Способ диагностики или прогнозирования основных респираторных бактериальных патогенов у субъекта

005776 Область техники изобретения Данное изобретение относится к диагностике и/или прогнозированию основных респираторных бактериальных патогенов. В частности, оно относится к Streptococcus pneumoniae и Mycobacterium tuberculosis. Более конкретно, оно относится к измерениям концентрации растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) в биологических жидкостях человека (мокроте, пузырной жидкости, асцитах, сыворотке, плазме, моче) в качестве инструмента диагностики респираторной бактериальной инфекции, а также прогнозирования прогрессирования болезни. Предпосылки изобретения Клеточный рецептор для урокиназы (uPAR, CD87) выполняет множественные функции в миграции клеток, адгезии клеток, околоклеточном протеолизе и ремоделировании ткани. uPAR экспрессируется большинством лейкоцитов, в том числе моноцитами, макрофагами, нейтрофилами и тромбоцитами.uPAR является активирующим антигеном в моноцитах и Т-клетках, и Т-клетки из ВИЧ-1 инфицированных индивидуумов экспрессируют повышенные уровни Upar 1, 1994. Инфицирование ВИЧ 1 лейкоцитов in vitro вызывает повышающую регуляцию экспрессии uPAR клеточной поверхности в процессе, который, по-видимому, совпадает во времени с появлением вирусной репликации 2.uPAR может выделяться из клеточной поверхности, образуя растворимую форму рецептора(suPAR), не имеющего GPI(гликозилфосфатидилинозит)-якоря. Механизм выделения является малопонятным, но может происходить посредством гидролитического расщепления GPI-якоря, катализируемогоGPI-специфической фосфолипазой D. Растворимые формы uPAR (suPAR) были идентифицированы в супернатантах клеточных культур и в разнообразных биологических жидкостях, таких как асциты опухолей, пузырная жидкость, сыворотка, плазма, а недавно также в моче 3. Уровни suPAR в сыворотке, плазме и моче повышаются у пациентов, страдающих от различных типов рака 4, синдрома пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH) 5, и у пациентов с ревматоидным артритом 6. Кроме того, уровень suPAR в плазме является прогностическим маркером для общего выживания в случае пациентов, страдающих от ВИЧ-1-инфекции 7. Клеточное происхождение циркулирующего suPAR неизвестно. Многие, если не все, клетки, которые экспрессируют uPAR, также выделяют растворимые формы этого рецептора при культивировании invitro. Предполагалось, что источником избытка suPAR у пациентов с раком являются раковые клетки и/или инфильтрирующие опухоли макрофаги, так как эти клетки часто экспрессируют высокие уровниuPAR, и эксперименты с использованием ксенотрансплантированных мышей, несущих опухоли человека, в самом деле показали, что ткань этих опухолей действительно высвобождает suPAR в кровоток и мочу 8. Сущность изобретения Технической проблемой, на которую направлено данное изобретение, является обеспечение нового маркера для диагностики и прогнозирования основных респираторных бактериальных патогенов, в частности, Streptococcus pneumoniae и Mycobacterium tuberculosis. Дополнительной технической проблемой,на которую направлено данное изобретение, является обеспечение маркера указанного типа, который является простым и доступным для измерения. Данное изобретение обеспечило решение указанных выше технических проблем, причем данное изобретение относится к способу диагностики или прогнозирования основных респираторных бактериальных патогенов, таких как Streptococcus pneumoniae и Mycobacterium tuberculosis, у субъекта, предусматривающему стадии(а) выполнения in vitro измерения уровня одного или нескольких маркеров в форме (i) рецептора урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) и/или (iii) одного или нескольких продуктов деградации (i) или (ii) в пробе биологической жидкости от субъекта и(b) использования полученной величины измерения для оценки состояния данного субъекта. Данное изобретение основано на неожиданном обнаружении того, что растворимый uPAR (suPAR) присутствует в повышенных уровнях в сыворотке, плазме и моче пациентов с двумя основными респираторными бактериальными патогенами, Streptococcus pneumoniae и Mycobacterium tuberculosis, и что уровень suPAR применим в качестве диагностического маркера. Уровень suPAR у индивидуумов с двумя основными респираторными бактериальными патогенами, Streptococcus pneumoniae и Mycobacteriumtuberculosis, является прогностическим в отношении развития заболевания и смерти. Уровнь suPAR является новым и в высокой степени диагностическим и прогностическим фактором, даже в контексте других известных прогностических факторов, связанных с инфекцией Streptococcus pneumoniae или Mycobacterium tuberculosis легкого. Кроме того, данное изобретение основано на признании того, что количество suPAR коррелирует с количеством uPAR и что, следовательно, количества uPAR равным образом пригодны в качестве диагностических и прогностических индикаторов туберкулезной инфекции. Следующим преимуществом данного изобретения является то, что измерения suPAR могут выполняться с использованием, например, простого способа ELISA или даже зонда (щупа) и, следовательно,могут обеспечивать очень недорогое, простое и быстрое дополнение к используемым в настоящее время-1 005776 прогностических инструментов для лиц, инфицированных туберкулезом. Таким образом, в развивающихся странах без финансовой возможности проведения дорогостоящих анализов, используемых в западном мире, уровни suPAR могут быть использованы 1) для определения статуса туберкулеза (диагностики), 2) для выбора пациентов для лечения (прогнозирования) и 3) для мониторинга хода лечения. Кроме того, данное изобретение включает в себя преимущество, заключающееся в том, что хотя уровни suPAR могут быть измерены очень просто с использованием, например, пробы мочи или пробы мокроты, которые легко получить, общепринятые диагностические и прогностические анализы, например, на туберкулез, являются неопределенными, сложными и включают в себя, например, выращивание в культуре мокроты, клиническое испытание и рентген грудной клетки. Далее, данное изобретение относится к способу оценки прогрессирования состояния субъекта,страдающего от основного респираторного бактериального патогена, такого как Mycobacterium tuberculosis или Streptococcus pneumoniae, предусматривающему стадии(a) выполнения in vitro измерения уровня одного или нескольких маркеров в форме (i) рецептора урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) и/или (iii) одного или нескольких продуктов деградации (i) или (ii) в каждой из ряда проб биологической жидкости от субъекта и(b) использования полученных величин измерения для оценки прогрессирования состояния данного субъекта. Этот способ может быть использован для непрерывного мониторинга этого состояния, например,эффективности лечения данного пациента. Наконец, данное изобретение относится к набору ELISA и набору с зондом, использующими описанные выше знания. Краткое описание фигур Фиг. 1. Уровни suPAR среди ТБ-мокрота-положительных (SP), ТБ-культура-положительных (СР),ТБ-предположительных пациентов (РТВ), ТБ-положительных, получающих лечение при зачислении на исследование (ТАЕ), и ТБ-отрицательных (NEG) пациентов. Блок-диаграмма показывает медиану (черная линия в блоке), квартили (блок) и выбросы (случаи с величинами, между 1,5 и 3 длинами блока от верхнего или нижнего края этого блока), но не крайние наблюдаемые значения (случаи с величинами,большими, чем 3 длины блока от верхнего или нижнего края данного блока). Фиг. 2 а показывает взаимосвязь между величинами suPAR и вероятностью диагноза как ТБположительного. 16 пациентов, которые лечились по поводу ТБ во время поступления, не включали в этот анализ. Таким образом, пациенты, включенные в этот анализ, являются ТБ-положительными (ТБмокрота- и -культура-положительными и ТБ-предположительными) и ТБ-отрицательными индивидуумами. Пациенты с увеличивающимися suPAR имеют более высокую вероятность диагностирования, как имеющие активный ТБ (Р=0,0001). Пациенты с величинами suPAR более 8,3 нг/мл (n=8) не показаны. Штриховые линии в нижней части показывают величины suPAR отдельных пациентов, а расположенная наверху линия является величиной медианы. Точечные пунктирные линии являются 95% доверительными интервалами. Фиг. 2b. Вероятность диагноза ТБ при исключении ТБ-мокрота-положительных пациентов. Пациентами, включенными в этот анализ вероятности, являются 35 ТБ-культура-положительных, 63 ТБпредположительных пациентов и 64 ТБ-отрицательных. Таким образом, этот анализ предсказывает вероятность всех предполагаемых ТБ-пациентов, за исключением положительных, согласно микроскопии пациентов и 16 пациентов, которые получали лечение при поступлении. Восемь проб имели величиныsuPAR выше 8,5 нг/мл, и они не показаны. Эта фигура показывает, что вероятность диагноза ТБ, вопреки ТБ-отрицательному микроскопическому анализу мокроты, увеличивается с увеличением уровней suPAR(p=0,001). Штриховые линии в нижней части показывают величины suPAR отдельных пациентов, а расположенная наверху линия является величиной медианы. Точечные пунктирные линии являются 95% доверительными интервалами. Фиг. 2 с. Эта фигура идентична фиг. 2b, за исключением того, что исключены ВИЧ-1 инфицированные индивидуумы. Существовала значимая взаимосвязь между увеличением suPAR и вероятностью диагноза как ТБ-культура-положительных или ТБ-предположительных пациентов (р=0,02). Штриховые линии в нижней части показывают величины suPAR отдельных пациентов, а расположенная наверху линия является величиной медианы. Точечные пунктирные линии являются 95% доверительными интервалами. Фиг. 2d показывает вероятность положительного ТБ-диагноза среди ВИЧ-1-положительных пациентов согласно величине suPAR. р=0,08. Имеется тенденция в направлении взаимосвязи между увеличением suPAR и вероятностью диагноза пациентов как ТБ-культура-положительных или ТБпредположительных пациентов (р=0,08). Штриховые линии в нижней части показывают величины suPAR отдельных пациентов, а расположенная наверху линия является величиной медианы. Точечные пунктирные линии являются 95% доверительными интервалами. Фиг. 3. Кривые выживаемости Каплана-Мейера, показывающие выживаемость среди 182 пациентов с активным ТБ. Тонкая линия показывает пациентов с низким suPAR, а жирная линия пациентов с высо-2 005776 ким suPAR. Фиг. А: не было значимого различия при разделении пациентов в соответствии с величиной медианы. Фиг. В: пациенты с величинами suPAR, в 2 раза большими чем величина медианы (т.