Антитело против мср-1, содержащие его композиции и способы применения антитела и композиций

АНТИТЕЛО ПРОТИВ МСР-1, СОДЕРЖАЩИЕ ЕГО КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛА И КОМПОЗИЦИЙ Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному новому антителу против МСР-1, в том числе к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим по меньшей мере одно антитело против МСР-1, МСР-1, векторам, клеткам-хозяевам, трансгенным животным или растениям и способам их получения и применения, в том числе к терапевтическим композициям, способам и устройствам. 014229 Перекрестная ссылка на родственную заявку Настоящая заявка претендует на приоритет предварительных заявок на патенты США с серийными 60/682654 и 60/682620, поданных 19 мая 2005, содержание которых полностью включено посредством ссылки. Область техники Настоящее изобретение относится к антителам, в том числе точно определенным частям или вариантам, специфичным в отношении по меньшей мере одного моноцитарного хемоаттрактантного белка-1(МСР-1) человека или его фрагмента, а также антиидиотипическим антителам, и к кодирующим такие антитела против МСР-1 нуклеиновым кислотам, комплементарным нуклеиновым кислотам, векторам,клеткам-хозяевам и способам их получения и использования, в том числе к терапевтическим композициям, введению и устройствам. Родственный уровень техники Моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (МСР-1) человека (также называемый CCL-2), содержащий 76 аминокислотных остатков белок с М.м. 8,6 кДа, является членом С-С (или хемокин-бета)семейства цитокинов. Хемокины являются низкомолекулярными (8-10 кДа), индуцируемыми, секретируемыми, провоспалительными хемотаксическими цитокинами, которые, как показано, играют центральную роль в перемещении и периваскулярной аккумуляции специфических субпопуляций лейкоцитов в местах повреждения ткани. В зависимости от позиций четырех консервативных цистеинов определи два основных семейства. СХС или -хемокины преимущественно вызывают аттракцию нейтрофилов,в то время как СС или -хемокины преимущественно вызывают аттракцию моноцитов и других лейкоцитов, но не нейтрофилов (Leonard and Yoshimura et al., 1990). Члены МСР-1 (моноцитарный хемотаксический белок-1)-семейства образуют главную составляющую С-С-семейства цитокинов, и их считают основными хемокинами, вовлеченными в рекрутмент моноцитов, макрофагов и активированных лимфоцитов. При анализе гомологии МСР-1 от различных видов МСР-1 человека и обезьяны отличаются только по двум аминокислотам, обнаруживая идентичность последовательностей, составляющую 97%, в то время как крысиный МСР-1, содержащий 125 аминокислотных остатков белок с М.м. 13,8 кДа, отличается от МСР-1 человека по молекулярному размеру и степени гликозилирования. Рецепторы хемокинов принадлежат к большому семейству соединенных с G-белком рецепторов с семью трансмембранными доменами (7 ТМ) (GPCR, также называемых змеевидными рецепторами). На основе номенклатуры рецепторов, принятой в 1996 г. на исследовательской конференции Гордона по хемотаксическим цитокинам, рецепторы хемокинов, связывающиеся с хемокинами СХС, обозначаютCXCR, а рецепторы, связывающиеся с хемокинами СС, обозначают CCR. Известно, что МСР-1 связывается с хемокиновым рецептором CCR2 и передает через него сигнал.CCR2 является проходящим через мембрану семь раз, соединенным с G-белком рецептором, экспрессированным на многих клетках, в том числе моноцитах, Т-клетках, В-клетках и базофилах. Клонировали два специфичных в отношении МСР-1 рецептора, CCR2A и CCR2B, которые передают сигнал в ответ на наномолярные (нМ) концентрации МСР-1. CCR2A (CC-CKR2A) и CCR2B (CC-CKR2B) представляют собой две кДНК, которые кодируют два специфичных в отношении МСР-1 рецептора с подвергнутыми альтернативному сплайсингу карбоксильными концами. МСР-1 связывается с обеими изоформами с высокой аффинностью. МСР-1 индуцирует поступление кальция в клетки, экспрессирующие CCR2B, но не в клетки, экспрессирующие CCR2A. МСР-1 индуцирует хемотаксис на 5 порядков меньше в клетках,экспрессирующих CCR2B, по сравнению с клетками, экспрессирующими CCR2A. Известны другие белки с определенной функциональной гомологией с МСР-1 человека и гомологией последовательностей с этим белком. Особенно схожими с МСР-1 (GenBank NP002973) являются МСР-2 (GenBank NP005614) и эотаксин (GenBank NP51671), при этом идентичность последовательностей МСР-1 и МСР-2 составляет 61,8%, а МСР-1 и эотаксина-1 - 63,2%. Диапазон активностей и спектр вовлечения этих белков в гомеостатические механизмы и патологию человека недостаточно понятен в отношении гомологов МСР-1. Например, МСР-2 (переименованный CCL8) является близкородственным к МСР-1 и МСР-3 (переименованный CCL7, GenBank NP006264) и использует в качестве своих функциональных рецепторов оба CCR1, а также CCR2B. МСР-3 связывается с рецептором, обозначенным D6. МСР-3 также связывается с CCR10 и CCR1. Последовательности МСР-3 (97 аминокислот) и МСР-1 идентичны на 74%, а последовательности МСР-3 и МСР-2 - на 58%. Секретируемый МСР-3 отличается от МСР-1 тем, что он является N-гликозилированным. Идентичность последовательностей МСР-4 (переименованный CCL13, GenBank NP005399) и трех известных моноцитарных хемотаксических белков составляет 56-61 процент, а с эотаксином-1 МСР-4 идентичен на 60 процентов. Функции МСР-4, по-видимому, весьма схожи с функциями МСР-3 и эотаксина. Подобно МСР-3 МСР-4 является сильным хемоаттрактантом для моноцитов и Т-лимфоцитов. Он является неактивным в отношении нейтрофилов. МСР-4 связывается с рецепторами моноцитов, которые узнают МСР-1, МСР-3, RANTES (CCL5) и эотаксин, (рецепторами CCR1 и CCR3) и демонстрирует полную перекрестную десенсибилизацию эотаксином-1. МСР-5 представляет собой крысиный СС-хемокин и является наиболее близкородственным к МСР-1 человека (идентичность аминокислот на 66%). Обо-1 014229 значением гена для МСР-5 (переименованный CCL12) является SCYA12. Показано, что клетки, трасфицированные хемокиновым рецептором CCR2, отвечают на МСР-5. В отношении общей информации по цитокинам и хемокинам см. http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi, а в отношении находящейся в обращении классификационной системы - Zlotnic A., Yoshie О. 2000.I-MCP-1 связывается с моноцитами, и анализ графика Скэтчарда указывает на то, что моноциты имеют минимум 1700 сайтов связывания на клетку с Kd, составляющей 2 нМ (Yoshimura and Leonard,1990). Позже, с помощью экспериментов, касающихся равновесного связывания, обнаружили присутствие приблизительно 3000 сайтов связывания на клетку с Kd, составляющей 0,77 нМ (Ernst et al., 1994). 125I-МСР-1 также продемонстрировал связывание с высокой аффинностью с клетками dEoL-3, экспрессирующими рецептор CCR2, со значением Kd, составляющим 0,4 нМ (Sarau et al., 1997), что подтверждает субнаномолярную аффинность МСР-1 к своему рецептору. Для идентификации районов МСР-1, контактирующих со своим рецептором, CCR2, все выставленные на поверхность остатки заменили аланином. Некоторые остатки также мутировали в другие аминокислоты для определения важности заряда,гидрофобности или ароматичности в конкретных положениях. Два кластера первоначально основных остатков (R24, K35, K38, K49 и Y13), разделенные гидрофобной 35 А-бороздкой, уменьшали уровень связывания на 15-100-порядков. Данные говорят о модели, в которой с рецептором контактирует большая площадь поверхности МСР-1, а аккумуляция ряда слабых взаимодействий приводит к 35 пМаффинности, наблюдаемой с белком дикого типа (WT) (Hemmerich et al., 1999). Аффинность в диапазоне от 2 нМ вниз до 35 пМ, описанная в литературе, может быть обусловлена используемыми анализами и ограничениями соответствующих анализов. Известны другие белки с определенной функциональной гомологией с МСР-1 человека и гомологией последовательностей с этим белком. Особенно схожими с МСР-1 (GenBank NP002973) являются МСР-2 (GenBank NP005614) и эотаксин (GenBank NP 51671), при этом идентичность последовательностей МСР-1 и МСР-2 составляет 61,8 процентов, а МСР-1 и эотаксина - 63,2 процента. Диапазон активностей и спектр вовлечения этих белков в гомеостатические механизмы и патологию человека недостаточно понятен в отношении гомологов МСР-1. Например, МСР-2 является близкородственным к МСР-1 и МСР-3 (GenBank NP006264) и использует в качестве своих функциональных рецепторов оба CCR1,а также CCR2B. МСР-3 связывается с рецептором, обозначенным D6. МСР-3 также связывается сCCR10. Последовательности белка МСР-3 (97 аминокислот) и МСР-1 идентичны на 74 процента, а последовательности белка МСР-3 и МСР-2 - на 58 процентов. Секретируемый МСР-3 отличается от МСР-1 тем, что он является N-гликозилированным. Идентичность последовательностей МСР-4 (GenBankNP005399) и трех известных моноцитарных хемоаттрактантных белков составляет 56-61 процент, а с эотаксином-1 МСР-4 идентичен на 60 процентов. Функции МСР-4, по-видимому, весьма схожи с функциями МСР-3 и эотаксина. Подобно МСР-3,МСР-4 является сильным хемоаттрактантом для моноцитов и Т-лимфоцитов. Он является неактивным в отношении нейтрофилов. МСР-4 связывается с рецепторами моноцитов, которые узнают МСР-1, МСР-3 и RANTES, (CCR2). В отношении эозинофилов МСР-4 имеют сходную с МСР-3, RANTES и эотаксином действенность и силу. МСР-4 делит рецепторы с эотаксином (CCR1 и CCR3) и демонстрирует полную перекрестную десенсибилизацию эотаксином-1. Сообщалось о других антителах, способных связываться с МСР-1: в JP9067399 описывается антитело, полученное из выделенных клеток крови, а в JP05276986 описывается гибридома, секретирующаяIgM против МСР-1 человека. Более недавно описаны антитела, способные связываться с множеством бета-хемокинов, в том числе МСР-1, (WO03048083) и связывающееся с МСР-1-антитело, которое также связывается с эотаксином (US20040047860). Соответственно, существует необходимость в обеспечении антителами человека, специфичных в отношении МСР-1 человека, для использования в терапии с целью ослабления или устранения симптомов МСР-1-зависимых заболеваний, а также в улучшении известных антител или их фрагментов. ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящим изобретением обеспечиваются выделенные антитела против МСР-1, являющиеся антителами человека, примата, грызуна, млекопитающего, химерными, гуманизированными и/или CDRпривитыми, и другие происходящие из иммуноглобулинов белки, фрагменты, продукты расщепления и другие их точно определенные части и варианты, а также композиции антител против МСР-1, кодирующие или комплементарные нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева, композиции, составы, устройства, трансгенные животные, трансгенные растения и способы их получения и применения, как здесь описывается и делается возможным в сочетании с тем, что известно в данной области. В дополнение к описанной здесь композиции антител антитело согласно изобретению определяют по его аффинности к МСР-1 человека, специфичности в отношении МСР-1 человека и способности блокировать биологическую активность МСР-1 человека. Настоящим изобретением также обеспечивается по меньшей мере одно выделенное антитело против МСР-1, такое как, без ограничения, по меньшей мере одно антитело, слитый с антителом белок или-2 014229 фрагмент, описанные здесь. Антитело в соответствии с настоящим изобретением включает любую содержащую белок или пептид молекулу, которая включает по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как, без ограничения, по меньшей мере один лигандсвязывающий домен, такой как, без ограничения, вариабельная область тяжелой или легкой цепи, определяющий комплементарность участок (CDR) тяжелой или легкой цепи или его лигандсвязывающая часть, представленный в таблице 4 А,В, D и Е (SEQ ID NO: 6-26) и необязательно функционально связанный с каркасной областью (например,FR1, FR2, FR3, FR4 и их фрагментами, как описано в табл. 4 С (SEQ ID NO: 2-5, кроме того необязательно включает по меньшей мере СН 1, шарнирную область, СН 2 или СНЗ иммуноглобулина человека. Аминокислотная последовательность по меньшей мере одного антитела может, кроме того, необязательно включать в себя по меньшей мере одну точно определенную замену, вставку или делецию, описанную здесь или известную в данной области. В одном варианте осуществления согласно изобретению лигандсвязывающие части антитела включают SEQ ID NO: 27 и 28. В одном аспекте настоящим изобретением обеспечивается по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против МСР-1, включающее по меньшей мере одну вариабельную область, включающую SEQ ID NO: 27 или 28. В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против МСР-1, включающее в себя или (i) аминокислотные последовательностиSEQ ID NO: 6, 7 и 9 всех определяющих комплементэрность участков (CDR) тяжелой цепи, или (ii) аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13, 14 и 16 всех CDR легкой цепи. В одном аспекте настоящим изобретением обеспечиваются выделенные молекулы нуклеиновых кислот, включающие полинуклеотид, кодирующий специфические антитела против МСР-1, включающие по меньшей мере одну их специфическую последовательность, домен, часть или вариант, комплементарные такому полинуклеотиду или гибридизующиеся с таким полинуклеотидом. Кроме того, настоящим изобретением обеспечиваются рекомбинантные векторы, включающие указанные молекулы нуклеиновых кислот для антител против МСР-1, клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или рекомбинантные векторы, а также способы получения и/или применения таких нуклеиновых кислот для антител, векторов и/или клеток-хозяев. По меньшей мере одно антитело согласно изобретению связывается с по меньшей мере одним специфическим эпитопом, специфичным в отношении по меньшей мере одного белка МСР-1 или варианта,или производного, как, например, те, которые представлены в SEQ ID NO: 1. По меньшей мере один эпитоп может включать в себя по меньшей мере одну антитело-связывающую область, которая включает по меньшей мере одну часть указанного белка, предпочтительно указанный эпитоп состоит из по меньшей мере 1-5 аминокислот по меньшей мере одной части белка, такой как, без ограничения, по меньшей мере одного функционального, внеклеточного, растворимого, гидрофильного, наружного или цитоплазматического домена указанного белка или любой его части. По меньшей мере одно антитело может необязательно включать в себя по меньшей мере одну специфическую часть по меньшей мере одного определяющего комплементарность участка (CDR) (например, CDR1, CD2 или CD3 вариабельной области тяжелой или легкой цепи, представленной SEQ ID NO: 27 или 28, соответственно), представленного SEQ ID NO: 6, 7, 9, 13, 14 и 16, и необязательно, кроме того,включать в себя по меньшей мере одну каркасную область константной или вариабельной области или ее часть, причем антитело блокирует, ингибирует или предотвращает по меньшей мере одну активность,такую как, без ограничения, связывание МСР-1 с рецептором на клеточной поверхности, интернализация рецептора CCR2, стимулируемая МСР-1 мобилизация Са 2+ или любой другой известный подходящий анализ МСР-1. Таким образом, антитело против МСР-1 можно скринировать в отношении соответствующей активности в соответствии с известными способами, такой как, без ограничения, по меньшей мере одна биологическая активность по направлению к белку МСР-1. Кроме того, настоящим изобретением дополнительно обеспечивается по меньшей мере одно МРС 1-антиидиотипическое антитело против по меньшей мере одного МСР-1-антитела согласно изобретению. Антиидиотипическое антитело включает любую содержащую белок или пептид молекулу, которая включает по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как, без ограничения, по меньшей мере одна лигандсвязывающая часть (LBP), такая как, без ограничения, определяющий комплементарность участок (CDR) тяжелой или легкой цепи или его лигандсвязывающая часть, вариабельная область тяжелой или легкой цепи, константная область тяжелой или легкой цепи, каркасная область или любая их часть, которую можно включить в антиидиотипическое антитело согласно изобретению. Антиидиотипическое антитело согласно изобретению может включать в себя или происходить от любого млекопитающего, такого как, без ограничения, человек, мышь, кролик, крыса, грызун, примат и т.