Способ обнаружения патогенов

(57) Описан способ обнаружения патогенов, в частности организмов, ассоциированных с заболеваниями, передающимися половым путем, в частности генотипов вируса папилломы человека. Способ включает применение ПЦР в реальном времени с применением особым образом сконструированных зондов. Также описаны зонды, комплекты для осуществления данного способа и способ конструирования праймеров, подходящих для применения в способе согласно изобретению. 014648 Данное изобретение относится к диагностике, в частности к диагностике организмов, ассоциированных с заболеваниями, передающимися половым путем, и более конкретно - к обнаружению генотипов вируса папилломы человека (ВПЧ), в частности генотипов генитального вируса папилломы человека. Вирус папилломы человека и его значение Согласно Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) рак шейки матки является второй по распространенности причиной смерти от рака у женщин. Инфекция ВПЧ вовлечена более чем в 99% случаев развития рака шейки матки во всем мире. По оценкам ежегодно рак шейки развивается более чем у 500000 женщин в мире, причем более чем 273000 случаев имеют смертельный исход. Даже при существовании программы тестирования по Папаниколау ежегодно значительное количество женщин умирает от рака шейки матки. Инфекция ВПЧ представляет собой наиболее распространенное в мире заболевание, передающееся половым путем (ЗППП), и до 60% сексуально активных женщин хотя бы один раз в течение жизни приобретают инфекцию ВПЧ половых путей. Инвазивный рак шейки матки развивается менее чем у 1 из 10000 женщин, вне зависимости от состояния инфицирования ВПЧ. Тот факт, что у большинства ВПЧинфицированных женщин не развиваются цитологические аномалии или рак, подчеркивает важность факторов, оказывающих влияние на прогрессирование поражения шейки матки в рак у ВПЧинфицированных женщин. Эти факторы могут включать генотип и молекулярную разновидность ВПЧ,вирусную нагрузку ВПЧ, устойчивость инфекции ВПЧ, совместное инфицирование другими агентами,вызывающими ЗППП, состояние иммунной системы организма-носителя и факторы окружающей среды,например курение. Вирусы папилломы представляют собой небольшие ДНК-содержащие вирусы, инфицирующие эпителиальные клетки млекопитающих, вызывая пролиферативные повреждения эпителия, которые могут быть доброкачественными, например фибропапилломы (бородавки), или злокачественными. Все вирусы папилломы имеют схожие размеры генома, организацию генома, открытые рамки считывания и функции белков. Многие, но не все, участки генома консервативны у различных вирусов папилломы. Вследствие существования тесной связи между жизненным циклом вируса папилломы и состояния дифференцировки клетки-хозяина, детали жизненного цикла вирусов папилломы не полностью выявлены. Известно, что вирусы папилломы инфицируют базальные клетки эпителия хозяина, в которые попадает геном вируса и где сохраняется в виде низкокопийной эписомы, которая реплицируется вместе с репликацией клетки-хозяина. По мере того как инфицированные клетки дифференцируются в кератиноциты, происходит амплификация ДНК вируса, индукция поздних генов и вегетативная репликация вируса папилломы. Вирусы папилломы инфицируют широкий круг животных, в том числе и человека. Вирусы папилломы человека (ВПЧ) (включая семейство Papillomaviridae, альфа-, бета-, гамма-, дельта-, Mupapillomavirus и неклассифицированные рода Papillomaviridae) являются распространенными возбудителями заболеваний, передающихся половым путем. При анализе данных по последовательностям ДНК было выявлено несколько типов ВПЧ, к настоящему времени известны полные последовательности 96 генотипов ВПЧ. Генотипирование ВПЧ основано на последовательностях ДНК генов L1, Е 6 и Е 7. Различие по последовательности, составляющее 10%, при сравнении с ранее определенными штаммами достаточно для определения нового типа вируса. Гетерогенность группы вирусов папилломы человека в общих чертах описана в работе deVilliers,1989, J. Virology 63:4898-4903, включенной в данное изобретение посредством ссылки. Геномы многочисленных типов ВПЧ были секвенированы и/или описаны. ВПЧ представляют собой ДНК-содержащие опухолевые вирусы, геном которых образован тремя областями: областью ранних генов (Е 1-Е 7), поздних генов (L1 и L2) и регуляторной областью (upperregulatory region, URR) или длинной контролирующей областью (long control region, LCR). В состав URR входят сайты связывания многих репрессоров и активаторов транскрипции, что позволяет предположить,что эта область может играть роль в определении круга хозяев для конкретных типов ВПЧ. При этом Е 1 и Е 2 кодируют белки, которые крайне важны для репликации экстрахромосомной ДНК и завершения жизненного цикла вируса. Е 2 кодирует два белка: один - ингибирующий транскрипцию генов ранней области; а другой - вызывающий усиление транскрипции генов ранней области. Признаком ассоциированной с ВПЧ карциномы шейки матки является утрата экспрессии вирусных белков Е 2. Недавно был описан новый белок Е 2, состоящий из продукта небольшой ОРС Е 8 и части белка Е 2. Этот белок способен подавлять как репликацию, так и транскрипцию вируса, и поэтому считается, что он играет основную роль в латентности вируса. Белок Е 4 экспрессируется на поздних этапах инфекции, когда происходит сборка полных вирионов,и не известно, обладает ли этот белок трансформирующими свойствами; тем не менее, считается, что этот белок играет важную роль в созревании и репликации вируса. Белок Е 4 также индуцирует разрушение цитоплазматической цитокератиновой сети в кератиноцитах человека, состояние, которое может способствовать высвобождению вирионов из инфицированной клетки. В то же время в клетках карциномы шейки матки открытая рамка считывания (ОРС) Е 5 часто делетирована, что указывает на то, что она не является необходимой для поддержания злокачественной-1 014648 трансформации клетки-хозяина. В случае присутствия Е 5, он взаимодействует с различными трансмембранными белками, такими как рецепторы эпидермального фактора роста, тромбоцитарного фактора ростаи колониестимулирующего фактора. Исследование с использованием клеток, инфицированных ВПЧ-16, показали, что белок Е 5 обладает слабой трансформирующей активностью. Считается, что при канцерогенезе ОРС Е 6 и Е 7 играют наиболее важную роль. Эти два гена кодируют онкобелки, которые обеспечивают репликацию вируса, а также иммортализацию и трансформацию клеток, содержащих ДНК ВПЧ. Поздние гены L1 и L2 кодируют белки капсида вируса на поздних стадиях сборки вириона. Белок,кодируемый L1, является высококонсервативным среди различных видов вирусов папилломы. Минорный белок капсида, кодируемый L2, имеет большую вариабельность последовательностей, чем белок L1. ВПЧ могут инфицировать базальные клетки эпителия кожи или внутренних тканевых выстилок, и,таким образом, их относят либо к кожному типу, либо к типу, поражающему слизистые оболочки (аногенитальному). В доброкачественных предшествующих повреждениях шейки матки ДНК ВПЧ представляет собой либо экстрахромосомный или эписомный материал. Однако во многих цервикальных раковых клетках, а также в клеточных линиях рака шейки матки и трансформированных ВПЧ кератиноцитах человека invitro ДНК ВПЧ интегрируется в геном хозяина. Раковые ткани могут одновременно содержать как эписомные, так и интегрировавшиеся молекулы ДНК вируса папилломы человека, хотя интеграция, видимо, происходит более часто в случае рака шейки матки, ассоциированного с ВПЧ-18, чем в случае рака шейки матки, ассоциированного с ВПЧ-16. Интегрированный ВПЧ-16 присутствует в некоторых предраковых повреждениях, но не всегда присутствует в карциномах. В ходе интеграции ДНК ВПЧ обычно происходит разрыв вирусной ДНК в области Е 1/Е 2. Разрыв обычно приводит к потере областей Е 1 и Е 2. Известно, что потеря Е 2, кодирующего белки, в том числе белок, ингибирующий транскрипцию областей Е 6 и Е 7, приводит к неконтролируемой и повышенной экспрессии онкогенных белков Е 6 и Е 7. В то же время повышение уровня экспрессии Е 6 и Е 7 приводит к злокачественной трансформации клеток-хозяев и формированию опухоли. Интеграция вируса ВПЧ в геномную ДНК хозяина ассоциирована с переходом из поликлонального в моноклональное состояние цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН), и эти события играют фундаментальную роль в прогрессии цервикальной неоплазии из легкой формы в тяжелую форму. Характер нарушений копийности (НК) ДНК является показателем степени цервикального сквамозного интраэпителиального повреждения (СИП), статуса вируса папилломы человека (ВПЧ) и послеоперационного рецидива. В то время как некоторые НК наблюдали с близкой частотой при тяжелой форме СИП и легкой форме СИП, другие, в том числе увеличение количества 1q, 3q и 16q, часто обнаруживали при тяжелой форме СИП, но не при легкой форме СИП. Значительно больше НК на случай наблюдали при тяжелой форме СИП с потерей гена ВПЧ-16 Е 2 и при тяжелой форме СИП с последующими рецидивами, эти данные согласуются с последовательным накоплением НК при прогрессировании цервикального СИП. Более высокая частота НК наряду с потерей гена Е 2 является полученным in vitro свидетельством того, что высокий риск интеграции ВПЧ связан с нестабильностью генома. На основании доступных молекулярных, клинических и эпидемиологических данных одну подгруппу ВПЧ однозначно определяют как агенты, вызывающие развитие рака шейки матки и предшествующих ему состояний. ВПЧ выявляют примерно в 90% случаях аденокарциномы шейки матки и плоскоклеточной карциномы. Большинство инфекций ВПЧ устраняются спонтанно, однако персистирующая инфекция нуклеиновой кислотой ВПЧ обнаружена в метастазах, образующихся из опухолей шейки матки. Тем не менее, известные типы ВПЧ с высоким риском (или онкогенные) представляют собой значительный фактор риска развития рака шейки матки, и все в большей степени признается их роль при развитии других форм рака. Практически во всех типах рака шейки матки (99%) присутствуют гены ВПЧ с высоким риском, причем наиболее часто встречаются типы 16, 18, 31 и 45. Другие типы с высоким риском включают типы 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 и 73. ВПЧ-31, 33, 35, 51 и 52 иногда рассматривают как типы с "промежуточным риском", поскольку они чаще встречаются при диспластических повреждениях умеренной или тяжелой формы, чем при карциномах. Среди штаммов с высоким риском с цервикальной карциномой наиболее тесно ассоциированы ВПЧ-16 и 18. ДНК ВПЧ-16 обнаружена более чем в 50% плоскоклеточных карцином, а ДНК ВПЧ-18 обнаружена более чем в 50% аденокарцином. Тем не менее, онкогенным потенциалом обладает большинство аногенитальных ВПЧ. Взаимодействие ВПЧ с клетками-хозяевами имеет два основных биологических следствия. а) Все аногенитальные ВПЧ индуцируют сквамозные повреждения легкой формы, которые являются морфологическим явлением, коррелирующим с продуктивной инфекцией и фенотипами иммортализации, обусловленных нормальной экспрессией Е 6, Е 7. Иммортализация представляет собой характерную для вирусов папилломы стратегию мобилизации ресурсов для репликации ДНК и производства нового потомства. б) В редких случаях ВПЧ стимулируют фенотип, связанный с пролиферацией эпителия, признаком которого является повреждение тяжелой формы, и который является непосредственным цитогистологическим предшественником инвазивной карциномы шейки матки, которая может включать неконтроли-2 014648 руемую экспрессию Е 6, Е 7. В настоящее время клинические заболевания ассоциированы с инфекциями ВПЧ, а потенциальная область применения способов детектирования и типирования ВПЧ включает остроконечную кондилому,склерозирующий лишай, плоскоклеточную гиперплазию, интраэпителиальную неоплазию вульвы, плоскоклеточную карциному, цервикальную интраэпителиальную неоплазию, карценому шейки матки (цервикальную карциному), аденокарциному шейки матки, анальную интраэпителиальную неоплазию, интраэпителиальную неоплазию полового члена, аденокарциному гортани, рецидивирующий респираторный папилломатоз и бородавчатую эпидермодисплазию. Последние данные позволяют предположить,что ВПЧ может также играть роль в развитии рака простаты у мужчин. Повреждения, предшествующие раку шейки матки (интраэпителиальные повреждения), или цитологические аномалии исследуют методом окрашивания по Папаниколау, известного как мазок Папаниколау, по имени изобретателя Джорджа Папаниколау. Методика включает приготовление мазка из соскоба шейки матки на предметном стекле и окрашивание клеток, полученных из аногенитального тракта гематоксилином, красителем ядер. Недостаток мазка Папаниколау состоит в отсутствии воспроизводимости, а также он не в достаточной степени предсказывает угрозу развития индуцированных ВПЧ неоплазий. Показано, что 25% пациентов с запущенной карциномой in situ могут иметь нормальный мазок Папаниколау за несколько лет до постановки диагноза, или последний отрицательный результат цитологического анализа является постоянно положительным у пациентов с раком шейки матки при повторном исследовании. Получающей все большее распространение проблемой является возникновение инвазивного рака в период до 3 лет с момента отрицательного результата мазка Папаниколау. В настоящее время приемлемая доля ложноотрицательных ответов (т.