Выделенный связывающий белок, который связывается с her-3, и его применение

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки Данное изобретение относится к связывающим белкам, которые связываются с HER-3, и кодирующим их полинуклеотидам. Обеспечены также экспрессирующие векторы и клеткихозяева, содержащие их, для получения связывающего белка этого изобретения. Кроме того,это изобретение обеспечивает композиции и способы диагностики и лечения заболеваний,ассоциированных с опосредованной HER-3 трансдукцией сигнала и/или его лигандом херегулином. 015782 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к связывающим белкам, включающим в себя антитела и их связывающие фрагменты, которые связываются с HER-3, и кодирующим их полинуклеотидам. Обеспечены также экспрессирующие векторы и клетки-хозяева, содержащие их, для получения связывающего белка этого изобретения. Кроме того, это изобретение обеспечивает композиции и способы диагностики и лечения заболеваний, ассоциированных с опосредованной HER-3 трансдукцией сигнала и/или его лигандом херегулином. Сведения о предшествующем уровне техники Рецептор 3 эпидермального фактора роста человека (HER-3, также известный как ErbB3) является рецепторной протеинтирозинкиназой и принадлежит к подсемейству рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), которое также включает в себя HER-1 (также известный как EGFR), HER-2 и HER-4(Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87 (1990), 4905-4909; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 86 (1989), 9193-9197; и Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90 (1993), 2900-2904). Аналогично прототипу, рецептору эпидермального фактора роста, трансмембранный рецептор HER-3 состоит из внеклеточного лигандсвязывающего домена (ECD), домена димеризации в этом ECD, трансмембранного домена, внутриклеточного протеинтирозинкиназного домена (TKD) и С-концевого домена фосфорилирования. Лиганд херегулин (HRG) связывается с внеклеточным доменом HER-3 и активирует опосредованный рецептором путь передачи сигнала стимуляцией димеризации с другими членами семейства рецепторов эпидермального фактора роста (HER) и трансфосфорилирования его внутриклеточного домена. Образование димеров между членами семейства HER расширяет потенциал передачи сигнала HER-3 и является средством не только создания разнообразия сигналов, но и усиления сигналов. Например, гетеродимер HER-2/HER-3 индуцирует один из наиболее важных митогенных сигналов среди членов семейства HER. Было обнаружено, что HER-3 сверхэкспрессируется в нескольких типах рака, таких как рак молочной железы, желудочно-кишечный рак и рак поджелудочной железы. Интересно, что была показана корреляция между экспрессией HER-2/HER-3 и прогрессированием из неинвазивной стадии в инвазивную стадию (Alimandi et al., Oncogene 10, 1813-1821; deFazio et al., Cancer 87, 487-498; Naidu et al., Br. J. Cancer 78, 1385-1390). Таким образом, желательными являются агенты, которые препятствуют опосредованной HER-3 передаче сигнала. Сообщались мышиные или химерные HER-3-антитела, например, в US 5968511, US 5480968 и WO 03013602. Недавно было показано, что моноклональное антитело против HER-2, Херцептин, препятствует опосредованной HER-2 передаче сигнала и является терапевтически эффективным у людей (Fendly et al.,Hybridoma 6, 359-370; Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172; Stebbing et al., Cancer Treat. Rev. 26,287-290). Было показано, что Херцептин действует посредством двух различных механизмов, т.е. захвата эффекторных клеток иммунной системы, а также прямого цитотоксического, индуцирующего апоптоз действия. Однако только пациенты с высокоамплифицированным HER-2 отвечают в значительной степени на терапию с использованием Херцептина, ограничивая тем самым количество пациентов, подходящих для терапии. Кроме того, развитие резистентности к лекарственным средствам или изменение экспрессии или последовательности эпитопа HER-2 на опухолевых клетках может делать даже этих поддающихся лечению пациентов не реагирующими на это антитело и, следовательно, аннулируют их терапевтическую пользу. Таким образом, необходимо большее количество лекарственных средств для нацеленных терапий, с использованием дополнительных членов семейства HER, например HER-3. Перечень фигур Фиг. 1 показывает степень экспрессии HER-3 в панели линий раковых клеток человека и демонстрирует, что HER-3 экспрессируется при разнообразных раковых заболеваниях человека. Фиг. 2 - результаты FACS-анализа связывания HER-3-антитела либо с клетками Ratl, стабильно экспрессирующими различные члены семейства HER, либо только с пустым вектором. Фиг. 3 - карманы конкурентного связывания антител, картированные относительно доменов HER3. Фиг. 4 - результаты непрямого FACS-анализа аффинности антител по Скетчарду, выполненного с анти-HER-3-антителами этого изобретения. Этот анализ показывает, что анти-HER-3-антитела этого изобретения имеют высокие аффинности и высокие константы связывания в отношении HER-3, экспрессируемого на клеточной поверхности. Фиг. 5 - ускоренный эндоцитоз HER-3, индуцированный анти-HER-3-антителами этого изобретения. Фиг. 6 а-е - результаты конкурентного анализа связывания лиганда, выполненного с анти-HER-3 антителами этого изобретения. Эти результаты демонстрируют, что антитела этого изобретения специфически уменьшают связывание [125I]HRG/[125I]HRG с клетками, экспрессирующими эндогенныйHER-3. Фиг. 7 а - результаты ELISA фосфотирозина HER-3, выполненного с анти-HER-3-антителами этого изобретения. Антитела в соответствии с данным изобретением способны ингибировать -HRG-1 015782 опосредованную активацию HER-3, как показано увеличенным фосфорилированием тирозина рецептора. Кроме того, фиг. 7b показывает репрезентативные результаты этого эксперимента с титрованным антителом. Фиг. 8 - результат ELISA МАР-киназы р 42/р 44, выполненного с анти-HER-3-антителами этого изобретения. Антитела в соответствии с данным изобретением были способны ингибировать -HRGопосредованную активацию МАР-киназы р 42/р 44, как показано увеличением фосфорилирования МАРкиназы. Фиг. 9 - результат фосфо-AKT-ELISA, выполненного с анти-HER-3-антителами этого изобретения. Антитела в соответствии с данным изобретением способны уменьшать -HRG-опосредованную активацию киназы АКТ, как показано фосфорилированием АКТ. Фиг. 10 - ингибирование пролиферации клеток MCF7 анти-HER-3-антителами человека этого изобретения. Антитела в соответствии с данным изобретением ингибируют HRG-индуцированный рост клеток в раковых клетках человека. Фиг. 11 - трансмиграцию клеток MCF7, ингибируемую анти-HER-3-антителами человека этого изобретения. Фиг. 12a-i - ингибирование роста независимых от прикрепления клеток анти-HER-3-антителами человека этого изобретения. Фиг. 13 - ингибирование роста ксенотрансплантата клеток рака молочной железы человека антиHER-3-антителами человека этого изобретения. Фиг. 14 - уменьшение клеток рака поджелудочной железы человека В РС 3 в мышах после введения анти-HER-3-(U1-59 и U1-53) или анти-EGFR (Erbitux)-антител. Фиг. 15 - уменьшение роста ксенотрансплантата клеток В РС 3 рака поджелудочной железы человека анти-HER-3-антителом человека этого изобретения и в комбинации с анти-EGFR (Erbitux)антителами. Фиг. 16 демонстрирует, что антитела этого изобретения задерживают рост клеток меланомы человека (НТ 144) в nu/nu-мышах. Фиг. 17 показывает уменьшение роста ксенотрансплантата клеток НТ-29 рака ободочной кишки человека анти-HER-3-антителами человека этого изобретения (U1-53, U1-59 и U1-7). Фиг. 18 - уменьшение роста ксенотрансплантата клеток Calu-3 рака легкого человека анти-HER-3 антителами человека этого изобретения (U1-59, U1-53 и U1-7). Фиг. 19 - уменьшение роста ксенотрансплантата клеток В РС-3 рака поджелудочной железы человека анти-HER-3-антителами человека этого изобретения (U1-7, U1-59 и U1-53). Фиг. 20 демонстрирует, что антитело этого изобретения (U1-59) вызывает супрессию HER-3 в ксенотрансплантатах В РС 3 рака поджелудочной железы человека. Сущность изобретения Первый аспект данного изобретения относится к выделенному связывающему белку, который связывается с HER-3. В одном варианте осуществления данного изобретения, выделенный связывающий белок этого изобретения содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую по меньшей мере один из CDR, выбранных из группы, состоящей из (а) CDRH1, показанных в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18,22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122,126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210,214, 218, 222, 226 и 230, (b) CDRH2, показанных в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42,46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142,146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 и 230, и(с) CDRH3, показанных в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74,78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166,170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 и 230, и/или аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую по меньшей мере один из CDR, выбранных из группы, состоящей из (d) CDRL1, показанных в SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68,72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168,172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 и 232, (е) CDRL2, показанных вSEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110,114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200,204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 и 232, и (f) CDRL3, показанных в SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32,38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144,148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 и 232. В другом варианте осуществления данного изобретения выделенный связывающий белок этого изобретения содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88,92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178,-2 015782 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 и 230, и/или аминокислотную последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56,58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160,164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 и 232. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения выделенный связывающий белок этого изобретения содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 2 и 4, 6 и 8, 10 и 12, 14 и 16, 18 и 20, 22 и 24, 26 и 28,30 и 32, 36 и 38, 42 и 44, 46 и 48, 50 и 52, 54 и 56, 60 и 58, 62 и 64, 66 и 68, 70 и 72, 74 и 76, 78 и 82, 80 и 82, 84 и 86, 88 и 90, 92 и 94, 96 и 98, 100 и 102, 104 и 106, 108 и 110, 112 и 114, 116 и 118, 122 и 124, 126 и 128, 130 и 132, 134 и 136, 138 и 140, 142 и 144, 146 и 148, 150 и 152, 154 и 156, 158 и 160, 162 и 164, 166 и 168, 170 и 172, 174 и 176, 178 и 180, 182 и 184, 186 и 188, 190 и 192, 194 и 196, 198 и 200, 202 и 204, 206 и 208, 210 и 212, 214 и 216, 218 и 220, 222 и 224, 226 и 228, 230 и 232, или аминокислотную последовательность тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 34, 40, 60, 62 или 120, или аминокислотную последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 58 или 64. В соответствии с данным изобретением выделенный связывающий белок, который способен связываться с HER-3, взаимодействует по меньшей мере с одним эпитопом во внеклеточной части HER-3. Эти эпитопы локализованы предпочтительно в домене L1 (аминокислоты 19-184), который является аминоконцевым доменом, в домене S1 (аминокислоты 185-327) и S2 (аминокислоты 500-632), которые являются двумя цистеин-богатыми доменами, или в домене (328-499), который фланкирован двумя цистеинбогатыми доменами. Эти эпитопы могут быть также локализованы в комбинации доменов, такой как, но не только, эпитоп, состоящий из частей L1 и S1. Кроме того, предпочтительным является выделенный связывающий белок, который связывается с трехмерной структурой, образованной аминокислотными остатками 1-160, 161-358, 359-575, 1-358 и/или 359-604 зрелого HER-3, в частности зрелого HER-3 человека. Предпочтительно выделенный связывающий белок этого изобретения является белком-каркасом,имеющим антителоподобную связывающую активность, или антителом, например, анти-HER-3 антителом. В частности, анти-HER-3-антитело выбрано из группы, состоящей из антитела U1-1, антителаU1-59, антитела U1-61.1, антитела U1-61, антитела U1-62 или антитела, имеющего по меньшей мере одну тяжелую или легкую цепь одного из указанных антител. Особенно предпочтительными являются антитела U1-49 (SEQ ID NO: 42/44), U1-53 (SEQ ID NO: 54/56) и U1-59 (SEQ ID NO: 70/72) или антитело, имеющее по меньшей мере одну тяжелую или легкую цепь одного из указанных антител. Кроме того, дополнительные варианты осуществления данного изобретения обеспечивают выделенный связывающий белок, соединенный с метящей группой или эффекторной группой. Предпочтительно такой связывающий белок применим для лечения гиперпролиферативных заболеваний, в частности онкологических заболеваний, таких как рак молочной железы, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак желудка, рак эндометрия, рак слюнных желез, рак легкого, рак почки, рак ободочной кишки, колоректальный рак, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, глиома, меланома, рак яичка, саркома мягких тканей, рак головы и шеи или другие экспрессирующие или сверхэкспрессирующие раковые опухоли, и образование опухолевых метастазов. Другие аспекты данного изобретения относятся к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающий белок этого изобретения, вектору, имеющему молекулу нуклеиновой кислоты,кодирующей связывающий белок этого изобретения, и клетке-хозяину, например клетке СНО, клетке миеломы NS/0, трансформированной такой молекулой нуклеиновой кислоты или вектором. Следующий аспект данного изобретения относится к способу получения связывающего белка этого изобретения получением указанного белка из клетки-хозяина, которая секретирует этот связывающий белок. Предпочтительно связывающий белок этого изобретения получают из гибридомной клеточной линии, которая секретирует связывающий белок, или клетки СНО или другого типа клеток, трансформированных молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающий белок этого изобретения. Другой аспект данного изобретения относится к способу получения связывающего белка этого изобретения получением указанного связывающего белка из ткани, продукта или секрета животного, растения или гриба, трансгенных в отношении молекулы нуклеиновой кислоты или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих связывающий белок этого изобретения. Предпочтительно связывающий белок этого изобретения получают из ткани, продукта или секрета трансгенного животного, такого как корова,-3 015782 овца, кролик, курица или другой вид млекопитающего или вид птицы, трансгенного растения, такого как кукуруза, табак или другое растение, или трансгенного гриба, такого как Aspergillus, Pichia или другие виды грибов. Другой аспект данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного агента по меньшей мере один связывающий белок этого изобретения в смеси с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или адъювантами. В другом предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция этого изобретения дополнительно содержит по меньшей мере один другой активный агент, например по меньшей мере один противоопухолевый агент. Еще один аспект данного изобретения относится к применению по меньшей мере одного связывающего белка этого изобретения и необязательно по меньшей мере одного другого активного агента, например по меньшей мере одного противоопухолевого агента, в смеси с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или адъювантами для приготовления фармацевтической композиции. Эта фармацевтическая композиция пригодна для диагностики, предупреждения или лечения гиперпролиферативного заболевания, в частности онкологического заболевания, такого как рак молочной железы, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак желудка,рак эндометрия, рак слюнных желез, рак легкого, рак почки, рак ободочной кишки, колоректальный рак,рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, глиома, меланома или другие экспрессирующие или сверхэкспрессирующие HER-3 раковые заболевания, и образования опухолевых метастазов. Кроме того, данное изобретение относится в дополнительном аспекте к способу диагностики заболеваний или состояний, ассоциированных с экспрессией HER-3, предусматривающему контактирование пробы по меньшей мере с одним связывающим белком этого изобретения и детектирование присутствияHER-3. Предпочтительные заболевания или состояния включают в себя вышеупомянутые гиперпролиферативные заболевания. Еще одним аспектом данного изобретения является способ предупреждения или лечения заболеваний или состояний, ассоциированных с экспрессией HER-3 в пациенте, нуждающемся в этом, предусматривающий введение этому пациенту эффективного количества по меньшей мере одного связывающего белка этого изобретения и необязательно по меньшей мере одного другого активного агента, например по меньшей мере одного противоопухолевого агента. Предпочтительно этим пациентом является пациент-млекопитающее, более предпочтительно пациент-человек. Предпочтительными заболеваниями или состояниями, ассоциированными с экспрессией HER-3, являются вышеупомянутые гиперпролиферативные заболевания. Следующий аспект данного изобретения относится к набору для диагностики, предупреждения или лечения заболеваний или состояний, ассоциированных с экспрессией HER-3, содержащему, по меньшей мере, один связывающий белок и/или молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор этого изобретения. Необязательно, набор этого изобретения может дополнительно содержать по меньшей мере один другой активный агент, например по меньшей мере один противоопухолевый агент и/или например по меньшей мере один противоопухолевый агент. Предпочтительно заболеваниями или состояниями, ассоциированными с экспрессией HER-3, являются вышеупомянутые гиперпролиферативные заболевания. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Первый аспект данного изобретения относится к выделенному связывающему белку, который связывается с HER-3. В одном варианте осуществления данного изобретения выделенный связывающий белок этого изобретения содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую по меньшей мере один из CDR, выбранных из группы, состоящей из (а) CDRH1, показанных в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18,22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122,126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210,214, 218, 222, 226 и 230, (b) CDRH2, показанных в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42,46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142,146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 и 230, и(с) CDRH3, показанных в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74,78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166,170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 и 230, и/или аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую по меньшей мере один из CDR, выбранных из группы, состоящей из (d) CDRL1, показанных в SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68,72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168,172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 и 232, (е) CDRL2, показанных вSEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110,114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200,204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 и 232, и (f) CDRL3, показанных в SEQ ID NO: 4, 8,12, 16, 20, 24, 28, 32,38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144,148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 и 232. В другом варианте осуществления данного изобретения выделенный связывающий белок этого-4 015782 изобретения содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88,92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178,182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 и 230, и/или аминокислотную последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56,58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160,164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 и 232. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения выделенный связывающий белок этого изобретения содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, показанные в SEQ ID NO: 2 и 4, 6 и 8, 10 и 12, 14 и 16, 18 и 20, 22 и 24, 26 и 28,30 и 32, 36 и 38, 42 и 44, 46 и 48, 50 и 52, 54 и 56, 60 и 58, 62 и 64, 66 и 68, 70 и 72, 74 и 76, 78 и 82, 80 и 82, 84 и 86, 88 и 90, 92 и 94, 96 и 98, 100 и 102, 104 и 106, 108 и 110, 112 и 114, 116 и 118, 122 и 124, 126 и 128, 130 и 132, 134 и 136, 138 и 140, 142 и 144, 146 и 148, 150 и 152, 154 и 156, 158 и 160, 162 и 164, 166 и 168, 170 и 172, 174 и 176, 178 и 180, 182 и 184, 186 и 188, 190 и 192, 194 и 196, 198 и 200, 202 и 204, 206 и 208, 210 и 212, 214 и 216, 218 и 220, 222 и 224, 226 и 228, 230 и 232, или аминокислотную последовательность тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 34, 40, 60, 62 или 120, или аминокислотную последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 58 или 64. В соответствии с данным изобретением должно быть понятно, что аминокислотная последовательность связывающего белка этого изобретения не ограничивается двадцатью обычными аминокислотами(См. Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland,Mass. (1991, которая включена здесь в качестве ссылки). Например, эти аминокислоты могут включать в себя стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати обычных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как -,-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочную кислоту и другие нетрадиционные аминокислоты. Примеры нетрадиционных аминокислот, которые могут быть также подходящими компонентами для связывающего белка этого изобретения, включают в себя 4 гидроксипролин, -карбоксиглутамин, -N,N,N-триметиллизин, -N-ацетиллизин, О-фосфосерин, Nацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, -N-метиларгинин и другие сходные аминокислоты и аминокислоты, например 4-гидроксипролин. Кроме того, в соответствии с данным изобретением, минорные вариации в аминокислотных последовательностях, показанных в SEQ ID NO:1-232, рассматриваются как включенные в данное изобретение, при условии, что эти вариации в аминокислотной последовательности сохраняют по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95 и наиболее предпочтительно 99% последовательностей, показанных в SEQ ID NO:1-232. Эти вариации могут встречаться в каркасных районах (т.е. вне CDR), в пределах CDR или в пределах каркасных районов и CDR. Предпочтительные вариации в аминокислотных последовательностях, показанных в SEQ ID NO: 1-232, т.е. делеции, инсерции и/или замены, по меньшей мере, аминокислоты, встречаются вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы сравнением данных нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей с публичными или частными базами данных последовательностей. Компьютеризованные способы сравнения могут быть использованы для идентификации мотивов последовательностей или предсказанных доменов конформации белков, которые встречаются в других связывающих белках известной структуры и/или функции. Известны способы идентификации белковых последовательностей, которые уложены в известную трехмерную структуру. См., например,Bowie et al., Science 253, 164 (1991); Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H.Freeman and Company, New York (1984; Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds.,Garland Publishing, New York, N.Y. (1991; и Thornton et al., Nature 354, 105 (1991), все из которых включены здесь в качестве ссылки. Таким образом, специалистам с квалификацией в данной области будут известны мотивы и структурные конформации, которые могут быть использованы для определения структурных и функциональных доменов в соответствии с данным изобретением. Особенно предпочтительными вариациями в аминокислотных последовательностях, показанных вSEQ ID NO: 1-174 и 1-232, являются вариации, которые приводят к уменьшенной чувствительности к протеолизу или окислению, изменяют картины гликозилирования или изменяют аффинности связывания или придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства связывающего белка. В частности, рассматриваются консервативные замены аминокислот. Консервативными заменами являются замены, которые имеют место в семействе аминокислот, которые являются родственными в их боковых цепях. Предпочтительными семействами аминокислот являются следующие: семейство кислотных аминокислот = аспартат, глутамат; семейство основных аминокислот = лизин, аргинин,гистидин; семейство неполярных аминокислот = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; семейство незаряженных полярных аминокислот = глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Более предпочтительными семействами являются семейство алифатических гидроксиаминокислот = серин и треонин; семейство амидсодержащих аминокислот = аспарагин и глутамин; семейство алифатических аминокислот = аланин, валин, лейцин и изолейцин и-5 015782 семейство ароматических аминокислот = фенилаланин, триптофан и тирозин. Например, разумно ожидать, что отдельная замена лейцина изолейцином или валином, аспартата глутаматом, треонина серином или аналогичная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой не будет оказывать большого влияния на связывание или свойства полученного связывающего белка, особенно, если эта замена не включает в себя аминокислоту в сайте каркаса. Однако данное изобретение включает в себя также все другие возможные аминокислотные замены. Приводит ли изменение аминокислоты к функциональному связывающему белку, т.е. к связывающему белку, который связывается с HER-3 и уменьшает трансдукцию сигнала членов семейства HER, может быть легко определено анализом специфической активности полученного связывающего белка в ELISA или FACS на связывание с HER-3 или в функциональном анализе in vitro или in vivo. В соответствии с данным изобретением связывающий белок этого изобретения взаимодействует по меньшей мере с одним эпитопом во внеклеточной части HER-3. Эти эпитопы предпочтительно расположены в домене L1 (аминокислоты 19-184), который является аминоконцевым доменом, в домене S1(аминокислоты 185-327) и S2 (аминокислоты 500-632), которые являются двумя цистеин-богатыми доменами, или в домене (328-499), который фланкирован двумя цистеин-богатыми доменами. Эти эпитопы могут быть также локализованы в комбинациях доменов, такой как, но не только, эпитоп, состоящий из частей L1 и S1. Кроме того, связывающий белок этого изобретения дополнительно характеризуется тем,что его связывание с HER-3 уменьшает HER-3-опосредованную трансдукцию сигнала. В соответствии с данным изобретением уменьшение HER-3-опосредованного сигнала может быть, например, обусловлено негативной регуляцией HER-3, приводящей, по меньшей мере, к частичному исчезновению молекулHER-3 из клеточной поверхности, или стабилизацией HER-3 на клеточной поверхности, по существу, в неактивной форме, т.е. форме, которая проявляет более низкую трансдукцию сигнала в сравнении с нестабилизированной формой. Альтернативно, уменьшение HER-3-опосредованной трансдукции сигнала может быть также обусловлено влиянием, например, уменьшением или ингибированием, связывания лиганда или другого члена семейства HER с HER-3, GRB2 с HER-2 или GRB2 с SHC, ингибированием фосфорилирования тирозина рецептора, фосфорилирования АКТ, фосфорилирования тирозина PYK2 или фосфорилирования ERK2 или уменьшением инвазивности опухоли. Альтернативно, уменьшениеHER-3-опосредованной трансдукции сигнала может быть обусловлено влиянием, например, уменьшением или ингибированием, образования HER-3-содержащих димеров с другими членами семейства HER. Одним примером среди других может быть уменьшение или ингибирование образования белкового комплекса HER3-EGFR. Предпочтительно связывающий белок данного изобретения является белком-каркасом (белком типа лесов), имеющим антителоподобную связывающую активность, или антителом, т.е. анти-HER-3 антителом. В контексте данного изобретения термин белок-каркас обозначает полипептид или белок с открытыми зонами поверхности, в которых инсерции, замены или делеции являются высокопереносимыми. Примеры белков-каркасов, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, являются белок А из Staphylococcus aureus, билинсвязывающий белок из Pieris brassicae или другие липокалины, белки с повторами анкирина и фибронектин человека (см. обзор Binz and Plckthun, CurrOpin Biotechnol, 16, 459-69). Конструирование белка-каркаса (белка типа лесов) может рассматриваться как трансплантация или интеграция аффинной функции на этот структурный каркас или в этот структурный каркас стабильно уложенного белка. Аффинная функция обозначает аффинность связывания белка в соответствии с данным изобретением. Каркас может быть структурно отделяемым от аминокислотных последовательностей, придающих специфичность связывания. Обычно белки, являющиеся подходящими для развития таких искусственных аффинных реагентов, могут быть получены рациональными или наиболее часто комбинаторными способами конструирования белков, такими как пэннинг против HER-3,либо очищенного белка, либо белка, расположенного на клеточной поверхности, на связывающие агенты в библиотеке искусственных каркасов, представленной in vitro, в способах, которые известны в данной области (Skerra, J. Mol. Recog., 2000; Binz and Pl ckthun, 2005). Кроме того, белок-каркас, имеющий антителоподобную связывающую активность, может быть произведен из акцепторного полипептида, содержащего домен-каркас, который может быть трансплантирован связывающими доменами донорного полипептида для придания связывающей специфичности донорного полипептида содержащему доменкаркас акцепторному полипептиду. Указанными инсертированными связывающими доменами может быть, например, определяющий комплементарность район (CDR) антитела, в частности анти-HER-3 антитела. Инсерция может выполняться различными способами, известными квалифицированным в данной области специалистам, включающими в себя, например, синтез полипептидов, синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоту, а также различные формы рекомбинантных способов, хорошо известных квалифицированным в данной области специалистам. Кроме того, термин "антитело" или "анти-HER-3-антитело" обозначает в этом контексте моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, гуманизированное антителоStruct. Biol. 2 (1992), 593-596), химерное антитело (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984),-6 015782 6851-6855), мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело), образованное по меньшей мере из двух антител, или фрагмент антитела. Термин "фрагмент антитела" включает в себя любую часть вышеупомянутых антител, предпочтительно их антигенсвязывающие или вариабельные районы. Примеры фрагментов антител включают в себя Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2 фрагменты, Fv-фрагменты, диатела (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448),одноцепочечные молекулы антител (Pl ckthun in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) и другие фрагменты, пока они проявляют желаемую способность связывания с HER-3. Кроме того, термин "антитело" или "анти-HER-3-антитело" в данном контексте может включать в себя антителоподобные молекулы, которые содержат сконструированные субдомены антител или природно встречающиеся варианты антител. Эти антителоподобные молекулы могут быть одноцепочечными антителами, например только VH- или только VL-доменами, произведенными либо из природных источников, таких как представители семейства верблюдовых (Muyldermans et al., Reviews in MolecularBiotechnology 74, 277-302), либо посредством дисплея in vitro библиотек из людей, верблюдовых(Camelidae) или других видов (Holt et al., Trends Biotechnol., 21, 484-90). В соответствии с данным изобретением Fv-фрагмент является минимальным фрагментом антител,который содержит полный антигенузнающий и антигенсвязывающий сайт. Этот район состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в плотной, нековалентной связи. В этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий сайт на поверхности этого VH-VL-димера. Вместе эти шесть CDR придают антигенсвязывающую специфичность этому антителу. Однако даже единственный вариабельный домен(или половина Fv, содержащая только три CDR, специфических в отношении антигена) может узнавать и связывать этот антиген, хотя обычно при более низкой аффинности, чем полный сайт связывания. Fabфрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН 1) тяжелой цепи. Этот Fab-фрагмент отличается от Fab'-фрагмента добавлением нескольких остатков на карбоксиконце СН 1-домена тяжелой цепи, в том числе одного или нескольких цистеинов из шарнирной области антитела. F(ab')2-фрагмент первоначально получен в виде пары Fab'-фрагментов, которые имеют между ними цистеины шарнирной области. Способы получения таких фрагментов антител, такие как расщепление папаином или пепсином, известны квалифицированным в данной области специалистам. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения анти-HER-3-антитело этого изобретения является антителом IgA-, IgD-, IgE-, IgG- или IgM-типа, предпочтительно IgG- или IgMтипа, в том числе, но не только, IgG1-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgM1- и IgM2-типа. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления это антитело является антителом IgG1-, IgG2- или IgG4-типа. В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения анти-HER-3-антитело этого изобретения является анти-HER-3-антителом, направленным против внеклеточного домена (ECD)HER-3. В некоторых отношениях, например в связи с генерированием антител в качестве терапевтических кандидатов против HER-3, может быть желательным, чтобы анти-HER-3-антитело этого изобретения было способно фиксировать комплемент и участвовать в комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Имеются ряд изотипов антител, которые способны к этому, в том числе, без ограничений, следующие: мышиный IgM, мышиный IgG2a, мышиный IgG2b, мышиный IgG3, IgM человека, IgG1 человека, IgG3 человека и IgA человека. Будет понятно, что антитела, которые генерируют, не должны обязательно иметь первоначально такой изотип, но скорее генерированное антитело может иметь любой изотип, и изотип этого антитела может быть переключен добавлением молекулярно клонированных генов или кДНК V-области к молекулярно клонированным генам или кДНК константной области в подходящих экспрессирующих векторах с использованием общепринятых молекулярно-биологических способов, которые хорошо известны в данной области, и затем экспрессией этих антител в клетках-хозяевах с использованием способов, известных в данной области. Это антитело с переключенным изотипом может также иметь Fc-район, который был молекулярно сконструирован таким образом, что он имеет более высокую CDC в сравнении с природно встречающимися вариантами (Idusogie et al., J Immunol., 166,2571-2575), и экспрессирован рекомбинантно в клетках-хозяевах с использованием способов, известных в данной области. Такие способы включают в себя применение прямых рекомбинантных способов (см.,например, патент США 4816397), способов слияния клетка-клетка (см., например, патенты США с 5916771 и 6207418), среди других способов. В способе слияния клетка-клетка получают миеломную или другую клеточную линию, такую как СНО, которая имеет тяжелую цепь любого желаемого изотипа,и получают другую миеломную или другую клеточную линию, такую как СНО, которая имеет легкую цепь. Такие клетки могут быть после этого слиты, и может быть выделена клеточная линия, экспрессирующая интактное антитело. В качестве примера, анти-HER-3-антитело IgG4 человека, которое имеет желаемое связывание с антигеном HER-3, могло бы быть легко подвергнуто переключению изотипа для генерирования изотипа IgM человека, IgG1 человека или IgG3 человека, при обладании все еще той же самой вариабельной областью (которая определяет специфичность этого антитела и некоторую часть его аффинности). Затем такая молекула может быть способна к фиксации комплемента и участию в CDC.-7 015782 Кроме того, может быть желательно, чтобы анти-HER-3-антитело этого изобретения было способно связываться с Fc-рецепторами на эффекторных клетках, таких как моноциты и природные клеткиубийцы (NK), и участвовать в антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC). Имеются ряд изотипов антител, которые способны к этому, в том числе, без ограничения, следующие: мышиный IgG2a, мышиный IgG2b, мышиный IgG3, IgG1 человека и IgG3 человека. Будет понятно, что антитела, которые генерируют, не должны обязательно иметь первоначально такой изотип, но скорее генерированное антитело может иметь любой изотип, и изотип этого антитела может быть переключен добавлением молекулярно клонированных генов или кДНК V-области к молекулярно клонированным генам или кДНК константной области в подходящих экспрессирующих векторах с использованием общепринятых молекулярно-биологических способов, которые хорошо известны в данной области, и затем экспрессией этих антител в клетках-хозяевах с использованием способов, известных в данной области. Это антитело с переключенным изотипом может также иметь Fc-район, который был молекулярно сконструирован таким образом, что он имеет более высокую ADCC в сравнении с природно встречающимися вариантами (Shields et al. J Biol Chem., 276, 6591-6604), и экспрессирован рекомбинантно в клеткаххозяевах с использованием способов, известных в данной области. Такие способы включают в себя применение прямых рекомбинантных способов (см., например, патент США 4816397), способов слияния клетка-клетка (см., например, патенты США с 5916771 и 6207418) среди других способов. В способе слияния клетка-клетка получают миеломную или другую клеточную линию, такую как СНО, которая имеет тяжелую цепь любого желаемого изотипа, и получают другую миеломную или другую клеточную линию, такую как СНО, которая имеет легкую цепь. Такие клетки могут быть после этого слиты, и может быть выделена клеточная линия, экспрессирующая интактное антитело. В качестве примера, антиHER-3-антитело IgG4 человека, которое имеет желаемое связывание с антигеном HER-3, могло бы быть легко подвергнуто переключению изотипа для генерирования изотипа IgG1 человека или IgG3 человека при обладании все еще той же самой вариабельной областью (которая определяет специфичность этого антитела и некоторую часть его аффинности). Затем такая молекула может быть способна к связыванию с FcyR на эффекторных клетках и участию в ADCC. Кроме того, в соответствии с данным изобретением, понятно, что анти-HER-3-антитело этого изобретения является полностью антителом человека или гуманизированным антителом. Антитела человека избегают некоторых из проблем, связанных с ксеногенными антителами, например, антител, которые имеют мышиные или крысиные константные области. Присутствие ксеногенно-произведенных белков,таких как происходящие из мыши или крысы белки, может приводить к генерированию иммунной реакции против этого антитела пациентом, приводящей затем к быстрому клиренсу этих антител, потере терапевтической применимости вследствие нейтрализации этого антитела и/или тяжелым, даже угрожающим жизни аллергическим реакциям. Предпочтительно анти-HER-3-антитело этого изобретения выбрано из группы, состоящей из антитела U1-1, антитела U1-2, антитела U1-3, антитела U1-4, антитела U1-5, антитела U1-6, антитела U1-7,антитела U1-8, антитела U1-9, антитела U1-10, антитела U1-11, антитела U1-12, антитела U1-13, антителаU1-58, антитела U1-59, антитела U1-61.1, антитела U1-61, антитела U1-62. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения связывающий белок этого изобретения связан с метящей группой. Такой связывающий белок особенно пригоден для диагностических применений. В данном контексте термин "метящая группа" относится к детектируемому маркеру, например радиоактивно меченой аминокислоте или биотинильной группе, которая может быть детектирована меченым авидином (например, стрептавидином, связанным с флуоресцентным маркером или ферментативной активностью, которые могут быть детектированы оптическими или колориметрическими способами). Различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов, таких как антитела, известны в данной области и могут быть использованы в выполнении данного изобретения. Примеры подходящих метящих групп включают в себя, но не ограничиваются ими, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3 Н, 14 С, 15N, 35S, 90Y, 99 Тс, 111In, 125I, 131I), флуоресцентные группы (например, FITC, родамин, лантанидные люминофоры), ферментативные группы (например, пероксидаза хрена, галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные группы, биотинильные группы или заранее определенные полипептидные эпитопы, узнаваемые вторичным репортером (например, пары последовательностей лейциновой молнии, сайты связывания для вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки). В некоторых отношениях, может быть желательным, чтобы метящие группы были присоединены спейсерными плечами различной длины для уменьшения потенциального пространственного затруднения.-8 015782 Альтернативно, связывающий белок этого изобретения может быть связан с эффекторной группой в другом предпочтительном варианте осуществления этого изобретения. Такой связывающий белок особенно пригоден для терапевтических применений. В данном контексте термин эффекторная группа относится к цитотоксической группе, такой как радиоизотоп или радионуклид, токсин, терапевтическая группа или другая эффекторная группа, известная в данной области. Примерами подходящих эффекторных групп являются радиоизотопы или радионуклиды (например, 3 Н, 14 С, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, mIn, 125I, 131I),калихеамицин, аналоги доластатина, такие как ауристатины, и химиотерапевтические агенты, такие как гелданомицин и производные майтансина, в том числе DM1. В некоторых отношениях может быть желательным, чтобы эти эффекторные группы были присоединены спейсерными плечами различной длины для уменьшения потенциального пространственного затруднения. Второй аспект данного изобретения относится к способу получения выделенного связывающего белка этого изобретения, предусматривающему стадию получения связывающего белка из клеткихозяина, которая секретирует этот связывающий белок. Клетки-хозяева, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, являются гибридомами; эукариотическими клетками, такими как клетки млекопитающих, например хомячка, кролика, крысы, свиньи, мыши или клетки других животных, клетки растений, грибковые клетки, например Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris; прокариотические клетки, такие как Е. coli.; и другие клетки, используемые в области получения связывающих белков. Различные способы получения и выделения связывающих белков, например, белков-каркасов или антител, из клеток-хозяев известны в данной области и могут быть использованы в выполнении данного изобретения. Кроме того, способы получения фрагментов связывающих белков, например фрагментов белков-каркасов или фрагментов антител, например расщепление папаином или пепсином, современные способы клонирования, способы получения одноцепочечных молекул антител (Pl ckthun in: ThePharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS, Springer Veriag, N.Y. (1994), 269315) и диател (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), также известны квалифицированным в данной области специалистам и могут быть использованы при осуществлении данного изобретения. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, связывающий белок этого изобретения получают из гибридомы, которая секретирует этот связывающий белок. См., например, Khleret al., Nature 256 (1975), 495. В следующем предпочтительном варианте осуществления этого изобретения связывающий белок этого изобретения получают рекомбинантно оптимизацией и/или амплификацией экспрессии связывающего белка в клетке-хозяине и выделением этого связывающего белка из указанной клетки-хозяина. Для этой цели, клетки-хозяева трансформируют или трансфицируют ДНК, кодирующей связывающий белок,или вектором, содержащим ДНК, кодирующую связывающий белок, и культивируют при подходящих условиях для получения связывающего белка этого изобретения. См., например, патент США 4816567. Предпочтительными клетками-хозяевами могут быть клетки СНО, миеломные клетки NS/0,клетки 293 эмбриональной почки человека, Е. coli и Saccharomyces cerevisiae. Что касается связывающих белков, которые являются антителами, эти антитела могут быть получены из животных, генетически сконструированных таким образом, что они продуцируют полностью человеческие антитела, или из дисплей-библиотек антител, приготовленных в бактериофаге, дрожжах, рибосоме или Е. coli. См., например, Clackson et al., Nature 352 (1991), 624-628, Marks et al., J. Mol. Biol. 222Ther., 5, 125-135 и Jostock and Dubel, Comb Chem High Throughput Screen. 8, 127-133. Антитела человека избегают некоторых из проблем, связанных с антителами, которые имеют мышиные или крысиные вариабельные и/или константные области. Присутствие таких происходящих из мыши или крысы белков может приводить к быстрому клиренсу этих антител или может приводить к генерированию иммунной реакции против этого антитела пациентом. Во избежание использования происходящих из мыши или крысы антител полностью человеческие антитела могут быть генерированы введением локусов функционального антитела человека в грызуна, другого млекопитающего или другого животного, так что этот грызун, другое млекопитающее или животное продуцирует полностью человеческие антитела. Одним способом генерирования полностью человеческих антител является способ с использованием штаммов XENOMOUSE мышей, которые были сконструированы таким образом, что они содержат фрагменты с конфигурацией зародышевой линии с размерами 245 и 190 т.п.н. локуса тяжелой цепи и локуса легкой цепи каппа человека. Другие штаммы XenoMouse мышей содержат фрагменты с конфигурацией зародышевой линии с размерами 980 и 800 т.п.н. локуса тяжелой цепи и локуса легкой цепи каппа человека. Другие штаммы XenoMouse мышей содержат фрагменты с конфигурацией зародышевой линии с размерами 245 и 190 т.п.н. локуса тяжелой цепи и локуса легкой цепи каппа человека плюс полный локус с конфигурацией зародышевой линии с размером 740 т.п.н. легкой цепи лямбда человека. См.-9 015782 Получение мышей XENOMOUSE дополнительно обсуждается и описывается в заявках на патент США с порядковыми 07/466008, поданной 12 января 1990 г., 07/610515, поданной 8 ноября 1990 г.,07/919297, поданной 24 июля 1992 г., 07/922649, поданной 30 июля 1992 г., 08/031801, поданной 15 марта 1993 г., 08/112848, поданной 27 августа 1993 г., 08/234145, поданной 28 августа 1994 г., 08/376279,поданной 20 января 1995 г., 08/430938, поданной 27 апреля 1995 г., 08/464584, поданной 5 июня 1995 г.,08/464582, поданной 5 июня 1005 г., 08/463191, поданной 5 июня 1995 г., 08/462837, поданной 5 июня 1995 г., 08/486853, поданной 5 июня 1995 г., 1995, 08/486857, поданной 5 июня 1995 г., 08/486859, поданной 5 июня 1995 г., 08/462513, поданной 5 июня 1995 г., 08/724752, поданной 2 октября 1996 г. и 08/759620, поданной 3 декабря 1996 г., публикации патента США 2003/0217373, поданной 20 ноября 2002 г. и патентов США с 6833268, 6162963, 6150584, 6114598, 6075181 и 5939598 и патентах Японии с 3068180 В 2, 3068506 В 2 и 3068507 В 2. См., также европейский патент ЕР 463151 В 1, опубликованный 12 июня 1996 г., международную заявку на патент WO 94/02602, опубликованную 3 февраля 1994 г., международную заявку на патент WO 96/34096, опубликованную 31 октября 1996 г., WO 98/24893, опубликованную 11 июня 1998 г., WO 00/76310, опубликованную 21 декабря 2000 г. Описания каждого из цитируемых выше патентов, каждой из цитируемых заявок и ссылки включены здесь путем отсылки в полном виде. В альтернативном подходе другие, в том числе GenPharm International, Inc., использовали минилокусный подход. В этом минилокусном подходе экзогенный локус Ig имитируют включением участков(индивидуальных генов) из локуса Ig. Таким образом, один или несколько VH-генов, один или несколькоDH-генов, один или несколько JH-генов, константную областьи вторую константную область (предпочтительно константную область ) образуют в виде конструкции для встраивания в животное. Этот подход описан в патенте США 5545807, выданном Surani et al., и патентах США с 5545806, 5625825,5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5877397, 5874299 и 6255458, выданных в каждом случае Lonberg и Kay, патентах США с 5591669 и 6023010, выданных Krimpenfort и Berns, патентах США с 5612205, 5721367 и 5789215, выданных Berns et al., и патенте США 5643763, выданномChoi и Dunn, и заявках на патент GenPharm International с порядковыми 07/574748, поданной 29 августа 1990 г., 07/575962, поданной 31 августа 1990 г., 07/810279, поданной 11 декабря 1991 г., 07/853408,поданной 18 марта 1992 г., 07/904068, поданной 23 июня 1992 г., 07/990860, поданной 16 декабря 1992 г.,08/053131, поданной 26 апреля 1993 г., 08/096762, поданной 22 июля 1993 г., 08/155301, поданной 18 ноября 1993 г., 08/161739, поданной 3 декабря 1993 г., 08/165699, поданной 10 декабря 1993 г., 08/209741,поданной 9 марта 1994 г., описания которых включены здесь путем отсылки. См. также европейский патент 0546073 В 1, международные заявки на патент WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 и WO 98/24884 и патент США 5981175, описания которых включены здесь путем отсылки в их полном виде. См. дополнительно Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., 1994, Tayloret al., 1994, and Tuaillon et al., 1995, Fishwild et al., 1996, описания которых включены здесь путем отсылки в их полном виде.Kirin продемонстрировал также получение антител человека из мышей, в которых посредством слияния микроклеток, были введены большие участки хромосом или целые хромосомы. См. европейские заявки на патент с 773288 и 843961, описания которых включены в качестве ссылки. Дополнительно были получены КМ-мыши, которые являются результатом кроссбридинга Тс-мышей Kirin с минилокусом мышей Medarex (Humab). Эти мыши имели НС-трансхромосому мышей Kirin и трансген -цепи мышей Medarex (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102). Антитела человека могут быть также получены способами in vitro. Подходящие примеры включают в себя, но не ограничиваются ими, фаговый дисплей (в виде продаваемого способа Cambridge AntibodyTechnology, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (ранее Proliferon), Affimed),рибосомный дисплей (в виде продаваемого способа Cambridge Antibody Technology), дрожжевой дисплей и т.