,например, до пяти изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот подряд исследуемой аминокис- 23016038 лотной последовательности. Другими словами, первая аминокислотная последовательность, которая является как минимум на 95% идентичной второй аминокислотной последовательности, может содержать до 5% от общего количества аминокислотных остатков, отличающихся от второй последовательности,например, вставкой, делецией или заменой аминокислотного остатка. Изменения в аминокислотных остатках последовательности полипептида могут происходить, например, в амино- или карбоксиконцевых положениях или в любом месте между этими концевыми положениями, вставлены в промежутки вразброс или отдельно среди остатков в последовательности или в одном или больше остатков, частей или фрагментов из смежных аминокислот в пределах последовательности. На практике, демонстрирует ли какая-либо конкретная последовательность полипептида как минимум приблизительно 80, 85, 90, 95, 96,97, 98 или 99% сходство с другой последовательностью, например, такой как показано в табл. в данном описании, может быть определено с использованием известных из уровня техники способов. Варианты, включенные в изобретение, могут содержать изменения в кодирующих участках, не кодирующих участках или обоих. Кроме того, варианты, в которых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот заменены, удалены или добавлены в какую-либо комбинацию, также являются предпочтительными. Не встречающиеся в природе варианты могут быть получены методами мутагенеза или прямым синтезом с использованием известных способов инженерии белка и технологии рекомбинации ДНК. Такие варианты могут быть получены для того, чтобы улучшить или изменить характеристики полипептида композиции для связывания (или его фрагмента). Например, одна или больше аминокислот может быть удалена с N-конца или C-конца выделенного полипептида по изобретению (или его фрагмента) без значительного снижения биологической функции. Например, Ron, et al. 1993 J. Biol. Chem. 268:2984-8, сообщают о различных белках KGF, обладающих гепарин-связывающей активностью даже после удаление 3, 8 или 27 аминоконцевых аминокислотных остатков. Например, антигенность и/или иммуногенность может сохраняться (например, способность варианта с делецией индуцировать и/или связываться с антителами,которые распознают зрелую форму полипептида), когда меньше, чем большинство остатков секретированной формы удалены с N-конца или C-конца. Сохраняет ли полипептид, в котором удалены Nконцевые или C-концевые остатки белка, такую активность, может быть легко определено шаблонными способами, описанными в данном описании или известными из уровня техники. Таким образом, изобретение также включает, например, варианты полипептида, которые демонстрируют биологическую активность, например иммуногенность или антигенность. Такие варианты включают, например, делеции,вставки, инверсии, повторения и замены, выбранные таким образом, чтобы оказывать незначительное влияние на активность, с использованием общих правил, известных из уровня техники. Например, указания по созданию фенотипически молчащих замен аминокислот предложены, например, в Bowie, et al.(1990) Science 247: 1306-1310. Помимо использования консервативных замен аминокислот, другие варианты по изобретению включают, например, но не ограничиваясь ими, (i) замены с одним или больше неконсервативных аминокислотных остатков, где замененные аминокислотные остатки могут или не быть такими, которые кодируются генетическим кодом, или (ii) замены одного или больше аминокислотных остатков, содержащих группу заместителя, или (iii) слияние зрелого полипептида с другим соединением, таким как соединение с повышенной стабильностью и/или растворимостью полипептида (например, полиэтиленгликоль), или (iv) слияние полипептида с дополнительными аминокислотами, например пептид со слитым участком Fc IgG, или лидерной или секреторной последовательностью или последовательностью, которая облегчает очистку. Все такие варианты находятся в пределах навыков специалистов в данной области молекулярной биологии, приведенных в данном описании указаний заявителя, например, конкретизации уникальных последовательностей полинуклеотида и полипептида. Например, варианты полипептида, содержащие замены заряженных аминокислот на другие заряженные или нейтральные аминокислоты, могут давать полипептиды с улучшенными характеристиками,например меньшей агрегацией. Агрегация фармацевтических препаратов как снижает активность, так и повышает клиренс за счет иммуногенной активности агрегата (Pinckard, et al. (1967) Clin. Exp. Immunol. 