Сосудистое растение с повышенной толерантностью к na + и способ его получения

(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ОСТРЭЙЛИАН СЕНТР ФОР ПЛАНТ ФАНКШЕНЛ ДЖЕНОМИКС ПТИ ЛТД. 014986 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к сосудистым растениям и клеткам, полученным из сосудистых растений, экспрессирующим АТФазу, перекачивающую Na+. Настоящее изобретение также относится к способам повышения секреции Na+ и толерантности кNa у сосудистых растений и клеток, полученных из сосудистых растений, посредством экспрессии перекачивающей Na+ АТФазы в растениях или клетках. Уровень техники Высокие концентрации солей в почвах являются причиной большого снижения урожая широкого множества культур во всем мире. Почти 1000 млн гектаров земли поражено засолением почв, что составляет 7% всей площади суши. Из 1,5 млрд гектаров, которые возделывают в настоящее время, примерно 5% (77 млн га) испорчены солью. Проблема засоленности почв, вероятно, только ухудшится, принимая во внимание, что современные способы ведения сельского хозяйства способствуют засолению водных источников. Растворы хлорида натрия создают как ионный, так и осмотический стрессы для растений. Указанные стрессы могут быть отмечены на нескольких уровнях. В частности, Na+-специфичное повреждение связано с накоплением Na+ в тканях листа и приводит к некрозу более старых листьев, начиная с кончиков и краев и продолжаясь к противоположному концу листа. Снижение роста и урожая происходит вследствие сокращения времени жизни отдельных листьев и, таким образом, снижения чистой продуктивности и урожайности. В побегах высокие концентрации Na+ могут вызывать ряд проблем для растения как осмотических,так и метаболических. Листья более уязвимы к Na+, чем корни, просто потому, что Na+ накапливается в побегах в более высоких концентрациях, чем в корнях. В корнях наблюдается тенденция поддержания довольно постоянных уровней Na+ в течение времени, и корни могут регулировать уровни Na+ за счет экспорта в почву или в побег.Na+ транспортируется в побеги в быстро передвигающемся транспирационном токе по ксилеме и может возвращаться в корни только по флоэме. Имеются ограниченные данные о рециркуляции Na+ побегов в корни, что свидетельствует о том, что транспорт Na+ в основном является однонаправленным и приводит к прогрессирующему накоплению Na+ по мере старения листьев. Можно использовать ряд различных механизмов для повышения толерантности к солености. Каждый из процессов - внутриклеточная компартментализация Na+ в клетках, распределение Na+ внутри растения и удаление Na+ из целого растения, могут повысить толерантность к солености. Такие процессы обеспечивают адаптацию к Na+ на двух уровнях организации: процессы, которые придают толерантность клеткам как таковым, и процессы, которые вносят вклад в толерантность растения в целом. Компартментализация Na+ в вакуолях является одним из примеров того, как можно повысить толерантность клеток к Na+. Однако, хотя клетки с повышенной толерантностью к Na+ могут быть отобраныin vitro, уже длительное время не могут создать жизнеспособные растения, толерантные к Na+, из таких толерантных клеток. Как можно понять из предшествующего обсуждения, существует необходимость выявить новые способы повышения толерантности растений к Na+ и получить растения с повышенной толерантностью кNa+. Настоящее изобретение относится к сосудистым растениям и клеткам, полученным из сосудистых растений, которые экспрессируют АТФазу, перекачивающую Na+. Настоящее изобретение также относится к способам повышения секреции Na+ и толерантности к Na+ у сосудистых растений и клеток, полученных из сосудистых растений, посредством экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в растениях или клетках. На протяжении настоящего описания могут быть приведены ссылки на документы в целях описания различных аспектов данного изобретения. Однако не делается допущения, что какой-либо ссылочный материал, цитированный в данном описании, составляет предшествующий уровень техники. В частности, будет понятно, ссылка на любой документ в данном описании не является допущением того, что какой-либо из указанных документов составляет часть общеизвестного уровня техники в данной области в какой-либо стране. В обсуждении ссылок сообщается о том, что их авторы утверждают и заявитель сохраняет за собой право оспаривать точность и пертинентность любого из документов, цитированных в данном описании. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к сосудистому растению, содержащему клетки, экспрессирующие АТФазу, перекачивающую Na+. Настоящее изобретение также относится к клетке, полученной из сосудистого растения, экспрессирующей АТФазу, перекачивающую Na+. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу повышения секреции Na+ из клетки сосудистого растения, включающему стадию экспрессии в клетке АТФазы, перекачивающей Na+. Настоящее изобретение также относится к клетке сосудистого растения, обладающей повышенной секрецией Na+ вследствие экспрессии в клетке АТФазы, перекачивающей Na+. Настоящее изобретение также относится к сосудистому растению, содержащему клетки с повы-1 014986 шенной секрецией Na+, при этом повышенная секреция Na+ из клеток является следствием экспрессии в клетках АТФазы, перекачивающей Na+. Настоящее изобретение также относится к способу повышения толерантности клетки сосудистого растения к Na+, включающему стадию экспрессии в клетке АТФазы, перекачивающей Na+. Настоящее изобретение также относится к клетке сосудистого растения, имеющей повышенную толерантность к Na+ вследствие экспрессии в клетке АТФазы, перекачивающей Na+. Настоящее изобретение также относится к способу повышения толерантности сосудистого растения к Na+, включающему стадию экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в клетках растения. Настоящее изобретение также относится к сосудистому растению с повышенной толерантностью кNa+, при этом повышенная толерантность к Na+ является следствием экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в клетках растения. Настоящее изобретение является результатом выявления того, что управление перемещением Na+ в растении с помощью экспрессии экзогенных переносчиков Na+, вероятно, является более эффективным способом повышения толерантности растений к Na+, чем управление эндогенными переносчиками Na+. Настоящее изобретение основано на выделении нуклеиновых кислот, которые кодируют АТФазу, перекачивающую ионы Na+, из эукариот, не относящихся к животным, таких как мох, Physcomitrella patens и дрожжи Saccharomyces cerevisiae, и введении таких нуклеиновых кислот в сосудистые растения, которые,по-видимому, не кодируют АТФазу, перекачивающую ионы Na+. Предполагается, что экспрессия в таких растениях АТФазы, перекачивающей Na+, приведет к повышенной секреции Na+ из их клеток и что растения будут проявлять повышенную толерантность к Na+. Различные термины, которые будут использованы на протяжении описания, имеют значения, которые будут хорошо понятны специалисту, которому они адресованы. Однако для простоты некоторым из таких терминов будут даны определения. Следует понимать, что термин "растение", который использован на протяжении описания, включает целые растения, части растений, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена и потомство любого из указанных выше. Следует понимать, что термин "сосудистое растение", который использован на протяжении описания, означает любое растение, которое имеет специализированную проводящую систему, обычно состоящую из флоэмы (ткани, проводящей питательные вещества) и ксилемы (ткани, проводящей воду). Следует понимать, что термин "толерантность" или его варианты, которые использованы на протяжении описания по отношению к растениям и растительным клеткам, означает способность растения или растительной клетки проявлять улучшенный ответ на увеличение внеклеточной и/или внутриклеточной концентрации Na+, по сравнению со сходным растением или клеткой, не экспрессирующими АТФазу,перекачивающую Na+. Растение с повышенной толерантностью к Na+ может, например, проявлять повышенную скорость роста или пониженный уровень некроза в листьях в том случае, когда подвергается воздействию повышенной концентрации Na+, по сравнению со сходным растением. Следует понимать, что термин "нуклеиновая кислота", который использован на протяжении описания, означает любой олигонуклеотид или полинуклеотид. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК и может быть однонитевой или двунитевой. Нуклеиновая кислота может представлять собой любой тип нуклеиновой кислоты, включая, например, нуклеиновую кислоту геномного происхождения, происходящую из кДНК (т.е. полученную на основе мРНК), или синтетического происхождения. В связи с этим термин "полинуклеотид", в общем, относится к полирибонуклеотидам и полидезоксирибонуклеотидам и может означать немодифицированную РНК или ДНК, модифицированную РНК или ДНК или любые другие модификации оснований, сахарного или фосфатного остова, которые функционально эквивалентны последовательности нуклеотидов. Термин "аминокислотная последовательность" относится к последовательности олигопептида, пептида, полипептида или белка и их фрагментов или частей и к встречающимся в природе рекомбинантным, мутантным или синтетическим полипептидам. Следует понимать, что термин "амплификация" или его варианты, которые использованы на протяжении описания, означают получение дополнительных копий последовательности нуклеиновой кислоты. Например, амплификация может быть осуществлена с использованием методики полимеразной цепной реакции (ПЦР), по существу, как описано в Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S. (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview N.Y. Следует понимать, что термин "гибридизация" или его варианты, которые использованы на протяжении описания, означают любой процесс, при котором нить нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной нитью посредством спаривания оснований. Гибридизация может происходить в растворе или между одной последовательностью нуклеиновой кислоты, присутствующей в растворе, и другой последовательностью нуклеиновой кислоты, иммобилизованной на твердой подложке (например, мембранах, фильтрах, чипах и т.д.). В этой связи жесткими условиями для выявления комплементарных нуклеиновых кислот являются условия, которые позволяют комплементарным нуклеиновым кислотам связываться друг с другом в диапазоне от температуры, равной или близкой Tm (Tm означает температуру плавления), до примерно 20C ниже Tm. Необходимо учитывать все факторы, такие как длина компле-2 014986 ментарных областей, тип и состав нуклеиновых кислот (ДНК, РНК, состав оснований) и концентрация солей и других компонентов (например, присутствие или отсутствие формамида, декстрансульфата и/или полиэтиленгликоля), по существу, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley andSons, N.Y. (1989). Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана карта плазмиды pTOOL2; на фиг. 2 - карта плазмиды pAJ21; на фиг. 3 - карта плазмиды pGreenII0229UAS+Nos5A; на фиг. 4 - карта плазмиды pDP1; на фиг. 5 - карта плазмиды pPG1; на фиг. 6 - карта плазмиды pJIT145-Kan; на фиг. 7 - карта плазмиды T-Easy 35S-Hyg; на фиг. 8 - карта плазмиды pAJ40; на фиг. 9 показана карта плазмиды pAJ41; на фиг. 10 показано, что Gal-индуцированная транскрипция PpENA1 спасает фенотип чувствительности к соли мутанта B31; чувствительные к соли дрожжи B31 трансформировали PpENA1 под контролем Gal-промотора и высевали на чашки, содержащие 300 мМ NaCl. B31 (MAT а ade2 ura3 leu2 his3 trp1ena1HIS3ena4 nha1LEU2, трансформированный pYES-ENA) выращивали в SC-ura в течение ночи; делали 5 серийных разведений 1 к 2 и 1 мкл каждого разведения наносили в виде пятна либо наSC-ura + 0,3 М NaCl + глюкоза, либо на SC-ura + 0,3 М NaCl + галактоза; на фиг. 11 - результаты подтверждения с помощью ПЦР нарушение PpENA1 в геномной ДНК из резистентных к канамицину трансформантов Physcomitrella patens; ПЦР-проверку 5'-конца осуществляли,используя oCL148-oCL76 для первой ПЦР и oCL149-oCL100 для второй ПЦР; ПЦР-проверку 3'-конца осуществляли, используя PpENA1R-oCL77 для первой ПЦР и oCL101-PpENA1R для второй; ожидаемый размер фрагмента в случае, если инсерция происходила, составлял 1429 и 1835 п.