Способ обеспечения экспрессии аполипопротеина в растениях и растения и их семена, содержащие аполипопротеин
Формула / Реферат
1. Способ обеспечения экспрессии аполипопротеина в растениях, предусматривающий:
(a) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:
(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках растений;
(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид аполипопротеина;
(iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую либо (1) нацеливающий пептид/белок, способный направлять аполипопротеин в эндоплазматический ретикулум (ЭР) или производную от ЭР запасающую везикулу, либо (2) сигнальный пептид, который способен направлять полипептид аполипопротеина в апопласт, и стабилизирующий полипептид;
(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и
(c) выращивание клетки растения в зрелое растение, которое экспрессирует аполипопротеин.
2. Способ по п.1, где последовательность химерной нуклеиновой кислоты вводят в клетку растения в условиях ядерной геномной интеграции.
3. Способ по п.1 или 2, где указанная клетка растения представляет собой клетку семени.
4. Способ по пп.1, 2 или 3, где последовательность нуклеиновой кислоты, способная контролировать экспрессию в клетках растения, представляет собой предпочтительный для семян промотор.
5. Способ по п.4, где предпочтительный для семян промотор представляет собой фазеолиновый промотор.
6. Способ по п.1 или 2, где последовательность нуклеиновой кислоты, способная контролировать экспрессию в клетках растения, представляет собой конститутивный промотор.
7. Способ по п.6, где указанный конститутивный промотор представляет собой убиквитиновый промотор.
8. Способ по п.1, где указанный стабилизирующий полипептид является растениеспецифическим.
9. Способ по п.1, где указанный стабилизирующий полипептид является не растениеспецифическим.
10. Способ по п.8, где указанный растениеспецифический стабилизирующий полипептид представляет собой белок масляного тельца, или тиоредоксин, или его фрагмент.
11. Способ по п.10, где указанный белок масляного тельца выбран из группы, состоящей из олеозина, калеозина и стеролеозина.
12. Способ по п.11, где указанный олеозин, калеозин и стеролеозин получены из Arabidopsis thalania.
13. Способ по п.10, где указанный тиоредоксин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56.
14. Способ по п.9, где указанный не растениеспецифический стабилизирующий полипептид представляет собой зеленый флуоресцентный белок, или одноцепочечное антитело, или его фрагмент.
15. Способ по п.9, где указанный не растениеспецифический стабилизирующий полипептид является кодон-оптимизированным для оптимальной экспрессии в растениях.
16. Способ по п.14, где указанный зеленый флуоресцентный белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57.
17. Способ по п.14, где указанное одноцепочечное антитело способно облегчать очистку аполипопротеина, экспрессированного в семенах.
18. Способ по п.14, где указанное одноцепочечное антитело способно специфически ассоциироваться с белком масляного тельца.
19. Способ по п.14, где указанное одноцепочечное антитело представляет собой Fv, способное специфически связываться с олеозином, полученным из Arabidopsis thalania, массой 18 кДа (D9scFv).
20. Способ по п.14, где указанное одноцепочечное антитело имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 240.
21. Способ по п.1, где указанный стабилизирующий полипептид связан с аполипопротеином посредством расщепляемого линкера.
22. Способ по п.21, где указанный расщепляемый линкер представляет собой пропоследовательность химозина.
23. Способ по п.22, где указанная пропоследовательность химозина представляет собой SEQ ID NO: 143.
24. Способ по п.1, где указанная запасающая везикула, являющаяся производной ЭР, представляет собой масляное тельце и указанный нацеливающий пептид является белком масляного тельца.
25. Способ по п.1, где указанный нацеливающий пептид/белок содержит С-концевой ЭР-удерживающий мотив.
26. Способ по п.25, где указанный С-концевой ЭР-удерживающий мотив представляет собой KDEL.
27. Способ по п.1, где указанный сигнальный пептид представляет собой сигнальную последовательность белка, связанного с патогенезом табака (PR-S).
28. Способ по п.27, где указанная сигнальная последовательность PR-S имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
29. Способ по любому из пп.1-28, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, выбрана из группы, включающей последовательности, кодирующие аполипопротеин человека, проаполипопротеин человека, свиной аполипопротеин, свиной проаполипопротеин, бычий аполипопротеин и бычий проаполипопротеин.
30. Способ по любому из пп.1-29, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, оптимизирована для использования кодонов растений.
31. Способ получения семян растения, содержащих аполипопротеин, предусматривающий:
(а) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:
(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений;
(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид аполипопротеина;
(iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую либо (1) нацеливающий пептид/белок, способный направлять аполипопротеин в ЭР или производную от ЭР запасающую везикулу, либо (2) сигнальный пептид, который способен направлять полипептид аполипопротеина в апопласт, и стабилизирующий полипептид;
(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения;
(c) выращивание клетки растения в зрелое растение и
(d) получение семян указанного растения, которые содержат аполипопротеин.
32. Растение, содержащее последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащую в 5'-3' направлении транскрипции:
(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в растении, функционально связанную с
(b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина, и
(c) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую либо (1) нацеливающий пептид/белок, способный направлять аполипопротеин в ЭР или производную от ЭР запасающую везикулу, либо (2) сигнальный пептид, который способен направлять полипептид аполипопротеина в апопласт, и стабилизирующий полипептид,
причем указанное растение способно к экспрессии аполипопротеина.
33. Растение по п.32, где последовательность химерной нуклеиновой кислоты интегрирована в ядерный геном растения.
34. Растение по пп.1-33, которое представляет собой Arabidopsis или сафлор красильный.
35. Семя растения, содержащее последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащую в 5'-3' направлении транскрипции:
(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в семени растения, функционально связанную с
(b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина, и
(c) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую либо (1) нацеливающий пептид/белок, способный направлять аполипопротеин в ЭР или производную от ЭР запасающую везикулу, либо (2) сигнальный пептид, который способен направлять полипептид аполипопротеина в апопласт, и стабилизирующий полипептид,
причем в указанном семени экспрессируется аполипопротеин.
36. Композиция, содержащая, по существу, очищенные масляные тельца, содержащие аполипопротеин, полученные из растения по пп.32-34.
37. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, связанная с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту, способную контролировать экспрессию в клетке растения, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую либо (1) нацеливающий пептид/белок, способный направлять аполипопротеин в ЭР или производную от ЭР запасающую везикулу, либо (2) сигнальный пептид, который способен направлять полипептид аполипопротеина в апопласт, и стабилизирующий полипептид.
38. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.37, где указанная клетка растения представляет собой клетку семени.
39. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.38, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты, способная контролировать экспрессию в клетке растения, представляет собой предпочтительный для семян промотор.
40. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.39, где указанный предпочтительный для семян промотор представляет собой фазеолиновый промотор.
41. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.40, где указанный промотор представляет собой конститутивный промотор.
42. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.41, где указанный промотор представляет собой убиквитиновый промотор.
43. Рекомбинантный вектор экспрессии, подходящий для экспрессии аполипопротеина в клетке растения, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по пп.37-42.
44. Способ получения, по существу, очищенного аполипопротеина, предусматривающий:
(a) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:
(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений;
(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид аполипопротеина;
(iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую либо (1) нацеливающий пептид/белок, способный направлять аполипопротеин в ЭР или производную от ЭР запасающую везикулу, либо (2) сигнальный пептид, который способен направлять полипептид аполипопротеина в апопласт, и стабилизирующий полипептид;
(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения;
(c) выращивание клетки растения в зрелое растение;
(d) получение семян указанного растения, где семена содержат аполипопротеин;
(e) отделение аполипопротеина от компонентов семян растения для получения, по существу, очищенного аполипопротеина.
45. Применение растения по пп.32-34 для получения, по существу, очищенного аполипопротеина.
46. Композиция, содержащая, по существу, очищенный аполипопротеин, полученный способом по п.44.
Текст
СПОСОБ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ АПОЛИПОПРОТЕИНА В РАСТЕНИЯХ И РАСТЕНИЯ И ИХ СЕМЕНА, СОДЕРЖАЩИЕ АПОЛИПОПРОТЕИН Представлены способы продуцирования аполипопротеина в растениях. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу экспрессии аполипопротеина в растениях, предусматривающему (а) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов: (i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках растений; и (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид аполипопротеина; (b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и выращивание клетки растения в зрелое растение, способное давать семена, где семена экспрессируют аполипопротеин.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: СЕМБАЙОСИЗ ДЖИНЕТИКС ИНК.; ЮТИ ЛИМИТЕД ПАРТНЕРШИП (CA) 015167 Область изобретения Настоящее изобретение относится к методам генной инженерии растений и продуцированию аполипопротеинов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам продуцирования рекомбинантных аполипопротеинов в трансгенных растениях. Предпосылки создания изобретения В здоровом организме человека существует баланс между поступлением и выведением холестерина. Когда у людей наблюдается высокий уровень липопротеина низкой плотности (LDL) и низкий уровень липопротеина высокой плотности (HDL), дисбаланс приводит к большему осаждению холестерина в артериях, чем к его удалению (van Dam, M.J. et al. 2002, Lancet, 359: 37-42). Атеросклероз, сужение или блокирование артерий является следствием повторного осаждения холестерина, называемого бляшками(Major, A.S. et al. 2001, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21: 1790-1795). Липопротеины могут быть разделены на атерогенные и вазопротекторные липопротеины. Обычно атерогенные липопротеины все представляют собой аполипопротеин (Аро) В-содержащий липопротеин,такой как липопротеин очень низкой плотности (VLDL), промежуточной плотности (IDL), низкой плотности (LDL) или липопротеин (Lp(a, тогда как вазопротекторные липопротеины представляют собой Аро AI-содержащие, такие как HDL. Аро AI, основной белок-компонент HDL, играет решающую роль в гомеостазе холестерина. Клинические исследования и статистические исследования населения продемонстрировали превосходную обратную корреляцию между сердечно-сосудистыми заболеваниями и уровнями HDL в плазме крови, позволяя предположить, что Аро AI и HDL помогают выполнять защитную роль против атерогенеза(Rubins, Н.В. et al. 1993, Am. J. Cartiol. 71: 45-52). Исследования трансгенных мышей (Rubin, E.M. et al. 1991, Nature, 353: 265-267) и кроликов (Duverger, N. et al. 1996, Circulation, 94: 713-717), склонных к атеросклерозу, показали, что экспрессия Аро AI человека ингибирует развитие атеросклероза. Это действие может быть связано с эффективным промотированием выведения холестерина из клеток (Castro, G. et al. 1997, Biochemistry, 36: 2243-2249), первой стадией процесса "обратного транспорта холестерина" (RCT)(Glomset, J.А. 1968, J. Lipid Res. 9: 155-167). Аро AI модулирует данный процесс, будучи предпочтительным акцептором клеточного холестерина (Rothblat, G.H. et al. 1999, J. Lipid Res. 40: 781-796), увеличивая активность лецитин-холестерин-ацилтрансферазы (LCAT) в этерификации HDL-связанного холестерина на несколько порядков (Jonas, A. 1991, Biochim. Biophys. Acta, 1084: 205-220; Mahley, R.W. et al. 1984, J.Lipid Res. 25: 1277-1294) и транспортируя сложные эфиры холестерина - производные LCAT - в печень(Morrison, J.R. et al. 1992, J. Biol. Chem. 267: 13205-13209). В отличие от синтетических антигиперлипидемиков, таких как LIPITOR (аторвастатин кальция),действие которых заключается в снижении уровня липидов в организме за счет ингибирования синтеза холестерина (Alaupovic, P. et al. 1997, Atherosclerosis, 133: 123-133), инфузия очищенного Аро AI стимулирует выведение холестерина из тканей в плазму крови (Navab, M. et al. 2002, Circulation, 105: 290-292). Это позволяет предположить, что Аро AI стимулирует выведение холестерина из ксантомных клеток в стенке артерии и индуцирует возвращение на более раннюю стадию развития атеросклеротических бляшек, эффективно "очищая" артерии. У людей Аро AI синтезируется в печени и клетках кишечника в виде негликозилированного предпробелка (Gordon, J.I. et al. 1983, J. Biol. Chem. 258: 4037-4044). Предсегмент, состоящий из 18 аминокислот, удаляется перед тем, как белок покидает клетку, и просегмент из 6 аминокислот отщепляется после выделения с помощью неизвестной протеазы, оставляя зрелый белок, состоящий из 243 аминокислот (Saku, K. et al. 1999, Eur. J. Clin. Invest. 29: 196-203). Аполипопротеин A-IMilano (Apo AI-M) представляет собой первый описанный молекулярный вариант Аро AI человека (Franceschini, G. et al. 1980, J. Clin. Invest. 66: 892-900). Он характеризуется замещением Argl73 на Cys (Weisgraber, K.Н. et al. 1983, J. Biol. Chem. 258: 2508-2513). Мутантный аполипопротеин передается по наследству в виде аутосомальной доминантной характерной черты и было выявлено 8 поколений носителей (Gerli, G.С. et al. 1984, Hum. Hered. 34: 133-140). Статус индивидуального носителя Аро AI-M характеризуется значительным снижением уровняHDL-холестерина. Несмотря на это, субъекты, на которых оказывалось воздействие, очевидно, не демонстрируют повышенного риска артериального заболевания, действительно, при исследовании генеалогического дерева оказывается, что данные субъекты могут быть "защищены" от атеросклероза. Механизм возможного защитного действия Аро AI-M на его носителей, по-видимому, связан с модификацией структуры мутантного аполипопротеина с потерей одной альфа-спирали и повышенным воздействием гидрофобных остатков (Franceschini, G. et al. 1985, J. Biol. Chem. 260: 16321-16325). Потеря жесткой структуры множества альфа-цепей приводит к повышенной гибкости молекулы, которая более легко связывается с липидами по сравнению с обычным A-I. Более того, комплексы аполипопротеин/липид более подвержены денатурации, таким образом позволяя предположить, что доставка липидов также улучшается в случае мутантов. Терапевтическое применение Аро AI и мутанта Аро AI-M в настоящее время ограничено отсутствием способа, дающего возможность получения указанных аполипопротеинов в достаточном количестве и в подходящем виде. В частности, было показано, что рекомбинантное продуцирование Аро AI является-1 015167 очень трудным вследствие его амфифильного характера, автоагрегации и разложения (Schmidt, H.H. et al. 1997, Protein Expr. Purif. 10: 226-236). К моменту создания настоящего изобретения Аро AI был экспрессирован in vitro в двух системах эукариотов: трансфектированных бакуловирусом клетках Spodopterafrugiperda (Sf9) (Sorci-Thomas, M.G. et al. 1996, J. Lipid Res. 37: 673-683) и стабильно трансфектированных клетках яичников китайского хомячка (СНО) (Forte, Т.М. et al. 1990, Biochim. Biophys. Acta, 1047: 11-18; Mallory, J.B. et al. 1987, J. Biol. Chem. 262: 4241-4247). В системе бакуловируса, после того как клетки были успешно трансфектированы, имеется тщательный процесс скрининга перед использованием клеток с правильной конструкцией для экспрессии. Аналогично колонии клеток СНО должны подвергаться процессу скрининга для выявления стабильно трансфектированных колоний с высокой экспрессией. Дополнительно, для обоих таких типов клеток требуется относительно длительный период времени перед достижением значительной экспрессии и намного более высокий уровень поддержания, чем для бактерий. Рекомбинантная экспрессия белков в бактериальных системах обычно является привлекательной,поскольку она способна быстро и экономично продуцировать большие количества чистого белка. Имеется несколько сообщений об экспрессии Аро AI в трансформированных Escherichia coli (Е.coli); однако хотя недавно были сделаны некоторые улучшения общего уровня экспрессии (Ryan, R.O. et al. 2003, Protein Expr. Purif. 27: 98-103), данные способы дают относительно низкие выходы или нежелательное присутствие тагов или сигналов секреции с чужеродной аффинностью (Bergeron, J. et al. 1997, Biochim. Biophys. Acta, 1344: 139-152; Li, H.H. et al. 2001, J. Lipid Res. 42: 2084-2091; McGuire, K.A. et al. 1996, J. LipidRes. 37: 1519-1528). Более того, известно, что эндотоксины Е.coli образуют относительно прочные комплексы с аполипопротеинами (Emancipator et al. (1992), Infect. Immun. 60: 596-601). Весьма желательно снижение или исключение токсичности, связанной с такими эндотоксинами Е.coli, в фармацевтических препаратах аполипопротеинов. Удаление этих эндотоксинов, хотя технически осуществимо, включает сложные и дорогие методологии очистки белка (патент США 6506879), не исключая полностью риск для здоровья человека. Применение растений в качестве биореакторов для крупномасштабного продуцирования рекомбинантных белков известно в данной области, и многочисленные белки, включая белки для лечения человека, были продуцированы таким образом. Например, в патентах США 4956282, 5550038 и 5629175 раскрыто продуцирование -интерферона в растениях, в патентах США 5650307, 5716802 и 5763748 подробно описано продуцирование сывороточного альбумина человека в растениях, патенты США 5202422,5639947 и 5959177 относятся к продуцированию антител в растениях. Одним из существенных преимуществ, предлагаемых системами продуцирования рекомбинантных белков на основе растений, является то, что по мере увеличения площади земли под выращиваемыми растениями продуцирование белка может быть неограниченно масштабировано для обеспечения больших количеств белка. Напротив, требования к системам ферментирования и культивирования клеток включают большое пространство, оборудование и затраты энергии, приводя к повышению стоимости масштабирования производства. Однако,несмотря на то что применение растений в качестве биореакторов подробно документировано и несмотря на вышеуказанные терапевтические применения аполипопротеинов, в предшествующем уровне развития данной области отсутствуют способы продуцирования аполипопротеина в растениях. Для того чтобы предложить практическую альтернативу системам на основе ферментирования и культивирования клеток, важно, чтобы растения оставались здоровыми и чтобы аполипопротеины накапливались в растениях в значительных уровнях. С точки зрения присущего аполипопротеинам свойства образовывать ассоциаты с липидами, рекомбинантно экспрессируемые аполипопротеины могут образовывать ассоциаты с эндогенными растительными липидами и таким образом мешать метаболизму липидов в растениях. Таким образом, рекомбинантная экспрессия аполипопротеинов может влиять на здоровье растения. Альтернативно, рекомбинантно экспрессируемый аполипопротеин может не накапливаться на эффективных уровнях, поскольку защитные механизмы могут приводить к разложению аполипопротеина. Таким образом, остается непонятным, как и до какой степени может использоваться синтетическая способность растений для достижения коммерческого производства аполипопротеина в растениях. Таким образом, с точки зрения недостатков, связанных со способами рекомбинантного продуцирования аполипопротеинов по предшествующему уровню данной области, существует необходимость усовершенствования способов продуцирования аполипопротеинов. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к способам продуцирования аполипопротеина в растениях. В частности, настоящее изобретение относится к способам продуцирования аполипопротеина в семенах растений. Соответственно настоящее изобретение относится к способу экспрессии аполипопротеина в растениях, предусматривающему:(a) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках растений;(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и(c) выращивание клетки растения в зрелое растение, способное экспрессировать аполипопротеин. В соответствии с настоящим изобретением было установлено, что семена растений являются особенно подходящими для продуцирования аполипопротеина. Соответственно настоящее изобретение относится к способу экспрессии аполипопротеина в семенах растений, предусматривающему:(a) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках растений;(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и(с) выращивание клетки растения в зрелое растение, способное давать урожай семян, где семена экспрессируют аполипопротеин. В следующем предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, способная контролировать экспрессию в клетке семян растений, представляет собой промотор, предпочтительный для семян, такой как фазеолиновый промотор. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 0,25% общего белка семени представляет собой аполипопротеин. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность химерной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую стабилизирующий полипептид, связанный в рамке считывания с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аполипопротеин. Предпочтительно стабилизирующий полипептид представляет собой полипептид, который легко может быть экспрессирован в отсутствие аполипопротеина и стабильно накапливается в растительной клетке. Стабилизирующий белок может быть растениеспецифическим или не растение-специфическим. Растение-специфические стабилизирующие полипептиды, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, включают белки масляного тела и тиоредоксины. Не растение-специфические стабилизирующие полипептиды, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, включают зеленый флуоресцентный белок(GFP) и одноцепочечные антитела или их фрагменты. Растение-специфический или не растениеспецифический стабилизирующий полипептид может быть связан с аполипопротеином посредством линкера, который может быть отщеплен, высвобождая аполипопротеин в его свободной природной форме. Дополнительно последовательность химерной нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит нацеливающий сигнал таким образом, что полипептид аполипопротеина аккумулируется в растительной клетке в эндоплазматической сети (ER) или в связанной с ней запасающей везикуле, являющейся производной ER, например, в масляном теле. Соответственно конструкция химерной нуклеиновой кислоты дополнительно может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид,который способен направлять полипептид аполипопротеина в ER или в запасающую везикулу, являющуюся производной ER. Последовательности нуклеиновых кислот, которые можно использовать для нацеливания аполипопротеина в ER, включают, например, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности KDEL, HDEL, SDEL. Последовательности нуклеиновых кислот, которые можно использовать для направления аполипопротеина в масляное тело, включают последовательности нуклеиновых кислот,кодирующие белки масляного тела, такие как олеозины. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением аполипопротеин может быть направлен в масляное тело путем экспрессии аполипопротеина таким образом, что аполипопротеин не содержит нацеливающий сигнал, но при условии, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, содержит пропептид аполипопротеина. В другом предпочтительном варианте осуществления химерная нуклеиновая кислота содержит нацеливающий сигнал таким образом, что аполипопротеин аккумулируется в апопласте. Соответственно, в таком варианте осуществления конструкция химерной нуклеиновой кислоты предпочтительно дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который способен направлять аполипопротеин в апопласт. В еще одном следующем предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, экспрессируется таким образом, что аполипопротеин аккумулируется в цитоплазме. В таком варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты не содержит нацеливающий сигнал. В следующем предпочтительном варианте осуществления конструкцию химерной нуклеиновой кислоты вводят в клетку растения в условиях ядерной геномной интеграции. При таких условиях последовательность химерной нуклеиновой кислоты стабильно интегрируется в геном растения. Еще в одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, оптимизирована для использования растительного кодона. Предпочтительные последовательности нуклеиновых кислот, используемые в соответствии с настоящим изобретением, кодируют человеческий, бычий или свиной аполипопротеин A-I и проаполипо-3 015167 протеин A-I. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения семян растений, содержащих аполипопротеин. Соответственно разработан соответствующий настоящему изобретению способ получения семян растений, предусматривающий:(a) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках тканей растений;(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения;(c) выращивание клетки растения в зрелое растение, способное давать семена;(d) получение семян указанного растения, где семена включают аполипопротеин. Семена можно использовать для получения популяции прогенных растений, каждое из которых содержит множество семян, экспрессирующих аполипопротеин. Настоящее изобретение также относится к растениям, способным давать семена, экспрессирующие аполипопротеин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растения, способные давать семена, содержат последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащую в 5'-3' направлении транскрипции (a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в растении, функционально связанную с(b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина, где клетка содержит аполипопротеин. В предпочтительном варианте осуществления последовательность химерной нуклеиновой кислоты интегрирована в ядерный геном растения. В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используемое растение представляет собой растение Arabidopsis, в особенно предпочтительном варианте осуществления растение представляет собой сафлор красильный. Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к семенам растений, экспрессирующим аполипопротеин. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения семена растения содержат последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащую в 5'-3' направлении транскрипции (a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в растении, функционально связанную с (b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина. Семена представляют собой источник, откуда желаемый полипептид аполипопротеина, который синтезирован клетками семян, может быть экстрагирован и получен в более или менее чистом виде. Аполипопротеин можно использовать для лечения сосудистых заболеваний. Другие отличительные особенности и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и представляют предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку специалистам в данной области из данного подробного описания будут очевидны различные изменения и модификации, не отступая от сути и объема изобретения. Краткое описание чертежей Изобретение теперь будет рассмотрено со ссылками на фигуры. Фиг. 1(А). Последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO: 1) и выведенная последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 2) аполипопротеина AI Homo sapiens (Apo AI) (любезно предоставленная Dr.Norman Wong, Calgary Alberta) (инвентарный номер NM-000039). Выделенные жирным шрифтом остатки представляют сигнальный пептид пред-последовательности, подчеркнутые остатки показывают пропоследовательность. Фиг. 1(В). Последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO: 3) и выведенная последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 4) природного варианта Apo AIMilano (R173C). Остатки, обозначенные липидным шрифтом/кириллицей, представляют мутированную аминокислоту. Фиг. 1(С). Последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO: 5) и выведенная последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 6) природного варианта Apo AI Paris (R151C). Остатки, обозначенные жирным шрифтом/кириллицей, представляют мутированную аминокислоту. Фиг. 2. Схематическое изображение всех бинарных конструкций, созданных для экспрессии аполипопротеина Apo AI в трансгенных растениях Arabidopsis. (А) Конструкции, которые направлены в цитозоли в растительных клетках. (В) Конструкции, которые направлены в масляные тела в растительной клетке. (С-Е) Конструкции, которые направлены по секреторному пути. (D и Е) Конструкции могут содержать дополнительные последовательности KDEL для сохранения в эндоплазматической сети. (D) Конструкции, содержащие пропоследовательность Apo AI или зрелый Apo AI. (Е) Конструкции, содержащие расщепляемую последовательность для высвобождения pro-Apo AI или зрелого Аро AI. В подписи указан тип промотора, сигнального пептида и кодирующей последовательности, содержащихся в каждой конструкции. Фиг. 3(А). Схематическое изображение стратегии клонирования для GFP кодирующей области для-4 015167 использования в Apo AI-GFP трансляционных слитых конструкциях. Фиг. 3(В). Схематическое изображение стратегии клонирования для про- и зрелой кодирующих областей трансляционных слитых конструкций Apo AI и специфического для семян Apo AI-GFP. Фиг. 3(С). Схематическое изображение стратегии клонирования для создания бинарных векторов,используемых для трансформации клеток Agrobacterium EHA101 с целью специфического для семян направления Аро AI-GFP в цитозоли и масляное тело. Apo10 и Apo11, содержащие зрелый и pro-Apo AIGFP соответственно, направлены в цитозоль. Аро 12 и Аро 13, содержащие про- и зрелый Аро AI-GFP слитый трансляционный белок соответственно, нацеливали в масляные тела. Фиг. 3(D). Схематическое изображение стратегии клонирования для создания бинарных векторов,используемых для трансформации клеток Agrobacterium EHA101 с целью специфического для семян нацеливания Аро AI-GFP по секреторному пути. Аро 15 и Аро 16, содержащие зрелый и pro-Apo AI-GFP трансляционный слитый белок соответственно, нацеливали по секреторному пути. Фиг. 4(А). Схематическое изображение стратегии клонирования для создания бинарных векторов,используемых для трансформации клеток Agrobacterium EHA101, для конститутивного цитозольного нацеливания Аро AI-GFP. Apo17 и Аро 18 а, содержащие зрелый и pro-Apo AI-GFP трансляционный слитый белок соответственно, нацеливали в цитозоль. Фиг. 4(В). Схематическое изображение стратегии клонирования для конститутивного нацеливания Аро AI-GFP в цитозоли. Аро 18b, содержащий трансляционный слитый белок, нацеливали в цитозоль. Фиг. 5(А). Схематическое изображение стратегии клонирования для про- и зрелой области кодирования Аро AI и конститутивной экспрессии Аро AI-GFP трансляционного слитого белка. Фиг. 5(В). Схематическое изображение стратегии клонирования для создания бинарных векторов,используемых для трансформации клеток Agrobacterium EHA101, для конститутивного нацеливания АроAI-GFP по секреторному пути. Аро 19 и Аро 20, содержащие зрелый и pro-Apo AI-GFP трансляционный слитый белок соответственно, нацеливали по секреторному пути. Фиг. 6. Схематическое изображение стратегии клонирования для зрелой формы области кодирования Аро AI. Аро 21 с целью специфического для семян нацеливания в цитозоль, Аро 23 с целью специфического для семян нацеливания в масляные тела, Аро 25 с целью специфического для семян нацеливания в масляные тела и очистки с использованием расщепляемой последовательности klip8 и Аро 29 с целью специфического для семян нацеливания по секреторному пути. Фиг. 7. Схематическое изображение стратегии клонирования для проформы области кодирования Аро AI. Аро 22 с целью специфического для семян нацеливания в цитозоль, Аро 24 с целью специфического для семян нацеливания в масляные тела, Аро 30 с целью специфического для семян нацеливания в масляные тела и Аро 26 с целью специфического для семян нацеливания в масляные тела и очистки с использованием расщепляемой последовательности klip8. Фиг. 8(А). Схематическое изображение стратегии клонирования для проформы области кодирования Аро AI с удаленными внутренними сайтами XhoI, содержащей сигнальный пептид KDEL. Аро 27 с целью специфического для семян нацеливания в масляные тела как слитый с олеозином в рамке считывания. Оба Аро 31 и Аро 35 направлены по секреторному пути вместе с Аро 31 и Аро 35, слитыми в рамке считывания с антителом D9 олеозина, и Аро 35 накапливается в эндоплазматической сети благодаря сигнальному пептиду KDEL. Фиг. 8(В). Схематическое изображение стратегии клонирования для проформы области кодирования Аро AIMilano. Аро 27 М с целью специфического для семян нацеливания Аро AIMilano в масляные тела как слитый в рамке считывания с олеозином. Фиг. 9. Схематическое изображение стратегии клонирования для проформы области кодирования Аро AI с удаленными внутренними сайтами XhoI. Apo28, направленный в масляные тела и способный расщепляться по последовательности klip8, Apo32, который нацеливает Аро AI по секреторному пути. Слитый в рамке считывания с антителом D9 олеозина. Фиг. 10. Схематическое изображение стратегии клонирования для про- и зрелой форм области кодирования Аро AI с удаленными внутренними сайтами XhoI, содержащих дополнительный Met остаток в начале области кодирования. Аро 34 (pro-Apo AI) и Аро 33 (зрелый Аро AI), которые направлены по секреторному пути и слиты в рамке считывания с антителом D9 олеозина. Фиг. 11. Схематическое изображение стратегии клонирования для проформы области кодирования Аро AI с внутренними сайтами XhoI, содержащей сигнальный пептид KDEL. Аро 36, направленный по секреторному пути и слитый в рамке считывания с антителом D9 олеозина, накапливается в эндоплазматической сети благодаря сигнальному пептиду KDEL. Фиг. 12. Схематическое изображение стратегии клонирования для про- и зрелой форм области кодирования Аро AI с удаленными внутренними сайтами XhoI, содержащих дополнительный Met остаток в начале области кодирования и сигнальный пептид KDEL. Apo38 и Аро 37, которые направлены по секреторному пути и слиты в рамке считывания с антителом D9 олеозина, накапливаются в эндоплазматической сети благодаря сигнальному пептиду KDEL. Фиг. 13. Схематическое изображение стратегии клонирования для про- и зрелой форм области кодирования Аро AI и протеазного сайта расщепления. Аро 43, Аро 44, Аро 39 и Аро 40, направленные по-5 015167 секреторному пути, слиты в рамке считывания с антителом D9 олеозина. Аро 43 и Аро 44 будут накапливаться в эндоплазматической сети благодаря сигнальному пептиду KDEL. Фиг. 14. Схематическое изображение стратегии клонирования для про- и зрелой форм области кодирования Аро AI, содержащих дополнительный Met остаток в начале области кодирования и протеазный сайт расщепления. Аро 42, Аро 46, Аро 41 и Аро 45 направлены по секреторному пути, слиты в рамке считывания с антителом D9 олеозина. Аро 46 и Аро 45 будут накапливаться в эндоплазматической сети благодаря сигнальному пептиду KDEL. Фиг. 15. Схематическое изображение стратегии клонирования для зрелой формы области кодирования Аро AI, содержащей дополнительный Met остаток в начале области кодирования и протеазный сайт расщепления. Аро 47 слит в рамке считывания с олеозином маиса для нацеливания в масляные тела. Фиг. 16. Вестерн-блоты для общего белка листьев (А) (25 мкг) и общего белка семян (В) (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. Аро 17 представляет собой конструкцию ubimat-Apo AI-GFP. Белок листьев (25 мкг) и семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 17. Вестерн-блоты для общего белка листьев (А) (25 мкг) и общего белка семян (В) (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. Аро 18 а представляет собой конструкцию ubipro-Apo AI-GFP. Белок листьев (25 мкг) и семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 18. Вестерн-блоты для общего белка листьев (А) (25 мкг) и общего белка семян (В) (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. Аро 19 представляет собой конструкцию ubiPRS-mat-Apo AI-GFP. Белок листьев (25 мкг) и семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 19. Вестерн-блоты для общего белка листьев (А) (25 мкг) и общего белка семян (В) (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. Аро 20 представляет собой конструкцию ubi-PRSpro-Apo AI-GFP. Белок листьев (25 мкг) и семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 20. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против GFP. (А) Аро 10 представляет собой конструкцию pha-mat-Apo AI-GFP. (В) Apo11 представляет собой конструкцию pha-pro-Apo AI-GFP. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 200 нг очищенного белка GFP использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 21. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против GFP. (А) Аро 12 представляет собой конструкцию pha-олеозин-mat-Apo AI-GFP. (В) Аро 13 представляет собой конструкцию pha-олеозин-pro-Аро AI-GFP. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 200 нг очищенного белка GFP использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 22. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против GFP. (А) Аро 15 представляет собой конструкцию pha-PRS-mat-Apo AI-GFP. (В) Аро 16 представляет собой конструкцию pha-PRS-pro-Apo AI-GFP. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 200 нг очищенного белка GFP использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 23. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 21 представляет собой конструкцию pha-mat-Apo AI. (В) Аро 22 представляет собой pha-pro-Apo AI. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 24. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 23 представляет собой pha-oleo-mat-Apo AI. (В) Аро 24 представляет собойpha-oleo-pro-Apo AI. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 25. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 25 представляет собой pha-oleo-klip8-mat-Apo AI(+Met). (В) Аро 26 представляет собой pha-oleo-klip8-pro-Apo AI(+Met). Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 26. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 28 представляет собой pha-oleo-klip8-pro-Apo AI. (В) Аро 29 представляет собой pha-PRS-mat-Apo AI. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 27. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 30 представляет собой pha-PRS-pro-Apo AI. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля.-6 015167 Фиг. 28. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 32 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo AI. (В) Аро 33 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-mat-Apo AI (+Met). Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 29. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. Аро 34 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo AI(+Met). Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 30. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 36 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo AI-KDEL. (В) Аро 37 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-mat-Apo AI(+Met) KDEL. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 31. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 38 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo AI(+Met)-KDEL. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. (В) Аро 29 представляет собой pha-PRS-D9scFv-KLIP8-Apo AI. Семена дикого типа использовали в качестве отрицательного контроля и 3 мкг АроAI человека, полученного из обычной плазмы крови человека (US Biologicals), использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 32. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 40 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI. (В) Аро 41 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-klip8-mat-Apo AI(+Met). Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 33. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. Аро 42 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI(+Met). Белок семян(50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 34. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. (А) Аро 44 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI-KDEL. (В) Аро 45 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-klip8-mat-Apo AI(+Met). Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 35. Вестерн-блоты для общего белка семян (50 мкг) с использованием поликлонального антитела против Аро AI. Аро 46 представляет собой pha-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI(+Met)-KDEL. Белок семян (50 мкг) с 24 использовали в качестве отрицательного контроля и 0,5 мкг белка сыворотки крови человека использовали в качестве положительного контроля. Фиг. 36. Исследование ассоциации ненаправленного и направленного в масляное тело Аро AI-GFP со специфическими клеточными фракциями семян. Вестерн-блот анализ с использованием поликлонального антитела против Аро AI и приблизительно равных количеств общего белка (50 мкг), выделенного из водной фракции (AQ), фосфатных (PW) и мочевинных (UW) промывок масляного тела (РО и UO соответственно с использованными приблизительно 20 мкг общих масляных тел) и микросомальной (ER) фракции из зрелых семян. Окрашивание иммуноблота с помощью Ponceau-S показывает относительные количества белка, нагруженные на гель (верхняя панель). Сыворотку крови человека (0,5 мкг) использовали в качестве положительного контроля для экспрессии Аро AI. (А) Аро 10 представляет собой Аро AIGFP. Apo11 представляет собой pro-Аро AI-GFP. (В) Аро 12 представляет собой олеозин-Аро AI-GFP и Аро 13 представляет собой олеозин-pro-Apo AI-GFP. Фиг. 37. Исследование ассоциации секретируемого про- и зрелого Аро AI-GFP со специфическими клеточными фракциями семян. Вестерн-блот анализ с использованием анти-Аро AI антитела и приблизительно равных количеств общего белка (50 мкг), выделенного из водной фракции (AQ), фосфатных(PW) и мочевинных (UW) промывок масляного тела (РО и UO соответственно с использованными приблизительно 20 мкг общих масляных тел) и микросомальной (ER) фракции из зрелых семян. Окрашивание иммуноблота с помощью Ponceau-S показывает относительные количества белка, нагруженные на гель (верхняя панель). Сыворотку крови человека (0,5 мкг) использовали в качестве положительного контроля для экспрессии Аро AI. Аро 15 представляет собой PRS-Apo AI-GFP. Аро 16 представляет собойPRS-pro-Apo AI-GFP. Фиг. 38. Конститутивная экспрессия Аро AI-GFP трансляционных слитых конструкций в листьях. Вестерн-блот анализ с использованием анти-GFP антитела и приблизительно равных количеств общего белка (50 мкг), выделенного из листьев. Окрашивание иммуноблота с помощью Ponceau-S показывает относительные количества белка, нагруженные на гель (верхняя панель). Растения дикого типа (с 24) ис-7 015167 пользовали в качестве отрицательного контроля для экспрессии GFP. Очищенный белок GFP (200 нг) использовали в качестве положительного контроля для экспрессии GFP. UG-14 и UR2 включены в качестве положительного контроля накапливания белка GFP в листьях. Ожидаемые массы следующие: Аро 17=55,4 кДа; Аро 18=56,4 кДа; Аро 19=58,3 кДа; Аро 20=59,3 кДа; UG-14=26,8 кДа; UR2=50 кДа. Фиг. 39. Специфическая для семян экспрессия ненаправленного и секретированного Аро AI в семенах. Вестерн-блот анализ с использованием анти-Аро AI антитела и приблизительно равных количеств общего белка (50 мкг), выделенного из зрелых семян. Окрашивание иммуноблота с помощью Ponceau-S показывает относительные количества белка, нагруженные на гель (верхняя панель). Растения дикого типа (с 24) использовали в качестве отрицательного контроля для экспрессии Аро AI. Сыворотку крови человека (0,5 мкг) использовали в качестве положительного контроля для экспрессии Аро AI. Ожидаемые массы следующие: Аро 21=28,3 кДа; Аро 22=29,32 кДа; Аро 23=46,9 кДа; Аро 24=47,8 кДа; Аро 25=51,5 кДа; Аро 26=52,5 кДа; Аро 27=51,3 кДа; Аро 28=52,3 кДа; Аро 29- 31,3 кДа; Аро 30=32,2 кДа. Фиг. 40. Исследование субклеточных фракций Аро 22-3 (ненаправленный pro-Apo AI) Т 3 генерации семян. Вестерн-блот анализ с использованием анти-Аро AI антитела и приблизительно равных количеств общего белка (50 мкг), выделенного из водной фракции (AQ), фосфатных (PW) и мочевинных (UW) промывок масляного тела (РО и UO соответственно с использованными приблизительно 20 мкг общих масляных тел) из зрелых семян. Окрашивание иммуноблота с помощью Ponceau-S показывает относительные количества белка, нагруженные на гель (верхняя панель). Для экспрессии Аро AI в качестве положительного контроля использовали сыворотку крови человека (0,5 мкг). Величина молекулярной массы указана слева. Фиг. 41. Конфокальные микрографии специфических для семян конструкций Аро AI-GFP в поздней семядольной стадии эмбриональных клеток, окрашенных Nile красным. (А-С) Аро 10 представляет собой ненаправленный зрелый Аро AI, слитый с GFP. (D-F) Apo11 представляет собой ненаправленный proApo AI, слитый с GFP. (G-I) Аро 12 представляет собой зрелый Аро AI, слитый с GFP, направленный в масляные тела с использованием молеозина. (Колонка 1) Зеленый канал. (Колонка 2) Красный канал.(Колонка 3) Слившиеся каналы. Полоса=5 мкм. Фиг. 42. Конфокальные микрографии специфических для семян конструкций Аро AI-GFP в поздней семядольной стадии эмбриональных клеток, окрашенных Nile красным. (А-С) Аро 13 представляет собойpro-Apo AI, слитый с GFP, направленный в масляные тела с использованием олеозина. (D-F) Аро 15 представляет собой зрелый Аро AI, слитый с GFP, направленный в секреторный путь. (G-I) Аро 16 представляет собой pro-Apo AI, слитый с GFP, направленный в секреторный путь. (Колонка 1) Зеленый канал.(Колонка 2) Красный канал. (Колонка 3) Слившиеся каналы. Полоса=5 мкм. Фиг. 43. Конфокальные микрографии конститутивно экспрессированного ненаправленного и секретированного Аро AI-GFP в поздней семядольной стадии эмбриональных клеток, окрашенных Nile красным. (А-С) Аро 17 представляет собой ненаправленный зрелый Аро AI, слитый с GFP. (D-F) Аро 18 представляет собой ненаправленный pro-Apo AI, слитый с GFP. (G-H) Аро 19 представляет собой зрелый Аро(Колонка 3) Слившиеся каналы. Полоса=5 мкм. Фиг. 44. Конфокальные микрографии Аро AI-GFP конститутивных конструкций, экспрессированных в эпидермальных клетках листьев. (А-С) Аро 17 представляет собой ненаправленный зрелый Аро AI,слитый с GFP. (D-F) Аро 18 представляет собой ненаправленный pro-Apo AI, слитый с GFP. (G-H) Аро 19 представляет собой зрелый Аро AI, слитый с GFP, направленный в секреторный путь. (J-L) Аро 20 представляет собой pro-Apo AI, слитый с GFP и направленный в секреторный путь. (Колонка 1) Зеленый канал. (Колонка 2) Красный канал. (Колонка 3) Слившиеся каналы. Полоса=5 мкм. Фиг. 45. Очистка Аро 25, Аро 26 и Аро 28 хроматографией с обращенной фазой. (А) ВЭЖХ контур стандарта Аро AI. (В) ВЭЖХ контур Аро 25. (С) ВЭЖХ контур Аро 26. (D) ВЭЖХ контур Аро 28. Отдельные использованные длины волн включали 214, 254, 280 и 326 нм. Подробное описание изобретения Как отмечено ранее, настоящее изобретение относится к способам продуцирования аполипопротеина в трансгенных растениях. В настоящем изобретении неожиданно было установлено, что продуцирование аполипопротеинов в растениях не только реально осуществимо, но также имеет существенные преимущества по сравнению с общепринятыми методологиями. Исходные материалы для продуцирования на основе растений являются более стабильными, в частности, поскольку белок продуцируется в семенах растений и, более того, они не содержат бактериальных эндотоксинов. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает безопасный источник для производства аполипопротеинов. Также было обнаружено, что рекомбинантная экспрессия аполипопротеина может давать природный аполипопротеин в более или менее чистом виде на уровнях, которые дают возможность производства аполипопротеинов в коммерческом масштабе. Соответственно согласно настоящему изобретению разработан способ экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аполипопротеин в растениях, где способ предусматривает:(a) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транс-8 015167 крипции в качестве функционально связанных компонентов:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках растений;(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и(c) выращивание клетки растения в зрелое растение, экспрессирующее аполипопротеин. В настоящем изобретении было установлено, что высокие уровни экспрессии аполипопротеина могут достигаться путем экспрессии рекомбинантного белка в семенах растений. Соответственно настоящее изобретение относится к способу экспрессии аполипопротеина в семенах растений, предусматривающему:(а) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений;(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и(c) выращивание клетки растения в зрелое растение, способное давать семена, где семена экспрессируют аполипопротеин. Термины и определения Если не указано иначе, все технические и научные термины, использованные в данном описании,имеют те же самые значения, как это обычно понимается специалистом в данной области, к которой принадлежит изобретение. Где это допустимо, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, включая последовательности нуклеиновых кислот и полипептидов из GenBank, SwissPro и других баз данных, упоминаемые в данном описании, включены путем ссылки во всей своей полноте. Термин "последовательность нуклеиновой кислоты", как он использован в данном описании, относится к последовательности нуклеозидов или нуклеотидных мономеров, состоящей из природных оснований, сахаров и межсахарных (скелетных) связующих фрагментов. Термин также включает модифицированные или замещенные последовательности, содержащие не существующие в природе мономеры или их части. Последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут представлять собой последовательности дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) или последовательности рибонуклеиновых кислот (РНК) и могут содержать природные основания, включая аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Последовательности могут также содержать модифицированные основания, включая аза- и деазааденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил; и ксантин и гипоксантин. Термины "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин" и "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид аполипопротеина", которые в данном описании могут использоваться взаимозаменяемо, относятся к любым и ко всем последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим полипептид аполипопротеина, включая любой полипептид аполипопротеина млекопитающего, и к любым последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют проаполипопротеин и препроаполипопротеин. Как использовано в данном описании, термин "проаполипопротеин" относится к полипептиду аполипопротеина, который включает полипептид, который отщепляется после трансляции. В природном аполипопротеине человека пропептид состоит из полипептидной цепи,включающей 6 остатков аминокислот. Термин "препроаполипопротеин" относится к молекуле проаполипопротеина, дополнительно содержащей N-концевую сигнальную последовательность, которая облегчает внутриклеточный транспорт полипептидной цепи. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид аполипопротеина, дополнительно содержат любые и все последовательности нуклеиновых кислот, которые (i) кодируют полипептиды, которые, по существу, идентичны указанным в данном описании последовательностям полипептидов аполипопротеина; или (ii) гибридизуются с любыми указанными в данном описании последовательностями нуклеиновых кислот, по меньшей мере, при умеренно строгих условиях гибридизации, или которые будут гибридизоваться с ними при умеренно строгих условиях гибридизации, но для применения синонимичных кодонов. Под термином "по существу, идентичный" подразумевается, что две последовательности полипептидов предпочтительно по меньшей мере на 70% идентичны, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентичны и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны, например идентичны на 96, 97, 98 или 99%. Для определения процента идентичности между двумя полипептидными последовательностями последовательности аминокислот в этих двух последовательностях выстраивают в ряд,используя, например, выравнивающий метод Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443), модифицированный Smith и Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482), так что получают наиболее высокий порядок сопоставления между двумя последовательностями и определяют число идентичных аминокислот в двух последовательностях. Способы расчета процента идентичности двух последовательностей аминокислот общеприняты в данной области и включают, например, методы, описанные Carillo и Liptone.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects. Обычно, для таких расчетов будут использоваться компьютерные программы. Компьютерные программы, которые можно использовать для данных целей, включают, но не ограничиваются указанным, GCG (Devereux etal., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al., J. Molec. Biol., 1990,215: 403). Особенно предпочтительный метод определения процента идентичности между двумя полипептидами включает алгоритм Clustal W. (Thompson, J.D., Higgines, D.G. and Gibson T.J., 1994, Nucleic.Acid. Res. 22(22): 4673-4680) вместе с матрицей вычисления BLOSUM 62 (Henikoff S.Henikoff, J.G.,1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) с использованием интервала, открывающего ошибку,равного 10, и интервала расширения ошибки, равного 0,1, так что получают наиболее высокий порядок сопоставления двух последовательностей, где по меньшей мере 50% общей длины одной из двух последовательностей включен в выравнивание. Под термином "по меньшей мере, умеренно строгие условия гибридизации" подразумевается, что выбирают условия, которые промотируют селективную гибридизацию между двумя комплементарными молекулами нуклеиновых кислот в растворе. Гибридизация может происходить для всей или для части молекулы последовательности нуклеиновой кислоты. Гибридизованная часть обычно составляет по меньшей мере 15 (например, 20, 25, 30, 40 или 50) нуклеотидов в длину. Специалистам в данной области будет понятно, что стабильность сдвоенных нуклеиновых кислот, или гибридов, определяется с помощью величины Tm, которая в натрийсодержащих буферах является функцией концентрации ионов натрия и температуры (Tm=81,5 С-16,6(Log10[Na+])+0,41(%(G+C)-600/1) или аналогичное уравнение). Соответственно, параметры условий промывки, которые определяют стабильность гибрида, представляют собой концентрацию иона натрия и температуру. Для того чтобы идентифицировать молекулы, которые являются схожими, но не идентичными, для известной молекулы нуклеиновой кислоты можно допустить 1% несоответствия, что приводит к снижению Tm примерно на 1 С; например, если предполагается, что молекулы нуклеиновых кислот имеют 95% идентичность, конечная температура промывки будет снижена примерно на 5 С. На основании данных рассуждений специалисты в данной области легко выберут подходящие условия гибридизации. В предпочтительных вариантах осуществления выбирают строгие условия гибридизации. В качестве примера, для достижения строгой гибридизации можно использовать следующие условия: гибридизация при 5 хлорид натрия/цитрат натрия (SSC)/5 раствор Денхардта (Denhardt)/1,0% SDS при Tm (на основе вышеуказанного уравнения -5 С, с последующей промывкой с использованием 0,2 SSC/0,1% SDS при 60 С. Умеренно строгие условия гибридизации включают стадию промывки в 3 SSC при 42 С. Однако следует понимать, что эквивалентная точность может достигаться с использованием альтернативных буферов, солей и температуры. Дополнительные указания, касающиеся условий гибридизации, можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, N.Y.,1989, 6.3.1-6.3.6 и в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989, vol. 3. Как использовано в данном описании, термины "аполипопротеин" и "полипептид аполипопротеина" относятся к любой и ко всем полипептидным последовательностям аполипопротеина, включая все полипептиды аполипопротеина млекопитающих и полипептид, содержащий последовательность остатков аминокислот, которая (i) по существу, идентична последовательностям аминокислот, составляющим любые полипептиды аполипопротеина, указанные в данном описании, или (ii) кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, способной к гибридизации, по меньшей мере, в относительно строгих условиях с любой кодирующей аполипопротеин последовательностью нуклеиновой кислоты, приведенной в данном описании или способной к гибридизации, по меньшей мере, в умеренно строгих условиях с любой кодирующей аполипопротеин последовательностью нуклеиновой кислоты, приведенной в данном описании, но для использования синонимических кодонов. Термины "аполипопротеин" и "полипептид аполипопротеина" включают полипептиды проаполипопротеина. Полипептиды аполипопротеина предпочтительно имеют человеческое, свиное и бычье происхождение. В предпочтительных вариантах осуществления данные аполипопротеины включают, но не ограничиваются указанным, аполипопротеин A-I(Аро AI), аполипопротеин A-IV (Apo AIV), аполипопротеин A-V (Аро AV) и аполипопротеин Е (Аро Е). Термин "химерный", как он использован в данном описании в контексте последовательностей нуклеиновых кислот, относится по меньшей мере к двум связанным последовательностям нуклеиновых кислот, которые не связаны по природе. Химерные последовательности нуклеиновых кислот включают связанные последовательности нуклеиновых кислот различного природного происхождения. Например,последовательность нуклеиновой кислоты, составляющая растительный промотор, связанная с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аполипопротеин человека, рассматривается как химерная. Химерные последовательности нуклеиновых кислот также могут содержать последовательности нуклеиновых кислот одного и того же природного происхождения при условии, что они не являются природно связанными. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, составляющая промотор,полученная от конкретного типа клетки, может быть связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, полученный от того же клеточного типа, но обычно не связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, составляющей промотор. Химерные последовательности нуклеи- 10015167 новых кислот также включают последовательности нуклеиновых кислот, содержащие любую природно существующую последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с любой не существующей в природе последовательностью нуклеиновой кислоты. Получение рекомбинантных векторов экспрессии, содержащих последовательности химерных нуклеиновых кислот, кодирующие аполипопротеин, и последовательность нуклеиновой кислоты,способную контролировать экспрессию в растительной клетке. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аполипопротеин, которые могут использоваться в соответствии со способами и композициями, разработанными в данном изобретении, могут представлять собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид аполипопротеина, включая любой проаполипопротеин и пред-проаполипопротеин. Существует ряд различных аполипопротеинов, которые обнаружены в плазме крови человека, и они могут действовать в качестве сигналов, которые вызывают действие липопротеинов на определенные ткани или активируют ферменты, которые действуют на данные липопротеины (Lehninger, A. et al.Commun. 203(2), 1146-1151 (1994, Apo H (см., например, Mehdi, H., et al., Gene, 108(2), 293-298 (1991 и Apo L (см., например, Duchateau, P.N., et al., J. Biol. Chem. 272(41), 25576-25582 (1997. Иллюстративные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аполипопротеин, хорошо известны в данной области и обычно легко доступны из множества различных источников, имеющих происхождение от млекопитающих, включая человека (см. выше), свинью (см., например, Trieu V.N. et al., Gene, 134(2),267-270 (1993, быка (см., например, Yang, Y.W., et al. J. Mol. Evol. 32(6), 469-475 (1991, овцу (см., например, Robertson, J.A. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 67(4), 285-292 (1998 и т.п. Последовательности, кодирующие аполипопротеин человека, которые можно использовать, включают те, кодирующие полипептидные цепи, которые указаны как последовательности, представленные SEQ ID NO: 1, 7 и 8. Дополнительные последовательности, кодирующие аполипопротеин, не являющийся аполипопротеином человека, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, указаны как последовательности, представленные SEQ ID NO: 9-55 и 241-251. Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные цепи аполипопротеина, легко могут быть идентифицированы с помощью каталожных идентификационных номеров, приведенных в табл. 1. С использованием данных последовательностей нуклеиновых кислот с помощью методов, известных специалистам в данной области, легко можно идентифицировать дополнительные новые последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аполипопротеин. Например, можно провести скрининг библиотек, таких как библиотеки экспрессии, кДНК и геномные библиотеки, и можно провести поиск по базам данных, содержащих информацию о последовательностях по проектам секвенирования. Можно использовать альтернативные способы выделения дополнительных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды аполипопротеина, и новые последовательности могут быть открыты и использованы в соответствии с настоящим изобретением. В предпочтительных вариантах осуществления последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аполипопротеин, представляют собой аполипопротеин человека,свиньи и быка. В соответствии с предшествующим уровнем данной области известны многочисленные аналоги аполипопротеина (см., например, Cheung M.C. et al., Biochim Biophys Acta. 1988 May 2; 960(1): 73-82 иStrobl W. et al., Pediatr Res. 1988, Aug.; 24(2): 222-8), и они могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Аналоги, которые можно использовать, включают молекулы аполипопротеина человека, где было открыто множество природных и синтетических мутаций и модификаций, включая,но не ограничиваясь указанным, точечные мутации, мутации с делецией, мутации со сдвигом рамки считывания и химические модификации. В соответствии с настоящим изобретением в предпочтительном варианте осуществления используется природный вариант, известный как Аро AI-M. Примеры мутаций и модификаций, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются указанным, те, которые приведены в табл. 2. В предпочтительных вариантах осуществления используемая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, представляет собой проаполипопротеин. Для получения аналогов аполипопротеина изменения в последовательности нуклеиновой кислоты,кодирующей аполипопротеин, могут быть сделаны с использованием множества способов модификации- 11015167 нуклеиновых кислот, известных специалистам в данной области, включая, например, сайт-направленный мутагенез, направленный мутагенез, случайный мутагенез, добавление органических растворителей,генное тасование или сочетание данных или других способов, известных специалистам в данной областиCarugo et al., 1997, Proteins 28: 10-28; Hurley et al., 1996, Biochem., 35: 5670-5678; Holmberg et al., 1999,Protein Eng. 12: 851-856). В соответствии с изложенным последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, способной контролировать экспрессию полипептида аполипопротеина в растительной клетке. Соответственно настоящее изобретение также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аполипопротеин, связанной с промотором, способным контролировать экспрессию в растительной клетке. Последовательности нуклеиновых кислот, способные контролировать экспрессию в клетках растений, которые можно использовать в данном изобретении, включают любой, полученный из растения промотор, способный контролировать экспрессию полипептидов в растениях. Обычно, будут использоваться промоторы, полученные из видов двудольных растений, когда двудольное растение выбрано в соответствии с изобретением, хотя промотор однодольного растения будет использоваться, когда выбирают растение однодольных видов. В одном варианте осуществления используется промотор, который приводит к экспрессии полипептида аполипопротеина в целом растении. Конститутивные промоторы,которые могут использоваться, включают, например, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты(CaMV) (Rothstein et al., 1987, Gene, 53: 153-161), актиновый промотор риса (McElroy et al., 1990, Plant.Cell. 2: 163-171; патент США 6429357), убиквитиновый промотор, такой как убиквитиновый промотор кукурузы (патенты США 5879903; 5273894), и убиквитиновый промотор петрушки (Kawalleck, P. et al.,1993, Plant. Mol. Biol. 21: 673-684). В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения аполипопротеин продуцируется в семенах растений. Продуцирование в семенах растений дает гибкость хранения и перевозки аполипопротеина в виде сырого материала, поскольку аполипопротеин сохраняет свою активность при экстракции из хранящихся семян. Кроме того, количество биомассы, которое необходимо подвергать экстракции, ограничивается благодаря относительно низкому содержанию воды, присутствующему в семенах. Соответственно в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка растения представляет собой клетку семени и растение выращивают в зрелое растение, способное давать семена, где семена экспрессируют аполипопротеин. В следующем предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, способная контролировать экспрессию в растительной клетке представляет собой предпочтительный для семян промотор, такой как фазеолиновый промотор. В таком варианте осуществления используют промотор, который приводит к предпочтительной экспрессии полипептида аполипопротеина в ткани семени. Термин "предпочтительные для семян промоторы" в данном отношении относится к промоторам, которые контролируют экспрессию рекомбинантного белка(т.е. аполипопротеина) таким образом, что предпочтительно по меньшей мере 80% общего количества рекомбинантного белка, присутствующего в зрелом растении, находится в семенах. Более предпочтительно по меньшей мере 90% общего количества рекомбинантного белка, присутствующего в зрелом растении, находится в семенах. Наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% общего количества рекомбинантного белка, присутствующего в зрелом растении, находится в семенах. Предпочтительные для семян промоторы, которые можно использовать в данном отношении, включают, например, фазеолиновый промотор бобов (Sengupta-Gopalan et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3320-3324); олеозиновый промотор Arabidopsis массой 18 кДа (патент США 5792922) или олеозиновый промотор льна(WO 01/16340); легуминоподобный промотор запасающего белка льна (линии) (WO 01/16340); промотор запасающего белка 2S льна (WO 01/16340); и эндосперм-предпочтительный промотор, такой как промотор Amy32b (Rogers and Milliman, J. Biol. Chem., 1984, 259: 12234-12240), промотор Amy6-4 (Kursheedand Rogers, J. Biol. Chem., 1988, 263: 18953-18960) или промотор Алеураина (Aleurain) (Whittier et al.,1987, Nucleic Acids Res., 15: 2515-2535) или арцелиновый промотор бобов (Jaeger G.D., et al., 2002, Nat.Biotechnol. Dec; 20: 1265-8). Постоянно открываются новые промоторы, используемые во многих растениях. Многочисленные примеры растительных промоторов можно найти в публикации Ohamuro et al.(Biochem. of Plnts., 1989, 15: 1-82). В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность химерной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую стабилизирующий полипептид, связанный в рамке считывания с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аполипопротеин. Стабилизирующий полипептид используется для облегчения складывания белка и/или усиления стабильного накопления аполипопротеина в клетках растений. Дополнительно стабилизирующий полипептид можно использовать для нацеливания в желательное месторасположение в клетке растения и/или облегчения очистки аполипопротеина. Предпочтительно стабилизирующий полипептид представляет собой полипептид, который в отсутствие аполипопротеина легко может экспрессироваться и стабильно накапливается в клетках трансгенных растений. Стабилизирующий полипептид может представлять собой растение-специфический или растениенеспецифический- 12015167 полипептид. Растение-специфические стабилизирующие полипептиды, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают белки масляного тела (см. ниже) и тиоредоксины,например тиоредоксин, представленный SEQ ID NO: 56. Растениенеспецифические стабилизирующие полипептиды, которые можно использовать в соответствии с указанным в данном описании, включают зеленый флуоресцентный белок (GFP) (Davis and Vierstra, 1996, Weeds World 3(2): 43-48)(SEQ ID NO: 57) и одноцепочечные антитела или их фрагменты. Предпочтительно растениенеспецифические стабилизирующие полипептиды представляют собой кодон, оптимизированный для оптимальной экспрессии в растениях. Одноцепочечные антитела или антитела, которые предпочтительно используются в данном изобретении, включают одноцепочечные антитела или их фрагменты, которые облегчают очистку аполипопротеина. В соответствии с этим, например, можно использовать одноцепочечное антитело или его фрагмент, которое способно к специфической ассоциации с масляным телом или белком масляного тела, что дает возможность соочистки аполипопротеина с фракцией масляного тела, где фракция масляного тела легко может быть получена из семян растений. Предпочтительно одноцепочечное антитело способно к ассоциации с белком масляного тела, получаемым из семян, в которых экспрессируется аполипопротеин,т.е. в варианте осуществления изобретения, в котором используются клетки растения Arabidopsis, выбирают одноцепочечное антитело или его фрагмент, способное к ассоциации с белком масляного телаArabidopsis. В следующем предпочтительном варианте осуществления одноцепочечное антитело представляет собой одноцепочечное антитело Fv, способное специфически образовывать ассоциаты с олеозином, полученным из Arabidopsis thalania, массой 18 кДа (D9scFv). В наиболее предпочтительном варианте осуществления одноцепочечное антитело представлено последовательностью SEQ ID NO: 240. Термин "фрагмент одноцепочечного антитела" (scFv) или "фрагмент антитела", как он использован в настоящем описании, означает полипептид, содержащий вариабельный домен легкой цепи (VL), связанный с вариабельным доменом тяжелой цепи (VH) пептидным линкером (L), представленный как VL-L-VH. Порядок доменов VL и VH может быть обратным для получения полипептидов, представленных как VH-LVL. "Домен" (область) представляет собой сегмент белка, который выполняет отдельную функцию, такую как связывание антигена или распознавание антигена. Фрагменты одноцепочечных антител для использования в настоящем изобретении могут быть получены из вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи любого антитела. Предпочтительно вариабельные области легкой и тяжелой цепей являются специфическими в отношении одного и того же антигена. Наиболее предпочтительно антиген представляет собой белок масляного тела. Фрагменты индивидуального антитела, которые связаны с образованием мультивалентного одноцепочечного антитела, могут быть направлены против одного и того же антигена или могут быть направлены против различных антигенов. Методологии создания одноцепочечных антител хорошо известны в данной области. Например, одноцепочечные антитела могут быть созданы путем скрининга одноцепочечных (scFv) библиотек фагового дисплея. Методологии создания одноцепочечных антител из библиотек фагового дисплея хорошо известны в данной области. McCarrerty et al. (Nature, 348: 552-554) продемонстрировал применение системы фагового дисплея, в которой фрагменты антител экспрессировались в виде слитого белка с вектором fd фага,давая возможность экспрессии одноцепочечных антител на поверхности фага. Продуцирование библиотеки фагового дисплея одноцепочечного антитела может достигаться с использованием, например, системы рекомбинантного фагового антитела (Recombinant Phage Antibody System), разработанной Amersham Biosciences и Cambridge Antibody Technology. Более подробный протокол доступен от AmershamBiosciences, который продается в виде 3 частей, включая молекулу мышиного scFV, модуль экспрессии и модуль обнаружения. Кратко, протокол продуцирования одноцепочечных антител состоит в следующем. Мессенджерная РНК может быть получена или из гибридомы мыши, или из клеток селезенки мыши, полученной от мыши, иммунизированной представляющим интерес антигеном. Мышиная гибридома представляет собой наиболее изобильный источник гена антитела для клонирования, поскольку она экспрессирует гены тяжелой и легкой цепей для отдельного антитела, но антитела также могут быть клонированы с использованием клеток селезенки от иммунизированной мыши. мРНК преобразовывают в кДНК с использованием обратной транскриптазы и выбранных наугад гексамерных праймеров. Применение случайных гексамеров будет приводить к молекулам кДНК, которые достаточны по длине для клонирования вариабельных областей молекул тяжелой и легкой цепей. После создания молекул кДНК проводят первичные ПЦР реакции для амплификации по отдельности тяжелой и легкой вариабельных областей. Праймеры разрабатывают для амплификации вариабельных областей тяжелой или легкой цепи путем гибридизации противоположных концов цепи. После амплификации вариабельных областей ПЦР реакции подвергают электрофорезу на агарозном геле и очищают на геле для удаления праймеров и любых посторонних ПЦР продуктов. После очистки вариабельных областей тяжелой и легкой цепи их собирают в единый ген с использованием линкера. Область линкера конструируется таким образом, чтобы гарантировать то, что поддерживается корректная рамка считывания между тяжелой и легкой цепями. Например, вариабельная тяжелая (VH) и вариабельная легкая (VL) цепи могут быть связаны с использованием линкера (Gly4Ser3) для получения фрагмента одноцепочечного антитела (scFv), имеющего в длину приблизительно 750 пар оснований. После того как тяжелая и легкая цепи собраны вместе с помощью лин- 13015167 кера, проводят вторую ПЦР реакцию для амплификации scFv фрагментов ДНК. Для введения сайтов рестрикции должны быть разработаны праймеры, чтобы дать возможность клонирования в фагомидные векторы экспрессии. Например, сайты SfiI и NotI могут быть добавлены в 5' и 3' концы данного scFv гена для клонирования в вектор pCANTAB 5 Е (Amersham Biosciences). По завершении ПЦР фрагменты ДНК должны быть очищены для удаления невведенных праймеров и dNTP. Это может быть осуществлено с использованием очистки на скрученной колонке. После того как фрагменты ДНК были очищены и оценены количественно, фрагменты расщепляют с использованием подходящих рестрикционных ферментов, чтобы иметь возможность клонирования в подходящий вектор экспрессии. Фрагменты ДНК впоследствии лигируют в вектор экспрессии, например, pCANTAB 5 Е (Amersham Biosciences) и вводят в подходящие клетки E.coli. Клетки следует выращивать на подходящей селекционной среде, чтобы гарантировать, что будут расти только клетки, содержащие вектор экспрессии (т.е. с использованием определенного источника углерода и селекцией по антибиотику). После выращивания клеток E.coli фагомидсодержащие колонии инфицируют хелперным фагом М 13 (т.е. KO7 - Amersham Biosciences), получая рекомбинантный фаг, который отображает фрагменты scFv. Фаг М 13 будет инициировать репликацию фага, и полные частицы фагов будут продуцироваться и высвобождаться из клеток, экспрессируя разновидности scFv на их поверхности. Фаговое отображение корректных антител scFv идентифицируют путем пэннинга с использованием специфического антигена. Для исключения неспецифического фага культура рекомбинантного фага может быть перенесена на покрытую антигеном подложку (т.е. колбу или пробирку) и промыта. Только фаги, отображающие корректный scFv, будут связываться с подложкой. Восприимчивый штамм E.coli впоследствии инфицируют фагом, связанным с покрытой антигеном подложкой. Фаг может быть обогащен "спасением" с помощью хелперного фага и с последующим многократным пэннингом против антигена, или он может быть непосредственно размещен на твердой среде без дополнительного обогащения. Размещают клетки E.coli, которые были инфицированы фагом, отобранные относительно подходящего антигена, и собирают индивидуальные колонии. Фаг из индивидуальных колоний затем анализируют с использованием, например, анализа ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Фаговые антитела, которые являются положительными при использовании анализа ELISA, затем могут быть использованы для инфицирования клеток НВ 2151 E.coli для продуцирования растворимых рекомбинантных антител. После отбора подходящих клонов последовательность гена антитела scFv может быть идентифицирована и использована в целях настоящего изобретения. Стабилизирующий белок может быть связан с аполипопротеином с помощью линкера, который может отщепляться для высвобождения аполипопротеина в его свободном природном виде. Линкеры,которые могут быть включены для этой цели, включают последовательности пептидов, распознаваемые фактором Ха, протеазой IgA или энтерокиназой. В особенно предпочтительном варианте осуществления линкер кодирует пропоследовательность химозина, которая может расщепляться с помощью зрелого химозина, как указано в патентной заявке РСТ WO 98/49326. В предпочтительных вариантах осуществления последовательность химерной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит "нацеливающий сигнал". Термин "нацеливающий сигнал", как он использован в данном описании, означает любую последовательность аминокислот, способную направлять полипептид аполипопротеина, когда он экспрессируется, в желаемое месторасположение внутри клетки растения. Подходящие нацеливающие сигналы, которые можно использовать в данном случае, включают те,которые способны направлять полипептид аполипопротеина в эндоплазматическую сеть или везикулы хранения, полученные из эндоплазматической сети, такие как масляное тело, и в апопласт. Для достижения накопления аполипопротеина в ER или в везикуле хранения, производной ER, полипептид, кодирующий полипептид, кодирующий аполипопротеин, связан с нацеливающим сигналом,который вызывает сохранение аполипопротеина в ER или в везикуле хранения, производной ER. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нацеливающий сигнал, который способен сохранять аполипопротеин в ER, содержит С-концевой мотив ER-удерживания. Примеры таких Сконцевых мотивов ER-удерживания включают последовательности KDEL, HDEL, DDEL, ADEL и SDEL. Другие примеры включают HDEF (Lehmann et al., 2001, Plant. Physiol. 127(2): 436-439), или два остатка аргинина, близко расположенные к N-концу в положениях 2 и 3, 3 и 4 или 4 и 5 (Abstract from Plant. Biology, 2001, Program, ASPB, July 2001, Providence, Rhode Island, USA). Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие С-концевой мотив удерживания, предпочтительно связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аполипопротеин таким образом, что полипептид, способный удерживать аполипопротеин в ER, связан с С-концом полипептида аполипопротеина. В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых аполипопротеин сохраняется в ER,последовательность химерной нуклеиновой кислоты дополнительно может содержать нуклеиновую последовательность, которая нацеливает последовательность нуклеиновой кислоты в эндомембранную систему ("сигнальный пептид"). В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых аполипопротеин сохраняется в ER с использованием последовательности, такой как полипептид KDEL, HDEL или SDEL, особенно желательно включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид.- 14015167 Иллюстративные сигнальные пептиды, которые могут использоваться в данном случае, включают сигнальную последовательность белка, связанного с патогенезом табака (PR-S) (SEQ ID NO: 58) (Sijmonset al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221), сигнальную последовательность лецитина (Boehn et al., 2000,Transgenic Res, 9(6): 477-86), сигнальную последовательность гидроксипролин-обогащенного гликопротеина из Phaseolus vulgaris (Yan et al., 1997, Plant. Phyiol. 115 (3): 915-24, и Corbin et al., 1987, Mol. Cell.Biol. 7(12): 4337-44), сигнальную последовательность пататина картофеля (Iturriaga, G. et al., 1989, Plant.Cell. 1: 381-390, и Bevan et al., 1986, Nuc. Acids Res. 41: 4625-4638) и сигнальную последовательность альфа-амилазы ячменя (Rasmussen and Johansson, 1992, Plant. Mol. Biol. 18(2): 423-7). Пример 3 в данном описании иллюстрирует аккумуляцию аполипопротеина в ER. В следующем предпочтительном варианте осуществления полипептид аполипопротеина связан с полипептидом, который способен удерживать полипептид аполипопротеина в везикуле хранения, производной ER. В предпочтительном варианте осуществления везикула хранения, производная ER, представляет собой масляное тело, и аполипопротеин связан с белком масляного тела. Белки масляного тела, которые могут использоваться для данной цели, включают любой белок, который связан в природе с масляным телом (см. SEQ ID NO: 59-137 в табл. 3). Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные цепи белков масляного тела, легко могут быть идентифицированы с помощью идентификационных инвентарных номеров, представленных в табл. 3. С использованием данных последовательностей нуклеиновых кислот легко могут быть идентифицированы с использованием методов, известных специалистам в данной области, дополнительные новые белки масляного тела, кодирующие последовательности нуклеиновых кислот. Например, может быть проведен скрининг библиотек,таких как библиотеки экспрессии, кДНК и геномные библиотеки, и может быть проведен поиск аналогичных последовательностей по базам данных, содержащим информацию по проектам секвенирования. Можно использовать альтернативные способы выделения дополнительных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды белков масляного тела, и новые последовательности могут быть открыты и использованы в соответствии с настоящим изобретением. Белки масляного тела, которые являются особенно предпочтительными, представляют собой олеозины, например олеозин кукурузы(Bowman-Vance et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 11275-11279; Qu et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 2238-2243) или Brassica (Lee et al., 1991, Plant. Physiol. 96: 1395-1397), калеозины, см. например, Genbank инвентарный номер AF067857) и стеролеозины (Lin et al., 2002, Plant. Physiol. 128(4): 1200-11). В следующем предпочтительном варианте осуществления белок масляного тела представляет собой растительный олеозин и разделяет сходство последовательности с другими растительными олеозинами, такими как олеозин, выделенный из Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 138) или Brassica napus (SEQ ID NO: 139). В другом варианте осуществления белок масляного тела представляет собой калеозин или кальцийсвязывающий белок, полученный из растения, гриба или других источников, и разделяет гомологию последовательности с растительными калеозинами, такими как калеозин, выделенный из Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141). В другом предпочтительном варианте осуществления белок масляного тела представляет собой стеролеозин (SEQ ID NO: 142), стеролсвязывающая дегидрогеназа (Lin L.-J. et al. (2002),Plant. Physiol. 128: 1200-1211). Данный вариант осуществления настоящего изобретения проиллюстрирован в примере 3. Дополнительно в соответствии с настоящим изобретением аполипопротеин может быть также направлен в масляное тело путем экспрессии аполипопротеина, происходящей таким образом, что аполипопротеин не содержит нацеливающий сигнал, однако при условии, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, содержит пропептид аполипопротеина. Данный вариант осуществления настоящего изобретения проиллюстрирован в примере 3. Полипептиды, способные удерживать аполипопротеин в ER или в везикуле хранения, производнойER, обычно не расщепляются, и аполипопротеин может накапливаться в виде слитого белка, что типично, например, в том случае, когда KDEL удерживающий сигнал используется для удерживания полипептида в ER, или когда белок масляного тела используется для удерживания полипептида в масляном теле. В другом варианте осуществления настоящего изобретения полипептид аполипопротеина экспрессируется таким образом, что полипептид накапливается в апопласте. Для достижения такого накопления последовательность химерной нуклеиновой кислоты предпочтительно включает нацеливающую последовательность, способную направлять полипептид аполипопротеина в ER ("сигнальный пептид"). Иллюстративные сигнальные пептиды, которые можно использовать в данном случае, включают отмеченные выше сигнальную последовательность белка, связанного с патогенезом табака (PR-S) (SEQ ID NO: 58)(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221), сигнальную последовательность лецитина (Boehn et al.,2000, Transgenic Res, 9(6): 477-86), сигнальную последовательность гидроксипролинобогащенного гликопротеина из Phaseolus vulgaris (Yan et al., 1997, Plant. Phyiol. 115 (3): 915-24, и Corbin et al., 1987, Mol.Cell. Biol. 7(12): 4337-44), сигнальную последовательность пататина картофеля (Iturriaga, G. et al., 1989,Plant. Cell. 1: 381-390, Bevan et al., 1986, Nuc. Acids Res. 41: 4625-4638) и сигнальную последовательность альфа-амилазы ячменя (Rasmussen and Johansson, 1992, Plant. Mol. Biol. 18(2): 423-7). Такие нацеливающие сигналы могут отщепляться in vivo от полипептида аполипопротеина, что, например, обычно в том случае, когда используется апопластнацеливающий сигнал, такой как сигнальная последовательность- 15015167 белка, связанного с патогенезом табака S(PR-S) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Другие сигнальные пептиды могут быть спрогнозированы с использованием Вэб-сервера SignalP World WideWeb server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), который предсказывает присутствие и расположение сайтов расщепления сигнального пептида в последовательностях аминокислот различных организмов. Обычно имеется небольшая сохранность первичной последовательности аминокислот, хотя общие физико-химические свойства в определенной степени сохраняются. Общая структура сигнальных пептидов имеет 3 области, короткую аминоконцевую "n-область", содержащую положительно заряженные остатки, центральная "h-область" изменяется в размере от 7 до 15 аминокислот, и карбоксиконцевая "собласть" содержит полярные аминокислоты и сайт-расщепления, который распознается мембранносвязанными сигнальными ферментами пептидазы (Nakai K., 2000, Advances in Protein Chem. 54: 277-344). Нацеливающие сигналы, которые также можно использовать в соответствии с этим, включают сигнальную последовательность природного аполипопротеина (18 аминокислот в длину в случае последовательности человека). В предпочтительных вариантах осуществления этого используют расположенную на Nконце нацеливающую в апопласт последовательность, такую как указанная выше PR-S последовательность табака, в сочетании с расположенной на С-конце последовательностью удерживания в ER, такой как последовательность KDEL. В еще одном следующем предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, экспрессируется таким образом, что аполипопротеин накапливается в цитоплазме. В таком варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты не содержит нацеливающего сигнала. Предпочтительно в таком варианте осуществления аполипопротеин содержит дополнительный стабилизирующий полипептид, такой как зеленый флуоресцентный белок(GFP). Последовательность химерной нуклеиновой кислоты может также содержать N- и/или С-концевые полипептидные расширения. Такие расширения можно использовать для стабилизации и/или способствования складыванию полипептидной цепи аполипопротеина, или они могут облегчать нацеливание в отдел клетки, например масляное тело. Полипептидные расширения, которые можно использовать в данном случае, включают, например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую одноцепочечное антитело, или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (Davis and Vierstra, 1996, Weeds World, 3(2): 43-48), или комбинацию таких полипептидов. Особенно желательные расширения одноцепочечного антитела включают те, которые дают возможность ассоциации аполипопротеина с масляным телом для облегчения очистки аполипопротеина, связанного с фракцией масляного тела. Такие расширения предпочтительно включены в варианты осуществления настоящего изобретения, в которых аполипопротеин экспрессируется в семенах растений и направляется в клетках семян в ER или в апопласт. В следующем варианте осуществления сайт расщепления может быть расположен выше N-конца или ниже С-конца пептида аполипопротеина A-I, давая возможность полипептиду аполипопротеина A-I отщепляться от партнера слияния с получением таким образом выделенного аполипопротеина A-I. Примеры таких сайтов расщепления можно найти в WO 98/49326 (Способ расщепления слитых белков) и родственных заявках и в публикации LaVallie et al. (1994), Enzymatic and chemical cleavage of fusion proteins In Current Protocols in Molecular Biology, p. 16.4.5-16.4.17, John Wiley and Sons, Inc., New York NY. В предпочтительном варианте осуществления сайт расщепления представляет собой KLIP 8 (SEQ ID NO: 143), который расщепляется аспарагиновыми протеазами, включая химозин. В следующем предпочтительном варианте осуществления к N-концу полипептида Аро AI или полипептида pro-Apo AI добавлены дополнительные метиониновые остатки. Изобретение дополнительно относится к способам отделения гетерологичного белка от компонентов клетки-хозяина путем распределения фракции масляного тела и последующего высвобождения гетерологичного белка посредством специфического расщепления слитого белка гетерологичный белокбелок масляного тела. Необязательно сайт расщепления может быть расположен выше N-конца или ниже С-конца гетерологичного полипептида, давая возможность слитому белку отщепляться и отделяться путем разделения фаз на компоненты пептидов. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, может быть видоизменена для улучшения уровней экспрессии, например, путем оптимизации последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с применением предпочтительного кодона для конкретного типа растительной клетки, которая выбрана для экспрессии полипептида аполипопротеина, или путем изменения известных мотивов для дестабилизации мРНК (см., например, патентную заявку РСТ 97/02352). Сравнение использования кодона последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина, и использования кодона типа растительной клетки делает возможным идентификацию кодонов, которые могут быть изменены. Конструкция синтетических генов путем изменения применения кодона описана,например, в патентной заявке РСТ 93/07278. В предпочтительном варианте осуществления используемая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аполипопротеин, представлена SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5.- 16015167 В данном случае можно использовать некоторые генетические элементы, способные усиливать экспрессию полипептида аполипопротеина. Данные элементы включают нетранслируемые лидерные последовательности некоторых вирусов, такие как лидерная последовательность AMV (Jobling and Gehrke,1987, Nature, 325: 622-625) и интрон, связанный с убиквитиновым промотором кукурузы (патент США 5504200). Обычно последовательность химерной нуклеиновой кислоты будут получать таким образом,чтобы генные элементы, способные усиливать экспрессию, были бы расположены 5' относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина. В соответствии с настоящим изобретением последовательности химерных нуклеиновых кислот, содержащие промотор, способный контролировать экспрессию в растении, связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина, мог быть интегрирован в рекомбинантный вектор экспрессии, который гарантирует хорошую экспрессию в клетке. Соответственно настоящее изобретение включает рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках растений;(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид аполипопротеина; где вектор экспрессии является подходящим для экспрессии в растительной клетке. Термин "подходящий для экспрессии в растительной клетке" означает, что рекомбинантный вектор экспрессии содержит последовательность химерной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению,связанную с генетическими элементами, требуемыми для достижения экспрессии в растительной клетке. Генетические элементы, которые могут быть включены в вектор экспрессии в таком отношении, включают область окончания транскрипции, одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот,кодирующих маркерные гены, один или несколько источников репликации и т.п. В предпочтительных вариантах осуществления вектор экспрессии дополнительно содержит генетические элементы, требуемые для интеграции вектора или его части в ядерный геном клетки растения, например, Т-ДНК левую или правую граничные последовательности, которые облегчают интеграцию в ядерный геном клетки растения в вариантах осуществления изобретения, где клетки растения трансформируют с использованием Agrobacterium. В следующем предпочтительном варианте осуществления указанная растительная клетка представляет собой клетку семени растения. Как отмечено ранее, рекомбинантный вектор экспрессии обычно содержит терминатор транскрипции, который помимо того, что он служит в качестве сигнала для окончания транскрипции, дополнительно может служить в качестве защитного элемента, способного продлевать полупериод жизни мРНК(Guarneros et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 238-242). Терминатор транскрипции обычно содержит примерно от 200 до примерно 1000 нуклеотидов, и вектор экспрессии получают таким образом, что терминатор транскрипции расположен в 3' положении последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аполипопротеин. Терминаторные последовательности, которые можно использовать в данном случае, включают, например, терминаторную область нопалина (Bevan et al., 1983, Nucl. Acids. Res., 11: 369-385), терминатор фазеолина (van der Geest et al., 1994, Plant. J. 6: 413-423), терминатор арцелина (Jaeger G.D., et al., 2002, Nat. Biotechnol. 20: 1265-8), терминатор для генов октопинсинтазы Agrobacteriumtumefaciens или другие аналогично функционирующие элементы. Терминаторы транскрипции могут быть получены, как описано An (An, 1987, Methods in Enzym. 153: 292). В соответствии с настоящим изобретением вектор экспрессии может дополнительно содержать маркерный ген. Маркерные гены, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают все гены, которые дают возможность отличать трансформированные клетки от нетрансформированных клеток, включая все селектируемые и скринабельные маркерные гены. Маркерный ген может представлять собой маркер резистентности, такой как маркер резистентности к антибиотикам,например, против канамицина (патент США 6174724), ампициллина, G418, блеомицина, гидромицина,который дает возможность отбора характерной особенности с помощью химических способов, или маркер толерантности против химического агента, такой как обычно фитотоксический сахар манноза (Negrotto et al., 2000, Plant. Cell. Rep. 19: 798-803). Другие удобные маркеры, которые можно использовать в данном изобретении, включают маркеры, способные передавать резистентность против гербицидов, таких как глифосат (патенты США 4940935; 5188642), фосфинотрицин (патент США 5879903) или сульфонилмочевины (патент США 5633437). Маркеры резистентности, когда они связаны вблизи последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина, могут использоваться для поддержания давления отбора на популяцию клеток растения или растений, которые не утратили последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид аполипопротеина. Скринабельные маркеры, которые могут использоваться для идентификации трансформантов путем визуального осмотра,включают -глюкуронидазу (GUS) (патенты США 5268463 и 5599670) и зеленый флуоресцентный белок(GFP) (Niedz et al., 1995, Plant. Cell. Rep., 14: 403). Рекомбинантные векторы, подходящие для введения последовательностей нуклеиновых кислот в растения, включают векторы на основе Agrobacterium и Rhizobium, такие как плазмиды Ti и Ri, включая,например, pBIN19 (Bevan, Nucl. Acid. Res., 1984, 22: 8711-8721), pGKB5 (Bouchez et al., 1993, С. R. Acad.Sci. Paris, Life Sciences, 316: 1188-1193), ряд бинарных векторов pCGN (McBride and Summerfelt, 1990,Plant. Mol. Biol., 14: 269-276) и другие бинарные векторы (например, патент США 4940838). Рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с методологиями, хорошо известными специалистам в области молекулярной биологии. Такие методы получения обычно будут включать в качестве промежуточных хозяев клонирования виды бактерийEscherichia coli. Получение векторов Е.coli, также как и векторов трансформации растений может быть осуществлено с использованием обычных известных методов, таких как рестрикционное расщепление,лигирование, гелевый электрофорез, секвенирование ДНК, полимеразная цепная реакция (PCR) и других методологий. Доступно большое число векторов клонирования для осуществления необходимых стадий,требуемых для получения рекомбинантного вектора экспрессии. К числу векторов с системой репликации, функционирующей в Е.coli, относятся такие векторы как pBR322, ряд векторов pUC, ряд векторовM13mp, pBluescript и т.