п. Антитела, описанные здесь, получали с использованием технологии XENOMOUSE, как описано ниже. Затем такие мыши способны продуцировать молекулы иммуноглобулина человека и антитела и являются недостаточными в отношении продуцирования молекул иммуноглобулина и антител. Технологии, используемые для их получения, описаны в патентах, заявках и ссылках, описанных в разделе Область техники. В частности, однако, предпочтительный вариант осуществления трансгенного получения мышей и антител из них описан в заявке на патент США с порядковым 08/759,620, поданной 3 декабря 1996 г, и международных заявках на патент сWO 98/24893, опубликованной 11 июня 1998 г., иWO 00/76310, опубликованной 21 декабря 2000 г., описания которых включены здесь в качестве ссылки. См. также Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), описание которой включено здесь в качестве ссылки. Посредством применения такой технологии были получены полностью человеческие моноклональные антитела к различным антигенам. По существу, линии XENOMOUSE мышей иммунизируют представляющим интерес антигеном (например, HER-3), из этих мышей извлекают лимфатические клетки(такие как В-клетки), которые экспрессируют антитела, и извлеченные клеточные линии сливают с клеточной линией миелоидного типа для получения иммортализованных гибридомных клеточных линий. Эти гибридомные клеточные линии подвергают скринингу и отбору для идентификации гибридомных клеточных линий, которые продуцируют антитела, специфические в отношении представляющего интерес антигена. Здесь обеспечены способы получения множественных гибридомных клеточных линий, которые продуцируют антитела, специфические в отношении HER-3. Кроме того, здесь обеспечена характеристика антител, продуцируемых такими клеточными линиями, в том числе анализы нуклеотидной и аминокислотной последовательностей тяжелой и легкой цепей таких антител. Обычно антитела, продуцируемые этими слитыми гибридомами, были тяжелыми цепями IgG1 человека с полностью человеческими легкими цепями . Описанные здесь антитела имеют тяжелые цепиIgG4 человека, а также тяжелые цепи IgG1. Антитела могут быть также антителами других изотипов человека, в том числе IgG2 или IgG3. Эти антитела имели высокие аффинности, обычно имели KD приблизительно 10-6-10-13 М или ниже при измерении твердофазным способом и способом на основе клеток. Другой аспект данного изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающий белок этого изобретения. В контексте данного изобретения термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты обозначает полинуклеотид геномного, кДНК или синтетического происхождения или некоторую их комбинацию, которая вследствие ее происхождения как выделенной молекулы нуклеиновой кислоты (1) не связана со всем олигонуклеотидом или частью олигонуклеотида, в которых этот выделенный полинуклеотид обнаруживается в природе, (2) функционально связана с полинуклеотидом, который не связан с ней в природе, или (3) не встречается в природе в виде части большей последовательности. Кроме того, термин молекула нуклеиновой кислоты обозначает в данном контексте полимерную форму нуклеотидов с длиной по меньшей мере 10 оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, или модифицированную форму любого типа нуклеотида, например нуклеотидов с модифицированными или замещенными сахарными группами и т.п. Этот термин включает в себя также одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК. В одном варианте осуществления этого изобретения молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения функционально связана с регуляторной последовательностью. Термин регуляторная последовательность относится в этом контексте к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Природа таких регуляторных последовательностей различается в зависимости от организмахозяина. В прокариотах такие регуляторные последовательности обычно включают в себя промоторы,сайты связывания рибосом и последовательности терминации транскрипции. В эукариотах обычно такие регуляторные последовательности включают в себя промоторы и последовательности терминации транскрипции. В соответствии с данным изобретением термин регуляторная последовательность включает в себя, как минимум, все компоненты, присутствие которых является незаменимым для экспрессии и процессинга, и могут также включать в себя дополнительные компоненты, присутствие которых является предпочтительным, например лидерные последовательности и последовательности партнеров слияния. Кроме того, термин функционально связанные относится в данном контексте к положениям описанных таким образом компонентов, которые находятся в некоторой связи, которая разрешает им функционировать предполагаемым для них образом. Кроме того, согласно данному изобретению регуляторная последовательность экспрессии, связанная с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия этой кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с этой регуляторной последовательностью экспрессии. Следующим аспектом данного изобретения является вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует связывающий белок этого изобретения. Эта молекула нуклеиновой кислоты может быть функционально связана с регуляторной последовательностью. Кроме того, этот вектор может дополнительно содержать сайт инициации репликации или ген селективного маркера. Примерами векторов, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, являются плазмиды, космиды, фаги, вирусы и т.д. Другой аспект данного изобретения относится к клетке-хозяину, трансформированной молекулой нуклеиновой кислоты или вектором этого изобретения. Трансформация может выполняться любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяин, включающих в себя, например, упаковку этого полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и трансдукцию клетки-хозяина этим вирусом (или вектором), или процедурами, известными в данной области, иллюстрированными патентами США с 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455, включенными здесь в качестве ссылки. Конкретно,способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают в себя опосредованную декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомы и прямую микроинъекцию этой ДНК в ядра. Примерами клеток-хозяев, которые могут быть использованы, являются гибридомные эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, например хомячка, кролика, крысы, свиньи, мыши или клетки дру- 11015782 гих млекопитающих; клетки растений и грибные клетки, например кукурузы, табака, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris; прокариотические клетки, такие как Е. coli; и другие клетки, используемые в этой области для получения антител. В частности, линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев, хорошо известны в данной области и включают в себя многие иммортализованные клеточные линии,доступные из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), в том числе, но не только, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почки детеныша хомячка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки печеночно-клеточной карциномы (например, Hep G2) и ряд других клеточных линий. Еще одним аспектом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного агента по меньшей мере один связывающий белок этого изобретения и фармацевтически приемлемые носители, разбавители и/или адъюванты. Термин фармацевтическая композиция относится в этом контексте к химическому соединению или композиции, способными индуцировать желаемое терапевтическое действие при правильном введении пациенту (см. словарь The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985), включенный здесь в качестве ссылки). Согласно данному изобретению эффективность фармацевтической композиции данного изобретения основана на связывании по меньшей мере одного связывающего белка с HER-3. Предпочтительно это связывание приводит к уменьшению HER-3-опосредованной трансдукции сигнала. Кроме того, термин носители включает в себя в данном контексте носители, эксципиенты или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клетки или млекопитающего, подвергнутых их действию в используемых дозах и концентрациях. Часто физиологически приемлемым носителем является водный раствор с забуференным рН или липосома (небольшой пузырек, состоящий из различных типов липидов, фосфолипидов и поверхностноактивных веществ, которые применимы для доставки лекарственного средства в млекопитающее). Примеры физиологически приемлемых носителей включают в себя буферы, такие как фосфатный, нитратный и содержащий другие органические кислоты; антиоксиданты, в том числе аскорбиновая кислота; низкомолекулярные (менее чем 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин,желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахароспирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS (плуроники). В одном варианте осуществления данного изобретения по меньшей мере один связывающий белок этого изобретения, содержащийся в этой фармацевтической композиции, связан с эффектором, таким как калихеамицин, Ауристатин-РЕ, радиоизотоп или токсичный химиотерапевтический агент, такой как гелданамицин и майтансин. В частности, эти конъюгаты связывающего белка применимы в нацеливании на клетки, например, раковые клетки, экспрессирующие HER-3, для элиминации. Кроме того, связывание связывающих белков этого изобретения с радиоизотопами обеспечивает,например, преимущества для лечения опухолей. В отличие от химиотерапии и других форм лечения рака, радиоиммунотерапия или введение комбинации радиоизотопсвязывающий белок, непосредственно поражает раковые клетки с минимальным повреждением окружающей нормальной, здоровой ткани. Этой волшебной пулей пациент может лечиться с использованием гораздо меньших количеств радиоизотопов, чем в случае других форм лечения, доступных в настоящее время. Предпочтительные радиоизотопы включают в себя иттрий 90 (90Y), индий 111 (111In), 131I, 99mTc, радиосеребро-111, радиосеребро-199 и висмут 213. Связывание радиоизотопов со связывающими белками этого изобретения может, например,выполняться с использованием общепринятых бифункциональных хелатов. Поскольку серебро является одновалентным, для связывания радиосеребра-111 и радиосеребра-199, могут быть использованы линкеры на основе серы (Hazra et al., Cell Biophys. 24-25, 1-7 (1994. Связывание радиоизотопов серебра может включать в себя восстановление иммуноглобулина аскорбиновой кислотой. Кроме того, тиуксетан является линкерным хелатором MX-DTPA, присоединенным к ибритумомабу для образования ибритумомаб-тиуксетана (Zevalin) (Witzig, T.E, Cancer Chemother. Pharmacol. 48 Suppl. 1, 91-5 (2001). Ибритумомаб-тиуксетан может взаимодействовать с радиоизотопами, такими как индий 111 (111In) или 90Y с образованием 111In-ибритумомаб-тиуксетана и 90Y-ибритумомаб-тиуксетана соответственно. Кроме того, связывающий белок этого изобретения, в частности, при применении для лечения рака,может быть конъюгирован с токсичными химиотерапевтическими средствами, такими как калихеамицин(Hamann et al., Bioconjug. Chem. 13(1), 40-6 (2002), гелданамицин (Mandler et al., J. Natl. Cancer Inst,92(19), 1549-51 (2000 и майтансин, например майтансиноидное лекарственное средство, DM1 (Liu et al.,Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 93:8618-8623 (1996. Различные линкеры, которые высвобождают эти лекарственные средства при кислотных или восстанавливающих условиях или после воздействия специфическими протеазами, могут быть использованы с этой технологией. Согласно данному изобретению связывающий белок этого изобретения может быть конъюгирован, как описано в данной области.- 12015782 Ауристатин-РЕ, например, является антимикротрубочковым агентом, который является структурной модификацией пептидного компонента морского безраковинного моллюска доластатина 10. Ауристатин-РЕ имеет как противоопухолевую, так и противоопухолевую васкулярную активность (Otani et al.,Jpn. J. Cancer Res. 91(8), 837-44 (2000. Например, ауристатин-РЕ ингибирует рост клеток и индуцирует остановку клеточного цикла и апоптоз в клеточных линиях рака поджелудочной железы (Li et al., Int. J.Mol. Med. 3(6), 647-53 (1999. Таким образом, для специфического нацеливания противоопухолевой активности и противоопухолевой васкулярной активности ауристатина-РЕ на конкретные опухоли ауристатин-РЕ может быть конъюгирован со связывающим белком этого изобретения. В одном варианте осуществления этого изобретения эта фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один дополнительный активный агент. Примерами дополнительных активных агентов,которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, являются антитела или низкомолекулярные ингибиторы других рецепторных протеинкиназ, таких как EGFR, HER-2, HER-4, IGFR1 или c-met, лиганды рецепторов, такие как васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF), цитотоксические агенты, такие как доксорубицин, цисплатин или карбоплатин, цитокины или противоопухолевые агенты. Многие противоопухолевые агенты известны в настоящее время в данной области. В одном варианте осуществления этот противоопухолевый агент выбран из группы терапевтических белков,в том числе, но не только, антител или иммуномодуляторных белков. В другом варианте осуществления противоопухолевый агент выбран из группы низкомолекулярных ингибиторов или химиотерапевтических агентов, состоящей из митотических ингибиторов, ингибиторов киназ, алкилирующих агентов, антиметаболитов, интеркалирующих антибиотиков, ингибиторов факторов роста, ингибиторов клеточного цикла, ферментов, ингибиторов топоизомеразы, ингибиторов гистондеацетилазы, агентов против выживания, модификаторов биологических реакций, антигормонов, например антиандрогенов, и ингибирующих ангиогенез агентов. Когда противоопухолевым агентом является облучение, лечение может достигаться с использованием либо внутреннего (брахитерапия ВТ), либо наружного (наружная терапия с направленным облучением: EBRT) источника. Фармацевтическая композиция данного изобретения особенно пригодна для диагностики, предупреждения или лечения гиперпролиферативного заболевания. Это гиперпролиферативное заболевание может быть ассоциировано с увеличенной трансдукцией сигнала семейства HER. В частности, это заболевание может быть ассоциировано с увеличенным фосфорилированием HER-3 и/или увеличенным комплексообразованием между HER-3 и другими членами семейства HER и/или увеличенной активностью киназы PI3 и/или увеличенной активности терминальной киназы c-jun и/или активности AKT и/или увеличенной активности ERK2 и/или активности PYK2. Предпочтительно это гиперпролиферативное заболевание выбрано из группы, состоящей из рака молочной железы, желудочно-кишечного рака, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака желудка, рака эндометрия, рака слюнных желез, рака легкого, рака почки, рака ободочной кишки, колоректального рака, рака щитовидной железы, рака мочевого пузыря, глиомы, меланомы или других экспрессирующих или сверхэкспрессирующих HER-3 раковых опухолей, и образования опухолевых метастазов. В соответствии с данным изобретением термин предупреждение или лечение относится в данном контексте как к терапевтическому лечению, так и профилактическим или превентивным мерам, при помощи которых пациент, нуждающийся в этом, подлежит предупреждению или замедлению (ослаблению) патологического состояния или нарушения, которое является мишенью. Пациенты, нуждающиеся в предупреждении или лечении, включают в себя пациентов, уже имеющих это нарушение, а также пациенты,склонные к развитию этого нарушения, или пациенты, в которых должно быть предотвращено это нарушение. Пациентом, нуждающимся в предупреждении или лечении, является пациент-млекопитающее,т.