2:331-340; Robbins, et al. (1987) Diabetes 36:838-845; Cleland, et al. (1993) Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377). В предпочтительном варианте композиция для связывания по изобретению,введенная в подходящую систему pH/буфер (как описано в данном описании или известно из уровня техники), не демонстрирует значительной агрегации после инкубации как минимум в течение 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8 или 9 месяцев в температурных условиях в интервале 1-10C, более предпочтительно 2-8C, даже более предпочтительно 3-7C и даже более предпочтительно 5-6C. Другой вариант изобретения включает композицию, которая содержит аминокислотную последовательность по изобретению, содержащую как минимум одну замену аминокислоты, но не более чем 50 замен аминокислот, даже более предпочтительно не более чем 40 замен аминокислот, все еще более предпочтительно не более 30 замен аминокислот и все еще даже более предпочтительно не более 20 замен аминокислот и не более 15 замен аминокислот. Конечно, в порядке увеличения предпочтительности,для пептида или полипептида чрезвычайно предпочтительно содержать аминокислотную последовательность, которая включает аминокислотную последовательность по изобретению, которая содержит как- 24016038 минимум: одну, но не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен аминокислот. В конкретных вариантах число вставок, замен и/или делеций в последовательности полипептида по изобретению или его фрагментов составляет как минимум: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25, 10-50 или 50-150; где консервативные замены аминокислот являются более предпочтительными,чем неконсервативные замены. Терапевтическое применение Данное изобретение также обеспечивает реагенты, пригодные для применения с терапевтической целью. Терапевтические композиции для связывания по изобретению включают, например, но не ограничиваясь ими, композиции для связывания антитела по изобретению (в том числе их фрагменты, аналоги и производные, как описано в данном описании) и кодирующие их молекулы нуклеиновых кислот (в том числе их фрагменты, аналоги и производные, а также анти-идиотипические антитела, как описано в данном описании). Такое антитело может применяться для модуляции, лечения, регрессии, облегчения или предупреждения заболевания, расстройства или состояния, связанных с аномальной экспрессией и/или активностью TGF-бета 1 (или его фрагмента), в том числе, например, но не ограничиваясь ими,одно или больше заболеваний, расстройств, синдромов или состояний, описанных в данном описании. Лечение, облегчение и/или предотвращение заболеваний, расстройств или состояний, связанных с аномальной экспрессией и/или активностью TGF-бета 1, включают, например, но не ограничиваясь ими,облегчение симптомов, связанных с такими заболеваниями, расстройствами или состояниями. Например, заболевание или расстройство, связанное с аномальной экспрессией или аномальным проведением сигнала TGF-бета 1, представляет собой мишень для антагониста TGF-бета 1, такого как композиция для связывания по изобретению. Изобретение включает терапии на основе композиций для связывания, которые включают введение композиции для связывания животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно примату (например, человеку) с целью модулирования, лечения, регрессии, влияния или облегчения одного или больше раскрытых заболеваний, расстройств или состояний, описанных в данном описании. Например, не привязываясь к теории, показано, что специфичные в отношении человеческого TGF-бета антитела являются эффективными на животных моделях с точки зрения лечения заболеваний, при которых наблюдается чрезмерная экспрессия рецептора TGF(TGFR). Показано, что антисыворотка против TGF-бета является эффективной с точки зрения лечения гломерулонефрита (Border, et al. 1990 Nature 346:371-4) и фиброза легкого (Giri, et al. 1993 Thorax 48:95966). Таким образом, новые композиции для связывания по изобретению с улучшенными характеристиками также были бы эффективны для облегчения расстройств, состояний или заболеваний, например фиброзных заболеваний и состояний, связанных с TGF-бета 1. Рекомбинантные и/или изолированные композиции для связывания по изобретению, например антитела, могут быть очищены и введены субъекту для лечения. Эти реактивы могут сочетаться для применения с дополнительными активными или инертными ингредиентами, например, в традиционных фармацевтически приемлемых носителях или наполнителях, например иммуногенных адъювантах, наряду с физиологически инертными стабилизаторами и вспомогательными веществами. Такие комбинации могут быть стерилизованы фильтрацией и введены в лекарственные формы как путем лиофилизации в однодозовых флаконах или хранения в стабилизированных водных препаратах. Данное изобретение также включает применение антител или их связывающихся фрагментов, в