е. 4,2 нг/мл, n=38), умирали значимо быстрее, чем пациенты с величиной suPAR, меньшей, чем 2-кратная величина медианы (n=144), р=0,007, логарифмический ранговый критерий. Фиг. 4. После лечения были доступны сыворотки от 101 индивидуума. Эта блок-диаграмма показывает пре- и пост- уровни suPAR (пост- помечены -Р) этих 101 индивидуума. А: ТБ-мокротаположительные (SP), В: ТБ-культура-положительные (СР), С: ТБ-предположительные (РТВ), D: ТБположительные, получающие лечение при поступлении (ТАЕ), и Е: ТБ-отрицательные (NEG). Для простоты, эта блок-диаграмма показывает медиану (черная линия в блоке), квартили (блок), но не выбросы и крайние наблюдаемые значения (случаи с величинами, большими чем 1,5 длины блока от верхнего или нижнего края данного блока). Фиг. 5: Блок-диаграммы на основе медианы, квартилей и крайних наблюдаемых величин уровней(медиана=5,5 нг/мл). suPAR был значимо повышенным у пациентов в сравнении с контролями (р=0,001). В: пациенты, перенесшие инфекцию (медиана=5,0 нг/мл), и пациенты, умершие от инфекции (медиана=9,4 нг/мл). Увеличенный уровень suPAR в группе умерших пациентов был статистически значимым(р=0,0001). Эти блоки представляют интерквартильный диапазон, который содержит 50% величин, и небольшие расстояния, простирающиеся от наибольших и наименьших величин этих блоков, за исключением выбросов и крайних наблюдаемых величин. Кружки (о) представляют выбросы (1,5 и 3-длины блока), а звездочкипредставляют крайние наблюдаемые значения (величины, большие, чем 3 длины блока). Фиг. 6. Уровни suPAR у индивидуумов с предполагаемым ТБ в соответствии с тем, были ли пациенты положительными или отрицательными в отношении AFB в прямой микроскопии. Фиг. 7. Уровни suPAR у нелечившихся и лечившихся ТБ-пациентов. Фиг. 8. Ось Y слева показывает уровни suPAR (нг/мл) в сыворотке. Ось Y справа показывает процент клеток, экспрессирующих рецептор uPAR (CD87-положительных клеток). Подробное описание изобретения Далее, данное изобретение объясняется, в частности, со ссылкой на suPAR для простоты. Это не должно рассматриваться, как ограничение объема данного изобретения только для suPAR. Кроме того,подходящие экстраполяции на uPAR и продукты деградации этих двух указанных веществ находятся вполне в рамках квалификации специалиста в данной области. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что концентрация suPAR, молекулы, о которой известно, что она участвует в миграции и адгезии клеток, увеличивается в сыворотке и/или мокроте у лиц с двумя основными респираторными бактериальными патогенами, Streptococcus pneumoniae и Mycobacterium tuberculosis в сравнении со здоровыми контролями. Основные респираторные бактериальные патогены могут быть выбраны изStreptococcus pneumoniae (в том числе устойчивый к лекарственным средствам S. pneumoniae),Chlamidia pneumoniae и Chlamidia psittaci,Legionella spp., Coxiella burnetii,Haemophilus influenzae, Респираторные вирусы,Кишечные грамотрицательные бациллы (в частности, Klebsiella spp.),Эндемические грибы (кокцидиоидомикоз, гистоплазмоз, бластмикоз),Staphylococcus aureus,Streptococcus pyogenes,Mycoplasma pneumoniae,Mycobacterium tuberculosis,Pseudomonas aeruginosa,Pneumocystis carinii. Пробой биологической жидкости может быть любая жидкость, которая может быть получена от людей, т.е. мокрота, пузырная жидкость, асциты, кровь, сыворотка, плазма и моча. Моча является предпочтительной вследствие того факта, что ее легко получить. При применении мочи в качестве пробы биологической жидкости измерение маркера должно коррелировать с общим уровнем концентрации пробы, например, измерения маркера должны коррелировать с содержанием креатинина в этой пробе. Предпочтительно, пробу биологической жидкости хранят при температуре ниже 0 С, более предпочтительно от -20 до -80 С, до измерения. Измерение маркера в пробе биологической жидкости может проводиться с использованием любого доступного способа/устройства для этого. Примерами таких измерительных способов/устройств являются ELISA, RIA (радиоиммуноанализ), вестерн-блоттинг, TR-FIA (иммунофлуорометрические анализы с временным разрешением), FACS-анализ (анализ с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции), зонды (щупы) и т.д. Предпочтительными способами/устройствами измерения являютсяELISA может проводиться в ряде различных вариантов, многие из которых применимы в данном изобретении. Один вариант ELISA, который является особенно подходящим в данном изобретении, является вариант, описанный в 8 и 9, которые включены здесь в качестве ссылки. Измерения маркера могут проводиться с использованием любого подходящего зонда (щупа). Предпочтительно этот зонд является зондом, содержащим антитело к маркеру в качестве захватывающего агента. Предпочтительно, измерение uPAR в пробе биологической жидкости проводят с использованиемFACS-анализа, вестерн-блоттинга или ELISA. Предпочтительно, измерение продуктов деградации uPAR/suPAR проводят с использованием вестерн-блоттинга или TR-FIA (иммунофлуорометрических анализов с временным разрешением). Измерение uPAR проводят в пробах биологических жидкостей, содержащих экспрессирующиеuPAR клетки, т.е. в пробах крови. Величина измерения уровня маркера, полученная на стадии (а), может быть использована для оценки состояния субъекта сравнением этой величины измерения с уровнем этого маркера у субъектов, не имеющих бактериальной инфекции легких Streptococcus pneumoniae или Mycobacterium tuberculosis. Как упоминалось выше, один аспект данного изобретения относится к способу оценки прогрессирования состояния субъекта, страдающего от инфекции Streptococcus pneumoniae или Mycobacterium tuberculosis. Величины измерения уровня маркера, полученные на стадии (а), могут быть использованы для оценки состояния субъекта сравнением этих величин измерения с уровнем этого маркера у субъектов, не инфицированных туберкулезом или Streptococcus pneumoniae, и/или сравнением временного хода величин измерений с временным ходом величин измерения у субъектов, не инфицированных туберкулезом или Streptococcus pneumoniae. Далее, данное изобретение относится к набору ELISA для оценки физического состояния субъекта,страдающего от туберкулезной инфекции, содержащему а) иммобилизованный захватывающий агент,способный захватывать один или несколько маркеров, в форме (i) рецептора урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) и/или(iii) одного или более продуктов деградации (i) или (ii), и b) партнера связывания, способного связываться с маркером, причем партнер связывания содержит с) систему метки. Захватывающим агентом может быть антитело к маркеру. Партнером связывания может быть антитело к маркеру. Предпочтительно, система метки конъюгирована с партнером связывания. Системой метки может быть любая обычно используемая система метки, такая как антитело к агенту связывания, конъюгированное с ферментом, например, конъюгат иммуноглобулин-щелочная фосфатаза. Кроме того, данное изобретение относится к зонду для оценки физического состояния субъекта,страдающего от туберкулеза или инфекции Streptococcus pneumoniae, содержащему а) иммобилизованный захватывающий агент, способный захватывать один или несколько маркеров, в форме (i) рецептора урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) и/или (iii) одного или более продуктов деградации (i) или (ii), и b) партнера связывания, способного связываться с указанным маркером, причем партнер связывания содержит с) систему метки. Захватывающим агентом может быть антитело к маркеру. Партнером связывания может быть антитело к маркеру. Предпочтительно, система метки конъюгирована с партнером связывания. Системой метки может быть любая обычно используемая система метки, такая как антитело к агенту связывания, конъюгированное с ферментом, например, конъюгат иммуноглобулин-щелочная фосфатаза. Определения В связи с данным изобретением "uPAR" определяется как любая форма uPAR (та же самая, что иCD87), присутствующая на поверхности экспрессирующих uPAR клеток в биологических жидкостях. Выражение экспрессирующие uPAR клетки обозначает все клетки, экспрессирующие uPAR(CD87), такие как моноциты, лейкоциты, макрофаги и нейтрофилы. В связи с данным изобретением "suPAR" (растворимый uPAR) определяется как любая форма uPAR(та же самая, что и CD87), присутствующая в биологических жидкостях в несвязанной с клетками форме. Биологические жидкости определяются как любая жидкость, которая может быть получена от людей, т.е. мокрота, пузырная жидкость, асциты, кровь, сыворотка, плазма и моча. Выражение продукт деградации suPAR или uPAR в данном контексте означает все их фрагменты,наблюдаемые с использованием вестерн-блоттинга или антител против suPAR или uPAR. В частности,указанное выражение включает в себя фрагменты Dl, D2 и D3 suPAR. Примеры Пример 1. Диагностика активного ТБ посредством измерения сывороточного suPAR. Цель.-4 005776 Определение, имеют ли пациенты с подозрением на активный ТБ, повышенные уровни suPAR в сыворотке, т.е. могут ли уровни suPAR быть использованы для диагностики активного ТБ. Описание эксперимента.Mycobacterium tuberculosis является внутриклеточным патогеном, который поселяется преимущественно в макрофагах. Рецептор урокиназного активатора плазминогена (uPAR) в основном локализуется на моноцитах и макрофагах. uPAR представляет собой трехдоменный гликозилированный белок (D1D3), который связывает урокиназу с высокой аффинностью через его домен D1. Комплекс uPAR/uPA участвует, в активации плазминогена, околоклеточном протеолизе и ремоделировании ткани, а также активации интегрина, клеточной адгезии и миграции. uPAR связан с поверхностью клетки GPI-якорем,который может быть расщеплен, что приводит к образованию растворимой формы этого рецептора (suPAR). Растворимые формы uPAR (suPAR) включают в себя полноразмерный рецептор (D1-D3), а также фрагмент D2D3 с хемотаксическими свойствами 10 и фрагмент D1 с неизвестной функцией. suPAR был идентифицирован в супернатантах клеточных культур и в биологических жидкостях, таких как пузырная жидкость, сыворотка, плазма и моча 11. Из-за трудностей диагностики туберкулезных инфекций в развивающихся странах и высокой смертности, вызываемой этой инфекцией, авторы исследовали уровни suPAR среди индивидуумов, подозреваемых в наличии у них активного туберкулеза, в группе индивидуумов в Гвинее-Бисау. Здесь авторы изобретения показывают, что suPAR несет как диагностическую, так и прогностическую информацию у пациентов, страдающих от активного туберкулеза. Население и ТБ-контроль. Четыре пригородных зоны в Бисау, столице Гвинеи-Бисау, с приблизительно 4 6000 жителей прослеживались через систему демографического контроля с 1978 года. В мае 1996 года в этой зоне проводили систему ТБ-контроля в сотрудничестве с национальной ТБ-больницей, Больницей Raoul Follereau(HRF). Всех взрослых, постоянно или временно живущих в зоне исследования, присутствующих в любом из этих 2 центров здоровья, с симптомами или признаками активного туберкулеза, направляли в больницу для дополнительного обследования. Две ТБ-сестры каждый третий месяц выполняли визиты в дома, где были обнаружены случаи ТБ, для обследования и опроса домочадцев с целью обнаружения вторичных случаев заболевания. Людей с подозрением на заболевание направляли в ТБ-больницу для дополнительных медицинских обследований. Пациентов, живущих в этой зоне, но с начатым в другом месте лечением ТБ, также направляли для дополнительного обследования и включения, если они были обнаружены сестрами, раздающими лекарство, в национальную ТБ-программу. Критерии включения в программу. Критериями для включения в это исследование были один или несколько из следующих симптомов и признаков без другого объясняющего эти симптомы заболевания, кашель более 1 месяца без улучшения при приеме антибиотиков, лихорадка постоянно или периодически в течение более, чем 1 месяц,потеря веса, одышка, кровохарканье, ночная потливость или лимфаденопатия. Лиц в возрасте до 15 лет и беременных женщин не включали в программу. Давших согласие пациентов обследовали клинически,опрашивали с использованием стандартных анкет в отношении истории болезни, социодемографических и поведенческих факторов риска, исследовали с использованием рентгена, прямой микроскопии утренней мокроты в 3 последовательных дня, культивирования мокроты и теста Манту (с использованием Multiteste, Bio-Merieux, France). Брали кровь для испытания на ВИЧ-инфекцию, гематологию и иммунологические параметры. В это исследование были включены двести шестьдесят два пациента с подозрением на ТБ. Пациентов зачисляли между 1996 и 1998 годами. 