п. В одном аспекте настоящим изобретением обеспечиваются выделенные молекулы нуклеиновых кислот, включающие полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно МРС-1 антиидиотипическое антитело, включающее в себя по меньшей мере одну его специфическую последовательность, домен, часть или вариант, комплементарные такому полинуклеотиду или гибридизующиеся с таким полинуклеотидом. Кроме того, настоящим изобретением дополнительно обеспечиваются рекомбинантные векторы,-3 014229 включающие указанные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие МРС-1 антиидиотипическое антитело, клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или рекомбинантные векторы, а также способы получения и/или применения таких нуклеиновых кислот для антиидиотипических антител, векторов и/или клеток-хозяев. Настоящим изобретением также обеспечивается по меньшей мере один способ экспрессии по меньшей мере одного антитела против МСР-1 или МРС-1 антиидиотипического антитела в клеткехозяине, включающий в себя культивирование клетки-хозяина, описанной здесь, в условиях, когда по меньшей мере одно антитело против МСР-1 экспрессируется в определяемых и/или выделяемых количествах. Настоящим изобретением также обеспечивается по меньшей мере одна композиция, содержащая (а) выделенную кодирующую антитело против МСР-1 нуклеиновую кислоту и/или антитело, описанные здесь; и (б) подходящий носитель или разбавитель. Носитель или разбавитель могут быть необязательно фармацевтически приемлемыми, в соответствии с известными носителями или разбавителями. Кроме того, композиция может необязательно содержать по меньшей мере один дополнительный компонент,белок или композицию. Кроме того, настоящим изобретением обеспечивается по меньшей мере один способ или композиция с использованием антитела против МСР-1 для введения терапевтически эффективного количества с целью модулирования или лечения по меньшей мере одного связанного с МСР-1 состояния в клетке,ткани, органе, у животного или пациента и/или до, после или во время связанного с МСР-1 состояния,известного в данной области и/или описанного здесь. Настоящим изобретением также обеспечивается по меньшей мере одна композиция, устройство и/или способ доставки терапевтически или профилактически эффективного количества по меньшей мере одного антитела против МСР-1 в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, настоящим изобретением обеспечивается по меньшей мере один способ или композиция с использованием антитела против МСР-1 для диагностики по меньшей мере одного связанного с МСР-1 состояния в клетке, ткани, органе, у животного или пациента и/или до, после или во время связанного с МСР-1 состояния, известного в данной области и/или описанного здесь. Настоящим изобретением также обеспечивается по меньшей мере одна композиция, устройство и/или способ доставки для диагностики по меньшей мере одного антитела против МСР-1 в соответствии с настоящим изобретением. В одном аспекте настоящим изобретением обеспечивается по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против МСР-1, включающее в себя по меньшей мере одну вариабельную область,включающую SEQ ID NO: 27 или 28. В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против МСР-1, включающее в себя или (i) аминокислотные последовательностиSEQ ID NO: 6, 7 и 8 или 9 всех определяющих комплементарность участков (CDR) тяжелой цепи, или (ii) аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13, 14 и 15 или 16 всех CDR легкой цепи. В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против МСР-1, включающее в себя по меньшей мере одну из (i) аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6, 7 и 8 или 9 всех определяющих комплементарность участковCDR легкой цепи. По меньшей мере одно антитело может, кроме того, необязательно проявлять одну из следующих активностей: связываться с МСР-1 с по меньшей мере одной аффинностью, выбранной из по меньшей мере 10-9 М, по меньшей мере 10-10 М, по меньшей мере 10-11 М и по меньшей мере 10-12 М; существенно нейтрализовать по меньшей мере одну активность по меньшей мере одного белка МСР-1. Также обеспечивается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против МСР-1, вектор, включающий в себя выделенную нуклеиновую кислоту, и/или прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, включающая выделенную нуклеиновую кислоту. Клетка-хозяин может необязательно быть по меньшей мере одной из клеток, выбранных из NSO, COS-1,COS-7, НЕК 293, ВНК 21, СНО, BSC-1, HepG2, УВ 2/0, SP2/0, HeLa, клетки миеломы или лимфомы или их любого производного, иммортализованной или трасформированной клетки. Также обеспечивается способ получения по меньшей мере одного антитела против МСР-1, включающий в себя трансляцию кодирующей антитело нуклеиновой кислоты в условиях in vitro, in vivo или in situ, так что антитело против МСР-1 экспрессируется в определяемых и/или выделяемых количествах. Также обеспечивается композиция, содержащая по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против МСР-1 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Также обеспечивается способ диагностики или лечения связанного с МСР-1 состояния в клетке,ткани, органе или у животного, включающий в себя (а) приведение в контакт композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного выделенного антитела млекопитающего против МСР-1 согласно изобретению, с клеткой, тканью, органом или животным или введение такой композиции в-4 014229 клетку, ткань, орган или животному. Также обеспечивается медицинское устройство, включающее в себя по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против МСР-1 согласно изобретению, причем устройство пригодно для приведения в контакт или введения по меньшей мере одного антитела против МСР-1 по меньшей мере одним способом, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного,интраартикулярного, эндобронхиального, интраабдоминального, интракапсульного, внутрихрящевого,внутриполосного, внутрибрюшного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного способа, введения в толстую кишку, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного способа, введения в почечную лоханку, интраперикардиального, интраперитонеального, интраплеврального способа, введения в предстательную железу, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, внутрисуставного, интраторакального, внутриматочного, внутрипузырного способа, введения внутрь повреждения, болюса, вагинального,ректального, трансбуккального, подъязычного, интраназального или трансдермального способа. Также обеспечивается изделие производства для фармацевтического или диагностического применения для человека, включающее в себя упаковочный материал и контейнер, содержащий раствор, (макро)частицу или лиофилизированную форму по меньшей мере одного выделенного антитела млекопитающего против МСР-1 согласно изобретению. Также обеспечивается способ получения по меньшей мере одного выделенного антитела млекопитающего против МСР-1 согласно изобретению, включающий в себя обеспечение клетки-хозяина или трансгенного животного, или трансгенного растения, или клетки растения, способных экспрессировать антитело в выделяемых количествах. Кроме того, настоящим изобретением обеспечивается по меньшей мере одно антитело против МСР-1, полученное вышеуказанным способом. Настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается любое описанное здесь изобретение.-5 014229 Краткое описание списка последовательностей Подробное описание изобретения Настоящим изобретением обеспечивается по меньшей мере одно очищенное, выделенное, рекомбинантное и/или синтетическое антитело против МСР-1, являющееся антителом человека, примата, грызуна, млекопитающего, химерным, гуманизированным, полученным методами инженерии и/или CDRпривитым, и МСР-1-антиидиотипическое антитело против него, а также композиции и кодирующие молекулы нуклеиновых кислот, включающие по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно антитело против МСР-1 или антиидиотипическое антитело. Кроме того, настоящее-6 014229 изобретение включает, но не ограничивается перечисленными, способы получения и применения таких нуклеиновых кислот и антител, и антиидиотипических антител, в том числе диагностические и терапевтические композиции, способы и устройства. Ссылки: Все публикации или патенты, на которые здесь ссылаются, полностью включены сюда посредством ссылки, поскольку они показывают уровень техники во время создания согласно изобретению и/или обеспечивают описание и осуществление согласно изобретению. Публикации относятся к любым научным или патентным публикациям или любой другой информации, находящейся в любой форме носителя, в том числе все записанные на пленку, электронные или напечатанные формы. Следующие ссылки полностью включены сюда посредством ссылки: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, Inc., NY, NY (1987-2004); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A LaboratorySpring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John WileySons, Inc.,NY (1994-2004); Colligan, et al., Current Protocols in Protein Science, John WileySons, NY, NY (19872004). Сокращения Aa: аминокислота; BSA: бычий сывороточный альбумин; CDR: определяющие комплементарность участки; ECL: электрохемилюминесценция; HuCAL: комбинаторная библиотека антител человека; HSA: сывороточный альбумин человека; МСР-1: моноцитарный хемоаттрактантный белок 1; Ig: иммуноглобулин; IPTG: изопропилD-тиогалактозид; мАт: моноклональное антитело; PBS: забуференный фосфатом раствор, рН 7,4; SET: титрование до равновесия в растворе; VH: вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина; VL: вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина. Определения Используемые здесь термины "антитело против CCL2", "антитело против МСР-1", "часть антитела против МСР-1" или "фрагмент антитела против МСР-1" и/или вариант антитела против МСР-1" и т.п. включают любые содержащие белок или пептид молекулы, которые включают по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как, без ограничения, по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) тяжелой или легкой цепи или его лигандсвязывающую часть, вариабельная область тяжелой цепи или легкой цепи, константная область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасная область или любая их часть, или по меньшей мере одну часть рецептора МСР-1 или МСР-1 связывающего белка, которая может быть включена в антитело согласно изобретению. Такое антитело необязательно, кроме того, действует на специфический лиганд, например, без ограничения, такое антитело модулирует, уменьшает, увеличивает, действует в качестве антагониста или агониста, смягчает, облегчает, блокирует, ингибирует, отменяет и/или мешает по меньшей мере одной активности или связыванию МСР-1 или активности рецептора МСР-1 или связыванию с таким рецептором in vitro, in situ и/или in vivo. Неограничивающим примером является подходящее антитело против МСР-1, специфическая часть или вариант согласно изобретению, которые могут связываться с по меньшей мере одним МСР-1 или его точно определенными частями, вариантами или доменами. Используемый здесь термин "эпитоп" означает сегмент или образование белка, способное специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и, как правило, имеют специфические свойства трехмерной структуры, а также специфические зарядные характеристики. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что в присутствии денатурирующих растворов связывание с конформационным эпитопом, в отличие от неконформационного эпитопа, не происходит. Включаются эпитопы белка, являющиеся результатом конформационной укладки молекулы МСР-1,происходящей, когда аминокислоты различных частей линейной последовательности молекулы МСР-1 близко собираются вместе в трехмерном пространстве. Под "МСР-1" подразумевается последовательность из 76 аминокислот, на которую имеется ссылка в NCBI под номером официального доступа NP002973 и которая известна под разными именами: МСР(моноцитарный хемотаксический белок), SMC-CF (хемотаксический фактор гладкомышечных клеток),LDCF (происходящий из лимфоцитов хемотаксический фактор), GDCF (происходящий из глиомы моноцитарный хемотаксический фактор), TDCF (происходящие из опухоли хемотаксические факторы), НС 11(цитокин-11 человека), MCAF (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор). SCYA2 является обозначением гена, гена JE на хромосоме-17 человека, а новым обозначением является CCL2 (Zlotnik, Yoshie 2000. Immunity 12: 121-127). JE является мышиным гомологом МСР-1/CCL2 человека. Используемый здесь термин "антитело человека" относится к антителу, в котором по существу каждая часть белка (например, CDR, каркасная область, домены CL, Сн (например, СН 1, СН 2, СН 3), шарнирная область (VL, VH является результатом событий рекомбинации последовательностей генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека или происходит из последовательностей зрелых антител человека. Помимо выделения из людей такие антитела человека можно получить иммунизацией трансгенных мышей, способных индуцировать иммунный ответ на гены иммуноглобулинов зародышевой линии человека (Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1): 65-93 (1995) and Fishwall et al., Nat Biotechnol 14(7): 845-851(1996, или отобрать из библиотеки спектра антител человека, такой как та, которая здесь описана. Источник таких последовательностей генов человека можно найти в любой пригодной библиотеке, такой-7 014229 как VBASE, базе данных генов антител человека (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc) или их транслированных продуктов или на сайте http://people.cryst.bbk.ac.uk/ubcg07s/, нa котором приводятся антитела человека, классифицированные в группы на основе сходств их аминокислотных последовательностей. В пределах данного определения находятся комбинированные антитела или функциональные фрагменты комбинированных антител человека, которые включают каркасные области из одной или нескольких последовательностей антител человека и CDR-участки из двух различных источников, являющихся человеком или не являющихся им. В рамки определения "антитело человека" входит комбинированное антитело или функциональный фрагмент комбинированного антитела человека, который содержит каркасные области из последовательностей и антител человека зародышевой линии, и реаранжированных антител человека и CDR-участки антител из двух различных источников. Комбинированное антитело человека или функциональный фрагмент комбинированного антитела человека в соответствии с настоящим описанием включает каркасные области из одной или нескольких последовательностей антител человека и CDR-участки, происходящие из последовательностей антител человека или не являющихся человеком видов, или могут быть полностью синтетическими. Следовательно, антитело человека отличается от химерного или гуманизированного антитела. Подчеркивается, что антитело человека можно получить при использовании не являющегося человеком животного или прокариотической или эукариотической клетки, которые способны экспрессировать функционально реаранжированные гены иммуноглобулинов человека (например, тяжелой цепи и/или легкой цепи). Кроме того, когда антитело человека является одноцепочечным, оно может содержать линкерный пептид, который не обнаруживается у встречающихся в природе антител человека. Например, Fv может включать в себя линкерный пептид, как, например, от двух до приблизительно восьми остатков глицина или других аминокислот, который соединяет вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Считается, что такое линкерные пептиды происходят из человека."Гуманизированные" формы антител не являющихся человеком видов (например, крысиных антител) являются химерными антителами, которые имеют в значительной степени замененные части последовательностей, происходящие из иммуноглобулинов не являющихся человеком видов. Большей частью гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (реципиентное антитело), в которых остатки CDR (определяющих комплементарность участков, также известных в качестве гипервариабельных участков) заменяют остатками CDR от не являющихся человеком видов (донорское антитело),таких как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, имеющих желаемые специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками не являющихся человеком видов. Более того, гуманизированные антитела могут включать в себя остатки, которые не обнаруживаются в реципиентном антителе или донорском антителе. Эти модификации осуществляют для дальнейшего усовершенствования характеристики антитела. Как правило, гуманизированное антитело включает по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные участки соответствуют гипервариабельным участкам иммуноглобулина не являющегося человеком вида, и все или по существу все FR являются FR последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также включает по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно Fc иммуноглобулина IgG человека. Для получения дополнительных деталей смотри Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988);and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Используемый здесь Kd-антитела относится к константе диссоциации, KD, антитела, специфичного в отношении заранее определенного антигена, и представляет собой меру аффинности антитела к специфической мишени. Антитела с высокой аффинностью к заранее определенному антигену имеют KD, составляющую 10-8 М или меньше, более предпочтительно 10-9 М или меньше и даже более предпочтительно 10-10 М или меньше. Подразумевается, что используемые здесь термины "Kdis" или "KD" или "Kd" относятся к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. "KD" представляет собой отношение скорости диссоциации (k2), также называемой скоростью высвобождения (koff), к скорости ассоциации (ki) или скорости связывания (kon). Таким образом, KD равняется k2/ki или (koff/kon) и выражается в молярной концентрации (М). Следовательно, чем меньше KD, тем сильнее связывание. Значит KD, составляющая 10-6 М (или 1 мкМ), указывает на более слабое связывание по сравнению с 10-9 М (или 1 нМ). Используемые здесь термины "специфичность в отношении" и "специфическое связывание" и "связывается специфически" относятся к связыванию антитела с заранее определенным антигеном с большей аффинностью, чем с другими антигенами или белками. Как правило, антитело связывается с константой диссоциации (KD), составляющей 10-7 М или меньше, и связывается с заранее определенным антигеном сKD, которая по меньшей мере на два порядка меньше KD при связывании с неспецифическим антигеном(например, BSA, казеином или любым другим определенным полипептидом), отличающимся от заранее определенного антигена. Фразы "узнающее антиген антитело" и "специфичное в отношении антигена антитело" используются здесь взаимозаменяемо с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном" или "антиген-специфичное антитело", например, МСР-1-специфичное антитело.-8 014229 1. Получение антител согласно изобретению Получение антител человека, которые специфичны в отношении белка МСР-1 человека или его фрагмента, такого как выделенный белок МСР-1 или его фрагмент (в том числе такие синтетические молекулы как синтетические пептиды), можно осуществить с использованием любого подходящего метода,известного в данной области. Антитела человека можно продуцировать с использованием различных методов, известных в данной области. В одном варианте осуществления согласно изобретению антитела человека отбирают из библиотеки фагов, экспрессирующих антитела человека (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996): Sheets et al. PITAS (USA) 95: 6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter, J.Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al. J. Mol. Biol., 222: 581 (1991. Антитела человека можно также создать путем введения локусов иммуноглобулинов человека в трансгенных животных, например, мышей, в которых эндогенные гены иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. Например, трансгенную мышь, содержащую функционально реаранжированный трансген тяжелой цепи иммуноглобулина человека и трансген, содержащий ДНК из локуса легкой цепи иммуноглобулина человека, который можно подвергнуть реаранжировке, можно иммунизировать МСР-1 человека или его фрагментом для индуцирования продукции антител. Если требуется, продуцирующие антитела клетки можно выделить, а гибридомы или другие иммортализованные продуцирующие антитела клетки можно приготовить, как описано здесь и/или известно в данной области. В альтернативном случае антитело, точно определенную часть или вариант можно зкспрессировать, используя кодирующую нуклеиновую кислоту или ее часть, в подходящей клетке-хозяине. При стимулировании соответствующим антигеном наблюдают продукцию антител человека, которая близко напоминает наблюдаемую у людей продукцию во всех отношениях, в том числе реаранжировки генов, сборки и спектра антител. Этот подход описывается, например, в патентах США 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016 и в следующих научных публикациях: Marks etal., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huezar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). В альтернативном случае антитело человека можно получить через иммортализацию В-лимфоцитов человека, продуцирующих антитело,направленное против целевого антигена, (такие В-лимфоциты можно выделить из индивидуума, или они могут быть сенсибилизированы in vitro. См., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991); и патент США 5750373. Продуцирующие антитела клетки можно также получить из периферической крови или, предпочтительно, селезенки или лимфатических узлов человека или других подходящих животных, иммунизированных представляющим интерес антигеном. Можно также использовать любую другую подходящую клеткухозяина для экспрессии гетерологичной или эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело,его точно определенный фрагмент или вариант согласно изобретению. Слитые клетки (гибридомы) или рекомбинантные клетки можно выделить, используя селективные условия культивирования или другие подходящие известные способы, и клонировать с помощью предельного разведения или сортировки клеток, или других известных способов. Клетки, продуцирующие антитела требуемой специфичности, можно отобрать с помощью подходящего анализа (например, ELISA - твердофазного иммуноферментного анализа). При одном подходе гибридому получают слиянием подходящей бессмертной клеточной линии (например, линии клеток миеломы, такой как, без ограничения, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1,L.5.243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1,JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A или т.п., или гетеромиелом, продуктов их слияния, или любой клетки или происходящей из нее слитой клетки, или любой подходящей клеточной линии, известной в данной области, см., например, www.atcc.org,www.lifetech.com и т.п.) с продуцирующими антитело клетками, такими как, без ограничения, выделенные или клонированные клетки селезенки, периферической крови, лимфы, миндалины или другие иммунные или содержащие В-клетки клетки, или любыми другими клетками, экспрессирующими последовательности CDR или каркасных областей, или константных или вариабельных областей тяжелой или легкой цепей в виде эндогенной или гетерологичной нуклеиновой кислоты, в виде рекомбинантной или эндогенной ДНК, ДНК вируса, бактерии, водоросли, земноводного, насекомого, пресмыкающегося, рыбы, млекопитающего, грызуна, лошади, овцы, козы, барана, примата, прокариотической, эукариотической, геномной ДНК, кДНК, рДНК, митохондриальной ДНК или РНК, хлоропластной ДНК или РНК,чнРНК, мРНК, тРНК, одно-, двух- или трехцепочечной, гибридизующейся и т.п. или любых их комбинаций. См., например, Ausubel, выше, и Colligan, Immunology, выше, глава 2, полностью включенные сюда посредством ссылки. Антитела человека, которые связываются с МСР-1 человека и включают установленную вариабельную область тяжелой или легкой цепи, можно получить с использованием подходящих способов, таких как фаговый дисплей (Katsube, Y., et al., Int. J. Mol. Med., 1(5): 863-868 (1998. Можно использовать другие подходящие способы получения или выделения антител требуемой специфичности, включающие, но не ограничивающиеся перечисленными, способы, с помощью которых отбирают рекомбинантное анти-9 014229 тело из пептидной или белковой библиотеки (например, без ограничения, библиотеки бактериофагов,рибосом, олигонуклеотидов, РНК, кДНК и т.п., библиотеки в виде дисплея, например, имеющихся уWO90/3809 (Dyax); US 4704692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP 371998; EP 550400; (Xoma); EP 229046; PCT/US91/07149 (Ixsys); или стохастически образованные пептиды или белки (US 5723323, 5763192, 5814476, 5817484, 5824514, 5976862, WO 86/05803, ЕР 590689 (Ixsys, в настоящее время Applied Molecular Evolution (AME, все из которых полностью включены сюда посредством ссылки), или методы, основанные на иммунизации трансгенных животных (например, мышей SCID,Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41: 901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95-118 (1996);Eren et al., Immunol. 93: 154-161 (1998), все из которых полностью включены посредством ссылки). Конкретный вариант осуществления Авторы согласно изобретению привели в качестве примера способ отбора и получения антител человека с требуемой аффинностью, специфичностью и биологической активностью в отношении к МСР-1 человека, начинающийся с Fab-библиотеки в виде фагового дисплея. В итоге скринировали 17856 клонов из всех 10 пэннингов, что привело к выделению 1104 первично положительных клонов и, в конце концов, к 26 уникальным Fab. Для обеспечения уникального лиганда, который служил примером антигена, сохраняющего способность связываться со встречающимися в природе рецепторами МСР-1, химически синтезировали МСР-1 человека и его аналоги или "мутеины", и их модифицировали для специфического использования при отборе, для анализов аффинности и биологических анализов. МСР-1 Ile41 человека и МСР-1 Tyr43 человека использовали в исходном твердофазном пэннинге, а также при других видах отбора антител и анализах созревания аффинности, и они описаны здесь, а также биотинилированные варианты мутеина МСР-1: Ile41, Lys(биотин-PEG4)69 и Ile41, Lys (биотин-PEG4)75 (SEQ ID NO: 1). Поскольку ни один из 26 уникальных Fab не имел аффинности, соответствующей KD0,5 нМ, или требуемых значений IC50 в определенных биологических исследованиях, было необходимо созревание. Кандидатов на созревание аффинности отбирали в виде Fab, а соответствующие IgG анализировали параллельно процессу созревания. Критериями отбора являлись (1) активность в анализе связывания с рецептором целой клетки, (2) активность в анализе мобилизации кальция, (3) аффинность к МСР-1 человека, (4) специфичность в отношении МСР-1 человека и (5) аффинность к МСР-1 яванской макаки и связывание со встречающимся в природе МСР-1. Измерения аффинности в Biocore методом захвата Fab белком МСР-1 в растворе работали хорошо в отношении распределения кандидатов на созревание, и аффинности находились в диапазоне от 49 до 406 нМ. Наилучший родительский Fab продемонстрировал аффинность, составляющую 50 нМ, что указывает на то, что аффинность необходимо оптимизировать на по меньшей мере 100 порядков для достижения критерия успешной аффинности. Кроме того, связывание с МСР-1 яванской макаки и встречающимся у человека МСР-1 можно было определить способом захвата Fab, что было дополнительно необходимо как условие созревания. Аффинности к МСР-1 яванской макаки находились в том же диапазоне, что и в случае МСР-1 человека. Из-за возможных модификаций, например, гликозилирования, продемонстрировали, что антитела не только узнают синтетический или рекомбинантный МСР-1, но также и встречающийся в природе МСР-1, который эндогенно экспрессировали и очистили из супернатанта клеток PANC1 человека. Специфичность в отношении МСР-1 измеряли способом захвата антител в Biocore, добавляя 100 нМ каждого хемокина и определяя сигнал связывания. Большинство Fab-кандидатов на созревание были специфическими, в то время как два из них продемонстрировали перекрестную реактивность с гомологичными хемокинами. Очень важной особенностью Fab была нейтрализующая активность, и поставили несколько различных исследований для анализа этой активности. Анализ связывания 125IMCP-1 с клетками Thp-1 был наиболее чувствительным анализом, который особенно важен после оптимизации. Родительские Fab продемонстрировали значения IC50 от 10 до 650 нМ. Помимо анализа связывания меченного радиоактивными изотопами лиганда спланировали другие вторичные биологические анализы, удостоверяющие нейтрализующую активность на различных уровнях пути передачи сигнала от МСР-1 в прямом направлении. Аттракция моноцитов является одной из основных функций МСР-1, но наиболее вероятно вследствие потери активности, совместно очищаемых факторов или эндотоксина родительские Fab не работали в анализе хемотаксиса, и поэтому решили проверять только соответствующие IgG1, вместо того, чтобы пытаться заставить работать в этом анализе Fab. Другим результатом передачи сигнала в прямом направ- 10014229 лении является высвобождение в цитоплазму кальция. Действительно все Fab, которые продемонстрировали нейтрализующую активность в анализе связывания меченного радиоактивными изотопами лиганда,ингибировали индуцируемую МСР-1 мобилизацию кальция в клетках Thp-1 с IC50 в диапазоне от 0,1 до 3 мкМ. Следовало показать, что биологическая активность родительских Fab полностью сохраняется после превращения в форму IgG. Как и ожидалось, все соответствующие IgG продемонстрировали активность в анализе связывания меченного радиоактивными изотопами лиганда, анализе мобилизации кальция и даже в анализе хемотаксиса, что, в конце концов, удостоверяет, что все IgG сохраняли активности, наблюдаемые для Fab-форм, и даже ингибировали индуцируемый МСР-1 хемотаксис. Для созревания аффинности отобрали в соответствии с их свойствами семь различных Fab с KD в диапазоне 10-400 нМ и значениями IC50 в диапазоне 10-650 нМ в анализе связывания меченного радиоактивными изотопами лиганда. Впоследствии их сгруппировали в 3 группы для клонирования в виде библиотеки и последующего отбора. Параллельно проводили оптимизацию в отношении L-CDR3 и HCDR2. Создали библиотеки высокого качества. В процессе отбора использовали пэннинг в растворе, и строгость отбора увеличивали с помощью уменьшения антигена, отбора скорости диссоциации и очень продолжительных стадий промывок. Для следующего процесса скрининга использовали скрининг BioVeris, делающий возможным высокомасштабное распределение оптимизированных связующих веществ. Для идентификации улучшенных связующих веществ скрининг работал очень эффективно. Кроме того,можно было идентифицировать оптимизированные в отношении L-CDR3 и H-CDR2 Fab, что делало возможным перекрестное клонирование производных MOR03471 и MOR03548. Особенно успешным было перекрестное клонирование производных MOR03471, что послужило введением дальнейшего улучшения на 100 порядков аффинности по сравнению с двумя оптимизированными начальными Fab. Из 17 оптимизированных Fab 16 отобрали для детальной характеристики, и, в конце концов, 4 связующих вещества,которые удовлетворяли всем критериям успеха, происходящие из родительского MOR03471, два из которых были оптимизированы в отношении только L-CDR3, а два других явились результатом перекрестного клонирования. Анализы кандидатов со зрелой аффинностью и последовательности представлены в деталях в примерах 3 и 4, табл. 4-6 и SEQ ID NO: 2-28. После созревания было невозможно проанализировать в Biacore аффинность оптимизированных связующих веществ, главным образом поскольку достигли порогов обнаружения. В MorphoSys использовали очень чувствительный способ определения KD, представляющий собой титрование до равновесия в растворе (SET) в сочетании с методом BioVeris. Константы моновалентной диссоциации можно было рассчитать с помощью моделей соответствующих подгонок для Fab и IgG. Помимо измерения аффинности этот способ использовали для исследований перекрестной реактивности. Аффинности конечных кандидатов к МСР-1 человека и яванской макаки, измеренные в BioVeris и подтвержденные с помощьюBioVeris показала отсутствие перекрестной реактивности с МСР-2 человека у всех проверенных 16 Fab иIgG. Несколько Fab и IgG также продемонстрировали отсутствие значительной перекрестной реактивности с эотаксином человека. В соответствии с критерием успеха критерий специфичности определяли в виде отсутствия связывания с гомологом МСР-2, 3, 4 при 100 нМ и эотаксином 1, 2 и 3 при 100 нМ в способе захвата антител Biacore. В способе захвата Fab Biacore все отобранные Fab продемонстрировали различную степень перекрестной реактивности с МСР-2 и эотаксином. Неспецифическому связыванию могли способствовать предполагаемая немного увеличенная нестабильность Fab по сравнению IgG и общая способность к неспецифическому связыванию хемокинов. Некоторые из отобранных IgG не продемонстрировали значительного сигнала связывания с хемокинами-гомологами и удовлетворили критериям успешной специфичности в способе захвата IgG Biacore. В экспериментах титрования до равновесия в растворе с использованием BioVeris даже некоторые Fab не продемонстрировали перекрестной реактивности. Для анализа того, преобразуется ли активность связывания Fab с МСР-2, определяемая вBiacore, в нейтрализующую активность, в Centocor разработали анализы связывания меченного радиоактивными изотопами лиганда с целыми клетками. Проверенные в этом анализе Fab не продемонстрировали значительного ингибирования связывания 125I-меченного МСР-2 с рецептором CCR2 на клетках Thp-1(IC502 мкМ). Из-за низкого требуемого количества МСР-1, составляющего 1 нг/мл, анализ связывания меченного радиоактивными изотопами лиганда являлся наиболее чувствительным анализом в этом проекте с определяемым в анализе предельным значением IC50, составляющим приблизительно 100 пМ для Fab и даже 20 пМ для IgG. Помимо аффинности активность в этом анализе использовали для распределения и отбора оптимизированных связующих веществ с целью детальной характеристики. Коэффициент общего улучшения активности во время оптимизации составлял до 1000 х, и в конце один происходящий изMOR03471 Fab, MOR03878, продемонстрировал наибольшую аффинность при 100 пМ. Все проверенныеIgG сохраняли активность в анализе связывания меченного радиоактивными изотопами лиганда. Значения IC50 4 конечных IgG-кандидатов MOR03781, MOR03790, MOR03850 и MOR03878 находились в диапазоне 20-50 пМ и были даже немного лучше по сравнению с соответствующими активностями Fab. Одной из причин улучшенной активности является то, что бивалентные IgG нейтрализуют два МСР-1 на молекулу (коэффициент 2 х). IgG являлись результатом чистой высокомасштабной продукции, и, следо- 11014229 вательно, другой причиной могла служить чистота, стабильность или активность антител. В качестве вторичного биологического анализа успешно разработали основанный на FACS (клеточном сортере с возбуждением флуоресценции) анализ, в котором измеряется ингбирование индуцируемой МСР-1 интернализации рецептора CCR2. В конце концов, этот анализ сделал даже возможным определение IC50 и распределение. Значения IC50 4 конечных Fab-кандидатов, MOR03790, MOR03850, MOR03781 иMOR03878, находились в диапазоне 3-5 нМ. Требовался встречающийся в природе МСР-1 для подтверждения активности антител против МСР 1, выделенных с использованием синтетических или рекомбинантных МСР-1. Встречающийся в природе МСР-1 очищали из супернатанта PANC1 и использовали для индукции высвобождения кальция. Оптимизированные Fab продемонстрировали ингибирование индуцируемой встречающимся в природе МСР-1 мобилизации кальция с более высокой активностью по сравнению с эталонным антителом С 775. Все происходящие из MOR03548 предварительно отобранные Fab полностью ингибировали связывание С 775 с МСР-1 в конкурентном ELISA (твердофазном иммуноферментном анализе). Все происходящие изELISA, что указывает на то, что эпитопы являются по меньшей мере перекрывающимися. Наконец, четыре антитела, MOR03781, MOR03790, MOR03850 и MOR03878, удовлетворили всем критериям успеха,в том числе критерию специфичности и нейтрализации встречающегося в природе МСР-1. Другие подходящие методы получения антител Другие методы получения антител согласно изобретению, способные продуцировать спектр антител человека, известны в данной области и/или описаны здесь. Такие методы включают, но не ограничиваются перечисленными, рибосомный дисплей (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937-4942(May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14130-14135 (Nov. 1998; методы продуцирования антител одной клеткой (например, метод антител отобранного лимфоцита ("SLAM")(патент США 5627052, Wen et al., J. Immunol. 17: 887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848(1994); Jonak et al., Progress Biotech, vol. 5, in Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed.,Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherland (1998. Методы инженерии или гуманизации антител не являющихся человеком видов или человека также можно использовать, и они хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное или полученное методами инженерии антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков из источника, который не является человеком, например, без ограничения, мыши, крысы, кролика, не являющегося человеком примата или другого млекопитающего. На эти аминокислотные остатки человека часто ссылаются как на "импортные" остатки, которые обычно происходят из "импортного" вариабельного,константного или другого домена известной последовательности человека. Последовательности известных Ig человека хорошо известны в данной области и могут быть любой известной последовательностью. Разработаны различные стратегии оптимизации связывания, конформации и уменьшенной иммуногенности полученных методами инженерии гуманизированных антител. См., например, Presta et al. J.Immunol. 