том числе форм, которые не связывают комплемент. Другой терапевтический подход, который находится в рамках данного изобретения,включает прямое введение субъекту реактивов, препаратов или композиций какими-либо традиционными способами введения (например, но не ограничиваясь ими, местной инъекцией, ингаляцией или системным введением). Изобретение также предлагает фармацевтический пакет или набор, содержащий один или больше контейнеров, наполненных одним или больше ингредиентов композиций по изобретению, и инструкции, например, по применению (обычно в форме, предписанной правительственным органом, который регулирует производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов). Способы введения включают внутривенное, внутрибрюшное или внутримышечное введение, трансдермальную диффузию и т.д. Фармацевтически приемлемые носители включают воду, солевой раствор, буферы и другие описанные смеси, например, в Merck Index, MerckCo.,Rahway, NJ. Другие аномальные состояния развития, включенные в данное описание, известны для типов клеток, для которых с помощью нозерн-блоттинга показано наличие TGF-бета 1 мРНК (см., например, Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, MerckCo., Rahway, N.J.; Thorn et al. Harrison'sPrinciples of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; and Rich (ed.) Clinical Immunology; Principles and Practice, Mosby, St. Louis (cur. ed.); и ниже). Аномалии развития или функциональные аномалии (например,нейронной, иммунной или гемопоэтической системы) вызывают существенные с медицинской точки зрения отклонения и состояния, которые могут быть восприимчивыми к профилактике или лечению с применением композиций, предложенных в данном описании. Другой терапевтический подход, который находится в рамках изобретения, включает прямое введение реактивов, препаратов или композиций любыми традиционными способами введения (например,но не ограничиваясь ими, местной инъекцией, ингаляцией или систематическим введением) субъекту.- 25016038 Включенные реактивы, препараты или композиции могут быть получены любым способом, описанным в данном описании или известным из уровня техники. Фактическая дозировка реактива, препарата или композиции, которая модулирует заболевание, расстройство, состояние, синдром и т.п., зависит от многих факторов, в том числе размера и состояния здоровья организма, однако средний специалист в данной области может использовать следующие указания, описывающие способы и методы определения клинической дозировки (см., например, Spilker (1984) Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Ravened., Williams and Wilkins, Baltimore, pp. 50-56; Tallarida, et al. (1988) Principles in General Pharmacology,Springer-Verlag, New York, pp. 18-20; и патенты США 4657760; 5206344; или 5225212). В целом, конечная концентрация в интервале приблизительно от 0,5 фг/мл до 500 мкг/мл в сутки вводится взрослому человеку в каком-либо фармацевтически приемлемом носителе. Кроме того, эксперименты на животных обеспечивают надежное руководство для определения эффективных доз в лечении человека. Межвидовое масштабирование эффективных доз может выполняться в соответствии с известными из уровня техники принципамиand New Drug Development; Yacobi, et al. (eds.) Pergamon Press, NY). Эффективные дозы также могут быть экстраполированы с использованием кривых доза-реакция,полученных на основе экспериментов in vitro или на животных моделях. Например, для антител дозировка обычно составляет от 0,1 до 100 мг/кг массы тела реципиента. Предпочтительно дозировка составляет от 0,1 до 20 мг/кг массы тела реципиента, более предпочтительно от 1 до 10 мг/кг массы тела реципиента. В общем, гомоспецифические антитела демонстрируют более длинный период полувыведения,чем гетероспецифические антитела (например, человеческие антитела дольше остаются в организме хозяина-человека, чем антитела других видов, например, таких как мышь, вероятно, из-за иммунной реакции хозяина на чужеродную композицию). Таким образом, часто дозы человеческих антител могут быть ниже с большими промежутками времени между введением отдельных доз, если антитела вводят субъекту-человеку. Кроме того, дозы и частота введения антител по изобретению могут быть уменьшены при увеличении захвата и проникновения в ткани (например, в мозг) с использованием модификации, например липидирования. Изобретение также предлагает фармацевтический пакет или набор, содержащий один или больше контейнеров, наполненных одним или больше ингредиентов композиций по изобретению, и инструкции,например, по применению (обычно в форме, предписанной правительственным органом, который регулирует производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов). Количества реактивов, необходимых для эффективного лечения, будут зависеть от множества факторов, в том числе способа введения, целевой области, физиологического состояния больного и сопутствующего введения других лекарственных средств. Таким образом, дозы для лечения следует титровать для оптимизации безопасности и эффективности. Обычно дозы, применяемые in vitro, могут обеспечить полезные указания относительно количеств этих реактивов, пригодных для введения in situ. Проверка эффективных доз для лечения конкретных расстройств на животных обеспечит дальнейшие прогностические указания в отношении доз для человека. Различные соображения описаны, например, в Gilman, etal. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergamon Press; и (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA. Способы введения обсуждаются в данном описании, здесь и ниже, например, для перорального, внутривенного, внутрибрюшинного или внутримышечного введения, трансдермальной диффузии и др. Фармацевтически приемлемые носители включают воду, солевой раствор, буферы и другие описанные смеси, например, в Merck Index, MerckCo., Rahway, NJ. Обычно ожидается, что интервалы доз находятся в пределах ниже концентрации 1 мМ, обычно меньше концентрации приблизительно 10 мкм,обычно меньше приблизительно 100 нМ, предпочтительно меньше приблизительно 10 пМ (пикомоль) и наиболее предпочтительно меньше приблизительно 1 фМ (фемтомоль) с подходящим носителем. Препараты замедленного высвобождения или устройства для замедленного высвобождения часто применяются для непрерывного длительного введения. Композиции для связывания могут вводиться непосредственно хозяину, который подлежит лечению, или, в зависимости от размера соединений, может быть желательным перед введением конъюгировать их с белками-носителями, такими как яичный белок или альбумин сыворотки. Терапевтические препараты могут быть введены в любой традиционной лекарственной форме. Хотя активный ингредиент можно вводить отдельно, предпочтительно ввести его в лекарственную форму. Препараты обычно включают как минимум один активный ингредиент, как определено в данном описании, вместе с одним или больше приемлемыми для него носителями. Каждый носитель должен быть как фармацевтически, так и физиологически приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами и безвредности для пациента. Препараты включают пригодные для перорального, ректального, назального или парентерального введения (в том числе подкожного, внутримышечного, внутривенного и внутрикожного). Препара- 26016038 ты могут быть представлены в форме дозированных лекарственных форм и могут быть изготовлены любыми способами, хорошо известными из уровня техники в фармацевтической области. См., например,Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergamon Press; and (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA;(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; и Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. Лечение по данному изобретению может быть комбинированным или сопутствующим с другими терапевтическими агентами, например ингибиторами АПФ. Изобретение также предлагает фармацевтическую композицию. Такая композиция включает, например, терапевтически эффективное количество композиции по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе. В данном описании термин фармацевтически приемлемый носитель подразумевает носитель, одобренный федеральным регуляторным органом Соединенных Штатов Америки или контролирующим/административным органом правительства штата Соединенных штатов, или носитель, который описан в Фармакопее США или другой фармакопее; который общепризнан в уровне техники для применения у животного, например, млекопитающего, и, более конкретно, у примата, например гуманоидного примата. Термин носитель в данном описании означает разбавитель, адъювант, вспомогательное вещество или носитель, который вводят с композицией по изобретению. Фармацевтический носитель обычно может представлять собой стерильную жидкость, такую как вода или масла (в том числе из нефти, а также животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п.). Обычно, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно, предпочтительным носителем является стерильная вода. Солевые растворы и водные растворы глюкозы и глицерина также могут использоваться как жидкие носители, особенно для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают, например, но не ограничиваясь ими, крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, натрия стеарат, моностеарат глицерина, тальк, натрия хлорид, сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль,воду, этанол и т.