е. женщин, у которых действительно имеется дисплазия согласно заключениям экспертов-патологов, анализирующим биоптаты ткани, а не образцы мазков, у которых, тем не менее, данное заболевание не было выявлено при стандартном исследовании мазка) составляет примерно 5-10%, но результаты последних исследований свидетельствуют о том, что фактический показатель может быть значительно выше. Кроме того, приблизительно в 7-8% случаев мазок Папаниколау демонстрирует атипичные сквамозные клетки неясного значения (атипические клетки плоского эпителия неопределенного значения). Еще в 20-30% случаев мазок Папаниколау сложно интерпретировать из-за присутствия воспалительных клеток. В случае шейки матки плоские бородавки (выявляемые при кольпоскопии) представляют собой предполагаемые предраковые повреждения. Хорошо описано гистопатологическое развитие плоских бородавок в карциному in situ и рак шейки матки. Интраэпителиальные повреждения представляют собой обычные ранние явления у женщин со случаями инфекции ВПЧ, и интервал между инфицированием ВПЧ-16 или ВПЧ-18 и подтвержденной биопсией ЦИН 2-3 степени, по-видимому, является относительно коротким. Однако исследования показали,что инфицирование типами ВПЧ с высоким риском, как правило, является временным. Персистенция инфекции ВПЧ в значительной степени увеличивает риск прогрессирования в тяжелую форму интраэпителиального повреждения и инвазивного заболевания. Прогрессирование заболевания может меняться в зависимости от потери или персистенции ВПЧ. Значительное число диспластических повреждений регрессирует спонтанно, другие не прогрессируют, а небольшое число быстро прогрессирует. Преимущественная роль генотипов с высоким риском в развитии рака шейки матки и различия в последствиях и признаках других патологических состояний, связанных с разными типами ВПЧ, определяют высокую значимость как идентификация, так и типирование ВПЧ. Кроме того, различные типы ВПЧ с высоким риском обуславливают различную степень риска для пораженных индивидов. Например,ВПЧ-16 и ВПЧ-18 выявляют при более тяжелых формах цервикальной дисплазии и карциномы, чаще,чем другие типы ВПЧ. ВПЧ-16 также в большей степени преобладает в случаях плоскоклеточной карциномы, а ВПЧ-18 преобладает в случаях аденокарциномы. Диагностика ВПЧ Начиная с 1980 года были клонированы геномы нескольких вирусов, которые использовали в диагностике ВПЧ в качестве зондов, специфичных в отношении конкретных типов. Для обнаружения ДНК ВПЧ в соскобах из шейки матки, взятых параллельно с образцами для стандартного цитологического анализа, применяли методику гибридизации на фильтрах. ДНК-зонды ВПЧ применяли в различных способах анализа, основанных на гибридизации, таких как Саузерн-анализ и гибридный дот-/Саузернанализ, для детекции ДНК ВПЧ в полученных из клиник образцах ткани. Кроме того, продемонстрировали гибридизацию очищенной ДНК из биоптатов и гибридизацию in situ в фиксированных образцах ткани, т.е. непосредственную локализацию в интактной клетке последовательностей, комплементарных зондам нуклеиновых кислот. Описан способ детектирования типов ДНК ВПЧ с применением процедуры обратного блоттинга. Процедура включает получение мембраны, с которой связана геномная ДНК четырех различных типов ВПЧ, и последующую гибридизацию меченой ДНК из биологического образца с ДНК, связанной с мембраной. Были разработаны различные способы детектирования типов вирусов папилломы человека с при-3 014648 менением реакций, специфичных в отношении конкретных типов, позволяющие детектировать один тип ВПЧ за один раз. Для амплификации и детектирования ДНК ВПЧ-16 и ВПЧ-18 применяли полимеразную цепную реакцию (ПЦР), в частности, для детектирования ВПЧ-16 в биоптатах из ротовой полости и шейки матки. Описана комбинация праймеров для специфической амплификации методом ПЦР последовательностей ВПЧ типов 1 а, 5, 6 а, 8, 11, 16, 18 и 33. В патентах США 4683195 и 4683202 описана ПЦР и применение ПЦР для выявления наличия или отсутствия последовательности нуклеиновой кислоты в образце. В патенте США 5447839, включенном в данное изобретение посредством ссылки, описан способ детектирования и типирования ВПЧ. В этом способе последовательности ДНК ВПЧ в образце амплифицируют путем ПЦР с применением консенсусных праймеров, амплифицирующих как онкогенные, так и неонкогенные типы ВПЧ. Таким образом, о наличии ВПЧ в образце свидетельствует образование продуктов амплификации. Затем проводят типирование ВПЧ с применением специфичных к конкретным типам (типоспецифичных) ДНК-зондов, гибридизующихся с амплифицированным участком ДНК. Зонды, специфичные к конкретным типам, описанные в данном изобретении, позволяют идентифицировать и различать 5 известных онкогенных типов ВПЧ, а именно ВПЧ-6, ВПЧ-11, ВПЧ-16, ВПЧ-18 и ВПЧ-33. Разработан ряд способов детектирования типов ВПЧ с высоким риском. Многие из них основаны на детектировании уникальных последовательностей в геноме ВПЧ. Например, в данной области описаны ДНК- или РНК-зонды, комплементарные части генов некоторых штаммов ВПЧ с высоким риском, которые можно применять для скрининга на присутствие конкретного штамма ВПЧ с высоким риском в образцах, взятых у пациентов (патент США 4849332, включенный в данное изобретение посредством ссылки). В патенте США 5705627, включенном в данное изобретение посредством ссылки, описано применение ПЦР для амплификации и детектирования ДНК ВПЧ с применением вырожденных праймеров или смеси консенсусных праймеров с последующим типированием с применением смеси генотипспецифических ДНК-зондов. Другие примеры применения консенсусных праймеров можно найти в патенте США 5364758 и в работе Kleter, В. et al., Am. J. of Pathology, vol. 153, No. 6, 1731-39 (1998). Эти источники также включены в данное изобретение посредством ссылок. Существует доступный коммерчески способ, основанный на гибридизации и усилении сигнала.(Hybrid Capture II, Digene Corp.) Однако, как сообщалось, для данного способа характерны проблемы со специфичностью вследствие высокой гомологии последовательностей некоторой части генома ВПЧ. Способы, основанные на амплификации, включают часть, ответственную за чувствительность (амплификацию), которая отделена от частей, ответственных за специфичность (детекция путем гибридизации). Эти методики различаются по амплифицируемым участкам генома, числу праймеров и способам детектирования. Наиболее часто применяют способы амплификации GP5+-GP6+ (общий праймер - GP),MY9-MY11, PGMY, SPF, L1C и типоспецифичные ПЦР. Наиболее часто применяемыми методиками детектирования являются гибридизация, специфичная в отношении последовательности, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и обратная гибридизация с типоспецифичными зондами (lineprobe assay, LiPA). Иногда, но редко, применяют секвенирование или другие способы. Аналитические свойства амплификации варьируют в широком диапазоне и характеризуются числом генотипов, которые они позволяют амплифицировать, аналитической чувствительностью, специфичностью амплификации/детектирования гентипов, а также различиями в чувствительности для разных генотипов. Детектирование ВПЧ путем ПЦР в реальном времени Вирусная нагрузка для вируса папилломы человека-16 (ВПЧ-16) может являться биомаркером, позволяющим предсказать наличие повреждений шейки матки тяжелой формы. Разработано несколько способов анализа методом ПЦР в реальном времени для точного измерения вирусной нагрузки ВПЧ-16(ВПЧ-16 L1, ВПЧ-16 Е 6 и ВПЧ-16 Е 6 PG). Эти методы позволяют осуществлять детектирование ВПЧ в реальном времени, но при этом за один раз можно осуществить детектирование только одного генотипа. Идентификация ДНК ВПЧ у пациентов с юношеским рецидивирующим респираторным папилломатозом проводили методом ПЦР в реальном времени с красителем SYBR Green. Способ, применяемый для обнаружения различных генотипов вируса папилломы человека, представляет собой ПЦР в реальном времени. Однако этот способ амплификации отличается от способа, описанного в настоящем изобретении. Образующийся ампликон имеет большую длину (около 450 по), чем принятая в данной области длина для способа амплификации в режиме реального времени, основанного на зондах. Предпочтительная длина составляет 150 по или менее. Способ детектирования является аспецифичным и не позволяет достоверно различать генотипы, что требует последующего типирования вирусов с применением ПЦР в реальном времени с типоспецифическими праймерами для типов ВПЧ-6, 11, 16, 18, 31 и 33. Это способ также позволяет выявить типы вируса папилломы человека в изолятах, но только по одному генотипу за реакцию. Аналогично, другие исследователи применяли метод, в котором применяли ПСР с двумя парами праймеров в одной пробирке (single-tube nested) для общего детектирования генотипов вируса папилломы человека. Однако специфическая детекция групп не была описана. Другой способ применяли для детектирования ДНК вируса папилломы человека у половых партне-4 014648 ров: также с применением двухэтапного подхода для оценки как генотипов, так и вирусной нагрузки. В данном методе применяют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) GP5+/6+ с последующим анализом методом обратного блота. Этот метод применяли для детектирования 45 типов ВПЧ в образцах соскобов шейки матки и пениса. Затем определяли вирусную нагрузку в образцах соскобов с положительным результатом для типов ВПЧ-16, 18, 31 и 33 при помощи ПЦР в реальном времени в системе LightCycler. При ПЦР GP5+/GP6+ размер ампликона составляет 150 по, что делает возможным применение способов детектирования в реальном времени с применением зондов. Однако данный способ не позволяет выявлять множество генотипов или групп в одной реакции. Был разработан способ гомогенного детектирования в реальном времени и количественной оценки амплификации нуклеиновых кислот с помощью расщепления ферментами рестрикции. В такой гомогенной системе детектирование обеспечивает праймер, содержащий репортерный элемент и элементгаситель на 5'-конце, разделенные коротким участком ДНК, кодирующим последовательность, узнаваемую ферментом рестрикции. В одноцепочечной форме происходит "гашение" сигнала от флуоресцентного репортера вследствие резонансного переноса энергии флуоресценции (fluorescence resonance energytransfer, FRET). Однако когда праймер встраивается в двухцепочечный ампликон, фермент рестрикции,присутствующий в реакционной смеси, разрезает ДНК, соединяющую репортер и гаситель, что обеспечивает неограниченную флуоресценцию репортера. Данная система была протестирована с применением праймера, специфичного в отношении гена Е 6 вируса папилломы человека (ВПЧ) 