151: 2623-2632, 1993; WO200302019 и WO2005080432. Такие импортируемые последовательности можно использовать для уменьшения иммуногенности или уменьшения, увеличения или модификации связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, времени полужизни или любого другого подходящего свойства, известного в данной области. Как правило, сохраняют часть или все последовательности CDR не являющихся человеком видов или человека, в то время как последовательности вариабельных и константных областей не являющихся человеком видов заменяют аминокислотами человека или другими аминокислотами. Антитела можно также необязательно гуманизировать с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные антитела можно необязательно получить в процессе анализа родительских последовательностей и различных умозрительных гуманизированных продуктов с использованием моделей в трехмерном пространстве родительских и гуманизированных последовательностей. Модели иммуноглобулинов в трехмерном пространстве обычно доступны и знакомы квалифицированным в данной области специалистам. Имеются компьютерные программы, иллюстрирующие и отображающие возможные трехмерные конформационные структуры последовательностей отобранных иммуноглобулинов-кандидатов. Изучение этих отображений позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, т.е. анализировать остатки, влияющие на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. Таким способом остатки FR можно отобрать и скомбинировать из консенсусной и импортной последовательностей так, чтобы достичь требуемых свойств антитела, например увеличенной аффинности к целевому(ым) антигену(ам). Как правило, остатки CDR напрямую и наиболее существенно оказывают влияние на связывание с антигеном. Гуманизацию или получение методами инженерии антител согласно изобретению можно осуществить с использованием любого известного метода, такого как, без ограничения, те, которые описаны у Winter (Jones etal., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993), патенты США 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023,6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630,US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755, WO90/14443, WO90/14424,WO90/14430, ЕР 22924 6, все из которых полностью включены сюда посредством ссылки, в том числе процитированные в них ссылки. Трансгенных мышей, продуцирующих спектр антител человека, связывающихся с антигенами человека, можно получить с помощью известных способов (например, без ограничения, патенты США 5770428, 5569825, 5545806, 5625126, 5625825, 5633425, 5661016 и 5789650, выданные Lonberg et al.;al. Int. Rev. Immunol. 13(1): 65-93 (1995) и Fishwald et al., Nat. Biotechnol. 14(7): 845-851 (1996), все из которых полностью включены сюда посредством ссылки). Как правило, эти мыши содержат по меньшей мере один трансген, включающий в себя ДНК из по меньшей мере одного иммуноглобулинового локуса человека, который функционально реаранжирован или который может подвергнуться функциональной реаранжировке. Эндогенный иммуноглобулиновый локус у таких мышей может быть разрушен или делетирован для исключения способности животного продуцировать антитела, кодируемые эндогенными генами. Скрининг антител в отношении специфического связывания со схожими белками или фрагментами можно подходящим образом выполнить с использованием библиотек в виде пептидного дисплея. Этот метод включает скрининг больших коллекций пептидов в отношении индивидуальных членов, имеющих требуемую функцию или структуру. Скрининг антител в библиотеках в виде пептидного дисплея хорошо известен в данной области. Длины последовательностей пептидов в библиотеке в виде дисплея могут составлять от 3 до 5000 или более аминокислот, зачастую от 5 до 100 аминокислот и часто от 8 до 25 аминокислот. Помимо методов прямого химического синтеза для генерирования пептидных библиотек описаны несколько методов рекомбинантных ДНК. Один из типов включает дисплей пептидной последовательности на поверхности бактериофага или клетки. Каждый бактериофаг или клетка содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность конкретного пептида в библиотеке в виде дисплея. Такие методы описаны в РСТ-заявках на патенты 91/17271, 91/18980, 91/19818 и 93/08278. Другие системы генерирования пептидных библиотек имеют аспекты и метода химического синтеза, и рекомбинантного метода. См., в РСТ-заявки на патенты 92/05258, 92/14843 и 96/19256. См. также патенты США 5658754 и 5643768. Библиотеки в виде пептидного дисплея, векторы и наборы для скрининга коммерчески доступны от таких поставщиков, как Invitrogen (Carlbad, СА) и Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshine, UK). См., например, патенты США 4704692, 4939666,4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, переуступленныеAusubel, выше; или Sambrook, выше, все из вышеуказанных патентов и публикаций полностью включены сюда посредством ссылки. 2. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению Используя представленную здесь информацию, например, нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере 70-100% смежных аминокислот по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 2-5 и 27-28, их точно определенные фрагменты, варианты или консенсусные последовательности, можно получить молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению, кодирующие по меньшей мере одно антитело против МСР-1, с помощью методов, описанных здесь или известных в данной области. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут включать в себя молекулы нуклеиновых кислот, содержащие открытую рамку считывания (ORF), необязательно с одним или несколькими интронами, например, без ограничения, по меньшей мере одну точно определенную часть по меньшей мере одного CDR, такого как CDR1, CDR2 и/или CDR3 по меньшей мере одной тяжелой цепи (например,SEQ ID NO: 6-12, 22 и 23) или легкой цепи (например, SEQ ID NO: 13-21 и 24-26); молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательность, кодирующую антитело против МСР-1 или вариабельную область (например, SEQ ID NO: 2-5, 27 и 28); и молекулы нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотидную последовательность, которая существенно отличается от описанных выше, но которая вследствие вырожденности генетического кода все еще кодирует по меньшей мере одно антитело против МСР-1,- 13014229 описанное здесь и/или известное в данной области. Генетический код, конечно, хорошо известен в данной области. Следовательно, для квалифицированного в данной области специалиста генерирование таких вариантов вырожденных нуклеиновых кислот, кодирующих специфические антитела против МСР-1 согласно изобретению, будет представлять собой рутинную процедуру. См., например, Ausubel et al.,выше, и такие варианты нуклеиновых кислот включены в настоящее изобретение. Как здесь указывается, молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против МСР-1, могут включать в себя, не ограничиваясь перечисленными, последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность фрагмента антитела, отдельно; последовательность, кодирующую полное антитело или его часть; последовательность, кодирующую антитело, фрагмент или часть, а также дополнительные последовательности, такие как последовательность, кодирующая по меньшей мере один сигнальный пептид или слитый белок, с вышеуказанными дополнительными кодирующими последовательностями, такими как по меньшей мере один интрон, или без них и вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, в том числе, без ограничения, некодирующими 5'- и 3'-последовательностями, такими как транскрибируемые,нетранслируемые последовательности, играющие роль в транскрипции, процессинге мРНК, в том числе сигнальные последовательности сплайсинга и полиаденилирования (например, связывания рибосом и стабильности мРНК); дополнительную кодирующую последовательность, которая кодирует дополнительные аминокислоты, такие как те, которые обеспечивают дополнительные функциональности. Таким образом, кодирующую антитело последовательность можно слить с маркерной последовательностью,например, последовательностью, кодирующей пептид, облегчающий очистку слитого антитела, включающего фрагмент или часть антитела. Полинуклеотиды, которые избирательно гибридизуются с описанным здесь полинуклеотидом Настоящим изобретением обеспечиваются выделенные нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в условиях избирательной гибридизации с описанным здесь полинуклеотидом. Таким образом, полинуклеотиды этого варианта осуществления согласно изобретению можно использовать для выделения,обнаружения и/или количественного определения нуклеиновых кислот, включающих такие полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды согласно изобретению можно использовать для идентификации, выделения или амплификации частичных или полноразмерных клонов в находящейся на хранении библиотеке. В некоторых вариантах осуществления согласно изобретению полинуклеотидами являются выделенные последовательности геномной ДНК или кДНК, или в противном случае комплементарные им последовательности, кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего. Предпочтительно библиотека кДНК включает по меньшей мере 80% полноразмерных последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 85 или 90% полноразмерных последовательностей, а более предпочтительно по меньшей мере 95% полноразмерных последовательностей. Библиотеку кДНК можно нормализовать для увеличения представленности редких последовательностей. Гибридизацию в условиях низкой или средней жесткости обычно, но не исключительно, используют с последовательностями, имеющими сниженную идентичность последовательностей относительно комплементарных последовательностей. Условия средней или высокой жесткости можно необязательно использовать для последовательностей с большей идентичностью. Условия низкой жесткости делают возможной избирательную гибридизацию последовательностей, идентичных приблизительно на 70%, и их можно использовать для идентификации ортологичных или паралогичных последовательностей. Необязательно полинуклеотиды согласно изобретению кодируют по меньшей мере часть антитела,кодируемого описанными здесь полинуклеотидами. Полинуклеотиды согласно изобретению охватывают последовательности нуклеиновых кислот, которые можно использовать для избирательной гибридизации с полинуклеотидом, кодирующим антитело согласно изобретению. См., например, Ausubel, выше; Colligan, выше, все из которых полностью включены сюда посредством ссылки. Конструкция нуклеиновых кислот Выделенные нуклеиновые кислоты согласно изобретению можно приготовить с использование (а) рекомбинантных методов, (б) синтетических методов, (с) методов очистки или их комбинаций, хорошо известных в данной области. Рекомбинантные методы конструирования нуклеиновых кислот Композиции выделенных нуклеиновых кислот согласно изобретению, например, РНК, кДНК, геномной ДНК или их комбинации, можно получить из биологических источников с использованием любого числа методологий клонирования, известных квалифицированным в данной области специалистам. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотидные зонды, избирательно гибридизующиеся в жестких условиях с полинуклеотидами согласно изобретению, используют для идентификации требуемой последовательности в библиотеке кДНК или геномной ДНК. Выделение РНК и конструирование библиотек кДНК и геномной ДНК хорошо известно квалифицированным в данной области специалистам (смотри, например, Ausubel, выше; или Sambrook, выше). Методы скрининга и выделения нуклеиновых кислот Библиотеку кДНК и геномной ДНК можно скринировать с использованием зонда на основе последовательности полинуклеотида согласно изобретению, такого как те, которые здесь раскрыты. Зонды можно использовать для гибридизации с последо- 14014229 вательностями геномной ДНК или кДНК для выделения гомологичных генов в одном и том же организме или разных организмах. Квалифицированные в данной области специалисты принимают во внимание то, что при анализе можно использовать различные степени жесткости гибридизации; жесткой может быть или гибридизации или среда для отмывки. По мере увеличения жесткости условий гибридизации должна увеличиваться степень комплементарности между зондом и мишенью для того, чтобы имело место образование дуплекса. Степень жесткости можно контролировать с помощью одного или нескольких из следующих параметров: температуры, ионной силы, рН и присутствия частично денатурирующего раствора, такого как формамид. Например, жесткость гибридизации подходящим образом меняют с помощью изменения полярности реагентного раствора посредством, например, манипуляции с концентрацией формамида в пределах диапазона от 0 до 50%. Степень комплементарности (идентичность последовательности), требуемая для определяемого связывания, изменяется в соответствии с жесткостью среды для гибридизации и/или среды для отмывок. Оптимальная степень комплементарности составляет 100% или 70-100%, или любой диапазон или величина в пределах вышеуказанного диапазона. Однако должно быть понятно, что минорные вариации последовательности в зондах и праймерах можно компенсировать с помощью уменьшения жесткости гибридизации и/или среды для отмывок. Методы амплификации РНК или ДНК хорошо известны в данной области, и их можно использовать в соответствии с настоящим изобретением без чрезмерного экспериментирования, основываясь на представленные здесь доктрину и руководство. Известные методы амплификации ДНК или РНК включают, но не ограничиваются перечисленными, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и родственные способы амплификации (Mullis et al., патент США 4683202 (1987); и Innis et al., PCR Protocols A Guide toMethods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990. Синтетические методы конструирования нуклеиновых кислот Выделенные нуклеиновые кислоты согласно изобретению можно также получить с помощью прямого химического синтеза известными способами (см., например, Ausubel, et al., выше). С помощью химического синтеза обычно продуцируют одноцепочечный олигонуклеотид, который можно превратить в двухцепочечную ДНК с помощью гибридизации с комплементарной последовательностью или с помощью полимеризации с участием ДНК-полимеразы с использованием одноцепочечной последовательности в качестве матрицы. Квалифицированный в данной области специалист знает, что, несмотря на то,что химический синтез ДНК может быть ограничен последовательностями размером приблизительно 100 или более оснований, последовательности большего размера можно получить с помощью лигирования более коротких последовательностей. Об особенно предпочтительном методе химического синтеза кодирующих последовательностей говорится в патентах США 6521427 и 6670127. 3. Векторы и экспрессирующие системы Настоящим изобретением обеспечиваются векторы, предпочтительно экспрессирующие векторы,содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против МСР-1, или настоящее изобретение можно использовать для получения плазмид, содержащих гены НС или LC различных антител или их части. Используемый здесь термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним из типов векторов является "плазмида", которая относится к двухцепочечной ДНК в виде кольца, с которой можно лигировать дополнительные ДНК-сегменты. Другим типом векторов является вирусный вектор, причем с вирусным геномом можно лигировать дополнительные ДНК-сегменты. Настоящее изобретение также относится к векторам,которые включают выделенные молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению, клеткамхозяевам, полученным методами генной инженерии с использованием рекомбинантных векторов, и получению по меньшей мере одного антитела против МСР-1 с помощью рекомбинантных методов, также хорошо известных в данной области. См., например, Sambrook, et al., выше; Ausubel, et al., выше; все из которых полностью включены сюда посредством ссылки. Для экспрессии антител или их фрагментов ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкую и тяжелую цепи, можно вставить в экспрессирующие кассеты или векторы так, чтобы гены были функционально связаны с контролирующими транскрипцию и трансляцию последовательностями. Кодирующую антитело кассету можно собрать в виде конструкции. Конструкцию можно приготовить с использованием хорошо известных в данной области способов. Конструкцию можно приготовить в виде части большей плазмиды. Такое приготовление делает возможным клонирование и отбор правильных конструкций эффективным способом. Конструкцию можно расположить между удобными рестрикционными сайтами на плазмиде или другом векторе так, чтобы их можно было легко отделить от остальных последовательностей плазмиды. Как правило, плазмидный вектор вводят в преципитате, таком как преципитат фосфата кальция, или в комплексе с заряженным липидом DEAE-декстрана. Если вектором является вирус, его можно упаковать in vitro с использованием пакующей клеточной линии и затем трансдуцировать в клетки-хозяев. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина можно также осуществить с помощью электропорации или других известных способов. Такие способы описаны в данной области, как, например, Sambrook,выше, главы 1-4 и 16-18; Ausubel, выше, главы 1, 9, 13, 15, 16. В данном контексте подразумевается, что термин "функционально связанный" означает, что ген ан- 15014229 титела лигирован с вектором так, что контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности внутри вектора служат предназначенной им функции регулирования транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор и контролирующие экспрессию последовательности выбирают так,чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно встроить в отдельные векторы или, более типично, оба гена встраивают в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антител встраивают в экспрессирующий вектор с помощью стандартных способов (например, лигирования комплементарных рестрикционных сайтов на фрагменте гена антитела и векторе или лигирования по тупым концам, если нет рестрикционных сайтов). Вариабельные области легкой и тяжелой цепей описанных здесь антител можно использовать для создания полноразмерных генов антител любого изотипа путем встраивания их в экспрессирующие векторы, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи требуемого изотипа так, чтобы сегмент VH был функционально связан с сегментом(ами) СН в пределах вектора, а сегмент VL был функционально связан с сегментом(ами) CL в пределах вектора. Дополнительно или альтернативно рекомбинантный экспрессирующий вектор может кодировать сигнальный пептид,облегчающий секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в векторе так, чтобы сигнальный пептид находился в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальным пептидом из не являющегося иммуноглобулином белка). Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела согласно изобретению или в прокариотических, или в эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительной является экспрессия антител в эукариотических клетках, а наиболее предпочтительной - в клетках млекопитающего, поскольку такие эукариотические клетки, и особенно клетки млекопитающего, соберут и секретируют иммунологически активное антитело с правильной укладкой с большей вероятностью, чем прокариотические клетки. Как правило, предназначенный для экспрессии в млекопитающем вектор будет содержать (1) регуляторные элементы, обычно в форме последовательностей вирусного промотора или энхансера и характеризующиеся широким диапазоном хозяев и тканей; (2) последовательность "полилинкера", облегчающую встраивание ДНК-фрагмента, который содержит кодирующую антитело последовательность, в плазмидный вектор; и (3) последовательности, ответственные за сплайсинг интронов и полиаденилирование мРНК-транскриптов. На этот смежный район промотор-полилинкер-сайт полиаденилирования обычно ссылаются как на единицу транскрипции. Вероятно, вектор будет также содержать (4) селективный(ые) маркерный(ые) ген(ы) (например, ген бета-лактамазы), часто придающий устойчивость к антибиотику (как, например, ампициллину), что делает возможным отбор первоначальных положительных трансформатов в E.coli; и (5) последовательности, облегчающие репликацию вектора как в хозяине в виде бактерий, так и в хозяине в виде млекопитающего. Плазмидную область начала репликации включают для размножения экспрессирующей конструкции в E.coli и для временной экспрессии в клетках Cos, а в экспрессирующую плазмиду включают область начала репликации SV40. Промотор можно выбрать из промотора SV40 (например, позднего и раннего промоторов SV40),промотора CMV (патенты США 5168062 и 5385839), промотора tk HSV, промотора pgk (фосфоглицераткиназы), промотора EF-1 альфа (патент США 5266491), по меньшей мере одного промотора имммуноглобулина человека. Экспрессирующие векторы предпочтительно, но не обязательно, включают по меньшей мере один селективный маркерный ген. Такие маркерные гены включают, например, без ограничения, ген устойчивости к метотрексату (МТХ), ген дигидрофолатредуктазы (DHFR, патенты США 4399216, 4634665,4656134, 4956288, 5149636, 5179017), гены устойчивости к амипициллину, неомицину (G418), микофеноловой кислоте или ген глутаминсинтетазы (GS, патенты США 5122464, 5770359, 5827739) для культивирования эукариотических клеток или гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину для культивирования E.coli или других бактерий, или прокариот (вышеуказанные патенты полностью включены сюда посредством ссылки). Подходящие культуральные среды и условия для описанных выше клеток-хозяев известны в данной области. Подходящие векторы вполне очевидны квалифицированному специалисту. Если применяют эукариотические клетки-хозяев, в вектор обычно включают сигнал полиаденилирования или терминирующую транскрипцию последовательность. Примером терминирующей последовательности является сигнал полиаденилирования из гена гормона роста быка. Также можно включить последовательности для точного сплайсинга транскрипта. Примером подвергаемой сплайсингу последовательности является VP1-интрон из SV40 (Sprague et al., J. Virol. 45: 773-781 (1983. Кроме того, в вектор можно включить известные в данной области последовательности генов, контролирующие репликацию в клетке-хозяине. Также во избежание высокой экспрессии молекул тяжелой цепи на поверхности может потребоваться использовать экспрессирующий вектор, исключающий сплайсинговые варианты трансмембранного домена. Дополнительные элементы включают энхансеры, последовательности Козак и интронные последовательности, фланкированные донорскими или акцепторными сайтами для сплайсинга РНК. Высокоэф- 16014229 фективной транскрипции можно достичь при использовании раннего и позднего промоторов из SV40,длинных концевых повторов (LTRS) из ретровирусов, например, RSV, HTLVI, HIVI, и раннего промотора из цитомегаловируса (CMV). Однако можно также использовать клеточные элементы (например,промотор актина человека). Подходящие экспрессирующие векторы, используемые для осуществления согласно изобретению, включают, например, такие векторы, как pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On,PLXSN или pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) илиpcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL и PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152),pSV2dhfr (ATCC 37146) и pBC12MI (ATCC 67109). В альтернативном случае нуклеиновые кислоты, кодирующие последовательность антитела, можно экспрессировать в стабильных клеточных линиях, которые содержат интегрированный в хромосому ген. Котрансфекция с использованием селективного маркера, такого как dhfr, gpt, неомицин или гигромицин,позволяет идентифицировать и выделить трансфицированные клетки, которые экспрессируют большие количества кодируемых антител. Маркер DHFR (дигидрофолатредуктазу) используют для разработки клеточных линий, которые несут несколько сотен или даже несколько тысяч копий представляющего интерес ген. Другим полезным селективным маркером является фермент глутаминсинтаза (GS) (Murphy,et al., Biochem. J. 227: 277-279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10: 169-175 (1992. Используя эти маркеры, клетки млекопитающих выращивают в селективной среде и отбирают клетки с наибольшей устойчивостью. Эти клеточные линии содержат амплифицированный(ые) ген(ы), интегрированные в хромосому. Для продукции антител часто используют клетки яичника китайского хомячка (СНО) и NSO. В ДНК-конструкции, используемые для продукции антител согласно изобретению, можно необязательно включить по меньшей мере одну изоляторную последовательность. Термины "изолятор", "изоляторная последовательность" и "изоляторный элемент" используют здесь взаимозаменяемо. Изоляторный элемент - это контролирующий элемент, который изолирует транскрипцию генов, помещенных в пределы его действия, но который не влияет на экспрессию генов, или положительно, или отрицательно. Предпочтительно, изоляторную последовательность встраивают с одной из двух сторон транскрибируемой ДНК-последовательности. Например, изолятор можно поместить 5' от промотора на расстоянии от приблизительно 200 п. о. до приблизительно 1 т.п.о. и на 3'-конце представляющего интерес гена на расстоянии по меньшей мере от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 5 т.п.о. от промотора. Расстояние от изоляторной последовательности до промотора и 3'-конца представляющего интерес гена может быть определено квалифицированными в данной области специалистами в зависимости от относительных размеров представляющих интерес генов, используемых в конструкции промотора и энхансера. Кроме того, можно расположить более одной изоляторной последовательности 5' от промотора или на 3'конце трансгена. Например, две или более изоляторных последовательностей можно расположить 5' от промотора. Изолятор или изоляторы на 3'-конце трансгена можно расположить на 3'-конце представляющего интерес гена или на 3'-конце 3'-регуляторной последовательности, например 3'нетранслируемого района (UTR) или 3'-фланкирующей последовательности. Примеры подходящих экспрессирующих векторов, индуцибельные не слитые белки белков в E.coli,включают pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) и pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Dieco, Calif. (1990) 60-89). В основе экспрессии целевого гена из вектора pTrc лежит транскрипция с гибридного trp-lac-слитого промотора с помощью РНК-полимеразы хозяина. В основе экспрессии целевого гена из вектора pET 11d лежит транскрипция с Т 7 gn10-lac-слитого промотора, опосредуемая совместно экспрессируемой вирусной РНК-полимеразой(Т 7 gn1). Эта вирусная полимераза поставляется штаммами клеток-хозяев BL21(DE3) или HMS174(DE3) из присутствующего в них профага X, несущего ген Т 7 gnl под транскрипционным контролем промотораlacUV5. В другом варианте осуществления согласно изобретению экспрессирующим вектором является вектор экспрессии в дрожжах. Примеры векторов для экспрессии в дрожжах S.cerevisiae включают pYepSecl(Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) и pPicZ (Invitrogen Corp., San Diego, Calif.). В альтернативном случае экспрессирующим вектором является бакуловирусный экспрессирующий вектор. Бакуловирусные векторы, пригодные для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых (например, клетках Sf9), включают серии рАс (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) и серии pVL (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39). В еще одном варианте осуществления нуклеиновую кислоту согласно изобретению экспрессируют в клетках млекопитающего с использованием вектора для экспрессии в млекопитающем. Примеры векторов для экспрессии в млекопитающем включают pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) и рМТ 2 РС(Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). При использовании клеток млекопитающего функции контроля в экспрессирующих векторах часто обеспечиваются вирусными регуляторными элементами. Например, обычно используемыми промоторами являются промоторы, происходящие из полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса и вируса 40 обезьяны. В отношении других подходящих систем экспрессии как в прокариотических клетках, так и в эукариотических клетках смотри главы 16 и 17 Sambrook и др.,- 17014229 выше. В другом варианте осуществления согласно изобретению рекомбинантный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего способен направлять экспрессию нуклеиновой кислоты предпочтительно в специфическом типе клеток, таком как клетки лимфомы (например, клетки миеломы мыши). В специфических типах клеток используют тканеспецифические регуляторные элементы для экспрессии нуклеиновой кислоты. Тканеспецифические регуляторные элементы известны в данной области. Неограничивающие примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают промотор альбумина (специфичный в отношении печени; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), промоторы, специфичные в отношении лимфоидной ткани (Calame and Eaton (1998) Adv. Immunol. 43: 235-275), в частности промоторы рецепторов Т-клеток (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) и иммуноглобулинов (Banerji etal. (1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), промоторы, специфичные в отношении нервных клеток (например, промоторы нейрофиламента; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl.Acad. Sci USA 86: 5473-5477); промоторы, специфичные в отношении поджелудочной железы (Edlund etal. (1985) Science 230: 912-916), и промоторы, специфичные в отношении молочной железы (например,промотор молочной сыворотки; патент США 4873316 и Европейский патент 264166). Регулируемые в процессе развития промоторы также охватываются, например, крысиным гомеобокс промотором(1989) Genes Dev. 3: 537-546). Кроме того, изобретением обеспечивается рекомбинантный экспрессирующий вектор, включающий в себя ДНК-молекулу, клонированную в экспрессирующий вектор в антисмысловой ориентации. Т.е. ДНК-молекула функционально связана с регуляторной последовательностью таким образом, который делает возможной экспрессию (посредством транскрипции ДНК-молекулы) РНК-молекулы, которая является антисмысловой относительно кодирующей полипептид мРНК. Можно выбрать регуляторные последовательности, функционально связанные с клонированной в антисмысловой ориентации нуклеиновой кислотой, которые направляют непрерывную экспрессию антисмысловой РНК-молекулы в различных типах клеток. Например, можно выбрать вирусные промоторы и/или энхансеры или регуляторные последовательности, которые направляют конститутивную специфичную в отношении ткани или типа клеток экспрессию антисмысловой РНК. Антисмысловой экспрессирующий вектор может быть в форме рекомбинантной плазмиды, фагемиды или ослабленного в своей вирулентности вируса, в которой антисмысловые нуклеиновые кислоты продуцируются под контролем высокоэффективного регуляторного района, активность которого может определяться типом клетки, в которую вводят вектор. В отношении обсуждения регуляции генной экспрессии при использовании антисмысловых генов, смотри Weintraub et al. (Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986). Клонирование и экспрессия в клетках миеломы Наблюдали, что химерное мышь/человек моноклональное антитело IgGlk против CD4 человека, известное как СМ-Т 412 (ЕР 0511308, полностью включенный сюда посредством ссылки), экспрессируется на высоких уровнях в трансфицированных клетках миеломы мыши (Looney et al. 1992. Hum Antibodies Hybridomas 3(4): 191-200). Без большого усилия оптимизировать условия культивирования в Centocor, Inc.Malvern в 1990 легко получили уровни продукции, составляющие 500 мг/л (специфическая продуктивность, измеряемая в пг/клетку/день, не известна). На основе компонентов этих экспрессирующих векторов разработали векторы для клонирования антител, полезные для клонирования НС и LC, которые включают промотор гена/последовательность нуклеиновой кислоты инициации транскрипции; 5'нетранслируемые последовательности и последовательности нуклеиновых кислот инициации трансляции, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие сигнальную последовательность, интрон/экзон сплайсинговую донорскую последовательность для сигнального интрона и J-C-интрона и последовательности нуклеиновых кислот энхансера J-C-интрона. Плазмида р 139, плазмида pUC19, содержит геномный EcoRI-EcoRI-фрагмент размером 5,8 т.п.о., клонированный из гибридомных клеток С 123,секретирующих полностью мышиное Aт M-T412; фрагмент содержит промотор и часть V-области гена НС сМ-Т 412. Исходным материалом для получения методами инженерии вектора, включающего Vобласть гена LC, послужила плазмида р 39, плазмида pUC, которая содержит геномный HindIII-HindIIIфрагмент размером 3 т.п.о., клонированный из гибридомных клеток С 123; этот фрагмент содержит промотор и часть V-области гена LC сМ-Т 412. Сконструировали методами инженерии векторы, происходящие из р 139 и р 39, делающие возможной подходящую сборку генов НС или LC, пригодных для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающего, в двухэтапном процессе, который включает (1) клонирование ДНК, кодирующую представляющую интерес последовательность, между специально приготовленными рестрикционными сайтами в векторе V-области, посредством чего кодирующая V-область последовательность располагается тотчас же 3' от кодируемой вектором сигнальной последовательности, а также 3' от части или всего промотора гена; и (2) перенос фрагмента, включающего вставленную последовательность, из вектора V-области в вектор С-области в правильной ориентации, посредством чего получающаяся в результате плазмида образует конечную экспрессирующую плазмиду, подходящую для экспрессии в клетках (Scallon et al. 1995 Cytokine 7(8): 759-769).- 18014229 Клонирование и экспрессия в клетках СНО Плазмида рС 4 является производной плазмиды pSV2-dhfr (ATCC номер доступа 37146). Эта плазмида содержит ген DHFR мыши под контролем раннего промотора SV40. Трансфицированные этими плазмидами клетки яичника китайского хомячка или другие клетки без дигидрофолатной активности можно отобрать путем выращивания клеток в селективной среде (например, альфа минус MEM, LifeTechnologies, Gaitherburg, MD), дополненной химиотерапевтическим агентом метотрексатом. Об амплификации генов DHFR в устойчивых к метотрексату (МТХ) клетках сообщалось (см., например, F. W. Alt,et al., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); J.L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107-143(1990); and M.J. Page and M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64-68 (1991. У клеток, выращиваемых при увеличивающихся концентрациях МТХ, развивается устойчивость к лекарственному средству посредством сверхпродукции целевого фермента, DHFR, являющейся результатом амплификации гена DHFR. Если с геном DHFR связать второй ген, он, как правило, совместно амплифицируется и сверхэкспрессируется. В данной области известно, что этот подход можно использовать для разработки клеточных линий, несущих более 1000 копий амплифицированного(ых) гена(ов). Впоследствии, когда метотрексат удаляют, получают клеточные линии, содержащие амплифицированный ген, интегрированный в одну или несколько хромосом клетки-хозяина. Плазмида рС 4 для экспрессии представляющего интерес гена содержит сильный промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (Cullen, et al., Molec. Cell Biol. 5: 438-447 (1985 плюс фрагмент, изолированный из энхансера немедленного раннего гена цитомегаловируса человека (CMV)(Boshard et al., Cell 41: 521-530 (1985. 3' от промотора находятся сайты расщепления рестрикционными ферментами BamHI, XbaI и Asp718, делающие возможной интеграцию генов. Ниже этих сайтов для клонирования плазмида содержит 3'-интрон и сайт полиаденилирования гена препроинсулина крысы. Для экспрессии можно также использовать другие высокоэффективные промоторы, например промотор актина человека, ранний или поздний промоторы SV40 или длинные концевые повторы из других ретровирусов, например HIV и HTLVI. Для экспрессии антитела против МСР-1 в клетках млекопитающего регулируемым способом можно применять системы Clontech для экспрессии генов с использованиемTet-депрессии и Tet-репрессии (М. Gossen, and H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992. Для полиаделинирования мРНК можно также использовать другие сигналы, например, из генов гормона роста человека или глобина. 