п. При желании композиция по изобретению может также содержать незначительные количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или буферных агентов для коррекции pH. Композиция по изобретению может находиться в растворе, суспензии, эмульсии, таблетке, пилюле,капсуле, порошке, препарате замедленного высвобождения и т.п., или она может иметь форму суппозитория (с традиционными связующими агентами и/или носителями, например, такими как триглицериды). Дополнительные примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в действующем изданииRemington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin. Такие препараты будут содержать терапевтически эффективное количество композиции по изобретению, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить надлежащее введение субъекту. Традиционно препарат соответствует способу введения. В предпочтительном варианте композицию вводят в лекарственную форму в соответствии с шаблонными процедурами как фармацевтическую композицию, адаптированную для внутривенного введения, например, человеку. Обычно композиции для внутривенного введения представляет собой растворы в стерильном изотоническом водном буферном растворе. При необходимости композиция также может включать, например, солюбилизирующий агент и местно-анестезирующее средство, такое как лидокаин,чтобы обеспечить комфорт в месте инъекции. В целом, ингредиенты поставляются или отдельно, или смешанными в дозированной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметически запечатанном контейнере (таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента). Если композиция предназначена для инфузионного введения, она может отпускаться с бутылью для инфузий, содержащей стерильную воду или солевой раствор фармацевтической категории. Если композиция предназначена для инъекционного введения,ампула стерильной воды для инъекций или солевого раствора может прилагаться таким образом, что ингредиенты могут быть смешаны перед введением. Композиции по изобретению могут иметь нейтральную форму или форму солей. Фармацевтически приемлемые соли включают, например, но не ограничиваясь ими, анионные соли (такие как соли хлористо-водородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислоты и т.п.) и катионные соли (например,такие как соли натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина,этанол-2-этиламина, гистидина, прокаина и т.д). Фиброзные заболевания, расстройства или состояния Композиция для связывания, например, такая как антитело, пригодна лечения состояний, связанных с фиброзными заболеваниями. Аккумуляция компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) или замещение нормального клеточного материала компонентами ВКМ в многочисленных типах клеток, тканей и органов может приводить к вызывающему заболевание фиброзу. Прогрессирующий фиброз может быть смертельным и приводит к терминальной недостаточности множества органов, например почек. Как- 27016038 доклинические, так и клинические данные указывают на то, что TGF-бета 1 вносит основной вклад в отложение матричного белка при интерстициальном фиброзе и принимает участие в инициации и прогрессировании целого ряда сопутствующих фиброзному заболеванию состояний, включая фиброз почек, который обычно встречается во всех формах хронического заболевания почек (ХЗП). Степень фиброза почек положительно коррелирует с прогрессом до хронической почечной недостаточности (ХПН, также известной как терминальная стадия заболевания почек (ESRD и может приводить к смерти, потребовать хронического диализа или трансплантации почки. TGF-бета 1 представляет собой цитокин, который наиболее систематически связан как по результатам экспериментов, так и ассоциацией в клинических исследованиях и экспериментах на животных с такими фиброзными процессами. Фундаментальное воздействие TGF-бета 1 на ВКМ, включая его роль в стимулировании синтеза и торможении деградации компонентов внеклеточного матрикса, является темой многочисленных обзоровRes. 44:157-97). TGF-бета 1 может индуцировать аккумуляцию ВКМ во множественных и кооперативных путях, например, TGF-бета 1 стимулирует экспрессию мРНК и продукцию белка ключевых компонентов ВКМ, в том числе коллагена типа I, коллагена типа IV, фибронектина и ламинина (SharmaZiyadeh 1997 Semin Nephrol 17:80-92). В то же время TGF-бета 1 препятствует разложению ВКМ, ингибируя выработку протеаз (например, активатора плазминогена, коллагеназы, эластазы и стромелизина),которые осуществляют ферментное расщепление матрикса, и активируя ингибиторы таких протеаз, например тканевые ингибиторы металлопротеиназ и ингибитора 1 активатора плазминогена (SharmaZiyadeh 1995 Kidney Int 51:S34-6). TGF-бета 1 также регулирует вверх интегрины и рецепторы поверхности клетки для ВКМ, таким образом, усиливая способность клеток взаимодействовать со специфическими белками ВКМ (Heino, et al. 1989 J. Biol Chem 