147 были мужчинами и 115 женщинами. Средний возраст был 41,4 лет (диапазон 15-80). На основании исследований пациентов делили на 4 группы. 1) Пациенты, положительные в отношении AFB в прямой микроскопии мокроты(Acid Fast Bacilli, AFB, в прямой микроскопии), обозначались как ТБ-мокрота-положительные. 2) Пациенты, отрицательные по микроскопии, но положительные при культивировании мокроты, обозначались как ТБ-культура-положительные. 3) Пациентов с клиническими признаками, симптомами и обнаруживаемыми рентгеном изменениями, совместимыми с активным интраторакальным ТБ, но без бактериологического подтверждения в прямой микроскопии мокроты или культуры, лечили антибиотиками (котримоксазолом или амоксициллином) и затем повторно оценивали клинически и при помощи рентгена грудной клетки. Если не было улучшения и подозрение на ТБ оставалось, предполагалось, что этот пациент имеет ТБ, и он обозначался как ТБ-предположительный. 4) Пациентов, не диагностированных как имеющих ТБ, лечили в соответствии с диагнозом (например, пневмонией). Этих пациентов обозначали как ТБ-отрицательные. Лечение ТБ. После 4-месячной интенсивной фазы ежедневного Прямого Наблюдаемого Лечения (DOT) стандартными дозами этамбутола, изониазида, рифампицина и пиразинамида следовала 4-месячная последующая фаза с этамбутолом и изониазидом, получаемыми пациентом в центре здоровья дважды в месяц. Эта программа лечения была рекомендована для ВИЧ-инфицированных индивидуумов национальной ТБ-программой в Гвинее-Басау, когда начинали этот проект исследования в 1996 году, по причинам конфиденциальности и сравнения ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных индивидуумов, получав-5 005776 ших одно и то же лечение. Кроме того, всем пациентам давали комплекс витамина В и мультивитамины один раз в день. Пациентам, которые обнаруживали серьезное заболевание, предлагали госпитализацию, если имелись доступные койко-места. В интенсивной фазе пациентов, не пришедших для получения лечения, навещали сестры в тот же день и уговаривали продолжать лечение. Соблюдение лечения проверяли счетом пилюль и анализом мочи на изониазид (INH) при 2, 5 и 8 месяцах последующего врачебного наблюдения; информацию регистрировали в картах и формах лечения. Лабораторные способы. При включении в программу фельдшер собирал пробы утренней мокроты в течение трех последовательных дней и транспортировал в герметизированном контейнере при 4 С в тот же день в Национальную Лабораторию Общественного Здоровья (LNSP) в Бисау для прямой микроскопии и культивирования. Перед культивированием пробы расщепляли и деконтаминировали от немикобактериальных микроорганизмов с использованием лаурилсульфатного способа. Аликвоту 0,5 мл гомогенизированной пробы инокулировали в одну пробирку с общепринятой яичной средой Левенстейна-Йенсена (LJ) и в одну пробирку, содержащую модифицированную среду LJ с 0,6% пируватом. Пробирки инкубировали при 37 С и исследовали один раз в неделю в течение 7 недель. Размножение микобактерий подтверждали кислотостойкой микроскопией. Изоляты транспортировали в замороженном виде в Шведский Институт Контроля Инфекционных заболеваний (SMI) в Стокгольме для подтверждения. ВИЧ-тестирование. Сыворотки подвергали скринингу на ВИЧ в LNSP с использованием Capillus HIV-1/HIV-2 (Cambridge Diagnostics, Galway, Ireland) и Enzygnost Anti-HIV 1+2 Plus (Behring Diagnostics GmbH, Marburg,Germany). Положительные пробы затем подтверждали с использованием Multispot HIV-l/HIV-2 (SanofiDiagnostics Pasteur, Marnes-Ia Coquette, France). Двойные реактивные пробы посылали в замороженном виде в SMI в Стокгольме и подтверждали с использованием Immunocomb II Hiv-12 Bispot (Orgenics,Yavne, Israel). Количества CD4- и СD8-клеток измеряли с использованием способа иммуно-щелочной фосфатазы 13. Измерение suPAR. Измерения suPAR выполняли ретроспективно на замороженных пробах сыворотки с использованием сэндвич-ELISA. Иммунопланшеты (Maxisorb, Nunc, Denmark) инкубировали в течение ночи при 4 С с мышиным моноклональным антителом против человеческого suPAR, R2 (2 мкг/мл), в буфере для покрытия (15,1 мМ Na2 СО 3, 35,7 мМ NaHСО 3, рН 9,6). После инкубирования лунки промывали три раза буфером для промывок (ЗФР, 0,1% Твин 20). Неспецифическое связывание блокировали 2% бычьим сывороточным альбумином (профильтрованным БСА, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР) в течение 30 мин при 37 С (при встряхивании). После промывки три раза планшеты инкубировали с 10 мкл проб сывороток, разведенных 90 мкл буфера, рН 7,4 (7,3 мМKН 2 РО 4, 50,7 мМ NaH2PO4, 0,1 М NaCl, 0,5% феноловый красный) в течение одного часа при комнатной температуре. Детектирующий слой состоял из поликлонального кроличьего антитела против suPAR человека (1 мкг/мл) в буфере для разведения. Используемым вторичным антителом было моноклональное антитело против кроличьего иммуноглобулина, конъюгированное со щелочной фосфатазой (Sigma), разведенное 1:2000 в буфере для разведения. Спустя тридцать минут после добавления субстрата (1 таблетки п-нитрофенилфосфата, Sigma) в 12 мл раствора субстрата, рН 9,5 (0,1 М Трис-основание, 0,1 М NaCl,5 мМ MgCl2) реакции останавливали при помощи 50 мкл на лунку 1 М NaOH и измеряли оптическую плотность при 4 05 нм. Во всех планшетах включали три лабораторных стандарта. Вариации между анализами и внутри анализа были менее 10%. Порог детектирования suPAR был 0,03 нг/мл. Статистика. Все статистические анализы выполняли с использованием статистической программы SSPS, Version 10 или SAS. Для сравнений между группами использовали U-критерий Манна-Уитни или Т-критерий Стьюдента. Вероятность suPAR для прогнозирования активного ТВ оценивали с использованием логистической регрессионной модели. Все тесты вероятности выполняли в виде тестов коэффициентов сходств. Различие между кривыми Каплана-Мейера анализировали с использованием логарифмического рангового критерия. Возможность применения сывороточного suPAR для предсказания смертности в контексте с другими известными прогностическими маркерами оценивали с соблюдением норм и правил с использованием модели пропорциональных факторов риска Кокса. Весь тест проводили в виде частичных тестов коэффициентов сходств. Эта статистическая модель допускала иную, чем линейную взаимосвязь suPAR: смертность. Линейная взаимосвязь была достаточной. Использовали уровень значимости 5%. Регрессионный анализ Кокса проводили со времени включения в программу и до окончания лечения или наблюдения вследствие смерти (N=30), начиная с войны в Гвинее-Бисау (6 июня 1998 года) (N=50),или прекращения последующего наблюдения из-за того, что пациент вернулся в сельскую местность(N=23). Шестнадцать пациентов, которые получали лечение от ТБ в момент включения в программу, не включали в анализ выживаемости, так как лечение могло не влиять на их уровень suPAR. Что касается ВИЧ-статуса, пациентов с двойной инфекцией (как ВИЧ-1-, так и ВИЧ-2-положительных) включали в-6 005776 эти анализы в качестве ВИЧ-1-инфицированных, так как было обнаружено, что индивидуумы с двойным инфицированием имеют такой же риск и такую же тяжесть ТБ-инфекции, что и ВИЧ-1-индивидуумы. Этическая сторона. Доктора, ответственные за это исследование, предлагали всем, включенным в программу, предварительное и последующее консультирование. Субъектов информировали письменно на португальском языке и устно на их собственном языке перед включением в данное исследование. Информированное согласие было получено от всех пациентов. Это исследование было одобрено Министерством Общественного Здравоохранения Гвинеи-Бисау и Центральным Комитетом по Этике Дании. Результаты. Все 262 индивидуума имели поддающиеся измерениям уровни suPAR, и уровень медианы suPAR был 2,1 нг/мл (диапазон 0,66-18,7 нг/мл). Не было корреляции между возрастом и suPAR (p=0,9) и не было различия в уровнях suPAR между мужчинами и женщинами (р=0,87) (таблица 1). Из 262 индивидуумов о 16 уже было известно, что они имеют активный ТБ и они получали соответствующее лечение в момент включения в это исследование. Из остальных 244 индивидуумов активный ТБ диагностировали в 182, которые затем вступали в 8-месячную программу лечения. Среди них 84 были диагностированы как положительные посредством прямой микроскопии мокроты (ТВ-мокрота-положительные), а 35 случаев были отрицательными в прямой микроскопии, но положительными в культуре (ТБ-культураположительные), и 63 были диагностированы на клиническом и радиологическом основаниях (ТБпредположительные). Остальные 64 были диагностированы как имеющие пневмонию или бронхит (ТБотрицательные).suPAR является повышенным при туберкулезной инфекции. Уровни suPAR были значимо более высокими среди ТБ-положительных пациентов (ТБ-мокротаположительных, ТБ-культура-положительных и ТБ-предположительных, N=182) в сравнении с ТБотрицательными пациентами (N=64) (р 0,001) (фиг. 1). Уровни suPAR были повышенными у 84 ТБмокрота-положительных (р 0,001) и у 35 ТБ-культура-положительных (р=0,005) в сравнении с 64 ТБотрицательными пациентами. Была тенденция в направлении повышенных уровней suPAR у 63 дагностированных как ТБ-предположительные в сравнении с ТБ-отрицательными (р=0,06). Не наблюдали различия в уровнях suPAR между 16 пациентами, которые получали лечение перед включением в это исследование, и ТБ-отрицательными (р=0,72, t-критерий). Уровни suPAR показаны на фиг. 1.suPAR имеет диагностическую ценность для ТБ. При включении всех, участвующих в данном исследовании, была значительно более высокая вероятность диагностирования как ТБ с увеличением suPAR. Это показано в виде графика вероятностей на фиг. 2 а. Из-за трудностей диагностирования мокрота-отрицательных индивидуумов, представляющим наибольший интерес анализом был анализ, имел ли suPAR диагностическую ценность у 162 мокротаотрицательных индивидуумов, т.