4. Клетки-хозяева для продукции антител По меньшей мере одно антитело против МСР-1 согласно изобретению можно необязательно продуцировать с использованием клеточной линии, смешанной клеточной линии, иммортализованной клетки или клоновой популяции иммортализованных клеток, хорошо известных в данной области. Смотри, например, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, Inc., NY, NY (19872004); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989);Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, John WileySons, Inc., NY, NY (1994-2004); Colligan et al., eds., Current Protocols in Protein Science, John WileySons, NY, NY (1997-2004); все из которых полностью включены сюда посредством ссылки. Для того чтобы продуцировать биофармацевтические продукты, требуется продуцирующая клеточная линия, способная к эффективной и репродуцируемой экспрессии рекомбинантного(ых) полипептида(ов). Клеточная линия является стабильной и поддерживаемой. Для этой цели можно использовать различные линии клеток-хозяев. По мере понимания сложности того, каким образом структура клетки влияет на конечное количество и состав биотерапевтического продукта, становится более очевидным выбор линии клеток-хозяев, которые будут сообщать продукции и составу продукта требуемые свойства. В отличие от большинства генов, транскрибируемых с непрерывных геномных ДНКпоследовательностей, гены антител собираются из генных сегментов, которые могут быть значительно разделены в зародышевой линии. В частности, гены тяжелой цепи образуются путем рекомбинации трех геномных сегментов, кодирующих вариабельную область (V), область, вносящую дополнительный вклад в разнообразие антител, (D) и соединительную (J)/константную (С) область антитела. Функциональные гены легкой цепи образуются соединением двух генных сегментов; один кодирует V-область, а другой кодирует J/C-область. Оба локуса тяжелой цепи и легкой цепи каппа содержат много генных сегментов V-области (оценки варьируют между 100 и 1000), которые протягиваются на 1000 т.п.о. Локус лямбда, напротив, много меньше и протягивается на приблизительно 300 т.п.о. на хромосоме 16 у мыши. Он состоит из двух генных сегментов вариабельной области и четырех генных сегментов соединительной/константной (J/C) области. Для образования функционального гена требуется рекомбинация между V- и J/C-элементами. В В-клетке, в которой антитело продуцируется в природе, контроль транскрипции обоих реаранжированных генов тяжелой цепи и легкой цепи каппа зависит от активности тканеспецифического промотора 5' от V-области и тканеспецифического энхансера, расположенного в J-C-интроне. Эти элементы действуют синергически. Кроме того, второй специфичный в отношении В-клеток энхансер идентифицирован в локусе легкой цепи каппа. Этот дополнительный энхансер расположен на расстоянии 9 т.п.о. 3'- 19014229 от Скаппа. Следовательно, в гибридомном способе иммортализации экспрессирующих антитела генов используются эндогенные последовательности промотора и энхансера родительской В-клеточной линии. В альтернативном случае нуклеиновые кислоты согласно изобретению можно экспрессировать в клеткехозяине с помощью ее индукции (с помощью манипуляции) в клетке-хозяине, которая содержит эндогенную ДНК, кодирующую антитело согласно изобретению. Такие способы хорошо известны в данной области, например, способы, описанные в патентах США 5580734, 5641670, 5733746 и 5733761,которые полностью включены сюда посредством ссылки. Другим способом создания клетки-хозяина, способной экспрессировать антитела, является клонирование геномной ДНК антитела в искусственном векторе. Впрочем, экспрессия моноклональных антител под контролем сильного промотора увеличивает возможность идентификации высокопродуцирующих клеточных линий и получения высоких выходов моноклональных антител. Антитела согласно изобретению можно продуцировать в клетке-хозяине в виде трансфектомы с использованием, например,комбинации методов рекомбинантных ДНК и методов трансфекции генов, хорошо известных в данной области (например, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). Системы клонирования и экспрессии биофармацевтических препаратов, в том числе антител, в ряде различных клеток-хозяев хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, клетки млекопитающих, клетки растений, дрожжи и бакуловирусные системы и трансгенные растения и животные. Имеющиеся в данной области линии клеток млекопитающих для экспрессии гетерологичных полипептидов в виде интактных гликозилированных белков включают клетки яичника китайского хомячка(СНО), клетки HeLa, клетки почки детеныша хомячка (ВНК), клетки меланомы мыши NSO и производные клеточные линии, например, SP2/0, YB2/0 (АТС CRL-1662), клетки миеломы крысы, эмбриональные почечные клетки человека (НЕК), эмбриональные клетки сетчатки человека, клетки PerC.6, клетки hepG2, BSC-1 (например, АТСС CRL-26) и многие другие, доступные, например, из американской коллекции типовых культур, Manassas, Va (www.atcc.org). Частным предпочтительным бактериальным хозяином является E.coli. Для стабильной экспрессии гетерологичных генов часто использовали такие клетки млекопитающих, как клетки СНО, миеломные клетки, клетки НЕК 293, клетки ВНК (ВНК 21, АТСС CRL-10), клеткиLtk мыши и клетки NIH3T3. Напротив, для временной экспрессии рекомбинантных белков в заведенном порядке используют такие клеточные линии, как Cos (COS-1 АТСС CRL-1650; COS-7 АТСС CRL-1651) и НЕК 293. Предпочтительные клетки-хозяева, являющиеся млекопитающими, для экспрессии рекомбинантных антител согласно изобретению включают миеломные клетки, такие как Sp2/0, YB2/0 (АТСС CRL1662), NSO и Р 3 Х 63.Ag8.653 (например, SP2/0-Ag14), из-за их высокой скорости экспрессии. В частности, при использовании миеломных клеток NSO другой предпочтительной экспрессирующей системой является система экспрессии гена GS, раскрытая в WO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338841. Когда в клетки-хозяев, являющихся млекопитающими, вводят рекомбинантные экспрессирующие векторы, при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для того, чтобы сделать возможной экспрессию антитела в клетке-хозяине или, более предпочтительно, секрецию антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяев, продуцируются антитела. Из культуральной среды антитела можно извлечь с использованием стандартных способов очистки белков. Иллюстрацией клеточных культур, используемых для продуцироваеия антител, их точно определенных частей или вариантов, являются клетки млекопитающих. Системы клеток млекопитающих часто находятся в форме монослоев клеток, хотя можно также использовать суспензии клеток млекопитающих. В данной области разработан ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных экспрессировать интактные гликозилированные белки, которые включают клеточные линии COS-1 (например, АТССCRL-1650), COS-7 (например, АТСС CRL-1651), HEK293, ВНК 21 (например, АТСС CRL-10), СНО (например, АТСС CRL-1610) и BSC-1 (например, АТСС CRL-26), клетки Cos-7, клетки СНО, клетки hep G2,P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, клетки 293, клетки HeLa и т.п., которые легко доступны, например, из американской коллекции типовых культур, Manassas, Va (www.atcc.org). Предпочтительные клетки-хозяева включает клетки лимфоидного происхождения, такие как клетки миеломы и лимфомы. Особенно предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки РЗХ 63Ag8.653 (номер доступа в АТСС - CRL1580) и SP2/0-Agl4 (номер доступа в АТСС - CRL-1851). Для продукции белка на высоком уровне используют клетки СНО-K1 и DHFR-CHO DG44 и DUKB11 (G. Urlaub, L.A. Chasin, 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4216-4220), поскольку амплификация представляющих интерес генов становится возможной при включении селективного, амплифицируемого маркера, DHFR, с использованием, например, лекарственного средства метотрексата (МТХ) (R.J. Kaufman, 1990. Methods Enzymol. 185: 537-566). Для продукции рекомбинантных мАт на высоком уровне можно с успехом использовать клетки DHFR"CHO. Клетки DHFFTCHO могут продуцировать антитела против МСР-1 со скоростью, составляющей 80-110 мг 106 клеток-1 день-1 и более чем 200 мг 106 клеток-1 день-1. Для достижения экпрессии Н- и L-цепей в клетках СНО можно использовать ряд промоторов, например промотор -актина, промотор CMV MIE человека, главный поздний промотор (MLP) вируса Ad,промотор RSV и LTR вируса крысиного лейкоза. В литературе для экспрессии мАт описывается ряд век- 20014229 торов, в которых две различные плазмиды с независимыми селективными/амплифицируемыми маркерами несут две цепи Ig. Для получения до 180 мг гуманизированных мАт л-1 7 дней-1 в центрифужных стаканах можно использовать векторы, содержащие одну цепь антитела, например, Н-цепь, связанную с маркером DHFR, и экспрессирующую L-цепь кассету с маркером Neor, или наоборот. Используемые для первоначального отбора и последующей амплификации способы могут варьировать, и они хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. Как правило, экспрессию мАт на высоком уровне можно получить, используя следующие стадии: первоначальный отбор и последующая амплификация клонов-кандидатов, совместный отбор (например, в случаях, когда оба вектора, экспрессирующих Н-цепь и L-цепь, несут экспрессирующую DHRF единицу) и амплификация, совместная амплификация с использованием различных амплифицируемых маркеров, и первоначальный отбор и амплификация в культуральной массе с последующим разведением клонов для идентификации индивидуальных клонов с высокой экспрессией. Поскольку на эффективность экспрессии Н-цепи и L-цепи и общую экспрессию мАт могут оказывать влияние сайты интеграции, создали единичные векторы, в которых две экспрессирующие Ig-цепи единицы располагаются в тандеме. Эти векторы также несут доминантный селективный маркер, такой как Neor и экспрессирующая DHRF кассета. Для обзора смотри Ganguly, S. and A. Shatzman. Expression Systems, mammalian cells IN: Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation. 1999 by John WileySons, Inc. Для экспрессии на высоком уровне гетерологичных генов в клетках СНО Cockett и др. (1990.Bio/Technology 8, 662-667) разработали GS-системы. Для получения клонов, экспрессирующих антитела согласно изобретению с выходами, сопоставимыми с выходами систем DHRF-CHO, можно использовать трансфекцию экспрессирующего вектора, содержащего кДНК (под транскрипционным контролем промотора hCMV) и миниген GS (под контролем позднего промотора SV40), в клетки СНО-K1 (с последующим отбором с использованием от 20 мМ до 500 мМ MSX). GS-системы обсуждаются в целом или отчасти в связи с Европейскими патентами 021684 6, 0256055 и 0323997 и заявкой на Европейский патент 8 9303964. В качестве неограничивающего примера для получения больших количеств рекомбинантных белков, например с использованием индуцибельного промотора, использовали листья трансгенного табака,экспрессирующего рекомбинантные белки. См., например, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) и приведенные там ссылки. Также использовали трансгенную кукурузу для экспрессии белков млекопитающих на уровнях коммерческой продукции, с биологическими активностями, эквивалентными активностям белков, продуцированных в других рекомбинантных системах или очищенных из природных источников. См., например, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999) и приведенные там ссылки. Антитела, в том числе фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела (scFv), продуцировали в больших количествах из семян трансгенных растений, в том числе семян табака и клубней картофеля. См., например, Conrad et al., Plant. Mol. Biol. 38: 101-109 (1998) и приведенные там ссылки. Таким образом, антитела согласно изобретению можно также получить с использованием трансгенных растений в соответствии с известными способами. См. также, например, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109: 341-6 (1995);Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22: 940-944 (1994) и приведенные там ссылки. См. также в общем в отношении экспрессии антител в растениях, без ограничения, патент США 5959177. Все вышеуказанные ссылки полностью включены сюда посредством ссылки. 5. Очистка антитела Антитело против МСР-1 можно извлечь и очистить из культур рекомбинантных клеток с помощью хорошо известных способов, включающих, но не ограничивающихся перечисленными, очистку с использованием белка А, преципитацию с использованием сульфата аммония или этанола, экстракцию кислотой, анион- или катионообменную хроматографию, хроматографию с использованием фосфоцеллюлозы, хроматографию на основе гидробных взаимодействий, аффинную хроматографию, хроматографию с использованием гидроксилапатита и хроматографию с использованием лектина. Для очистки можно также использовать жидкостную хроматографию высокого разрешения (HPLC). Смотри, например, Colligan, Current Protocols in Immunology, или Current Protocols in Protein Science, John WileySons, NY, NY(1997-2001), например главы 1, 4, 6, 8, 9, 10, все из которых полностью включены сюда посредством ссылки. Антитела согласно изобретению включают встречающиеся в природе очищенные продукты, продукты методик проведения химического синтеза и продукты, полученными рекомбинантными методами из эукариотических хозяев, включающих, например, дрожжи, высшие растения, насекомых и клетки млекопитающих. В зависимости от используемого в процедуре рекомбинантной продукции хозяина антитело согласно изобретению может быть гликозилированным или негликозилированным, и гликозилированное антитело является предпочтительным. Такие методы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Sambrook, выше, параграфы 17.37-17.42; Ausubel, выше, главы 10, 12, 13,16, 18 и 20, Colligan, Protein Science, выше, главы 12-14, все из которых полностью включены сюда посредством ссылки.- 21014229 6. Антитела согласно изобретению Антитела против МСР-1 (также называемые антителами против CCL-2 или МСР-1-антитела), применимые в способах и композициях согласно изобретению, необязательно характеризуются связыванием с высокой аффинностью с МСР-1, связыванием с высокой специфичностью с МСР-1, способностью ингибировать одну или несколько биологических активностей, ассоциированных с МСР-1, и необязательно и предпочтительно наличием низкой токсичности. Антитела согласно изобретению могут связываться с МСР-1 человека с аффинностями (KD) в широком диапазоне. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно мАт человека согласно изобретению может необязательно связываться с МСР-1 человека с высокой аффинностью. Например, мАт человека может связываться с МСР-1 человека с KD, равной или меньшей, чем приблизительно 10-7 М, такой как, без ограничения, 0,1-9,9 (или любой диапазон или величина в пределах указанного диапазона) X 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, или любой диапазон или величина в пределах указанного диапазона. Аффинность, или сродство, или авидность антитела к антигену можно определить экспериментально с помощью любого подходящего способа (Смотри, например, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1994); Kuby, JanisImmunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); и описанные здесь способы). Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может варьировать при измерении в различных условиях (например, концентрации соли, рН). Следовательно, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, KD, Ka, Kd) предпочтительно проводить с использованием стандартизованных растворов антитела и антигена и стандартизованного буфера, такого как стандартные растворы и буферы, описанные здесь. Выделенные антитела согласно изобретению включают раскрытые здесь аминокислотные последовательности антител, кодируемые любым подходящим полинуклеотидом, или любое выделенное или приготовленное антитело. Предпочтительно антитело человека или антигенсвязывающий фрагмент связывается с МСР-1 человека и, таким образом, частично или существенно нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность белка. Антитело или его точно определенная часть или вариант, которые частично или предпочтительно существенно нейтрализуют по меньшей мере одну биологическую активность по меньшей мере одного белка МСР-1 или фрагмента, могут связываться с белком или фрагментом и, таким образом, ингибируют активности, опосредуемые через связывание МСР-1 с рецептором МСР-1 или через другие МСР-1-зависимые и МСР-1-опосредумые механизмы. Используемый здесь термин "нейтрализующее антитело" относится к антителу, которое может ингибировать МСР-1-зависимую активность на приблизительно 20-120%, предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 10, 20,30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более в зависимости от анализа. Способность антитела против МСР-1 ингибировать МСР-1-зависимую активность предпочтительно оценивают с помощью по меньшей мере одного подходящего анализа белка или рецептора МСР 1, описанного здесь и/или известного в данной области. Антитело человека согласно изобретению может быть любого класса (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD и т.