16, объединенного с расщепляемой меткой, опосредующей перенос энергии, и использована для амплификации ВПЧ-16 положительной ДНК. Данный способ не позволяет выявлять множество генотипов или групп. Также описана система, основанная на ПЦР в реальном времени, для одновременной количественной оценки типов вирусов папилломы человека, ассоциированных с высоким риском рака шейки матки. Был разработан метод анализа с применением ПЦР в реальном времени для детектирования и количественной оценки ВПЧ-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58 и 67. Этот способ анализа основан на трех параллельных ПЦР в реальном времени с каждым образцом, взятым у пациента:(i) реакция 1 позволяет выявить и определить количественно ВПЧ-16, 31, 18 и 45 (ВПЧ-18 и 45 были выявлены и их количество определено вместе с применением одного зонда) с тремя различными флуорофорами;(ii) реакция 2 позволяет выявить и определить количество ВПЧ-33, 35, 39, 52, 58 и 67 (ВПЧ-33, 52,58 и 67 были выявлены и их количество определено вместе), также с применением трех различных флуорофоров и только трех различных зондов; и(iii) реакция 3 позволяет выявить и определить количество однокопийного гена человека (HMBS,гидроксиметилбилан-синтазу Homo sapiens; номер доступа в GenBank M95623.1). Реакция 1 включает в общей сложности семь праймеров для ПЦР и три зонда, реакция 2 включает в общей сложности семь праймеров для ПЦР и три зонда, и реакция 3 включает два праймера для ПЦР и один зонд. В данном способе применяют гидролизуемые зонды TaqMan для ПЦР в реальном времени. Описано применение лишь трех зондов в одной реакции, позволяющее обнаружить максимум 6 генотипов в этой реакции. Данный способ нельзя использовать в качестве общего подхода для разработки реакций, позволяющих детектировать множество генотипов ВПЧ, поскольку идентичность последовательностей между генотипами ограничена. Масштабирование реакции ограничено применением идентичности между последовательностями различных генотипов. Ранее был разработан способ детектирования и определения количества онкогенных вирусов папилломы человека (ВПЧ) путем флуоресцентного анализа с применением 5' экзонуклеазы. Этот способ основан на амплификации фрагмента длиной 180 по с 3'концевого участка открытой рамки считывания Е 1 в одной ПЦР с типоспецифичными зондами для ВПЧ 16, 18, 31, 33 и 35. Зонды можно применять по отдельности или в комбинации до трех зондов на анализ. Ограничение применения способа: три зонда на один анализ. Также был описан подход к детектированию и генотипированию вируса папилломы человека с помощью полимеразной цепной реакции с применением SybrGreen и "молекулярных маяков" (molecularbeacon). Данный способ анализа позволяет осуществить общее детектирование ВПЧ путем выявления амплифицированных участков ДНК ВПЧ с помощью SybrGreen, и генотипирование семи наиболее распространенных типов ВПЧ (ВПЧ-6, 11, 16, 18, 31, 33, 45) методом ПЦР в реальном времени с применением молекулярных маяков. В двухэтапном способе применяют три различным образом меченных молекулярных маяка в одной ПЦР. Также описан другой способ: вырожденный флуоресцентный праймер, содержащий комплементарные участки ВПЧ, известный как Scorpion, и смесь "скорпионов" применяли вместе с общим праймером с дополнительной концевой последовательностью. Праймер с дополнительной концевой позволяет ввести консенсусный сайт, который позволяет одному "скорпиону" узнавать множество различных ампликонов ВПЧ. Эта двухэтапная процедура теоретически позволяет выявить более 40 различных типов ВПЧ. В данном исследовании применяли 10 праймеров для типирования (ВПЧ-6, 11, 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51,56). Последовательность каждого праймера Scorpion является типоспецифичной и расположена в том же положении последовательности, что и в праймере GP6+ (Jacobs et al.). Данный способ обеспечивает общий подход к выявлению присутствия ВПЧ (детектированию) и способ типоспецифического детектиро-5 014648 вания для типирования образцов, давших положительный результат. Он не решает проблему скрининга с мультиплексными зондами, в результате которой возникает перекрестная реактивность зондов. Фактически, в этом методе не применяют многочисленные зонды в одной реакции. Было проведено сравнение способов детектирования ВПЧ, основанных на ПЦР в реальном времени, в которых применяют системы анализа в реальном времени LightCycler и TaqMan, с традиционными ПЦР с GP5+/6+/иммуноферментный анализ (ИФА) по оценке вирусной нагрузки для вируса папилломы человека в образцах соскобов из шейки матки. Оба варианта анализа методом ПЦР в реальном времени показали близкие результаты при определении нагрузки ВПЧ-16 в соскобах, но при этом наблюдали плохое соответствие результатов этих методов анализа с GP5+/6+ ПЦР/ИФА, что свидетельствует о том, что последний способ не подходит для определения количества ДНК ВПЧ. Значения вирусной нагрузки для ВПЧ-6/11 и ВПЧ-16/18 определяли также путем флуорогенной количественной ПЦР в реальном времени, выявляющей два типа генов ВПЧ за одну реакцию. Способы конструирования консенсусных праймеров Праймеры и зонды, применяемые для детектирования только одной молекулы нуклеиновой кислоты вируса папилломы человека, например молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей часть L1, можно сконструировать, например, с помощью компьютерной программы, такой как, например, OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Колорадо, США) или Primer3. Соответствующие характеристики таких олигонуклеотидов хорошо известны специалистам в данной области. Существует большое количество литературных данных, касающихся общих принципов конструирования праймеров для ПЦР, которые легли в основу различных программных приложений, из которых наиболее известны Primer3 и различные варианты этой программы. Также были разработаны быстрые решения на основе динамического программирования для проверки пар праймеров на совместимость. В ходе последнего десятилетия имел место устойчивый рост применения мультиплексной ПЦР, что требует усложнения протоколов выбора праймеров. Различные алгоритмы могут облегчать решение конкретных задач или они могут быть разработаны для конкретных технологических платформ. В целом, было показано, что проблема выявления пар праймеров для увеличения уровня мультиплексирования для одного исследования является до предела НП-полной. Был создан алгоритм аппроксимации, не учитывающий 3'-концевую комплементарность оснований, оперирующий с ограничениями по размеру продукта. Способ согласно настоящему изобретению относится к проблеме разработки способов анализа методом мультиплексной ПЦР, в частности к разработке консенсусных праймеров. Общим подходом к этой проблеме является конструирование праймеров для амплификации многочисленных последовательностей-мишеней с числом пар праймеров, меньшим, чем число мишеней. Кроме того, при конструировании необходимо также учитывать принципы мультиплексного ПЦР-анализа, которые можно пояснить на примере консенсусного вируса герпеса. Был разработан частный подход к идентификации генов с низкой степенью родства на основании консенсусно-вырожденных гибридных олигонулеотидных праймеров (consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers, CODEHOP). Короткие участки белков с высоким уровнем консервативности можно представить в виде не содержащих пробелов блоков множественных выровненных последовательностей белков. CODEHOP-праймеры конструируют на основе таких консервативных блоков последовательностей и применяют в ПЦР для амплификации участков между ними. CODEHOP-праймер для ПЦР состоит из набора праймеров, содержащих различные последовательности в 3'-вырожденной коровой области,при этом каждый праймер обеспечивает одну из возможных комбинаций кодонов, кодирующих целевой консервативный мотив из 3-4 аминокислот в пределах блока последовательности. Кроме того, праймеры из этого набора имеют идентичные 5'-концевые консенсусные "удерживающие" (clamp) области, сконструированные из наиболее вероятных нуклеотидов в каждом положении, кодирующих консервативные аминокислоты, фланкирующие целевой мотив. Амплификация начинается с отжига праймера и удлинения праймеров из набора, имеющих наибольшее сходство с целевой матрицей в 3'-концевом вырожденном участке. Присоединение праймера (отжиг) стабилизируют при помощи 5'-концевой консенсусной"удерживающей" последовательности, которая частично совпадает с целевой матрицей. После встраивания такого праймера он становится матрицей в последующих циклах амплификации. Поскольку все праймеры имеют идентичные 5'-концевые консенсусные "удерживающие" области, все они отжигаются в жестких условиях в ходе последующих раундов амплификации. Этот способ применяли, среди прочего,и в области вирусологии. Данный способ отличается от способа согласно настоящему изобретению, в котором для достижения эффективной амплификации родственных последовательностей применяют специфические блоки последовательностей. Программа Codehop находит праймеры для амплификации неизвестных целевых последовательностей, но работает с выровненными последовательностями белков,а не последовательностями ДНК. Существуют многочисленные способы конструирования консенсусных/вырожденных праймеров,но они, как правило, используют различные алгоритмы для решения, по сути, одной и той же задачи: идентификации набора праймеров, наилучшим образом подходящего для эффективной амплификации родственных целевых последовательностей. Взаимодействие между праймерами не учитывается. Другой подход реализован в программе PriFi (http://cgi-www.daimi.au.dk/cgi-chili/PriFi/main). Эта-6 014648 программа позволяет конструировать пары праймеров, которые можно применять для ПЦРамплификации геномной ДНК видов, для которых не доступна предварительная информация о последовательностях. Эта программа работает с выравниванием последовательностей ДНК филогенетически близких видов и выдает список возможных пар вырожденных праймеров, удовлетворяющих ряду критериев, и, таким образом, праймеры с высокой вероятностью амплифицируют ортологичные последовательности другого филогенетически близкого вида. Однако в этой программе не используется принцип взаимодействия между праймерами. Программа Amplicon для конструирования праймеров для ПЦР на основе выровненных групп последовательностей ДНК основана на аналогичном методе. Наиболее важное применение программыAmplicon - конструирование "группоспецифичных" наборов ПЦР-праймеров, амплифицирующих область ДНК данной таксономической группы, которые в то же время не амплифицируют ортологичные области других таксономических групп. В этой программе, опять же, не учтено взаимодействие между праймерами. В литературе не описаны четкие правила конструирования участвующих в реакции амплификации праймеров для детектирования путем "нацеливания" на многочисленные родственные мишени амплификации. Тем не менее, считается, что непредсказуемые взаимодействия между праймерами и конкуренция за ресурсы амплификации снижают чувствительность реакции, и что большее число праймеров увеличивает вероятность неправильного присоединения праймеров с образованием неспецифических продуктов,вступающих в конкуренцию за ресурсы. Потенциальная роль анализа на ВПЧ при скрининге карциномы шейки матки в значительной степени зависит от существующей инфраструктуры. Перед медицинскими учреждениями, в которых действует эффективная организованная программа, основанная на цитологических исследованиях, стоит задача дополнения существующей программы анализом на ВПЧ, в связи с чем возникают вопросы об эффективности затрат, контроле качества и увеличения ценности текущей практики. В противоположность этому, в ситуациях, когда скрининг отсутствует или он не эффективен вследствие низкого качества цитологических исследований или неизбежных ограничений, обусловленных высокой частотой мазков с воспалением, на первый план выступают вопросы чувствительности, специфичности