е. при исключении 84 мокрота-положительных. Авторы обнаружили,что был увеличенный риск диагностирования как ТБ-культура-положительные или ТБ-предположительные с увеличением уровней suPAR (р=0,001, фиг. 2b). Поскольку ВИЧ-1-инфекция влияет на уровень suPAR, авторы провели тот же самый анализ для 130 ВИЧ-1-отрицательных индивидуумов. (76 ВИЧ-1-отрицательных ТБ-культура-положительных или ТБ-предположительных и 54 ВИЧ-1 отрицательных ТБ-культура-отрицательных пациентов) и обнаружили ту же самую ассоциацию между увеличением вероятности диагностирования как ТБ-положительные и увеличением уровней suPAR(p=0,002, фиг. 2 с). Более высокий уровень suPAR при включении в программу среди ТБ-бактериологических пациентов, которые умерли во время последующего наблюдения. Пациентов наблюдали с момента включения в программу и лечили в течение 8-месячного периода. Тридцать пациентов умерли во время последующего наблюдения с медианой уровня suPAR 3,26 при включении в программу (диапазон 1,04-18,70), которая была значимо более высокой, чем среди 232 выживших (медиана suPAR 2,12, диапазон 0,66-16,22) (р=0,02). Среди 119 бактериологически подтвержденных ТБ-пациентов (ТБ-мокрота- и ТБ-культура-положительных) десять умерли во время последующего наблюдения. Те, которые умерли, имели значимо более высокие уровни suPAR (медиана 5,98 нг/мл, диапазон 1,3-18,3), чем выжившие (медиана 3,04 нг/мл (диапазон 0,9-14,7 (Манн-Уитни,р=0,022). Среди 63 ТБ-предположительных 13 умерли во время периода лечения. Уровень suPAR при включении в программу этих 13 пациентов, которые умерли, был 2,35 нг/мл (медиана) (диапазон 1,0-6,6) в сравнении с 2,12 (медиана) (диапазон 0,7-6,6) среди выживших (р=0,45). Среди 64 ТБ-отрицательных 7 умерли во время последующего наблюдения с медианой suPAR 3,32 (диапазон 1,43-18,70) и 57 были живыми при последующем наблюдении и имели медиану suPAR 1,17 нг/мл (диапазон 0,81-16,22) (р=0,04). При разделении этих пациентов на 4 группы равных размеров на основании уровня suPAR наблюдалась тенденция в направлении более высокой смертности среди пациентов с наивысшим квартилем suPAR в сравнении с наименьшим квартилем suPAR (5/65 против 13/65, р=0,07) (таблица 1). Анализ Каплана-Мейера для пациентов с активным ТБ. Не было различия в выживаемости среди пациентов с активным ТБ (ТБ-мокрота-, ТБ-культураположительных или ТБ-предположительных, n=182), при разделении пациентов по величине медианыsuPAR (фиг. 3 А). Пациенты с большей в 2 раза величиной медианы, т.е. пациенты, имеющие более высокий уровень, чем 4,2 нг suPAR на мл сыворотки (n=38), имели увеличенный риск смерти во время последующего наблюдения в сравнении с пациентами, имеющими величины suPAR менее 4,2 нг/мл (N=144)(MR=3,05 на нг увеличения suPAR, p=0,007), фиг. 3 В. Уровень suPAR, как прогностический фактор исхода инфекции ВИЧ-1. Было обнаружено, что 47 пациентов являются ВИЧ-1-инфицированными или пациентами с двойной инфекцией в момент включения в программу. ВИЧ-1-инфицированные имели медиану уровня suPAR 2,34 нг/мл (диапазон 0,92-18,7). Из этих 47 пациентов 13 умерли во время последующего наблюдения(медиана suPAR 3,43, диапазон 1,15-18,70). Эти пациенты имели значимо более высокую величину suPAR, чем 34 пациента, живые при наблюдении во время исследования (медиана suPAR 2,05, диапазон 0,92-6,88) (р=0,015, Манн-Уитни). Регрессионный анализ Кокса на ВИЧ-1-инфицированных пациентах показал, что suPAR был значимо ассоциирован с выживаемостью в этой подгруппе (р 0,001, MR=1,53). Было сходное различие в уровнях suPAR среди 66 ВИЧ-2-инфицированных индивидуумов (медиана suPAR 2,44, диапазон 0,91-18,30), из которых 7 умерли во время последующего наблюдения (медиана suPAR 3,32, диапазон 1,04-18,3), 59 выжили (медиана suPAR 2,44, диапазон 0,91-14,71), хотя это различие не было значимым вследствие меньшего числа смертей (р=0,64). Не было значимого различия между уровнями suPAR у пациентов с ТБ с ВИЧ-инфекцией или без ВИЧ-инфекции или между числом ВИЧ-1 или ВИЧ-инфицированных между различными ТБ-диагностическими группами (таблица 2). Уровень сывороточного suPAR коррелирует с выживаемостью в регрессионном анализе Кокса. За исключением 16 пациентов, которые получали лечение при включении в программу, 182 пациента, диагностированные как имеющие активный ТБ, наблюдались в течение периода до 8 месяцев после начала лечения и 23 умерли. В одномерных регрессионных анализах Кокса уровни suPAR были значимо ассоциированы со смертью во время лечения (увеличение отношения коэффициента смертности(MR)=1,18 на нг увеличения suPAR, p=0,01), так же как ВИЧ-1-инфекция (MR=2,66, p=0,023) и статус ТБ-положительные пациенты на основе клинических и радиологических обоснований (ТБпредположительные) (р=0,03). При лечении всех ТБ-положительных пациентов равным образом независимо от их ВИЧ-статуса, авторы изобретения не обнаружили влияния диагностического способа на время смерти, принимая во внимание уровень suPAR (р=0,43). Было обнаружено, что ни ВИЧ-2 положительный результат (р=0,63), ни возраст (р=0,72), ни пол (р=0,19), ни представленные в виде log 10 количества CD4 Т-клеток (р=0,42) не были значимо связаны с выживаемостью во время последующего периода наблюдения. В многомерном анализе Кокса, включающем все значимые факторы, все оставались значимыми,причем MR был 3,9 (р=0,003) для бактериологически ТБ-отрицательных (ТБ-предположительных) в сравнении с бактериологически ТБ-положительными пациентами, MR=2,1 (p=0,12) для ВИЧ-1 положительных в сравнении с ВИЧ-1-отрицательными ТБ-пациентами, и 1,28 (р 0,001) на нг увеличенияsuPAR. При исключении ВИЧ-1-положительных пациентов, 14 умерли среди остальных 149 ТБ-пациентов. Среди ВИЧ-1-отрицательных пациентов с активным ТБ, suPAR все еще сохранял прогностическую силу(RR=1,14, p=0,05). Таким образом, авторы данного изобретения наблюдали ту же самую зависимость доза/ответ (suPAR/время до смерти) при исключении ВИЧ-1-положительных пациентов. Обсуждение.Mycobacterium tuberculosis влияет на жизнь миллионов людей по всему свету, и оценивается, что 3 миллиона умирают от этого заболевания каждый год. В этом примере авторы устанавливают впервые,что молекула suPAR имеет диагностическую и прогностическую ценность в ТБ-инфекции. В этом примере 32 процента из 262 индивидуумов с подозрением на наличие ТВ были найдены положительными с использованием прямой микроскопии. Эти ТБ-мокрота-положительные пациенты имели более высокие уровни suPAR, чем пациенты, диагностируемые с использованием культуры (ТБкультура-положительные), или диагностированные клинически (ТБ-предположительные). Все эти пациенты имели более высокие уровни suPAR, чем ТБ-отрицательные. Из-за трудностей диагностики активного ТБ у пациентов, ТБ-отрицательных в соответствии с микроскопией, важным вопросом в данном исследовании был вопрос, могут ли уровни suPAR иметь диагностическую ценность в случае индивидуумов, у которых остается подозрение на наличие ТБ. Авторы данного изобретения обнаружили, что существовала увеличивающаяся вероятность для пациентов, диагностированных как имеющие активный ТБ по культуре (культура-положительных) или по клиническому обследованию (ТБ-предположительных), с увеличением уровня suPAR. ТБ-отрицательные пациенты были включены в данное исследование по подозрению ТБ вследствие родственных симптомов и рассматривались как имеющие пневмонию после отрицательных тестов в культуре и клиническом обследовании и лечились антибиотиками после вступления в программу. Авторы не знают, может ли быть уровень suPAR более высоким среди ТБ-отрицательных пациентов в сравнении с контрольной группой здоровых индивидуумов. Однако, было явное различие между ТБ-отрицательными пациентами и группами, диагностированными как имеющие активный ТБ, что указывало на то, что пневмония не могла быть причиной большого увеличения уровня suPAR.-8 005776 Шестнадцать пациентов получали соответствующее лечение ТБ в момент включения в программу. Уровень suPAR в сыворотке у этих пациентов был значимо более низким, чем у пациентов, диагностированных как ТБ после включения, и сравнимым с ТБ-отрицательными. Это указывает на то, что уровеньsuPAR может падать после лечения и что suPAR может быть использован для мониторинга действия лечения.suPAR был прогностическим показателем для выживаемости в этой группе. Среди ТБ-мокротаположительных и ТБ-культура-положительных 10 умерли во время последующего наблюдения, и эти индивидуумы имели значимо более высокие величины suPAR при включении в программу. Согласно регрессионному анализу Кокса, suPAR был значимо ассоциирован с выживаемостью среди 182 пациентов, диагностированных как имеющие ТБ. Авторы данного изобретения ранее показали, что suPAR является прогностическим показателем для прогрессирования ВИЧ-1-заболевания, и это наблюдение подтвердилось в данном исследовании. При исключении ВИЧ-1- и ВИЧ-1+ВИЧ-2-положительных, suPAR все еще оставался значимо ассоциированным с выживаемостью среди пациентов с активным ТБ. Другим фактором, значимо связанным с выживаемостью, в регрессионном анализе Кокса является тип дигностики ТБ. Пациенты, диагностированные как имеющие активный ТБ только клиническим испытанием (ТБпредположительные), имели больший риск смерти во время последующего наблюдения, что, возможно,связано с задержанным лечением. Наблюдение наивысшего уровня suPAR у ТБ-мокрота-положительных пациентов, затем у ТБ-культура-положительных пациентов и у ТБ-индивидуумов, отрицательных в бактериологических анализах (ТБ-предположительных пациентов), показало, что suPAR может коррелировать с бактериальной нагрузкой туберкулеза. Поскольку увеличенные уровни suPAR отражают, повидимому, увеличение экспрессии uPAR на поверхности клеток Mustjoki, открытия авторов данного изобретения предполагают, что suPAR и/или uPAR могут участвовать в патогенезе туберкулезной инфекции. Начальное взаимодействие между Mycobacterium tuberculosis и макрофагами хозяина является важной первой стадией в патогенезе туберкулеза. Эта стадия опосредована специфическими рецепторами моноцитов/макрофагов и лигандами, присутствующими на поверхности Mycobacterium tuberculosis (ТБ). Сообщались о нескольких рецепторах макрофагов, которые опосредуют связывание с М. tuberculosis, в том числе о рецепторах комплемента CR1, CR3 и CR4, рецепторе глюкана, липополисахаридном рецепторе маннозы и toll-подобных рецепторах. Однако, ни один из этих рецепторов не был продемонстрирован как существенный для взаимодействия макрофаг/М. tuberculosis. Участие CR3 в процессе инфицирования при туберкулезе было дополнительно показано посредством использования мышиных моделей с нокаутом CD11b, которые обнаруживают 60% уменьшение инвазионной способности по туберкулезу, но не влияют на внутриклеточную репликацию. Было показано, что uPAR образует комплекс с CR3 (mас-1,CD11b/CD18). uPAR связывает CR3 через CD11b (обзор в 14), приводя к активации этого комплекса. Таким образом, одна из возможных причин диагностической и прогностической роли suPAR в ТБ могла бы быть обусловлена участием во вхождении в клетку и повышением вхождения в клетку uPAR/CD11b M.tuberculosis. Другой возможностью является то, что uPAR повышающим образом регулируется внутриклеточной репликацией ТБ, что отражается в числе инфицированных клеток. Кроме ВИЧ-инфекции и,теперь, туберкулезной инфекции, сывороточный уровень suPAR является также прогностическим маркером для общей выживаемости пациентов, страдающих от рака яичника и колоректального рака и в ответ на терапию в случае лейкоза 15,11. Другим возможным повышающим suPAR фактором является Borreliaburgdorferi, так как недавнее исследование in vitro показало увеличенные уровни uPAR на моноцитарных клетках после инфекции. Чтобы иметь возможность сравнения данных между отдельными исследованиями по раку, ТБ- и ВИЧ-инфекции необходимо разработать воспроизводимый и коммерчески доступный анализ suPAR. Анализ, используемый в данном исследовании, сравним с анализом, используемым в прежних исследованиях авторов данного изобретения suPAR в качестве прогностического фактора в прогрессировании ВИЧ 7 и описан в этом исследовании Stephens et al. 16. В заключение можно сказать, что авторы данного изобретения обнаружили, что suPAR является повышенным у пациентов с активным ТБ и что пациенты с высоким уровнем suPAR имеют более высокий риск смерти во время периода лечения.