п.) или изотипа и может включать в себя легкую цепь каппа или лямбда. В одном варианте осуществления согласно изобретению антитело человека включает тяжелую цепь IgG или точно определенный фрагмент, например, по меньшей мере одного из изотипов,IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Антитела этого типа можно получить с использованием трансгенной мыши или другого трансгенного не являющегося человеком млекопитающего, включающего по меньшей мере один трансген легкой цепи человека (например IgG, IgA и IgM (например, 1, 2, 3, 4, описанный здесь и/или известный в данной области. В другом варианте осуществления согласно изобретению антитело против МСР-1 человека включает тяжелую цепь IgG1 и легкую цепь IgG1. По меньшей мере одно антитело согласно изобретению связывается с по меньшей мере одним точно определенным эпитопом, специфичным в отношении по меньшей мере одного белка МСР-1, его фрагмента, части или любой их комбинации. По меньшей мере один эпитоп может включать в себя по меньшей мере одну антитело-связывающую область, которая включает по меньшей мере одну часть белка, а предпочтительно эпитоп состоит из по меньшей мере 1-3 аминокислот целой точно определенной части смежных аминокислот SEQ ID NO: 1. Как правило, антитело человека или антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению содержит антигенсвязывающую область, которая включает по меньшей мере один определяющий комплементарность участок человека (CDR1, CDR2 и CDR3) или вариант по меньшей мере одной вариабельной области тяжелой цепи и по меньшей мере один определяющий комплементарность участок человека(CDR1, CDR2 и CDR3) или вариант по меньшей мере одной вариабельной области легкой цепи. Неограничивающим примером является антитело или антигенсвязывающая часть или вариант, которые содержат по меньшей мере один CDR3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 9 или 12, и/или CDR3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1517, 20 или 21. В конкретном варианте осуществления согласно изобретению антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут иметь антигенсвязывающую область, которая содержит по меньшей мере часть по меньшей мере одного CDR тяжелой цепи (т.е. CDR1, CDR2 и/или CDR3), имеющего аминокислотную- 22014229 последовательность, соответствующую CDR1, 2 и/или 3 (например, SEQ ID NO: 6-12 и/или 22, 23 и 26). В другом конкретном варианте осуществления согласно изобретению антитело или антигенсвязывающая часть или вариант могут иметь антигенсвязывающую область, которая содержит по меньшей мере часть по меньшей мере одного CDR легкой цепи (т.е. CDR1, CDR2 и/или CDR3), имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую CDR1, 2 и/или 3 (например, SEQ ID NO: 13-21 и/или 24 и 25). В предпочтительном варианте осуществления согласно изобретению три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента произошли из соответствующих CDR по меньшей мере одного Fab MOR0336, MOR03464, MOR03468, MOR03470, MOR03471, MOR03473,MOR03548, описанных здесь, каркасные области тяжелой цепи произошли из антитела с VH3 (SEQ IDNO: 2), и каркасные области легкой цепи произошли из антитела каппа-типа (SEQ ID NO: 4). Такие антитела можно приготовить путем химического соединения вместе различных частей (CDR и каркасных областей) антитела, используя традиционные методы, путем получения и экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, используя традиционные методы технологии рекомбинантной ДНК или с помощью любого другого подходящего метода. Антитело против МСР-1 может включать в себя по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой или легкой цепи, имеющую определенную аминокислотную последовательность, в каркасных областях. Например, в предпочтительном варианте осуществления согласно изобретению антитело против МСР-1 включает по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, необязательно имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3, и/или по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, необязательно имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или 5. Класс антитела или изотип (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) зависит от константных областей, которые кодируются генами константных областей тяжелой цепи. В классе IgG человека существует четыре подкласса или подтипа: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, названных в порядке их природного относительного содержания в сыворотке, начиная от наибольшего к наименьшему. Антитела IgA обнаруживают в виде двух подклассов: IgA1 и IgA2. Используемый здесь термин "переключение изотипа" также относится к изменению между подклассами или подтипами IgG. Изобретение также относится к антителам, антигенсвязывающим фрагментам, цепям иммуноглобулинов и CDR, содержащим аминокислотную последовательность, которая является по существу той же самой, что и описанная здесь аминокислотная последовательность. Предпочтительно такие антитела или антигенсвязывающий фрагмент и антитела, содержащие такие цепи или CDR, могут связываться с МСР 1 человека с высокой аффинностью (например, KD, меньшей или равной приблизительно 10-9 М). Аминокислотные последовательности, которые являются по существу теми же самыми, что и описанные здесь последовательности, включают последовательности, включающие консервативные замены аминокислот, а также делеции и/или вставки аминокислот. Консервативные замены аминокислот относятся к замещению первой аминокислоты второй аминокислотой, которая имеет химические и/или физические свойства (например, заряд, структуру, полярность, гиброфобность/гидрофильность), схожие со свойствами первой аминокислоты. Консервативные замены включают замещение одной аминокислоты другой аминокислотой в пределах следующих групп: лизин (К), аргинин (R) и гистидин (Н)/ аспартат (D) и глутамат (Е); аспарагин (N), глутамин (Q), серии (S), треонин (Т), тирозин (Y), К, R, H, D и Е; аланин (А),валин (V), лейцин (L), изолейцин (I), пролин (Р), фенилаланин (F), триптофан (W), метионин (М), цистеин (С) и глицин (G); F, W и Y; С, S и Т. Антитело против МСР-1 согласно изобретению может включать в себя одну или несколько аминокислотных замен, делеций или вставок, или в результате природных мутаций, или манипуляций человека, как отмечается здесь или говорится у Knappik и др. (патент США 6828422) в отношении вариабельных областей, происходящих из последовательностей генов зародышевой линии человека и классифицированных на основе схожести последовательностей в семейства, обозначенные VH1A, VH1B, VH2 и т.п., и на основе легких цепей в виде подгрупп каппа или лямбда. Эти последовательности и другие последовательности, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются перечисленными, конфигурации, представленные в табл. 1, которые, кроме того, описываются на фиг. 1-42 РСТ-заявки WO 05/005604 и заявки US 10/872932, поданной 21 июня 2004, полностью включенных сюда посредством ссылки, причем упоминаемые в качестве ссылки фиг. 1-42 демонстрируют примеры последовательностей вариабельных и константных доменов тяжелой и легкой цепей, каркасных областей, субдоменов, областей и замен, часть из которых можно использовать в происходящих из Ig белках согласно изобретению, как здесь говорится. Число аминокислотных замен, которые мог бы осуществить квалифицированный специалист, зависит от многих факторов, в том числе тех, которые описаны выше. Вообще говоря, число аминокислотных замен, вставок или делеций для любого данного антитела против МСР-1, фрагмента или варианта будет не более 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, как, например, 1-30 или любой диапазон или величины в пределах указанного диапазона, как здесь отмечено. Существенные для функционирования аминокислоты в антителе против МСР-1 согласно изобретению можно идентифицировать с помощью известных в данной области способов, таких как сайтнаправленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (например, Ausubel, выше, главы 8, 15;Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989. При аланин-сканирующем мутагенезе вводят мутации в виде только аланина в каждый остаток молекулы. Получающиеся в результате мутантные молекулы затем проверяют на биологическую активность, такую как, без ограничения, по меньшей мере одна нейтрализующая МСР-1 активность. Сайты, являющиеся критическими для связывания антитела, можно также идентифицировать с помощью структурного анализа, такого как кристаллизация, ядерномагнитный резонанс или фотоаффинное мечение (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992); и de Vos,et al., Science 255: 306-312 (1992. Антитела против МСР-1 согласно изобретению могут включать в себя, без ограничения, по меньшей мере одну часть, последовательность или комбинацию, выбранную из от 5 до всех смежных аминокислот по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 2-5 и 27-28. Кроме того, антитело против МСР-1 может необязательно включать в себя полипептид по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 27 и 28. В одном варианте осуществления согласно изобретению аминокислотная последовательность иммуноглобулиновой цепи или ее части идентична приблизительно на 100% аминокислотной последовательности соответствующей цепи по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 27 и 28, за исключением консервативных замен, которые не изменяют специфичность связывания антитела против МСР-1. Например, аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи можно сопоставить с последовательностью SEQ ID NO: 4 или 5, или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи можно сопоставить с последовательностью SEQ ID NO: 2 или 3. Предпочтительно, идентичность аминокислот определяют с использованием подходящего компьютерного метода, известного в данной области. Как понятно квалифицированным специалистам, настоящее изобретение включает по меньшей мере одно биологически активное антитело согласно изобретению. Биологически активные антитела имеют специфическую активность на уровне по меньшей мере 20, 30 или 40% и предпочтительно по меньшей мере 50, 60 или 70%, и более предпочтительно по меньшей мере 80, 90 или 95-100% активности встречающегося в природе (не синтетического), эндогенного или родственного и известного антитела. Способы анализа и количественного определения ферментативной активности и субстратной специфичности хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам и описываются здесь. В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителам человека и антигенсвязывающим фрагментам, описанным здесь, модифицированным с помощью ковалентного присоединения органической составляющей. С помощью такой модификации можно продуцировать антитело или антигенсвязывающий фрагмент с улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, увеличенным in vivo временем полужизни в сыворотке). Органической составляющей может быть линейная или разветвленная гидрофильная полимерная группа, группа жирной кислоты или группа сложного эфира жирной кислоты. В конкретном варианте осуществления согласно изобретению гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу, составляющую от приблизительно 800 до приблизительно 120000 Да,- 24014229 и может представлять собой полиалкангликоль (например, полиэтиленгликоль (PEG), полипропиленгликоль (PPG, углеводородный полимер, аминокислотный полимер или поливинилпирролидон, а группа жирной кислоты или группа сложного эфира жирной кислоты может включать в себя от приблизительно восьми до приблизительно сорока атомов углерода. Модифицированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению могут включать в себя одну или несколько органических составляющих, которые ковалентно связаны, напрямую или опосредовано, с антителом. Каждая органическая составляющая, которая связана с антителом и антигенсвязывающим фрагментом согласно изобретению,может независимо представлять собой гидрофильную полимерную группу, группу жирной кислоты или группу сложного эфира жирной кислоты. Используемый здесь термин "жирная кислота" охватывает монокарбоксильные кислоты и дикарбоксильные кислоты. В качестве используемого здесь термина "гидрофильная полимерная группа" относится к органическому полимеру, который больше растворим в воде,чем в октане. Например, полилизин больше растворим в воде, чем в октане. Следовательно, антитело,модифицированное путем ковалентного присоединения полилизина, охватывается настоящим изобретением. Гидрофильные полимеры, пригодные для модификации антител согласно изобретению, могут быть линейными или разветвленными и включают, например, полиалкангликоли (например, PEG, монометоксиполиэтиленгликоль (mPEG), PPG и т.п.), углеводороды (например, декстран, целлюлозу, олигосахариды, полисахариды и т.п.), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и т.п.), полиалканоксиды (например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и т.п.) и поливинилпирролидон. Предпочтительно гидрофильный полимер, модифицирующий антитело согласно изобретению, имеет молекулярную массу от приблизительно 800 до приблизительно 150000 Да в виде отдельной молекулярной частицы. Например, можно использовать PEG5000 и РЕС 20000, где субскрипт представляет собой среднюю молекулярную массу полимера в дальтонах. Гидрофильная полимерная группа может быть замещена от одной до приблизительно шести алкильными группами, группами жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты. Гидрофильный полимер, замещенный группой жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты, можно приготовить, используя подходящие способы. Например, полимер, включающий в себя аминогруппу, можно связать с карбоксилатом жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты, а активированный карбоксилат (например, активированный с использованием N,N-карбонилдиимидазола) жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты можно связать с гидроксильной группой полимера. Жирные кислоты или сложные эфиры жирных кислот, подходящие для модификации антител согласно изобретению, могут быть насыщенными или могут содержать одну или несколько ненасыщенных единиц. Жирные кислоты, подходящие для модификации антител согласно изобретению, включают, например, N-додеканоат (C12, лаурат), N-тетрадеканоат (С 14, миристат), N-октадеканоат (C18, стеарат), Nэйкозаноат (С 20, арахидат), N-докозаноат (С 22, бегенат), N-триаконтаноат (С 30), N-тетраконтаноат (С 40),цис-9-октадеканоат (C18, олеат), все цис-5,8,11,14-эйкозатетраеноат (C20, арахидонат), октандионовую кислоту, тетрадекандионовую кислоту, октадекандионовую кислоту, докозандионовую кислоту и т.п. Подходящие сложные эфиры жирных кислот включают моноэфиры дикарбоксильных кислот, которые включают группу линейного или разветвленного низшего алкила. Группа низшего алкила может включать в себя от одного до приблизительно двенадцати, предпочтительно от одного до приблизительно шести атомов углерода. Модифицированные антитела человека и антигенсвязывающие фрагменты можно получить с помощью подходящих способов, таких как реакция с одним или несколькими модифицирующими агентами. Используемый здесь термин "модифицирующий агент" относится к подходящей органической группе (например, гидрофильному полимеру, жирной кислоте, эфиру жирной кислоты), которая включает активирующую группу. "Активирующая группа" представляет собой химическую составляющую или функциональную группу, которая может при соответствующих условиях взаимодействовать со второй химической группой, таким образом образуя ковалентную связь между модифицирующим агентом и второй химической группой. Например, реакционноспособные в отношении аминов активирующие группы включают электрофильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, йод),N-гидроксисукцинимидиловые эфиры (NHS) и т.п. Активирующие группы, которые могут взаимодействовать с тиолами, включают, например, имид малеиновой кислоты, йодацетил, акрилоил, пиридилдисульфиды, тиоэфир 5-тиол-2-нитробензойной кислоты (TNB-тиол) и т.п. Функциональную группу альдегидов можно связать с амино- или гидразид-содержащими молекулами, а азидная группа может взаимодействовать с трехвалентной фосфористой группой с образованием связей в виде фосфорамидата или имида фосфористой кислоты. Подходящие способы введения активирующих групп в молекулы известны в данной области (смотри, например, Hermanson, G. Т., Bioconjugate Techniques, Academic Press: SanDiego, CA (1996. Активирующая группа может быть связана напрямую с органической группой (например, гидрофильным полимером, жирной кислотой, сложным эфиром жирной кислоты) или через линкерную составляющую, например двухвалентную C1-C12-группу, где один или несколько атомов углерода могут быть замещены гетероатомом, таким как кислород, азот или сера. Подходящие линкерные составляющие включают, например, тетраэтиленгликоль, -(СН 2)3-, -NH-(CH2)6-NH, -(CH2)2-NH- и -СН 2O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Модифицирующие агенты, включающие линкерную составляющую,- 25014229 можно получить, например, с результате взаимодействия моно-Вос-алкилдиамина (например, моно-Восэтилендиамина, моно-Вос-диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксилатом жирной кислоты. Вос-защитную группу можно удалить из продукта путем обработки трифторуксусной кислотой (TFA) с оставлением незащищенным первичного амина, который может связаться с другим карбоксилатом, как описано, или может взаимодействовать с малеиновым ангидридом, и образующийся в результате продукт подвергают циклизации с получением активированного производного жирной кислоты в виде имида малеиновой кислоты (смотри, например, Thompson, et al., WO 92/16221, полное описание которой включено сюда посредством ссылки). Модифицированные антитела согласно изобретению можно получить при взаимодействии антитела человека или антигенсвязывающего фрагмента с модифицирующим агентом. Например, органические составляющие можно связать с антителом не являющимся сайт-специфическим способом, применяя реакционноспособный в отношении аминов модифицирующий агент, например, NHS-эфир PEG. Модифицированные антитела человека или антигенсвязывающие фрагменты можно также получить путем восстановления дисульфидных связей (например, внутрицепочечных дисульфидных связей) антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Восстановленное антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно затем привести во взаимодействие с реакционноспособным в отношении тиолов модифицирующим агентом с получением модифицированного антитела согласно изобретению. Модифицированные антитела человека или антигенсвязывающие фрагменты, включающие органическую составляющую, которая связана со специфическими сайтами антитела согласно изобретению, можно получить с использованием подходящих способов, таких как обратный протеолиз (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992);Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4): 456-463 (1997, и способов, описанных у Hermanson, G. Т., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996). 