н.; на фиг. 12 - уровни мРНК PpENA1, которые определяли с помощью кПЦР для трех нокаутированных по PpENA1 мутантов мха и для мха дикого типа; на фиг. 13 - концентрации натрия и калия у мха дикого типа и мутантного мха, которые определяли пламенной фотометрией; черточки указывают стандартное отклонение; на фиг. 14 показано, что нокаутированные по PpENA1 мутанты имеют пониженную биомассу по сравнению с диким типом через 1 неделю в средах, содержащих 100 или 200 мМ NaCl; на фиг. 15 - графическое представление диаметра колоний для дикого типа и нокаутированных поPpENA1 мутантов через 1 неделю в средах, содержащих 100 или 200 мМ NaCl; на фиг. 16 - уровни мРНК PpENA1 у трансгенных растений Arabidopsis T1, конститутивно экспрессирующих PpENA1; на фиг. 17 - уровни мРНК PpENA1 у трансгенных растений Arabidopsis T1, индуцированные после воздействия 30 мМ NaCl; на фиг. 18 - уровни мРНК PpENA1 у трансгенных растений Arabidopsis T1, индуцированные после воздействия 30 мМ NaCl; промотор VHAc3 Arabidopsis дает низкий уровень экспрессии мРНК PpENA1 при 30 мМ NaCl; на фиг. 19 показано, что трансгенные растения Arabidopsis T3, конститутивно экспрессирующиеPpENA1, могут иметь преимущества роста при 100 мМ NaCl по сравнению с диким типом; на фиг. 20 - экспрессия PpENA1 у риса; на фиг. 21 - резистентные к гигромицину растения ячменя, трансформированные pAJ54 и pAJ55 в культуре ткани; на фиг. 22 - вестерн-анализ трансгенных растений Arabidopsis T2 и обработанного солью мха с использованием в качестве зонда PpENA1-антитела. Общее описание изобретения Как описано выше, в одной форме настоящее изобретение относится к сосудистому растению, содержащему клетки, экспрессирующие АТФазу, перекачивающую Na+. Указанная форма настоящего изобретения относится к сосудистому растению, в котором несколько или все клетки растения экспрессируют АТФазу, перекачивающую Na+. АТФазы, перекачивающие ионыNa+, представляют собой класс связанных с мембранами белков, которые активно выкачивают ионы Na+ из клеток и которые, вероятно, не существуют в сосудистых или цветущих растениях. Они относятся к суперсемейству запускаемых АТФ насосов P-типа и, в частности, к отдельной филогенетической группе,АТФазам типа HD. Сосудистое растение согласно данной форме настоящего изобретения может представлять собой растение, в котором все клетки растения экспрессируют АТФазу, перекачивающую Na+. Альтернативно,сосудистое растение согласно настоящему изобретению также может представлять собой растение, в котором только подгруппа клеток, которые составляют растение, экспрессирует АТФазу, перекачивающую Na+. Примеры сосудистых растений, подходящих для настоящего изобретения, включают люцерну,-3 014986 миндаль, яблоню, абрикос, арабидопсис, артишок, лебеду Atriplex, авокадо, ячмень, свеклу, березу, Brassica, капусту, какао, канолу, канталупу, гвоздику, маниоку, клещевину, цветную капусту, сельдерей, клевер, кофе, маис, хлопок, огурцы, чеснок, виноград, грейпфрут, коноплю, хмель, салат-латук, люпины,клен, люцерну, дыню, горчицу, дуб, овес, оливу, лук, апельсин, горох, персик, грушу, перец, сосну, сливу, тополь, картофель, чернослив, редис, рапс, рис, розу, рожь, сорго, сою, шпинат, тыкву, землянику,подсолнечник, сахарную кукурузу, табак, томат и пшеницу. Сосудистое растение может быть двудольным растением или однодольным растением. Предпочтительно сосудистое растение является однодольным растением. Наиболее предпочтительно однодольное растение является зерновым растением, таким как пшеница, ячмень, рожь, кукуруза, рис и кормовые травы, такие как райграс. АТФаза, перекачивающая Na+, экспрессируется в клетках сосудистого растения с подходящей нуклеотидной последовательностью, действующей при экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, введенной в клетки. Соответственно, в другой форме настоящее изобретение относится к клетке из сосудистого растения, при этом клетка содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую АТФазу, перекачивающую Na+. В другой форме настоящее изобретение относится к сосудистому растению, содержащему клетки, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую АТФазу, перекачивающуюNa+. Способы трансформации нуклеиновых кислот в растительные клетки известны в данной области. Например, можно использовать трансформацию, опосредованную Agrobacterium tumefaciens, или трансформацию, опосредованную бомбардировкой частицами, чтобы трансформировать растения, в зависимости от вида растения. Подходящий способ трансформации растений посредством Agrobacterium описан в Clough S.J. and Bent A.F. (1998) Plant Journal, 165: 735-743. Подходящий способ трансформации с использованием бомбардировки частицами описан в Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., 85(12): 43054309. АТФаза, перекачивающая Na+, согласно настоящему изобретению может быть получена из подходящего организма, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую АТФазу, перекачивающую Na+, такого как мох или дрожжи. Другие организмы, имеющие ген, кодирующий АТФазу, перекачивающую Na+, включают Lieshmania donovani, Neurospora crassa, Schizosaccharomyces pombe, Zygosaccharomyces rouxi и Saccharomycesoccidentalis, Fusarium oxysporum, Dunaliella maritima и Tetraselmis viridis. В случае АТФазы мха, перекачивающей Na+, предпочтительно АТФазу, перекачивающую Na+, получают из рода Physcomitrella. Наиболее предпочтительно АТФазу, перекачивающую Na+, получают изpatens, описана в GenBank с No. доступа AJ564254 и обозначена SEQ ID NO. 1. Аминокислотная последовательность АТФазы ENA1 обозначена SEQ ID NO. 2. Ген ENA2, вероятно, продуцирует три альтернативных мРНК (ENA2A, ENA2B и ENA2C) вследствие альтернативного сплайсинга на 3'-конце. Нуклеотидная последовательность, кодирующая ген ENA2,описана в GenBank с No. доступа AJ564259 и обозначена SEQ ID NO. 3. Нуклеотидная последовательность, соответствующая мРНК варианта 2A сплайсинга ENA2 Physcomitrella patens, описана в GenBank с No. доступа AJ564259 и обозначена SEQ ID NO. 4. Аминокислотная последовательность белка, кодируемая вариантом сплайсинга ENA2A, обозначена SEQ ID NO. 5. Нуклеотидная последовательность, соответствующая гену ENA2B, описана в GenBank с No. доступа AJ564260 и обозначена SEQ ID NO. 6. Нуклеотидная последовательность, соответствующая мРНК варианта 2B сплайсинга ENA2 Physcomitrella patens, описана в GenBank с No. доступа AJ564260 и обозначена SEQ ID NO. 7. Аминокислотная последовательность белка, кодируемого вариантом ENA2B, обозначена SEQ ID NO. 8. Нуклеотидная последовательность, соответствующая гену ENA2C, описана в GenBank с No. доступа AJ564261 и обозначена SEQ ID NO. 9. Нуклеотидная последовательность, соответствующая мРНК варианта 2C сплайсинга ENA2, описана в GenBank с No. доступа AJ564261 и обозначена SEQ ID NO. 10. Аминокислотная последовательность белка, кодируемого вариантом сплайсинга ENA2C, обозначенаNa , получают из рода Saccharomyces. Наиболее предпочтительно АТФазу, перекачивающую Na+, получают из Saccharomyces cerevisiae. В этом отношении Saccharomyces cerevisiae, вероятно, кодирует три АТФазы, перекачивающие Na+,ENA1, ENA2 и ENA5. Нуклеотидная последовательность, соответствующая гену ENA1 Saccharomycescerevisiae, описана в GenBank с номером доступа Z74336. Нуклеотидная последовательность, соответствующая мРНК, описана в GenBank с номером доступа Z74336 и обозначена SEQ ID NO. 12. Аминокислотная последовательность АТФазы ENA1 обозначена SEQ ID NO. 13.-4 014986 Нуклеотидная последовательность, соответствующая гену ENA2 Saccharomyces cerevisiae, описана в GenBank с номером доступа Z74335. Нуклеотидная последовательность, соответствующая мРНК, также описана в GenBank с номером доступа Z74335 и обозначена SEQ ID NO. 14. Аминокислотная последовательность АТФазы ENA2 обозначена SEQ ID NO. 15. Нуклеотидная последовательность, соответствующая гену ENA5 Saccharomyces cerevisiae, описана в GenBank с номером доступа Z74334. Нуклеотидная последовательность, соответствующая мРНК, также описана в GenBank с номером доступа Z74334 и обозначена SEQ ID NO. 16. Аминокислотная последовательность АТФазы ENA2 обозначена SEQ ID NO. 17. В случае АТФаз, перекачивающих Na+, из других видов нуклеотидную последовательность, кодирующую АТФазу, перекачивающую Na+, можно идентифицировать способом, известным в данной области. Например, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием праймеров, которые будут амплифицировать нуклеотидные последовательности, кодирующие АТФазу, перекачивающую Na+,можно использовать для выделении генов, которые кодируют АТФазы P-типа типа II. Подходящий способ описан в Benito et al. (2000) Mol. Micro., 35(5): 1079-1088. Альтернативно, гибридизацию колоний геномной библиотеки с использованием нуклеотидных последовательностей, которые выявляют АТФазу, перекачивающую Na+, можно использовать для выделения кДНК или генов, которые кодируют АТФазы P-типа типа II. Подходящий способ осуществления гибридизации колоний описан в Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: A LaboratoryManual 2nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989). В данном случае использования методики гибридизации для идентификации нуклеотидной последовательности, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+, следует отметить, что абсолютная комплементарность не требуется, хотя и является предпочтительной, при условии, что регистрируемый меченый зонд способен гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой-мишенью. Как будет понятно, способность гибридизоваться будет зависеть как от степени комплементарности, так и от длины зонда. Известные в данной области способы могут быть использованы для разработки возможных зондов и для получения и мечения зондов. Способы, широко распространенные для получения и мечения зондов, описаны в Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989). Альтернативный способ идентификации нуклеотидной последовательности, кодирующей АТФазу,перекачивающую Na+, заключается в идентификации нуклеотидной последовательности, которая проявляет значительное сходство последовательности или гомологию с известными АТФазами, перекачивающими Na+. В этой связи существуют различные алгоритмы для определения степени гомологии между любыми двумя белками или любыми двумя нуклеотидными последовательностями. Например, можно использовать алгоритм BLAST для определения существования гомологии между двумя нуклеотидными последовательностями (blastn) или степени гомологии между двумя аминокислотными последовательностями(blastp). С помощью BLAST идентифицируют локальные выравнивания между последовательностями в базе данных и прогнозируют вероятность случайно возникающего локального выравнивания. АлгоритмBLAST описан в Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая АТФазы, перекачивающие Na+,имеет более чем 90% сходство с ENA1 Physcomitrella patents. Более предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая АТФазы, перекачивающие Na+, имеет более чем 95% сходство с ENA1Physcomitrella patents. Затем кДНК или гены могут быть выделены и клонированы способами, известными в данной области, такими как способы, описанные в Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: ALaboratory Manual 2nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989). После выделения и клонирования выбранных для исследования кДНК или генов способность нуклеотидных последовательностей экспрессировать функциональную АТФазу, перекачивающую Na+,можно подтвердить подходящим способом, известным в данной области. Например, способность нуклеотидной последовательности экспрессировать функциональную АТФазу, перекачивающую Na+, можно подтвердить по способности белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью, снижать концентрацию Na+ в подходящей клетке. Определение внутриклеточной концентрации Na+ можно осуществить способом, известным в данной области, таким как определение внутриклеточных концентраций Na+ пламенной фотометрией, как описано в Essah et al. (2003) PlantPhysiology, 133: 307-318. Альтернативно, можно определить способность нуклеотидной последовательности супрессировать дефект, приводящий к Na+-чувствительности, у нуль-мутанта по АТФазе, перекачивающей Na+, у Saccharomyces cerevisiae, как описано, например, в Benito et al. (2000) Mol. Microbiol., 35: 1079-1088. Сходным образом можно определить способность нуклеотидной последовательности супрессировать чувствительность к Na+ у мха Physcomitrella patents, содержащего неактивные гены ENA1 и/или ENA2. Альтернативно, АТФазу, перекачивающую Na+, в различных формах согласно настоящему изобретению можно получить на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей не встречающуюся в-5 014986 природе АТФазу, перекачивающую