-9 005776 Таблица 1. Пациенты, разделенные на четыре группы равного размера в соответствии с их уровнемsuPAR. В скобках показано количество пациентов, которые умерли во время последующего наблюдения. Таблица 2. Эта таблица иллюстрирует количество (и процент ТБ-диагностической группы) и suPAR Пример 2. Сывороточный уровень растворимого рецептора урокиназы повышается у туберкулезных пациентов, прогнозирует смертность во время лечения и может быть использован для мониторинга эффективности лечения ТБ.- 10005776 Цель. Исследование, несет ли сывороточный уровень растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) прогностическую информацию у индивидуумов, инфицированных Mycobacteriumtuberculosis, во время периода лечения и может ли он быть использован для мониторинга эффективности лечения ТБ. План исследования.suPAR измеряли при помощи ELISA у 262 индивидуумов в момент зачисления в группу на основании подозрения активного туберкулеза и у 101 индивидуума после 8 месяцев последующего наблюдения. Эти 262 индивидуума были теми же самыми, которые исследовались в примере 1. Результаты. Уровни suPAR были повышенными у пациентов с активным ТБ в сравнении с ТБ-отрицательными индивидуумами (р 0,001). Уровни suPAR были наивысшими у пациентов, положительных в отношении ТБ в прямой микроскопии (N=84, медиана suPAR 3,17 нг/мл, р 0,001), затем следовали пациенты, отрицательные в прямой микроскопии, но культура-положительные (N=35, медиана suPAR 2,41 нг/мл,р=0,005), и затем пациенты, диагностированные на клинических основаниях (N=63, медиана suPAR 2,13 нг/мл, р=0,06), в сравнении с 64 ТБ-отрицательными индивидуумами (медиана suPAR 1,73 нг/мл). Во время 8-месячного периода лечения 23 ТБ-пациента умерли. В многомерной модели Кокса, контролирующей статус ВИЧ, возраст, пол, число CD4 клеток и тип ТБ-диагноза, увеличение смертности на нгsuPAR было 1,25 (95% CI 1,12-1,40). После лечения уровни suPAR уменьшались до уровней ТБотрицательных индивидуумов. Выводы: уровни suPAR повышаются у ТБ-пациентов и ассоциируются со смертностью. Кроме того,suPAR является маркером эффективности лечения. Популяция исследования и способы. Критерии включения в программу и лабораторные способы. Включенными в данное исследование субъектами были те же самые субъекты, что и в примере 1. Различие между описанным здесь исследованием и исследованием в примере 1 является то, что это исследование исследует роль suPAR в качестве маркера во время 8 месяцев терапии. Кроме того, во время периода лечения умерли 30 пациентов. После 8 месяцев последующего наблюдения брали вторую пробу крови. Из 262 индивидуумов, включенных в данное изобретение, 101 индивидуумов были доступны для второго кровеизвлечения. Статистика. Для сравнений между группами использовали U-критерий Манна-Уитни, за исключением сравнений между уровнями suPAR до и после лечения ТБ, в которых использовали t-критерий Стьюдента для парных проб. Различие между кривыми Каплана-Мейера анализировали с использованием логарифмического рангового критерия. Возможность применения сывороточного suPAR для предсказания смертности с учетом других известных прогностических маркеров оценивали с соблюдением норм и правил с использованием модели пропорциональных факторов риска Кокса, допускающей нелинейные взаимосвязи между suPAR и смертностью. Все тесты проводили в виде частичных тестов коэффициентов сходств. Анализ времени смерти проводили от момента включения в программу до первого из событий: окончание лечения, 8 месяцев последующего наблюдения, смерти (N=30), начиная с войны в Гвинее-Бисау, которая влияла на лечение (N=50), или прекращения последующего наблюдения из-за того, что пациент вернулся в сельскую местность (N=23). Шестнадцать пациентов, которые получали лечение от ТБ в момент включения в программу, не включали в анализ выживаемости, так как лечение могло влиять на их уровень suPAR. Что касается ВИЧ-статуса, пациентов с двойной инфекцией (как ВИЧ-1-, так и ВИЧ-2 положительных) включали в эти анализы в качестве ВИЧ-1-инфицированных, так как было обнаружено,что индивидуумы с двойным инфицированием имеют такой же риск и такую же тяжесть ТБ-инфекции,что и ВИЧ-1-индивидуумы. Статистические анализы выполняли с использованием программы SSPS,Version 10 или SAS, Version 8.1. Для значимости использовали уровень 5%. Этическая сторона. Все субъекты получали письменную информацию на португальском языке и устную информацию на их местном этническом языке перед зачислением в программу исследования. Информированное согласие получали от всех пациентов. Это исследование было одобрено Министерством Общественного Здравоохранения Гвинеи-Бисау и Центральным Комитетом по Этике Дании. Результаты. Все 262 индивидуума имели поддающиеся измерениям уровни suPAR, и уровень медианы suPAR был 2,1 нг/мл (диапазон 0,66-18,7 нг/мл). Не было корреляции между возрастом и suPAR (p=0,9) и не было различия в уровнях suPAR между мужчинами и женщинами (р=0,87) (таблица 1). Из 262 индивидуумов о 16 уже было известно, что они имеют активный ТБ, и они получали соответствующее лечение в момент включения в это исследование. Из остальных 246 индивидуумов, активный ТБ диагностировали в 182, которые затем вступали в 8-месячную программу лечения. Среди них 84 были ТБ-мокротаположительными, 35 случаев были ТБ-культура-положительными и 63 были диагностированы как ТБ- 11005776 предположительные пациенты. Остальные 64 были диагностированы как ТБ-отрицательные. Во время периода лечения 30 пациентов умерли, из них 7 были ТБ-отрицательными (таблица 1).suPAR является повышенным в туберкулезной инфекции. Уровни suPAR были значимо более высокими среди ТБ-положительных пациентов (ТБ-мокротаположительных, ТБ-культура-положительных и ТБ-предположительных, N=182) в сравнении с ТБотрицательными пациентами (N=64) (р 0,001). Уровень suPAR, по-видимому, коррелирует с количеством микобактерий в мокроте, так как наивысшие уровни suPAR были обнаружены среди 84 ТБ-мокротаположительных пациентов (р 0,001), за которыми следовали ТБ-культура-положительные пациенты(р=0,001) и затем ТБ-предположительные пациенты (р=0,06), в сравнении с 64 ТБ-отрицательными пациентами, как показано на фиг. 1. Не наблюдали различия в уровнях suPAR между 16 пациентами, которые получали лечение перед включением в это исследование, и ТБ-отрицательными (р=0,72). Группирование пациентов в квартили в соответствии с уровнем suPAR показано в таблице 1. Анализ Каплана-Мейера для пациентов с активным ТБ. Не было значимого различия в коэффициенте выживаемости среди пациентов с активным ТБ (ТБмокрота-, ТБ-культура-положительных или ТБ-предположительных, n=182), при разделении пациентов по величине медианы suPAR (фиг. 3 А). Пациенты с высоким suPAR (с большей в 2 раза величиной медианы, т.е. пациенты, имеющие более высокий уровень, чем 4,2 нг suPAR на мл сыворотки (n=38, умирали значимо более быстро после зачисления в программу в сравнении с пациентами, имеющими величины suPAR менее 4,2 нг/мл (N=144, р=0,007), фиг. 3 В. Уровень сывороточного suPAR коррелирует с выживаемостью в регрессионном анализе Кокса. За исключением 16 пациентов, которые уже начали лечение в момент включения в программу, 182 пациента, диагностированные как имеющие активный ТБ, наблюдались в течение периода до 8 месяцев после начала лечения, 23 из них умерли. В одномерных регрессионных анализах Кокса уровни suPAR были значимо ассоциированы со смертью во время лечения, причем увеличение отношения коэффициента смертности (MR) было 1,18 на нг увеличения suPAR (95% CI: 1,06-1,30), так же как ВИЧ-1-инфекция(MR=2,71, 95% CI: 1,16-6,29) и статус ТБ-положительные, диагностированный на основе клинических и радиологических обоснований (ТБ-предположительные) (MR=2,48, 95% CI: 1,09-5,66). При лечении всех ТБ-положительных пациентов равным образом независимо от их ВИЧ-статуса и коррекции на уровеньsuPAR, авторы изобретения не обнаружили влияния диагностического способа на смертность (р=0,43). Было обнаружено, что ни ВИЧ-2-положительный результат (р=0,63), ни возраст (р=0,72), ни пол(р=0,19), ни представленные в виде log 10 количества CD4 Т-клеток (р=0,42) не были значимо связаны с выживаемостью. Все факторы, которые были обнаружены как значимые в одномерных анализах, оставались значимыми в многомерном анализе Кокса. При контроле на диагноз ТБ (ТБ-предположительные в сравнении с ТБ-пациентами, положительными в прямой микроскопии или в культуре, MR=3,5 (95% CI: 1,39-8,67 и на ВИЧ-статус (ВИЧ-1-положительные в сравнении с ВИЧ-1-отрицательными ТБ-пациентами, MR=2,5(95% CI: 1,07-5,99, увеличение в смертности на нг suPAR было MR=1,25 (95% CI: 1,12-1,40). При исключении ВИЧ-1-положительных индивидуумов, 14 умерли среди остальных 149 ТБпациентов во время последующего наблюдения. Среди этих 149 ТБ-пациентов suPAR все еще сохранял прогностическую силу (MR=1,14, 95% CI: 1,00-1,31). Таким образом, положительная ассоциация междуsuPAR и смертностью была сходной у ВИЧ-1-положительных и ВИЧ-1-отрицательных субъектов. Уровень suPAR как прогностический показатель исхода среди ВИЧ-1-или ВИЧ-2-инфицированных индивидуумов. Авторы изобретения показали ранее, что suPAR является сильным прогностическим фактором для прогрессирования ВИЧ-1. В данном исследовании было обнаружено, что 47 из 262 индивидуумов с подозрением на ТБ были ВИЧ-1-положительными в момент включения в программу и 13 из них умерли. Одномерный регрессионный анализ Кокса на ВИЧ-1-инфицированных пациентах показал, что suPAR значимо отрицательно ассоциировался с выживаемостью (n=47, MR=1,53 на нг увеличения suPAR, 95%CI: 1,22-1,92). Другие