е. любое животное, классифицируемое как млекопитающее, в том числе люди, домашние и сельскохозяйственные животные и животные зоопарков, спортивные животные или любимые животные, такие как собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи, козы, кролики и т.д. Предпочтительно пациентом, нуждающимся в лечении, является пациент-человек. Согласно данному изобретению фармацевтическая композиция этого изобретения может быть приготовлена смешиванием активного агента (активных агентов) с физиологически приемлемыми носителями, разбавителями и/или адъювантами и необязательно другими агентами, которые обычно включают в готовые формы для обеспечения улучшенного переноса, доставки, переносимости и т.п. Фармацевтическая композиция этого изобретения может быть приготовлена, например, в форме лиофилизированных композиций, водных растворов, дисперсий или твердых препаратов, таких как таблетки, драже или капсулы. Множество подходящих готовых форм может быть найдено в фармакологическом справочнике,известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed, Mack PublishingCompany, Easton, PA (1990, в частности в части 87 (Chapter 87), написанной Block, Lawrence, в этом справочнике. Эти готовые формы включают в себя, например, порошки пасты, мази, желе, воски, масла,липиды, содержащие липид (катионные или анионные) носители (такие как Липофектин), ДНКконъюгаты, безводные абсорбционные пасты, эмульсии типа масло-в-воде и вода-в-масле, эмульсии carbowax (полиэтиленгликоли различных молекулярных масс), полутвердые гели и полутвердые смеси, со- 13015782 держащие carbowax. Любые из предыдущих смесей могут быть подходящими в лечении и терапиях в соответствии с данным изобретением при условии, что активный агент в этой готовой форме не инактивируется этой готовой формой и эта готовая форма совместима со способом введения и выдерживает конкретный способ введения. См. также Baldrick P., "Pharmaceutical excipient development: the need foral., "Compendium of excipients for parenteral formulations", PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52, 238-311 (1998); и цитирования в них в отношении дополнительной информации, относящейся к композициям, эксципиентам и носителям, хорошо известным химикам-фармацевтам. Другой аспект данного изобретения относится к применению, по меньшей мере, одного выделенного связывающего белка этого изобретения и необязательно по меньшей мере одного другого активного агента, например по меньшей мере одного противоопухолевого агента, описанного выше, в смеси с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или адъювантами, для приготовления фармацевтической композиции для диагностики, предупреждения или лечения гиперпролиферативного заболевания. Предпочтительно эта фармацевтическая композиция является фармацевтической композицией,описанной выше, а этим гиперпролиферативным заболеванием является гиперпролиферативное заболевание, упомянутое выше. Еще один аспект данного изобретения относится к способу диагностики заболеваний и состояний,связанных с экспрессией HER-3, предусматривающему контактирование пробы со связывающим белком этого изобретения и детектирование присутствия HER-3 в этой пробе. Этой пробой может быть клетка,которая обнаруживает экспрессию HER-3, такая как опухолевая клетка, проба крови или другая подходящая проба. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения заболеваниями или состояниями, ассоциированными с экспрессией HER-3, являются определенные выше гиперпролиферативные заболевания. Согласно данному изобретению этот способ может быть, например, использован для детектирования антигена HER-3 в клетке, для определения концентрации антигена HER-3 в пациентах, страдающих от гиперпролиферативного заболевания, упомянутого выше, или для определения стадии указанного гиперпролиферативного заболевания в пациенте. Для определения стадии прогрессирования гиперпролиферативного заболевания в исследуемом субъекте или для характеристики реакции этого субъекта на ход терапии, может быть взята проба крови из этого субъекта и может быть определена концентрация антигена HER-3, присутствующего в этой пробе. Полученную таким образом концентрацию используют для идентификации, в какой диапазон концентраций попадает эта величина. Идентифицированный таким образом диапазон коррелирует со стадией прогрессирования или со стадией терапии, идентифицированной в различных популяциях диагностируемых субъектов, с обеспечением посредством этого стадии заболевания исследуемого субъекта. Для оценки количества присутствующего антигена HER-3 может быть также использована биопсия ткани этого заболевания, например, рака, полученной из этого пациента. Количество антигена HER-3, присутствующего в этой ткани заболевания, может оцениваться иммуногистохимией, ELISA или ранжированным рядом антител с использованием HER-3-антител этого изобретения. Другими параметрами, представляющими диагностический интерес, являются состояние димеризации, а также партнеры димеризации белка HER-3 и состояние активации этого белка и его партнеров. Способы анализа белков для определения этих параметров хорошо известны в данной области и включают в себя, среди прочих, способы вестерн-блоттинга и иммунопреципитации, FACS-анализ, химическое сшивание, резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET), резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) и т.п. (например, Price et al., Methods in Molecular Biology, 218: 255-268(2002) или eTag-технологию (WO 0503707, WO 04091384, WO 04011900). Кроме того, данное изобретение относится в другом аспекте к способу предупреждения или лечения заболеваний или состояний, ассоциированных с экспрессией HER-3 в пациенте, предусматривающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества по меньшей мере одного связывающего белка этого изобретения. Предпочтительно этими заболеваниями или состояниями, ассоциированными с экспрессией HER-3, являются определенные выше гиперпролиферативные заболевания. Пациентом, нуждающимся в предупреждении или лечении, является пациент-млекопитающее, т.е. любое животное, классифицируемое как млекопитающее, в том числе люди, домашние и сельскохозяйственные животные и животные зоопарков, спортивные животные или любимые животные, такие как собаки,кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи, козы, кролики и т.д. Предпочтительно пациентом,нуждающимся в лечении, является пациент-человек. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения, способ предупреждения или лечения гиперпролиферативного заболевания в пациенте, нуждающемся в этом, предусматривает введение этому пациенту эффективного количества по меньшей мере одного связывающего белка этого изобретения и дополнительно по меньшей мере одного другого активного агента, например по меньшей мер, одного противоопухолевого агента, упомянутого выше. Предпочтительно этот способ предназначен для ингибирования ненормального роста, ненормальной миграции или инвазии клеток.- 14015782 Кроме классических способов введения потенциальных содержащих связывающий белок терапевтических средств, например через вышеуказанные готовые формы, недавно развитые способы введения могут быть также применимы к данному изобретению. Например, сообщалось локальное введение 131Iмеченого моноклонального антитела для лечения первичных опухолей головного мозга после хирургической резекции. Кроме того, исследуется клинически и преклинически прямая стереотаксическая интрацеребральная инъекция моноклональных антител и их фрагментов. Интракаротидная гиперосмолярная перфузия является экспериментальной стратегией для лечения первичной злокачественности головного мозга лекарственным средством, конъюгированным с моноклональными антителами человека. В зависимости от типа и тяжести подлежащего лечению состояния приблизительно 1-15 мг/кг по меньшей мере одного связывающего белка этого изобретения могут вводиться пациенту, нуждающемуся в этом, например, посредством одного или нескольких отдельных введений или непрерывной инфузией. Типичная суточная доза может находиться в диапазоне приблизительно 1 мкг/кг - приблизительно 100 мг/кг в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторяемых введений на протяжении нескольких дней или более продолжительного времени в зависимости от подлежащего лечению состояния это лечение поддерживается, пока не произойдет подавление симптомов заболевания. Доза этого по меньшей мере одного вводимого противоопухолевого агента зависит от различных факторов. Этими факторами являются, например, природа агента, тип опухоли или способ введения. Следует подчеркнуть, что данное изобретение не ограничивается какой-либо дозой. Наконец, данное изобретение относится в дополнительном аспекте к набору для диагностики, предупреждения или лечения гиперпролиферативных заболеваний, ассоциированных с опосредованнойHER-3 трансдукцией сигнала, содержащему по меньшей мере один связывающий белок, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор этого изобретения. Кроме того, набор этого изобретения может дополнительно содержать по меньшей мере один другой активный агент, например по меньшей мере один другой противоопухолевый агент, как упоминалось выше. Далее данное изобретение будет объясняться следующими примерами и сопутствующим графическим материалом. Примеры Следующие примеры, включающие в себя проводимые эксперименты и полученные результаты,обеспечены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничение данного изобретения. Пример 1. Получение антигена HER-3 и клеточной линии. В данном исследовании получали рекомбинантные белки HER-3. кДНК внеклеточного доменаHER-3 (ECD) клонировали полимеразной цепной реакцией (ПЦР) из pcDNA3-HER-3 (экспрессирующего вектора с полноразмерным HER-3 человека, C. Wallasch et al., EMBO J. 14, 4267-4275) с праймерами на основе последовательности HER-3 (Genebank AccNr. NM001982). Праймеры, используемые для амплификации HER-3, были следующими: Прямой праймер: 5'-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3' (SEQ ID NO: 233) Обратный праймер: 5'-GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTTGTCCTAAACAGTCTTG-3'(SEQ ID NO: 234). Продукт ПЦР расщепляли BamHI и XbaI и лигировали в pcDNA3 (Invitrogen), расщепленнуюBamHI и XbaI. Плазмиды трансфицировали в клетки HEK293 с использованием СаРО 4-способа. Слитый белок HER-3-HIS очищали из собранных кондиционированных сред с использованием Ni-NTAаффинной хроматографии. Клетки Ratl HER-3 генерировали переносом ретровирусного гена. Вкратце, клетки GP+E 86 (3105) высевали на чашку для культивирования 60 мм и трансфицировали 2 мкг/мл вектора pLXSN или кДНКpLXSN-HER-3 (С. Wallasch, PhD Thesis, Max-Planck Insitute of Biochemistry, Martinsried, Germany) с использованием кальций-фосфатного способа. Спустя 24 ч среду заменяли свежей средой и клетки GP+E 86 инкубировали в течение 4-8 ч. Затем субконфлюэнтные клетки Ratl (2105 клеток на чашку 6 см) инкубировали с супернатантами клеток GP+E 86, высвобождающими высокий титр pLXSN или pLXSNHER-3, р-вируса (1106 G418 KOE/мл; множественность заражения 10), в течение 4-12 ч в присутствии Полибрена (4 мг/мл; Aldrich). После замены среды начинали отбор клеток Ratl с G418. Обычно стабильные клоны извлекали после отбора в течение 21 дня. Пример 2. Экспрессия HER-3 в клеточных линиях рака человека. Рецепторные тирозинкиназы, такие как, например, HER-3, играют решающую роль в инициации и прогрессировании гиперпролиферативных заболеваний, таком как переход от роста доброкачественных гиперпластических клеток к злокачественной карциноме. Поскольку экспрессия HER-3 варьируется между опухолевыми клетками и нормальной тканью, анализ экспрессии HER-3 является решающим фактором для идентификации подгрупп пациентов, которые могли бы получить пользу от лечения связывающими белками этого изобретения. Таким образом, экспрессию HER-3 определяли количественно в панели линий раковых клеток человека для выяснения роли HER-3 в образовании рака человека. Линии раковых клеток выращивали в соответствии с рекомендациями АТСС. Более подробно, 105 клеток собирали с- 15015782 использованием 10 мМ ЭДТА в ЗФР, промывали один раз FACS-буфером (ЗФР, 3% ФТС, 0,4% азид) и высевали на 96-луночный круглодонный планшет. Эти клетки откручивали в течение 3 мин при 1000 об/мин для удаления супернатанта и затем ресуспендировали с -HER-3-антителом 2D1D12 (WO 03013602) (3 мкг/мл). Суспензии клеток инкубировали на льду в течение 1 ч, промывали дважды FACSбуфером и ресуспендировали с вторичным антителом (100 мкл на лунку) ослиным антителом против антитела человека-РЕ (Jackson), разведенным 1:50 в FACS-буфере. Эти суспензии клеток инкубировали на льду и в темноте в течение 30 мин, промывали дважды FACS-буфером и анализировали (FACS, Beckman Coulter). Фиг. 1 показывает репрезентативные результаты этого анализа и демонстрирует, что HER-3 экспрессируется в различных раковых заболеваниях человека. Пример 3. Иммунизация и определение титра. Белок ECD HER-3, который получали, как описано в примере 1 и в клетках С 32 (меланома человека; АТСС CRL-1585), использовали в качестве антигена. Моноклональные антитела против HER-3 получали последовательной иммунизацией мышей XenoMouse (штаммов XenoMouse: XMG1 и XMG4,Abgenix, Inc. Fremont, CA). Животных XenoMouse иммунизировали через подушечку стопы для всех инъекций. Общий объем каждой инъекции был равен 50 мкл на мышь, 25 мкл на подушечку стопы. Для когорты 1 (10 мышей XMG1) начальная иммунизация была равна 10 мкг белка ECD HER-3,смешанного 1:1 (об./об.) с TITERMAX GOLD (Sigma, Oakville, ON), на мышь. Следующие пять бустеринъекций выполняли с использованием 10 мкг белка ECD HER-3, смешанного 1:1 (об./об.) с 100 мкг геля квасцов (Sigma, Oakville, ON) в апирогенном D-ЗФР. Шестая бустер-инъекция состояла из 10 мкг белкаECD HER-3, смешанного 1:1 (об./об.) с TITERMAX GOLD. Седьмая инъекция состояла из 10 мкг белкаECD HER-3, смешанного 1:1 об./об. с 100 мкг геля квасцов. Конечную бустер-инъекцию выполняли с использованием 10 мкг белка ECD HER-3 в апирогенном D-ЗФР, без адъюванта. Мышей XenoMouse иммунизировали в дни 0, 4, 7, 11, 15, 20, 24 и 29 в течение этого протокола и слияния выполняли в день 33. Два кровопускания выполняли в соответствии с процедурой ретробульбарного кровопускания в день 13 после четвертого бустера, в день 19 после шестого бустера. Когорты 2 не было. Для когорты 3 (10 мышей XMG1) и когорты 4 (10 мышей XMG4) первой инъекцией были 107 клеток С 32 в апирогенном ЗФР Дульбекко (DPBS), смешанном 1:1 (об./об.) с TITERMAX GOLD, на мышь. Следующие четыре бустера содержали 107 клеток С 32 в апирогенном DPBS, смешанном с 25 мкгAdju-Phos и 10 мкг CpG, на мышь. Шестой бустер был с 107 клеток С 32 в апирогенном DPBS, смешанном 1:1 (об./об.) с TITERMAX GOLD, на мышь. Седьмой, восьмой, девятый бустеры были с 107 клеток С 32 в апирогенном DPBS, смешанном с 25 мкг Adju-Phos и 10 мкг CpG, на мышь. С десятого до четырнадцатого бустеров вводили 5 мкг белка ECD HER-3 в апирогенном DPBS, смешанном с 25 мкг AdjuPhos и 10 мкг CpG, на мышь. Конечный бустер состоял из 5 мкг белка ECD HER-3 в апирогенном DPBS,без адъюванта. Обе когорты 3 и 4 мышей XenoMouse иммунизировали в дни 0, 3, 7, 11, 14, 17, 21,24, 28, 33, 35, 38, 42 и 45 для этого протокола и слияния выполняли в день 49. Выполняли три кровопускания через ретробульбарное кровопускание в день 12 после четвертого бустера, в день 19 после шестого бустера и в день 40 после двенадцатого бустера. Отбор животных для сбора по титру. Для когорты 1 титры анти-HER-3-антител в сыворотке из иммунизированных мышейXenoMouse определяли при помощи ELISA против белка ECD HER.