Na+, такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая синтетическую АТФазу, перекачивающую Na+, химерную АТФазу, перекачивающую Na+, или АТФазу, перекачивающую Na+, которая представляет собой вариант встречающейся в природе АТФазы, перекачивающей Na+. Примеры вариантов включают модификации нуклеотидной последовательности с изменением использования кодонов, варианты, которые кодируют биологически активный фрагмент встречающейся в природе АТФазы, перекачивающей Na+, или варианты, которые делетируют, заменяют или добавляют одну или несколько аминокислот к кодирующей области встречающейся в природе АТФазы, перекачивающей Na+. Изменение использования кодонов в нуклеотидной последовательности, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+, можно использовать для улучшения экспрессии гена в сосудистом растении. Например, для экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в злаковом растении использование кодонов в кодирующей последовательности гена-предшественника или кДНК можно изменить так, чтобы ближе отразить предпочтительное использование кодонов у злаковых. В качестве примера сравнение использования кодонов у Physcomitrella patens и различных злаковых показано в примере 8 в табл. 2. В данном случае предпочтительно использование кодонов для аминокислот цистеина, фенилаланина, глицина, серина и треонина модифицируют так, чтобы ближе отразить использование кодонов, в общем, у злаковых или у конкретного представляющего интерес злакового растения. В качестве другого примера для экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, у двудольного растения использование кодонов в кодирующей последовательности гена-предшественника или кДНК можно изменить так, чтобы ближе отразить использование кодонов у двудольных. Сравнение использования кодонов у Physcomitrella patens и различных двудольных растений показано в примере 8 в табл. 3. В данном случае предпочтительно использование кодонов для аминокислот аспарагиновой кислоты, аргинина и валина модифицируют так, чтобы ближе отразить использование кодонов у двудольных. Биологически активным фрагментом встречающейся в природе АТФазы, перекачивающей Na+, является полипептид, имеющий структурные, регуляторные или биохимические функции, сходные с функциями полноразмерного белка. Биологически активные фрагменты могут представлять собой делеции на аминоконце или карбоксильном конце белка или полипептида, внутреннюю делецию белка или полипептида или любую комбинацию таких делеций. Биологически активный фрагмент также будет включать любые такие делеции, слитые с одной или несколькими дополнительными аминокислотами. Например, биологически активный фрагмент гена PpENA1 представляет собой делецию 255 аминокислот на аминоконце белка или укорочение по меньшей мере на 187 аминокислот на карбоксильном конце белка. Соответственно, в другой форме настоящее изобретение относится к сосудистому растению, содержащему клетки, экспрессирующие перекачивающую Na+ АТФазу, Physcomitrella patens, при этом АТФаза, перекачивающая Na+, представляет собой делецию 255 аминокислот на аминоконце или делецию 187 аминокислот на карбоксильном конце белка ENA1. В еще одной форме настоящее изобретение относится к клетке сосудистого растения, при этом клетка экспрессирует перекачивающую Na+ АТФазуPhyscomitrella patens, и АТФаза, перекачивающая Na+, представляет собой делецию 255 аминокислот на аминоконце или делецию 187 аминокислот на карбоксильном конце белка ENA1. В случае варианта, который является модификацией с заменой одной или нескольких аминокислот,вариант может иметь "консервативные" изменения, когда замененная аминокислота имеет структурные или химические свойства, схожие со свойствами замененной аминокислоты (например, замена лейцина изолейцином). Альтернативно, вариант также может иметь "неконсервативные" изменения (например,замену глицина триптофаном) или делецию и/или инсерцию одной или нескольких аминокислот. В том случае, когда вариант представляет собой химерную перекачивающую Na+ АТФазу, нуклеотидная последовательность, кодирующая химеру, может быть получена из разных АТФаз, перекачивающих Na+, конкретного вида или может быть получена из АТФаз, перекачивающих Na+, разных видов. Вариант также может представлять собой вариант сплайсинга встречающегося в природе гена. Например, вариантом сплайсинга может быть встречающийся в природе вариант сплайсинга или вариант,сконструированный для экспрессии альтернативно сплайсируемой формы мРНК, кодирующей АТФазу,перекачивающую Na+. Как будет понятно, для того чтобы добиться экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в клетках растения, нуклеотидная последовательность, кодирующая АТФазу, перекачивающую Na+, будет функционально связана с подходящим промотором. Предпочтительно уровень экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в клетках приводит к повышенной секреции Na+ из клеток и/или повышенной толерантности к Na+ по сравнению с клетками, не экспрессирующими АТФазу, перекачивающую Na+. Например, промотор может быть эндогенным промотором по отношению к представляющему интерес растению, промотором из другого растения, промотором, обычно связанным с нуклеотидной последовательностью, кодирующей перекачивающую Na+ АТФазу в организме, из которого АТФаза, перекачивающая Na+, выделена (при условии, что промотор является достаточно активным в представляю-6 014986 щем интерес сосудистом растении) промотором из другого организма, который является активным в представляющем интерес сосудистом растении (таким как промотор плазмиды Ti), вирусным промотором, активным в представляющем интерес сосудистом растении, химерным промотором или синтетическим промотором. Кроме того, промотор может представлять собой конститутивный промотор, индуцируемый промотор или специфичный для клеток промотор. Примеры конститутивных промоторов включают промотор 35S вируса мозаики цветной капусты,промотор нопалинсинтазы, промотор убиквитина, промотор актина и промотор вируса PS4. Примеры индуцируемых промоторов включают индуцируемые Na+ промоторы (т.е. подвергаемые активации в ответ на солевой стресс), такие как PIP2.2, промоторы PpENA1 и VHA-c3, индуцируемые засухой промоторы, такие как Bnuc, Dhn8, Rd17, индуцируемые тепловым шоком промоторы, такие какhsp1, индуцируемые ионами металлов промоторы, такие как промотор металлотионеина, или промоторы,активные в растениях, которые подвергаются репрессии бактериальными или плазмидными системами оператор/репрессоры, такие как системы Gal4, lacO/lacI или tetO/tetR, или другие индуцируемые промоторы, такие как промотор alcR, промотор дексаметазона (dex) и промоторы NHA1 и NHA(D). В случае индуцируемого промотора предпочтительным промотором является промотор PIP2.2 или промотор VHA-c3, вариант любого из указанных промоторов или другой промотор, включая элементы ДНК, ответственные за способность указанных промоторов к индукции. Примеры специфичных для клеток промоторов зависят от конкретного типа клеток, в котором желательна экспрессия АТФазы, перекачивающей Na+. Например, предпочтительно АТФаза, перекачивающая Na+, экспрессируется в зрелых клетках эпидермиса корня, стимулируя удаление из корня (и таким образом из растения). Однако также следует понимать, что экспрессия АТФазы, перекачивающейNa+, в некоторых клетках может быть вредной для растения в целом. Например, экспрессия АТФазы,перекачивающей Na+, в клетках стелы, где вытеснение из клеток могло бы увеличить загрузку в сосуды ксилемы и таким образом увеличить доставку в стебель, вероятно, является приносящим вред процессом. Другие типы клеток, в которых может быть желательной экспрессия АТФазы, перекачивающей Na+,включают зрелые трихомы коры корня, листа, стебля и гидатоды. Для управления экспрессией в специфичных типах клеток, в которых отсутствует хорошо охарактеризованный промотор, можно использовать линии энхансерных ловушек, экспрессирующие слитый белок дрожжевого фактора транскрипции, GAL4:VP16 (который визуализируют по экспрессии GFP,управляемой расположенной выше последовательностью активации GAL4), как описано в Johnson et al.(2005) Plant J. 41(5): 779-89. Предпочтительно АТФаза, перекачивающая Na+, экспрессируется в клетках коры и эпидермиса корня растения. В связи с этим экспрессия АТФазы, перекачивающей Na+, в клетках корня растения может быть достигнута с применением подходящего конститутивного промотора, индуцируемого промотора или промотора, специфичного для коры корня. Также могут быть осуществлены различные модификации в нуклеотидной последовательности, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+, чтобы регулировать ее экспрессию. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты для экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, также может содержать другие подходящие элементы для регуляции транскрипции, стабильности мРНК или трансляции, известные в данной области. Например, стабильность мРНК, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+, также можно регулировать посредством модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей мРНК, например введением в мРНК элемента, который стабилизирует мРНК в ответ на повышенную концентрацию Na+. Также могут быть модифицированы скорости трансляции. Например, сигналы, обеспечивающие эффективную трансляцию, могут быть введены в нуклеотидную последовательность, кодирующую АТФазу, перекачивающую Na+. Кроме того, в некоторых случаях может быть предпочтительным введение одной или нескольких интронных последовательностей в нуклеотидную последовательность, кодирующую АТФазу, перекачивающую Na+, так чтобы интрон вырезался при сплайсинге из зрелой мРНК в представляющем интерес сосудистом растении. Такая конструкция особенно применима, принимая во внимание трудность клонирования АТФаз, перекачивающих Na+, в бактериях. Присутствие интронной последовательности дает генный продукт в бактериях, который является нефункциональным, что обеспечивает возможность клонирования и манипуляций с нуклеотидной последовательностью. Затем интрон удаляется при экспрессии нуклеотидной последовательности в сосудистом растении. Примером подходящей интронной последовательности является небольшой первый интрон WRKY33 Arabidopsis. Настоящее изобретение также относится к изолированным нуклеиновым кислотам, которые описаны выше. Соответственно, в одной форме настоящее изобретение относится к изолированной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую АТФазу, перекачивающую Na+,при этом нуклеотидная последовательность сконструирована для улучшения экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в сосудистом растении.-7 014986 Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут быть получены подходящим способом, известным в данной области. Способы получения нуклеиновых кислот описаны в Sambrook J.,Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory-Manual 2nd. ed. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York (1989). В случае более коротких нуклеиновых кислот, таких как олигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты также могут быть синтезированы посредством химического синтеза с использованием способа, известного в данной области. Более крупные нуклеотидные последовательности также могут быть получены отжигом и лигированием нескольких олигонуклеотидов. В случае нуклеиновых кислот, кодирующих АТФазу, перекачивающую Na+, нуклеиновая кислота может быть получена, например, клонированием кДНК, клонированием геномной ДНК, синтезом ДНК,способом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или комбинацией указанных способов. Векторы для введения нуклеиновых кислот в клетки также известны в данной области. Тип выбранного вектора зависит от конкретной стадии в общем процессе конструирования конечной нуклеиновой кислоты для введения в клетку растения. Векторы могут быть сконструированы способами на основе рекомбинантной ДНК, известными в данной области. Типы векторов включают космиды, плазмиды, бактериофаги, бакуловирусы и вирусы. Затем вектор может быть введен в конкретного хозяина способом трансформации, известным в данной области и приемлемым для хозяина. Способы введения экзогенных ДНК в клетки описаны вSambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989). Например, векторы и способы, подходящие для трансформации бактерий или для трансформации растений, известны в данной области. Соответственно, настоящее изобретение также относится к клетке, содержащей любую из описанных выше нуклеиновых кислот. Примеры клеток включают клетки грибов, клетки дрожжей, бактериальные клетки (например, E. coli, Agrobacterium) или клетки растений. После конструирования подходящей нуклеиновой кислоты для экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в сосудистом растении нуклеотидную последовательность, кодирующую АТФазу, перекачивающую Na+, необходимо ввести в подходящую растительную клетку. Например, можно использовать опосредованную Agrobacterium tumefaciens или опосредованную бомбардировкой частицами трансформацию, чтобы трансформировать растительные клетки в зависимости от вида растения. Соответственно, настоящее изобретение также относится к клетке сосудистого растения, экспрессирующей АТФазу, перекачивающую Na+. Кроме того, настоящее изобретение также относится к клетке сосудистого растения, трансформированной нуклеотидной последовательностью, кодирующей АТФазу,перекачивающую Na+. Растения, которые можно трансформировать Agrobacterium tumefaciens, включают арабидопсис,ячмень, картофель, томат, капусту, хлопок, кукурузу, подсолнечник, землянику, шпинат, салат-латук,пшеницу и рис. Растения, которые можно трансформировать с помощью систем доставки на основе биолистических частиц (бомбардировки частицами), включают сою, кукурузу, пшеницу, рожь, ячмень, лебеду Atriplex и солерос. Способы и реагенты для получения зрелого растения из клеток также известны в данной области,например способы, описанные в Kumria et al. (2001) Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 67: 63-71 иPrzetakiewicz et al. (2003) Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 73: 245-256. Как указано ранее, растение согласно данной форме настоящего изобретения может представлять собой растение, в котором все клетки в растении экспрессируют АТФазу, перекачивающую Na+, или,альтернативно, растение, в котором только группа клеток экспрессирует АТФазу, перекачивающую Na+. Поэтому будет понятно, что в одной форме сосудистое растение является трансгенным растением, в котором все клетки растения трансформированы нуклеотидной последовательностью, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+. В данном случае запуск экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, с конститутивного промотора будет приводить к транскрипции АТФазы, перекачивающей Na+, по существу, во всех типах клеток в растении. Однако запуск экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, со специфичного для типа клеток промотора будет приводить только к транскрипции нуклеотидной последовательности, кодирующей АТФазу,перекачивающую Na+, в тех тканях, в которых активен специфичный для типа клеток промотор. Запуск экспрессии с индуцируемого промотора, такого как индуцируемый ионами Na+ промотор, будет приводить к индукции транскрипции в ответ на индуцирующий агент/обработку. Однако следует также понимать, что сосудистое растение согласно настоящему изобретению также может быть химерным растением, в котором только подгруппа клеток, которые составляют растение,трансформирована нуклеотидной последовательностью, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+. Подобно тому, как описано выше, нуклеотидная последовательность может быть экспрессирована с конститутивного промотора, специфичного для типа клеток промотора или индуцируемого промотора. Способы создания химерных растений известны в данной области.-8 014986 Предпочтительно растительная клетка, экспрессирующая АТФазу, перекачивающую Na+, будет иметь повышенную секрецию Na+ по сравнению со сходной клеткой, которая не экспрессирует АТФазу,перекачивающую Na+. Таким образом, предпочтительно уровень экспрессии АТФазы, перекачивающейNa+, в клетке приводит к повышенной секреции Na+ из клетки по сравнению со сходной клеткой, не экспрессирующей АТФазу, перекачивающую Na+. Способы определения способности клеток секретироватьNa+ известны в данной области и включают измерение притока и оттока 22Na+ или измерение внутриклеточных уровней Na+ с использованием пламенной фотометрии. Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу увеличения секреции Na+ из клетки сосудистого растения, включающему стадию экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в клетке. Настоящее изобретение также относится к клетке растения, полученной способом согласно данной форме настоящего изобретения. Соответственно, настоящее изобретение также относится к клетке сосудистого растения, имеющей повышенную секрецию Na+ вследствие экспрессии в клетке АТФазы, перекачивающей Na+. Настоящее изобретение также относится к растению (или части растения), содержащему одну или несколько клеток, полученных способом согласно данной форме настоящего изобретения. Кроме того,настоящее изобретение также относится к растению или части растения, полученной размножением клеток растения. Как описано выше, растения могут быть регенерированы из клеток, трансформированных нуклеотидной последовательностью, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+, с получением при этом растения с клетками, имеющими повышенную секрецию Na+. Соответственно, в другой форме настоящее изобретение относится к сосудистому растению, содержащему клетки с повышенной секрецией Na+, и повышенная секреция Na+ является следствием экспрессии в клетках АТФазы, перекачивающей Na+. Предпочтительно растительная клетка, экспрессирующая АТФазу, перекачивающую Na+, будет иметь повышенную толерантность к Na+. Таким образом, предпочтительно уровень экспрессии АТФазы,перекачивающей Na+, в клетке приводит к клетке, имеющей повышенную толерантность к Na+, по сравнению со сходной клеткой, не экспрессирующей АТФазу, перекачивающую Na+. В этом отношении в данной области известно множество способов определения толерантности клетки растения к Na+, таких как оценка скоростей роста растения и способности растения поддерживать низкие концентрации Na+ в побегах. Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу повышения толерантности кNa+ клетки сосудистого растения, включающему стадию экспрессии в клетке АТФазы, перекачивающейNa+. Настоящее изобретение также относится к клетке растения, полученной согласно данному способу. Соответственно, в другой форме настоящее изобретение относится к клетке сосудистого растения,имеющей повышенную толерантность к Na+ вследствие экспрессии в клетке АТФазы, перекачивающейNa+. Настоящее изобретение также относится к растению (или части растения), содержащему одну или несколько клеток, полученных способом согласно данной форме настоящего изобретения. Кроме того,настоящее изобретение также относится к растению или части растения, полученной в результате размножения клеток растения. Как описано выше, растения могут быть регенерированы из клеток, трансформированных нуклеотидной последовательностью, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+, с получением таким образом растения с повышенной толерантностью к Na+. Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу повышения толерантности кNa+ сосудистого растения, включающему стадию экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в клетках растения. В этой связи предпочтительно способ согласно данной форме настоящего изобретения включает клонирование или синтез молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+,встраивание молекулы нуклеиновой кислоты в вектор, так чтобы молекула нуклеиновой кислоты была функционально связана с промотором; встраивание вектора в клетку растения или семя растения и регенерацию растения из клетки растения или семени растения. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения сосудистого растения с повышенной толерантностью к Na+, включающему стадию трансформации клетки из сосудистого растения нуклеиновой кислотой, кодирующей АТФазу, перекачивающую Na+, и получения растения из клетки растения. Способы регенерации растения из растительных клеток известны в данной области. Сосудистые растения, экспрессирующие АТФазу, перекачивающую Na+, также могут быть скрещены с другими линиями с желательными характеристиками. Например, растения, экспрессирующие АТФазу, перекачивающую Na+, могут быть скрещены с растениями, которые уже имеют повышенную толерантность к Na+. Альтернативно, сосудистые растения, экспрессирующие АТФазу, перекачивающуюNa+, могут быть скрещены с растениями, которые не являются толерантными к Na+, и может быть проведен отбор растений, которые являются толерантными к Na+.-9 014986 Также будет понятно, что если растения, экспрессирующие АТФазу, перекачивающую Na+, являются самоопыляющимися, то может быть идентифицировано гомозиготное потомство из семян указанных растений. Растения, выращенные из таких семян, могут проявлять дополнительно повышенную толерантность к Na+ по сравнению с родительской линией. Настоящее изобретение также относится к растению, полученному способом согласно данной форме настоящего изобретения. Соответственно, в другой форме настоящее изобретение относится к сосудистому растению с повышенной толерантностью к Na+, и при этом повышенная толерантность к Na+ является следствием экспрессии АТФазы, перекачивающей Na+, в клетках растения. Настоящее изобретение также относится к растению, клетке растения или части растения, полученным от таких растений. Настоящее изобретение также относится к набору для трансформации клетки из сосудистого растения АТФазой, перекачивающей Na+, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую АТФазу, перекачивающую Na+. Предпочтительно набор дополнительно содержит реагенты и/или инструкции для трансформации клеток растения. Как описано выше, набор можно использовать для получения растений или частей растений из трансформированных клеток. Кроме того, набор можно использовать для получения растительных клеток и растений, содержащих клетки с повышенной секрецией Na+. Набор также можно использовать для получения клеток и растений с повышенной толерантностью к Na+. Наконец, приведена ссылка на стандартные руководства по молекулярной биологии, в которых описаны способы осуществления основных методик, включенных в настоящее изобретение. См., например, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New YorkYork (1989) and Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York (1995). Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения В данном разделе приведена ссылка на эксперименты, в которых реализованы описанные выше общие принципы согласно настоящему изобретению. Однако следует понимать, что следующее описание не должно ограничивать применимость приведенного выше описания. Пример 1. Клонирование кДНК ENA1, ENA2 Physcomitrella patens и ENA1 Saccharomyces cerevisiae. Полноразмерные кДНК ENA1 и ScENA1 в клонирующих векторах pCR 2.1-TOPO (Invitrogen) иpJQ10, соответственно, могут быть клонированы, как описано в Benito В. и Rodriguez-Navarro А. (2003),The Plant Journal, 36: 382-389 и Benito et al. (1997) Biochimica et Biophysica Acta., 1328(2): 214-26. кДНК получали от Alonso Rodriguez-Navarro. Нуклеотидная последовательность кДНК ENA1 Physcomitrella patens представлена в GenBank с No. доступа AJ564254 и обозначена SEQ ID NO. 1. кДНК кодирует 967 аминокислот АТФазы, перекачивающей Na+, обозначенных SEQ ID NO. 2. Нуклеотидная последовательность кДНК ENA1 Saccharomyces cerevisiae представлена в GenBank сNo. доступа AJ564254 и обозначена SEQ ID NO. 12. кДНК кодирует 1091 аминокислоту АТФазы, перекачивающей Na+, обозначенные SEQ ID NO. 13. Коротко, кДНК, представляющие собой полные открытые рамки считывания генов PpENA1,PpENA2 и ScENA1, могут быть получены обратной транскрипцией (ОТ)-ПЦР-амплификацией. Суммарная РНК, экстрагированная из Physcomitrella patens и Saccharomyces cerevisiae, растущих на средах, содержащих соль, может быть копирована в кДНК и использована в качестве матрицы для ПЦР со специфичными для гена праймерами. Перекрывающиеся фрагменты кДНК из ОТ-ПЦР могут быть объединены, действуя в качестве матрицы для амплификации полноразмерной кДНК. Затем кДНК могут быть клонированы в коммерчески доступном клонирующем векторе, таком как pCR2.1-TOPO (Invitrogen) илиpGEM T-Easy (Promega). Альтернативно, фрагменты рестрикции перекрывающихся кДНК могут быть лигированы вместе в совместимых сайтах, чтобы создать полноразмерную кДНК. Подходящими являются следующие праймеры: ПЦР осуществляли в объемах реакции 25 мкл, используя 500 нг геномной ДНК в качестве матрицы или 100 пг кДНК. Смесь ферментов элонгаз и буфер (Invitrogen) использовали с 200 мкМ каждого dNTP и 400 нМ праймера. Стадию предварительной амплификации при 94C в течение 30 с проводили перед 35 циклами при 94C в течение 30 с, при 55C в течение 30 с, при 68C в течение 3,5 мин.