параметры (возраст, пол, диагноз ТБ или количество CD4 Т-клеток) не были значимо ассоциированы с выживаемостью в этой подгруппе. Шестьдесят шесть из 262 индивидуумов были ВИЧ-2-положительными в момент зачисления в программу (не считая пациентов с двойным инфицированием), из которых семь умерли во время последующего наблюдения. suPAR проявлял сходное действие на выживаемость (n=66, MR=1,13, 95% CI: 0,971,32), хотя различие не было значимым, вследствие меньшего числа смертей. Ни возраст, ни пол, ни диагноз ТБ, ни количества CD4 Т-клеток не были значимо связаны с выживаемостью в этой ВИЧ-2-группе. Не было значимых различий в уровнях suPAR в ТБ-пациентах с ВИЧ-инфекцией или без ВИЧ-инфекции или между ВИЧ-1- и ВИЧ-2-инфицированными индивидуумами в различных ТБ-диагностических группах. Лечение было ассоциировано с уменьшением уровней suPAR. Из 262 индивидуумов, включенных в данное исследование, пробы сыворотки были доступны от 101 пациентов после 8 месяцев лечения. При включении в исследование 45 были диагностированы как ТБмокрота-положительные, 15 как ТБ-культура-положительные, 22 как ТБ-предположительные, 6 как по- 12005776 лучавшие лечение при включении и 13 как ТБ-отрицательные. Уровни до и после лечения для этих индивидуумов показаны на фиг. 3. Лечение было ассоциировано со значимым уменьшением suPAR среди 4 5 мокрота-положительных (95% CI: -2,07 - -0,56 нг/мл) и незначимым уменьшением для 15 ТБ-культураположительных (95% CI: -2,12 -0,24 нг/мл). Не наблюдали различия в величинах suPAR до и после обработки для ТБ-предположительных (95% CI: -0,81 - 0,84 нг/мл) или для пациентов, получающих лечение при включении в исследование (95% CI: -3,3 - 3,1 нг/мл). Увеличение suPAR наблюдали после лечения среди 13 ТБ-отрицательных (3 ВИЧ-2-положительных и 10 ВИЧ-отрицательных (р=0,041, 95% CI: 3,311,33 нг/мл. Увеличение было наиболее заметным среди трех ВИЧ-2-положительных. Уровни suPAR после лечения не различались между различными диагностическими группами (фиг. 3). Обсуждение.Mycobacterium tuberculosis влияет на жизнь миллионов людей по всему свету, и оценивается, что 2 миллиона умирают от этого заболевания каждый год. В этом примере авторы обнаружили, что уровниsuPAR были повышенными у ТБ-пациентов, они коррелируют с типом диагноза ТБ и имеют прогностическую ценность. Кроме того, лечение ассоциировалось с уменьшенными уровнями suPAR. Было обнаружено, что suPAR является значимо более высоким среди ТБ-пациентов в сравнении с ТБ-отрицательными пациентами. Кроме того, наивысшие уровни suPAR были обнаружены у ТБпациентов, положительных в прямой микроскопии, затем следовали пациенты, отрицательные в прямой микроскопии, но положительные в культуре, и затем ТБ-пациенты, отрицательные как в прямой микроскопии, так и в культуре. При условии, что культура является более чувствительным способом, чем прямая микроскопия в диагностировании присутствия AFB в мокроте, эти результаты могут свидетельствовать о том, что уровень suPAR в крови коррелирует с количеством бактерий в мокроте и, следовательно,бактериальной нагрузкой в бронхах. Повышенные уровни suPAR могут быть результатом мобилизации макрофагов в бронхах. Прикрепление и миграция моноцитов включает в себя функциональное взаимодействие между uPAR и интегринами, что подтверждается также исследованиями на мышах с нокаутомuPAR May, Kanse, et al. 1998 MAY 1998/id. Лучше всего описанным взаимодействием uPAR/интегрин является взаимодействие между uPAR и CD11b/CD18 (рецептором комплемента 3 или МАС-1) Simon,Rao, et al. 1993 14/id. После подачи этого изобретения Juffermans et al. показали совпадающую повышающую регуляцию uPAR и CD11b во время экспериментальной эндотоксемии с использованием LAM,компонента клеточной стенки Mycobacterium tuberculosis 17. Интересно, что было также показано, чтоCD11b/CD18 опосредует прикрепление М. tuberculosis к макрофагам 18, что позволяет предполагать, что ТБ может использовать эту повышающую регуляцию для прикрепления и инфицирования рекрутированных макрофагов. Таким образом, авторы данного изобретения предполагают, что CD11b/CD18 может быть новой мишенью для взаимодействия М. tuberculosis. С использованием регрессионного анализа Кокса было обнаружено, что suPAR был значимо ассоциирован с выживаемостью среди 182 пациентов с диагностированным ТБ. В Гвинее-Бисау преобладание ВИЧ является более высоким среди пациентов с ТБ в сравнении со здоровыми контролями. Авторы показали ранее, что suPAR является сильным прогностическим маркером для прогрессирования ВИЧ-1 заболевания 11, и это наблюдение было подтверждено в данном исследовании. Однако, даже при исключении ВИЧ-1-инфицированных, suPAR все еще остается значимо ассоциированным с выживаемостью среди пациентов с активным ТБ. Восьмимесячное лечение приводит к значимому уменьшению уровней suPAR, приводя к сходным уровням между диагностированными с наличием ТБ или без ТБ при включении. Кроме того, шестнадцать пациентов уже получали соответствующее лечение ТБ в момент включения в это исследование. Сывороточные уровни suPAR у этих пациентов были значимо более низкими, чем у пациентов, диагостированных как имеющие ТБ, после включения, и сравнимыми с ТБ-отрицательными. Эти наблюдения показывают, что измерение suPAR может быть ценным инструментом для мониторинга ответа на лечение ТБ-пациентов.suPAR является повышенным и прогностическим для исхода в ВИЧ-1-инфекции. Данное изобретение показало, что сывороточный уровень suPAR является повышенным у ТБ-пациентов и что уровень перед лечением положительно ассоциирован со смертностью пациентов, получающих лечение в отношении ТБ. Выводы. Сывороточный уровень растворимого рецептора урокиназы (suPAR) является повышенным у пациентов с активным туберкулезом и наивысшим у пациентов, которые являются мокрота-положительными в микроскопических анализах. Было обнаружено, что suPAR положительно ассоциирован со смертностью ТБ-пациентов во время лечения, даже при исключении пациентов, одновременно инфицированных ВИЧ-1, для которых, как известно, suPAR является очень сильным прогностическим маркером. После лечения мокрота-положительные пациенты имели значимо более низкие уровни suPAR, что позволяет предполагать, что suPAR мог бы использоваться для мониторинга эффективности лечения ТБ.- 13005776 Пример 3. Уровень в плазме растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена является повышенным у пациентов с бактериемией Streptococcus pneumoniae и имеет большую прогностическую ценность.Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) является первичным агентом внебольничной (домашней) пневмонии и в высокой степени ассоциирован с бактериемией. Ежегодная встречаемость пневмонии оценивается как 1-12 на 1000 населения в развивающихся странах. Пневмококковая бактериемия находится в диапазоне 9-18 на 100000 в год. Смертность от пневмококковой бактериемии составляет 17%36% с наивысшей смертностью среди пожилых людей. Рецептор активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR/CD87) экспрессируется на различных типах клеток, в том числе нейтрофилах, лимфоцитах, макрофагах, эндотелиальных и злокачественных клетках. Хорошо известно, что uPAR участвует в многочисленных биологических функциях. uPAR и его лиганд активатор плазминогена урокиназного типа (uРА) участвуют в превращении плазминогена в плазмин. Кроме того, uPAR связывает -интегрины, а также сигналы рекрутинга воспалительных клеток 10. В патогенезе рака uРА и uPAR играют ключевую роль в инвазии в ткани посредством деградации внеклеточного матрикса. uPAR может отщепляться от клеточной поверхности рядом протеаз, таких как химотрипсин, фосфолипаза С и uPA 19. Протеолитическое отщепление uPAR от клеточной поверхности высвобождает хемотаксическую активную форму suPAR. Альтернативно, uPAR высвобождается/секретируется из клеточной поверхности без протеолиза. Недавно авторы данного изобретения сообщили о сильной корреляции между прогрессированием патологического состояния ВИЧ-1-инфекции и повышенным suPAR, что предполагает использованиеsuPAR в качестве прогностического маркера. Наконец, как показано в данной заявке, пациенты с легочным туберкулезом имеют увеличенные сывороточные уровни suPAR. Возможная роль suPAR и uРА в иммунных реакциях против других инфекционных заболеваний остается невыясненной. Мыши с нокаутом гена, не имеющие uPAR, показали уменьшенный легочный рекрутинг нейтрофилов и увеличенную смертность в инфекции Streptococcus pneumoniae в сравнении с мышами дикого типа 20. Липотейхоевая кислота из Streptococcus pyogenes способствует повышающей регуляции uPAR моноцитов in vitro. Сообщалась также повышающая регуляция uPAR моноцитами, индуцируемая поверхностными белками Borrelia burgdorferi 21. Было описано, что сывороточный уровень белка YKL-40 повышается во время пневмонии, и он используется в качестве независимого прогностического фактора у пневмококковых бактериемических пациентов. Здесь авторы исследуют, влияет ли бактериемия Streptococcus pneumoniae на уровень suPAR в плазме. Авторы впервые сообщают, что suPAR является повышенным и имеет прогностическую ценность у пациентов с бактериемией S. pneumoniae. Субъекты и способы. Пациенты. Между октябрем 1999 года и июнем 2001 года в исследование были включены взрослые(18 лет или старше) с бактериемией S. pneumoniae, поступившие в одну из пяти университетских больниц (Aalborg, Aarhus, Odense, Hvidovre или Rigshospitalet) в Дании. Пробы крови брали в момент включения в исследование (в момент госпитализации) и клинические данные во время госпитализации собирали в дальнейшем, как описано (G. Kronborg, N. Weis, H.O. Madsen, S.S. Pedersen, С. Wejse, H. Nielsen,P. Skinhoj, P. Garred, в печати). Для сравнения кровь брали у группы 30 здоровых индивидуумов (работников лаборатории) (контрольная группа). В целом 141 пациентов, 77 женщин и 64 мужчин, были включены в исследование. Средний возраст пациентов был 64 года с диапазоном 20-99 лет. Шестьдесят шесть процентов этих пациентов имели другое лежащее в основе заболевание, и пневмония была наиболее обычным очагом инфекции (n=116). Двадцать четыре пациента умерли в больнице (коэффициент смертности=17%). Характеристики фона (базового уровня) пациентов приведены в таблице 3. Все пациенты получали соответствующее лечение антибиотиками либо с начала поступления, либо когда культура крови становилась положительной. Это исследование было одобрено местными комитетами по этике. Планшеты Maxisorb ELISA (Nunc, Rosklide, Denmark) покрывали и инкубировали в течение ночи при 4 С 100 мкл 2 мкг/мл мышиного моноклонального анти-suPAR-антитела против suPAR человека,разведенного в буфере для покрытия (15,1 мМ Na2CO3, 35,7 мМ NaHC3, pH 9,6). Планшеты промывали три раза буфером (ЗФР, 0,1% Твин 20) и блокировали с использованием SuperBlock (Pierce Chemicals),разведенным 1:1 в ЗФР. Добавляли пробы плазмы, разведенные в буфере для разведения (7,3 мМ КН 2 РО 4, 50,7 мМ Na2HPO4, 0,1 М NaCl, 0,5% феноловый красный, рН 7,4), и планшеты