и простоты процедуры исследования. Методика ПЦР в реальном времени обладает характеристиками, которые удовлетворяют и даже превосходят требования обоих описанных выше сценариев. Недавние исследования позволили определить количество ДНК ВПЧ некоторых наиболее распространенных ВПЧ с высоким риском как факторы прогрессии злокачественных образований шейки матки (ЦИН). Диапазон числа копий на клетку не различается для различных типов ВПЧ, но относительный риск ЦИН в процентиле с максимальной вирусной нагрузкой в значительной степени выше для ВПЧ-16 (ОР=36,9; 95% ДИ=8,9-153,2), чем для ВПЧ-31(ОР=3,2; 95% ДИ=1,1-9,1), ОР ВПЧ-18/45 (ОР=2,6; 95% ДИ=1,0-6,4). Таким образом, вирусную нагрузку ВПЧ можно использовать для предсказания риска ЦИН на этапе, когда результаты анализа мазков на аномалии плоского эпителия являются негативными. Методики детектирования в реальном времени позволяет определять вирусную нагрузку с большей точностью, чем существующие способы детектирования ВПЧ. Методика детектирования в реальном времени обладает несколькими преимуществам по сравнению с существующими способами. Однако способы амплификации в реальном времени и детектирования, позволяющие обнаружить более трех типов вируса папилломы человека в одной реакции, еще не разработаны. Кроме того, не были разработаны способы детектирования клинически важных групп вирусов, например групп вирусов папилломы человека с низким риском или высоким риском, в одной реакции. Точный тест на ВПЧ с самостоятельным забором проб пациентом имел бы огромное значение. Такой тест открывает возможности для проведения анализа у женщин, которые в противном случае отказались или были бы не в состоянии пройти обследование таза. В малоразвитых районах данный способ обладал бы преимуществом по сравнению с существующей практикой. В областях, в которых организована система обследования, проведение анализов с самостоятельным забором проб представляет собой дополнительный способ анализа, охватывающий женщин, которые отказываются от стандартного обследования, а также может играть роль при наблюдении или мониторинге после лечения ВПЧположительных женщин с отрицательным результатом цитологического обследования, которым необходимы последующие частые врачебные обследования. Подход, основанный на самостоятельном заборе проб пациентом, с применением удобных для пациента средств проведения анализа, мог бы улучшить качество и доступность программ обследования. Тест на ВПЧ, ориентированный на рынок традиционных исследований и первичного скрининга,должен удовлетворять всем этим потребностям. Для технологического обеспечения данных особенно подходит методика ПЦР в реальном времени. Свойственная данной технологии простота способствует устранению инфраструктурных барьеров, и, кроме того, она является экономически более эффективной,чем другие методики. С другой стороны, технологии ПЦР в реальном времени позволят повысить аналитическую чувствительность и, что более важно, специфичность детектирования ВПЧ, что обеспечивает более прочную основу для улучшения клинических проявлений данных параметров. Применение внут-7 014648 реннего контроля дополнительно обеспечивает контроль качества данной системы. Для применения удобного для пациентов детектирования ВПЧ наиболее целесообразным выбором являются технологии исследований в реальном времени. Создание удобных для пациента способов анализа становится новым рубежом первичного скрининга, и технологии в реальном времени уже привлекли значительное внимание в данной области в случае других патогенов и могут обеспечить дополнительную практическую пользу. Повышенная по сравнению с другими способами чувствительность ПЦР в реальном времени, а также улучшенные характеристики, обеспечиваемые ПЦР в реальном времени, включая обеспечение безопасности при работе с образцами и детектирование амплифицированного продукта в реальном времени, определяют возможность реализации данной технологии в рутинной диагностике папилломавирусных инфекции в клинической лаборатории. В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ выявления присутствия (детектирования) по меньшей мере одного патогена, включающий приведение нуклеиновой кислоты, извлеченной из образца, в контакт с набором, включающим по меньшей мере четыре зонда, при этом каждый из указанных зондов содержит последовательность, комплементарную последовательности патогена, фланкированную четырьмя или пятью парами комплементарных оснований, при этом указанные основания в отсутствие гибридизации с нуклеиновой кислотой патогена образуют "стеблевую" структуру, и где указанный зонд помечен первой меткой и второй меткой, что обеспечивает изменение детектируемого сигнала при гибридизации указанного зонда с нуклеиновой кислотой патогена. В данном изобретении термин "нуклеиновая кислота" относится к ДНК и РНК в различных формах,таких как мРНК и гяРНК. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной. В данном изобретении термин "патоген" относится к биологическому агенту, нарушающему нормальную физиологию животного, который вызывает болезнь или заболевание, либо ассоциирован с болезнью и заболеванием. Патоген может являться причиной возникновения болезни, т.е. инфицирование пациента патогеном вызывает болезнь, либо самостоятельно, либо в присутствии одного или более кофакторов. Предпочтительно патоген представляет собой организм, ассоциированный с заболеванием, передающимся половым путем. В данном изобретении термин "организм, ассоциированный с заболеванием,передающимся половым путем" относится к организму, присутствующему в организме пациентов, страдающих заболеванием, передающимся половым путем. Примеры организмов, ассоциированных с заболеванием, передающимся половым путем, включают Chlamydia trachomatis, ассоциированную с хламидиозом, Neisseria gonorrhoeae, ассоциированную с гонореей, вирус простого герпеса, ассоциированный с генитальным герпесом, вирус папилломы человека, ассоциированный с остроконечной кондиломой, иTreponema pallidum, ассоциированную с сифилисом. Организм предпочтительно представляет собой вирус, более предпочтительно вирус папилломы человека (ВПЧ). Способ предпочтительно применяют для выявления присутствия одного или более генотипа ВПЧ. Хотя способ согласно настоящему изобретению относится к детектированию патогена, этот способ можно также применять для выявления присутствия или отсутствия любого организма, в частности организмов, включающих более одного подвида или родственных организмов. В данном изобретении термин "родственные организмы" относится к организмам из одного класса, рода или вида, имеющим высокий уровень генетического сходства, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичность, более предпочтительно 90% идентичность. Родственные организмы предпочтительно представляют собой вирусы, более предпочтительно вирусы папилломы человека. Каждый зонд предпочтительно имеет общую структуру 3' - "стебель" - F-последовательность, комплементарная ВПЧ - F' - "стебель'" - 5'F и F' представляют собой необязательные линкерные последовательности, соединяющие комплементарные последовательности с фланкирующими парами оснований, "стебель" и "стебель'". "Стебель" и"стебель'" представляют собой последовательности, образованные комплементарными парами оснований, формирующие двухцепочечную "стеблевую" структуру в растворе. Эти последовательности предпочтительно являются палиндромными. Предпочтительно на каждом конце зонда присутствуют 4 основания. Основания, образующие структуру "стебля", предпочтительно включают пары C-G, предпочтительно 1, 2, 3, 4 или 5 пары C-G. "Стебель" предпочтительно имеет последовательность CGCG. В экспериментах, проведенных авторами изобретения, было показано, что молекулярные "маяки" со "стеблем" из четырех-пяти пар оснований не взаимодействуют друг с другом с образованием непредсказуемых ложных сигналов амплификации в ходе реакции при отсутствии детектируемой ДНК-мишени,что, как представляется, обусловлено двумя состояниями "стеблевой" структуры. В некоторых случаях для оптимизации реакции необходимо применять молекулярные маяки с пятью парами оснований. Маяки с более длинными "стеблевыми" участками при одиночном и мультиплексном детектирования вызывают появление неконтролируемых ложных сигналов амплификации. Маяки с более короткими "стеблевыми" участками, как правило, имеют слишком низкую для применения в реакции детектирования в реальном времени температуру плавления. Термин "взаимодействующая метка" в данном изобретении относится к одной из пары меток, которая взаимодействует с другой меткой из пары. Такое взаимодействие происходит, когда метки находятся-8 014648 в непосредственной близости друг от друга, например когда зонды имеют структуру "петли на стебле". При гибридизации зонда с комплементарной нуклеиновой кислотой взаимодействие между метками ослабевает или полностью исчезает, по мере того как расстояние между ними увеличивается. Метки присоединены к каждому концу зонда, предпочтительно к комплементарным основаниям, формирующим структуру "петли на стебле", или в соседнем положении. Не существенно, к каким именно основаниям присоединены метки, при условии, что при изменении одной конформации зонда на другую, т.е. раскрытии "петли со стеблем", можно будет определить изменение сигнала. Изменение сигнала может представлять собой увеличение сигнала в случае, когда зонд находится в раскрытом положении, т.е. гибридизован с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты, например, если одна из взаимодействующих меток гасит сигнал, продуцируемый второй взаимодействующей меткой. Кроме того, изменение сигнала может представлять собой уменьшение сигнала, когда зонд находится в раскрытом положении, когда он гибридизован с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты, например, если первая взаимодействующая метка стимулирует образование сигнала, продуцируемого второй взаимодействующей меткой. В предпочтительном варианте реализации взаимодействующие метки представляют собой донорFRET и соответствующий акцептор FRET. Технология FRET (см., например, патенты США 4996143, 5565322, 5849489 и 6162603) основана на том факте, что при расположении донорной и соответствующей акцепторной флуоресцентной группы на определенном расстоянии друг от друга происходит перенос энергии между двумя флуоресцентными группами, который можно визуализировать или выявить иным способом и/или определить его величину. Вариант технологии FRET, применяемый в настоящем изобретении, задействует технологию молекулярных маяков для выявления присутствия или отсутствия вируса папилломы человека. Технология молекулярных маяков основана на гибридизации зонда, меченного донорной флуоресцентной группой и акцепторной флуоресцентной группой. Флуоресцентные метки обычно расположены по концам зонда. В технологии молекулярных маяков применяют олигонуклеотидные зонды, содержащие последовательности,обеспечивающие формирование вторичной структуры (например, шпильки). Если зонд находится в растворе, то в результате формирования вторичной структуры в пределах зонда обе флуоресцентные группы находятся в пространственной близости. После гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью (т.