- 10014986 Пример 2. Создание мутанта P. patens, у которого отсутствует PpENA1 и/или PpENA2. Фрагмент рестрикции PpENA1 или PpENA2 может быть перенесен из клонированной ДНК в подходящий вектор, например pGEM-T Easy (Promega). Кассета для нокаута затем может быть создана встраиванием селектируемого маркера, например гена, который придает резистентность к канамицину,гигромицину или basta, в середину полноразмерного гена, кодирующего PpENA1 или PpENA2. Кассета состоит из последовательности, гомологичной либо PpENA1, либо PpENA2, выше или ниже селектируемого маркера. Резистентность к G-418 получают, используя ген nptll после 35S-промотора из плазмидыpJIT145-Kan (фиг. 6). Резистентность к гигромицину получают, используя ген Hyg после 35S-промотора из плазмиды T-Easy 35S-Hyg (фиг. 7). Затем может быть создан мутантный мох посредством трансформации. Протопласты создают обработкой ткани протонемы ферментами, которые удаляют клеточную стенку. Протопласт трансформируют(вводят кассету для нокаута), используя способ, основанный на тепловом шоке и ПЭГ (Schaefer и Zryd(1997) Plant Journal, 11 (6): 1195-1206). Трансформанты могут быть отобраны высеванием протопластов на селективные среды (Schaefer and Zryd, 1997). Таким образом могут быть созданы мутанты, у которых отсутствует либо PpENA1, либо PpENA2, либо и то и другое. Пример 3. Создание мутанта P. patens, сверхэкспрессирующего PpENA1 и/или PpENA2. Полноразмерный клон PpENA2 может быть получен посредством конструирования праймеров,специфичных для 5'- и 3'-конца геномной последовательности, и осуществления ПЦР с использованием кДНК в качестве матрицы. Подходящим сверхэкспрессирующим вектором является вектор pTOOL2, который показан на фиг. 1. Затем конструкция может быть использована для трансформации мха (как описано выше), и могут быть отобраны мутанты, сверхэкспрессирующие PpENA1, PpENA2 (или оба) (как описано выше). Пример 4. Изменения толерантности к соли.P. patens дикого типа и мутантные P. patens, в которых отсутствуют или сверхэкспрессируютсяPpENA1, PpENA2 или оба гена, могут быть выращены на средах, содержащих разные уровни Na+, чтобы тестировать различия в толерантности к Na+, как описано в Benito and Rodriguez-Navarro (2003) The PlantJournal, 36: 382-389. Мох можно анализировать в отношении различий видимых фенотипов, например скорости роста, способности к дифференцировке и образованию гаметофитов, и в отношении уровней некроза. Также можно определить внутриклеточный уровень Na+, используя пламенную фотометрию,как описано в Essah et al., 2003, Plant Physiology, 133, 307-318. Пример 5. Анализ промотора PpENA1 и PpENA2. Последовательность нативного промотора PpENA1 и PpENA2 можно определить с помощью "геномной прогулки", как описано в Siebert et al. (1995) Nucleic Acids Research, 23: 1087-1088, и проанализировать с использованием подходящих средств поиска, таких как SignalScan, в отношении присутствия известных регуляторных элементов (Higo K., Ugawa Y., Iwamoto M. и Korenaga T. (1999) Nucleic AcidsResearch, 27(1): 297-300). Регуляцию in planta также можно определить, осуществляя количественную ПЦР и вестернблоттинг на ткани из мха дикого типа или мутантного мха (описанного выше), на которые воздействовали различными концентрациями Na+. Количественную ПЦР можно осуществить, как описано в Jacobs etSpring Harbor Laboratory Press, 1989. Уровень белка можно определить, используя поликлональные или моноклональные антитела, направленные против уникальных частей PpENA1 и PpENA2, как описано в примере 13. Пример 6. Функциональный анализ PpENA1 и PpENA2. На основании информации о структуре могут быть созданы укороченные варианты PpENA1 иPpENA2, чтобы изменить эффективность и/или регуляцию активности Na+-АТФазы. Например, первые 255 аминокислотных остатков аминоконца могут быть удалены из белка PpENA1 посредством амплификации и последующей экспрессии укороченной кДНК. Альтернативно, белок PpENA1 может быть укорочен на COOH-конце удалением последних 187 аминокислотных остатков. Праймеры, подходящие для применения в ПЦР для указанной цели, представляют собой следующие праймеры: Указанные праймеры могут быть использованы вместе с праймерами, перечисленными в примере 1,для создания укороченных кДНК PpENA1. Подходящими условиями ПЦР являются условия, которые описаны в примере 1, при этом цикл модифицирован уменьшением времени элонгации с 3,5 до 2,5 мин. Функциональность укороченных вариантов можно тестировать посредством трансформации мутантного мха, в котором отсутствуют PpENA1, PpENA2 (или оба), и анализа изменений в эффективности удаления Na+ и толерантности к Na+, как описано выше.- 11014986 Пример 7. Модификация кДНК PpENA и ScENA. Было обнаружено, что клонирование мембранных переносчиков облегчается при выращивании бактерий, несущих плазмиды с генами переносчиков, при более низких температурах (30C или ниже) в течение более длительных периодов времени (2 суток или более) и селекции в отношении колоний, которые имеют меньший размер и появляются на чашках позже. В том случае, когда было доказано, что кДНК ENA являются токсичными для бактериальных клеток, используемых для молекулярных обработок, в кодирующую область кДНК ENA посредством ПЦР вводили последовательность интрона растений из Arabidopsis. Вне растений это приводит к транскрипции нефункциональной Na+-АТФазы с модифицированной третичной структурой. Это значительно повышает эффективность конструирования векторов для последующих генетических манипуляций. Для этой цели использовали небольшой первый интрон WRKY33 Arabidopsis (286 п.о.), при этом последовательность ДНК (обозначенная SEQ ID NO. 40) представляла собой следующую последовательность: Первый интрон WRKY33 может быть амплифицирован в ПЦР с использованием следующих олигонуклеотидов: ПЦР осуществляли в объемах реакции 25 мкл с использованием 50 пг плазмидной ДНК в качестве матрицы. Смесь ферментов элонгаз и буфер (Invitrogen) использовали с 200 мкМ каждого dNTP и 400 нМ праймеров. Стадию предварительной амплификации при 94C в течение 30 с проводили перед 35 циклами при 94C в течение 30 с, при 55C в течение 30 с, при 68C в течение 20 с. Интрон встраивали в последовательность ENA, используя серию стадий ПЦР. Сначала последовательность PpENA1 амплифицировали в виде двух фрагментов с соединением, располагающимся так,чтобы правила сплайсинга интрона могли выполняться в случае встраивания интрона WRKY. ИнтронWRKY амплифицировали, используя набор олигонуклеотидов с перекрываниями 20 п.о. на 5'-концах,которые соответствовали последовательности кДНК PpENA1 в точке соединения. Очищенные продукты ПЦР затем объединяли и осуществляли ПЦР в отсутствии олигонуклеотидов. Продукт ПЦР WRKY гибридизовался с двумя последовательностями PpENA1 с помощью комплементарной последовательности на обоих концах и действовал в качестве праймера для удлинения ДНК полимеразой. Олигонуклеотиды,сконструированные для амплификации полной последовательности PpENA1, вводили в ПЦР после 5 циклов и таким образом получали модифицированную последовательность PpENA1, содержащую интрон. Пример 8. Сравнение использования кодонов у мха и высших растений. Анализ использования кодонов у Physcomitrella patens и 10 высших растений, включая трансформантов, описанных в данной публикации, осуществляли, используя данные на базе сети Интернет (Nakamura Y., Gojobori T. и Ikemura T. (2000) Nucleic Acids Res., 28: 292), расположенные на сайтеhttp://www.kazusa.or.jp/codon/. Подробные данные из базы данных показаны в табл. 1. В ходе анализа использовали все полноразмерные кодирующие последовательности каждого вида, доступные в настоящее время (с 5/08/04) в базе данных GenBank.(Сокращения названия видов, использованные выше, применяют в последующих таблицах). Такой анализ показал, что использование кодонов у анализируемых злаковых существенно отличалось от Physcomitrella patens наличием более значительного предпочтения использования G или C в третьем положении основания в кодонах, как показано в табл. 2. Наиболее значимые различия междуPhyscomitrella patens и злаковыми были обнаружены в предпочтительном использовании кодонов для цистеина, фенилаланина, глицина, серина и треонина (которые выделены в табл. 2). Таблица 2 Сравнение использования кодонов у мха и злаковых В отличие от злаковых было обнаружено небольшое различие между Physcomitrella patens и вы- 13014986 бранными видами двудольных растений в предпочтении нуклеотидов в третьем положении основания в кодонах, как показано в табл. 3. Однако были обнаружены различия в предпочтительном использовании кодонов для аспарагиновой кислоты, аргинина и валина (выделенных в таблице). Таблица 3 Сравнение использования кодонов у мха и двудольных растений В том случае, когда обнаружено, что различия в использовании кодонов между мхом и высшими растениями значительно снижают уровень экспрессии PpENA1 у реципиентного растения, можно использовать "рекурсивную ПЦР" (которая описана в Prodromou C., Pearl L.Н., (1992) Protein Eng., 5: 827-9), чтобы модифицировать использование кодонов PpENA1, отражая использование кодонов у реципиентного растения. Пример 9. Выделение промоторов PIP2.2 и VHA-c3 и их применение для управления экспрессиейENA. Промоторы PIP2.2 и VHA-c3 можно использовать для управления экспрессией Na+-АТФазы. Указанные промоторы могут быть клонированы и использованы для управления зависимой от NaCl экспрессией PpENA1 в бинарном векторе(ах), указанном в данном описании. Номера доступа MIPS для PIP2.2 и VHA-c3: At2g37180 и At4g38920 соответственно. Следующие праймеры можно использовать для амплификации 2013 п.о. последовательности про- 14014986 мотора PIP2.2, соответствующих положениям 57-2051 п.о. выше сайта инициации трансляции PIP2.2. Последовательность промотора PIP2.2 может быть амплифицирована в ПЦР с геномной ДНК Arabidopsis thaliana с использованием прямого праймера PIP2For (SEQ ID NO. 22) и обратного праймераPIP2Rev (SEQ ID NO. 23). Затем продукт указанной реакции можно использовать в качестве матрицы для второго раунда ПЦР с использованием прямого праймера PIP2F1 (SEQ ID NO. 24) и обратного праймераPIP2R1 (SEQ ID NO. 25). Второй раунд ПЦР вводит сайты рестрикции AscI (5') и MluI (3') в последовательность промотора, делая возможным последующее клонирование в векторах для трансформации растений. Продукты второго раунда ПЦР клонировали в клонирующем векторе pGemT (Promega) и секвенировали. Первый раунд ПЦР осуществляли в 25 мкл, используя 100 нг геномной ДНК в качестве матрицы. Второй раунд ПЦР осуществляли в 25 мкл, используя 50 пг очищенного продукта первого раунда в качестве матрицы. Смесь ферментов элонгаз и буфер (Invitrogen) использовали с 200 мкМ каждого dNTP и 400 нМ праймера. Стадию предварительной амплификации при 94C в течение 2 мин проводили перед 5 циклами при 94C в течение 1 мин, при 58C в течение 1 мин, при 72C в течение 2,5 мин с последующими 5 циклами при 94C в течение 1 мин, при 56C в течение 1 мин, при 72C в течение 2,5 мин и 20 циклами при 94C в течение 1 мин, при 54C в течение 1 мин, при 72C в течение 2,5 мин. Последовательность промотора PIP2.2 (обозначенная SEQ ID NO. 41) представляет собой следующую последовательность:PIP2.2 указан подчеркиванием и сайты праймеров PIP2F1 и PIP2R1 указаны жирным шрифтом и под- 15014986 черкнуты. Следующие праймеры могут быть использованы для амплификации 817 п.о. последовательности промотора VHA-c3 Arabidopsis, соответствующих положениям 3-819 п.