264:380-8). Дополнительно, TGF-бета 1 обладает мощным хемотаксическим свойством привлекать клетки ВКМ, такие как фибробласты и фагоцитарные клетки(Reibman, et al. 1991 PNAS 88:6805-9). Кроме того, TGF-бета 1 обладает особенной способностью индуцировать свою собственную экспрессию, потенциально приумножая аномальные фиброзные процессыTGF-бета 1 принимает участие в следующих заболеваниях, синдромах и/или состояниях: Заболевание почек, например хроническое заболевание почек (ХЗП); хроническая почечная недостаточность (ХПН); терминальная стадия заболевания почек (ESRD); гломерулонефрит (ГН), в том числе,например, мезангиальный пролиферативный ГН, мезангиокапиллярный ГН, мембранный ГН, очаговый и сегментарный ГН, иммунный ГН и суставной (crescentic) ГН; гломерулосклероз; нефросклероз, мембранная нефропатия, связанная с иммуноглобулином A (IgA) нефропатия; почечный интерстициальный фиброз; очаговый сегментарный гломерулосклероз, фиброз почек у пациентов, получающих циклоспорин после трансплантации; хроническое отторжение почечного трансплантата; связанная с ВИЧ нефропатия; гипертрофия почечных клеток; тубулоинтерстициальный фиброз, сопровождающий хронические заболевания почек, в том числе являющийся результатом обструкции мочевых путей, или связанная с терапией обезболивающими средствами нефропатия или после приступа острой почечной недостаточности, такой как острая почечная недостаточность вследствие ишемии почек (Spurgeon et al. Am. J PhysiolRenal Physiol 288:F568-F577, 2005); почечная тромботическая микроангиопатия, например, связанная с повреждением эндотелиальных клеток клубочков или другими микрососудистыми повреждениями эндотелиальных клеток, например, связанными с предэклампсией, эндотоксемией и радиационным облучением; почечный васкулит; очаговый некротизирующий гломерулонефрит; диабетическая нефропатия[TGF-бета 1 связан с ХПН посредством сложных и разнообразных феноменов, которые влияют на большинство клеток почки (Bottinger, 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13, 2600). Эти события, в конечном счете,приводят как к тубулоинтерстициальному фиброзу, так и гломерулосклерозу, результатом чего является снижение функции нефрона и, в конечном итоге, хроническая почечная недостаточность. Из трех изоформ TGF-бета TGF-бета 1, по-видимому, является доминирующим в опосредовании прогресса хронического почечного заболевания, не только в качестве наиболее доминантно экспрессирующейся изоформы, но также TGF-бета 2 и, по-видимому, TGF-бета 3 опосредуют свое воздействия через регулирование вверх экспрессии TGF-бета 1 (Yu, 2003, Kid. Int. 64, 844). Как in vitro, так и in vivo исследования связывают TGF-бета 1 с патогенезом диабетического почечного заболевания, в том числе осложнений, связанных с сахарным диабетом типа 1 или типа 2, например гломерулосклерозом и тубулоинтерстициальным фиброзом (Ziyadeh 1998 Cur. Pract. Med. 1:87-9). Антисыворотка против TGF-бета эффективна в лечении гломерулонефрита (Border et al. 1990 Nature 346:371-4)]; фиброзного заболевания почек [TGF-бета 1 опосредует гипертрофию почечных клеток, другую характеристику диабетической нефропатии, препятствуя нормальному регулированию клеточного цикла, индуцируя циклинзависимые ингибиторы киназы, такие как p27Kipl и p21Cipl (WolfZiyadeh 1999 Kidney Int 56:393-405). Уровни этих ингибиторов также повышены при высоком содержании глюкозы в крови и диабетическом состоянии (Wolf, et al. 2001 Am J Pathol; 158:1091-1100; Wolf, et al. 1999 Diabetologia 42:1425-32; Wolf, et al. 1997 Am J Physiol 273:F348-56). Они угнетают активность циклинзависимых киназ, в основном циклинзависимой киназы 2/циклин E киназы (LiuPreisig 1999 Am J Physiol 277:F186-94), таким образом, ин- 28016038 гибируя фосфорилирование белка ретинобластомы и останавливая клетку в поздней G1 фазе. Клетка входит в период синтеза белка без репликации ДНК, и возникает гипертрофия. Таким образом, TGF-бета 1 вызывает изменения на клеточном уровне, которые переходят в патофизиологические особенности диабетической нефропатии]; экспериментальная диабетическая нефропатия; гипертонический нефросклероз [Поскольку структура и фильтрационные свойства клубочка в значительной степени определяются составом внеклеточного матрикса мезангия и клубочковой мембраной, неудивительно, что TGF-бета 1 оказывает существенное влияние на почку. TGF-бета 1 опосредует патологические изменения при диабетическом заболевании почек (Ziyadeh 1998 Cur Prac Med 1:87-89). Аккумуляция мезангиального матрикса при пролиферативном гломерулонефрите (Border, et al. 1990 Kidney Int. 37:689-695) и диабетической нефропатии (Mauer, et al. (1984) J. Clin. Invest. 