7. Антиидиотипические антитела против анти-МСР-1-антител Помимо моноклональных иди химерных антител против МСР-1 настоящее изобретение также направлено на антиидиотипические (анти-Id) антитела, специфичные в отношении таких антител согласно изобретению. Анти-Id-антитело представляет собой антитело, узнающее уникальные детерминанты,обычно ассоциируемые с антигенсвязывающей областью другого антитела. Анти-Id-антитела можно получить путем иммунизации животного того же самого вида и генетического типа (например, линии мышей), что и источник Id-антител, антителами или содержащимся в них CDR-районом. Иммунизированные животные будут узнавать идиотипические детерминанты используемых для иммунизации антител и отвечать на них, и вырабатывать анти-Id-антитело. анти-Id-антитело можно также использовать в качестве "иммуногена" для индукции иммунного ответа в организме еще одного животного, с получением так называемых анти-анти-Id-антител. 8. Композиции антител, дополнительно содержащие терапевтически активные ингредиенты Композиции могут необязательно дополнительно содержать эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка, выбранного из по меньшей мере одного дерматологического средства, противовоспалительного средства, аналгезирующего средства, средства для заболеваний почки (например, антагониста или блокатора рецептора ангиотензина (ARB, противоинфекционного средства,средства от заболеваний сердечно-сосудистой системы (CV), средства от заболеваний центральной нервной системы (CNS), средства от заболеваний вегетативной нервной системы (ANS), средства от заболеваний дыхательных путей, средства от заболеваний желудочно-кишечного тракта (GI), гормонального средства, средства для водно-солевого баланса, гематологического средства, противоопухолевого средства, средства для иммуномодуляции, средства от заболеваний глаз, уха или носа, средства для местного применения, связанного с питанием средства и т.п. В данной области хорошо известны такие лекарственные средства, в том числе составы, показания, дозирование и назначение для каждого представленного здесь заболевания (см., например, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp.,Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc,Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., AppletonLange, Stamford, CT, все из которых полностью включены сюда посредством ссылки). Содержащие антитело против МСР-1 композиции согласно изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно подходящее и эффективное в отношении клетки, ткани, органа, животного или пациента, нуждающихся в такой модуляции, обработке или лечении, количество композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело против МСР-1, необязательно дополнительно содержащей по меньшей мере один агент, выбранный из по меньшей мере одного антагониста TNF (например, без ограничения, химического или белкового антагониста TNF, моноклонального или поликлонального антитела против TNF или фрагмента, растворимого TNF-рецептора (например, р 55, р 70 или р 85) или фрагмента, их слитых белков или антагониста TNF в виде небольших молекул, например, TNF-связывающего белка I или II (TBP-I или TBP-II), нерелимонмаба, инфликсимаба,энтерасепта, CDP-571, CDP-870, афелимомаба, ленерцепта и т.п.), противоревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, золота натрия тиомалата,- 26014229 гидроксихлорохина сульфата, лефлуномида, сульфасалзина), миорелаксанта, наркотического средства,нестероидного противовоспалительного средства (NSAID), аналгезирующего средства, анестезирующего средства, седативного, местного анестетика, нервно-мышечного блокатора, противомикробного средства(например, аминогликозида, противогрибкового средства, антипаразитного средства, антивирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, другого противомикробного средства), антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, связанного с диабетом средства, минерала, связанного с питанием средства, средства от заболеваний щитовидной железы, витамина, связанного с кальцием гормона, антидиарейного средства, средства против кашля, средства против рвоты, противоязвенного средства, слабительного средства, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, G-CSF, нейрогена), сарграмостима (GM-CSF, лейкина), агента от хронических обструктивных легочных заболеваний(COPD), антифиброзного агента, агента для иммунизации, иммуноглобулина, иммунодепрессанта (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба), гормона роста, замещающего гормон средства,модулятора рецептора эстрогена, мидриатического средства, средства от паралича аккомодации, алкилирующего агента, антиметаболита, митотического ингибитора, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антиманиакального агента, антипсихотического средства, транквилизатора, снотворного средства, симпатомиметического средства, возбуждающего средства, донепезила, такрина, средства от астмы, бета агониста, стероида для ингаляции, ингибитора лекотриена, метилксантина, кромолина, эпинефрина или аналога, дорназы альфа (пульмозима), цитокина или антагониста цитокина. Неограничивающие примеры таких цитокинов включают, но не ограничиваются перечисленными, любой из IL-1-IL29. Подходящие дозировки хорошо известны в данной области. Смотри, например, Wells et al., eds.,Pharmacotherapy Handbookm 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), все из которых полностью включены сюда посредством ссылки. Такие противораковые или противоинфекционные агенты могут также включать в себя молекулы токсина, которые ассоциируются, связаны, совместно образуют состав или совместно назначаются с по меньшей мере одним антителом согласно изобретению. Действие токсина может необязательно быть направлено на селективное уничтожение патологической клетки или ткани. Патологической клеткой может быть раковая клетка или другая клетка. Такие токсины могут быть, без ограничения, очищенным или рекомбинантным токсином или фрагментом токсина, включающим по меньшей мере один функциональный цитотоксический домен токсина, например, выбранного из по меньшей мере одного из рицина,дифтерийного токсина, токсина яда или бактериального токсина. Термин токсин также включает и эндотоксины, и экзотоксины, продуцируемые любыми встречающимися в природе, мутантными или рекомбинантными бактериями или вирусами, которые могут вызывать какое-либо патологическое состояние у людей и других млекопитающих, в том числе токсический шок, который может привести к смерти. Такие токсины могут включать в себя, без ограничения, неустойчивый к нагреванию энтеротоксин (LT) энтеротоксикогенной E.coli, устойчивый к нагреванию энтеротоксин (ST), цитотоксин Shigella, энтеротоксиныAeromonas, токсин-1 синдрома токсического шока (TSST-1), стафилококковый энтеротоксин A (SEA), В(SEB) или С (SEC), стрептококковые энтеротоксины и т.п. Такие бактерии включают, но не ограничиваются перечисленными, штаммы видов энтеротоксикогенной E.coli (ETEC), энтерогеморрагической E.coliImmunology, 76: 121-134 (1991); Marrack et al., Science, 248: 706-711 (1990), содержание которых полностью включено сюда посредством ссылки. Содержащие антитело против МСР-1 соединения, композиции или комбинации согласно изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере один любой подходящий дополнительный агент,такой как, без ограничения, разбавитель, связующее вещество, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консервант, адъювант и т.п. Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые дополнительные агенты. В данной области хорошо известны их неограничивающие примеры и способы приготовления таких стерильных растворов, такие как, без ограничения, у Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. В заведенном порядке можно отобрать фармацевтически приемлемые носители, подходящие в отношении способа введения,- 27014229 растворимости и/или стабильности антитела против МСР-1, фрагмента или вариантной композиции, хорошо известных в данной области и описанных здесь. Фармацевтические наполнители и добавки, применимые в композициях согласно изобретению,включают, но не ограничиваются перечисленными, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводороды (например, сахара, включающие моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; дериватизированные сахара, такие как альдиты, альдоновые кислоты, эстерифицированные сахара и т.п.; и полисахариды или сахарные полимеры), которые могут быть представлены отдельно или в комбинации, составляющие по отдельности или в комбинации 1-99,99% по весу или объему. Примеры белковых наполнителей включают сывороточный альбумин, как, например, сывороточный альбумин человека (HSA), рекомбинантный альбумин человека (rHA), желатин, казеин и т.п. Представители компонентов в виде аминокислот/антител, которые могут также функционировать в буферной емкости, включают аланин, глицин,аргинин, бетаин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и т.п. Одной из предпочтительных аминокислот является глицин. Углеводородные наполнители, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как рафиноза, мелецитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п; и альдиты, такие как маннит, ксилит,мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит), миоинозит и т.п. Предпочтительными углеводородными наполнителями для использования в настоящем изобретении являются маннит, трегалоза и рафиноза. Содержащие антитело против МСР-1 композиции могут также включать в себя буфер или рНрегулирующий агент; как правило, буфером является соль, приготовленная из органической кислоты и основания. Представители буферов включают соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, тартаровой кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; трометамина гидрохлорид или фосфатные буферы. Предпочтительными буферами для использования в настоящем изобретении являются соли органических кислот, такие как цитрат. Кроме того, содержащие антитело против МСР-1 композиции могут включать в себя полимерные наполнители/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколлы (полимерные сахара), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропилциклодекстрин), полиэтиленгликоли, корригенты, противомикробные агенты, подсластители, антиоксиданты, антистатические агенты, поверхностноактивные вещества (например, полисорбаты, такие как "твин-20" и "твин-80"), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелатирующие агенты (например,EDTA). Эти и другие известные фармацевтические наполнители и/или добавки, подходящие для использования для антитела против МСР-1, части или вариантных композиций в соответствии с настоящим изобретением известны в данной области, например, те, которые перечислены в "Remington: The SciencePractice of Pharmacy", 19th ed., WilliamsWilliams, (1995) и в "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), содержание которых полностью включено сюда посредством ссылки. Предпочтительными материалами носителей или наполнителей являются углеводороды (например, сахариды и альдиты) и буферы (например, цитратный) или полимерные агенты. 9. Композиции Как отмечено выше, настоящим изобретением обеспечиваются стабильные композиции, пригодные для фармацевтического или ветеринарного использования, включающие по меньшей мере одно антитело против МСР-1 в фармацевтически приемлемой композиции. Как отмечено выше, настоящим изобретением обеспечивается изделие производства, включающее в себя упаковочный материал и по меньшей мере один флакон, содержащий раствор по меньшей мере одного антитела против МСР-1 с прописанными буферами и/или консервантами необязательно в водном разбавителе, причем указанный упаковочный материал включает этикетку, в которой указывается на то,что такой раствор можно держать на протяжении периода, составляющего 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24,30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 ч или больше. Кроме того, настоящее изобретение включает изделие производства, включающее в себя упаковочный материал, первый флакон, содержащий лиофилизированное по меньшей мере одно антитело против МСР-1, и второй флакон, содержащий водный разбавитель прописанного буфера или консерванта, причем указанный упаковочный материал включает этикетку, в которой приводится инструкция для пациента по воссозданию по меньшей мере одного антитела против МСР-1 в водном разбавителе с формированием раствора, который можно держать на протяжении периода, составляющего двадцать четыре часа или больше. Диапазон по меньшей мере одного антитела против МСР-1 в продукте согласно изобретению включает количества, дающие при воссоздании, если присутствует в сырой/сухой системе, концентрации от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 1000 мкг/мл, хотя более низкие и более высокие концентрации являются операбельными и зависят от носителя для предполагаемой доставки, например, композиции в виде раствора будут отличаться от пластыря для трансдермальной доставки, легочной, чрессли- 28014229 зистой или осмотической или микронасосной системы. Водные разбавители необязательно дополнительно включают фармацевтически приемлемые консерванты. Предпочтительные консерванты включают те, которые выбирают из группы, состоящей из фенола, мета-крезола, папа-крезола, орто-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил, этил, пропил, бутил и т.п.), бензалькония хлорида, бензетония хлорида, натрия дегидроацетата и тимеросала или их смесей. Концентрация консерванта, используемого в композиции, представляет собой концентрацию, достаточную для получения противомикробного действия. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и без труда определяются квалифицированным специалистом. Другие наполнители, например, изотонические агенты, буферы, антиоксиданты, усилители консервантов можно необязательно и предпочтительно добавить к разбавителю. Изотонические агенты, такие как глицерин, обычно используют при известных концентрациях. Физиологически допустимые буферы предпочтительно добавляют для обеспечения улучшенного контроля рН. Композиции могут находиться в широком диапазоне рН, таком как от приблизительно 4 до приблизительно 10, а предпочтительные диапазоны - от приблизительно 5 до приблизительно 9, и более предпочтительные диапазоны - от приблизительно 6 до приблизительно 8. Предпочтительно, композиции согласно изобретению имеют рН между приблизительно 6,8 и приблизительно 7,8. Предпочтительные буферы включают фосфатные буферы, наиболее предпочтительно натрия фосфат, особенно забуференный фосфатом раствор (PBS). Для уменьшения агрегации к составам или композициям можно необязательно добавить другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые солюбилизаторы, напоминающие твин 20 (полиоксиэтилен(20) сорбитан монолаурат), твин 40 (полиоксиэтилен(20) сорбитан монопальмитат), твин 80 (полиоксиэтилен(20) сорбитан моноолеат), плуроник F68 (блоксополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена) и PEG (полиэтиленгликоль), или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 20 или 80, или полоксамер 184, или 188, Pluronicpolyls, другие блоксополимеры, и хелатообразующие вещества, такие как EDTA и EGTA. Эти добавки особенно полезны, если для введения композиции используют насос или пластмассовый контейнер. Присутствие фармацевтически приемлемых поверхностно-активных веществ уменьшает склонность белка к агрегации. Композиции согласно изобретению можно приготовить способом, который включает смешивание по меньшей мере одного антитела против МСР-1 и забуференного раствора в количествах, достаточных для получения требуемых концентраций белка. Специалисту со средней квалификацией в данной области известны вариации этого способа. Например, порядок, в котором добавляют компоненты, если используются дополнительные добавки, температура и рН, при которых готовят композицию, являются всеми теми факторами, которые можно оптимизировать в отношении используемой концентрации и способа введения. Заявленные композиции можно предоставить пациенту в виде растворов или в виде двух флаконов,включающих флакон с лиофилизированным по меньшей мере одним антителом против МСР-1, которое воссоздают с помощью второго флакона, содержащего воду, консервант и/или наполнители, предпочтительно фосфатный буфер и/или солевой раствор и выбранную соль, в водном разбавителе. Или единственный флакон с раствором, или два флакона, требующие воссоздания, можно вновь использовать много раз, и их может быть достаточно для единичного или множественных циклов лечения пациента, и, следовательно, они могут обеспечить более удобную схему лечения по сравнению с той, которая имеется в распоряжении в настоящее время. Заявленные в настоящем изобретении изделия производства применяются для введения на протяжении периода, составляющего от тотчас же до двадцати четырех часов или больше. Соответственно,заявленные в настоящем изобретении изделия производства приносят значительную пользу пациенту. Композиции согласно изобретению можно необязательно благополучно хранить при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 40 С, и они сохраняют биологическую активность белка в течение длительных периодов времени, что, следовательно, делает возможной этикетку упаковки, указывающую на то, что раствор можно держать и/или использовать на протяжении периода, составляющего 6, 12, 18,24, 36, 48, 72 или 96 ч или больше. Если используют разбавитель с консервантом, такая этикетка может включать в себя указание на возможность использования до 1-12 месяцев, полугода, полутора и/или двух лет. Заявленные продукты можно предоставить пациенту непрямо путем предоставления в аптеки, клиники и другие подобные учреждения и отделения прозрачных растворов или двух флаконов, включающих флакон с лиофилизированным по меньшей мере одним антителом против МСР-1, которое воссоздают с помощью второго флакона, содержащего водный разбавитель. Прозрачного раствора в этом случае может быть до одного литра или даже больше по объему, что обеспечивает большой резервуар, из которого более мелкие порции раствора по меньшей мере одного антитела могут извлекаться один или много раз для переноса в меньшие флаконы и предоставляться аптеками или клиникой покупателям и/или пациентам. Признанные устройства, включающие эти системы в виде единственного флакона, включают устройства в виде ручки-инжектора для доставки раствора, такие как BD Pens, BD Autojector, Humaject,- 29