о. выше сайта инициации трансляции VHA-c3. Последовательность промотора VHA-c3 может быть амплифицирована в ПЦР с геномной ДНКArabidopsis thaliana с использованием прямого праймера VHAc3For (SEQ ID NO. 26) и обратного праймера VHAc3Rev (SEQ ID NO. 27). Затем продукт указанной реакции может быть использован в качестве матрицы для второго раунда ПЦР с использованием прямого праймера VHAc3F1 (SEQ ID NO. 28) и обратного праймера VHAc3R1 (SEQ ID NO. 29). Второй раунд ПЦР вводит сайты рестрикции AscI (5') иMluI (3') в последовательность промотора, обеспечивая возможность последующего клонирования в векторах для трансформации растений. Продукты второго раунда ПЦР клонированы в клонирующем векторе pGem T-Easy (Promega) и секвенированы. Первый раунд ПЦР осуществляли в 25 мкл, используя 100 нг геномной ДНК в качестве матрицы. Второй раунд ПЦР осуществляли в 25 мкл, используя 50 пг очищенного продукта первого раунда в качестве матрицы. Смесь ферментов элонгаз и буфер (Invitrogen) использовали с 200 мкМ каждого dNTP и 400 нМ праймера. Стадию предварительной амплификации при 94C в течение 2 мин проводили перед 5 циклами при 94C в течение 1 мин, при 56C в течение 1 мин, при 72C в течение 1 мин с последующими 5 циклами при 94C в течение 1 мин, при 54C в течение 1 мин, при 72C в течение 1 мин и 20 циклами при 94C в течение 1 мин, при 50C в течение 1 мин, при 72C в течение 1 мин. Последовательность промотора VHA-c3 (обозначенная SEQ ID NO. 42) представляет собой следующую последовательность: Сайты праймеров VHAc3For и VHAc3Rev обозначены жирным курсивом, кодон инициации трансляции VHA-c3 подчеркнут и сайты праймеров VHAc3F1 и VHAc3R1 обозначены жирным шрифтом и подчеркнуты. Пример 10. Конструирование векторов для трансформации растений. кДНК PpENA1 может быть амплифицирована в ПЦР с клонирующего вектора pCR 2.1 TOPO с использованием прямого праймера PpENA1GF: 5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTTNO. 31), который вводит сигнальные последовательности рекомбинации Gateway дистально от последовательности ДНК PpENA1. ПЦР осуществляли в 25 мкл, используя 50 нг плазмидной ДНК в качестве матрицы. Смесь ферментов элонгаз и буфер (Invitrogen) использовали с 200 мкМ каждого dNTP и 400 нМ праймера. Стадию предварительной амплификации при 94C в течение 30 с проводили перед 35 циклами при 94C в течение 30 с, при 55C в течение 30 с, при 68C в течение 3,5 мин. Полученный в результате ПЦР фрагмент может быть рекомбинирован с использованием методикиGateway в бинарный вектор pTOOL2 (фиг. 1) посредством pDONR201 (Invitrogen) (Arabidopsis - конститутивная экспрессия с 35S, BASTA-резистентность). Коротко, методика Gateway является универ- 16014986 сальным способом клонирования, основанным на способности к сайт-специфичной рекомбинации бактериофага лямбда (как описано в Landy (1989) Ann. Rev. Biochem., 58, 913-949). Методика Gateway обеспечивает быстрый и высокоэффективный способ перемещения последовательностей ДНК в множественные векторные системы для функционального анализа и экспрессии белка. Полное описание методики можно найти на следующем сайте: http://www.invitroqen.com/content/sfs/manuals/gatewayman.pdf. кДНК ScENA1 может быть амплифицирована в ПЦР с вектора pJQ10 с использованием прямого праймера ScENA1GF: 5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT ATG GGC GAA GGACAA GAA AGC TGG GTT TCA TTG TTT AAT ACC AAT ATT AAC TT-3' (SEQ ID NO. 33), который вводит сигнальные последовательности рекомбинации Gateway (Invitrogen) дистально от последовательности ДНК ScENA1. Подходящими для ПЦР являются следующие условия: ПЦР может быть осуществлена в 25 мкл с использованием 50 пг плазмидной ДНК в качестве матрицы. Смесь ферментов элонгаз и буфер (Invitrogen) использовали с 200 мкМ каждого dNTP и 400 нМ праймера. Стадию предварительной амплификации при 94C в течение 30 с проводили перед 35 циклами при 94C в течение 30 с, при 55C в течение 30 с, при 68C в течение 3,5 мин. Полученный в результате ПЦР фрагмент может быть рекомбинирован в бинарный вектор pTOOL2 посредством pDONR201 (Invitrogen) (Arabidopsis - конститутивная экспрессия с 35S, BASTA - резистентность). кДНК PpENA1, ScENA1 и их модифицированные варианты могут быть вырезаны из соответствующих клонирующих векторов и введены в комплементарные сайты бинарной плазмиды pAJ21 (фиг. 2)(Arabidopsis - конститутивная экспрессия с 35S, BASTA - резистентность). кДНК PpENA1, ScENA1 и их модифицированные варианты могут быть вырезаны из соответствующих клонирующих векторов и введены в комплементарные сайты бинарных плазмид pAJ40 и pAJ41(Arabidopsis - индуцированная солевым стрессом экспрессия, BASTA - резистентность). Полученная в результате плазмида pAJ40-Pip2.2 показана на фиг. 8, а плазмида pAJ41-VHAc2 показана на фиг. 9. кДНК PpENA1, ScENA1 и их модифицированные варианты могут быть вырезаны из соответствующих клонирующих векторов и введены в комплементарные сайты бинарной плазмидыpGreenII0229UAS+Nos5A (фиг. 3; Arabidopsis - линии, снабженные системой GAL4-UAS-активации, экспрессирующие GAL4, содержат nptll, придающий резистентность к канамицину). Второй раунд селекции осуществляли, используя Basta. кДНК PpENA1, ScENA1 и их модифицированные варианты могут быть вырезаны из соответствующих клонирующих векторов и введены в комплементарные сайты бинарной плазмиды pDP1 (фиг. 4; рис-линии, снабженные системой GAL4-UAS-активации, резистентность к Hyg). кДНК PpENA1, ScENA1 и их укороченные варианты могут быть вырезаны из соответствующих клонирующих векторов и введены в комплементарные сайты челночного вектора pJIT60. кДНК или их фрагменты вырезают из pJIT60 с областью промотора CaMV35S и терминатором и переносят в комплементарные сайты бинарного вектора pPG1 (фиг. 6; ячмень - конститутивная экспрессия с 35S, резистентность к Hyg). Пример 11. Трансформация растений.PpENA1, ScENA1 и их модифицированные варианты, клонированные в бинарных векторах, описанных выше, затем могут быть введены в Agrobacterium штамм GV3101 электропорацией, как описано вMolecular Cloning: A Laboratory Manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis 2nd ed. Cold Spring Harbor,N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Полученные в результате бактерии использовали для трансформации растений посредством вакуумной инфильтрации, как описано в Clough S.J. и Bent A.F.(1998) Plant Journal, 16: 735-743. В некоторых случаях, когда растения не поддаются трансформации с помощью Agrobacterium, растения можно трансформировать с использованием бомбардировки частицами, как описано в Klein et al.(1988) PNAS 85(12): 4305-4309. Отбирали резистентные к антибиотикам и гербицидам трансгенные растения и подвергали экспериментам с физиологическим стрессом. Влияние трансгена на функционирование растения можно измерить на нескольких уровнях, и одним из наиболее исчерпывающих способов является применение микроматриц целого генома. В данной работе плейотропное действие экспрессии последовательностей ENA на уровни экспрессии всех других генов в геноме Arabidopsis можно измерить с использованием микроматриц целого генома, полученных на тканях из различных частей растения. Пример 12. Эксперименты с применением физиологического стресса. Толерантность к соли растений, экспрессирующих последовательности ENA, можно измерить, используя множество способов, известных в данной области. Например, визуальные симптомы можно регистрировать, используя цифровую фотографию. Рост можно количественно определить посредством измерения влажной и сухой массы корней и стеблей после двух-шестинедельного роста в условиях короткого дня; и в той же самой ткани можно количественно оценить степень накопления широкого ряда элементов (включая Na+ и K+), используя спектроскопию с индуктивно-связанной плазмой, например,- 17014986 как описано в Lahner et al. (2003) Nature Biotechnology, 21, 1215-1221. Однонаправленный приток и отток Na+ измеряли, используя радиоактивный 22Na+ в качестве индикатора потоков Na+, как описано в Essah et al. (2003) Plant Physiology, 133: 307-318. Такие анализы будут осуществлены на Arabidopsis, а также в регенерированных каллусах риса и ячменя, как описано в KumriaOrgan Culture, 73: 245-256 и Shankhdhar et al. (2000) Biologia Plantarum, 43: 477-480. Кроме того, активность ENA1 можно проанализировать непосредственно по экспрессии генного продукта в ооцитах Xenopus, например, как описано в Miller и Zhou (2000) Biochim. Biophys. Acta., 1465(1-2): 343-58, и измерением выходящих потоков, индуцированных экспрессией ENA1. Пример 13. Иммунолокализация/выявление белков PpENA. Антитела к различным АТФазам, перекачивающим Na+, согласно настоящему изобретению могут быть получены способом, известным в данной области. Антитела могут быть либо моноклональными антителами, поликлональными антителами или рекомбинантными антителами. Также может быть получена антигенсвязывающая часть антитела. В этой связи антигенсвязывающая часть молекулы антитела включает Fab, Fab', F(ab')2, Fv, одноцепочечное антитело (scFv), химерное антитело, димерное антитело или любой полипептид, который содержит по меньшей мере часть иммуноглобулина, которой достаточно для обеспечения специфичного для антигена связывания. Антитела могут быть созданы с использованием способов, известных в данной области. Для получения антител различные хозяева, включая коз, кроликов, крыс, мышей, человека и других, могут быть иммунизированы инъекцией АТФазы, перекачивающей Na+, или ее подходящим фрагментом, включая подходящий синтетический пептид АТФазы, перекачивающей Na+. В зависимости от вида хозяина можно использовать различные адъюванты, чтобы увеличить иммунологический ответ. Такие адъюванты включают адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, и поверхностноактивные вещества, такие как лизолецитин, полиолы плюроники, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин морского блюдечка "замочная скважина" и динитрофенол. Поликлональное антитело представляет собой антитело, которое получают вместе или в присутствии одного или нескольких других, неидентичных антител. В общем, поликлональные антитела продуцируются B-лимфоцитами. Обычно поликлональные антитела получают непосредственно из организма иммунизированного субъекта, такого как иммунизированное животное. Моноклональные антитела могут быть получены с использованием любого способа, который обеспечивает продуцирование молекул антител изолированными клетками в постоянной культуре. Способы включают, без ограничения, способ на основе гибридом, способ B-клеточных гибридом человека и способ EBV-гибридом. Способы получения моноклональных антител, в общем, описаны в Kohler et al.Acad. Sci., 80: 2026-2030 и Cole et al. (1984) Mol. Cell. Biol., 62: 109-120. Фрагменты антител, которые содержат специфичные сайты связывания, могут быть созданы способами, известными в данной области. Например, F(ab')2-фрагменты могут быть получены расщеплением пепсином молекулы антитела, а Fab-фрагменты могут быть созданы при восстановлении дисульфидных мостиков F(ab')2-фрагментов. Альтернативно, могут быть сконструированы библиотеки Fab-экспрессии,чтобы обеспечить возможность быстрой и простой идентификации моноклональных Fab-фрагментов с требуемой специфичностью, как описано в Huse W.D. et al. (1989) Science, 254: 1275-1281. Молекулы антител и их антигенсвязывающие части также могут быть получены рекомбинантно способами, известными в данной области, например посредством экспрессии в экспрессирующих системах E. coli/T7. Подходящим способом получения рекомбинантных антител является способ, который описан в патенте США 4816567. Различные иммуноанализы могут быть использованы для идентификации антител, имеющих требуемую специфичность. Многочисленные протоколы конкурентного связывания или иммунорадиометрических анализов с использованием либо поликлональных, либо моноклональных антител известны в данной области. Специально предполагается, что могут быть выбраны две антигенные последовательности и тестированы в отношении их способности вызвать образование антител, способных узнавать и взаимодействовать с исходной нативной последовательностью. Одна антигенная последовательность (Gly-Ser-GlyAsp-Lys-Arg-His-Glu-Asn-Leu-Asp-Glu-Asp-Gly; SEQ ID NO. 43) представляет собой синтетический пептидный антиген, полученный из PpENA1. Вторая последовательность (Gly-Lys-Pro-Leu-Ser-Lys-Trp-GluArg-Asn-Asp-Ala-Glu-Lys; SEQ ID NO. 44) представляет собой синтетический пептидный антиген, полученный из PpENA2. В обоих случаях подходящие полученные антитела узнают исходный пептид и исходный белок, но не реагируют перекрестно с альтернативной последовательностью или белком. Каждый синтетический пептид содержит дополнительный остаток Cys на карбоксильном конце, чтобы обеспечить связывание пептида с белками-носителями. Синтетические пептиды могут быть связаны через тиольные группы своих остатков цистеина с белками-носителями с использованием активированных малеимидом белков-носителей Imject (KLH или- 18014986 овальбумин) из Pierce Chemical Company согласно инструкциям производителя. Молодые мыши Balb/c будут использованы для иммунизации. Осуществляют три подкожные инъекции конъюгатов пептидKLH, смешанных с адъювантом Фрейнда с пятнадцатидневными интервалами. В первой инъекции используют полный адъювант, тогда как в двух следующих бустер-инъекциях используют неполный адъювант. Титр антител можно измерить в системе ELISA, используя синтетический пептид, связанный с овальбумином, для покрывания планшетов. Перекрестную реакцию антител с исходным полным белком можно оценить с помощью ELISA и