-3. Конкретный титр каждого животного XenoMouse определяли из оптической плотности при 650 нм, титры показаны в табл. 1 ниже. Величина титра является обратной величиной наивысшего разведения сывороток с показателем OD, в 2 раза большим, чем показатель фона. Таким образом, чем выше эта величина, тем больше гуморальная иммунная реакция на ECD HER-3. Таблица 1 Когорта 1. XMG1- 16015782 Для когорты 1 и 4 титры анти-HER-3-антител в сыворотке из иммунизированных мышейXenoMouse определяли при помощи FACS с использованием клеток Rat1/HER-3 (антигенположительной клеточной линии) и клеток Rat1/pLSXN (антигенотрицательной клеточной линии). Данные представлены в виде геометрического среднего (геом. среды) интенсивности флуоресценции окрашивания клеток с анти-HER-3-антителами серийными разведениями проб сыворотки. Таблица 2 Когорта 3. XMG1 Пример 4. Извлечение лимфоцитов, выделение В-клеток, слияние и получение гибридом. Иммунизированных мышей умерщвляли и лимфатические узлы собирали и объединяли из каждой когорты. Лимфоидные клетки диссоциировали растиранием в DMEM для высвобождения клеток из этих тканей и эти клетки суспендировали в DMEM. Клетки считали и 0,9 мл DMEM на 100 миллионов лимфоцитов добавляли к осадку клеток для осторожного, но полного ресуспендирования этих клеток. С использованием 100 мкл CD90+ магнитных гранул на 100 миллионов клеток эти клетки метили инкубированием этих клеток с магнитными гранулами при 4 С в течение 15 мин. Магнитно-меченую суспензию клеток, содержащую 108 положительных клеток (или до 2109 всех клеток), наносили на LS+ колонку и эту колонку промывали DMEM. Общий эффлюент собирали в качестве CD90-негативной фракции (ожидалось, что большинство этих клеток являются В-клетками). Слияние выполняли смешиванием промытых обогащенных В-клеток из полученных выше В-клеток и несекреторных клеток миеломы P3X63Ag8.653, приобретенных из АТСС (Cat. No. CRL 1580) (Kearneyet al., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550), в отношении 1:1. Эту смесь клеток осторожно осаждали центрифугированием при 800 г. После полного удаления супернатанта эти клетки обрабатывали 2-4 мл раствора проназы (CalBiochem, Cat. No. 53702; 0,5 мг/мл в ЗФР) в течение не более чем 2 мин. Затем добавляли 3-5 мл ФТС для остановки активности фермента и эту суспензию доводили до общего объема 40 мл с использованием раствора для электрослияния клеток, ECFS (0,3 М сахароза, Sigma, Cat. No. S7903, 0,1 мМ ацетат магния, Sigma, Cat. No. М 2545, 0,1 мМ ацетат кальция, Sigma, Cat. No. C4705). Супернатант удаляли после центрифугирования и эти клетки ресуспендировали в 40 мл ECFS. Эту стадию промывки повторяли и клетки опять ресуспендировали в ECFS до концентрации 2106 клеток/мл. Электрослияние клеток выполняли с использованием генератора слияния, модель ЕСМ 2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. Используемый размер камеры для слияния был 2,0 мл, использовали следующие уставки прибора: условия синхронизации: напряжение: 50 В, время: 50 с; разрыв мембран: напряжение: 3000 В, время: 30 мкс; время выдерживания после слияния: 3 с. После ECF суспензии клеток осторожно удаляли из камеры для слияния при стерильных условиях и переносили в стерильную пробирку, содержащую такой же объем среды для культивирования гибридомMannheim). Эти клетки инкубировали в течение 15-30 мин при 37 С и затем центрифугировали при 400 g в течение 5 мин. Эти клетки осторожно ресуспендировали в малом объеме среды для отбора гибридом(среды для культивирования гибридом, дополненной 0,5 НА (Sigma, Cat. No. A9666, и объем доводили должным образом дополнительным количеством среды для отбора гибридом на основе конечного посева в целом 5106 В-клеток на 96-луночный планшет и 200 мкл на лунку. Эти клетки осторожно смешивали и пипетировали в 96-луночные планшеты и давали им расти. В день 7 или 10 эту среду удаляли, клетки снова снабжали средой для отбора гибридом. Пример 5. Отбор кандидатных антител при помощи ELISA. После 14 дней культивирования выполняли первичный скрининг при помощи ELISA супернатантов гибридом из когорты 1 (мышей в когорте 1 произвольно делили на слияние 1 и 2) на HER-3 специфические антитела с использованием очищенного His-меченого ECD HER-3 и выполняли противоскрининг против постороннего His-меченого белка при помощи ELISA с использованием козьего антитела против IgGFc-HRP человека (анти-hulgGFc-HRP) (Caltag Inc., Cat. No. H10507, с использованием концентрации разведения 1:2000) для детектирования связывания IgG человека с ECD HER-3 на планшетах ELISA. Супернатанты старой культуры из лунок позитивного роста гибридомных клеток на основе первичного скрининга удаляли и HER-3-позитивные гибридомные клетки суспендировали со свежей средой для культивирования гибридом и переносили на 24-луночные планшеты. После 2 дней культивирования эти супернатанты были готовы для вторичного подтверждающего скрининга. В этом вторичном подтверждающем скрининге на HER-3-специфические полностью человеческие антитела IgGK, позитивные в первом скрининге, подвергали скринигу при помощи ELISA с двумя наборами детектирующих антител: козьего антитела анти-hulgGFc-HRP (Caltag Inc., Cat. No. H10507, с использованием концентрации разведения 1:2000) для детектирования -цепи иммуноглобулина человека и козьего антитела против-цепи Ig человека-HRP (Southern Biotechnology, Cat. No. 2060-05) для детектирования легкой цепииммуноглобулина человека. Из когорты 1 генерировали 91 полностью человеческое IgG/ HER-3 специфическое моноклональное антитело. Пример 6. Отбор кандидатных антител при помощи FMAT/FACS. После 14 дней культивирования супернатанты гибридом из когорт 3 и 4 (слияние 3 и 4) подвергали скринингу на HER-3-специфические моноклональные антитела посредством FMAT. В первичном скрининге гибридомные супернатанты при конечном разведении 1:10 инкубировали с клеткамиRatl-Her3, экспрессирующими HER-3 человека, и 400 нг/мл Су 5-конъюгированного козьего F(ab')2 антитела против IgG человека, Fc-специфического антитела (Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 109-176098) при комнатной температуре в течение 6 ч. Связывание антител и детектирование образования комплекса антител с клетками измеряли при помощи FMAT (Applied Biosystems). Неспецифическое связывание с этими клетками определяли по их связыванию с исходными клетками Ratl. В целом, 420 гибридом, продуцирующих HER-3-специфические антитела, были отобраны из первичного скрининга слияния 3. Супернатанты из этих размноженных культур опять испытывали с использованием того же самого протокола FMAT, и было подтверждено, что 262 гибридомы из них связываются специфически с экспрессирующими HER-3 клетками. В целом, 193 гибридомы, продуцирующие HER-3-специфические антитела, были отобраны из первичного скрининга слияния 4. Супернатанты из этих размноженных культур испытывали при помощи FACS, и было подтверждено, что 138 из них связываются специфически с экспрессирующими HER-3 клетками. В подтверждающем анализе FACS, клетки Rat1-Xher3 и исходные клетки Rat1 (в качестве негативного контроля) инкубировали с гибридомными супернатантами при разведении 1:2 в течение 1 ч при 4 С в ЗФР, содержащем 2% ФТС. После промывания ЗФР связывание антител с этими клетками детектировали с использованием 2,5 мкг/мл Су 5-конъюгированного козьего F(ab')2 против IgG человека, Fc-специфического антитела (JIR109-176-098) и 5 мкг/мл РЕконъюгированного козьего F(ab')2-антитела против цепичеловека (SB 2063-09). После удаления несвязанных антител промыванием ЗФР эти клетки фиксировали с использованием агента фиксации клеток(цитофикса) (BD 51-2090KZ) при разведении 1:4 и анализировали с использованием FACSCalibur. Пример 7. Отбор гибридом для клонирования. Антитела из когорт 1 и 2 отбирали для клонирования гибридом на основе специфичности в отношении HER-3 в сравнении с HER-1 (EGFR), HER-2 и HER-4 в ELISA с использованием очищенных рекомбинантных внеклеточных доменов, доступных, например, из RD Biosystems, и в анализе на основе FACS линий опухолевых клеток человека, экспрессирующих различные члены семейства HER, и 5 кратного увеличения средней интенсивности флуоресценции в FACS-окрашивании на HER-3 позитивные клетки относительно фона. На основании этих критериев были отобраны в целом 23 гибридомные линии для клонирования посредством высева клеток способом лимитирующих разведений. Антитела из когорт 3 и 4 отбирали для клонирования гибридом на основе специфичности в отношении HER-3 в сравнении с HER-1 (EGFR), HER-2 и HER-4 плюс трех других критериев. Первым критерием был ELISA-скрининг на антитела с эпитопами, содержащимися в домене L2 HER-3 (см. пример Структурный анализ анти-HER-3-антител в этом изобретении).- 19015782 Вторым критерием была нейтрализация связывания биотинилированного херегулина- с HER-3 экспрессирующими клетками в анализе на основе FACS. Клетки SKBR-3 собирали, промывали в культуральной среде, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в культуральной среде. Ресуспендированные клетки помещали в виде аликвот в 96-луночные планшеты. Эти планшеты центрифугировали для осаждения клеток. Тестируемые антитела в истощенных гибридомных супернатантах добавляли при 25 мкл на лунку и инкубировали в течение 1 ч на льду для создания возможности связывания антител. 50 мкл 10 нМ раствора херегулина- (RD Biosystems, Minneapolis, MN) добавляли в каждую лунку с получением конечной концентрации 5 нМ и инкубировали на льду в течение 1,5 ч. Клетки промывали в 150 мкл ЗФР, осаждали центрифугированием и супернатант удаляли. Клетки ресуспендировали в 50 мкл козьего поликлонального антитела против HRG- при 10 мкг/мл и инкубировали в течение 45 мин на льду. Клетки промывали в 200 мкл ЗФР, осаждали центрифугированием и супернатант удаляли. 50 мкл раствора кроличьего Су 5-меченого поликлонального антитела против козьего IgG при 5 мкг/мл плюс 7AAD при 10 мкг/мл добавляли и инкубировали на льду в течение 15 мин. Клетки промывали в 200 мкл ЗФР, осаждали центрифугированием и супернатант удаляли. Клетки ресуспендировали в 100 мкл FACS-буфера и считывали в FACS. Тестируемые HER-3-антитела, которые уменьшали связывание херегулина-, были антителами, которые имели самую низкую интенсивность флуоресценции. В качестве позитивных контролен использовали серийные разведения 1:5 от 10000 до 16 нг/мл мышиного HER-3-mAb (105.5) или HER-3-mAb IgG человека, U1-49. Негативными контролями были один херегулин-, одни клетки, одно козье поликлональное антитело против херегулина- и одно кроличье Су 5-меченое поликлональное антитело против козьего IgG. Третьим критерием было относительное ранжирование в отношении аффинности и/или более высокой относительной средней флуоресценции в FACS с использованием HER-3-экспрессирующих клеточных линий. Относительное ранжирование в отношении аффинности выполняли нормализацией концентраций HER-3-специфических антител и построения кривых (диаграмм) в зависимости от данных изELISA с лимитирующим антигеном следующим образом. Нормализация концентраций антигенспецифических антител с использованием ELISA для высоких количеств антигенов. С использованием способа ELISA супернатанты нормализовали в отношении концентрации антигенспецифического антитела. С использованием двух IgG1-антител против HER-3 человека из когорты 1 известной концентрации, титруемых параллельно, получали калибровочную кривую и количество антигенспецифического антитела в тестируемых гибридомных супернатантах из когорт 3 и 4 сравнивали с этим стандартом. Таким путем оценивали концентрацию IgG-антитела против HER-3 человека в каждой гибридомной культуре. Планшеты с нейтравидином готовили нанесением нейтравидина при 8 мкг/мл в смеси 1 ЗФР/0,05% азид натрия на планшеты для связывания Costar 3368 при 50 мкл на лунку с инкубированием в течение ночи при 4 С. На следующий день эти планшеты блокировали смесью 1 ЗФР/1% обезжиренное молоко. Фотобиотинилированный his-меченый ECD HER-3 при 500 нг/мл в смеси 1 ЗФР/1% обезжиренное молоко связывали с нейтравидиновыми планшетами инкубированием в течение 1 ч при комнатной температуре. Гибридомный супернатант, серийно разведенный 1:2,5 из исходного разведения 1:31 до конечного разведения 1:7568 в смеси 1 ЗФР/1% обезжиренное молоко/0,05% азид, добавляли при 50 мкл на лунку и затем инкубировали в течение 20 ч при комнатной температуре. Использовали серийные разведения для гарантии получения OD-показаний для каждой неизвестной величины в линейном диапазоне этого анализа. Затем добавляли второе детектирующее антитело, козье антитело противFc IgG человека-HRP при 400 нг/мл в смеси 1 ЗФР/1% обезжиренное молоко при 50 мкл на лунку. После 1 ч при комнатной температуре эти планшеты опять промывали водой и в каждую лунку добавляли однокомпонентный субстрат ТМВ. Реакцию останавливали спустя 30 мин добавлением 50 мкл 1 М хлористо-водородной кислоты в каждую лунку и эти планшеты считывали при длине волны 450 нм. Калибровочную кривую получали из двух IgG1-HER-3-mAb из когорты 1, серийно разведенных при 1:2 от 1000 до 0,06 нг/мл, и оценивали в ELISA с использованием вышеуказанного протокола. Для каждой неизвестной величины использовали OD-показания в линейном диапазоне этого анализа для определения концентрации HER-3-IgG человека в каждой пробе. Анализ с лимитирующим антигеном является способом, который аффинно ранжирует антигенспецифические антитела, полученные в супернатантах культур В-клеток, относительно всех других антигенспецифических антител. В присутствии очень низкого нанесения антигена только антитела с наивысшей аффинностью будут способны связываться с каким-либо детектируемым уровнем при равновесии.(См., например, РСТ-публикацию WO/03048730 A2, озаглавленную "IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING" (Идентификация высокоаффинных молекул скринингом лимитирующих разведений), опубликованную 12 июня 2003 г.). В этом случае два mAb из когорты 1, оба из которых имели известные концентрации и KD, использовали в качестве исходных пунктов в этом анализе. Планшеты с нейтравидином готовили нанесением нейтравидина при 8 мкг/мл в смеси 1- 20015782 ЗФР/0,05% азид натрия на планшеты для связывания Costar 3368 при 50 мкл на лунку с инкубированием в течение ночи при 4 С. На следующий день эти планшеты блокировали смесью 1 ЗФР/1% обезжиренное молоко. Фотобиотинилированный his-меченый ECD HER-3 (50 нг/мл) связывали с нейтравидиновыми планшетами при пяти концентрациях: 125, 62,5, 31,2, 15,6 и 7,8 нг/мл в смеси 1 ЗФР/1% обезжиренное молоко в течение 1 ч при комнатной температуре. Каждый планшет промывали 5 раз водой. Гибридомный супернатант, серийно разведенный 1:2,5 из исходного разведения 1:31 до конечного разведения 1:7568 в смеси 1 ЗФР/1% обезжиренное молоко/0,05% азид, добавляли при 50 мкл на лунку. После инкубирования в течение 20 ч при комнатной температуре на шейкере эти планшеты опять промывали 5 раз dH2O. Затем добавляли второе детектирующее антитело, козье антитело против Fc IgG человека-HRP при 400 нг/мл в смеси 1 ЗФР/1% обезжиренное молоко при 50 мкл на лунку. После 1 ч при комнатной температуре эти планшеты опять промывали 5 раз dH2O и в каждую лунку добавляли 50 мкл однокомпонентного субстрата ТМВ. Реакцию останавливали спустя 30 мин добавлением 50 мкл 1 М хлористоводородной кислоты в каждую лунку и эти планшеты считывали при длине волны 450 нм. OD-показания из концентрации антигена, которая давала величины OD в линейном диапазоне, использовали для анализа данных. Построение кривых данных высокого антигена, которые сравнительно оценивают концентрацию специфического антитела (см. выше в отношении деталей), в зависимости от OD лимитирующего антигена иллюстрировало антитела относительно более высокой аффинности, например антитела, которые в связанном виде имели более высокие OD в анализе с лимитирующими разведениями антигена, хотя они имели более низкие количества IgG-HER-3-антитела в супернатанте. Гибридомы из когорт 3 и 4 для 33 наиболее эффективно функционирующих антител в этих сериях анализов использовали для клонирования посевом гибридом с использованием способа лимитирующих разведений. Альтернативно FACS-анализ экспрессии HER-3 клеток Rat1/pLXSN и Rat1/HER-3 показал сходные результаты (отсутствие перекрестной реактивности с эндогенными эпитопами крыс) (фиг. 2). Подробно, 1105 клеток собирали с использованием 10 мМ ЭДТА в ЗФР, промывали один разFACS-буфером (ЗФР, 3% ФТС, 0,4% азид) и высевали на 96-луночный круглодонный планшет. Клетки откручивали в течение 3 мин при 1000 об/мин для удаления супернатанта и затем ресуспендировали со специфическими в отношении семейства HER антителами (3 мкг/мл). Суспензии клеток инкубировали на льду в течение 45 мин, промывали дважды FACS-буфером и ресуспендировали с вторичным антителом(100 мкл на лунку), ослиным антителом против антитела человека-РЕ человека (Jackson Immunoresearch,PA), разведенным 1:50 в FACS-буфере. Эти суспензии клеток инкубировали на льду и в темноте в течение 30 мин, промывали дважды FACS-буфером и анализировали (FACS, Beckman Coulter). Пример 8. Структурный анализ анти-HER-3-антител этого изобретения. В следующем обсуждении обеспечена структурная информация, относящаяся к антителам, полученным в соответствии с этим изобретением. Для анализа структур антител, полученных в соответствии с данным изобретением, гены, кодирующие фрагменты тяжелой цепи и легкой цепи, амплифицировали из конкретной гибридомы. Секвенирование выполняли следующим образом.VH- и VL-транскрипты амплифицировали из индивидуальных гибридомных клонов в 96-луночном планшете с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Поли(А)+/-мРНК выделяли из приблизительно 2105 гибридомных клеток с использованием набора FastTrack (Invitrogen). Выполняли 4 реакции ПЦР для каждой гибридомы: две для легкой цепи каппаи две для тяжелой цепи гамма . Для амплификации использовали набор QIAGEN для одноступенчатой ПЦР при комнатной температуре (Qiagen, Catalog No. 210212). В сопряженных