е. нуклеиновой кислотой генотипа ВПЧ) вторичная структура зонда нарушается, и флуоресцентные группы отдаляются одна от другой, и вследствие этого после возбуждения светом соответствующей длины волны испускания первой флуоресцентной группы отличаются от испускания, наблюдаемого в отсутствие нуклеиновой кислоты ВПЧ конкретного генотипа. В данном патенте термин "соответствующая" в отношении донорной и соответствующей акцепторной флуоресцентных групп относится к акцепторной флуоресцентной группе, имеющей спектр испускания, перекрывающийся со спектром возбуждения донорной флуоресцентной группы. Максимум длины волны спектра испускания акцепторной флуоресцентной группы предпочтительно должен быть по меньшей мере на 100 нм больше, чем максимум длины волны спектра возбуждения донорной флуоресцентной группы. Таким образом, между данными группами возможен эффективный безизлучательный перенос энергии. Флуоресцентные донорные и акцепторные группы обычно выбирают с учетом (а) высокоэффективной передачи энергии Форстера; (б) большого конечного сдвига Стокса (100 нм); (в) сдвига испускания по возможности в красную часть видимого спектра (600 нм) и (г) сдвига эмиссии в более длинноволновую область, по сравнению с рамановским флуоресцентным испусканием воды, индуцируемым возбуждением длиной волны возбуждения донора. Например, донорную флуоресцентную группу можно выбрать таким образом, что максимум ее возбуждения близок к линии излучения лазера (например, гелиево-кадмиевого, 442 нм или аргонового, 488 нм), при высоком коэффициенте экстинкции, высоком квантовом выходе и при значительном перекрывании ее флуоресцентного испускания со спектром возбуждения соответствующей акцепторной флуоресцентной группы. Соответствующую акцепторную флуоресцентную группу можно выбрать таким образом, что она имеет высокий коэффициент экстинкции, высокий квантовый выход, значительное перекрывание спектра ее возбуждения с испусканием донорной флуоресцентной группы и испускание в красной части видимого спектра (600 нм). Типичные донорные флуоресцентные группы, которые можно применять с различными акцепторными флуоресцентными группами в технологии FRET, включают флуоресцин, Lucifer Yellow, Вфикоэритрин, 9-акридинизотиоцианат, Lucifer Yellow VS, 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостилбен-2,2'дисульфокислоту,7-диэтиламино-3-(4'-изотиоцианатофенил)-4-метилкумарин,сукцинимидил 1 пиренбутират, производные 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостилбен-2,2'-дисульфокислоты, факультативно замещенные пирены, антрацены, нафталены, акридины, стильбены, индолы, бензилдоны, оксазолы, бензоксазолы, тиазолы, бензотиазолы, 4-амино-7-нитробенз-2-окса-1,3-диазолы, цианины, карбоцианины,карбостирилы, порфирины, салицилаты, антранилаты, азулены, перилены, пиридины, хинолины, кумарины, полиазаиндацены, ксантены, оксазины, бензоксазины, карбазины, феналеноны, бензфеналеноны,карбазины,4-бора-3a,4 а-диаза-s-индацены,фторфоресцеины,родамины,родолы,5 карбоксифторфоресцеины (FAM), 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфокислоты (EDANS), антрани-9 014648 ламиды, хелаты тербия, реактивный красный 4, техасский красный, красители АТТО, красители EVO,красители DYO, красители Alexa и красители BODIPY. Типичные акцепторные флуоресцентные группы в зависимости от применяемой донорной флуоресцентной группы включают LC.TM.-RED 640 (LightCycler.TM.-Red 640-N-гидроксисукцинимидэфир),LC.TM.-RED 705 (LightCycler.TM.-Red 705-фосфорамидит), цианиновые красители, такие как CY5 иCY5.5, Лиссамин родамин В сульфонилхлорид, тетраметилродаминизотиоцианат, родамин х изотиоцианат, эритрозинизотиоцианат, флуоресцеин, диэтилентриаминпентаацетат или другие хелаты лантаноидных ионов (например, европий или тербий). Донорные и акцепторные флуоресцентные группы можно приобрести, например, в Molecular Probes (Junction City, Oreg.) или Sigma Chemical Co. (St. Louis, Миссури, США). Предпочтительно акцепторная флуоресцентная группа представляет собой гаситель. В данном изобретении гаситель представляет собой группу, которая уменьшает флуоресценцию, испускаемую флуоресцентной меткой. Такое уменьшение включает полное и частичное подавление испускания флуоресценции. Степень подавления не играет существенной роли, если изменение флуоресценции при удалении гасителя поддается обнаружению. Группу гасителя предпочтительно выбирают из группы, включающей возможно замещенные фенилы, нафтилы, антраценилы, бензотиазолы, бензоксазолы или бензимидазолы, пирены, антрацены, нафталены, акридины, стилбены, индолы, бензиндолы, оксазолы, бензоксазолы, тиазолы, бензотиазолы, 4 амино-7-нитробенз-2-окса-1,3-диазолы, цианины, карбоцианины, карбостирилы, порфирины, салицилаты, антранилаты, азулены, перилены, пиридины, хинолины, кумарины, полиазаиндацены, ксантены,: оксазины, бензоксазины, карбазины, феналеноны, бензфеналеноны, оксазины, 4-бора-3a,4 а-диаза-sиндацены, фторфоресцеины, родамины, родолы, 5-карбоксифторфоресцеины (FAM), 5-(2'аминоэтил)аминонафтален-1-сульфокислоты (EDANS), антраниламиды, хелаты тербия, реактивный красный 4, дабцилы, нитротирозины, малахитовый зелный, техасский красный, динитробензены, красители АТТО, красители EVO, красители DYO, красители Alexa и красители BODIPY. Выбор подходящих пар доноров и акцепторов или гасителей для FRET находится в пределах компетенции специалиста в данной области. Как правило, обнаружение FRET в количестве, достоверно отличающемся от количества FRET в образце, в котором отсутствует молекула нуклеиновой кислоты вируса папилломы человека, указывает на наличие заражения вирусом папилломы человека у индивида. Гибридизация зонда с нуклеиновой кислотой приводит к увеличению расстояния между донорной и акцепторной группами, и, таким образом,FRET-взаимодействие ослабляется. Изменение испускания детектируемой длины волны может представлять собой увеличение испускания или изменение длины волны испускания, как, например, при применении гасителя. Кроме того, может наблюдаться уменьшение испускания или изменение длины волны испускания при применении акцептора, не вызывающего "гашение" донора. Флуоресцентный анализ можно проводить с применением, например, системы счета фотонов на основе эпифлуоресцентного микроскопа (содержащего подходящие дихроичные зеркала и фильтры для контроля испускания флуоресценции в определенном диапазоне), системы счета фотонов на основе фотоумножителя или флуориметр. Возбуждение, необходимое для инициации передачи энергии, можно осуществить с применением аргонового ионного лазера, ртутной (Hg) дуговой лампы высокой интенсивности, оптоволоконного источника света или другого источника света высокой интенсивности с использованием соответствующих фильтров для возбуждения в желаемом диапазоне. Донорные и акцепторные флуоресцентные группы предпочтительно присоединяют к зондам через линкерные последовательности. Донорные и акцепторные флуоресцентные группы можно присоединять к соответствующему олигонуклеотидному зонду через линкерное "плечо". Длина каждого линкерного"плеча" также важна, поскольку линкерные "плечи" влияют на расстояние между донорной флуоресцентной группой и акцепторной флуоресцентной группой. Длина линкерного "плеча" для задач настоящего изобретения измеряется в ангстремах от нуклеотидного основания до флуоресцентной группы. Как правило, длина линкерного "плеча" составляет от примерно 10 до примерно 25 ангстрем. Линкерное"плечо" может быть таким, как описано в WO 84/03285. В WO 84/03285 также описаны способы присоединения линкерного "плеча" к конкретным нуклеотидным основаниям, а также способы присоединения флуоресцентных групп к линкерному "плечу". Чтобы обеспечить возможность гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой одного или более патогена или организма, ассоциированного с заболеванием, передающимся половым путем, в подходящих условиях, зонд должен иметь значительную степень идентичности с нуклеиновой кислотой патогена или организма, ассоциированного с заболеванием, передающимся половым путем. Говорят, что одна одноцепочечная нуклеиновая кислота гибридизуется с другой, если они образуют дуплекс. Образование дуплекса происходит, если одна нуклеиновая кислота содержит последовательность, обратную или комплементарную по отношению к другой (аналогичный механизм определяет природные взаимодействия между смысловой и антисмысловой цепями ДНК в геноме и лежит в основе образования двойной спирали). Для формирования дуплекса не требуется полной комплементарности между гибридизующимися областями, необходимо только, чтобы количество спаренных оснований было достаточным для поддержания- 10014648 структуры дуплекса при применяемых условиях гибридизации. Часто желательно наличие одного или более несовпадения между последовательностью зонда и соответствующим участком генома патогена. Наличие несовпадения необходимо для предотвращения образования нежелательных вторичных структур в пределах зонда. Таким образом, в одном предпочтительном варианте реализации уникальная для патогена последовательность в пределах зонда содержит по меньшей мере одно несовпадение с последовательностью генома патогена. Подходящие условия гибридизации хорошо известны специалисту в данной области. Например,0,2SSC/0,1% SDS при 42 С (для условий умеренной жесткости) и 0,1SSC при 68 С (для условий высокой жесткости). Отмывку можно проводить с применением только одного из представленных вариантов условий, либо можно применять каждый из вариантов условий (например, по 10-15 мин каждого варианта отмывок в указанном выше порядке). Любой или все варианты отмывки можно повторять. Оптимальные условия могут быть различными, специалисту в данной области не составит труда их установить. Степень идентичности между нуклеиновой кислотой зонда и патогена может варьировать в зависимости от назначения зонда. Например, зонд можно применять для идентификации наличия всех подвидов патогена, например всех генотипов ВПЧ, в этом случае зонд должен включать последовательность,которая будет гибридизоваться с последовательностью участка нуклеиновой кислоты, который является высококонсервативным у всех подвидов, например всех генотипов ВПЧ. Зонд можно применять для выявления присутствия патогенов, например генотипов ВПЧ определенной группы риска, например, генотипов с высоким риском или низким риском или других. Последовательность зонда можно сконструировать соответствующим образом. Например, можно сконструировать зонд для детектирования генотипов с высоким риском, который может связываться с нуклеиновыми кислотами типов 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 и 73, но не с нуклеиновыми кислотами других генотипов. Их называют "зонды группы риска". Кроме того, каждый зонд может иметь последовательность, которая имеет высокий уровень сходства с вариабельной областью одного конкретного генотипа, и такой зонд будет гибридизоваться только с нуклеиновой кислотой этого генотипа. Такие зонды называют "генотип-специфичными". Зонды, специфичные в отношении конкретного типа вирусов папилломы человека, могут гибридизоваться в пределах"генотипоспецифичных" областей, предпочтительно включающих SEQ ID NO: 53-103, на амплифицированной ДНК. Зонды, специфичные к генотипам ВПЧ, предпочтительно содержат последовательность,выбранную из SEQ ID NO: 33-52 или SEQ ID NO: 105-117. Эти последовательности составляют всю или часть последовательности, уникальной для патогена. Набор зондов включает по меньшей мере четыре зонда, предпочтительно 5, 10, 15 или 20 различных зондов. Зонды сконструированы таким образом, что последовательность, образующая "петлю" структуры "петли на стебле", не только гибридизуется с желаемой последовательностью нуклеиновой кислоты, которую необходимо детектировать, но также не образует вторичных структур с последовательностями "петель" других зондов. Таким образом, последовательности петлевой части зонда, как правило, представляют собой последовательность, не на 100% комплементарную последовательности в геноме, которую необходимо детектировать. Предпочтительно зонды, специфичные к конкретным типам вируса папилломы человека, могут гибридизоваться в пределах заданных типоспецифичных областей,предпочтительно содержащих SEQ ID NO: 53-103 или SEQ ID NO: 105-117. В одном предпочтительном варианте реализации каждый зонд содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 33-52 илиSEQ ID NO: 105-117. В особенно предпочтительном варианте реализации набор зондов включает Присутствие патогенов конкретной группы риска можно выявить двумя способами. Во-первых,можно применять зонды "группы риска". Предпочтительно набор зондов включает более одного типа зонда, специфичного для группы риска, причем каждый тип метят