вестерн-блота. Продуцирующие моноклональные антитела линии клеток гибридом можно создать слиянием клеток миеломы мышей NS-1, SP/20 или других клеток миеломы со спленоцитами, полученными от животных, иммунизированных, как описано выше согласно способу Kohler и Milstein (1975) Nature, 256: 495-497. Пример 14. Рост и комплементация дрожжей.ena1HIS3ena4 nha1LEU2) выращивали в течение ночи в YPD при 37C при встряхивании. Для трансформации дрожжевые клетки дважды промывали буфером TE, ресуспендировали с 1 мл буфера TE,содержащего 0,1 М ацетат лития, и инкубировали при 30C в течение 1 ч. Дрожжевые клетки (200 мкл) использовали с 2 мкл ДНК спермы лосося (10 мг/мл), 1 мкг ДНК pYES3/PpENA1, 1 мл 40% ПЭГ 4000,1XTE pH 7,5 и 0,1 М ацетатом лития. Реагенты смешивали и инкубировали при 30C в течение 30 мин. Дрожжи подвергали тепловому шоку при 42C в течение 15 мин, один раз промывали 1 мл TE перед ресуспендированием в 200 мкл TE и высевали на среду SC, не содержащую урацила. Пример 15. Условия роста мха.Physcomitrella patens (Hedw.), полученный из мха дикого типа, собранного в лесу Gransden в Huntingdonshire, UK (Ashton and Cove (1977) Mol. Gen. Genet., 154: 87-95), выращивали при 22C на целлофановых дисках, помещенных на твердую минимальную среду (Ashton et al. (1979) Planta, 144: 427-435) с добавлением тартрата NH4 (0,5 г/л). Стандартные условия роста представляли собой 16 ч дневного света(люминесцентные лампы, GRO-LUX, 100 мкмоль м-2 с-1) и 8 ч темноты. Пример 16. Получение PpENA1-мутанта Physcomitrella patens. Чтобы нокаутировать Physcomitrella patens по PpENA1 с использованием гомологичной рекомбинации создали конструкцию расщеплением pENTR-D/PpENA1 с использованием ClaI и встраиванием кассеты для селекции nptll. Кассета nptll содержит промотор 35S CaMV, ген nptll и терминатор CaMV. Кассету nptll получали расщеплением pMBL6 (www.moss.leeds.ac.uk) с использованием ClaI и встраиванием ее в середину гена PpENA1, создавая pCL247. Чтобы линеаризовать pCL247 перед трансформацией плазмиду расщепляли EcoRI. Трансформацию осуществляли с использованием способа на основе ПЭГ и теплового шока. Для трансформации Physcomitrella субкультивировали на полной среде, содержащей 0,8 г/лKpi-буфер (pH 7) 0,25 г/л,и однонедельную протонему использовали для получения протопластов (по существу, как описано в Hohe et al., (2004) Current Genetics, vol. 44 (6): 339-347). Драйселазу растворяли в 8% манните. Примерно 2 г протонемы собирали и инкубировали в течение 30 мин в 20 мл 1% драйселазы, 8,5% манните при 25C. Ткань фильтровали через сито 100 меш, оставляли на 15 мин и фильтровали через фильтр 70 мкм. Протопласты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 200 g. Протопласты дважды промывали в 8,5% манните и оценивали плотность протопластов, используя гемоцитометр. Протопласты суспендировали в концентрации 1-1,5106/мл в буфере МММ (8,5% маннит, 15 мМ MgCl2, 0,1% MES, pH 5,6). 10-30 мкг ДНК добавляли к 300 мкл протопластов, осторожно смешивали и добавляли 300 мкл ПЭГ (7%- 19014986 маннит, 0,1 М Ca(NO3)2, 35-40% (мас./об.) ПЭГ 4000, 10 мМ трис, pH 8). Протопласты подвергали тепловому шоку в течение 5 мин при 45C и возвращали в комнатную температуру на 5-10 мин, время от времени перемешивая. Трансформированные протопласты выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 12-20 ч и затем ресуспендировали в 3 мл 8,5% маннита и 3 мл расплавленной при 42C среды для верхнего слоя (полная среда с 66 г/л маннита, 1,4% агара). Протопласты высевали на покрытые целлофаном чашки с маннитом (полная среда с 66 г/л маннит, 0,7% агара). Селекцию начинали через 6-7 дней, перенося верхний слой на чашки для селекции, содержащие 25 мкг/л генетицина. Чтобы подтвердить интеграцию, осуществляли гнездовую или полугнездовую ПЦР на геномной ДНК, очищенной из резистентного мха, согласно Schlink и Reski (2002) Plant Mol. Biol. Rep., 20: 423a-423f. Для определения сайта интеграции использовали праймеры с последовательностями SEQ IDNO. 46, 75, 76, 77, 78, 79 (показаны в табл. 4), и праймеры отжигали с кассетой для селекции (P35S-nptllCaMVter) и с геномной последовательностью, расположенной с 5'- или 3'-конца от клона PpENA1. ПЦРпроверку 5'-конца осуществляли, используя oCL148-OCL76 для первой ПЦР и oCL49-oCL100 для второй ПЦР. ПЦР-проверку 3'-конца осуществляли с использованием PpENA1R-oCL77 для первой ПЦР иoCL101-PpENA1R для второй. Ожидаемый размер фрагмента в том случае, если происходила инсерция,составлял 1429 и 1835 п.о.Arabidopsis thaliana трансформировали способом на основе замачивания цветков (Clough et al.,(1998) Plant Journal, 16, 735-743), используя Agrobacterium tumefaciens, штамм GV3101pMP90(RK) с бинарными векторами pAJ53, pAJ65 и pAJ66. Растения (T3), используемые в анализах чувствительности к соли, выращивали на искусственной почве (3,6 л перлита - средняя фракция, 3,6 л кокосового волокна и 0,25 л речного песка) или на чашках с агаром, содержащих 1/2 среды MS (Murashige T. и Skoog F. (1962)Physiol. Plant, 15: 473-497) в помещении для роста при 22C в условиях 8-часовой освещенности и 16-часовой темноты. Проростки (10-дневного возраста), трансформированные бинарными конструкциями, отбирали при опрыскивании через день в течение одной недели 100 мг/л BASTA (AgrEvo, Dusseldorf,Germany). Растения на искусственной почве получали воду со смесью питательных веществ для гидропоники (табл. 5) один раз в неделю. Эмбриогенные нодулярные единицы Oryza sativa L. сорта Nipponbare, образующиеся из каллуса,полученного из щитка, инокулировали с использованием супервирулентных штаммов A. tumefaciensEHA105 и AGL1 (несущих плазмиду pC-4956:ET15). Растения трансформировали, используя бинарные векторы pAJ54 и pAJ55. Резистентные к гигромицину побеги (50 мгл-1) регенерировали после девяти недель согласно протоколу, описанному в Sallaud et al. (2004) Plant Journal, 39(3): 450-464. После селекции и регенерации в культуре ткани растения переносили в грунт и помещали в теплицу. Каллус Hordeum vulgare L. сорта Golden Promise, полученный из незрелого эмбриона, трансформировали, используя протокол опосредованной Agrobacterium tumefaciens трансформации, разработанныйBreeding, 7(3): 195-202. Растения трансформировали, используя бинарные векторы pAJ54 и pAJ55. После регенерации и селекции в культуре ткани растения переносили в грунт и помещали в теплицу. Пример 18. Анализы чувствительности к соли. Эксперименты по воздействию стресса на мох осуществляли на гаметофитах 5-недельного возраста. Абиотический стресс индуцировали, перенося целлофан с Physcomitrella на среду или фильтровальные диски, содержащие 60 или 100 мМ NaCl. В среду, содержащую NaCl, добавляли дополнительноCaCl2, чтобы поддержать уровень доступного Ca2+ постоянным. Количество добавленного CaCl2 определяли, используя MinTeq ver 2.30 (http://www.lwr.kth.se/English/OurSoftware/vminteq/). Семена Arabidopsis поверхностно стерилизовали в 50% доместосе в течение 5 мин и несколько раз промывали в стерильной воде перед посевом на среду 1/2 MS с 0,6% фитагеля с добавлением 100, 150,200, 250 или 300 мМ NaCl. Семя подвергали яровизации в темноте в течение ночи при 4C и чашки помещали в помещение для роста в описанные выше условия. Пример 19. Экстракция ДНК и РНК. Геномную ДНК экстрагировали из молодых листьев Arabidopsis, применяя способ с использованием горячего CTAB (Lassner et al., 1989) Molecular and General Genetics, 218, 25-32). Геномную ДНК экстрагировали из листьев ячменя и риса, используя протокол Pallotta et al. (2000) Theoretical and Applied Genetics, 101: 1100-1108). Суммарную РНК экстрагировали из молодых листьев Arabidopsis, ячменя и риса, используя реагент тризол (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) согласно инструкциям производителя. Пример 20. Анализ количества копий трансгена. Геномную ДНК (10 мкг) расщепляли в течение 6-18 ч при 37C, используя 100 ед. BamHI. Расщепленную ДНК разделяли в 1% (мас./об.) агарозных гелях и фрагменты ДНК переносили на нейлоновую мембрану, используя способ Саузерна. Нейлоновую мембрану нейтрализовали в растворе 2 SSC. Мембраны подвергали сухому блоттингу и сушили в вакууме при 80C перед исследованием с помощью зонда. Предгибридизацию мембран осуществляли в 6 SSC, 1 растворе Денхардта III (2% (мас./об.) БСА,2% (мас./об.) фикол 400 и 2% PVP), 1% (мас./об.) SDS и 2,5 мг денатурированной ДНК спермы лосося минимум в течение 4 ч при 65C. Смесь для гибридизации (10 мл), содержащую 3 SSC, 1 раствор Денхардта III, 1% (мас./об.) SDS и 2,5 мг денатурированной ДНК спермы лосося, использовали для замены удаляемой смеси для предгибридизации. ДНК-зонды радиоактивно метили [-32P]-dCTP, используя набор для мечения ДНК Megaprime согласно инструкциям производителя (Amersham, UK). Зонд гибридизовали в течение 16 ч при 65C. Мембраны последовательно промывали в течение 20 мин при 65C в 2SSC, содержащем 0,1% (мас./об.) SDS, в 1 SSC/0,1% (мас./об.) SDS и в 0,5 SSC/0,1% (мас./об.) SDS. Мембраны подвергали сухому блоттингу, герметизировали в пластике и рентгеновскую пленку RX экспонировали с мембраной при -80C в течение 24-48 ч, используя усиливающий экран. Пример 21. Пламенная фотометрия. Ткань для пламенной фотометрии быстро промывали в деионизованной воде, сушили, взвешивали,затем расщепляли в течение ночи в 1-2 мл 1% азотной кислоты при 85C. После охлаждения и в случае необходимости после разбавления образцы загружали в пламенный фотометр Sherwood модели 420 и регистрировали концентрации Na+ и K+. Пример 22. Клонирование и конструирование рекомбинантного экспрессирующего вектора. Систему экспрессии рекомбинантного белка QIAexpress (Qiagen) использовали для экспрессии и очистки области белка PpENA (аминокислоты с P150 по K244). Последовательность пептида P150/K244 амплифицировали с кДНК PpENA1 с использованием набора праймеров antiF1/R1 (табл. 4). Конструировали праймеры для добавления 5'-BamHI-последовательности и 3'-HindIII-последовательности к ПЦРампликону. Продукт ПЦР P150/K244 разрезали BamHI и HindIII, очищали с использованием колонок для очистки продуктов ПЦР Qiagen, следуя инструкциям производителя, и клонировали в экспрессирующем векторе pQE-30, расщепленном двумя ферментами BamHI и HindIII. Пример 23. Экспрессия и очистка рекомбинантного пептида PpENA. Рекомбинантными плазмидами трансформировали компетентные клетки E. coli M15 (Qiagen, USA) посредством обработки тепловым шоком. Клетки высевали на чашки с LB, содержащей 25 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина, и инкубировали в течение ночи при 37C. Отдельные колонии отбирали и высевали в 5 мл LB, содержащей оба антибиотика, и выращивали при 37C с постоянным встряхиванием в течение примерно 12 ч. 500 мкл начальной культуры извлекали и высевали в 10 мл среды LB,нагретой до 37C (содержащей 25 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина), и культуру выращивали при 37C со встряхиванием вплоть до достижения OD600 0,8. Экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 2 мМ. Через 3 ч после индукции клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали с помощью пипетки в 1 мл лизирующего раствора (50 мМ NaH2PO4,300 мМ NaCl, 1% тритон, 5 мМ имидазол, pH 8,0), содержащего 1, 0,3 и 0,3 мг лизоцима, РНКазы и ДНКазы соответственно. Затем раствор оставляли на льду на 30 мин. Клетки лизировали комбинированием быстрого замораживания-оттаивания (в жидком азоте) с последующей обработкой ультразвуком(66 с) при 40 Вт в ультразвуковом дезинтеграторе Branson B-12 и обломки клеток удаляли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин. К надосадку добавляли 50% взвесь Ni/нитрилоуксусная кислота-смолы (Qiagen, USA) в лизирующем буфере и рекомбинантные белки отделяли от эндогенных белков благодаря их гистидиновой метке. Загрязняющие белки удаляли посредством серии трех отдельных стадий промывки: стадия 1, четыре промывки 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазолом, pH 8,0; стадия 2, три промывки 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, pH 6,0; стадия 3, три промывки 100 мМKH2PO4, pH 6,0. Очищенный белок элюировали со смолы добавлением 100 мМ KH2PO4, 2 мМ EDTA,pH 3,0. Элюат, содержащий рекомбинантный белок, затем титровали до pH 7,0 добавлением 100 мМKH2PO4, 2 мМ EDTA, pH 10,0. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (ShimadzuUV-160 А) при 280 нм и сравнением со стандартной кривой для БСА. Очищенный белок визуализировали на 12,5% полиакриламидном геле с использованием белковых маркеров в диапазоне от 7 до 200 кД(предварительно окрашенных Broad-Range, BIORAD USA). Пример 24. Получение PpENA1-антител. Мышей Balb/c иммунизировали 50 мг препарата рекомбинантного пептида, связанного с белкомносителем гемоцианином морского блюдечка "замочная скважина", смешанным с адъювантом Фрейнда. Проводили четыре подкожных инъекции с 3-недельными интервалами. Через 3 дня после последней инъекции клетки селезенки сливали с клетками миеломы мышей NS1. Для выявления анти-PpENAантител в ELISA 50 мл каждого надосадка гибридом использовали в 96-луночных планшетах, покрытых тем же самым пептидом, который использовали для иммунизации, но связанным с белком-носителем овальбумином. Планшеты покрывали конъюгатом пептида в 0,1 М карбонатном буфере, pH 9,6, при 4C в течение ночи. Планшеты промывали и блокировали 200 мл казеина, подвергнутого обработке кипячением, в течение 60 мин и снова промывали. После инкубации с надосадком гибридом при 37C в течение 1,5 ч планшеты снова промывали и инкубировали с кроличьим антителом против IgG мыши, конъюгированным с HRP, в разведении 1:10000. Планшеты инкубировали в течение 60 мин при 37C, промывали и проявляли с использованием TMB. Отобранные гибридомы субклонировали способом лимитирующего разведения. Дополнительный скрининг специфичности позитивных гибридом осуществляли с использованием вестерн-блоттинга. Пример 25. Количественный ПЦР-анализ мРНК PpENA1. Суммарную РНК (2 мкг) использовали в кДНК-реакциях с применением набора для синтеза кДНКSuperscript III (Invitrogen). Конструировали пары праймеров для регуляторных генов для каждого сорта растения и гена PpENA1 мха, которые перечислены в табл. 4. Из кДНК готовили исходные растворы ПЦР-продукта, очищали и количественно оценивали посредством ВЭЖХ.- 23014986 Полученную из листьев кДНК (1 мкл) амплифицировали в реакционной смеси, содержащей 10 мкл реагента для ПЦР QuantiTect SYBR Green (Qiagen, Valencia, CA1 USA), по 3 мкл каждого прямого и обратного праймера, 4 мкМ, и 3 мкл воды. Амплификацию осуществляли в термоциклере RG 2000 RotorGene в режиме реального времени (Corbett Research, Sydney, Ausralia) следующим образом: 15 мин при 95C с последующими 45 циклами 20 с при 95C, 30 с при 55C, 30 с при 72C и 15 с при 80C. Кривую плавления получали для ПЦР-продукта в конце амплификации нагреванием от 70 до 99C. Во время амплификации получали данные флуоресценции при 72 и 80C, чтобы измерить относительное содержание отдельных генов в препарате кДНК. На основе кривой плавления определяли оптимальную температуру для сбора данных. От четырех до шести независимых реакционных смесей для ПЦР объемом 20 мкл объединяли и очищали с использованием ВЭЖХ (Wong et al., (2000) BioTechniques, 28: 776-783) на колонке с обращенной фазой Agilent Eclipse DS DNA 2,1 мм 15 см, 3,5 мкм (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Хроматографию осуществляли, используя буфер А (100 мМ ацетат триэтиламмония, 0,1 мМ EDTA) и буфер В (100 мМ ацетат триэтиламмония, 0,1 мМ EDTA, 25% ацетонитрил). Градиент подавали со скоростью потока 0,2 мл/мин при 40C следующим образом: 0-30 мин 35% буфера В, 30-31 мин 70% буфера В,31-40 мин 35% буфера В и после 40 мин 35% буфера В. Очищенные ПЦР-продукты количественно оценивали путем сравнения площади пика с площадями трех пиков в продукте расщепления pUC19/HpaII(Geneworks, Adelaide, Australia). В 2 мкл 500 нг/мкл продукта расщепления были пики, используемые для сравнения, 147 п.о., представляющий 55 нг, 190 п.о. (71 нг) и 242 п.о. (90 нг). На основе полученных данных рассчитывали среднее значение в нанограммах на единицу площади пика. Это значение использовали для определения массы очищенного продукта ПЦР. Значение определяли для каждой партии очищенных продуктов ПЦР. Продукт сушили и растворяли в воде, чтобы получить исходный раствор 20 нг/мкл. Размер в парах оснований и идентичность продуктов ПЦР подтверждали секвенированием. Аликвоту указанного раствора разбавляли, получая исходный раствор, содержащий 109 копий продукта ПЦР в микролитре. Из исходного раствора 109 копий/мкл готовили серийные разведения, охватывающие семь порядков величины, получая растворы от 107 копий/мкл до 101 копий/мкл. В каждый эксперимент Q-ПЦР включали три повтора каждой из семи стандартных концентраций вместе минимум с двумя контролями "без матрицы". В случае всех генов разведение кДНК 1:20 было достаточным для получения данных об экспрессии с приемлемым стандартным отклонением. В каждый эксперимент включали четыре повтора ПЦР для каждой кДНК. В случае экспериментов Q-ПЦР 1 мкл раствора кДНК использовали в реакционной смеси, содержащей 10 мкл реагента для ПЦР QuantiTect SYBR Green, по 3 мкл каждого прямого и обратного праймера, 4 мкМ, 0,6 мкл 10 SYBR Green в воде (свежеразбавленного 10000 в диметилсульфоксиде) и 2,4 мкл воды. Реакции осуществляли следующим образом: 15 мин при 95C с последующими 45 циклами в течение 20 с при 95C, 30 с при 55C, 30 с при 72C и 15 с при оптимальной температуре сбора (табл. III). Кривую плавления получали для продукта в конце амплификации нагреванием от 70 до 99C. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2,5% агарозных гелях с TBE и бромидом этидия. Компьютерную программу Rotor-Gene V4.6 (Corbett Research, Sydney, Australia) использовали для определения оптимального порога циклов (CT) на основе серийных разведений и рассчитывали средний уровень экспрессии и стандартные отклонения для каждого набора из четырех повторов для каждой кДНК. Пример 26. Вестерн-анализ PpENA1 у Arabidopsis и мха. Белок экстрагировали из образцов Arabidopsis и мха измельчением листа или ткани хлоронемы в 200 мкл 50 мМ HEPES-буфера, pH 4, содержащего 1 мМ PMSF, 1 мМ бензамидин, 50 мМ фторид натрия и 1 мМ ингибитор протеаз. Образцы центрифугировали при 13500 об/мин в течение 5 мин и осадки ресуспендировали в 110 мкл 50 мМ HEPES-буфера, pH 4, содержащего 1 мМ PMSF, 1 мМ бензамидин,50 мМ фторид натрия и 1 мМ ингибитор протеаз и 30 мкл 0,225 М трис-HCl-буфера, pH 8, содержащего 50% глицерин, 5% SDS, 0,05% бромфеноловый синий и 0,25 М DTT и кипятили в течение 15 мин. Образцы центрифугировали при 13500 об/мин в течение 5 мин и солюбилизированную мембранную фракцию наносили на 10% полиакриламидный гель. Белки электрофоретически переносили из геля на мембрану Hybond P (PVDF) (Amersham, Buckinghamshire, UK). 1 мкл конъюгированного с овальбумином рекомбинантного белка наносили в виде пятен на край мембраны и мембрану блокировали инкубацией в 5% растворе обезжиренного молока при комнатной температуре в течение ночи. Мембраны промывали 3 раза по 5 мин в PBS, содержащем 0,05% твин 20 при встряхивании. Очищенную на белке G поликлональную кроличью сыворотку, разбавленную 1:500 в PBS, содержащем 0,05% твин 20, инкубировали с мембранами в течение ночи. Мембраны промывали 3 раза по 5 мин в PBS, содержащем 0,05% твин 20, при встряхивании и добавляли конъюгат второго антитела против IgG кролика с биотином (Molecular probes, CA, USA), разбавленный 1:1000 в PBS, содержащем 0,05% твин 20, и оставляли для связывания на 1 ч. Мембраны промывали 3 раза по 5 мин в- 24014986 0,05% твин 20, со встряхиванием и проявляли в NBT/BCIP фиолетовом (Sigma, MO, USA). Пример 27. Экспрессия PpENA1 спасает чувствительный к соли дрожжевой штамм. Чувствительные к соли дрожжи B31 трансформировали PpENA1 под контролем промотора Gal и высевали в планшеты с 300 мМ NaCl. B31 (MAT a ade2 ura3 leu2 his3 trp1 ena1HIS3ena4nha1LEU2, трансформированные pYES-ENA) выращивали в SC-ura в течение ночи. Готовили 5 серийных разведений 1 к 2 и 1 мкл каждого наносили в виде пятен либо на SC-ura + 0,3 М NaCl + глюкоза, либо на SC-ura + 0,3 М NaCl + галактоза. Результаты показаны на фиг. 10. Как можно видеть, индуцированная Gal транскрипция PpENA1 спасает чувствительный к соли фенотип мутанта B31. Пример 28. Мутанты мха, дефектные по экспрессии PpENA1, накапливают больше Na+ и растут с пониженной скоростью. На фиг. 11 показаны результаты подтверждения с помощью ПЦР нарушения PpENA1 в геномной ДНК резистентных к канамицину трансформантов Physcomitrella patens. Проверку в ПЦР 5'-конца осуществляли с использованием oCL148-OCL76 для первой ПЦР и oCL149-oCL100 для второй ПЦР. ПЦР-проверку 3'-конца осуществляли, используя PpENA1R-oCL77 для первой ПЦР и oCL101-PpENA1R для второй. Ожидаемый размер фрагмента в случае, если инсерция происходила, составлял 1429 и 1835 п.н., на основе этого линии 2, 3, 5, 6, 7, 14 и 15 являются PpENA1-мутантами. Уровни мРНК PpENA1 определяли с помощью qПЦР для трех нокаутированных по PpENA1 мутантов мха и мха дикого типа. Результаты показаны на фиг. 12. Уровни мРНК PpENA1 возрастали у дикого типа по мере увеличения концентрации NaCl. Мутанты не способны синтезировать мРНК PpENA1. Чтобы определить концентрации натрия и калия у мха дикого типа и мутантного мха использовали пламенную фотометрию. Результаты показаны на фиг. 13. Как можно видеть, мох дикого типа способен поддерживать более высокое отношение K+/Na+, чем мутанты при концентрации NaCl 100 мМ. На фиг. 14 показано, что нокаутированные по PpENA1 мутанты имеют пониженную биомассу по сравнению с диким типом через 1 неделю в средах, содержащих 100 или 200 мМ NaCl. Результаты также представлены графически на фиг. 15. Как можно видеть, дикий тип достигает большего диаметра, чем нокаутированные по PpENA1 мутанты. Пример 29. Трансгенные растения Arabidopsis экспрессируют PpENA1 на разных уровнях. Трансгенные растения получали, как описано в примере 17. На фиг. 16A и 16B показаны уровни мРНК PpENA1 у трансгенных растений Arabidopsis T1, конститутивно экспрессирующих PpENA1. Высокоэкспрессирующие линии 5311 и 5316 были удалены из графика на панели B. Результаты показывают, что достигались разные уровни транскрипции мРНКPpENA1. На фиг. 17 показаны уровни мРНК PpENA1 у трансгенных растений Arabidopsis T1, индуцированные после воздействия 30 мМ NaCl. Эндогенный промотор PpENA1 дрожжей управляет экспрессиейPpENA1 чувствительным к соли образом в линии 6501. На фиг. 18 показаны уровни мРНК PpENA1 у трансгенных растений Arabidopsis T1, индуцированные после воздействия 30 мМ NaCl. Промотор VHAc3 Arabidopsis дает низкий уровень экспрессии мРНКPpENA1 при 30 мМ NaCl. Пример 30. Трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие PpENA1, имеют измененные уровни Na+. В табл. 6 показаны концентрации натрия и калия в ткани листа трансгенных растений ArabidopsisT1, конститутивно экспрессирующих PpENA1. Как можно видеть, в общем трансгенные растения накапливают в среднем меньше натрия, чем растения дикого типа или нетрансгенные растения. Таблица 6- 25014986 В табл. 7 показаны концентрации натрия и калия в ткани листа трансгенных растений ArabidopsisT1 с транскрипцией PpENA1 под контролем промотора VHAc3 Arabidopsis. Трансгенные растения накапливают разные уровни Na+ и K+. Таблица 7 Пример 31. Трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие PpENA1, имеют преимущества роста в 100 мМ NaCl. На фиг. 19 показано, что трансгенные растения Arabidopsis T3, конститутивно экспрессирующиеPpENA1, могут иметь преимущества роста при 100 мМ NaCl по сравнению с диким типом. Пример 32. Трансгенные растения риса содержат PpENA1. На фиг. 20 показаны результаты q-ПЦР-исследования экспрессии PpENA1 у трансгенных растений риса, содержащих бинарную конструкцию pAJ55. Саузерн-анализ (не показан) с использованиемPpENA1-зонда выявил, что несколько линий имеют более одной копии гена PpENA1. Пример 33. Предполагаемые трансгенные растения ячменя, содержащие PpENA1. На фиг. 21 показаны резистентные к гигромицину растения ячменя, трансформированные pAJ54 иpAJ55 в культуре ткани. Пример 34. Выявление белка PpENA1 у мха и трансгенных растений Arabidopsis. На фиг. 22 показан вестерн-анализ трансгенных растений Arabidopsis T2 и обработанного солью мха с использованием в качестве зонда PpENA1-антитела. Полоса 100 кД, показанная стрелкой, может представлять собой положение белка PpENA1 в белковых экстрактах мха и Arabidopsis. Наконец, будет понятно, что различные модификации и варианты описанных способов и композиций согласно изобретению, не выходящие за рамки и не отходящие от сути изобретения, будут очевидны для специалистов в данной области. Хотя изобретение описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами его осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение нельзя ограничивать такими конкретными вариантами. Действительно, подразумевается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в области биологии растений, молекулярной биологии или родственных областях, входят в объем настоящего изобретения.