74:1143-1155) представляют собой четкие и доминирующие патологические особенности заболеваний. Уровни TGF-бета 1 всегда повышены при диабетическом гломерулосклерозе у человека (поздние стадии нейропатии) (Yamamoto, et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1814-1818). Также обнаружено, что TGF-бета 1 является важным посредником в генезе почечного фиброза на многих животных моделях (Phan, et al. 1990 Kidney Int. 37:426; Okuda, et al. 1990 J. Clin.Invest. 86:453). Продемонстрировано подавление экспериментально индуцированного гломерулонефрита у крыс с применением антисыворотки против TGF-бета (Border, et al. 1990 Nature 346:371) и белка внеклеточного матрикса, декорина, который может связываться с TGF-бета 1 (Border, et al. 1992 Nature 360:361-363; see, also, e.g., BorderNoble 1994 N. Engl. J. Med. 331:1286-92; Border, et al. 1989 Semin.Nephrol. 9:307-17; Han, et al. 2000 Am J Physiol Renal Physiol 278:F628-34; и Ziyadeh, et al. 2000 PNAS 97:8015-20)]. Таким образом, композиция для связывания по изобретению была бы пригодной для лечения, облегчения, модулирования, диагностики и/или подавления заболевания, расстройства, синдрома и/или состояния, описанного выше. Заболевание печени, например цирроз; печеночный фиброз; [Печеночный фиброз представляет собой распространенную реакцию на гепатоцеллюлярный некроз или повреждение, которое может быть вызвано разнообразными агентами, например, каким-либо процессом, нарушающим печеночный гомеостаз (особенно воспалением, повреждением токсинами или изменением печеночного кровотока) и инфекциями печени (вирусными, бактериальными, грибковыми и паразитарными). Многочисленные расстройства хранения (накопления) вследствие врожденных ошибок метаболизма часто сопровождаются фиброзом, в том числе аномалии липидного обмена (болезнь Гоше); заболевания, связанные с хранением гликогена (особенно тип III, IV, VI, IX, и X); дефицит 1-антитрипсина; накопление экзогенных субстанций, как это наблюдается при синдромах перегрузки железом (гемохроматоз), заболеваниях, связанных с накоплением меди (болезнь Вильсона); накоплением токсичных метаболитов (например, при тирозинемии, фруктоземии и галактоземии); и пероксисомальные расстройства (синдром Зеллвегера). Многочисленные химические вещества и лекарственные средства вызывают фиброз, особенно спирт, метотрексат,изониазид, оксифенизатин, метилдопа, хлорпромазин, толбутамид и амиодарон. К фиброзу могут приводить нарушения печеночного кровообращения (например, хроническая сердечная недостаточность, синдром Бадда-Чиари, веноокклюзивное заболевание, тромбоз портальной вены) и хроническая обструкция желчных путей. Наконец, врожденный печеночный фиброз представляет собой аутосомальный рецессивный порок. У большинства людей в мире присутствует хронический вирусный гепатит печени или стеатогепатит, связанный с алкоголем или ожирением, но другие индуцирующие фиброз повреждающие факторы включают, например, паразитарное заболевание (например, шистозомиаз), аутоиммунную атаку на гепатоциты или эпителии желчевыводящих путей, заболевание печени у новорожденного, метаболические расстройства, включая гемохроматоз Вильсона и разнообразные заболевания, связанные с хранением,хронические воспалительные состояния (например, саркоидоз), токсичность лекарственных средств (например, метотрексат или гипервитаминоз), а также дисфункции сосудов, врожденные или приобретенные. Звездообразные клетки печени (ЗКП) представляют собой важный клеточный источник ВКМ при фиброзе печени (LiFriedman 1999 J. Gastroenterol. Hepatol. 14:618-33). ЗКП локализованы в перисинусоидальном пространстве Диссе, которое отделяет гепатоциты от синусоидального эпителия. Повреждающие печень факторы активируют в норме неподвижные ЗКП, что ведет к их последующей пролиферации и активации. Активизированные ЗКП далее подвергаются фенотипической трансдифференциации до сократительных миофибробластов (МФБ), которые экспрессируют актин гладких мышц и избыток молекул ВКМ, который наблюдается при фиброзе печени. Трансдифференциация ЗКП до МФБ является результатом чрезмерной экспрессии TGF-бета 1 в его роли ключевого регулятора фиброзной реакции печени на стресс и повреждение (Gressner, et al. 2002 Front Biosci. 7: d.793-807). TGF-бета 1 представляет собой наиболее сильный из известных индукторов фиброгенеза в эффекторных клетках печеночного фиброза (Schuppan, et al. 2003 Cell Death Differ. 10 Supl 1:S59-67). Соответственно, уровни активногоTGF-бета 1 в тканях и сыворотки при фиброзе печени повышаются, и показано, что чрезмерная экспрессия TGF-бета 1 у трансгенных мышей и применение экзогенного TGF-бета 1 индуцируют фиброз органа(Kanzler, et al. 1999 J. Physiol. 276:G1059-68; Sanderson, et al. 1995 PNAS 2572-76). Кроме того, экспериментальный фиброз может ингибироваться лечением анти-TGF-бета 1, например, нейтрализующими ан- 29