д. Обычно данные векторы клонирования содержат маркер, дающий возможность отбора трансформированных клеток. Последовательности нуклеиновых кислот можно вводить в данные векторы, и векторы могут быть введены в Е.coli, выращиваемые в подходящей среде. Рекомбинантные векторы экспрессии легко могут быть выделены из клеток при их сборе и лизировании. Далее, общие указания, касающиеся получения рекомбинантных векторов, можно найти, например, в справочникеSambrook и др., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, vol. 3. Получение растений, содержащих семена, способные экспрессировать аполипопротеин. В соответствии с настоящим изобретением последовательность химерной нуклеиновой кислоты вводят в клетку растения, клетки выращивают в зрелые растения, где растения экспрессируют полипептид аполипопротеина. В соответствии с этим могут быть выбраны любой вид растений или клетка растения. Конкретные используемые здесь клетки включают клетки, полученные из Arabidopsis thaliana, бразильского ореха(Cucurbita maxima); ячменя (Hordeum vulgare); пшеницы (Traeticum aestivum); ряски (Lemnaceae sp.) и подсолнечника (Helianthus annuus). В соответствии с этим в предпочтительном варианте осуществления изобретения используют виды растений или клетки растений из растений с масляными семенами. Растения с масляными семенами, которые могут использоваться в данном изобретении, включают арахис (Arachis hypogaea); горчицу (Brassica spp. и Sinapis alba); рапс (Brassica spp.); турецкий горох (Cicer arietinum); сою (Glycine max); хлопокusitatissimum); белый клевер (Trifolium repens); оливу (Olea eurpaea); масличную пальму (Elaeis guineeis); сафлор (Carthamus tinctorius) и вику чечевицевидную (Vicia narbonesis). В соответствии с этим в особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения используют Arabidopsis, лен или сафлор. Методологии для введения растительных рекомбинантных векторов экспрессии в клетку растения,также упоминаемого в данном описании как "трансформация", хорошо известны в данной области и обычно изменяются в зависимости от выбранного типа растения. Общие способы введения рекомбинантных векторов экспрессии в клетки включают электропорацию; химически опосредованные методы,например CaCl2 опосредованное поглощение нуклеиновой кислоты; бомбардировку частицами (биолистикс (biolistics; применение природно инфицированных последовательностей нуклеиновых кислот, например, полученных из вирусов последовательностей нуклеиновых кислот или последовательностей,являющихся производными Agrobacterium или Rhizobium, поглощение нуклеиновой кислоты, опосредованное полиэтиленгликолем (ПЭГ), микроинъекцию и применение крупиц карбида кремния. В предпочтительных вариантах осуществления выбирают методологию трансформации, дающую возможность интеграции последовательности химерной нуклеиновой кислоты в геном растительной клетки и предпочтительно геном ядра растительной клетки. Соответственно это считается особенно желательным, поскольку применение такой методологии будет приводить к переносу последовательности химерной нуклеиновой кислоты в потомство растений при половом размножении. Методы трансформации, которые можно использовать в данном отношении включают биолистикс и способы, опосредованные Agrobacterium. Методологии трансформации для двудольных видов растений хорошо известны. Обычно используют трансформацию, опосредованную Agrobacterium, вследствие ее высокой эффективности, а также общей применимости для многих, если не всех, видов двудольных растений. Трансформация с использованием Agrobacterium обычно включает перенос бинарного вектора, такого как один из упомянутых выше бинарных векторов, включающего последовательность химерной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению из Е.coli, в подходящий штамм Agrobacterium (например, ЕНА 101 и LBA4404) с использованием, например, трехродительского соединения со штаммом Е.coli, несущим рекомбинантный би- 18015167 нарный вектор, и штаммом Е.coli, несущим хелперную плазмиду, способную к мобилизации бинарного вектора к целевому штамму Agrobacterium, или путем трансформации ДНК штамма Agrobacterium(Hofgen et al., Nucl. Acids. Res., 1988, 16: 9877). Другие способы, которые можно использовать для трансформации клеток двудольных растений, включают биолистикс (Sanford, 1988, Trends in Biotechn. 6: 299-302); электропорацию (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5824-5828); опосредованное ПЭГ поглощение ДНК (Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genetics, 199: 169-177); микроинъекцию (Reich etal., Bio/Techn., 1986, 4: 1001-1004); и частицы карбида кремния (Kaeppler et al., 1990, Plant. Cell. Rep., 9: 415-418), или в трансформации in planta использование, например, методологии погружения цветов(Clough and Bent, 1998, Plant. J., 16: 735-743). Виды однодольных растений могут быть трансформированы с использованием множества методологий, включая бомбардировку частицами (Christou et al., 1991, Biotechn. 9: 957-962; Weeks et al., Plant.Physiol., 1993, 102: 1077-1084; Gordon-Kamm et al., Plant. Cell. 1990, 2: 5603-618); опосредованное ПЭГ поглощение ДНК (европейские патенты 0292435; 0392225) или опосредованную Agrobacterium трансформацию (Goto-Fumiyuki et al., 1999, Nature-Biotech. 17: 282-286). Конкретная методология трансформации растения может изменяться в некоторой степени в зависимости от вида растения и типа растительной клетки (например, типов клеток, полученных из семян,таких как гипокотиль (подсемядольное колено) и семядоля, или эмбриональная ткань), которая выбрана в качестве клетки-мишени для трансформации. Как отмечено выше, в особенно предпочтительном варианте осуществления используют сафлор. Методология получения трансформантов сафлора доступна по публикации Baker и Dyer (Plant. Cell. Rep., 1996, 16: 106-110). Дополнительные конкретные протоколы трансформации видов растений можно найти в Biotechnology in Agriculture and Forestry 46: TransgenicTransgenic Crops II (Y.P.S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, New York (2001). После трансформации клетки растений выращивают и после появления дифференцированной ткани, такой как побеги и корни, регенерируют зрелые растения. Обычно регенерируют множество растений. Методологии регенерации растений обычно являются зависимыми от вида растения и типа клетки,и они будут известны специалистам в данной области. Дальнейшие указания в отношении культуры растительных тканей можно найти, например, в Plant. Cell. and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds.,Kluwer Academic Publishers; и в Plant. Cell. Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111), 1999, HallEds., Humana Press. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения семян растений, содержащих аполипопротеин. Соответственно настоящее изобретение относится к способу получения семян растений, включающих аполипопротеин, предусматривающему:(a) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений;(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения;(c) выращивание клетки растения в зрелое растение, и(d) получение семян указанного растения, где семена содержат аполипопротеин. Семена можно использовать для получения популяции потомства растений, каждое из которых содержит множество семян, экспрессирующих аполипопротеин. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 0,25% общего белка семян представляет собой аполипопротеин. Более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,5% общего белка семян представляет собой аполипопротеин. Наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1,0% общего белка семян представляет собой аполипопротеин. В предпочтительном варианте осуществления множество трансформированных растений получают,выращивают и проводят для них скрининг на присутствие желаемой последовательности химерной нуклеиновой кислоты, присутствие которой в предполагаемых трансформантах может быть протестировано с помощью, например, выращивания на выбранной среде, где используются маркеры гербицидной резистентности, путем непосредственного нанесения гербицидов на растения или путем саузерн-блоттинга. Если присутствие последовательности химерной нуклеиновой кислоты обнаружено, трансформированные растения могут быть отобраны для образования потомства и в конечном счете зрелых растений, содержащих множество семян, включающих последовательность желаемой химерной нуклеиновой кислоты. Такие семена можно использовать для выделения аполипопротеина, или они могут быть высеяны для образования двух или более последующих поколений. Обычно будет желательно посеять множество трансгенных семян для получения популяции трансгенных растений, каждое из которых содержит семена, включающие последовательность химерной нуклеиновой кислоты, кодирующую аполипопротеин. Кроме того, обычно будет желательно гарантировать гомозиготность в растениях для того, чтобы гарантировать постоянное наследование рекомбинантного полипептида. Способы селекции гомозиготных рас- 19015167 тений хорошо известны специалистам в данной области. Способы получения гомозиготных растений,которые можно использовать, включают получение и трансформацию гаплоидных клеток или тканей с последующей регенерацией гаплоидных всходов и последующим превращением в диплоидные растения,например, путем обработки колхином или другими разрывающими микроканальцы агентами. Растения могут быть выращены в соответствии с другими обычными методами сельского хозяйства. В другом аспекте настоящее изобретение также относится к растениям, способным давать семена,экспрессирующие аполипопротеин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растения,способные давать семена, содержат последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащую в 5'-3' направлении транскрипции (a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений, функционально связанную с (b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина; где семена содержат аполипопротеин. В предпочтительном варианте осуществления последовательность химерной нуклеиновой кислоты стабильно интегрирована в ядерный геном растения. Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к семенам растений, экспрессирующих аполипопротеин. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения семена растений содержат последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащую в 5'-3' направлении транскрипции (a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений, функционально связанную с (b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид аполипопротеина. Полипептид аполипопротеина может присутствовать во множестве различных типов клеток семян,включая, например, гипокотили (подсемядольные колена) и эмбриональные оси, включая эмбриональные корни и эмбриональные листья, и где однодольные виды растений, включая злаковые и зерновые растения, используются в ткани эндосперма. Когда растения получены, белок аполипопротеина может быть экстрагирован и выделен из растений в более или менее чистой форме. Соответственно настоящее изобретение относится к способу получения, по существу, чистого аполипопротеина, предусматривающему:(a) создание конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в качестве функционально связанных компонентов:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, способную контролировать экспрессию в клетках семян растений;(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения;(c) выращивание клетки растения в зрелое растение, и получение семян указанного растения, где семена содержат аполипопротеин;(d) отделение аполипопротеина от компонентов семян растения для получения, по существу, чистого аполипопротеина. Для отделения аполипопротеина от компонентов семян семена растений могут быть измельчены с использованием любого способа измельчения, приводящего к существенному разрушению мембран клеток семян и клеточных стенок. Можно использовать условия как сухого, так и влажного помола (патент США 3971856; Lawhon et al., 1977, J. Am. Oil Chem. Soc. 63: 533-534). Подходящее в данном отношении оборудование для помола включает коллоидные мельницы, дисковые мельницы, IKA мельницы, промышленные гомогенизаторы и т.п. Выбор оборудования для измельчения будет зависеть от типа семян и требований производительности. Твердые компоненты семян, такие как шелуха семян, волокнистые материалы, нерастворимые углеводы, белки и другие не растворимые в воде составляющие, могут быть удалены из фракции семян с использованием, например, методологий с исключением по размеру, таких как фильтрование или основанные на гравитации процессы, такие как центрифугирование. В предпочтительных вариантах осуществления применение органических растворителей, обычно используемых для экстракции масла, таких как гексан, исключается, поскольку такие растворители могут повредить полипептид аполипопротеина. Как отмечено ранее в данном описании, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения аполипопротеин получают способом, который допускает ассоциацию полипептида аполипопротеина с масляными телами семян. Соответственно масляные тела семян, включающие аполипопротеин, могут быть получены после измельчения семян с использованием, например,методологии, подробно описанной в патенте США 6146645. Таким образом, настоящее изобретение также включает, по существу, чистые масляные тела, содержащие аполипопротеин, полученные из семян растений. Масляные тела можно использовать в качестве очищенной фракции семян растений для дальнейшей очистки аполипопротеина. По существу, чистый аполипопротеин может быть выделен из семян с использованием множества дополнительных методов очистки, таких как способы, основанные на центрифугировании; методологии, основанные на исключении по размеру, включая, например, мембранное ультрафильтрование и ультрафильтрование в поперечном потоке; и методы хроматографии, включая,например, ионообменную хроматографию, хроматографию с исключением по размеру, аффинную хро- 20015167 матографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), быструю белковую жидкостную хроматографию (ББЖХ), хроматографию гидрофобного взаимодействия и т.п. Обычно, сочетание таких методов будет использоваться для получения, по существу, чистого аполипопротеина. Предпочтительная методология получения, по существу, чистого аполипопротеина в его природной форме из семян трансгенных растений подробно описана в примере 6 данного описания. Таким образом, настоящее изобретение также включает, по существу, чистый аполипопротеин, полученный из растения. Фармацевтические препараты аполипопротеина могут быть получены из очищенного аполипопротеина и такие препараты можно использовать для лечения сосудистых заболеваний. Обычно очищенный аполипопротеин будет смешиваться с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в количествах, достаточных для оказания на подвергаемого лечению пациента терапевтически полезного действия в отсутствие нежелательных побочных действий. Для получения композиции аполипопротеина взвешенную фракцию аполипопротеина растворяют, суспендируют, диспергируют или каким-либо другим образом смешивают с выбранным носителем или разбавителем в эффективной концентрации, таким образом, чтобы облегчать состояние при подвергаемом лечению заболевании. Фармацевтические препараты аполипопротеина предпочтительно получают для введения единичной дозы. Терапевтически эффективные дозы для парентеральной доставки аполипопротеина человека хорошо известны в данной области. Когда используются аналоги аполипопротеина или другие способы доставки, терапевтически эффективные дозы легко могут быть определены эмпирически специалистом в данной области с использованием известных протоколов тестирования или путем экстраполяции данных испытаний in vivo или invitro. Однако следует понимать, что концентрации и дозировки могут изменяться в соответствии с серьезностью состояния, подвергаемого лечению. Дополнительно следует понимать, для любого конкретного субъекта определенные режимы дозировки можно регулировать с течением времени в соответствии с индивидуальным суждением субъекта, которому вводится препарат или для которого проводится наблюдение за введением препарата. Фармацевтические растворы или суспензии могут включать, например, стерильный разбавитель,такой как, например, вода, лактоза, сахароза, дикальцийфосфат или карбоксиметилцеллюлоза. Носители,которые можно использовать, включают воду, физиологический раствор, водную декстрозу, глицерин,гликоли, этанол и т.