инкубировали в течение ночи при 4 С. Связанный suPAR детектировали с использованием поликлонального кроличьего антитела против suPAR человека (любезный подарок от доктора Gunilla Hoyer-Hansen) и мышиного антикроличьего поликлонального антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой (Sigma, St. Louis,МО, USA), разведенного 1:2000. Каждой стадии предшествовала промывка 6 раз буфером для промывок,антитела разводили в буфере для разведения и планшеты инкубировали 1 ч при 37 С. В лунки добавляли- 14005776 субстрат (1 таблетку п-нитрофенилфосфата (Sigma, St. Louis, МО, USA) в 12 мл 0,1 М Трис-основания,0,1 М NaCl, 5 мМ МgСl2, рН 9,5) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакции останавливали добавлением 50 мкл на лунку 1 М NaOH и измеряли оптическую плотность при 405 нм. Все измерения ELISA проводили в двух повторностях. YKL-40 измеряли при помощи ELISA. Статистика. Сравнения между группами проводили при помощи U-критерия Манна-Уитни. suPAR в качестве прогностического маркера анализировали с использованием логистического регрессионного анализа. Величину р менее 0,05 рассматривали как значимую. Все анализы проводили с использованием программы SPSS (SPSS, Chikago, I1, USA). Результаты.suPAR является повышенным у пневмококковых бактериемических пациентов. Уровень suPAR в плазме был измеряемым во всех 141 пробах с величиной медианы 5,5 нг/мл (диапазон 2,4-21,0 нг/мл). Уровень медианы suPAR в контрольной группе был 2,6 нг/мл (диапазон 1,5-4,0 нг/мл). Уровни suPAR у пневмококковых бактериемических пациентов были значимо более высокими, чем в здоровых контроляхsuPAR прогнозирует исход инфекции. Разделение пациентов на одну группу, перенесших эту инфекцию (n=117), и одну группу пациентов, где инфекция заканчивалась смертью (n=24), показало значимо более высокие уровни suPAR в последней группе (фиг. 5 В, р=0,0001). Из умерших пациентов 79%(n=19) имели уровни suPAR, превышающие медиану 5,5 нг/мл. Клинические параметры прогностического значения в отношении смерти, вызываемой этой инфекцией, были такими, как описанные (G. Kronborg et al., в печати): церебральные симптомы (спутанность сознания, бессознательное состояние) в момент поступления (р=0,03), гипотензия (р=0,047) и почечная недостаточность (р=0,002); см. таблицу 3. Уровень suPAR был значимо повышенным у пациентов с гипотензией (р=0,0001) и почечной недостаточностью (р=0,0001). suPAR был также повышенным в группе хронических алкоголиков (р=0,0001). Основные заболевания не были значимо ассоциированными с летальным исходом пневмококковой бактериемии, за исключением алкоголизма (р=0,04).suPAR коррелировал с YKL-4 0, но не с CRP. YKL-40 является лектином, секретируемым из нейтрофилов и макрофагов (25). При сравнении уровней suPAR с уровнями YKL-40 (n=89) авторы данного изобретения обнаружили сильную корреляцию между suPAR и YKL-40 (коэффициент ранговой корреляции Спирмана: 0,70, р=0,0001). У большинства пациентов измеряли их уровень CRP. Не было корреляции между уровнями suPAR и уровнями CRP (n=131). Высокие уровни CRP не были прогностическими в отношении смерти.suPAR является независимым прогностическим маркером. В логистическом многомерном регрессионном анализе (таблица 3) , включающем все параметры, которые были обнаружены как значимые в одномерном анализе (церебральные симптомы, искусственная вентиляция легких, лечение гипотензии,почечная недостаточность, злоупотребление алкоголем и YKL-40), только suPAR оставался значимо ассоциированным со смертью. Пациенты с уровнем suPAR в плазме более 10 нг/мл имели коэффициент смертности (MR) 13 (р=0,04) и увеличение 1,31 на нг/мл suPAR (95% CI: 1,10-1,57), suPAR был в диапазоне от 2,4 до 21 нг/мл. Обсуждение. В этом исследовании авторы данного изобретения впервые демонстрируют, что уровни suPAR являются высоко повышенными у пациентов с пневмококковой бактериемией. Повышенные уровни suPAR были ранее обнаружены у пациентов с различными формами злокачественных заболеваний, а также с ВИЧ-1-инфекцией и с родственными легочными заболеваниями, например, у пациентов с не подвергаемым лечению активным туберкулезом.suPAR в плазме является сильным прогностическим фактором смерти с коэффициентом смертности 1,31 на нг увеличения suPAR (suPAR варьировался между 2,4 и 21,0 нг/мл) в пневмококковой бактериемии. Из этого исследования авторы могут сделать вывод только о прогностической ценности suPAR для пациентов с пневмококковой бактериемией. Гипотензия, почечная недостаточность, церебральные симптомы, хроническое злоупотребление алкоголем и повышенный уровень YKL-40 в плазме, все имели прогностическое значение, но только повышенные уровни suPAR были независимым прогностическим фактором смерти в многомерном логистическом регрессионном анализе. Авторы изобретения предлагают suPAR в плазме в качестве нового прогностического маркера для пациентов с пневмококковыми инфекциями. Трудно сравнивать величины suPAR из различных исследований вследствие вариаций между анализами, а также трудностей в клинических состояниях включенных в такое сравнение пациентов. Однако, suPAR, по-видимому, является очень сильно повышенным у пациентов с пневмококковой бактериемией в сравнении со здоровыми контролями. В исследовании Riisbro et al. 53 пациента с раком яичника имели медиану уровня suPAR 1,3 нг/мл, а здоровые субъекты имели медиану уровня 0,9 нг/мл, что имело результатом 44% в случае раковых пациентов. Пневмококковые пациенты имели явно более высокое повышение медианы suPAR 112% в сравнении со здоровыми контролями.- 15005776 Авторы изобретения обнаружили тесную корреляцию между suPAR и YKL-40. В многомерном анализе YKL-40 более 500 нг/мл, церебральные симптомы и гемодиализ были ассоциированы с повышенным MR, но они не были значимыми. Сообщалось о повышенных уровнях suPAR в плазме для группы (n=13) пациентов с ICUсепсисом 22, приводящие к предположениям, что секреция suPAR увеличивается во время острого воспаления. Авторы данного изобретения сравнивали уровни suPAR с CRP и не нашли корреляции. Это открытие подтверждается Slot et al. 6, которые не обнаружили корреляции между suPAR и CRP у пациентов с ревматическими заболеваниями. Таким образом, это исследование обнаружило существенное доказательство для исключения возможности того, что suPAR является реагентом острой фазы. Доказательства происхождения suPAR плазмы остаются недостаточными. Однако, известно, чтоuPAR состоит из трех доменов, и протеолитическое расщепление между доменом 1 (D1) и 2+3 (D2D3) создает хемотаксический активный домен D2D310. Протеолитическое расщепление опосредовано как его собственным лигандом, uРА, так и различными протеазами, например, химотрипсином. Авторы изобретения использовали в качестве захватывающего антитела моноклональное анти-suPAR, направленное против домена 3, в используемом ими анализе ELISA. Это означает, что как интактный suPAR, так и хемотаксический домен D2D3 детектировались в анализе авторов. Повышенный уровень suPAR плазмы,наблюдаемый в случае пневмококковой пневмонии, может быть обусловлен увеличенной секрецией из лейкоцитов. Во время пневмококковой пневмонии высвобождаются цитокины и различные хемотаксические вещества, и увеличенная смертность ассоциирована с высоким уровнем легочного интерлейкина-6.uPAR играет важную роль как в природном, так и в приобретенном иммунитете. May 23 et al. показали, что у трансгенных мышей, не имеющих uPAR, присутствие uPAR является решающим для прикрепления лейкоцитов к эндотелию. Мыши с нокаутом, не имеющие uPAR, обнаруживают уменьшенную иммунную реакцию на S. pneumoniae с уменьшенным рекрутингом нейтрофилов в легкое, а мыши, не имеющие иРА, имели увеличенную иммунную реакцию на S. Pneumoniae 20. Эти наблюдения предполагают, что uPAR необходим для рекрутинга нейтрофилов, но этот механизм является независимым от протеолитической активности. Считается, что, кроме активации плазмина, uPAR опосредует межклеточное взаимодействие через интегрины и посредством этого участвует в трансдукции сигнала. Хорошо описано, что инвазивные бактерии используют систему плазмина хозяина для деградации внеклеточного матрикса, например, стрептококки группы А активируют плазминоген при помощи стрептокиназы. Возможная протеолитическая роль uPAR/uPA в миграции нейтрофилов и моноцитов к Mycobacterium tuberculosis и Streptococcus pneumoniae все еще требует исследования. Описанные увеличения уровня suPAR плазмы во время бактериемии могут отражать повышающую регуляцию uPAR на нейтрофилах, моноцитах и васкулярных клетках и свидетельствуют об увеличенной активности нейтрофилов и моноцитов. В заключение, можно сказать, что, подобно ситуации для пациентов с туберкулезом, suPAR плазмы является увеличенным и является независимым прогностическим фактором смерти у пациентов с пневмококковой пневмонией. Таблица 3. Распределение возраста и пола 141 включенных в исследование пациентов и прогностические факторы в бактериемии S. pneumoniae. Эта таблица показывает коэффициент смертности (MR), прогнозируемый различными прогностическими факторами. Все факторы в одномерном логистическом регрессионном анализе были значимыми(р 0,05). В многомерном анализе только уровни suPAR более 10 нг/мл оставались значимыми. Церебральные симптомы определяются как бессознательное состояние или тяжелая спутанность сознания при госпитализации. Данныебыли доступными для 139 пациентов. CI: доверительный интервал. Пример 4. Корреляция между положительным результатом мазков на ТБ и уровнем suPAR. Цель. Определение, имеет ли suPAR диагностическую ценность в ТБ-инфекции в сравнении с микроскопическим анализом. Материал и субъекты. В это исследование включали 69 пациентов из пригородных зон в Бисау, столице Гвинеи-Бисау. Критериями для включения в это исследование были один или несколько из следующих симптомов и признаков без другого объясняющего эти признаки заболевания: стойкий кашель (более 1 месяца) без улучшения при приеме антибиотиков, постоянная или периодическая лихорадка в течение более чем 1 месяц, потеря веса, одышка, кровохарканье, ночная потливость или лимфаденопатия. suPAR измеряли в мокроте 69 пациентов. Всех пациентов анализировали на кислотостойкие бациллы (AFB) прямой микроскопией мокроты. suPAR измеряли с использованием ELISA. Результаты. Все 69 индивидуумов имели измеримый suPAR в мокроте. Медиана suPAR была 24,9 нг/мл мокроты (диапазон 3,1-50,0). Девять пациентов были положительными в отношении AFB в прямой микроскопии, и эти пациенты имели медиану suPAR 50 нг/мл (максимум в анализе, диапазон 9,73-50). Это было значимо более высоким, чем среди 60 пациентов, отрицательных в отношении AFB в прямой микроскопии (медиана suPAR 20,3 нг/мл; диапазон 3,1-50 нг/мл), р=0,002, критерий Манна-Уитни (фиг. 6). Обсуждение. Данное изобретение показывает, что пациенты, положительные в отношении AFB, имеют значимо более высокие уровни suPAR, чем индивидуумы, отрицательные в отношении AFB в прямой микроскопии. Таким образом, suPAR несет диагностическую информацию о положительной ТБ-мокроте у ТБпациентов. Пример 5. Пациенты с активным ТБ имеют более высокий уровень suPAR в мокроте. Цель.