ПЦР-реакциях при комнатной температуре кДНК синтезировали со смесью ферментов, действующих при комнатной температуре (Omniscript и Sensiscript) с использованием праймера, специфического для антисмысловой последовательности, соответствующего С- или консенсусу СН 1-областей генов С. Обратную транскрипцию выполняли при 50 С в течение 1 ч с последующей ПЦР-амплификацией этой кДНК ДНК-полимеразойHotStarTaq для высокой специфичности и чувствительности. Каждая реакция ПЦР использовала смесь 5'смысловых праймеров; последовательности праймеров основывались на лидерных последовательностяхVH и VK, доступных в Web-сайте Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Реакции ПЦР проводили при 94 С в течение 15 мин (начальный горячий старт) с последующими 40 циклами 94 С в течение 30 с (денатурация), 60 С в течение 30 с (отжиг) и 72 С в течение 1 мин (элонгация). Продукты ПЦР очищали и непосредственно секвенировали с использованием прямого и обратного праймеров ПЦР с применением набора ABI PRISM BigDye terminator cycle sequencing ready reaction Kit(Perkin Elmer). Обе цепи секвенировали с использованием наборов Prism dye-terminator sequencing и секвенирующего прибора ABI 377. Анализ последовательности. Анализы последовательностей кДНК V тяжелой цепи и V -цепи человека HER3-антител выполняли сопоставлением последовательностей HER-3 с последовательностями V тяжелой цепи и Vзароды- 21015782 шевой линии человека с использованием программы Abgenix (5AS) лаборатории авторов. Эта программа идентифицировала использование V-гена, D-гена и J-гена, а также нуклеотидных инсерций в рекомбинационных присоединениях и соматических мутаций. Аминокислотные последовательности также генерировали in silico для идентификации соматических мутаций. Сходные результаты могли быть получены с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для анализа последовательностей и публично доступной информации о последовательности генов V, D и J человека, например Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Молекулярное клонирование mAb U1-59. Тотальную РНК экстрагировали из лунки для культивирования ткани, содержащей множественные линии дифференцировки гибридом, в том числе линию дифференцировки гибридомы, секретирующую антитело U1-59. Вариабельную область тяжелой цепи амплифицировали с использованием специфических праймеров семейства 5'-лидера VH с праймером 3'-С-. Основную полосу амплифицировали с использованием праймера VH4, другие полосы не наблюдались. Этот фрагмент VH4-34 клонировали в экспрессирующий вектор pCDNA в рамке считывания с геном константной области 1 человека. Вариабельную область тяжелой цепи IgM амплифицировали с использованием специфических для 5' VH семейства праймеров с 3'-праймером константной области . Основную полосу амплифицировали с использованием праймера VH2, но были видимыми другие полосы, -фрагмент VH2-5 клонировали в экспрессирующий вектор pCDNA в рамке считывания с геном константной областичеловека. Цепи Vамплифицировали и секвенировали. Были идентифицированы четыре продукта ОТ-ПЦР -цепи. Эти продукты секвенировали и после анализа последовательности трансляцией in silico только три из них имели открытые рамки считывания. Эти три функциональные -цепи клонировали из лунки олигоклональной гибридомы U1-59, идентифицированные на основе использования гена Vкак (1) VK1 A3-JK2,(2) VK1 A20-JK3 и (3) B3-JK1. Все Vцепи клонировали в экспрессирующий вектор pCDNA в рамке считывания с константной областью легкой цепичеловека. Трансфекция. Каждую тяжелую цепь трансфицировали с каждой из -цепей в транзиторных трансфекциях для образования в целом 6 пар тяжелая цепь/легкая -цепь. Трансфекция -цепи с -цепью А 20 давала слабую экспрессию антитела, тогда как антитело не секретировалось или не детектировалось при котрансфекции -цепи А 20 с -цепью. В целом, для анализа связывания были доступны три супернатанта IgG и два супернатанта IgM. Активность связывания с HER-3+ клеточными линиями детектировали в FACS с IgG1-mAb, состоящим из VH4-34 и -цепи В 3. Другие комбинации VH/V к давали сигнал флуоресценции выше фона вFACS с использованием HER-3+ клеточных линий. Кокуренция связывания анти-HER-3-антител. Мультиплексное конкурентное связывание антител проводили, как опубликовано в Jia et al. J Immunol Methods. 288, 91-98 (2004), для оценки кластеров HER-3-антител, которые конкурируют за связывание с HER-3. Тестируемые HER-3-антитела из когорты 1 кластеризовали на 5 карманов на основе конкуренции за связывание. Характеристика эпитопов анти-HER-3-антител. Были охарактеризованы эпитопы анти-HER-3-антител человека этого изобретения. Сначала дотблот-анализ восстановленного, денатурированного белка HER-3-His-меченого ECD показал отсутствие связывания тестированными анти-HER-3-антителами (U1-59, U1-61, U1-41, U1-46, U1-53, U1-43, U1-44,U1-47, U1-52, U1-40, U1-49, демонстрируя, что все они имели эпитопы, чувствительные к восстановлению дисульфидных связей, что предполагает, что все они имели непрерывные эпитопы. Затем эти анти- 22015782 тела были картированы до определенных доменов в молекуле HER-3 конструированием различных химерных человек-крыса молекул HER-3, на основе разделения внеклеточного домена HER-3 на четыре домена: 1) L1 (D1): связывающий минорные лиганды домен,2) S1 (D2): первый богатый цистеином домен,3) L2 (D3): связывающие большие лиганды домен и 4) S2 (D4): второй богатый цистеином домен. Внеклеточный домен (ECD) кДНК HER-3 человека амплифицировали из клеток RAT1-HER-3. Крысиные кДНК HER-3 амплифицировали ОТ-ПЦР из РНК печени крысы и подтверждали секвенированием. кДНК, экспрессирующие ECD HER-3 человека и крысы клонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих в виде V5-His-слитых белков. Домены из ECD HER-3 человека вводили в каркас, обеспечиваемый ECD HER-3 крысы с использованием внутренних сайтов рестрикции MfeI, BstXI и DraIII. Таким путем конструировали различные химерные крыса/человек ECD HER-3 HIS-слитые белки (аминокислоты 1-160, 161-358, 359-575, 1-358, 359-604) и экспрессировали их посредством транзиторной трансфекции клеток НЕК 293 Т. Экспрессию этих конструкций подтверждали с использованием крысиного поликлонального антитела против HER-3 человека. Моноклональные антитела человека тестировали в ELISA на связывание этих секретированных химерных ECD. Два из этих антител человека, в том числе антитело U1-59, перекрестно реагировали с крысинымHER-3. Для определения связывающих доменов эти mAb тестировали против укороченной формы HER3, состоящей из L1-S1-V5-his-меченого белка, очищенного из супернатанта клеток HEK 293 Т, трансфицированных плазмидной ДНК, кодирующей экспрессию внеклеточных доменов L1-S1 HER3. mAb U1-59 связывался с белком L1-S1 в ELISA, что предполагало, что его эпитоп находится в L1-S1. mAb 2.5.1 не связывался с белком L1-S1, что предполагало, что его эпитоп находится в L2-S2. Дополнительное картирование антитела U1-59 выполняли с использованием времяпролетной масс-спектрометрии SELDI с протеолитическими продуктами расщепления на чипе комплексов mAb-HER-3 ECD. Картирование эпитопов U1-59 при помощи SELDI. Дополнительное картирование антитела U1-59 выполняли с использованием времяпролетной массспектрометрии SELDI с протеолитическими продуктами расщепления на чипе комплексов mAb-HER-3ECD. Белок А ковалентно связывали с матрицей PS-20-белкового чипа и использовали для захвата mAb. Затем комплекс этого PS20-белкового чипа и моноклонального антитела инкубировали с очищенным антигеном HER-3-His. После этого этот комплекс антитело-антиген расщепляли высокой концентрациейAsp-N. Этот чип промывали, что приводило к удерживанию только пептида HER-3, связанного с этим антителом на чипе. Этот эпитоп определяли при помощи SELDI и идентифицировали по массе этого фрагмента. Этот идентифицированный фрагмент 6814 D соответствует двум возможным ожидаемым пептидам, генерированным из продукта частичного расщепления ECD HER-3-his. Оба перекрывающихся пептида картируются в домене S1. При совместном рассмотрении результатов SELDI и связывания с делеционной конструкцией HER-3 можно сделать вывод, что этот эпитоп картируется в остатках 251-325. Местоположения связывающих доменов во внеклеточной части HER-3, которые узнаются антиHER-3-mAb человека этого изобретения, суммированы в табл. 4. Результаты картирования доменов эпитопов согласовались с результатами из определения резервуаров конкуренции (bins) конкурентного связывания антител, причем антитела, которые перекрестно конкурируют друг с другом за связывание сHER-3, также картированы в тех же самых доменах на HER-3 (фиг. 3).- 23015782 Таблица 4 Суммирование результатов по связывающим доменам mAb на основе результатов анализа ELISA ПР = перекрестно реактивный Пример 9. Определение канонических классов антител.Chothia, et al. описали структуру антитела в виде канонических классов гипервариабельных районов каждой цепи иммуноглобулина (J. Mol. Biol., 1987 Aug 20, 196(4):901-17). Атомные структуры Fabи VL-фрагментов различных иммуноглобулинов анализировали для определения родства между их аминокислотными последовательностями и трехмерными структурами их антигенсвязывающих сайтов.Chothia, et al. нашли, что было относительно мало остатков, которые посредством их упаковки, образования водородных связей или возможности предположения необычных фи-, пси- или омегаконформаций были первично ответственными за конформации основной цепи гипервариабельных районов. Было обнаружено, что эти остатки встречаются в сайтах в этих гипервариабельных районов и в консервативном -складчатом каркасе. Посредством испытания последовательностей иммуноглобулинов, имеющих неизвестную структуру, Chothia, et al. показывают, что многие иммуноглобулины имеют гипервариабельные районы, которые являются сходными по размеру с одной из известных структур и,кроме того, содержали идентичные остатки в сайтах, ответственных за наблюдаемую конформацию. Их открытие предполагало, что эти гипервариабельные районы имеют конформации, близкие к конформациям в известных структурах. Для пяти из этих гипервариабельных районов, репертуар конформаций, по-видимому, ограничен относительно малым количеством дискретных структурных классов. Эти обычно встречающиеся конформации основной цепи гипервариабельных районов были названы каноническими структурами. Следующая работа Chothia, et al. (Nature, 1989 Dec 21-28, 342 (6252):87783) и других авторов (Martin, et al. J. Mol. Biol., 1996 Nov 15, 263(5): 800-15) подтвердила, что существует малый репертуар конформаций основной цепи по меньшей мере для пяти из шести гипервариабельных районов антител.CDR каждого антитела, описанного выше, анализировали для определения их канонического класса. Как известно, канонические классы были определены только для CDR1 и CDR2 тяжелой цепи антитела вместе с CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи антитела. Приведенные ниже таблицы суммируют результаты этого анализа. Результаты этих канонических классов представлены в форме HCDR1-HCDR2LCDR1-LCDR2-LCDR3, где "HCDR" относится к CDR тяжелой цепи, a "LCDR" относится к CDR легкой цепи. Так, например, канонический класс 1-3-2-1-5 относится к антителу, которое имеет HCDR1, который попадает в канонический класс 1, HCDR2, который попадает в канонический класс 3, LCDR1, который попадает в канонический класс 2, LCDR2, который попадает в канонический класс 1 и LCDR3, который попадает в канонический класс 5. Были выполнены определения конкретного канонического класса, в которых наблюдали 70% или более высокую идентичность аминокислот в этом антителе с аминокислотами, определенными для каждого канонического класса. Аминокислоты, определенные для каждого антитела, могут быть найдены,например, в статьях Chothia, et al., цитируемых выше. Табл. 5 и 6 сообщают данные по каноническим классам каждого из HER-3-антител. В случаях, когда была меньшая чем 70% идентичность, отнесение к этому каноническому классу отмечено звездочкойдля указания, что была выполнена наилучшая оценка правильного канонического класса на основании длины каждого из CDR и всей суммы данных. В случаях, когда не было совпадающего канонического класса с той же самой длиной CDR, отнесение к- 24015782 этому каноническому классу отмечено буквой s и цифрой, например, s18, что означает CDR с размером 18. В случаях, когда не было данных о последовательности, доступных для одной из тяжелой цепи или легкой цепи, этот канонический класс отмечен буквой Z. Таблица 5 Табл. 7 является анализом количества антител на класс. Количество антител, имеющих конкретный канонический класс, обозначенный в левом столбце, показано в правом столбце. Четыре mAb, не имеющие данных о последовательности одной цепи и, следовательно, имеющие Z в отнесении к каноническому классу, не включены в этот расчет. Наиболее часто встречающейся структурой является 3-1-2-1-1: двадцать одно из сорока одногоmAb, имеющих последовательности как тяжелой цепи, так и легкой цепи, имели эту комбинацию. Таблица 6 Пример 10. Определение аффинности антител. Измерения аффинности анти-HER-3-антител этого изобретения выполняли непрямым анализом Скетчарда FACS. Таким образом, 105 представляющих интерес клеток или клеток SK-Br 3 собирали с использованием 10 мМ ЭДТА в ЗФР, промывали один раз FACS-буфером (ЗФР, 3% ФТС, 0,4% азид) и высевали на 96-луночный круглодонный планшет. Клетки откручивали в течение 3 мин при 1000 об/мин для удаления супернатанта и затем ресуспендировали с антителом -HER (3 мкг/мл) или с разведениями антитела (100 мкл на лунку), начиная с 20 мкг/ил моноклонального антитела человека в FACS-буфере,разведенным с шагом разведения 1:2. Суспензии клеток инкубировали на льду в течение 1 ч, промывали дважды FACS-буфером и ресуспендировали с вторичным антителом (100 мкл на лунку), ослиным антителом против антитела человека-РЕ (Jackson Immunoresearch, PA), разведенным 1:50 в FACS-буфере. Эти суспензии клеток инкубировали на льду и в темноте в течение 30 мин, промывали дважды FACSбуфером и анализировали (FACS, Beckman Coulter). В соответствии с анализом Скетчарда FACS, среднюю величину флуоресценции рассчитывали для каждого измерения. Фоновое окрашивание (= без 1-го антитела) вычитали из каждой средней величины флуоресценции. Строили график Скетчарда, где вели- 25015782 чина х = средняя величина флуоресценции и величина у = средняя величина флуоресценции/концентрацияmAb (нМ). Эту KD брали как абсолютную величину 1/m линейного уравнения. Фиг. 4 показывает кинетический анализ с использованием антитела U1-59 этого изобретения. В следующей таблице 8 приведены измерения аффинности для некоторых антител этого изобретения, выбранных таким образом. Пример 11. Анти-HER-3-антитела этого изобретения индуцируют эндоцитоз рецептора HER-3.HER-3 был идентифицирован как фактор, который может влиять на инициацию и прогрессирование гиперпролиферативных заболеваний, служа в качестве важного привратника опосредованной семейством HER-3 передачи сигнала клетки. Таким образом, если HER-3 эффективно выводится из клеточной поверхности/мембраны интернализацией рецептора, передача сигнала клетки и, следовательно, трансформация и/или поддержание клеток в злокачественности может, в конечном счете, уменьшаться или подавляться. Для исследования, способны ли анти-HER-3-антитела этого изобретения индуцировать ускоренный эндоцитоз HER-3, сравнивали относительное количество молекул HER-3HER-3 на клеточной поверхности после 0,5- и 4-часовой инкубации этих клеток с анти-HER-3-антителами этого изобретения. 310 клеток высевали в нормальной среде для выращивания в чашке с 24 лунками и оставляли расти в течение ночи. Клетки прединкубировали с 10 мкг/мл анти-HER-3-mAb в нормальной среде для выращивания в течение указанных периодов времени при 37 С. Клетки отделяли 10 мМ ЭДТА и инкубировали с 10 мкг/мл анти-HER-3-mAb в промывочном буфере (ЗФР, 3% ФТС, 0,04% азид) в течение 45 мин при 4 С. Клетки промывали дважды промывочным буфером, инкубировали с вторичным антителом, ослиным антителом против антитела человека-РЕ (Jackson), разведенным 1:100, в течение 45 мин при 4 С, промывали дважды промывочным буфером и анализировали FACS (BeckmanCoulter, EXPO). Данные, показанные на фиг. 5, демонстрируют, что обработка клеток анти-HER-3-антителами приводит к интернализации этого рецептора. Данные показаны в виде % интернализации и относятся к уменьшению интенсивности средней флуоресценции обработанных анти-HER-3-антителами проб относительно обработанных контролем проб. Пример 12. Ингибирование связывания лиганда с раковыми клетками SKBr3 анти-HER-3 антителами человека этого изобретения. Эксперименты по конкуренции с радиолигандом выполняли для количественного определения способности анти-HER-3-антител этого изобретения ингибировать связывание лиганда с HER-3 в анализе на основе клеток. Таким образом, анализ связывания рецептора HER-3 выполняли с 4105 клетками SK-BR3, которые инкубировали с различными концентрациями антител в течение 30 мин на льду. 1,25 нМ[I125]HRG/[125I]- -HRG добавляли в каждую лунку и инкубирование продолжали в течение 2 ч на льду. Планшеты промывали пять раз, сушили на воздухе и считали в сцинтилляционном счетчике. Фиг. 6 а-е показывает результаты этих экспериментов, выполненных с репрезентативными анти-HER-3 антителами этого изобретения, и демонстрируют, что антитела этого изобретения способны специфически уменьшать связывание [125I]HRG/[125I]HRG с клетками, экспрессирующими эндогенный HER-3. Пример 13. Ингибирование индуцированного лигандом фосфорилирования HER-3 анти-HER-3 антителами человека этого изобретения. Эксперименты с ELISA выполняли для исследования, способны ли антитела этого изобретения блокировать опосредованную лигандом -HRG активацию HER-3. Опосредованную лигандом активацию HER-3 детектировали по увеличенному фосфорилированию тирозина рецептора. День 1. 