п., образуя, таким образом, раствор или суспензию. При желании, фармацевтические композиции также могут содержать нетоксичные вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты; эмульгирующие агенты; солюбилизирующие агенты; антимикробные агенты, такие как бензиловый спирт и метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); рН буферные агенты, такие как ацетатный, цитратный или фосфатные буферы и их комбинации. Конечный состав препарата аполипопротеина обычно будет зависеть от способа доставки аполипопротеина. Аполипопротеин, полученный в соответствии с настоящим изобретением, может доставляться любым желаемым образом; однако парентеральные, пероральные и назальные формы доставки рассматриваются как наиболее вероятные. Парентеральные препараты могут быть заключены в ампулы, одноразовые цилиндры или однодозовые или многодозовые ампулы, изготовленные из стекла, пластика или других подходящих материалов. Примеры Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Пример 1. Конструкция A-I клонов аполипопротеина. Аро 10.Apo10 (SEQ ID NO: 144) представляет собой клон, разработанный для экспрессии специфическим для семян образом, который конструируют, как представлено на фиг. 3(А), 3(В) и 3(С). Как показано на фиг. 2, клон Аро 10 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 145) зрелого Аро AI и GFP. Для конструирования данного клона прямой праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') удалял сайтNcoI из стартовой области GFP (матрица, полученная из вектора pVS-GFP). Обратный праймер 1187PstI, XbaI и HindIII после стоп-кодона. Фрагмент ПЦР лигировали в EcoRI вектора клонирования Торо(5'-CCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') амплифицирует зрелую последовательность Аро AI и добавляет сайт NcoI в начало гена. Обратный праймер 1189 (SEQ ID NO: 149)(5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') удаляет стоп-кодон гена и добавляет сайт BamHI,чтобы способствовать созданию трансляционного слияния с GFP в рамке считывания (плазмида G1). Матрица для данных праймеров представляла собой вектор на основе pKS+ (Strategene), содержащий полную кодирующую последовательность гена Аро AI человека. Фрагмент ПЦР лигировали в сайт EcoRI вектора клонирования Торо (Invitrogen), создавая плазмиду М 2. Плазмиду М 2, содержавшую зрелую последовательность Аро AI, разрезали ферментами рестрикции NcoI и BamHI. Плазмида G'1 содержит последовательность, кодирующую GFP, и ее отрезали с помощью BamHI и XbaI (см. фиг. 3(В. Фрагменты- 21015167 М 2 и G'1 лигировали вместе в сайты NcoI и XbaI плазмиды SBS2090 (см. фиг. 3(В, для создания плазмиды 2 М 4. Плазмиду 2 М 4 отрезали с помощью NcoI и HindIII для удаления кассеты слияния Аро AIGFP и фрагменты впоследствии использовали для клонирования в сайты NcoI/HindIII бинарного вектораpSBS4006 (см. фиг. 3(С. Отметим, что плазмида содержит -фазеолиновый промотор/терминатор изApo11 (SEQ ID NO: 150) представляет собой клон, разработанный для экспрессии специфическим для семян образом, который конструируют, как представлено на фиг. 3(А), 3(В) и 3(С). Как показано на фиг. 2, клон Apo11 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 151) pro-Apo AI и GFP. Для конструирования данного клона прямой праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') удалял сайт NcoI из стартовой области GFP (матрица, полученная из вектора pVS-GFP). Обратный праймер 1187 (SEQ IDNO: 147) (5'-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3') добавлял сайты PstI, XbaI и HindIII после стоп-кодона. Фрагмент ПЦР лигировали в EcoRI вектора клонирования Торо (Invitrogen),создавая плазмиду G1 (фиг. 3(А. Прямой праймер 1191 (SEQ ID NO: 152)(5'-CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') амплифицирует пропоследовательность Аро AI и добавляет сайт NcoI в начало гена. Обратный праймер 1189 (SEQ ID NO: 149)(5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') удаляет стоп-кодон гена и добавляет сайт BamHI,чтобы способствовать созданию трансляционного слияния с GFP в рамке считывания (плазмида G1). Матрица для данных праймеров представляла собой вектор на основе pKS+ (Strategene), содержащий полную кодирующую последовательность гена Аро AI человека. Фрагменты ПЦР, каждый по отдельности, лигировали в сайт EcoRI вектора клонирования Торо (Invitrogen), создавая плазмиду Р 2. Плазмиду Р 2, содержавшую последовательность proApo AI, отрезали ферментами рестрикции NcoI и BamHI. Плазмида G'1 содержит последовательность, кодирующую GFP, и ее отрезали с помощью BamHI и XbaI(см. фиг. 3(В. Фрагменты Р 2 и G'1 лигировали вместе в сайты NcoI и XbaI плазмиды SBS2090 (см. фиг. 3(В, для создания плазмиды 2 Р 5. Плазмиду 2 Р 5 отрезали с помощью NcoI и HindIII для удаления кассеты слияния pro-Apo AI-GFP и фрагменты впоследствии использовали для клонирования в сайтыNcoI/HindIII бинарного вектора pSBS4006 (см. фиг. 3(С. Отметим, что данная плазмида содержит фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA,80: 1897-1901) и ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben etApo12 (SEQ ID NO: 153) представляет собой клон, разработанный для экспрессии специфическим для семян образом, который конструируют, как представлено на фиг. 3(А), 3(В) и 3(С). Как показано на фиг. 2, клон Аро 12 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 154) олеозина (van Rooijen, G.J., et al. Plant. Mol. Biol. 18(6), 1177-1179 (1992, зрелого Apo AI и GFP. Для конструирования данного клона прямой праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') удалял сайт NcoI из стартовой областиGFP (матрица, полученная из вектора pVS-GFP). Обратный праймер 1187 (SEQ ID NO: 147)(5'-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3') добавлял сайты PstI, XbaI и HindIII после стоп-кодона. Фрагмент ПЦР лигировали в EcoRI вектора клонирования Торо (Invitrogen), создавая плазмиду(5'-CCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') амплифицирует зрелую последовательность Apo AI и добавляет сайт NcoI в начало гена. Обратный праймер 1189 (SEQ ID NO: 149)(5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') удаляет стоп-кодон гена и добавляет сайт BamHI,чтобы способствовать созданию трансляционного слияния с GFP в рамке считывания (плазмида G1). Матрица для данных праймеров представляла собой вектор на основе pKS+ (Strategene), содержащий полную кодирующую последовательность гена Аро AI человека. Фрагмент ПЦР лигировали в сайт EcoRI вектора клонирования Торо (Invitrogen), создавая плазмиду М 2. Плазмиду М 2, содержавшую последовательность зрелого Аро AI, отрезали ферментами рестрикции NcoI и BamHI. Плазмида G'1 содержит последовательность, кодирующую GFP, и ее отрезали с помощью BamHI и XbaI (см. фиг. 3(В. Фрагменты М 2 и G'1 лигировали вместе в сайты NcoI и XbaI плазмиды SBS2090 (см. фиг. 3(В, для создания плазмиды 2 М 4. Плазмиду 2 М 4 отрезали с помощью NcoI и HindIII для удаления кассеты слияния Аро AIGFP и фрагменты впоследствии использовали для клонирования в сайты NcoI/HindIII бинарного вектораpSBS4008 (см. фиг. 3(С. Отметим, что плазмида содержит -фазеолиновый промотор/терминатор изPhaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901), контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G.J. et al., 1992, Plant. Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) для- 22015167 слияния со слитым белком Аро AI/GFP. Плазмида также содержит ген pat, придающий растениюхозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium.Apo13 (SEQ ID NO: 155) представляет собой клон, разработанный для экспрессии специфическим для семян образом, который конструируют, как представлено на фиг. 3(А), 3(В) и 3 (С). Как показано на фиг. 2, клон Аро 13 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 156) олеозина, pro-Apo AI и GFP. Для конструирования данного клона прямой праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') удалял сайт NcoI из стартовой области GFP (матрица, полученная из вектора pVS-GFP). Обратный праймер 1187PstI, XbaI и HindIII после стоп-кодона. Фрагмент ПЦР лигировали в EcoRI вектора клонирования Торо(5'-CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') амплифицирует пропоследовательность Аро AI и добавляет сайт NcoI в начало гена. Обратный праймер 1189 (SEQ ID NO: 149)(5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') удаляет стоп-кодон гена и добавляет сайт BamHI,чтобы способствовать созданию трансляционного слияния с GFP в рамке считывания (плазмида G1). Матрица для данных праймеров представляла собой вектор на основе pKS+ (Strategene), содержащий полную кодирующую последовательность гена Аро AI человека. Фрагменты ПЦР, каждый по отдельности, лигировали в сайт EcoRI вектора клонирования Торо (Invitrogen), создавая плазмиду Р 2. Плазмиду Р 2, содержавшую последовательность pro-Apo AI, отрезали ферментами рестрикции NcoI и BamHI. Плазмида G'1 содержит последовательность, кодирующую GFP, и ее отрезали с помощью BamHI и XbaI(см. фиг. 3(В. Фрагменты Р 2 и G'1 лигировали вместе в сайты NcoI и XbaI плазмиды SBS2090 (см. фиг. 3(В, для создания плазмиды 2 Р 5. Плазмиду 2 Р 5 отрезали с помощью NcoI и HindIII для удаления кассеты слияния pro-Apo AI-GFP и фрагменты впоследствии использовали для клонирования в сайтыNcoI/HindIII бинарного вектора pSBS4008 (см. фиг. 3(С. Отметим, что данная плазмида содержит фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA,80: 1897-1901), контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G.J. et al., 1992,Plant. Mol. Biol. 18(6), 1177-1179) для слияния со слитым белком Аро AI/GFP. Плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al.,1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium.Apo15 (SEQ ID NO: 157) представляет собой клон, разработанный для экспрессии специфическим для семян образом, который конструируют, как представлено на фиг. 3(А), 3(В) и 3(D). Как показано на фиг. 2, клон Аро 15 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 158) зрелого Аро AI и GFP. Слитый белок нацеливали для экспрессии по секреторному пути с использованием сигнального пептида последовательности, связанной с патогеном табака (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструирования данного клона прямой праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') удалял сайт NcoI из стартовой области GFP (матрица, полученная из вектора pVS-GFP). Обратный праймер 1187PstI, XbaI и HindIII после стоп-кодона. Фрагмент ПЦР лигировали в EcoRI вектора клонирования Торо(5'-CCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') амплифицирует зрелую последовательность Аро AI и добавляет сайт NcoI в начало гена. Обратный праймер 1189 (SEQ ID NO: 149)(5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') удаляет стоп-кодон гена и добавляет сайт BamHI,чтобы способствовать созданию трансляционного слияния с GFP в рамке считывания (плазмида G1). Матрица для данных праймеров представляла собой вектор на основе pKS+ (Strategene), содержащий полную кодирующую последовательность гена Аро AI человека. Фрагмент ПЦР лигировали в сайт EcoRI вектора клонирования Торо (Invitrogen), создавая плазмиду М 2. Плазмиду М 2, содержавшую зрелую последовательность Аро AI, отрезали ферментами рестрикции NcoI и BamHI. Плазмида G'1 содержит последовательность, кодирующую GFP, и ее отрезали с помощью BamHI и XbaI (см. фиг. 3(В. Фрагменты М 2 и G'1 лигировали вместе в сайты NcoI и XbaI плазмиды SBS2090 (см. фиг. 3(В для создания плазмиды 2 М 4. Плазмиду 2 М 4 отрезали с помощью NcoI и HindIII для удаления кассеты слияния Аро AIGFP и фрагменты впоследствии использовали для клонирования в сайты NcoI/HindIII бинарного вектораpSBS4011 (см. фиг. 3(D. Отметим, что плазмида содержит -фазеолиновый промотор/терминатор изPhaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901), слитый с сигнальным пептидом PRS. Плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промото- 23015167 ром/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Аро 16.Apo16 (SEQ ID NO: 159) представляет собой клон, разработанный для экспрессии специфическим для семян образом, который конструируют, как представлено на фиг. 3(А), 3(В) и 3(D). Как показано на фиг. 2, клон Аро 16 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 160) pro-Apo AI и GFP. Слитый белок нацеливали для экспрессии по секреторному пути с использованием сигнального пептида последовательности, связанной с патогеном табака (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструирования данного клона прямой праймер 1186 (SEQ ID NO: 146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') удалял сайт NcoI из стартовой области GFP (матрица, полученная из вектора pVS-GFP). Обратный праймер 1187 (SEQ IDNO: 147) (5'-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3') добавлял сайты PstI, XbaI и HindIII после стоп-кодона. Фрагмент ПЦР лигировали в EcoRI вектора клонирования Торо (Invitrogen),создавая плазмиду G1 (фиг. 3 А. Прямой праймер 1191 (SEQ ID NO: 152)(5'-CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') амплифицирует пропоследовательность Аро AI и добавляет сайт NcoI в начало гена. Обратный праймер 1189 (SEQ ID NO: 149)(5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') удаляет стоп-кодон гена и добавляет сайт BamHI,чтобы способствовать созданию трансляционного слияния с GFP (плазмида G1). Матрица для данных праймеров представляла собой вектор на основе pKS+ (Strategene), содержащий полную кодирующую последовательность гена Аро AI человека. Фрагменты ПЦР, каждый по отдельности, лигировали в сайтEcoRI вектора клонирования Торо (Invitrogen), создавая плазмиду Р 2. Плазмиду Р 2, содержавшую последовательность pro-Apo AI, отрезали ферментами рестрикции NcoI и BamHI. Плазмида G'1 содержит последовательность, кодирующую GFP, и ее отрезали с помощью BamHI и XbaI (см. фиг. 3(В. Фрагменты Р 2 и G'1 лигировали вместе в сайты NcoI и XbaI плазмиды SBS2090 (см. фиг. 3(В для создания плазмиды 2 Р 5. Плазмиду 2 Р 5 отрезали с помощью NcoI и HindIII для удаления кассеты слияния pro-Apo AI-GFP и фрагменты впоследствии использовали для клонирования в сайты NcoI/HindIII бинарного вектораpSBS4011 (см. фиг. 3(D. Отметим, что плазмида содержит -фазеолиновый промотор/терминатор изPhaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901), слитый с сигнальным пептидом PRS. Плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium.Apo17 (SEQ ID NO: 161) представляет собой клон, разработанный для экспрессии конститутивным образом, который конструируют, как представлено на фиг. 4(А). Как видно на фиг. 2, клон Аро 17 состоит из конститутивного промотора и терминатора (убиквитина), управляющего экспрессией слитого белка(SEQ ID NO: 162) Аро AI и GFP. Для конструирования данного клона плазмиду 2 М 4 (см. фиг. 3(В отрезали с помощью NcoI и HindIII для удаления кассеты слияния Аро AI-GFP и фрагменты лигировали в сайты NcoI и PstI плазмиды pKUO3' для создания плазмиды KU2M4. Плазмида pKUO3' содержит ген олеозина Brassica napus, который удаляют, когда вектор отрезают с помощью NcoI и PstI, приводя к образованию слитой конструкции Аро AI/GFP под контролем убиквитинового промотора и убиквитинового терминатора петрушки (Kawalleck, P. et al., 1993, Plant. Mol. Biol. 21: 673-684). Плазмиду KU2M4 отрезали с использованием KpnI и лигировали в сайт KpnI бинарного вектора SBS3000 (фиг. 4). Отметим,что плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину(Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Клон Аро 17 содержит трансляционный слитый белок зрелый Аро AI-GFP и направлен в цитозоль. Аро 18 а. Аро 18 а (SEQ ID NO: 163) представляет собой клон, разработанный для экспрессии конститутивным образом, который конструируют, как представлено на фиг. 4. Как видно на фиг. 2, клон Аро 18 а состоит из конститутивного промотора и терминатора (убиквитина), управляющего экспрессией слитого белка(SEQ ID NO: 164) pro-Apo AI и GFP. Для конструирования данного клона плазмиду 2 Р 5 (см. фиг. 3(В отрезали с помощью NcoI и PstI для удаления кассеты слияния pro-Apo AI-GFP и фрагменты лигировали в сайты NcoI и PstI плазмиды pKUO3' для создания плазмиды KU2P5. Плазмида pKUO3' содержит ген олеозина Brassica napus, который удаляют, когда вектор отрезают с помощью NcoI и PstI, приводя к образованию слитой конструкции pro-Apo AI/GFP под контролем убиквитинового промотора и убиквитинового терминатора петрушки (Kawalleck, P. et al., 1993, Plant. Mol. Biol. 21: 673-684). Плазмиду KU2P5 отрезали с использованием KpnI и лигировали в сайт KpnI бинарного вектора SBS3000 (фиг. 4). Отметим,что плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину(Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993; Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Клон Аро 18 а содержит трансляционный слитый белок pro-Apo AI-GFP и направлен в цитозоль.Apo18b (SEQ ID NO: 163) представляет собой клон, разработанный для экспрессии конститутивным образом, который конструируют, как представлено на фиг. 4(В). Как видно на фиг. 2, клон Аро 18b состоит из конститутивного промотора и терминатора (убиквитина), управляющего экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 164) pro-Apo AI и GFP. Отметим, что оба клона Аро 18 а и Аро 18b содержат конститутивный промотор (убиквитин), управляющий экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 164) pro-Apo AI иGFP. Разница между двумя клонами заключается в том, что Аро 18 а вставляют в сайт KpnI бинарного вектора pSBS3000 (который содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium). Напротив, Apo18b вставляют в сайт KpnI бинарного вектора pSBS5001, который содержит ген pmi (Miles et al., 1984, Gene, 21: 41-48), кодирующий фосфоманнозаизомеразу, которая дает возможность положительной селекции на содержащей маннозу среде для выборки. Ген pmi находится под контролем убиквитинового промотора/терминатора из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant.Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Для конструирования данного клона бинарный вектор Аро 18 а отрезали с помощью KpnI для удаления кассеты слияния pro-Apo AI-GFP и фрагменты лигировали в сайт KpnI плазмиды SBS5001 для экспрессии в Agrobacterium. Клон Аро 18b содержит трансляционный слитый белок pro-Apo AI-GFP и направлен в цитозоль. Аро 19. Аро 19 (SEQ ID NO: 165) представляет собой клон, разработанный для экспрессии конститутивным образом, который конструируют, как представлено на фиг. 5(А) и 5(В). Как видно на фиг. 2, клон Аро 19 состоит из конститутивного промотора и терминатора (убиквитина), управляющего экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 166) Аро AI и GFP. Слитый белок нацеливали для экспрессии по секреторному пути с использованием сигнального пептида последовательности, связанной с патогеном табака (PRS) (Sijmons etal., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструирования данного клона Аро 15 используют в качестве матрицы. Прямой праймер 1177 (SEQ ID NO: 167) (5'-GCAGCATTCATGAACTTCCTTAAGTCTTTCC-3') амплифицирует начало растительной предпоследовательности (PRS), которая содержит сайт BspHI в качестве стартового кодона. Обратный праймер 1178BamHI, способствующий созданию трансляционного слияния с GFP в рамке считывания. Дополнительные основания оставляют на концах обоих праймеров для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Плазмиду G1 (см. фиг. 3(А разлагают с помощью BamHI и PstI для лигирования в pubiP+iS3',который содержит убиквитиновый промотор и терминатор Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993,Plant. Mol. Bio., 21: 673-684). Фрагмент ПЦР PRS-Apo AI расщепляют с помощью BspHI и BamHI и лигируют вместе с фрагментом G1 в плазмиду pubiP+iS3', для образования плазмиды 19-6. Плазмиду 19-6 расщепляли с помощью EcoRI для удаления кассеты экспрессии и кассету затем лигировали в плазмиду(фиг. 5(В. Отметим, что данная плазмида содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Клон Аро 19 содержит соответственно зрелый трансляционный слитый белок Аро AI-GFP, направленный по секреторному пути. Аро 20. Аро 20 (SEQ ID NO: 169) представляет собой клон, разработанный для экспрессии конститутивным образом, который конструируют, как представлено на фиг. 5(А) и 5(В). Как видно на фиг. 2, клон Аро 20 состоит из конститутивного промотора и терминатора (убиквитина), управляющего экспрессией слитого белка (SEQ ID NO: 170) pro-Apo AI и GFP. Слитый белок нацеливали для экспрессии по секреторному пути с использованием сигнального пептида последовательности, связанной с патогеном табака (PRS)(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструирования данного клона Аро 16 используют в качестве матрицы. Прямой праймер 1177 (SEQ ID NO: 167)(5'-GCAGCATTCATGAACTTCCTTAAGTCTTTCC-3') амплифицирует начало растительной предпоследовательности (PRS), которая содержит сайт BspHI в качестве стартового кодона. Обратный праймер 1178 (SEQ ID NO: 168) (5'-GGTGGTGGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') удаляет стоп-кодон гена и добавляет сайт BamHI, способствующий созданию трансляционного слияния с GFP в рамке считывания. Дополнительные основания оставляют на концах обоих праймеров для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Плазмиду G1 (см. фиг. 3(А разлагают с помощью BamHI и PstI для лигирования в pubiP+iS3', который содержит убиквитиновый промотор и терминатор Petroselinum crispum(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684). Фрагмент ПЦР PRS-pro-Apo AI расщепляют с помощью BspHI и BamHI и лигируют вместе с фрагментом G1 в плазмиду pubiP+iS3' для образования плазмиды 20-11. Плазмиду 20-11 расщепляли с помощью EcoRI для удаления кассеты экспрессии и кассету затем лигировали в плазмиду pKUO3'K (фиг. 4(А между сайтами EcoRI (удаляя существующую кассе- 25015167 ту), создавая кассету KU20-11. KU20-11 расщепляли с помощью KpnI и фрагмент лигировали в сайтыKpnI плазмиды SBS3000 (фиг. 5(В. Отметим, что данная плазмида содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio.,21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Клон Аро 20 содержит соответственно трансляционный слитый белок pro-Apo AI-GFP, направленный по секреторному пути. Аро 21. Аро 21 (SEQ ID NO: 171) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 6. Как показано на фиг. 2, клон Аро 21 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией Аро AI (SEQ ID NO: 172). Для конструирования данного клона прямой праймер 1203 (SEQ ID NO: 173)HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержали дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Фрагмент ПЦР расщепляли с использованием NcoI и HindIII и лигировали в плазмиду SBS2090,создавая плазмиду 5-3 (фиг. 6). Плазмиду 5-3 расщепляли с использованием NcoI и HindIII и фрагмент Аро AI лигировали в сайты NcoI/HindIII SBS4006 (фиг. 3(С. SBS4006 содержит -фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901) и ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al.,1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Apo21 представляет собой клон с целью специфического для семян нацеливания Аро AI в цитозоль. Аро 22. Аро 22 (SEQ ID NO: 175) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 7. Как показано на фиг. 2, клон Аро 22 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией pro-Apo AI (SEQ ID NO: 176). Для конструирования данного клона прямой праймер 1201HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержали дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Фрагмент ПЦР расщепляли с использованием NcoI и HindIII и лигировали в плазмиду SBS2090al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Apo22 представляет собой клон с целью специфического для семян нацеливания pro-Apo AI в цитозоль. Аро 23. Аро 23 (SEQ ID NO: 178) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 6. Как показано на фиг. 2, клон Аро 23 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией олеозин/Аро AI (SEQ ID NO: 179). Для конструирования данного клона прямой праймер 1203 (SEQ ID NO: 173)HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержали дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Фрагмент ПЦР расщепляли с использованием NcoI и HindIII и лигировали в плазмиду SBS2090,создавая плазмиду 5-3 (фиг. 6). Плазмиду 5-3 расщепляли с использованием NcoI и HindIII и фрагмент Аро AI лигировали в сайты NcoI/HindIII SBS4008 (фиг. 3(С. SBS4008 содержит -фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901),контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant. Mol. Biol. 18(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Apo23 представляет собой клон с целью специфического для семян нацеливания олеозин/Аро AI в масляные тела.