- 17005776 Определение, является ли suPAR измеримым в мокроте и имеют ли пациенты, получающие лечение, более низкие уровни suPAR, чем пациенты, которые являются ТБ-положительными, но не получают лечения. Материалы и субъекты. 25 пациентов из четырех пригородных зон в Бисау, столице Гвинеи-Бисау, были включены в это исследование. Критериями для включения в это исследование были один или несколько из следующих симптомов и признаков без другого объясняющего эти симптомы заболевания, стойкий кашель (более 1 месяца) без улучшения при приеме антибиотиков, постоянная или периодическая лихорадка в течение более чем 1 месяц, потеря веса, одышка, кровохарканье, ночная потливость или лимфаденопатия. suPAR измеряли в мокроте 25 пациентов. Все пациенты имели признаки, симптомы и определяемые рентгеном изменения, совместимые с активным ТБ, в грудной клетке и с обнаружениями кислотостойких бацилл(AFB) в прямой микроскопии мокроты. Семь из пациентов получали лечение в момент взятия проб мокроты и 18 пациентов получали лечение после взятия проб мокроты. Лечение, состоявшее из 4-месячной интенсивной фазы ежедневного непосредственно наблюдаемого лечения этамбутолом, изониазидом, рифампицином и пиразинамидом, сопровождалось 4-месячной дополнительной фазой с изониазидом и этамбутолом, забираемыми в центре здоровья два раза в месяц пациентом. Эта программа лечения была рекомендована для ВИЧ-инфицированных индивидуумов национальной программой по туберкулезу в Гвинее-Бисау в начале этого исследовательского проекта в 1996 году. По причинам конфиденциальности и сравнимости ВИЧ-инфицированные и неинфицированные индивидуумы получали одно и то же лечение. Кроме того, все пациенты получали ежедневно комплекс витамина В и мультивитамины. Соблюдение лечения проверяли счетом пилюль и анализом мочи на INH во 2-ом, 5-ом и 8-ом месяце последующего наблюдения. Не выполняющих схемы приема лекарств пациентов навещала медицинская сестра и уговаривала их продолжать лечение. Специфические для ВИЧ лекарственные средства или профилактическое лечение ВИЧ-родственных заболеваний не были доступными в Гвинее-Бисау, стране, которая является одной из самых бедных стран в мире. Результаты. 18 пациентов были положительными в отношении AFB и 7 пациентов были положительными в отношении AFB, но получали лечение. Наблюдали значимо более высокие уровни suPAR в мокроте пациентов, которые не получали лечения, в сравнении с 7 ТБ-пациентами, которые получали лечение(р=0,024) (фиг. 7). Обсуждение. В этом исследовании авторы изобретения обнаружили, что suPAR поддается определению в мокроте. Что наиболее важно, авторы показывают, что ТБ-пациенты, не получающие лечения, имеют значимо более высокие уровни suPAR в сравнении с пациентами после начала лечения. Таким образом, начало лечения приводит к уменьшению suPAR в мокроте, и, следовательно, измерение suPAR в мокроте может быть использовано для мониторинга эффективности лечения ТБ. Пример 6. Цель. Определение, является ли suPAR измеримым в цереброспинальной жидкости. Материалы и способы. Цереброспинальную жидкость получали от 23 пациентов с пневмококковым заболеванием и от 1 контроля. suPAR измеряли при помощи ELISA. Результаты.suPAR был измеримым в цереброспинальной жидкости всех 24 индивидуумов, включенных в это исследование. Медиана suPAR была 3,49 нг/мл цереброспинальной жидкости. Контрольный пациент имел величину suPAR 0,69 нг/мл. Обсуждение. В этом исследовании авторы показывают, что suPAR является измеримым в цереброспинальной жидкости. Таким образом, измерение suPAR в цереброспинальной жидкости может быть использовано в диагностических и прогностических целях. Пример 7. На уровень suPAR не влияет инфекция HCV или лечение альфа-интерфероном и рибавирином. Предпосылки исследования. Авторы данного изобретения показали, что уровень suPAR (растворимого рецептора урокиназы) увеличивается у пациентов с ВИЧ, туберкулезной инфекцией или инфекцией Streptococcus pneumoniae и что suPAR является независимым высоко значимым прогностическим маркером для этих заболеваний. Целью данного исследования было определение, изменяется ли уровень suPAR инфекцией и лечениемHCV (вируса гепатита С). Если suPAR модулируется HCV-инфекцией, это может оказывать влияние на прогностическую ценность suPAR в инфицированных ВИЧ, Mycobacterium tuberculosis или Streptococcus- 18005776 Сорок семь HCV-положительных пациентов лечили альфа-интерфероном и рибавирином в течение 12 месяцев. Все пациенты были ВИЧ- и HBV-отрицательными. Пробы крови брали непосредственно перед терапией (Т 0) и в конце лечения (Т 12) и спустя 6 месяцев (Т 18). Для сравнения включали пробы плазмы из 30 здоровых контролей. suPAR измеряли при помощи ELISA, а вирусную нагрузку HCV при помощи ОТ-ПЦР. Результаты. Наблюдали значимое снижение вирусной нагрузки HCV после терапии (t-критерий с парными пробами, р=0,033). Не было различия в уровнях suPAR между пациентами перед лечением (медиана suPAR: 2,58 нг/мл (диапазон 1,15-6,01, после лечения (медиана suPAR: 2,52 нг/мл (диапазон 1,24-6,26 и при 6 месячном последующем наблюдении (медиана suPAR 2,43 нг/мл (диапазон 1,21-4,98. Не наблюдали различия в suPAR между пациентами и контролями (р=0,68). suPAR в высокой степени коррелировал во всех временных точках (Т 0-Т 12, Т 0-Т 18 и Т 12-Т 18, все имели р 0,001, все r0,67, корреляция Пирсона). Кроме того, не было различия в suPAR между 30 реагирующими на лечение и 19 не реагирующими на лечение пациентами (р=0,39). Вывод. Уровни suPAR в плазме оставались стабильными на протяжении времени, указывая на возможное применение suPAR в качестве серологического маркера. Инфекция HCV, титр HCV, введение терапии альфа-интерфероном и рибавирином не влияют на уровень suPAR в сыворотке. Эти данные предполагают, что коинфицирование HCV/HIV (ВИЧ) не влияет на suPAR как прогностический маркер в ВИЧинфицированных, инфицированных Mycobacterium tuberculosis или Streptococcus pneumoniae пациентах. Пример 8. Экспрессия uPAR на РВМС коррелирует с уровнем suPAR в сыворотке. Предпосылки. Определение, имеется ли значимая взаимосвязь между поверхностной экспрессией uPAR и сывороточным уровнем suPAR. Способы. Кровь брали у 10 здоровых доноров, посещающих донорскую клинику при Hvidovre Hospital. Сыворотку собирали и измеряли концентрацию suPAR при помощи ELISA. РВМС собирали с использованием центрифугирования в градиенте Histopaq и экспрессию CD87 измеряли с использованием антителаR2 и вторичного FITC-конъюгированного антитела против мышиного антитела с использованием FACSанализа. В качестве контроля на специфичность включали идиотипическое антитело отрицательного контроля. Результаты. Все доноры крови имели измеримый рецептор uPAR на РВМС и измеримый suPAR в сыворотке. Сывороточные уровни suPAR значимо коррелировали с поверхностной экспрессией uPAR (корреляция Пирсона, р 0,05) (фиг. 8). Обсуждение. Здесь авторы данного изобретения показали значимую взаимосвязь экспрессии uPAR (CD87) на поверхности РВМС и уровнем suPAR в сыворотке. Это согласуется с наблюдениями других авторов 11, которые также обнаруживают, что уровень uPAR на циркулирующих в кровотоке клетках коррелируют значимо с уровнем suPAR в плазме/сыворотке. Таким образом, разумно предположить, что поверхностная экспрессия uPAR может быть сильным прогностическим фактором у пациентов с инфекцией Mycobacterium tuberculosis и Streptococcus pneumoniae. CD87 (uPAR) мог бы измеряться при помощи FACS и посредством этого добавлять ценную информацию в отношении диагноза, а также состояния прогрессирования заболевания у пациентов. Ссылки 1. Nykjaer, А., В. Moller, R.F. Todd, III, Т. Christensen, P.A. Andreasen, J. Gliemann, and C.M. Petersen. 1994. Urokinase receptor. An activation antigen in human T lymphocytes. J Immunol 152:505-516. 2. Speth, C. I. Pichler, G. Stockl, M. Mair, and M.P. Dierich. 1998. Urokinase plasminogen activator receptor (uPAR; CD87) expression on monocytic cells and T cells is modulated by HIV-1 infection. Immunobiology 199:152-162. 3. Sier, C.F., N. Sidenius, A. Mariani, G. Aletti, V. Agape, A. Ferrari, G. Casetta, R.W. Stephens, N. Brunner, and F. Blasi. 1999. Presence of urokinase-type plasminogen activator receptor in urine of cancer patientsreceptor Blood 96 506-513. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ диагностики и/или прогнозирования респираторных бактериальных инфекций у субъекта,предусматривающий стадии(a) выполнения in vitro измерения уровня одного или нескольких маркеров в форме (i) рецептора урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) и/или (iii) одного или нескольких продуктов деградации (i) или (ii) в пробе биологической жидкости от субъекта и(b) использования полученной величины измерения для оценки состояния субъекта.- 20005776 2. Способ по п.1, где респираторная бактериальная инфекция обусловлена патогенами Streptococcuspneumoniae или Mycobacterium tuberculosis. 3. Способ по п.1 или 2, где пробой биологической жидкости является проба мочи и где измерение маркера коррелирует с общим уровнем концентрации этой пробы. 4. Способ по любому из пп.1-3, где стадию а) выполняют при помощи зонда. 5. Способ по любому из пп.1-3, где стадию а) выполняют с использованием ELISA. 6. Способ оценки прогрессирования состояния субъекта, страдающего от респираторной бактериальной инфекции, предусматривающий стадии(а) выполнения in vitro измерения уровня одного или нескольких маркеров в форме (i) рецептора урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) и/или (iii) одного или нескольких продуктов деградации (i) или (ii) в каждой из ряда проб биологической жидкости от субъекта, где эти пробы получают в различных точках времени, и(b) использования полученных величин измерения для оценки состояния субъекта. 7. Способ по п.6, где респираторная бактериальная инфекция обусловлена патогенами Streptococcuspneumoniae или Mycobacterium tuberculosis. 8. Способ по п.7, где оцениваемый субъект находится в процессе терапии. 9. Набор с зондом для оценки физического состояния субъекта, страдающего от респираторной бактериальной инфекции, содержащий а) иммобилизованный захватывающий агент, способный захватывать один или несколько маркеров в форме (i) рецептора урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) и/или (iii) одного или нескольких продуктов деградации (i) или (ii), и b) партнера связывания, способного связываться с указанным маркером, причем этот партнер связывания содержит с) систему метки. 10. Набор с зондом по п.9, где респираторная бактериальная инфекция обусловлена патогенамиStreptococcus pneumoniae или Mycobacterium tuberculosis. 11. Набор по любому из пп.9-10, где захватывающим агентом является антитело к маркеру. 12. Набор по любому из пп.9-10, где партнером связывания является антитело к маркеру. Фиг. 2 с Уровень suPAR для положительных по ВИЧ-1