разными метками. Например, зонд,специфичный для группы с высоким риском, можно отличить от зонда, специфичного для группы с низким риском. Таким образом, можно обнаружить присутствие патогена, такого как ВПЧ любой группы риска. Кроме того, набор зондов может включать генотип-специфичные зонды, при этом все зонды, специфичные для генотипов конкретной группы риска, например, генотипов с высоким риском, помечены одними и теми же взаимодействующими метками. Таким способом нельзя установить идентичность конкретных присутствующих генотипов, но можно подтвердить присутствие генотипа конкретной группы. В предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает определение температуры плавления двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, образованной одним из указанных зондов и комплементарной нуклеиновой кислотой из указанного образца. Поскольку каждый из зондов имеет определенную последовательность нуклеиновой кислоты, температура плавления двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, образованной зондами и комплементарной нуклеиновой кислотой, полученной из указанного образца, уникальна для каждого зонда. Это позволяет детектировать конкретный патоген или генотип, присутствующий в образце. Например, можно применять набор генотипспецифичных для конкретной группы риска, чтобы определить, присутствует ли какой-либо генотип из данной группы в образце. Затем можно определить температуру плавления с целью идентификации конкретных генотипов, присутствующих в образце. Способ детектирования отдельных типов ВПЧ можно осуществлять после описанного способа выявления семейства, рода или групп вируса папилломы человека или параллельно с данным способом для детектирования вирусов папилломы человека. В случае применения более одного зонда такие зонды можно и предпочтительно отличать друг от друга, т.е. при возбуждении определенной длиной волны каждый зонд испускает сигнал, обнаружимо отличающийся от других. Таким образом, при применении двух зондов один из них при гибридизации с нуклеиновой кислотой патогена испускает сигнал на какой-либо длине волны, который можно отличить как от сигнала зонда в растворе (т.е. не вступившего в реакцию гибридизации с нуклеиновой кислотой патогена, такого как генотип ВПЧ), так и от сигнала другого зонда, вступившего в реакцию гибридизации с нуклеиновой кислотой патогена. Это позволяет одновременно визуализировать присутствие обоих зондов, вступивших в реакцию гибридизации с нуклеиновой кислотой. В качестве альтернативы, два зонда метят различными взаимодействующими метками, например донорами FRET, возбуждаемыми при различных длинах волн. Это можно осуществить с применением различных комбинаций взаимодействующих меток, например, доноров и акцепторов FRET. Выбор подходящих комбинаций взаимодействующих меток является рутинной операцией для специалиста в данной области. Способ предпочтительно позволяет выявить присутствие четырех или более патогенов или генотипов с применением четырех или более зондов. Предпочтительно зонды присоединены к твердой подлож- 12014648 ке, и благодаря этому каждый тип зонда занимает пространственно определенное положение, которое отлично от положения других зондов. Это позволяет применять зонды, меченные одними и теми же или аналогичными взаимодействующими метками, создающими сигнал с одинаковыми или близкими длинами волн, и в то же время обеспечивает возможность различать/отличать сигнал, создаваемый каждым зондом. Кроме того, зонды можно пометить таким образом, чтобы каждый тип зонда продуцировал отличный от других сигнал. Как понятно специалисту в данной области, при проведении исследований с помощью чипов применяют разнообразные твердые подложки, и любую из таких подложек можно применять при создании чипов на основе зондов согласно настоящему изобретению. Один предпочтительный вариант реализации обеспечивает способ создания реакционной смеси для детектирования многочисленных родственных молекул-мишеней с применением по меньшей мере четырех молекулярных маяков для исследования в реальном времени в одной реакции. Способ включает выбор сайтов связывания зонда, определение последовательности зондов, удовлетворяющих стандартным критериям для зондов (например, проверка полной комплементарности зондов с помощью компьютерной программы, такой как Primer3) и добавление оснований, предпочтительно четырех или пяти оснований, к последовательности зонда по обоим концам, что делает их комплементарными и способными образовывать двухцепочечные "стебли", состоящие из двух концов одного олигонуклеотида. Такие структуры известны как молекулярные маяки (beacons), содержащие четыре основания в стебле. Кроме того,температура плавления последовательности зонда должна быть выше температуры плавления структуры"стебля" при измерении при близких к равновесным скоростям нагрева и охлаждения. Молекулярные маяки со "стеблем" из четырех оснований, как правило, обладают преимуществами над стеблевыми структурами другой длины, имеющими меньшую скорость "раскрытия/смыкания" по сравнению с более длинными "стеблями", и имеющих большую температуру плавления по сравнению с молекулярными маяками с более коротким "стеблем". В целом, зонды из смеси гибридизуются с продуктом амплификации в пределах конкретной типоспецифичной области. Зонды, как правило, метят донорной флуоресцентной группой с одного конца, а с другого конца - соответствующей акцепторной группой или гасителем. В некоторых вариантах реализации донорная флуоресцентная группа может содержать конкретный комплекс флуоресцентных красителей, включая так называемые "коллекторные красители" (harvester dyes), для сдвига длины волны испускания зонда, обеспечивающего уникальный флуоресцентный сигнал для детектирования. Способ, кроме того, включает выявление наличия, отсутствия или изменения резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET, fluorescent resonance energy transfer) между донорной флуоресцентной группой и акцепторной флуоресцентной группой или группой-гасителем флуоресценции. Наличие или изменение FRET свидетельствует о присутствии вируса папилломы человека в биологическом образце, тогда как отсутствие FRET свидетельствует об отсутствии вируса папилломы человека в биологическом образце. Как правило, нуклеиновая кислота гибридизуется с зондом и возбуждается при длине волны, поглощаемой донорной флуоресцентной группой. Присутствие или отсутствие связавшегося зонда выявляют путем визуализации или измерения длины волны, испускаемой акцепторной флуоресцентной группой или группой-гасителем флуоресценции. Кроме того, присутствие или отсутствие связавшегося зонда можно выявить путем измерения FRET. В одном предпочтительном варианте реализации нуклеиновую кислоту, полученную из образца,перед взаимодействием с указанным набором зондов подвергают амплификации. Предпочтительно амплификацию проводят с применением полимеразной цепной реакции (ПЦП). Реакция амплификации может представлять собой ПЦР (см., например, патенты США 4,683,195 и 4,683,202, и Innis et al., editors, PCR Protocols, (Academic Press, New York, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition,(Cold Spring Harbour Laboratory, New York 1989. ПЦР можно также применять в том случае, если проводят выделение РНК и получают на ее основе, предпочтительно путем обратной транскрипции, кДНК. Предпочтительно, ПЦР проводят с применением ДНК-полимеразы Taq, например,. Amplitaq (PerkinElmer, Norwalk, Коннектикут, США). Taq-полимеразу можно также приобрести в MBI Fermentas, PerkinElmer, Boehringer Mannheim и Beckman Instruments. В способе согласно настоящему изобретению можно также применять аналогичную, предпочтительно термостабильную, ДНК-полимеразу, например Tflполимеразу (Thermus flavus) (Gut et al., Virol. Methods 77(1): 37-46 (1999. Кроме того, реакция амплификации может представлять собой ОТ-ПЦР (Yajima et al., Clin. Chem.,44(12): 2441-2445 (1998); Martell et al., J. Clin. Microbiol., 37(2): 327-332 (1999); Gut et al., Virol. Methods 77(1): 37-46 (1999); Predhomme et al., Leukemia, 13(6): 957-964 (1999, при которой проводят обратную транскрипцию РНК с получением кДНК, которую затем подвергают ПЦР-амплификации. Как известно, ПЦР включает выделение и денатурацию (предпочтительно путем нагрева) образца ДНК (или РНК). Добавляют молярный избыток олигонуклеотидных праймеров вместе с полимеразой,которая может быть термостабильной, и нуклеотидов для синтеза амплифицированной последовательности. Олигонуклеотидные праймеры гибридизуются с противоположными концами последовательности,которую необходимо амплифицировать. В первом раунде амплификации полимераза осуществляет репликацию ДНК с образованием двух "длинных продуктов", начинающихся с соответствующих праймеров. Общую ДНК, включающую два длинных продукта и две исходные цепи, затем денатурируют и проводят- 13014648 второй раунд полимеризации (например, понижая температуру). Результатом второго раунда являются две исходные цепи, два длинных продукта из первого раунда, два новых длинных продукта (полученные на матрице исходных цепей) и два "коротких продукта", полученные на матрице длинных продуктов. Последовательность таких коротких продуктов соответствует целевой последовательности (смысловой или антисмысловой) с праймерами на каждом конце. В ходе каждого дополнительного раунда амплификации количество коротких продуктов возрастает экспоненциально, при этом в каждом раунде образуется два дополнительных длинных продукта и число коротких продуктов, равное сумме длинных и коротких продуктов в конце предыдущего раунда. Олигонуклеотидные праймеры можно синтезировать различными способами, например, Ozaki et al.,Nuc. Acids Res. 20: 5205-5214 (1992); Agrawal et al., Nuc. Acids Res. 18: 5419-5423 (1990) или т.п. Для удобства олигонуклеотидные зонды синтезируют на автоматических синтезаторах ДНК, например на синтезаторе ДНК/РНК от Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, модели 392 или 394, с применением стандартных химических соединений, например фосфорамидитов (Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992), патенты США 4980460, 4725677, 4415732, 4458066 и 4973679). Можно также применять другие химические соединения, включая неприродные элементы, образующие остов, например фосфоротиоат и фосфорамидат, при условии отсутствия негативного влияния на эффективность гибридизации образующихся олигонуклеотидов. Точная длина и последовательность ДНК-праймеров зависит от целевого полинуклеотида, который необходимо амплифицировать. Предпочтительно длина ДНКпраймеров находится в диапазоне от 10 до 60 нуклеотидов и более предпочтительно в диапазоне от 15 до 30 или 25 нуклеотидов. Предпочтительно осуществляют непрерывный контроль образования амплифицированной нуклеиновой кислоты. В данном изобретении термин "непрерывный контроль" означает, что происходит регулярное измерение количества амплифицированного продукта. Например, считывание можно осуществлять после первого цикла амплификации и впоследствии после каждого одного, двух или пяти циклов. Кроме того, измерение количества присутствующего в реакции амплифицированного продукта можно осуществлять с определенными временными интервалами, например, каждую одну, две, пять или десять секунд. Такой непрерывный контроль количества продукта позволяет наблюдать процесс "в реальном времени". Специалисту в данной области очевидно, что уровень сигнала, создаваемого связавшимися зондами, колеблется по мере прохождения различных этапов цикла: отжига, амплификации и денатурации. Для осуществления на практике способов согласно настоящему изобретению можно применять стандартные методы ПЦР совместно с технологией FRET. В одном варианте реализации можно применять быстрый термоциклер, такой как прибор LIGHTCYCLER. Подробное описание системыLIGHTCYCLER и системы контроля ПЦР в реальном времени и в режиме он-лайн можно найти на веб-сайте Roche. В следующих заявках на патент описан вариант ПЦР в