- 26015167 Аро 24. Аро 24 (SEQ ID NO: 180) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 7. Как показано на фиг. 2, клон Аро 24 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией олеозин/pro-Apo AI (SEQ ID NO: 181). Для конструирования данного клона прямой праймер 1201 (SEQ ID NO: 177)HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержали дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Фрагмент ПЦР расщепляли с использованием NcoI и HindIII и лигировали в плазмиду SBS2090,создавая плазмиду 4-2 (фиг. 7). Плазмиду 4-2 расщепляли с использованием NcoI и HindIII и фрагментpro-Apo AI лигировали в сайты NcoI/HindIII SBS4008 (фиг. 3(С. SBS4008 содержит -фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901),контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant. Mol. Biol. 18(6), 1177-1179), и ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohllebencrispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Apo24 представляет собой клон с целью специфического для семян нацеливания олеозин/pro-Apo AI в масляные тела. Аро 25. Аро 25 (SEQ ID NO: 182) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 6. Как показано на фиг. 2, клон Аро 25 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией олеозин/klip8/met/Аро AI (SEQ IDNO: 183). Данная конструкция содержит расщепляемую последовательность klip8 (SEQ ID NO: 143) для облегчения отщепления слитого белка с помощью химозина. Для конструирования данного клона прямой праймер 1203 (SEQ ID NO: 173) (5'-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') добавляет сайт NcoI в начало зрелого Аро AI. Обратный праймер 1206 (SEQ ID NO: 174)HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержали дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Фрагмент ПЦР расщепляли с использованием NcoI и HindIII и лигировали в плазмиду SBS2090(фиг. 3(В, создавая плазмиду 5-3 (фиг. 6). Плазмиду 5-3 расщепляли с использованием NcoI и HindIII и фрагмент Аро AI лигировали в сайты NcoI/HindIII SBS4010 (фиг. 7). SBS4010 содержит -фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901),контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant. Mol. Biol. 18(6), 1177-1179), и сайт расщепления klip8. Плазмида также содержит ген pat, придающий растениюхозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Apo25 представляет собой клон с целью специфического для семян нацеливания олеозин/klip8/met/Apo AI в масляные тела и очистки с использованием расщепляемой последовательности klip8. Аро 26. Аро 26 (SEQ ID NO: 184) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 7. Как показано на фиг. 2, клон Аро 26 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией олеозин/klip8/met/pro-Аро AI (SEQ IDNO: 185). Данная конструкция содержит расщепляемую последовательность klip8 (SEQ ID NO: 143) для облегчения отщепления слитого белка с помощью химозина. Для конструирования данного клона прямой праймер 1201 (SEQ ID NO: 177) (5'-GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') добавляет сайт NcoI в начало pro-Apo AI. Обратный праймер 1206 (SEQ ID NO: 174)HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержали дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Фрагмент ПЦР расщепляли с использованием NcoI и HindIII и лигировали в плазмиду SBS2090(фиг. 3(В, создавая плазмиду 4-2 (фиг. 7). Плазмиду 4-2 расщепляли с использованием NcoI и HindIII и фрагмент pro-met-Аро AI лигировали в сайты BspHI/HindIII SBS4010 (фиг. 7). SBS4010 содержит фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA,80: 1897-1901), контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G.J. et al. 1992,Plant. Mol. Biol. 18(6), 1177-1179), и сайт расщепления klip8. Плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant.Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Apo26 представляет собой клон с целью специфического для семян нацеливания олеозин/klip8/met/pro-Аро AI в масляные тела и очистки с использованием расщепляемой последовательности klip8. Аро 27. Аро 27 (SEQ ID NO: 186) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 8(А). Как показано на фиг. 2, клон Аро 27 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией олеозин/klip8/Аро AI (SEQ IDNO: 187). Аро 27 нацеливали для экспрессии в масляных телах с использованием последовательности олеозина Arabidopsis (van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant. Mol. Biol. 18(6), 1177-1179), и он имеет расщепляемую последовательность klip8 (SEQ ID NO: 143) для облегчения отщепления слитого белка с помощью химозина. Для конструирования данного клона прямой праймер 1200 (SEQ ID NO: 188)(5'-GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3') добавляет сайт XhoI и дополнительные нуклеотиды для облегчения клонирования в рамке считывания в расщепляемую последовательностьHindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Матрицей для данных праймеров была плазмида Аро 33, которая содержит проформу Аро AI без внутренних сайтовXhoI и дополнительного остатка Met. Фрагменты ПЦР отрезали с использованием XhoI и лигировали в сайты XhoI/EcoRV pKS+, создавая плазмиду 6-3. Плазмиду 6-3 отрезали с использованием XhoI и HindIII и лигировали в сайты XhoI/HindIII бинарного вектора SBS4010 (фиг. 7). Отметим, что SBS4010 содержитUSA, 80: 1897-1901), контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G.J. et al. 1992,Plant. Mol. Biol. 18(6), 1177-1.179), и сайт расщепления klip8. Плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988, Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum (Kawalleck et al., 1993, Plant.Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Apo27 представляет собой клон с целью специфического для семян нацеливания Аро AI в масляные тела и очистки с использованием расщепляемой последовательности klip8. Аро 27 М. Аро 27 М (SEQ ID NO: 189) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 8(В). Как показано на фиг. 2, клон Аро 27 М состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией олеозин/klip8/met/Аро AIМ (SEQ ID NO: 190). Данная конструкция содержит расщепляемую последовательность klip8 (SEQ IDNO: 143) для облегчения отщепления слитого белка с помощью химозина. Для конструирования данного клона прямой праймер 1202 (SEQ ID NO: 191)(5'-GCAGCACTCGAGcaagttcGATGAACCCCCCCAGAGCCC-3') добавляет сайт XhoI и дополнительные нуклеотиды для облегчения клонирования в рамке считывания и расщепляемую последовательность(5'-CGCCAGtGCTTGGCCGCGCGCCTTG-3') представляет собой тупоконечный праймер, который осуществляет мутацию пары оснований от С к Т для изменения остатка Arg на остаток Cys. Обратный праймер 1206 (SEQ ID NO: 174)HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержат дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Матрицей для данных праймеров была плазмида Р-10, которая уже содержала мутированные сайты XhoI. Двухнитевую матрицу удаляли расщеплением с использованием DpnI. Фрагмент ПЦР отрезали с использованием XhoI и HindIII и лигировали в сайты XhoI/HindIII плазмиды pKS+, создавая плазмиду АроМ. АроМ расщепляли с помощью XhoI и HindIII и фрагмент лигировали в сайты XhoI/HindIII плазмиды SBS4010 (фиг. 7). SBS4010 содержит -фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901), контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant. Mol. Biol. 18(6), 1177-1179), и сайт расщепленияklip8. Плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицинуAgrobacterium. Apo27M представляет собой клон с целью специфического для семян нацеливания олеозин/klip8/met/Аро AI-M в масляные тела и очистки с использованием расщепляемой последовательностиklip8. Аро 28. Аро 28 (SEQ ID NO: 193) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 9. Как показано на фиг. 2, клон Аро 28 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией олеозин/klip8/pro-Аро AI (SEQ ID NO:- 28015167 194). Для конструирования данного клона прямой праймер 1200 (SEQ ID NO: 188)(5'-GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3') добавляет сайт XhoI и дополнительные нуклеотиды для облегчения клонирования в рамке считывания в расщепляемую последовательность(5'-CCAAGCCCGCGCTaGAGGACCTCCG-3') представляет собой тупоконечный праймер, который добавляет молчащую мутацию для удаления первого сайта XhoI. Обратный праймер 1206 (SEQ ID NO: 174)HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержат дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Матрица для данных праймеров представляла собой вектор на основе pKS+ (Stratagene), содержащий полную кодирующую последовательность гена Аро AI человека. Двухнитевую матрицу удаляли расщеплением с использованием DpnI. Фрагмент ПЦР отрезали с использованием XhoI и HindIII и лигировали в сайты XhoI/HindIII плазмиды pKS+, создавая плазмиду Р-10. Р-10 расщепляли с помощью XhoI и HindIII и фрагмент лигировали в сайты XhoI/HindIII плазмиды SBS4010 (фиг. 7). Отметим, чтоSBS4010 содержит -фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983,Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901), контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (vanRooijen G. J. et al. 1992, Plant. Mol. Biol. 18(6), 1177-1179), и сайт расщепления klip8. Плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988,Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Apo28 представляет собой клон pro-Apo AI, направленный в масляные тела и способный отщепляться по последовательности klip8. Аро 29. Аро 29 (SEQ ID NO: 196) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 6. Как показано на фиг. 2, клон Аро 29 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией PRS-Apo AI (SEQ ID NO: 197). Apo29 нацеливали для экспрессии по секреторному пути с использованием сигнального пептида последовательности, связанной с патогеном табака (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструирования данного клона прямой праймер 1203 (SEQ ID NO: 173)HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержали дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Фрагмент ПЦР расщепляли с использованием NcoI и HindIII и лигировали в плазмиду SBS2090,создавая плазмиду 5-3 (фиг. 6). Плазмиду 5-3 расщепляли с использованием NcoI и HindIII и фрагмент Аро AI лигировали в сайты NcoI/HindIII SBS4011 (фиг. 3D). SBS4011 содержит -фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901), контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant. Mol. Biol. 18(6),1177-1179), и сигнальный пептид PRS (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Плазмида также содержит ген pat, придающий растению-хозяину устойчивость к фосфинотрицину (Wohlleben et al., 1988,Gene, 70: 25-37), управляемый убиквитиновым промотором/терминатором из Petroselinum crispum(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) для трансформации в Agrobacterium. Apo29 представляет собой клон с целью специфического для семян нацеливания Аро AI по секреторному пути. Аро 30. Аро 30 (SEQ ID NO: 198) представляет собой предпочтительный для семян клон, который конструируют, как показано на фиг. 7. Как показано на фиг. 2, клон Аро 30 состоит из специфического для семян промотора и терминатора (фазеолина), управляющего экспрессией PRS-pro-Apo AI (SEQ ID NO: 199).pro-Apo AI был направлен для экспрессии по секреторному пути с использованием сигнального пептида последовательности, связанной с патогеном табака (PRS) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Для конструирования данного клона прямой праймер 1201 (SEQ ID NO: 177)HindIII после стоп-кодона и добавляет молчащую мутацию для удаления второго сайта XhoI. Оба праймера содержали дополнительные основания на концах 5' для облегчения расщепления ферментами рестрикции. Фрагмент ПЦР расщепляли с использованием NcoI и HindIII и лигировали в плазмиду SBS2090,создавая плазмиду 4-2 (фиг. 7). Плазмиду 4-2 расщепляли с использованием NcoI и HindIII и фрагмент Аро AI лигировали в сайты NcoI/HindIII pSBS4011 (фиг. 3D). SBS4011 содержит -фазеолиновый промотор/терминатор из Phaseolus vulgaris (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80: 1897-1901), контролирующий экспрессию гена олеозина Arabidopsis (van Rooijen G. J. et al. 1992, Plant. Mol. Biol. 18(6),- 29
МПК / Метки
МПК: C12P 21/02, A61P 3/06, A01H 5/10, C12N 15/12, A61K 38/17, C12N 15/82, A01H 5/00, C07K 14/775
Метки: аполипопротеина, растения, экспрессии, аполипопротеин, обеспечения, способ, семена, содержащие, растениях
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-15167-sposob-obespecheniya-ekspressii-apolipoproteina-v-rasteniyah-i-rasteniya-i-ih-semena-soderzhashhie-apolipoprotein.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ обеспечения экспрессии аполипопротеина в растениях и растения и их семена, содержащие аполипопротеин</a>
Способ экспрессии инсулина в семенах растения, способ получения семян растений, содержащих инсулин, и растения, способные производить семена, содержащие инсулин
Номер патента: 14887
Опубликовано: 28.02.2011
Авторы: Ван Роэйен Гейс, Молони Морис М., Кеон Ричард, Найкифорук Кори, Бут Джозеф
МПК: C12N 15/82, A01H 5/00, C07K 14/62...
Метки: инсулина, производить, семена, инсулин, способ, растений, получения, способные, содержащие, экспрессии, семенах, семян, растения, содержащих
Формула / Реферат:
1. Способ экспрессии инсулина в семенах растения, включающий:(a) получение конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в виде функционально связанных компонентов:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит предпочтительный для семян промотор; и(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина;(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку...
Рекомбинантная двухцепочная последовательность днк для экспрессии сахарозофосфорилазы в растении, способ получения трансгенного растения с повышенной экспрессией сахарозофосфорилазы в различных частяхрастения и линия трансформированных клеток растения
Номер патента: 634
Опубликовано: 29.12.1999
Авторы: Девирд Ян Виллем, Бэрри Джерард Фрэнсис, Кишор Джениш Мерти, Велдон Марсиа Ли
МПК: C12N 15/82
Метки: экспрессией, двухцепочная, повышенной, получения, рекомбинантная, растения, клеток, частяхрастения, растении, линия, последовательность, экспрессии, днк, сахарозофосфорилазы, различных, способ, трансформированных, трансгенного
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантная двухцепочечная последовательность ДНК для экспрессии сахарозофосфорилазы в растении, содержащая следующие конструктивные элементы: - промотор, активный в определенных клетках растений; - ген, кодирующий фермент сахарозофосфорилазу Streptococcus mutans, имеющий следующую последовательность нуклеотидов: (SEQ ID NO:5); и 3` - нетранслируемую область, обеспечивающую терминацию транскрипции гена сахарозофосфорилазы и...
Очищенная ксантозин-n7-метилтрансфераза из растения кофе, кодирующие ее нуклеиновые кислоты, трансгенные клетки растения кофе, трансгенные растения кофе и кофейные зерна, не содержащие кофеина, и способы уменьшения синтеза кофеина в клетках растения кофе
Номер патента: 3835
Опубликовано: 30.10.2003
Авторы: Стайлис Джон И., Неупане Каби Радж, Моисиади Истефо
Метки: синтеза, кофеина, способы, клетках, кофе, уменьшения, трансгенные, кислоты, клетки, кофейные, кодирующие, очищенная, растения, зерна, ксантозин-n7-метилтрансфераза, нуклеиновые, содержащие
Формула / Реферат:
1. Очищенная ксантозин-N7-метилтрансфераза из растения кофе Coffea arabica с выведенной аминокислотной последовательностью содержащая триптические фрагменты, имеющие аминокислотные последовательности (i) Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gln - Gly, или (ii) Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gln Thr, или (iii) Gln Tyr Val Pro Cys Tyr Phe (Thr/Asp) Phe Ile Asp (Asp) (Gln) Asp. 2. Выделенная последовательность кДНК,...
Специфические для семян льна промоторы, способы их применения, трансгенные семена и растения льна
Номер патента: 6549
Опубликовано: 24.02.2006
Авторы: Ван Роэйен Гейс, Сингх Суриндер, Чаудхари Сарита, Молони Морис М.
МПК: A01H 5/10, C12N 15/29, A01H 5/00...
Метки: льна, трансгенные, способы, семян, применения, растения, семена, промоторы, специфические
Формула / Реферат:
1. Способ обеспечения экспрессии представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в семенах льна, включающий: (a) получение химерной конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'® 3'-направлении транскрипции в виде функционально связанных компонентов: (1) семяспецифический промотор, полученный из льна; и (2) указанную представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, причем указанная представляющая интерес...
Линия клеток растения сахарной свеклы и растение сахарной свеклы, устойчивые к имидазолиноновому гербициду, семена указанного растения, способы получения указанной клеточной линии и гибридных растенийсвеклы, устойчивых к данному гербициду, и применение указанного гербицида для борьбы с сорняками, растущими на полях с указанными растениями сахарной свеклы
Номер патента: 3296
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Райт Терри Р., Пеннер Доналд
Метки: имидазолиноновому, способы, растения, сорняками, гербициду, растенийсвеклы, растущими, клеточной, растениями, указанными, указанной, гербицида, свеклы, растение, семена, линии, получения, устойчивых, полях, устойчивые, клеток, сахарной, указанного, данному, гибридных, борьбы, применение, линия
Формула / Реферат:
1. Линия клеток растения сахарной свеклы с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 337 гуанин замещен на аденин, устойчивая к имидазолиноновому гербициду, способная регенерировать в растение сахарной свеклы, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге регенерированных растений с растениями, чувствительными к данному гербициду. 2. Линия клеток по п.1, которая получена из чувствительных клеток...