1 96-луночный планшет покрывали 20 мкг/мл коллагена I в 0,1 М уксусной кислоте в течение 4 ч при 37 С. 2,5105 клеток высевали в нормальной среде для выращивания. День 2. Клетки голодали в 100 мкл бессывороточной среды в течение 24 ч. День 3. Клетки предынкубировали с 10 мкг/мл анти-HER-3-mAb в течение 1 ч при 37 С и затем обрабатывали 30 нг/мл -HRG-EGF-домена (RD Systems) в течение 10 мин. Среду стряхивали постукиванием и клетки фиксировали 4% раствором формальдегида в ЗФР в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствор формальдегида удаляли и клетки промывали промывочным буфером (ЗФР/0,1% Твин 20). Клетки гасили 1% Н 2 О 2, 0,1% NaN3 в промывочном буфере и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, затем блокировали NET-гелантином в течение 5 ч при 4 С. Первичное антитело фосфо-HER-3 (Tyr1289) (поликлональное кроличье; передача сигнала клетки 4791; 1:300) добавляли в течение ночи при 4 С. День 4. Этот планшет промывали 3 промывочным буфером, затем антитело против кроличьегоPOD-антитела, разбавленное 1:3000 в смеси ЗФР-0,5% БСА, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Планшет промывали 3 промывочным буфером и один раз ЗФР. Добавляли тетраметилбензидин (ТМВ, Calbiochem) и проводили мониторинг при 650 нм. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 250 нМ HCl и оптическую плотность считывали при 450 нм со ссылочной длиной волны 650 нм с использованием планшет-ридера Vmax (Thermo LabSystems). Фиг. 7 а показывает репрезентативные результаты этого эксперимента, демонстрирующие, что антиHER-3-антитела этого изобретения способны уменьшать опосредованную лигандом активацию HER-3,как показано уменьшенным фосфорилированием тирозина рецептора. Данные показаны в виде процент- 26015782 ного уменьшения терапевтическими антителами относительно контрольного антитела. Для тестирования эффективности mAb U1-53 для ингибирования индуцированной HER-3 активации, клетки MCF-7 голодали в течение 24 ч, их инкубировали с mAb U1-53 в течение 1 ч при 37 С и стимулировали 10 нМ HRG- в течение 10 мин. Лизаты переносили в покрытые 1 В 4 (мышиным анти-HER3-mAb) планшеты ELISA и фосфорилирование HER-3 анализировали с антителом 4G10. Как показано на фиг. 7b, фосфорилирование HER-3 почти полностью ингибировалось зависимым от дозы образом с IC50 0,14 нМ. Пример 14. Ингибирование индуцированного лигандом фосфорилирования МАР-киназы P42/D44 анти-HER-3-антителами человека этого изобретения. Следующие эксперименты ELISA выполняли для исследования, способны ли антитела этого изобретения блокировать опосредованную лигандом -HRG активацию МАР-киназы р 42/р 44. Опосредованную лигандом активацию HER-3 детектировали по увеличенному фосфорилированию белка(Thr202/Tyr204). День 1. 1 96-луночный планшет покрывали 20 мкг/мл коллагена I в 0,1 М уксусной кислоте в течение 4 ч при 37 С. 3105 клеток высевали в нормальной среде для выращивания. День 2. Клетки голодали в 100 мкл бессывороточной среды в течение 24 ч. День 3. Клетки предынкубировали с 5 мкг/мл анти-HER-3-mAb в течение 1 ч при 37 С и затем обрабатывали 20 нг/мл -HRG-EGF-домена (RD Systems) в течение 10 мин. Среду стряхивали постукиванием и клетки фиксировали 4% раствором формальдегида в ЗФР в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствор формальдегида удаляли и клетки промывали промывочным буфером (ЗФР/0,1% Твин 20). Клетки гасили 1% Н 2 О 2, 0,1% NaN3 в промывочном буфере и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, затем блокировали ЗФР/0,5% БСА в течение 5 ч при 4 С. Первичное антитело против фосфо-р 44/р 42 МАР-киназы (Thr202/Tyr204) (поликлональное кроличье; передача сигнала клетки 9101; 1:3000) добавляли в течение ночи при 4 С. День 4. Этот планшет промывали 3 промывочным буфером, затем антитело против кроличьего антитела-HRP, разбавленное 1:5000 в смеси ЗФР-0,5% БСА, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Планшет промывали 3 промывочным буфером и один раз ЗФР. Добавляли тетраметилбензидин (ТМВ, Calbiochem) и проводили мониторинг при 650 нм. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 250 нМ HCl и оптическую плотность считывали при 450 нм со ссылочной длиной волны 650 нм с использованием планшет-ридера Vmax (Thermo LabSystems). Фиг. 8 показывает репрезентативные результаты этого эксперимента. Антитела этого изобретения были способны уменьшать опосредованную лигандом активацию МАР-киназы р 42/р 44, как показано уменьшенным фосфорилированием. Данные показаны в виде процентного уменьшения терапевтическими антителами относительно контрольного антитела. Пример 15. Ингибирование P-HRG-индуцированного фосфорилирования фосфо-АКТ-киназы антиHER-3-антителами человека этого изобретения. В следующем эксперименте ELISA авторы исследовали, способны ли антитела этого изобретения блокировать опосредованную лигандом -HRG активацию АКТ-киназы. Опосредованную лигандом активацию АКТ детектировали по увеличенному фосфорилированию белка (Ser473). День 1. 1 96-луночный планшет покрывали 20 мкг/мл коллагена I в 0,1 М уксусной кислоте в течение 4 ч при 37 С. 3105 клеток высевали в нормальной среде для выращивания. День 2. Клетки голодали в 100 мкл бессывороточной среды в течение 24 ч. День 3. Клетки предынкубировали с 5 мкг/мл анти-HER-3-mAb в течение 1 ч при 37 С и затем обрабатывали 20 нг/мл -HRG-EGF-домена (RD Systems) в течение 10 мин. Среду стряхивали постукиванием и клетки фиксировали 4% раствором формальдегида в ЗФР в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствор формальдегида удаляли и клетки промывали промывочным буфером (ЗФР/0,1% Твин 20). Клетки гасили 1% Н 2 О 2, 0,1% NaN3 в промывочном буфере и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, затем блокировали ЗФР/0,5% БСА в течение 5 ч при 4 С. Первичное антитело против фосфо-Akt (Ser473) (поликлональное кроличье; передача сигнала клетки 9217; 1:1000) добавляли в течение ночи при 4 С. День 4. Этот планшет промывали 3 промывочным буфером, затем антитело против кроличьего антитела-HRP, разбавленное 1:5000 в смеси ЗФР-0,5% БСА, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Планшет промывали 3 промывочным буфером и один раз ЗФР. Добавляли тетраметилбензидин (ТМВ, Calbiochem) и проводили мониторинг при 650 нм. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 250 нМ HCl и оптическую плотность считывали при 450 нм со ссылочной длиной волны 650 нм с использованием планшет-ридера Vmax (Thermo LabSystems). Фиг. 9 показывает репрезентативные результаты этого эксперимента. Антитела этого изобретения были способны уменьшать P-HRG-опосредованную активацию AKT, как показано уменьшенным фосфорилированием. Данные показаны в виде процентного уменьшения терапевтическими антителами относительно контрольного антитела. Пример 16. Ингибирование -HRG/-HRG-опосредованной пролиферации клеток MCF7 анти-HER- 27015782 3-антителами человека этого изобретения. Эксперименты in vitro проводили для определения способности антител этого изобретения ингибировать HRG-стимулированную пролиферацию клеток. 2000 клеток MCF7 высевали в ФТС-содержащей среде на 96-луночные планшеты и выдерживали в течение ночи. Клетки предынкубировали в четырех повторностях с антителом, разведенным в среде с 0,5% ФТС в течение 1 ч при 37 С. Клетки стимулировали 30 нг/мл - или 20 нг/мл -HRG (RD Systems) добавлением лиганда непосредственно в раствор антитела и затем оставляли расти в течение 72 ч. Добавляли краситель Аламаровый синий (AlamarBlue) (BIOSOURCE) и инкубировали при 37 С в темноте. Оптическую плотность измеряли при 590 нм каждые 30 мин. Данные получали спустя 90 мин после добавления аламарового синего. Результаты,представленные на фиг. 19, показывают, что репрезентативные антитела этого изобретения ингибируютHRG-индуцированный рост клеток в раковых клетках человека. Данные показаны в виде процентного уменьшения терапевтическими антителами относительно контрольного антитела. Пример 17. Ингибирование -HRG-индуцированный миграции клеток MCF7 анти-HER-3 антителами человека этого изобретения. Эксперименты по трансмиграции выполняли для исследования, блокируют ли антитела этого изобретения миграцию клеток. Голодавшие без сыворотки клетки MCF7 предынкубировали добавлением указанного количества антитела к суспензии клеток и инкубированием их в течение 45 мин при 37 С. Затем 500 мкл суспензии клеток (50000 клеток) помещали в верхнюю камеру покрытых коллагеном I транс-лунок (BD Falcon, поры 8 мкм). В нижней камере использовали 750 мкл среды (MEM, аминокислоты, Na-пируват, пенициллин-стрептомицин, 0,1% БСА, без фетальной телячьей сыворотки), отдельной или содержащей лиганды -HRG-EGF-домен (RD Systems). Клетки оставляли мигрировать в течение 8 ч при 37 С и окрашивали DAPI (красителем на ДНК). Окрашенные ядра считали вручную; процентное ингибирование выражали как ингибирование относительно контрольного антитела. Фиг. 11 показывает результат этого эксперимента, демонстрирующий, что репрезентативные антиHER-3-антитела этого изобретения уменьшают HRG-индуцированную миграцию клеток. Пример 18. Анализ образования колоний (анализ с мягким агаром). Анализы с мягким агаром проводили для исследования способности анти-HER-3-антитела этого изобретения ингибировать рост независимых от прикрепления клеток. Анализ образования колоний в мягком агаре является стандартным анализом in vitro для тестирования трансформированных клеток, так как только такие трансформированные клетки могут расти в мягком агаре. 750-2000 клеток (в зависимости от клеточной линии) предынкубировали с указанными антителами при 10 мкг/мл в среде IMDM (Gibco) в течение 30 мин и ресуспендировали в 0,4% очищенном агареDifco. Суспензию клеток высевали на подслое из 0,75% агарозы, содержащем 20% ФТС, в четырех повторностях в 96-луночном планшете. Колониям давали образовываться в течение 14 дней и затем их окрашивали 50 мкл МТТ (0,5 мг/мл в ЗФР) в течение ночи. Фиг. 12a-i показывают результаты этих экспериментов, выполненных с тремя репрезентативными антителами этого изобретения. Эти результаты демонстрируют, что анти-HER-3-антитела этого изобретения уменьшают рост независимых от прикрепления клеток MDA-MB361 и клеток рака молочной железы NCI-ADR (фиг. 12a, b), рака желудка MKN-28 (фиг. 12 с), клеток меланомы НТ 144 (фиг. 12d), клеток карциномы яичника Skov3 (фиг. 12 е), клеток рака предстательной железы РРС-1 (фиг. 12f), клеток рака поджелудочной железы ВХ-РС 3 (фиг. 12g), клеток эпидермоидной карциномы А 431 (фиг, 12h) и клеток рака легких (фиг. 12i). Колонии считали с использованием системы камер Scanalyzer HTS (Lemnatec,Wuerselen). Пример 19. Анти-HER-3-антитела человека ингибируют рост рака молочной железы человека в голых мышах. Противоопухолевую эффективность терапевтических антител часто оценивают в исследованиях опухолей-ксенотрансплантатов человека. В этих исследованиях опухоли человека растут в виде ксенотрансплантатов в мышах с ослабленным иммунитетом, и терапевтическую эффективность измеряют по степени ингибирования роста опухоли. Для определения, препятствуют ли анти-HER-3-антитела этого изобретения опухолевому росту раковых клеток молочной железы человека в голых мышах, 5106 клеток T47D имплантировали в самок мышей NMRI nude/nude. Опухоли были подкожными, росшими на спинке этого животного. Обработки начинали, когда опухоли достигали среднего объема опухоли 20 мм 3; восемь дней после трансплантации. Перед первой обработкой мышей рандомизировали и выполняли статистические тесты для гарантии однородности в исходных объемах опухолей (среднее, медиана и стандартное отклонение) по группам обработки. Обработку начинали с дозой введения 50 мг/кг с последующими инъекциями 25 мг/кг один раз в неделю внутрибрюшинной инъекцией. Контрольная группа получала доксорубицин (фармацевтической категории). Всем животным добавляли 0,5 мг/кг/неделя эстрогена, инъецируемого i.p. Подробности этих групп обработки приведены ниже. обработка доксорубицином, как описано Boven et al., Cancer Research, 1992. Данные для медиан объема опухолей (фиг. 13) показали, что введение анти-HER-3-антитела этого изобретения приводило к уменьшению роста опухолей. Пример 20. Анти-HER-3-антитела человека ингибируют рост опухоли поджелудочной железы в мышах SCID. Для испытания терапевтического потенциала анти-HER-3-антител в других типах солидных опухолей анти-HER-3-антитела, U1-53 и U1-59 испытывали в мышах с установленными опухолями, произведенными из линии опухолевых клеток поджелудочной железы человека ВхРСЗ. В качестве наборов контролей были включены мыши, обработанные либо контролем-носителем, ЗФР, либо установленным терапевтическим антителом, Erbitux. 5106 клеток ВхРСЗ инокулировали подкожно без Matrigel в мышей СВ 17 SCID. Мыши, несущие установленные опухоли со средним объемом 140 мм 2, получали 50 мг/кгU1-53, U1-59, Erbitux или эквивалентный объем ЗФР посредством внутрибрюшинной инъекции. После этого мыши получали один раз в неделю инъекции 25 мг/кг на протяжении этого исследования. Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 14. U1-53 и U1-59 уменьшали рост опухолей поджелудочной железы человека цитостатическим образом. Примечательно, что в этом эксперименте U1-53 и U1-59 были более эффективными, чем EGFR-нацеливающее антитело Erbitux, в замедлении роста опухоли. Эти данные демонстрируют терапевтическую эффективность анти-HER-3-антител этого изобретения в сравнении с эталонным терапевтическим агентом. Пример 21. Комбинирование анти-HER-3-антител человека с анти-EGFR-антителами увеличивает противоопухолевую активность. Монотерапия гиперпролиферативных заболеваний нацеленными антителами часто затрудняется такими проблемами, как, с одной стороны, развитие устойчивости к лекарственным средствам и, с другой стороны, изменение антигенности. Например, потеря антигенности после продолжительного лечения может сделать опухолевые клетки нечувствительными к терапевтическим антителам, так как опухолевые клетки, которые не экспрессируют или утратили антиген-мишень, имеют преимущество селективного роста. Эти проблемы могут быть преодолены с использованием антител этого изобретения в комбинации с терапевтическим антителом, которое нацелено на отличающийся рецептор на опухолевых клетках, или другим противоопухолевым агентом. Вмешательство во множественные пути передачи сигнала или даже родственные пути, но на множественных стадиях вмешательства может также обеспечивать терапевтическую пользу. По-видимому, эти комбинированные способы лечения являются более эффективными,так как они комбинируют два противораковых агента, каждый из которых действует через отличающийся механизм действия. Для демонстрации возможности применения анти-HER-3-антител этого изобретения, U1-53 и U159, в качестве подходящих комбинированных агентов, авторы сравнивали монотерапевтические введения U1-53 или U1-59 с введениями, в которых либо U1-53, либо U1-59 комбинировались с анти-EGFRспецифическиим антителом, Erbitux. 5106 клеток ВхРС 3 cells инокулировали подкожно с Матригелем в мышей СВ 17 SCID. После достижения объемов опухолей 200 мм 3, мышей рандомизировали на группы индивидуальной обработки. Выполняли один раз в неделю внутрибрюшинные инъекции U1-53, U1-59 иErbitux в виде единственных агентов или в комбинациях, или анти-HER-3-антител с Erbitux, или в виде коктейля (смеси) двух анти-HER-3-антител. Все антитела вводили в единственных дозах введения 50 мг/кг/неделя, с последующими инъекциями один раз в неделю 25 мг/кг в течение шести недель. Контрольные группы получали введения каждые две недели гемцитабина (120 мг/кг), один раз в неделю объединенный IgG человека или один раз в неделю инъекции носителя (ЗФР). Схемы введения описаны подробно ниже.