реальном времени, применяемый в технологии LIGHTCYCLER: WO 97/46707, WO 97/46714 и WO 97/46712. Прибор LIGHTCYCLER представляет собой быстрый термоциклер, объединенный с микрообъемным флуориметром, в котором использована высококачественная оптика. В такой методике быстрого термоциклирования в качестве реакционных сосудов применяют кюветы из тонкого стекла. Нагрев и охлаждение камеры реакционных ячеек контролируется чередованием подачи нагретого воздуха и воздуха с температурой окружающей среды. Благодаря низкой массе воздуха и высокому отношению площади поверхности к объему кювет в пределах термической ячейки можно достичь очень высокой скорости изменения температуры. Прибор позволяет контролировать ПЦР в реальном времени и в режиме он-лайн. Кроме того, кюветы служат в качестве оптического элемента для сбора сигнала (подобно стекловолоконной оптике), концентрирующего сигнал в верхней части кюветы. Результатом является эффективное освещение и наблюдение за флуоресценцией проб микрообъемов. Вращающийся штатив, в котором размещены кюветы, можно извлечь из прибора. Таким образом, пробы можно наносить вне прибора (например, в стерильном боксе для ПЦР). Кроме того, это свойство обеспечивает легкую очистку и стерилизацию штатива для проб. В флуориметре, составляющем часть прибора, размещен источник света. Испускаемый свет проходит через фильтры и фокусируется при помощи линзы для освещения верхней части кюветы. Флуоресцентный свет, испускаемый образцом, затем фокусируется той же линзой, проходит через дихроичное зеркало,соответствующий фильтр и фокусируется на фотогибридах для сбора данных. Оптическое устройство в приборе предпочтительно включает три полосных фильтра (530, 640 и 710 нм), обеспечивающих шестицветную детекцию и несколько опций регистрации флуоресценции. Настоящее изобретение, однако, не ограничено конфигурацией коммерчески доступного прибора. Опции регистрации данных включают однократное измерение в ходе каждого этапа цикла, полностью непрерывную регистрацию данных для одного образца для анализа кривой плавления, непрерывный контроль проб (при этом частота контроля проб зависит от числа проб) и/или пошаговое измерение всех проб после некоторого интервала температур. Предпочтительно термоциклер управляется при помощи автоматизированного рабочего места на базе ПК и может использовать операционную систему Windows NT. Создаваемые образцами сигналы регистрируют по мере того, как механизм размещает капилляры последовательно над оптическим уст- 14014648 ройством. Программа может выводить данные о сигналах флуоресценции в реальном времени непосредственно после каждого измерения. Время регистрации флуоресценции составляет 10-100 мс. После каждого шага цикла можно осуществлять неоднократное обновление значений флуоресценции в зависимости от номера цикла для всех образцов. Полученные данные можно хранить для последующего анализа. В предпочтительном варианте реализации нуклеиновую кислоту амплифицируют с применением по меньшей мере одного праймера, выбранного из SEQ ID NO: 1-32, более предпочтительно с применением смеси праймеров, включающих SEQ ID NO: 1-32. В одном предпочтительном варианте реализации в способе применяют искусственно сконструированную или природную ДНК для внутреннего контроля, предпочтительно путем детектирования сигнала или испускания FRET при другой, отличимой, длине волны, или, вне зависимости от длин волн испускания, применяемых для детектирования, происходит изменение испускания в пространственно различимом положении зондов, связанных с твердой подложкой. Описанные выше способы могут, кроме того, включать предотвращение амплификации контаминирующей нуклеиновой кислоты из предшествующих реакций амплификации. Предотвращение такой нежелательной амплификации может включать проведение этапа амплификации в присутствии урацила и обработку биологического образца урацил-ДНК-гликозилазой перед первым этапом амплификации. Кроме того, эту стадию цикла можно проводить с применением отдельного контрольного образца для подтверждения адекватности условий амплификации. Контрольный образец может включать участок молекулы нуклеиновой кислоты вируса папилломы человека. Кроме того, можно амплифицировать такой контрольный образец с применением пары контрольных праймеров и гибридизовать его с применением пары контрольных зондов. Контрольный продукт амплификации в контрольной, если в образце присутствует контрольная матрица, и контрольные зонды гибридизуются с контрольным продуктом амплификации. Способы настоящего изобретения осуществляют с применением нуклеиновых кислот, полученных из биологического образца. Типичные биологические образцы включают соскоб шейки матки, биотаты,мазки или парафиновые срезы ткани, другие варианты соскобов из органов, которые может инфицировать вирус папилломы человека, и мочу. Предпочтительно образец выбирают из бронхиального аспирата, мочи, секрета простаты, эякулята,крови, а также цервикальных, вульварных, анальных, генитальных, кожных или глоточных цитологических образцов, мазков или биоптатов. Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор зондов, включающий по меньшей мере четыре зонда, где каждый из указанных зондов содержит последовательность, комплементарную последовательности патогена, фланкированную четырьмя парами комплементарных оснований, при этом указанные основания в отсутствие гибридизации с нуклеиновой кислотой патогена формируют стеблевую структуру, где указанный зонд помечен первой меткой и второй меткой, что обеспечивает изменение детектируемого сигнала при гибридизации указанного зонда с нуклеиновой кислотой патогена. Предпочтительные варианты реализации первого аспекта, касающиеся зондов, применимы и ко второму аспекту. Как описано выше, последовательности, которые образуют "петлевую" часть зонда, выбирают таким образом, что они не только гибридизуются с необходимой последовательностью у исследуемого организма, но одновременно не образуют вторичных структур с "петлевыми" областями других зондов. Таким образом, в третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает последовательность нуклеиновой кислоты, включающую любую из SEQ ID NO: 33-52 или SEQ ID NO: 105-117. Такие последовательности нуклеиновых кислот можно применять в других способах детектирования одного или более генотипов ВПЧ. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает применение нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению для выявления присутствия или отсутствия по меньшей мере одного генотипа ВПЧ. Предпочтительно нуклеиновую кислоту применяют в способе, в котором осуществляют непрерывный контроль амплификации нуклеиновой кислоты, полученной из образца. Такие способы включают технологию TAQMAN, применение последовательностей в составе молекулярных "скорпионов" и другие способы на основе ПЦР. Технология TAQMAN позволяет выявить присутствие или отсутствие продукта амплификации,и, следовательно, присутствие или отсутствие вируса папилломы человека. В технологии TAQMAN применяют одноцепочечный гибридизационный зонд, меченный двумя флуоресцентными группами. При возбуждении первой флуоресцентной группы светом соответствующей длины волны, происходит перенос поглощенной энергии на вторую флуоресцентную группу согласно принципам FRET. Вторая флуоресцентная группа, как правило, представляет собой молекулу гасителя. В ходе стадии отжига ПЦР меченый гибридизационный зонд связывается с ДНК-мишенью и разрушается в результате 5'-3' экзонуклеазной активности Taq-полимеразы в ходе последующей стадии элонгации. В результате происходит пространственное разделение возбужденной флуоресцентной группы и второй флуоресцентной группы. Как следствие, при возбуждении первой флуоресцентной группы в отсутствие второй флуоресцентной группы можно детектировать изменение испускания первой флуоресцентной группы. Например, если вторая- 15014648 флуоресцентная группа представляет собой гаситель, то произойдет увеличение испускания флуоресценции первой флуоресцентной группы, которое, соответственно, можно будет выявлять. Например,система детектирования последовательностей ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) использует технологию TAQMAN и подходит для осуществления способов детектирования вируса папилломы человека. Информацию о ПЦР-амплификации и детектирования с помощью системы ABIPRISM 7700 можно найти на веб-сайте Applied Biosystems. В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации (определения) минимального набора праймеров, позволяющего амплифицировать последовательности нуклеиновых кислот двух или более родственных организмов, включающий:(а) идентификацию сайтов связывания праймеров, обладающих у указанных организмов по меньшей мере 30% идентичностью;(б) конструирование набора праймеров, способных инициировать амплификацию в сайтах связывания праймеров, идентифицированных в (а), при этом каждый из указанных праймеров имеет не более 3 несовпадений с сайтом связывания праймера по меньшей мере у одного из указанных организмов, и при этом каждый из указанных праймеров отличается от каждого из указанных праймеров по 4 или менее нуклеотидам;(в) определение минимального числа праймеров, необходимого для детектирования предельно возможного количества указанных организмов;(г) определение относительного количества каждого праймера, которое должно присутствовать в указанном наборе праймеров для обеспечения одинаковой амплификации последовательностей нуклеиновых кислот всех указанных организмов. В данном изобретении термин "родственные организмы" обозначает организмы, относящиеся к одному и тому же классу, роду или виду и имеющие высокий уровень генетического сходства, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность. Родственные организмы предпочтительно представляют собой вирусы, более предпочтительно вирусы папилломы человека. Праймеры предпочтительно амплифицируют область L1 вирусов папилломы человека. Проценты идентичности двух последовательностей нуклеиновых кислот определяют путем выравнивания последовательностей с целью оптимального сравнения (например, для наилучшего выравнивания с определенной последовательностью в первую последовательность можно вводить пробелы) и сравнения нуклеотидов в соответствующих положениях. "Наилучшее выравнивание" представляет собой выравнивание двух последовательностей, которое дает наиболее высокий процент идентичности. Проценты идентичности определяют по числу идентичных нуклеотидов в сравниваемых последовательностях (т.е. % идентичности=число идентичных положений/общее число положений 100). Процент идентичности двух последовательностей можно определить с помощью математического алгоритма, известного специалистам в данной области. Примером математического алгоритма для сравнения двух последовательностей является алгоритм Карлина-Альтшуля, Karlin and Altschul (1990) Proc.USA 90:5873-5877. Данный алгоритм введен в программы NBLAST и XBLAST, Altschul, et al. (1990) J.Mol. Biol. 215:403-410. Можно провести поиск нуклеотидов по алгоритму BLAST с применением программы NBLAST, score (балл)=100, длина слова (wordlengh)=12, чтобы получить последовательности нуклеотидов, гомологичные молекулам нуклеиновых кислот согласно изобретению. Для получения выравниваний с пробелами с целью сравнения можно применять Gapped BLAST, как описано в Altschul etal. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Кроме того, можно применять PSI-Blast для проведения итерационного поиска, позволяющего выявить дальнее родство последовательностей (там же). При применении алгоритмов BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно использовать установленные по умолчанию параметры соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, является алгоритм МиерсаМиллера, Myers and Miller, CABIOS (1989). Подобный алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), входящую в состав пакета программ для выравнивания последовательностей CGC. Другие алгоритмы для анализа последовательностей, известные в данной области, включают ADVANCE и ADAM, описанные в работе Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5, и FASTA, описанный в работеPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. В алгоритме FASTA ktup представляет собой регулирующую опцию, определяющую чувствительность и скорость поиска. Минимальный набор праймеров представляет собой набор праймеров, содержащий наименьшее число праймеров, необходимое для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот необходимого числа родственных организмов. Набор праймеров может дополнительно содержать праймер для коррекции, который применяют для контроля различий присоединения праймеров в конкретном сайте связывания праймера. Праймеры для коррекции должны содержать не более трех несовпадений с сайтом связывания праймера, в котором они должны действовать. Добавление праймеров для коррекции помогает достичь уровня чувствительности детектирования, который составляет по меньшей мере два поряд- 16014648 ка величины или более для всех организмов, присутствие которых предстоит выявить, например, всех вирусов папилломы человека. В данном изобретении термин "несовпадение" относится к случаю, когда основание в праймере не образует пары оснований по принципу Уотсона и Крика с соответствующим основанием в сайте связывания праймера. Несовпадение образуется, если два соответствующих основания не удовлетворяют критерию Уотсона-Крика, например С-Т, G-A. Несоответствия предпочтительно находятся в части праймера, близкой к 5'-концу, более предпочтительно в части, образуемой 3 нуклеотидами перед 5'-концом праймера. Каждый из праймеров в наборе праймеров отличается от каждого другого праймера в наборе только по четырем или менее нуклеотидам. Таким образом, если длина всех праймеров составляет 15 нуклеотидов, то 11 нуклеотидов в каждом праймере идентичны 11 нуклеотидам каждого другого праймера. Предпочтительно идентичные нуклеотиды не расположены последовательно. В одном предпочтительном варианте реализации предложен способ создания весьма сложной мультиплексной реакции для амплификации вируса папилломы человека. Способ включает выбор консервативных сайтов связывания праймеров (с вариабельностью менее 70%) на соответствующем расстоянии друг от друга. Сайты связывания праймеров должны располагаться на некотором расстоянии друг от друга, обеспечивающем образование ампликона соответствующего размера. Предпочтительно образуется ампликон длиной 30-160 нуклеотидов, более предпочтительно длиной 40-120, 50-100, 60-90 или 70-80 нуклеотидов. Особенно предпочтительны ампликоны длиной от 130 до 160 нуклеотидов. Праймеры образуют часть синтезируемого ампликона. Длина праймеров составляет предпочтительно 10-30 нуклеотидов, более предпочтительно 12-25, 15-22 или 18, 19, 20 или 21 нуклеотида. Затем определяют последовательность полного набора праймеров, в котором праймеры удовлетворяют стандартным выдвигаемым критериям (например, проверка праймеров на полную комплементарность с помощью компьютерной программы, такой как Primer3), и конструируют минимально возможное количество праймеров, имеющих только три несовпадения, предпочтительно на одном конце праймера, более предпочтительно на 5'конце, для всех родственных организмов, например, типов вируса папилломы человека, которые предполагается амплифицировать. Кроме того, праймеры должны связываться с практически равным количеством типов не более чем с тремя несовпадениями. Дальнейшие различия в амплификации контролируют,изменяя относительную концентрацию праймеров. Итоговая чувствительность детектирования предпочтительно находится в пределах по меньшей мере двух порядков для всех родственных организмов, таких как типы вирусов папилломы человека, присутствие которых необходимо выявить. Данный способ является значительным достижением в сравнении с известными в данной области современными способами, в которых применяют последовательное добавление праймеров, и способами проб и ошибок. Разработанный способ сводит конкуренцию к минимуму. Наличие коррекции эффективности присоединения праймера по отношению ко всем мишеням позволяет достичь, по существу, равных значений чувствительности амплификации. Кроме того, вероятность неспецифичного присоединения праймера снижена за счет того, что вариабельная область праймера находится предпочтительно на 5'конце. Смесь праймеров позволяет амплифицировать область L1 вируса папилломы человека по меньшей мере одного типа, предпочтительно включающую SEQ ID NO: 53-103. Смесь праймеров предпочтительно включает по меньшей мере один прямой праймер из группы SEQ ID NO: 1-16 и по меньшей мере один обратный праймер из группы SEQ ID NO: 17-32. В седьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор праймеров, который можно получить способами согласно шестому аспекту, включающий по меньшей мере один праймер, выбранный изSEQ ID NO: 1-32. Предпочтительно смесь праймеров включает по меньшей мере один прямой праймер из группы SEQ ID NO: 1-16 и по меньшей мере один обратный праймер из группы SEQ ID NO: 17-32. Более предпочтительно она включает SEQ ID NO: 1-32. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает комплект для детектирования одного или более патогенов, включающий набор зондов, определенный во втором аспекте. Комплект предпочтительно включает также набор праймеров, идентифицированных способом согласно шестому аспекту. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает комплект для детектирования одного или более патогенов, включающий набор праймеров, идентифицированный способом согласно шестому аспекту. Предпочтительно комплекты можно применять для детектирования одного или более организмов,ассоциированных с заболеванием, передающимся половым путем, предпочтительно генотипов ВПЧ. Предпочтительно зонды содержат последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 17-33. Набор праймеров предпочтительно включает по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 132, более предпочтительно по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-16,и по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 17-32. Наиболее предпочтительно смесь праймеров включает праймеры SEQ ID NO: 1-32. Предпочтительно комплекты дополнительно включают внутренний контроль. Комплект может также включать упаковочную этикетку или листок-вкладыш в упаковке с инструкциями по применению смеси (смесей) праймеров и пару (пары) зондов для выявления присутствия- 17014648 или отсутствия вируса папилломы человека в биологическом образце. Комплекты могут дополнительно включать другие компоненты, например реагенты, необходимые для ПЦР. Такие реагенты включают буферы, соответствующую ДНК-полимеразу и дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), такие как dATP, dCTP, dGTP и dTTP. Компоненты комплекта могут быть помещены в различные флаконы или другие контейнеры. Реагенты могут быть лиофилизированы для последующего восстановления перед применением. В качестве альтернативы, компоненты могут быть помещены в соответствующие буферные растворы, готовые для применения. Такие растворы могут содержать подходящие консервирующие вещества. Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном патенте,имеют обычное значение, известное специалисту в области, к которой относится изобретение. Хотя при осуществлении на практике или тестировании настоящего изобретения можно применять способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в данном изобретении, подходящие способы и вещества описаны ниже. Кроме того, вещества, способы и примеры только иллюстрируют, но не ограничивают изобретение. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие источники, упомянутые в данном патенте, включены в него посредством ссылок в полном объеме. В случае конфликта настоящее описание, включающее определения, является регулирующим. Изобретение проиллюстрировано следующими не ограничивающими примерами. Другие характеристики, объекты и преимущества изобретения ясны из графических материалов и подробного описания изобретения, а также из формулы. Пример 1. Детектирование ДНК ВПЧ с высоким риском и низким риском методом ПЦР в реальном времени. Общий объем реакционной смеси составлял 20 мкл, в ее состав входили следующие компоненты: 2 мкл (0,2 пкг) клонированной ДНК ВПЧ, 18 мкл полимеразного буфера; конечная концентрация: 90 мМ TRIS-HCl (рН 8,0), 1 мМ ДТТ, 50 мМ KCl, 7 мМ MgCl2, 1% Tween-20 (SIGMA), 1% Фиколл, 1% ПВП, 250 мкМ каждого dNTP (ATP, CTP, GTP, TTP) (Promega), 0,28 мкМ каждого из праймеров: SEQ IDNO: 1-32, 0,18 мкМ каждого из молекулярных маяков SEQ ID NO: 33-52, и 7,5 ед. ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (ROCHE). Реакцию проводили в термоциклере LightCycler 2.0 при следующих параметрах: Шаг 1: 10 мин при 95 С; Шаг 2: 5 мин при 55 С; Шаг 3: циклы 1-37: 30 с при 95 С, 60 с при 42 С - режим однократного детектирования и 30 с при 72 С. Генотипы ВПЧ с высоким риском детектировали при помощи молекулярных маяков SEQ ID NO: 38-51. Значения флуоресценции регистрировали на длине волны 530 нм. Генотипы ВПЧ с низким риском ВПЧ детектировали при помощи молекулярных маяков SEQ ID NO: 33-37. Значения флуоресценции регистрировали на длине волны 560 нм. Внутренний контроль реакции детектировали при помощи молекулярного маяка SEQ ID NO: 52. Значения флуоресценции регистрировали на длине волны 610 нм. Были успешно выявлены следующие генотипы: с низким риском (6, 11, 42 ,43, 44/55), с высоким риском (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,58, 59, 66, 68) и внутренний контроль. Пример 2. Детектирования ВПЧ ВПЧ-16, ВПЧ-18 и ВПЧ-6, ВПЧ-11 методом ПЦР в реальном времени. Общий объем реакционной смеси составил 20 мкл, в ее состав входили следующие компоненты: 2 мкл ( 0,2 пкг) клонированной ДНК ВПЧ, 18 мкл полимеразного буфера; конечная концентрация: 90 мМ TRIS-HCl (рН 8,0), 10 мМ ДТТ, 50 мМ KCl, 7 мМ MgCl2, 1% Tween-20 (SIGMA), 1% Фиколл, 1% ПВП, 250 мкМ каждого дНТФ (ATP, CTP, GTP, TTP) (Promega), 0,28 мкМ каждого из праймеров: SEQ IDNO: 1-32, 0,18 мкМ каждого из молекулярных маяков SEQ ID NO: 33, 34, 38, 39, 52 и 7,5 ед. ДНКполимеразы AmpliTaq Gold (ROCHE). Реакцию проводили в термоциклере LightCycler 2.0 при следующих параметрах: Шаг 1: 10 мин при 95 С; Шаг 2: 5 мин при 55 С; Шаг 3: циклы 1-37: 30 с при 95 С, 60 с при 42 С - режим однократного детектирования и 30 с при 72 С. Генотипы ВПЧ-16 и ВПЧ-18 детектировали при помощи молекулярных маяков SEQ ID NO: 38-39. Значения флуоресценции регистрировали на длине волны 530 нм. Генотипы ВПЧ-6 и ВПЧ-11 детектировали при помощи молекулярных маяков SEQ ID NO: 33-34. Значения флуоресценции регистрировали на длине волны 560 нм. Реакцию внутреннего контроля детектировали при помощи молекулярного маякаSEQ ID NO: 52. Значения флуоресценции регистрировали при длине волны 610 нм. Были успешно выявлены следующие генотипы: с низким риском (6, 11), с высоким риском (16, 18) и внутренний контроль. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Набор зондов, включающий по меньшей мере четыре зонда, где каждый из указанных зондов содержит последовательность, комплементарную последовательности патогена, фланкированную четырьмя или пятью парами комплементарных оснований, при этом указанные основания в отсутствие гибридизации с нуклеиновой кислотой патогена формируют стеблевую структуру, причем указанный зонд помечен первой взаимодействующей меткой и второй взаимодействующей меткой, что обеспечивает изменение детектируемого сигнала при гибридизации указанного зонда с нуклеиновой кислотой патогена. 2. Набор зондов по п.1, отличающийся тем, что указанная первая взаимодействующая метка и указанная вторая взаимодействующая метка представляют собой донор FRET и акцептор FRET. 3. Набор зондов по п.2, отличающийся тем, что указанный акцептор FRET представляет собой гаситель. 4. Набор зондов по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанная последовательность, ком- 28